авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Владимирский государственный университет

С.С. РЫБАКОВ

КУРС ЛЕКЦИЙ

ПО ОСНОВАМ БИОТЕХНОЛОГИИ

В двух частях

Часть 2. Применение биотехнологии

Владимир 2010

УДК 573.6 (075.8)

ББК 30.16

Р 93

Рецензенты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой химии Владимирского государственного гуманитарного университета Н.П. Ларионов Доктор медицинских наук, профессор Владимирского государственного университета И.П. Бойко Доктор ветеринарных наук, профессор, начальник отдела разработки и внедрения промышленных технологий Федерального центра охраны здоровья животных В.В. Михалишин Печатается по решению редакционного совета Владимирского государственного университета Рыбаков, С.С.

Курс лекций по основам биотехнологии. В 2 ч. Ч. 2. Примене Р ние биотехнологии / С.С. Рыбаков ;

Владим. гос. ун-т. – Владимир :

Изд-во Владим. гос. ун-та, 2010. – 127 с. – ISBN 978-5-9984-0046-9.

В первую часть курса лекций была включена информация по истории биотехнологии, генетической, клеточной инженерии и тканевой инженерии, культивированию бактерий и новому направлению нанобиотехнологии.

Во второй части в краткой форме изложены сведения о применении био технологии в различных областях деятельности человека, включая вопросы, свя занные с биологическим оружием и биотерроризмом, биобезопасностью и охра ной авторских прав в биотехнологии.

Данный краткий курс предназначен для студентов 3 и 4-го курсов очной фор мы обучения по специальностям «Биотехнические и медицинские аппараты и систе мы» (200401), «Инженерное дело в медико-биологической практике» (200402).

Табл.: 8. Библиогр.: 11 назв.

УДК 573.6 (075.8) ББК 30. ISBN 978-5-9984-0046-9 © Владимирский государственный университет, ВВЕДЕНИЕ Сфера приложения биотехнологии и биотехнологических про цессов c каждым годом расширяется: медицина и фармакология, сельское хозяйство, промышленность, охрана окружающей среды и др. Наиболее широко биотехнология применяется в трех отраслях на родного хозяйства – медицине, сельском хозяйстве и промышленно сти. В последние годы все чаще она начинает применяться для реше ния проблем аквакультуры. Для обозначения указанных выше на правлений был введен ряд новых терминов.

Красная биотехнология – применение биотехнологии в медици не. Например, получение необходимых штаммов микроорганизмов и их применение;

разработка методов диагностики, средств лечения и профилактики различных заболеваний.

Зеленая биотехнология – процессы биотехнологии, применяемые в сельском хозяйстве. В качестве примеров можно привести традицион ную селекцию и выращивание необходимых человеку животных и рас тений или получение трансгенных животных и растений с заданными, полезными для человека свойствами. Есть надежда на то, что зеленая биотехнология внесет в охрану окружающей среды больший вклад, чем традиционное индустриальное сельское хозяйство, например, благодаря использованию биопестицидов, биогербицидов и биоудобрений.

Белая биотехнология известна как промышленная биотехнология.

Примером является создание микроорганизмов, продуцирующих нуж ные для человека вещества, использование ферментов в качестве про мышленных катализаторов или для деградации вредных отходов, загряз няющих окружающую среду. Из преимуществ белой биотехнологии пе ред традиционными процессами можно отметить снижение загрязнения окружающей среды и уменьшение потребления энергии и сырья.

Синяя биотехнология – термин, который введен для описания процессов биотехнологии, применяемых в аквакультуре. Этот тер мин пока используется редко.

Инвестиции и экономические вопросы, возникающие при при менении биотехнологии в вышеперечисленных областях, формируют то, что обычно называют биоэкономикой.

В последние годы появился новый термин нанобиотехнология, который используется все чаще (см.Ч.1). Нанобиотехнологи уже начали применять молекулярную самоорганизацию как способ производства новых нанобиоструктур, таких как нанокапсулы для лекарств и каркасы из нановолокон для выращивания тканей. Важным направлением нано биотехнологии считается разработка новых материалов для медицины.

Биотехнология является одним из научно-практических приори тетов XXI века. В 2004 г. рынок биотехнологической продукции в мире составил около 40 млрд долларов. По расчетам, к 2010 г. эта цифра увеличится до 100 млрд, а с включением сюда продукции, про изведенной в других отраслях с использованием биотехнологических методов, превысит 3 трлн. Долгосрочные прогнозы также подтвер ждают тенденции роста биотехнологической отрасли.

Сознавая приоритетность и актуальность современной биотех нологии, общество биотехнологов им. Ю.А. Овчинникова, воссоздан ное в октябре 2003 г., вместе с другими заинтересованными общест венными и государственными структурами России выступило с ини циативой формирования и последующей реализации комплексной на циональной программы «Развитие биотехнологии в России на 2006– 2015 гг.». Программа была утверждена Третьим съездом Общества биотехнологов им. Ю.А. Овчинникова 27 октября 2005 г.

Основная цель Программы – развертывание работ в области теоретической и практической биотехнологии в России на базе со временных инновационных подходов для производства отечествен ной биотехнологической продукции. В практическом (прикладном) аспекте будут поддержаны наиболее перспективные проекты в облас ти медицинской, сельскохозяйственной, пищевой, экологической, промышленной биотехнологии и других сфер применения биотехно логии с целью выйти на определенный процент импортозамещения.

Большое внимание уделено вопросам подготовки кадров XXI века. На это направлена одна из основных задач Программы – создание совре менной системы подготовки и сохранения кадров биотехнологов.

Лекция 1. БИОТЕХНОЛОГИЯ В МЕДИЦИНЕ В недалеком прошлом смерть постоянно угрожала человеку.

Смертность младенцев достигала 25 %, примерно столько же умирало в детском возрасте. Человек из-за эпидемий, которые возникали очень час то, мог умереть в любом возрасте. Чуть больше 2 % популяции доживало до 65 лет. Благодаря усилиям ученых были выяснены причины многих болезней, разработаны методы их диагностики, лечения и профилактики, созданы антисептики, вакцины, антибиотики и другие препараты.

С улучшением условий жизни, а также медицинского обслужива ния продолжительность жизни за последние 150 лет увеличилась с 40 до 80 лет и в будущем будет увеличиваться. В наши дни инфекционные бо лезни значительно меньше угрожают жизни и на первый план выступили сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, нейродегенератив ные болезни (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.), количество слу чаев которых значительно возросло в результате старения популяции.

В медицине современная биотехнология находит широкое при менение в таких областях, как разработка и производство фарм- и биопрепаратов;

генетическое тестирование, терапия генов и т.д. По лучение препаратов, применяемых в медицине, исследователи счита ют одним из важных направлений в биотехнологии. Речь идет о диаг ностических наборах, профилактических и лечебных препаратах. С помощью современных биотехнологических методов получено боль шое разнообразие биологически активных веществ белковой приро ды, в том числе гормонов, белков крови, иммунорегуляторов и имму номедиаторов — интерлейкинов, интерферонов и др. Разработаны новые принципы конструирования вакцин и диагностических набо ров. Эти задачи успешно решает иммунобиотехнология, выделившая ся в самостоятельный раздел биотехнологии.

Известно, что для разработки современных фармацевтических препаратов требуется значительное время. Кроме того, необходим длительный период их проверки, прежде чем соответствующие госу дарственные органы разрешат производство и применение препарата.

Стоимость разработки и испытания таких препаратов может состав лять многие миллионы долларов, поэтому они должны пользоваться большим спросом, чтобы не только возместить затраты, но и принес ти доход. Из-за отсутствия финансового интереса производящих ком паний, сталкивающихся с гигантскими затратами, многие необходи мые препараты не появляются на рынке. Биотехнология должна по мочь в производстве препаратов, которые необходимы для человека в небольших количествах и не дают большого дохода.

Новые медицинские препараты, полученные с помощью био технологии, появляются на рынке почти ежедневно. Они включают терапевтические продукты (гормоны, регуляторные белки, антибио тики и т. д.;

вакцины нового поколения, иммунодиагностические и ДНК-овые наборы для идентификации болезней;

препараты для тера пии генов и предродовой диагностики генетических болезней и др.) Молекулярные структурные элементы, образованные из амино кислот, пептидов, очень перспективны для разработки новых препара тов для медицины. В воде и жидкостях организма они образуют хоро шо упорядоченные каркасы из нановолокон, которые могут использо ваться для выращивания тканей. Например, ученые успешно использо вали такие каркасы для выращивания искусственных хрящей и костей с целью замены поврежденных тканей. Самоорганизующиеся пептид ные нановолокна могут мгновенно остановить кровотечение, что очень важно для хирургии. Применение новых структур для доставки ле карств и генов оказалось очень эффективным, так как они могут обво лакивать гидрофобные вещества и доставлять их в клетки больного.

Всестороннее изучение механизмов заболевания позволяет раз работать препараты целенаправленного действия. Это коммерчески развиваемые области новой биотехнологии с огромным настоящим и необъятным будущим рынком сбыта, некоторые из них будут кратко описаны ниже.

1.1. Фармацевтические и биофармацевтические препараты Антибиотики. Открытие в 1928 г. Александром Флемингом то го, что грибок, называемый Penicillum notatum, может продуцировать соединение, подавляющее размножение широкого ряда бактерий, без заметного действия на организм человека или животных, сыграло в дальнейшем огромную роль. Последующие многочисленные исследо вания в этом направлении изменили методы борьбы человека с инфек ционными, в первую очередь, бактериальными болезнями. Антибиоти ки начали интенсивно использоваться примерно с 1945 г. после приме нения пенициллина. Новые антибиотики вскоре расширили спектр ан тимикробных препаратов и в настоящее время широко используются в медицине и ветеринарии, а также (хотя менее интенсивно) в животно водстве, где некоторые антибиотики используются для увеличения ве са сельскохозяйственных животных. Они могут также использоваться для борьбы с болезнями растений, а также в качестве инсектицидов.

Антибиотики, которые действуют на ряд микроорганизмов, называются антибиотиками с широким спектром. К ним относятся, например, хлорамфеникол и тетрациклины, которые могут действо вать на такие неродственные группы микроорганизмов, как риккет сии, хламидии и микоплазмы. В противоположность им стрептомицин и пенициллин имеют узкий спектр действия, поскольку эффективны только против некоторых видов бактерий. Известно около 6000 анти биотиков, которые продуцируются грибами, стрептомицетами, бакте риями. В медицинской практике испольуются около 100 антибиоти ков. Большинство из них продуцируется актиномицетами, в частно сти, представителями рода Streptomyces (табл. 1.1).

Таблица 1. Некоторые наиболее важные антибиотики Микроорганизм Антибиотик Спектр действия продуцент Actinomicin D Антиопухолевое Streptomices sp.

Bacitracin Антибактериальное Bacillus sp.

Bleomicin Антираковое Streptomices sp.

Cephalosporin Антибактериальное Acremonium sp.

Chloramphenicol Антибактериальное Cephalosporium sp.

Daunorubicin Антипротозойное Streptomices sp.

Fumagillin Амебоцидольное Aspergillus sp.

Griseofulvin Антигрибковое Penicillum sp.

Mitomycin C Противоопухолевое Streptomices sp.

Natamycin Консервант продуктов Streptomices sp.

Nisin Консервант продуктов Lactococcus sp.

Penicillin G Антибактериальное Penicillum sp.

Rifamicin Противотуберкулезное Nocardia sp.

Streptomicin Антибактериальное Streptomices sp.

Tetraciyclin Антибактериальное, Streptomices sp.

Антиамебное В последние годы возникла проблема, связанная с повышением устойчивости бактерий к антибиотикам. Установлено, что факторы устойчивости расположены в плазмиде и могут легко передаваться от одной бактерии к другой. Открытие этого феномена послужило осно вой для разработки метода переноса генов, который широко исполь зуется в генетической инженерии.

Применение методов генетической инженерии позволило полу чить новые штаммы-продуценты с высокой продуктивностью, луч шей стабильностью и дало возможность синтезировать новые анти биотики. Эти модификации позволили снизить себестоимость анти биотиков. В настоящее время в их производстве используются танко вые реакторы с перемешиванием, работающие в аэробных цикличе ских условиях. Одним из путей получения новых антибиотиков счи тается их постсинтетическая химическая модификация.

Практика показывает, что поиск новых антибиотиков необходи мо проводить постоянно, поскольку бактерии очень быстро приобре тают устойчивость к ним. Например, производство нового антибио тика Zyvox было налажено в 2000 году, а первые стойкие к нему штаммы бактерий появились уже через год.

Наиболее актуальные задачи, связанные с разработкой, произ водством и применением антибиотиков:

– создание и разработка способов преодоления антибиотикоре зистентности микробов;

– изыскание природных и создание полусинтетических антибио тиков, эффективных в борьбе со стафилококковой, синегнойной и другими инфекциями;

– поиски других видов организмов – продуцентов антибиотиков;

– получение новых антибиотиков путем направленного биосин теза и подбора соответствующих мутантов и рекомбинантов.

Стимулом к дальнейшим исследованиям являются два основных фактора – большое значение антибиотиков в медицине и ветеринарии и низкая стоимость сырья, идущего на их изготовление. Эта отрасль производства в отличие от других не испытывает конкуренции со стороны химического производства. Однако проблемы, отмеченные выше, вынуждают изыскивать новые подходы в борьбе с инфекцион ными болезнями. Одним из наиболее перспективных путей в борьбе с некоторыми заболеваниями можно считать создание и широкое при менение пробиотиков. Большая часть пробиотиков, используемых в настоящее время, создана на основе бактерий рода Bacillus.

Ферменты. Ферменты очень широко используются в биотехно логии в качестве инструментов для осуществления тонкого химиче ского органического синтеза, в легкой, пищевой и фармацевтической промышленности, а также в генноинженерных исследованиях. В большинстве случаев получение ферментов – это аэробный процесс.

Их выгоднее получать микробиологическим путем, чем выделять из растительного или животного сырья.

Особенности получения ферментов:

– тщательное соблюдение стерильности, так как они при произ водстве в отличие от спиртов, кислот и антибиотиков не подавляют постороннюю микрофлору;

– биосинтез ряда ферментов подавляется катаболитами, (напри мер глюкоза ингибирует синтез -амилазы);

– большую опасность представляют протеазы, так как они гид ролизуют ферменты, большинство из которых являются белками.

В качестве примеров использования ферментов в медицине можно привести следующие: урокиназа, которая продуцируется куль турой клеток, ее используют для разрушения тромбов;

супероксид дисмутаза синтезируется бактериями и применяется для лечения ишемической болезни сердца;

стрептокиназа синтезируется бакте риями, способна превращать плазминоген в плазмин и поэтому при меняется для разрушения тромбов.

Перспективным считается направление, связанное с получени ем с помощью представителя энтеробактерий Serratia marcescens вы сокоактивной внеклеточной эндонуклеазы, расщепляющей ДНК и РНК. Эндонуклеаза находит применение в качестве объекта и инст румента исследований, обладает противоопухолевым и противови русным, а также ростстимулирующим действием. Методом индуци рованного мутагенеза и селекции получены высокопродуктивные штаммы S. marcescens с активностью внеклеточной эндонуклеазы, превышающей активность исходного штамма в 140 раз.

Гормоны. В зависимости от величины и структуры молекулы гормоны делят на 4 группы:

– пептидные гормоны (состоят из нескольких десятков амино кислот). Факторы гипоталамуса, гормоны гипофиза, щитовидной же лезы, пищеварительного тракта — холецистокинин, поджелудочной железы — инсулин;

– гормоны роста и пролактины (от 170-190 аминокислот), на пример соматотропин;

– гликозилированные (состоят из двух субъединиц). Лютеони зирующий, фолликулостимулирующий и тиреотропный гормоны;

– стероидные гормоны-глюкокортикоиды (кортизон, гидрокор тизон, преднизолон, дексаметазон и др.), которые применяются при заболеваниях крови, таких как гемолитическая анемия, острый лейкоз и др.;

иммуносупрессии, снижая отторжение органов и тканей;

аллер гии – астма, экзема и др.;

аутоиммунных заболеваниях — ревматоид ный артрит, системная красная волчанка.

Первыми генами человека, для которых была определена после довательность нуклеотидов и клонированными в микроорганизмы, были гены, кодирующие гормоны инсулин и соматотропин, а также интерферон, имеющие важное терапевтическое значение.

Инсулин. В мире миллионы людей нуждаются в регулярном введении инсулина для того, чтобы избежать летального действия диа бета. Долгое время для этих целей использовали инсулин, экстрагиро ванный из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота.

Такие препараты обладали побочным действием, поскольку они со держали различные контаминанты. В 80-х г. производство инсулина подверглось радикальному изменению. Появление рекомбинантного инсулина человека сняло проблему побочного действия и заметно увеличило рынок сбыта этого препарата, поскольку его производство не связано с забоем животных. В настоящее время почти весь инсулин производится в E. coli, в которые встроен ген, кодирующий инсулин человека. Генетически измененные дрожжи в последние годы также используются для производства инсулина. Имеются подтверждения того, что инсулин в трансгенных растениях можно получить с мень шими затратами, чем в биореакторах. Например, одна из канадских фирм сообщила, что произведенный ими в подсолнечнике инсулин дешевле более чем на 25 %. Новая технология уменьшит затраты на строительство необходимых производственных мощностей.

Соматотропин. Этот гормон крайне трудно получать из тка ней животных. Для получения 0,005 грамма чистого соматотропина требовалось переработать 0,5 млн мозгов овец. Используя трансген ные бактерии, содержащие ген, кодирующий соматотропин, такое ко личество гормона можно получить из 9 литров бактериальной куль туры. У детей гипофизарная карликовость возникает в результате де фицита гормона роста с частотой 1:5000. Получение этого гормона поможет детям, страдающим данным заболеванием. Ежегодный ры нок этого препарата оценивается в 100 млн долларов США. Потенци альный рынок его сильно возрос после того как было показано, что соматотропин может способствовать наращиванию мышечной массы нормальных (не больных) индивидуумов и теперь применяется с этой целью некоторыми атлетами. Было также показано, что регулярное введение этого гормона улучшает самочувствие у людей пожилого возраста.

Витамины. Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде мно гоатомного спирта D-рибита. Широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами и бактериями. Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii) и плесневые грибы (Aspergillus niger). Промышленное полу чение рибофлавина осуществляется химическим, микробиологиче ским или комбинированным методом: при этом синтезированная микроорганизмами рибоза химически трансформируется в В2. Жи вотные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его вме сте с кормом. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний. Для медицинских целей микробиологиче ский рибофлавин получают на основе гриба Aspergillus. В последние десятилетия бурно развивается микробиологическое производство витамина В2 путем культивирования микроскопического гриба Eremothecium ashbyii, которое успешно конкурирует с его химиче ским синтезом.

Витамин В12 – (-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин – это полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов. Мик робиологический синтез является единственным способом получения данного витамина. Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В12 Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры метанообразующих бактерий.

Эргостерин (эргоста-5,7,22-триен-3-ол) является исходным продуктом производства витамина D2 и кормовых препаратов дрож жей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи и плесневые грибы.

Для получения кристаллического -каротина в промышленном масштабе используется низший гриб Blakeslea trispora, характерной особенностью которого является способность к сверхсинтезу целево го продукта.

Интерфероны. В 1957 году были открыты вещества, обра зующиеся в организме, которые могут действовать против вирусов, делая тем самым клетки устойчивыми к ним. Эти вещества были на званы интерферонами. Многие вирусы могут индуцировать их синтез в клетках in vitro и являются чувствительными к ним. Получение ин терферонов в достаточных количествах довольно проблематично, по скольку они образуются в клетках в очень небольших количествах и поэтому их невероятно сложно отделить от других клеточных белков.

Интерфероны являются гликопротеинами и играют большую роль в контролировании многих типов вирусных инфекций. Многие типы интерферона охарактеризованы для отдельных видов животных:

мышиный интерферон будет действовать только в клетках мыши, но не человека и наоборот. Более того, различные ткани одного и того же вида животного производят различные интерфероны.

Имеется несколько источников получения интерферона. Дип лоидные фибробласты человека, культивируемые in vitro. В- и Т-лимфоциты синтезируют имунный интерферон. Его противоопухо левая активность в 50-100 раз выше, чем других интерферонов. Ген, кодирующий интерферон фибробластов человека, может быть встро ен в плазмиду бактерий таким образом, что они будут синтезировать интерферон, который затем можно экстрагировать и очистить.

Лимфокины. Лимфокины это белки, продуцируемые лимфоци тами (клетки иммунной системы организма). Они являются необхо димыми компонентами иммунной реакции и способны усиливать борьбу иммунной системы с инфекционными или онкологическими болезнями.

Таким образом, лимфоцитарные противораковые вещества — интерлейкин 1 и 2 являются факторами иммунитета. Их получают из лимфоцитов, фибробластов (диплоидные клетки), а также с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Большинство других фармацевтических препаратов, получен ных с помощью биотехнологии, представляют собой вещества, вы деленные из источников биологического происхождения. При этом они могут быть использованы после химической модификации или без неё. Методы молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии играют в настоящее время основную роль в открытии, дизайне и производстве препаратов. Можно привести несколько примеров получения фармацевтических препаратов с помощью со временной биотехнологии. РНКазы бактерий находят широкое при менение в биохимии и молекулярной биологии в качестве инстру ментов генетической инженерии и являются объектом биотехноло гического производства, кроме того, они обладают противовирус ными свойствами.

Из других микроорганизмов широко используются дрожжи. Ис точником сырья для получения дрожжевой РНК служат кормовые дрожжи, как правило рода Candida, выращенные на различных суб стратах и содержащие не менее 7 % компонентов нуклеотидной при роды. Дрожжевая РНК представляет собой смесь полирибонуклеоти дов разных молекулярных масс. Ее натриевая соль – нуклеинат на трия находит применение в медицине при лечении широкого круга заболеваний, а технический продукт РНК-концентрат используется в производстве нуклеозидов и мононуклеотидов. Представляют также интерес некоторые основания нуклеиновых кислот, применяемые в современной биотехнологии в виде ростовых факторов (аденин и его производное кинетин) или в технологиях тонкого органического син теза при получении фармакопейных препаратов (например, ацикло вира на основе гуанина).

Сравнительно недавно разработан биотехнологический метод получения тимидина, который является сырьем для производства ле карственного препарата азида тимидина, применяемого для лечения СПИДа путем ингибирования роста ВИЧ. Этот способ представляется более выгодным с экономической и экологической точек зрения в сравнении с методами химического синтеза и ферментативного гид ролиза ДНК, используемыми ранее в промышленности.

Многие физиологически активные вещества получают из расти тельного сырья. Более 25 % лекарственных препаратов изготовлены на основе соединений растительного происхождения. Так, элеутеро кокк колючий Eleutherococcus senticosus (синонимы-свободноягодник, дикий перец, колючий перец, чертов куст) – кустарниковое растение из семейства аралиевых, распространен главным образом в кедрово широколиственных и темнохвойных лесах малодоступных районов Сихоте-Алиня, используется для получения экстракта, который обла дает ярко выраженным адаптогенным действием: повышает умствен ную и физическую работоспособность, увеличивает резистентность к вредным воздействиям физической, химической и биологической природы. Физиологически активными веществами элеутерококка, обусловливающими его биологическую активность, являются глико зиды.

Продукты вторичного метаболизма растений также широко ис пользуются в медицине. При лечении аритмии сердца используют препарат аллапинин, действующим началом которого является дитер пеновый алкалоид лаппаконитин, который получают из аконита бело устого. С целью увеличения сырьевой базы для производства аллапи нина проводятся исследования другого вида аконита – борца северно го.

Биополимеры (БП). В настоящее время в медицине все большее внимание уделяется полимерам биологического происхождения. Это объясняется их разнообразием, уникальностью свойств, а также тем, что методы биотехнологии в отличие от традиционных химических позволяют получать экологически чистые материалы. Кроме белков и нуклеиновых кислот, особого рассмотрения заслуживают микробные термопластичные поли (3-оксиалканоаты) – полимеры 3-оксина сыщенных жирных кислот. Наиболее изученным считается полиокси бутират – гомополимер D-(3)-оксимасляной кислоты, служащий за пасным энергетическим соединением, которое синтезируют прока риоты в специфических условиях роста. Эти БП обладают механофи зическими свойствами, близкими к полиэтилену и полипропилену, а также рядом специфических свойств – биодеградируемостью, совмес тимостью с тканями человека и животных, пьезоэлектрическим эф фектом и другими полезными свойствами. Они успешно используют ся в медицине, в частности, в хирургии (прочный рассасываемый хи рургический материал, элементы для остеосинтеза, сосудистой пла стики, пленочные покрытия ран и ожоговых поверхностей, одноразо вые изделия, в том числе нетканые материалы), фармакологии (про лонгация действия лекарственных веществ). В последние годы иден тифицированы новые биополимеры этого класса, обладающие термо пластичностью и биодеградируемостью – гетерополимеры, вклю чающие в различных соотношениях и вариантах мономеры 3-оксинасыщенных жирных кислот (оксимасляной, оксивалериано вой, оксигексановой, оксиоктановой и др.).

В настоящее время проводится активный поиск новых проду центов БП, оптимизируются условия их ферментации, изучаются свойства полученных на их основе материалов.

Вакцины и диагностические препараты. Способность стимули ровать выработку антител с помощью вакцин известна давно. Вакци ны являются препаратами убитых (инактивированных) микроорга низмов (или их отдельных антигенов), живыми ослабленными (атте нуированными) микроорганизмами, которые могут стимулировать в организме человека или животных иммунитет к инфекционному за болеванию. Таким образом, они имитируют инфекционный агент и без патогенных последствий при введении в организм вызывают про тективный иммуннный ответ. Основной целью исследований, связан ных с разработкой вакцин нового поколения, являются идентифика ция и характеристика индивидуальных антигенов инфекционного агента, которые индуцируют защитный иммунный ответ. Применение субъединичных вакцин, состоящих из высокоочищенных компонен тов вириона, считается более безопасным, чем традиционных убитых или живых аттенуированных вакцин. Однако такие вакцины часто оказываются менее иммуногенными. Накопленная в последние годы информация о молекулярных механизмах презентации антигенов по зволяет нивелировать эти недостатки, моделировать вакцинный про цесс, избирательно активируя разные отделы иммунной системы пу тем использования адъювантов с различными механизмами действия, выбора антигена определенной степени полимеризации, включения в состав вакцины тех или иных цитокинов.

В настоящее время разработаны вакцины различных типов про тив многих инфекционных болезней.

Против некоторых болезней, вызываемых вирусами, разрабаты ваются вакцины с помощью технологии рекомбинантных ДНК – про тив гриппа, полиомиелита, гепатита, герпеса и др.

Проводятся исследования по получению различных вакцин про тив инфекционных болезней человека и животных, в том числе и с использованием растений в качестве продуцентов антигенов.

Интенсивные исследования проводятся в направлении создания некоторых бактериальных вакцин, а также вакцин против паразитар ных заболеваний. Малярия остается одним из наиболее опасных забо леваний в мире. Это сложная и неотложная проблема, возможно, бу дет решена в ближайшем будущем. Против некоторых инфекционных болезней разрабатываются ДНК-вакцины.

Биотехнологическими предприятиями выпускается большое разнообразие иммунодиагностических и ДНК-овых наборов для ди агностики. В последние годы большая часть иммунодиагностических наборов приготовлена не на основе поликлональных сывороток, а с использованием моноклональных антител (МАт).

Применение моноклональных антител (см.Ч.I). Моноклональные антитела (МАт) примененяются для диагностики онкогенных и инфек ционных заболеваний в качестве лечебных препаратов для создания пассивного иммунитета и т.д. Для диагностики МАт наиболее широко используются в сочетании с иммуноферментным анализом (ИФА).

В настоящее время производится несколько коммерческих пре паратов на основе МАт. Препарат Infliximab (Remicade) считается перспективным при некоторых болезнях воспалительного характера, таких как ревматоидный артрит.

МАт, соединенные с токсинами, используются для избиратель ной химиотерапии, поражая раковые и не действуя на нормальные клетки. Их можно применять против отторжения трансплантатов, на правляя на специфические иммунные клетки, участвующие в этом процессе, без нарушения функций других клеток иммунной системы.

В качестве примера таких препаратов можно привести Muromomab CD3. Модифицированная версия ингибировала аутоиммунное разру шение бета-клеток при сахарном диабете 1-го типа. МАт препарата Daclizumab (Zenapax) связываются с некоторыми рецепторами интер лейкина-2. Он используется для предотвращения отторжения транс плантированных почек. Кроме того, он эффективен при лимфоме T-клеток.

Кроме этого МАт применяются в качестве высокоспецифичных лекарственных препаратов.

Omalizumab (Xolair) связывается с IgE и предотвращает их взаимодействие с тучными клетками. Препарат применяется против астмы аллергической природы.

МАт исползуются для уничтожения или ингибиции роста рако вых клеток. Rituximab (Rituxan) связывается с молекулой CD20, кото рая обнаружена на большинстве B-клеток и используется для лечения лимфомы B-клеток.

Препарат Tositumomab (Bexxar) является конъюгатом МАт про тив CD20 и радиоактивного иода изотопа 131. Был одобрен для лече ния лимфомы.

Trastuzumab (Herceptin) связывается с рецептором HER2 эпи дермального фактора роста, найденного при некоторых видах рака молочной железы и лимфомах.

Cetuximab (Erbitux) блокирует HER1 другого рецептора эпидер мального фактора роста. Был одобрен для лечения рака толстого от дела кишечника.

Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) – конъюгат МАт к CD33, анти гену, находящемуся на поверхности клетки и экспрессируемому рако выми клетками при острой миелогенной лейкемии, и калихемицина – комплекса олигосахарида, разрушающего двунитевые ДНК. Препарат является первым иммунотоксином, с которым получены хорошие ре зультаты в борьбе против рака.

Alemtuzumab (Campath) связывает молекулу CD52, найденную на лимфоцитах, и позволяет излечивать хроническую лимфоцитар ную лейкемию в течение 18 месяцев.

Некоторые препараты на основе МАт используют в качестве ин гибиторов ангиогенеза. Bevacizumab (Avastin) блокирует рецептор фактора роста эндотелия сосудов. Был одобрен для лечения толстого отдела кишечника.

Препарат Abciximab (ReoPro) ингибирует агрегацию тромбоци тов, взамодействуя с рецепторами на их поверхности, которые в нор ме связываются фибриногеном. Этот препарат предотвращает блоки рование коронарных артерий у пациентов, которые подверглись ан гиопластике.

МАт погут быть получены на мышах, но будучи введенными в организм человека распознаются иммунной системой, что часто при водит не только к их элиминации без терапевтического эффекта, но и вызывает повреждение почек. Для решения этой проблемы ученые использовали химерные (человек - мышь) антитела. При этом вариа бельная часть антитела была взята от мыши, а константная – от чело века. Препараты Infliximab, Rituximab и Abciximab являются приме рами использования таких антител. Кроме того, можно брать не всю вариабельную область мышиных антител, а только аминокислоты, участвующие в связывании антигена, а остальную часть взять от мо лекулы антигена человека, заменив в антителе только гипервариа бельную область. Такие антитела включены в состав коммерческих препаратов Zenapax, Vitaxin, Mylotarg, Herceptin и Xolair.

Концепция направленной доставки лекарственных средств клет кам и тканям-мишеням, способная разрешить проблемы неспецифи ческого воздействия различных терапевтических препаратов на нор мальные ткани, стала предметом широкого экспериментального изу чения после разработки гибридомной технологии. В первую очередь реализация этих идей была направлена на лечение онкологических больных в связи с тем, что именно в этой области традиционные хи миотерапевтические и радиотерапевтические средства оказывают мощное повреждающее воздействие и на нормальные клетки. Интен сивное развитие гибридомной технологии привело к получению большого количества высокоспецифичных МАт против маркерных антигенов на поверхности клеток, которое сопровождалось не менее интенсивными исследованиями возможности использования их для избирательной элиминации популяций клеток-мишеней. В настоящее время достигнут значительный прогресс в создании цитотоксических фармакологических агентов направленного действия - иммунотокси нов, т.е. конъюгатов антител с токсинами растительного или бактери ального происхождения.

1.2. Использование трансгенных растений и животных в медицине В настоящее время многие биофармацевтические препараты производятся методом генетической инженерии в клетках млекопи тающих, растений, бактериях или классическим методом – микробной ферментацией. Однако с получением трансгенных животных (см.Ч.1) становится возможным получать некоторые белки человека, перспек тивные для фарминдустрии, включая тканевой активатор плазмино гена, фактор свертывания крови и т.д., в молочных железах несколь ких видов животных, таких как мыши, кролики, овцы, коровы и сви ньи. У этих животных необходимые препараты накапливаются в мо локе.

У некоторых людей, больных гемофилией, отсутствует агент свертывания крови, называемый коагулирующим фактором IХ. Был сконструирован ген, кодирующий этот белок, и успешно встроен в геном овец. Этот ген экспрессируется, хотя и в незначительной степе ни, и наследуется потомством.

В 2006 г. были получены трансгенные свиньи путем встраива ния гена "жир-1". Ген был взят от нематоды Caenorhabditis elegans. У 6 из 10 полученных клонов свиней экспрессировались высокие уров ни омега- 3 жирных кислот, полезных для профилактики сердечно сосудистых заболеваний.

Потенциал трансгенных животных, которые могут секретиро вать различные коммерчески важные для медицины продукты, не ог раничен и будет реализован в будущем. Основным преимуществом данной системы является то, что синтез проводится в организме мле копитающих, это обеспечивает посттрансляционную модификацию сложных белков человека, необходимую для проявления их биологи ческой активности. Такая модификация не может быть достигнута в бактериальных системах. Пока еще нет коммерческого производства, работа в настоящее время проводится в направлении повышения вы хода целевых продуктов. Процесс экспрессии не наносит вреда живот ному, которое продолжает давать молоко как обычно. Нет сомнения в том, что этот путь станет одним из основных при получении ряда бел ков, необходимых человеку. В качестве примера можно привести не которые американские компании, которые могут в настоящее время производить гемоглобин человека в крови трансгенных животных и на его основе готовить заменитель крови человека, который может иметь огромный спрос. Каждый год в мире делается 70 млн переливаний крови общей стоимостью 10 млрд долларов США. Такой кровезамени тель будет свободным от многих патогенов человека таких, например, как ВИЧ и будет исключена необходимость определения группы крови перед его введением, поскольку он не содержит красных клеток крови (эритроцитов). Однако предстоит провести дополнительные исследо вания, прежде чем данная технология будет применяться на практике.

Важным направлением можно назвать использование трансген ных животных в качестве доноров органов и тканей, необходимых для трансплантации. Почти четверти миллиона людей продлена жизнь благодаря пересадке органов. По статистическим данным в на стоящее время в экономически развитых странах около 150 000 чело век нуждаются в пересадке донорских органов и тканей. Мировая по требность в трансплантации может оказаться значительно большей.

По сравнению с 1988 г. она повысилась вдвое и продолжает ежегодно увеличиваться на 15 %. Одним из перспективных путей решения этой проблемы считают разработку метода пересадки человеку органов и тканей от животных (ксенотрансплантация). Естественным было бы считать, что ближе всего к нам стоят человекообразные обезьяны, од нако число животных этого вида ограничено и их трудно разводить в неволе. Не последнюю роль играет этическая сторона вопроса, свя занная с необходимостью убивать их с целью получения органов, и, наконец, невозможность полностью обезопасить реципиента от ин фекционных заболеваний заставляет искать донора органов для чело века среди животных другого вида. Как оказалось, таким животным может стать свинья, имеющая определенное анатомическое и физио логическое сходство с человеком. Некоторые биотехнологические компании работают над созданием свиней, с геном гистосовместимо сти человека. Предполагается, что эта технология завоюет огромный рынок. В настоящее время основным лимитирующим фактором явля ется получение большого числа трансгенных животных.

Одним из путей использования трансгенных растений в меди цине и ветеринарии – это получение вакцин. Для этого в растение встраивают гены, кодирующие белки возбудителей инфекционных болезней, индуцирующих выработку нейтрализующих антител. В на стоящее время получены генетически модифицированные картофель, томаты, подсолнечник, салат, табак, рис и другие растения. Если бу дущие клинические испытания пройдут успешно, то появятся «съе добные» вакцины, которые будут играть важную роль в борьбе с ин фекционными болезнями, особенно в развивающихся странах. Их преимущество состоит в том, что трансгенные растения могут быть выращены повсюду с применением сравнительно дешевой техноло гии. Изготовленные с их помощью вакцины позволили бы избежать материально-технических проблем, связанных с транспортировкой вакцин на большие расстояния и созданием холодовой цепи, необхо димой для большинства обычных вакцин. И так как они съедобны, они не будут нуждаться в шприцах, которые не только создают до полнительные материальные затраты, но также в случае их контами нации могут быть источником инфекций. Однако возникает другая проблема, связанная с тем, что в желудочно-кишечном тракте антиге ны расщепляются. Это затрудняет получение желаемого эффекта.

1.3. Генотерапия Несомненно, основным достижением генетической инженерии человека является терапия генов. Она дает возможность лечить бо лезни путем переноса и экспрессии генетического материала в клетки пациента с целью восстановления нормальной функции клеток. Ос новная цель терапии генов – корректировка отдельных дефектов гена (мутаций), например при кистозной болезни и гемофилии (табл. 1.2), которые могут наблюдаться в семьях согласно законам наследствен ности Менделя. Очевидно, что многие сотни подобных болезней можно лечить, корректируя дефекты гена. В настоящее время нет эф фективного лечения генетических болезней, но терапия генов может дать надежду большому количеству людей. Исправление дефектов соматических клеток при таких болезнях, как, например, болезнь Паркинсона, рак и многих других является трудной задачей, которая будет решена нескоро, поскольку происходит нарушение ряда генов.

Геном человека содержит около 100 000 генов, включающих около 3х109 нуклеотидов. Выполнение программы «Геном человека», кроме определения последовательности нуклеотидов всего генома дало воз можность провести его картирование с целью получения:

– генетической карты с относительным расположением генов;

– физической карты, дающей информацию по истинному поло жению генов.

Таблица 1. Некоторые генетические болезни человека Мишень Частота Болезнь (орган, клетки) встречаемости Талассемия (эритроб- Костный мозг 1:600 в некоторых ластическая анемия) популяциях Клеточная болезнь Печень 1: Прогрессивная мышцы/мозг 1:300 мужчины мышечная дистрофия Гемофилия А Миобласты, фиброб- 1:6000 мужчины ласты Гемофилия В Фибробласты 1:30000 мужчины Терапия генов включает несколько этапов. Она основана на ме тодах современной биотехнологии. Для ее выполнения следует доста вить с помощью вектора ген (ДНК) к специфическим клеткам мишеням;

поместить его в клетки, обычно это делается путем эндоци тоза;

провести транскрипцию и трансляцию гена в составе вектора и получить продукт терапевтического гена. Для этого требуется полное понимание механизмов, с помощью которых дефектный ген влияет на индивидуум, необходима возможность выключения и замены его нормальной копией. Имеется как минимум два вида терапии генов. В первом виде мишенью будут соматические, а во втором половые клетки, или оплодотворенная зигота. Во втором случае генетические изменения передаются по наследству. Для обоих случаев имеется ряд нерешенных вопросов, в том числе и этического характера.

Биотехнология ускоряет производство и скрининг новых препа ратов, а также помогает более точно объяснить их действие в орга низме человека и животных. Она заметно снижает стоимость новых препаратов, которая складывается из стоимости открытия, разработ ки, масштабирования, клинического испытания препарата и оформ ления документации необходимой для его применения.

Контрольные вопросы 1. Какие виды препаратов для лечения и профилактики можно получить с помощью биотехнологии?

2. С какой целью получают трансгенных животных и растений в медицине?

3. Применение МАт в медицине.

4. Каковы основные отличия антибиотиков от пробиотиков?

5. Терапия генов и перспективы её применения в медицине.

6. Какой вклад вносит биотехнология в развитие диагностики, лечения и профилактики болезней?

Лекция 2. БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ Эффективность сельскохозяйственных технологий зависит от многих факторов, включая экологогеографические, экономические, и от возобновляемых биологических ресурсов, таких как культурные растения, домашние животные и т.д. Повышение продуктивности в сельском хозяйстве зависит также от активных исследований с помо щью комплекса различных биологических наук. Вклад биотехнологии в развитие и повышение эффективности традиционных сельскохозяй ственных технологий постоянно возрастает. Стремительно растущий объем производства биотехнологической продукции растениеводства превысил 5 млрд долларов. В настоящее время особые перспективы в создании и распространении новых культивируемых сортов растений и пород животных имеют новейшие методы биотехнологии – клеточ ная и генетическая инженерия. Биотехнологические методы направ лены на увеличение количества и улучшение качества продукции за счет повышения устойчивости биологических видов к неблагоприят ным условиям внешней среды, вредителям и патогенам.

2.1. Биотехнология в животноводстве Животноводство во всем мире дает основные продукты питания.

В промышленно развитых странах для получения продуктов живот новодства используются интенсивные технологии. Продуктивность животных зависит от их породы, условий содержания и ряда других факторов.

На ранних этапах развития животноводства у животных выявля ли полезные свойства и пытались закрепить их у потомства. Благода ря обычной селекции и разведению получены высокопродуктивные породы сельскохозяйственных животных. Дальнейшее увеличение продуктивности с помощью традиционных приемов часто не дает же лаемых результатов. Селективное разведение, особенно крупных жи вотных, трудоемкий и медленный процесс, поскольку они имеют длинный период генерации. В связи с этим получение желаемых фе нотипических изменений может растянуться на много лет, поэтому постоянно продолжается поиск других путей получения животных с нужными свойствами. Разработка методов технологии рекомбинант ных ДНК и ее применение к программам разведения животных может значительно увеличить скорость и расширить возможности селектив ного разведения.

Трансгенные животные. Несколько лет назад многие ученые склонялись к мысли, что обновление генотипа сельскохозяйственных животных путем применения методов генетической инженерии не даст выигрыша во времени по сравнению с традиционным скрещива нием, так как для передачи определенного признака необходимо пе ренести группу или даже несколько групп генов. Первым примером переноса чужеродных генов в организм животного с помощью техно логии рекомбинатных ДНК было встраивание в геном мыши гена гормона роста крысы. Полученное от такой мыши потомство было значительно крупней, чем их родители. “Супермышь” привлекла большое внимание общественности, поскольку это была первая удач ная попытка получения трансгенного животного, т.е. животного, ко торое получило новый генетический материал искусственным спосо бом. Впоследствии велись длительные дискуссии об экономическом потенциале трансгенных сельскохозяйственных животных, однако в настоящее время нет сомнения, что это направление является пер спективным и сулит большие выгоды всему человечеству. В то же время, как указано в лекции 8, это одна из наиболее спорных областей современной биотехнологии. Хотя не всегда опыты по получению трансгенных животных заканчивались положительным результатом, однако в последние годы это направление успешно развивается:

1) в сельском хозяйстве для повышения устойчивости животных к различным заболеваниям, что приведет к увеличению количества и улучшению качества продуктов сельского хозяйства;

2) как источник органов для трансплантации (в результате ак тивности в них генов человека органы таких животных после транс плантации вызывают меньше вредных последствий);

3) как живые биореакторы для производства необходимых бел ков;

4) для тестирования вакцин и оценки токсичности, канцероген ности и мутагенности разных веществ;

5) для научных исследований, например, для расшифровки функционирования различных генов у разных видов животных.

Из перечисленных выше направлений самым необычным и коммерчески более перспективным считается проект, предусматри вающий использование некоторых лактирующих животных, таких как коровы, овцы, свиньи и кролики, для получения в их молоке бел ков человека или животных, которые можно затем выделять и ис пользовать в качестве фарм- и биопрепаратов. Общественность и кон тролирующие ведомства в настоящее время относятся к пищевым продуктам, полученным из генетически модифицированных организ мов (ГМО), менее настороженно, чем раньше. Недоверие к продук там, полученным с использованием генноинженерных манипуляций, возникло прежде всего из-за отсутствия стопроцентной гарантии того, что вводимые в растения гены не вызовут появления в их организме потенциально вредных для человека веществ. В отношении животных такие опасения считались менее обоснованными, так как наличие та ких веществ, скорее всего, отразилось бы на состоянии здоровья жи вотных, поскольку они генетически более близки человеку, чем рас тения. К другим опасениям, связанным с трансгенными животными, можно отнести следующие: 1) в них могут содержаться физиологиче ски активные вещества, попадание которых в пищу нежелательно (например, гормоны, стимулирующие рост, лактацию и др.);


2) они могут "случайно" передать гены нетрансгенным сородичам;

3) неко торые опасения вызывало использование в качестве векторов ретро вирусов. Все эти и другие нежелательные возможные последствия должны быть изучены и, если они реальны, исключены или хотя бы сведены к минимуму.

После получения трансгенных животных необходимо убедить ся в том, что чужеродная ДНК стабильна и наследуется по меньшей мере некоторыми родившимися потомками. Главным моментом явля ется доказательство того, что ген хорошо регулируется и функциони рует в новом для него организме.

В отношении трансгенных растений в настоящее время общест венность также склоняется к более рациональному и оптимистичному подходу, поскольку состав вводимого генетического материала всегда точно известен. Несомненно, мутации, включая делеции, вставки и ге нетические перестройки, могут возникнуть при введении генов в реци пиентный геном, и именно они могут оказаться потенциально опасны ми. Теоретически такая возможность не исключена. Однако необходи мо помнить, что разнообразные перестройки в геноме животных и рас тений происходят в их организме в течение десятилетий и без всякого вмешательства человека. При этом изменения, приводящие к выработ ке токсичных или других вредных для окружающих соединений, име ют место только при значительном селективном давлении. В растение водстве и животноводстве таких случаев не было отмечено.

Трансгенные свиньи, овцы и коровы в настоящее время уже по лучены, хотя частота успеха равна всего около 1% по сравнению с 2-5 % для мышей. Такая низкая эффективность сдерживает широкое получение и использование трансгенных животных. Однако с яйце клетками рыб, которые, как известно, оплодотворяются во внешней среде, выпадает несколько этапов, которые необходимо проводить при работе с млекопитающими, в частности, выделение яйцеклеток, оплодотворение их, а затем введение эмбрионов в суррогатную мать, эффекивность достигает 70 %.

Знание механизмов, регулирующих экспрессию гена у высших животных, недостаточны и это ограничивает возможности получения трансгенных животных.

Огромные перспективы использования трансгенных животных ожидаются в медицине (см. лекцию 1). В сельском хозяйстве основ ной целью получения трансгенных животных является введение спе цифических, экономически важных признаков, которые принесут пользу человеку.

За последние несколько лет контролирующие ведомства запад ных стран получили большое количество заявок от различных фирм на получение разрешения производить пищевые продукты с исполь зованием методов генетической инженерии. Начало было положено исследованиями физиолого-биохимического состояния свиней, полу чивших рекомбинантный гормон роста. В отличие от знаменитой су пермыши свиньи, в эмбриональные клетки которых вводили ген со матотропина, не вырастали до необычных размеров, а имели разви тую мышечную ткань, что отвечало запросам потребителей. К сожа лению, введение генов соматотропина приводило к ощутимому эн докринному сдвигу у животных. Свиньи страдали диабетом, беспло дием и другими заболеваниями. Эти последствия можно отнести к разряду технических проблем, но сам метод следует считать много обещающим в применении трансгенных животных для сельского хо зяйства.

Применение гормонов в животноводстве. Гипофиз животных секретирует гормон роста, который оказывает большое влияние на их рост, а у лактирующих животных на образоание молока. В 80-х годах ген, ответственный за выработку соматотропина КРС, был успешно выделен и встроен в бактериальную клетку с целью получения гор мона в больших количествах. При введении коровам 30 мг такого гормона значительно увеличивался надой молока (10 – 30 %), но про должительность его действия зависела от регулярных инъекций. Та кой эффект наблюдали у нескольких видов животных. Повышенного содержания соматотропина в молоке не было обнаружено и оно не изменялось ни по каким параметрам. Применение соматотропина в США в ноябре 1993 года явилось первым примером использования биотехнологически полученного коммерческого препарата, предна значенного для сельскохозяйственных животных. В результате про верки было показано, что соматотропин КРС оказался безопасным препаратом и в настоящее время применяется во многих странах, в частности в США, где он продается фирмой “Vonsanto” под торговым названием “Posilac”. Но многие потребительские организации высту пают против использования данного подхода. Что касается здоровья животных, установлено, что у трансгенных свиней, которым введен ген соматостатина, ССТ, обнаружили патологию в скелете, а у коров участилось заболевание маститами. Это было объяснено тем, что по лученные препараты были плохо очищены. Тем не менее, полученные результаты дискредитировали данное направление биотехнологии в глазах общественности. Появилось мнение, что биотехнологические продукты не дают прибыли и нет необходимости их применять. Од нако важно то, что в этих экспериментах была показана возможность применения достижений биотехнологии для увеличения продукции сельского хозяйства.

Ветеринарные препараты. Биопрепараты – средства биологиче ского происхождения, применяемые в медицине и ветеринарии для диагностики, профилактики и лечения неинфекционных, инфекцион ных и паразитарных болезней человека и животных. Важным направ лением биотехнологии стала разработка биопрепаратов, их произ водство и применение. Возбудители инфекционных болезней вызы вают заболевание всех видов сельскохозяйственных животных и рас тений. Если количество больных животных будет уменьшено или бо лезнь ликвидирована, то возрастет производство сельскохозяйствен ной продукции. Кроме того, биопрепараты необходимы также для домашних и диких животных.

Одним из видов биопрепаратов являются вакцины. Их произво дят с применением различных технологий и используют для создания у животных активного иммунитета. В настоящее время разработаны вакцины против многих инфекционных болезней животных. Обычно их применяют с профилактической (вакцинопрофилактика) и реже лечебной (вакцинотерапия) целями. Наиболее широко применяется вакцинопрофилактика против бактериальных (сибирская язва, бру целлез, рожа свиней, сальмонеллезы и др.) и вирусных (бешенство, классическая чума свиней, чума плотоядных, ящур и др.) болезней.

Ведется интенсивная разработка вакцин против инфекционных бо лезней животных с применением генноинженерных методов на осно ве мутантов и рекомбинантов возбудителей и ДНК-вакцин. Это еще раз подчеркивает важную роль биотехнологии в борьбе с инфекцион ными болезнями сельскохозяйственных, домашних и диких живот ных.

Методы диагностики. Кроме классических вирусологических, серологических и иммунологических методов, в настоящее время применяются несколько новых, предложенных биотехнологией, ме тодов, а именно: иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и др. Эти методы революционизируют многие аспекты анализа и дают возможность проводить определение in situ без при менения сложных процедур выделения анализируемого вещества.

Кроме того, они легче поддаются автоматизации и более быстро вы полняются.

Для успешного применения методы должны быть быстрыми, точными и надежными;

простыми в выполнении и дешевыми;

ис пользовать готовые и стабильные реагенты;

требовать небольших за трат труда;

иметь высокую чувствительность и специфичность.

Обычно эти требования очень трудно совместить. Многие из методов уже применяются или проходят испытание с целью обнару жения возбудителей болезней растений и животных, а также монито ринга физиологического cостояния животных. Почти во всех случаях они были разработаны вначале для использования в медицине и очень быстро нашли применение в ветеринарии. Одновременно с этим уве личивается их применение в растениеводстве. ИФА в комплексе с по ликлональными и особенно МАт широко используется не только для диагностики, но и для выявления нежелательных примесей в продук тах питания. Метод зондов нуклеиновых кислот основан на принципе гибридизации комплементарных последовательностей ДНК или РНК, ПЦР – на амплификации ДНК (см. Ч.I).

Использование этих методов диагностики позволяет обнаружи вать инфекционные заболевания на очень ранней стадии заражения, на пример путем анализа физиологических жидкостей, что дает возмож ность выявлять больное животное еще до проявления клинических при знаков. Ранняя диагностика значительно облегчает ликвидацию того или иного заболевания. Многие болезни животных можно легко кон тролировать путем использования наборов (китов) ветеринаром или да же фермером. Широкое применение наборы находят при определении половых гормонов (таких как прогестерон, эстрогенсульфат, тестосте рон и др.), гормона роста и антибиотиков в молоке и крови животных. В настоящее время выпускаются сотни наименований таких наборов.

2.2. Биотехнология в растениеводстве C помощью генетической инженерии ставится задача не только улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при тради ционной селекции, но и получить растения, способные производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химиче ском производстве и других областях деятельности человека. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полез ные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, моди фицированные полисахариды, «съедобные» вакцины, антитела, ин терфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не за грязняющие окружающую среду, и многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступ ными для широкого потребления. По общему мнению, применение методов клеточной и генетической инженерии в сельском хозяйстве позволит улучшить свойства культурных растений (см. Ч.I).


2.2.1.Трансгенные растения Используя методы современной биотехнологии, гены можно вводить в растение с целью передачи ему нового признака, повы шающего урожайность. Однако при решении данной задачи возника ет ряд трудностей. Современные методы генетической инженерии хо рошо разработаны для признаков, зависящих от одного гена. В то же время ряд сложных признаков, таких как, например, рост контролиру ется несколькими генами, каждый из которых может оказывать опре деленное влияние. Поэтому в научном плане предстоит выяснить ме ханизм ряда сложных процессов. Несмотря на ряд нерешенных во просов, трансгенные растения постепенно внедряются в практику сельского хозяйства многих стран. В США ими занято наибольшее количество сельскохозяйственных угодий.

Культура растительных клеток и тканей. Растительные клетки могут культивироваться как на жидких, так и твердых средах. Исполь зуемые при этом приемы аналогичны культивированию микроорга низмов. Процесс начинают с взятия в асептических условиях кусочков ткани от молодого здорового растения, как правило, используют ли стья или ствол. Кусочки ткани помещают в подобранную питательную среду, содержащую необходимые для роста компоненты. После полу чения каллуса возможно продолжение его выращивания на твердой среде или получение суспензии клеток. Суспендированные раститель ные клетки по сравнению с клетками каллуса более гомогенны, быст рее растут и имеют повышенные адаптационные возможности.

Культуры растительных клеток могут быть использованы для биотрансформации химических соединений и для эффективного син теза биологически активных соединений. Основными недостатками метода считаются низкие скорости роста растительных клеток, высо кая вероятность заражения и генетическая нестабильность. Кроме это го в суспензии клеток происходят их агрегация и дифференцировка, в результате чего снижается активность. Этих недостатков лишены про цессы с использованием иммобилизованных растительных клеток.

Особенностью клеточных культур растений является их способ ность к тотипотенции (см. Ч.I), что часто используют при микрораз множении растений. Данная технология имеет существенные преиму щества, так как позволяет быстро получать материал для размножения растений, не содержащий возбудителей болезней;

круглогодично иметь посадочный материал и повышать его однородность;

длительно хранить генетический материал и создавать новые генотипы.

Техника слияния протопластов: гаплоидные растения. Методи ка наиболее отработана применительно к видам семейства паслено вых. Получены парасексуальные гибридные растения в родах Nicotiana (табак), Solanum (картофель), Lucopersicum (томат), кресто цветных и зонтичных. Имеются плодовитые, фенотипически нор мальные межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнеп сом и стерильные межвидовые гибриды картофеля и томатов, табака и картофеля, табака и беладонны, образующие нормальные стебли и корни. Удалось получить растения, гетерозиготные по внеядерным генам – гибриды, в которых от одного родителя получено ядро, а от другого – цитоплазма. В настоящее время исследования и уровень данной технологии достигли такого состояния, при котором стано вится возможным практическое применение метода для улучшения ряда культурных видов растений.

Основными направлениями работ по соматической гибридизации высших растений являются гибридизация клеток как средство расши рения рамок скрещивания;

слияние клеток и перенос или реконструк ция генов;

слияние клеток с целью переноса отдельных небольших фрагментов генома. При гибридизации соматических клеток возможно получение асимметричных гибридов, что может способствовать полу чению более устойчивых и функционально улучшенных растений.

Генетическая инженерия растений. Исследования в области ге нетической инженерии растений интенсивно проводятся во многих лабораториях. При использовании новейших генетических методов при работе с высшими растениями возникают не только технические трудности. Приходится решать более сложные научные проблемы, связанные с нарушением структуры генома культивируемых расти тельных клеток (изменение плоидности, хромосомные перестройки).

Интенсивно исследуются структура и функции плазмидных ДНК растений и возможности их использования в качестве векторов.

Проблема создания векторов для введения чужеродной ДНК в прото пласты растений считается наиболее сложной. Здесь наметились сле дующие подходы: 1) использование плазмид бактерий, заражающих растения в естественных условиях. При этом часть плазмиды встраи вается в ядерный геном растения-хозяина и функционирует в составе его генома;

2) использование бактериальных плазмид, «сшитых» с фрагментами ДНК хлоропластов или митохондрий растений, для соз дания челночных векторов, способных к репликации в клетках прока риот и экспрессии в эукариотических клетках;

3) использование ДНК-содержащих вирусов растений.

Для защиты чужеродного генетического материала, вводимого в протопласты растений, от разрушающего действия нуклеаз также раз рабатываются новые методы, например, ингибирование нуклеаз и создание механической защиты рекомбинантных ДНК. С этой целью можно использовать липосомы. С их помощью в клетки и протопла сты эукариот введены РНК вируса табачной мозаики, еще более крупная ДНК вируса ОВ40 и Ti-плазмида Agrobacterium tumifaciens.

Надежная защита липосомами нуклеиновых кислот особенно важна при манипуляции с протопластами растений. Примером реализован ного генноинженерного проекта является синтез фазеолина (запасно го белка фасоли) в регенерированных растениях табака. Введение ге на, кодирующего синтез фазеолина, проведено с использованием в качестве вектора Ti-плазмиды. С помощью этой плазмиды в геном растений табака внедрен ген устойчивости к неомицину. С помощью CMV-вируса в геном растений репы встроен ген устойчивости к ме тотрексату –ингибитору дигидрофолатредуктазы.

Генноинженерные манипуляции с растениями породили некото рые опасения, аналогичные тем, которые возникли в начале генетиче ских манипуляций с микроорганизмами. Как уже отмечалось, опасе ния связаны с возможностями выхода генетических векторов и транс генных растений из-под контроля биотехнологов. В этой связи выска зываются опасения превращения генноинженерных растений в сорня ки. Вероятность такого превращения очень мала и может произойти только в результате переноса нескольких генов. Однако устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к определенному препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду.

Кроме того, следует учитывать, что биохимические изменения растений в результате генноинженерных перестроек могут привести к утрате способности синтеза биологически полезных соединений и приобретению нежелательных признаков. Однако данная проблема существует и при традиционных методах селекции. Это выдвигает необходимость тщательного тестирования всех генноинженерных растений перед их переносом в полевые условия.

Основные пути развития генетики высших растений включают несколько направлений:

– придание растениям способности синтезировать дополнитель ные ценные продукты;

– повышение фотосинтетической эффективности растений;

– придание растениям диазотрофности;

– обеспечение устойчивости к неблагоприятным факторам внеш ней среды.

2.2.2. Биопестициды, биогербициды и биоудобрения Биопестициды. Использование химических пестицидов привело к заметному увеличению уровня производства продуктов сельского хо зяйства. Их широкое применение привело к тому, что один человек мо жет в настоящее время производить больше продуктов с меньшими за тратами, чем раньше. Однако потребители все больше беспокоятся о качестве продуктов и возможном сохранении остатков пестицидов в го товых пищевых продуктах. Биотехнологи в настоящее время интенсив но ищут замену химическим веществам, с помощью которых можно было бы бороться с вредителями и болезнями. Очевидным подходом является использование существующих в природе биологических мето дов борьбы. Известно, что все организмы болеют характерными только для них специфическими болезнями, а также имеют хищников, врагов, которые их уничтожают. В данном контексте, биологические методы борьбы связаны с использованием микроорганизмов, применением их в полевых условиях для борьбы с вредителями и болезнями. Кроме того, насекомые-хищники также могут быть использованы для этих целей.

Наиболее успешным агентом биоконтроля считается Bacillus thuringiensis, которая является спорообразующей бактерией, содер жащей кристаллические белковые включения. Её белки очень токсич ны для насекомых-вредителей и специфичны в проявлении их актив ности. Они уже более 30 лет широко используются против насеко мых, которые имеют в своем цикле размножения стадию гусеницы.

B. thuringiensis обычно применяется в виде спор или кристаллических включений, полученных после её разрушения. В настоящее время ген, кодирующий токсин, выделен и секвенирован. Токсин производится и применяется в виде рекомбинантного белка. Ген может быть также включен в различные виды растений. Таким образом, можно исполь зовать готовые микробные белки (биопестициды) или защищать рас тения путем встраивания гена, кодирующего токсичный белок, кото рый экспрессируется в ткани растения. Большое число компаний в настоящее время включилось в исследования, разработку и производ ство токсина B. thuringiensis. Кроме него на рынке постепенно появ ляется ряд новых грибковых и вирусных пестицидов. В природе рас пространены многочисленные виды энтомопатогенных грибков, по ражающих широкий круг насекомых, используя различные механиз мы, включая контактный, что облегчает их применение. Грибковые биопестициды имеют ряд преимуществ перед бактериальными.

Применение вирусов в качестве биопестицидов ограничено из за сложности получения их в необходимых количествах. Для решения этой проблемы необходимы развитие технологии клеточных культур насекомых, отбор и модификация штаммов вирусов.

Микроорганизмы или продукты их жизнедеятельности, которые могут использоваться в качестве биологических агентов при борьбе с насекомыми-вредителями, должны отвечать следующим требовани ям: действовать не хуже чем химические пестициды;

быть безопас ными, иметь низкую токсичность для других видов животных, не яв ляющихся мишенями;

быть стабильными при хранении и дешевыми при их массовом производстве;

применяться с помощью обычной технологии без значительных изменений методов, обычно используе мых в сельском хозяйстве. Имея указанные выше характеристики, микроорганизмы найдут постоянный рынок сбыта.

Биогербициды. Гербициды – химические препараты, предназна ченные для борьбы с сорняками, составляют около 50 % суммарного рынка химикатов для сельского хозяйства. Им свойственны те же не достатки, что и пестицидам. Поэтому необходимость в создании био гербицидов очевидна. Их можно получить на основе микроорганиз мов-патогенов растений, ферментов, а также полупродуктов, полу чаемых биоконверсией. Для борьбы с отдельными видами сорняков, устойчивых к химическим препаратам, применяют специфические и токсичные для них микроорганизмы. Наиболее часто используют грибковые фитопатогены и фитотоксины. Для расширения сферы их применения необходимо получение грибковых форм, более устойчи вых по отношению к изменяющимся условиям внешней среды. Бак териальные фитопатогены, в отличие от грибковых, менее чувстви тельны к факторам внешней среды, но и в меньшей степени поражают растения. Последние разработки в данном направлении обещают зна чительные перспективы. Кроме биопестицидов и биогербицидов, для защиты растений все шире применяют биологические препараты для борьбы с возбудителями заболеваний. В целом масштабы применения различных препаратов для борьбы с вредителями и возбудителями болезней сельскохозяйственных культур все более расширяются.

Биоудобрения. Интенсивное растениеводство обедняет почву азотом, так как значительная его доля ежегодно выносится из нее вместе с урожаем. С древних времен для восстановления и улучшения почв существует практика использования бобовых растений, способ ных в симбиозе с азотфиксирующими микроорганизмами восполнять почвенные запасы азота в результате диазотрофности. Большой по ложительный эффект от возделывания бобовых побудил ученых к изучению этого процесса. Как только была выяснена роль симбиоти ческих бактерий рода Rhizobium в азотфиксации, стали разрабатывать способы внесения этих микроорганизмов в почву и применять для инокуляции семян. Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы после выращивания на ней бобовых растений.

Азотфиксирующие микроорганизмы имеют специфический фермент нитрогеназу, в активном центре которой происходит активирование инертной молекулы N2 и превращение её в NH3:

N2 + 8 H+ + 8 e– + n АTФ 2 NH3 + H2 + n АДФ + n Ф.

В качестве носителя для бактерий были опробованы различные композиции: смеси торфа с почвой, добавки люцерны и соломы, пе регнившие опилки, бентонит и активированный уголь.

Бактерии рода Azotobacter являются свободноживущими азот фиксирующими микроорганизмами и обладают высокой продуктив ностью азотфиксации. Помимо связывания атмосферного азота эти бактерии продуцируют биологически активные соединения (витами ны, гиббериллин, гетероауксин и др.). В результате этого инокуляция азотобактерином стимулирует прорастание семян и ускоряет рост и развитие растений. Более того, Azotabacter способен продуцировать фунгицидные вещества. Этим угнетается развитие в ризосфере расте ний микроскопических грибов, многие из которых тормозят развитие растений. Однако бактерии рода Azotobacter весьма требовательны к условиям среды, особенно концентрации в почве фосфатов и микро элементов, и активно развиваются только в плодородных почвах. В последние годы для изучения биологической азотфиксации стали применять методы молекулярной биологии и новейшие методы гене тики. Обнаружены плазмиды, несущие гены азотфиксации, относи тельно легко передающиеся при конъюгации от одного штамма бак терии к другому. После этого появились надежды на получение мето дами клеточной и генетической инженерии растений, способных фик сировать атмосферный азот. Однако перенос генов азотфиксации и их экспрессия – чрезвычайно сложная задача. Основными трудностями являются неизученность регуляции взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и ко факторов, необходимых для функционирования нитрогеназы;

необхо димость проведения интенсивных исследований генетики растений с целью подбора эффективных растений-хозяев, а также исследований, направленных на модификацию генома микроорганизмов для получе ния организмов, способных существовать в симбиозе не только с бо бовыми растениями, но и, например, хлебными злаками.

Снабжение растений фосфатами. Фосфатные ионы в почве, как известно, не очень подвижны, поэтому вокруг корневой зоны рас тений часто возникает дефицит фосфора. Везикулярно-арбускулярная (ВА) микориза играет существенную роль в плодородии почвы, так как способствует поглощению растениями фосфатов из почвы. Эндо и экзомикоризы представляют собой особые структуры, формирую щиеся внутри или вокруг мелких корешков растений в результате за ражения почвенными непатогенными грибами. Благодаря этой мико ризе рост растений на бедных фосфатами почвах улучшается. Одно временно с поступлением фосфатов растения также обогащаются микроэлементами.

Доказано, что в растениях с микоризой концентрация гормонов роста выше, чем в ее отсутствии. Если ВА-микориза формируется в присутствии азотфиксирующих бактерий, у бобовых усиливается процесс образования клубеньков и азотфиксация. Для размножения эндофитов в почве нужна их инокуляция. Однако размножение гри бов происходит только в присутствии растения-хозяина. Для получе ния положительного эффекта необходимо вносить 2–3 тонны иноку лята на 1 гектар. Получать такие количества инокулята ВА-микоризы пока не представляется возможным. Для улучшения питания сельско хозяйственных культур фосфатами эффективен метод применения фосфобактерина. Препарат получают на основе спор культуры Bacillus megaterium (var. рhosphaticum). Эти бактерии превращают трудно усвояемые минеральные фосфаты и фосфорорганические со единения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды) в доступную для усвоения растениями форму. Следует отметить, что фосфобактерин не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них. При его наличии урожайность сельскохозяйственных культур повышается на 10 %.

Для защиты растений на основе бактерии Pseudomonas fluorescens получен препарат «P-2-79», подавляющий развитие свыше 40 видов микроорганизмов, поражающих пшеницу, ячмень, рожь. С помощью этого препарата проводят защиту семян сорго и кукурузы от антрактоза и ризоктониоза, хлопчатника и сои – от вилта и ряда других заболеваний. Для борьбы с фитофторозом яблонь предложено применение почвенной бактерии Enterobacter aerogenes. Защита мно гих овощных культур от заболеваний, вызываемых некоторыми вида ми микроскопических грибов, обеспечивается использованием препа рата на основе культур Trichoderma polysporum и T. viride.

Контрольные вопросы 1. Какова разница между традиционными и современными ме тодами изменения пород животных и сортов растений?

2. Какова роль фарм- и биопрепаратов в развитии животновод ства?

3. Назовите основные пути использования трансгенных живот ных и растений в сельском хозяйстве.

4. Каковы преимущества и недостатки получения и применения биопестицидов и биоудобрений?

5. Каковы основные пути применения методов клеточной и ге нетической инженерии в улучшении свойств культурных растений?

Лекция 3. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В настоящее время c помощью биотехнологии получают боль шое разнообразие веществ, необходимых человеку. Основными из них являются алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, антиметаболиты, антиоксиданты, белки, витамины, гербициды, инсектициды, кофер менты, липиды, нуклеиновые кислоты, органические кислоты, пигмен ты, ПАВ, полисахариды, полиоксиалканоаты, растворители, сахара, стерины, ферменты, нуклеотиды, нуклеозиды, эмульгаторы и др.

Биотехнология позволяет разработать безотходные технологии, направленные на нужды общества, имеющего ряд проблем (нехватка продуктов питания, энергии, охрану окружающей среды и т.д.). По многим направлениям биотехнологии новые современные технологии только зарождаются и необходимы большие субсидии и усилия в их дальнейшем развитии, но потенциал их огромен и разнообразен и нет сомнения, что они будут играть все возрастающую роль в промыш ленном производстве будущего.

3.1. Органические кислоты Органические кислоты широко используют в пищевой и фарма цевтической промышленности, в технике и в качестве химического сы рья. Отдельные органические кислоты (лимонную, яблочную) можно получать экстракцией из природного растительного сырья;



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.