авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 23 |

«КНИГА 2 Harrison's PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Eleventh ...»

-- [ Страница 7 ] --

Ввиду того что рецессивные заболевания требуют наследования мутации в одном и том же генетическом локусе от каждого родителя, то при редко встре чающихся генах вероятность того, что оба родителя будут носителями одного и того же дефекта, невелика. Однако если родители имели общего предка, который был носителем рецессивного гена, то вероятность того, что два потомка унасле дуют этот ген, становится достаточно высокой. Чем реже встречается рецессивный ген, тем выше вероятность того, что пораженный индивид произошел от родст венного брака. С другой стороны, некоторые рецессивные гены встречаются в популяции столь часто, что вероятность того, что два случайных родителя ока жутся его носителями, достаточно велика и без родственного брака. Для носи телей таких распространенных заболеваний, как серповидно-клеточная анемия, фенилкетонурия, кистозный фиброз и болезнь Тея — Сакса, число которых в определенных популяциях велико, родственные браки не характерны.

В США, как правило, родственные браки в семьях с рецессивными заболева ниями встречаются нечасто, вероятно, в силу того, что низка частота родствен ных браков популяции в целом. На большей части территории США (в отличие от областей с относительной географической изоляцией, таких как северная Норве гии и Швейцария) заболевание должно быть поистине редким, чтобы его связали с достаточной частотой родственных браков. Например, родственные браки ожи даются в значительной пропорции в семьях, в которых дети страдают очень ред кими заболеваниями, такими как синдром Лоренса —Муна — Барде — Бидля и абеталипопротеинемия.

Особый тип рецессивно наследуемых нарушений представляют генетические компаунды, при которых два мутантных гена пораженного индивида хотя и нахо дятся в одном генетическом локусе, но неидентичны. Возможно, мутации отцов ского и материнского аллелей приводят к различным повреждениям Д Н К одного и того же гена. Примером такого г е т е р о а л л е л ь н о г о компаундного со стояния является SC гемоглобинопатия;

в этом случае больной имеет ген гемо глобина S в одной хромодоме и ген гемоглобина С в гомологичной хромосоме.

Х-с ц е п л е н н ы е н а р у ш е н и я. Гены, ответственные за Х-сцепленные нарушения, расположены в Х-хромосоме, поэтому клинический риск и тяжесть заболевания различны для разных полов. Поскольку женщина имеет две Х-хро мосомы, она может быть гетерозиготной или гомозиготной по мутантному гену и признак проявится либо по рецессивному, либо по доминантному типу. Муж чины же имеют только одну Х-хромосому, поэтому можно ожидать, что у них в случае унаследования данного гена синдром проявится в полной мере безотно сительно того, рецессивно или доминантно проявляется этот признак у женщины.

Таким образом, термины Х-с ц е п л е н н ы й д о м и н а н т н ы й и Х-с ц е п л е н н ы й р е ц е с с и в н ы й относятся только к экспрессии данного гена у женщин.

Важнейшей чертой всякой Х-сцепленной наследственности является отсут ствие передачи признака от мужчины к мужчине (т. е. от отца к сыну). Это Qr®B СМйЭ-тООПИ Or® ® DrO Dr®. IU 6 _L * ) * J_ 06I _L * *& ~®Vn u * ©*гб Пораженные мужчина, И# Пораженные мужчина, •• Пораженные мужчина, женщина •О жвншинэ ^^ женщине ^^ ® ® Женщина-носитель ® Женщина-носитель Женщина-носитель ПО Здоровые мужчина, ПО Здоровые мужчина, П О Здоровые мужчина, женщина женщина женщина а б в Рис. 57-8. Родословная семьи с Х-сцепленным рецессивным признаком, а — обратите внимание на косой тип наследования;

б - пораженная женщина может родиться от брака пораженного мужчины и женщины-носителя, как в показанном здесь родственном браке;

в — у пораженного мужчины, женившегося на здоровой женщине, все сыновья здоровы, а все дочери - носители.

происходит потому, что мужчина обязан передать сыну свою Y-хромосому, а никак не Х-хромосому. Дочерям же, напротив, мужчина передает свою единст венную Х-хромосому.

Родословная на рис. 57-8 иллюстрирует характерные особенности Х-сцеп ленного рецессивного наследования. ( I ) В отличие от вертикальности передачи доминантных признаков (поражаются родители и дети) и горизонтальности пе редачи аутосомно-рецессивных признаков (поражаются братья и сестры) конфи гурация родословной при Х-сцепленных рецессивных признаках является скорее косой, поскольку признак проявляется у сыновей нормальных носительниц, яв ляющихся сестрами пораженных мужчин (поражаются дяди и племянники) (рис. 57-8а). (2) Сын женщины-носительницы имеет 5 0 % вероятность пора жения. (3) Все дочери, но не сыновья, пораженного отца являются носителями (рис. 57-8в). (4) Непораженный мужчина не передает этот признак потомству.

(5) Пораженная гомозиготная женщина может быть только дочерью поражен ного отца и матери-носительницы (рис. 57-86).

Примерами Х-сцепленных рецессивных заболеваний человека являются гемо филия А, нефрогенный несахарный* диабет, синдром Леша — Нихена, мышечная дистрофия Д ю ш е н н а, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, тестикулярная феминизация и болезнь Фабри. Цветовая слепота также наследуется как Х-сцеп ленный рецессивный признак. Однако этот дефект настолько распространен (встречается примерно у 8% мужчин белой расы), что нередки и женщины гомозиготы, страдающие этим нарушением зрения.

Х-сцепленная доминантная наследственность иллюстрируется в родословной на рис. 57-9. Она имеет следующие характерные особенности: 1 • женщины по ражаются примерно вдвое чаще мужчин;

2 — пораженная женщина передает заболевание половине сыновей и половине дочерей;

3 — пораженный мужчина передает заболевание всем дочерям и не передает сыновьям и 4 — синдром более вариабелен и менее выражен у гетерозиготных пораженных женщин, чем у геми зиготных пораженных мужчин. Одно общее заболевание, группа крови X g ( a - f - ), наследуется как Х-сцепленный доминантный признак, так же как и гипофосфате мический рахит (резистентный к витамину D ).

Некоторые редкие признаки могут наследоваться как Х-сцепленные доми нантные с возможным летальным исходом для гемизиготных мужчин. Харак терные особенности этой формы наследования иллюстрируются на рис. 57-10:

1 — нарушения отмечаются только у ж е н щ и н, гетерозиготных по мутантному гену;

2 — пораженная мать передает признак половине своих дочерей;

3 — по вышенная частота выкидышей у пораженных ж е н щ и н ;

абортируются поражен ные плоды м у ж с к о г о пола. В заболевания, которые, по-видимому, передаются по этому типу наследования, входят «недержание пигмента», очаговая гипер плазия к о ж и, орофасциодигитальныи синдром и гипераммониемия, вызываемые дефицитом орнитинтранскарбамилазы.

А Л гл Пораженная • Пораженный гемизиготный мужчина • '-' и непораженная женщина • Пораженная гетерозиготная женщина О Здоровый мужчина • О Здоровые мужчина, женщина 4 выкидыш (аборт) Рис. 57-9. Родословная семьи с Х-сцепленным доминантным признаком.

Рис. 57-10. Родословная семьи с Х-сцепленным доминантным признаком, ле гальным для гемизиготных мужчин.

Благодаря явлению Х-хромосом мой инактивации экспрессия Х-сцепленных признаков у женщин достаточна вариабельна. В раннем эмбриональном раз витии одна из двух Х-хромосом каждой соматической клетки женщины инакти вирована. Процесс инактивации несет случайностный характер, так что в каждой метке Х-хромосома, унаследованная от отца, и Х-хромосома, унаследованная от матери, может быть ииактивирована с равной степенью вероятности. Инакти внрованная Х-хромосома становится нефункциональной, так что все потомство первоначальной клетки наследует одни и те же активные и имактивированные Х-хромосомы. Таким образом, в среднем половина клеток организма любой жен щины экспрессирует Х-хромосому отца, а половина — Х-хромосому матери. Если какой-либо ген одной из ее Х-хромосом мутантен, то примерно половина клеток любой ткани будет нормальна, а другая половина проявит мутантный фенотип.

Однако у каждого данного индивида случай или отбор того или иного клопа клеток может нарушить эти пропорции. В зависимости от пропорций мутантных и нормальных Х-хромосом в каждой ткани генетически гетерозиготная женщина может быть либо клинически здоровой, либо страдать от более или менее выра женных проявлений болезни. Например, матери мальчиков с Х-сцепленной рецес сивной формой мышечной дистрофии Дюшснна могут временами страдать легкой формой этого заболевания (например, слабость тазового или плечевого поясов или гипертрофия икр).

В каждой клетке женщины нефункциональная Х-хромосома может быть визуализирована с помощью нескольких методов.

При обычном окрашивании инактивированная Х-хромосома на стадии мета фазы выглядит гетеропикнотичной (конденсированная), поздно реплицируется в митотическом цикле («поздняя метка» при использовании 'Н-тимндина). В неде лящихся клетках инактивированная Х-хромосома имеет вид комка хроматина на периферии ядра так называемый Х-хроматин, или тельце Барра. При патоло гических состояниях, когда число Х-хромосом больше двух, например, 47, XXX, инактивированы все Х-хромосомы, кроме одной, поэтому клетки организма жен щины могут содержать множественные Х-хроматиновые тельца (см. гл. 60).

Поскольку для экспрессии Х-сцепленного рецессивного признака достаточно одного мутантного аллеля, то родственные браки не увеличивают вероятность экспрессии у мужчин в отличие от случаев редких аутосомно-рецессивных за болеваний. С другой стороны, так же как и при доминантно наследуемых болез нях, причиной может быть новая мутация. В целом если Х-сиепленное рецессив ное поражение снизит биологическое соответствие до нуля, то одна треть пора жений у мужчин будет вызвана новыми мутациями, а одна треть пораженных родится от матерей, которые сами стали носительницами в результате новых мутаций. Таким образом, лишь одна треть поражений будет передаваться по родословной классического типа с косой передачей признака. Примером этого служит мышечная дистрофия Дюшена, заболевание, при котором гемизиготные мужчины поражаются столь тяжело, что никогда не дают потомства. В случае гемофилии А, при которой биологическое соответствие больше нуля, новые мута ции являются причиной примерно 20 % поражений мужчин.

В семьях, где Х-сцепленным рецессивным заболеванием поражен только один мужчина и других случаев заболевания в анамнезе нет, для выработки правильных генетических рекомендаций существенно необходимо подвергнуть мать заболевшего тщательному обследованию с применением биохимических или других соответствующих методов исследования с целью выяснения, не является ли она носительницей признака. Если она таковой является, то половина ее доче рей будут носительницами, а половина сыновей будут поражены заболеванием.

Если же болезнь ее сына обязана своим происхождением новой мутации, то толь ко его дочери унаследуют дефектный ген. В настоящее время биохимические методы исследования позволяют идентифицировать женщину как носительницу при нескольких Х-сцепленных заболеваниях, включая синдром Леша — Нихена, болезнь Фабри, гемофилию и мышечную дистрофию Дюшенна.

Важно различать Х-сцепленную наследственность и а у т о с о м н о - д о м и н а н т н у ю н а с л е д с т в е н н н о с т ь, с ц е п л е н н у ю с п о л о м. Алопе ция (облысение), по-видимому, наследуется как аутосомно-доминантный признак, однако проявляется в основном у мужчин и лишь изредка у женщин. У гетеро зиготных женщин ген облысения экспрессируется только в том случае, если в ее организме появляется тестостерон, как, например, в случае маскулинизирующей опухоли яичника.

Многофакторные генетические заболевания. Многие распространенные хро нические болезни взрослых (гипертензия, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, пептическая язвенная болезнь, шизофрения) и распространенные врож денные дефекты (расщепление губы и неба, расщелина позвоночника, врожден ная болезнь сердца) давно известны как «семейные» нарушения. Они наилучшим образом попадают в категорию многофакторных генетических заболеваний. Гене тический элемент этих нарушений редко проявляется по принципу «все или ни чего», как в случае болезней, наследуемых по закону Менделя или при хромосом ных аберрациях. Скорее это взаимодействие многих генов с многочисленными внешними факторами, которые и приводят в результате к агрегации заболевания в семье.

В многофакторных генетических заболеваниях всегда присутствует п о л и г е н н ы й к о м п о н е н т, состоящий из последовательности генов, кумулятивно взаимодействующих друг с другом. Индивид, унаследовавший соответствующую:

комбинацию этих генов, переходит «порог риска»;

с этого момента уже к о м п о н е н т о к р у ж а ю щ е й с р е д ы определяет, будет ли иметь место клиниче ское поражение данного лица и в какой степени. Для того чтобы такой же синд ром проявился у другого члена этой семьи, он должен унаследовать идентич ную или подобную комбинацию генов. Поскольку каждый из близких родствен ников пораженного индивида (родители, родные братья и сестры, дети) имеет половину его генов, то все они рискуют приобрести тот же полигенный синдром.

Более отдаленные родственники (дяди, тети, дедушки и бабушки) имеют в сред / 1 \ нем одну четвертую часть генов данного индивида { —т- ), а дальние род / 1 \ сгвенники (двоюродные) — одну восьмую f - я - ) • Таким образом, чем отда леннее степень родства, тем меньше вероятность для родственника унаследовать ту же комбинацию генов. Кроме того, вероятность для любого родственника уна следовать «рискованную» комбинацию генов уменьшается по мере увеличения числа генов, необходимых для экспрессии данного признака.

Поскольку точное число генов, ответственных за полученные признаки, неиз вестно, трудно рассчитывать риск наследования для родственников пораженного индивида, поэтому стандарт основывается на эмпирических оценках риска (т. е.

прямым подсчетом пропорции пораженных родственников в ранее зарегистриро ванных семьях). В противоположность «менделевым» заболеваниям, при которых 25 или 50 % близких родственников пораженного пробанда находятся в состоя нии генетического риска, при многофакторных генетических нарушениях, как это установлено эмпирически, поражается не более 5—10% близких родственников.

Более того, по контрасту с «менделевыми» признаками риск повторения много Т а б л и ц а. 57-/, Эмпирические оценки риска для некоторых общих миогофакторных генетических болезней взрослых Оценки абсолютного риска |,и.|1Ч1н, в HOKiijnrtMbiKiM случае.чля (ыижайших родгмч-н НИКОВ. % Расщепление губы и/или неба Врожденное заболевание сердца Ишемическая болезнь сердца 8 для родственников муж ского пола 3 для родственников жен ского пола Сахарный диабет 5 Эпилепсия 5 Гипертсизим Маниакально-депрессивный психоз 10--- Псориаз 10 Шизофрении [олезни щитовидной железы (аутоиммунные нарушения, включая гипертиреоз.

тиреоидит, первичную микседему, зоб) факторных условий меняется от семьи к семье и его оценка в значительной сте пени зависит от двух факторов: количества уже пораженных членов семьи и ги жести заболеваний в показательном случае. Чем больше число пораженных родственников и чем тяжелее заболевание, тем выше риск для остальных родст венников. Например, риск для братьев и сестер ребенка с односторонне расщеп ленной губой иметь тот же дефект составляет примерно 2,5 %, однако если рас щепление в показательном случае двусторонне. то соответствующий риск возра стает до 6 %. В табл. 57-5 приводится степень риска (найденная эмпирически) иметь в семье повторный случай возникновения некоторых многофакторных гене тических заболеваний.

Гипотеза о полигенном компоненте в наследовании многофакторных забо леваний получила в последние годы солидное обоснование. Установлено, что по крайней мере одна треть всех генных локусов содержит полиморфные аллели, различающиеся у разных индивидов. Столь большая степень вариаций в нор мальных генах, несомненно, создает основу для вариаций в генетической пред расположенности, с которой могут взаимодействовать факторы внешней среды.

Насколько сейчас известно, наиболее очевидно асебциируются с предрасполо женностью к специфическим заболеваниям генетические локусы, образующие HLA-систему (называемые также г л а в н ы м г е н н ы м к о м п л е к с о м г и с т о с о в м е с т и м о с т и ) (см. гл. 63). HLA-комплекс находится в коротком плече хромосомы 6. Он состоит из четырех" тесно сцепленных, но тем не менее различных локусов (А, В. С, D). Продуктом этих генов являются белки, обнару живаемые на поверхности тела клеток и позволяющие иммунной системе инди вида отличать собственные клетки от чужеродных. В популяции каждый Н1.А-ло кус состоит из многочисленных аллелей, каждый из которых продуцирует иммуно логически различные белки. Например, индивид может унаследовать любые два из 20 аллелей локуса HLA-B.

Важный результат был получен в последние годы. Было найдено, что опре деленные аллели HLA-локусов определяют предрасположенность индивида к не которым специфическим заболеваниям. Например, если человек наследует аллель В-27 в локусе HLA-B, то вероятность развития у него анкилозирующего спонли лита в 121 раз больше, чем для человека, у которого этого аллеля нет (табл. 57-6).

И тем не менее анкилозирующий спондилит остается многофакторным заболева нием, поскольку для его развития определенно необходимы один или несколько факторов, помимо аллеля В-27. По этой причине болезнь развивается менее чем у 15 % людей, унаследовавших этот аллель. В табл. 57-6 перечислены некоторые Т а б л и ц а 57-6. Аллели HLA-локусов, ассоциированные с многофакторными генетическими болезнями HLA Болезнь Специфиче- Относитель локус ский аллель ный риск * в Анкилозирующий спондилит В27 В В Синдром Рейтера В27 В Псориаз с артритом «Чревная» болезнь В В Хронический активный гепатит В В В В8 " Миастения Сахарный диабет (инсулинозави DR3/DR DR симый) DR Гипертиреоз DR3 Болезнь Аддисона В8 В DR DR DR DR Рассеянный склероз " Относительный риск определяется как частное от деления вероятности развития забо левания у индивида -- носителя специфического аллеля на вероятность развития этого же заболевания у индивида, не являющегося носителем аллеля.

заболевания, ассоциированные с аллелями HLA-локусов. Подозревают, что неко торые из них имеют вирусную этиологию, что предполагает способность Н1.А локусов диктовать тип экспрессии определенных вирусных болезней. Более де тальное обсуждение HLA-системы приводится в гл. 63.

Многофакторные заболевания гетерогенны в том смысле, что сравнительный вклад в этиологию полигенных факторов («генов риска») и факторов окружаю щей среды сильно варьирует у разных индивидов. Необходимо, однако, помнить, что среди распространенных фенотипов, которые являются весьма многофак торными, небольшая доля будет определяться главными мутантными генами.

Например, ишемическая болезнь сердца хотя и имеет обычно многофакторную этиологию, но около 5 % лиц с ранним инфарктом миокарда гетерозиготны по семейной гиперхолестеринемии, одногенному нарушению, вызывающему атеро склероз, и при отсутствии какого-либо другого фактора предрасположенности.

Аналогично у небольшой части больных с другими распространенными заболе ваниями • - язвенной болезнью или выраженной гипертензией этиология заболе • ваний не многофакторная, а одногенная, такая же, как при синдроме множест венной эндокринной аденомы — язвы желудка или как при синдроме медулляр ной тиреокардиномы — феохромоцитомы соответственно.

Взаимодействие между генетическими и внешними факторами Многие болезни являются результатом взаимодействия специфического гено типа со специфическим внешним фактором. В частности, унаследованные одно генные мутации могут вызывать идиосинкразические реакции на определенные лекарственные средства, создавая угрозу здоровью, а часто и жизни больного.

В табл. 57-7 приведен список наиболее важных из этих ф а р м а к о г е н е т и ч е с к и х з а б о л е в а н и й, охватывающий все «менделевы» типы наследо вания. Пожалуй, наиболее распространен дефицит глюкозо-6-фосфатдегидроге назы, Х-сцепленный рецессивный признак, при котором целый ряд лекарственных препаратов может вызвать внезапную гемолитическую анемию. К примерам ауто еомно-рецессивных признаков относятся дефициты псевдохолинэстеразы плазмы крови и трансацетилазы печени, при которых катаболизм лекарственного пре-.

парата изменяется таким образом, что введение мышечного релаксанта дитилина Т а б л и ц а 57-7. Примеры наследуемых нарушений, включая аномальную реакцию на лекарственные средства Нарушение Нарушения на моле- Тип наследова- Частота встречаемости Клиническое прояв- Лекарственные сред кулярном уровне ния ление ства, вызывающие аномальную реакцию Медленная инак- Аутосомно- ре- Около 50 % населения Полиневрит Изониазид, сульфади Изониазидацетила тивация изониа- за в печени цессивный США мезин, сульфамап зида рин (Sulfamaprine) фенелзин (Phenelzi пе), диапсон, гидра лазин Апноэ Дитилин Чувствительность Псевдохолинэсте- Аутосомно-ре- Несколько мутантных к дитилину раза в плазме цессивный аллелей, для наибо лее общих частота поражения ~1 из Нечувствитель- Измененный рецеп- Аутосомно-до- Редко встречающееся Невозможность до- Варфарин ность к варфа- тор или гормон минантный стижения анти рину в печени с повы- коагуляции при шенной аффинно- применении обыч стью к витами- ных доз препа ну К рата Глаукома Неизвестна Аутосомно-до- Распространенное Повышенное внут- Кортикостероиды минантный риглазное давле ние Злокачественная Неизвестна Аутосомно-до- ~1 на 20 000 анесте- Тяжелая гиперпи- Анестетики типа фто минантный гипертермия зированных больных рексия, ригид- ротана, дитилина ность мышц, метоксифлуорана смерть (Methoxyf luorane), эфира для наркоза циклопропана Продолжение Тип наследовав Нарушения на моле Нарушение Частота встречаемости Клиническое прояв- Лекарственные сред кулярном уровне ния ление ства, вызывающие аномальную реакцию Нестабильные ге моглобины:

Сульфаниламиды Гемоглобин Цу- Замена в (5-цепи ар- Аутосомно-до- Редко встречающееся Гемолиз риха гинина в 63-м по- минантный ложении на гис тидин Гемоглобин Н Гемоглобин, состоя- Аутосомно-до- Редко встречающееся Гемолиз Сульфнсоксазол (Sul щий из четырех минантный Fisoxazole) Q nunaS р-цспси Анальгетики, сульфа Дефицит глюкозо- Около 100 млн больных Гемолиз Х-сцепленный 1-6-ФД в эритроци 6-фосфатдегид- в мире, обычно это ниламиды, антима тах рецессивный рогеназы лица африканского, лярийные средства.

средизем номорс кого нитрофурантоин.

и азиатского проис- другие лекарствен хождения;

множест- ные препараты венные мутантные аллели Из: Е. S. Vessell. - New Engl. J. Med., 1972, 287. 904.

или антитуберкулезного препарата изониазида может привести к остановке ды хания или к периферической невропатии соответственно. Злокачественная гипер термия является примером аутосомно-доминантного признака, при котором введе ние хотя бы одного из нескольких анестетиков может привести к остр,ой. гипер пирексии, ригидности мышц и гиперкалиемической остановке сердца. Острая перемежающаяся порфирия также является генетическим заболеванием, обо стряемым препаратами из группы барбитуратов.

Неправильная интерпретация неблагоприятной реакции на лекарственные средства может причинить серьезный вред больному. В общем случае любую необычную идиосинкразическую реакцию нужно рассматривать как генетически предопределенную до тех пор, пока не доказано обратное. По счастью, фармако генетические нарушения относятся к той группе болезней, для которых терапев тическая стратегия очевидна: больному и его родственникам следует избегать применения лекарственных средств, оказывающих на них отрицательное воздей ствие.

Помимо лекарственных препаратов, специфические генетические признаки могут обострять и другие внешние факторы. Дым от сигарет может разруши тельно действовать на гомозигот и, возможно, на гетерозигот по дефициту ai-антитрипсина, склонных к развитию эмфиземы. Больные с ксеродермальным пигментозом и с ангидратической эктодермальной дисплазией необычайно чувст вительны к солнечному свету и высокой температуре соответственно. Неупотреб ление молока в раннем возрасте предотвращает многие осложнения, которые в противном случае возникают у лиц с галактоземией.

Особенно важна роль взаимодействия генетических факторов с факторами внешней среды при беременности. Женщины, страдающие фенилкетонурией, могут во время беременности накапливать в плазме большое количество фенила ланина, и их дети впоследствии могут страдать от ряда врожденных дефектов, вызываемых этой аминокислотой, даже если у них самих фенилкетонурии нет.

Другими примерами заболеваний, вызываемых неблагоприятными генетическими отношениями «мать — плод», являются эритробластоз, вызываемый резус-несов местимостью, и диабетическая эмбриопатия ряд фундаментальных врожденных дефектов, возникающих у 5 % детей женщин, во время беременности страдавших диабетом).

Список литературы Harris H. The Principles of Human Biochemical Genetics, 3d ed. — New York:

American Elsevier, 1980.

Lewin B. Genes, 2d ed. — New York: Wiley, 1985.

McKusick V. A. Mendelian Inheritance in Man: Catalogs of Autosomal Dominant, Autosomal Recessive and X-Linked Phenotypes, 6th ed. — Baltimore;

Johns Hopkins, 1983.

McKusick V. A. The human map. — Clin. Genet., 1985, 27, 207.

Stanbury J. B. et al. The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed. — New York: McGraw-Hill, 1983.

Vogel F., Motulsky A. G. Human Genetics: Problems and Approaches, 2d ed. — Berlin;

Springer-Verlag, 1986.

Г Л А В А МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА И МЕДИЦИНА Артур Л. Беадет (Arthur L. Beaudet) Геном человека состоит примерно из 3 • 109 пар оснований ДНК и кодирует от 30 000 до 100 000 белков. Количественно длина ДНК часто оценивается в ты сячах оснований (килооснования, ко);

например, длина генома человека равна 3 млн ко. Каждый индивид наследует две копии генома, а ДНК упаковала в 23 пары хромосом, каждая из которых содержит единственную линейную двойную молекулу ДНК- Большая часть последовательностей ДНК, ответственных за кодирование белков, представлена в геноме уникальными (если рассматривать одну копию) последовательностями. Многие продукты генов проявляют сходство в последовательности аминокислот и могут рассматриваться как члены больших генных семейств, например, генного семейства глобинов. Большое количество со держащейся в геноме ДНК, по-видимому, нефункционально. В геноме присут ствуют также сотни или тысячи повторяющихся последовательностей ДНК, функ ции которых неясны. Некоторые из этих последовательностей рассеяны по ге ному, другие сгруппированы в кластеры.

Если бы кто-то захотел отпечатать одну копию одной нити генома человека, то такая копия заняла бы объем, в 170 раз превышающий объем данного изда ния. Эту аналогию можно продолжить и далее: такая книга должна печататься в 46 отдельных томах, каждый из которых служит эквивалентом одной хромосомы.

Индивид наследовал бы один отцовский набор из 23 томов и один материнский также из 23 томов. Серповидно-клеточная анемия была бы эквивалентом изме нения одной буквы на определенной странице определенного тома каждого на бора. Делеция генного кластера а-глобина при а-талассемии была бы представ лена утерей одной или двух страниц текста в каждом наборе. Расщепление ге номного ДНК ферментами рестрикции (рестриктазами), которые опознают спе цифические короткие последовательности ДНК и разрезают молекулу в этих сайтах, было бы эквивалентно разрезанию строки текста всякий раз, когда в нем встречается специфическое слово.

Для генома человека характерны два типа полиморфизма. Один состоит в изменчивости первичной последовательности ДНК, а другой связан с биологиче ской значимостью таких вариаций. Если начинать рассмотрение с одиночного ну клеотида, то последовательность ДНК в геноме человека может быть в данной позиции вариабельной или сравнительно постоянной. Например, ДНК-основание следовало бы считать весьма вариабельным в случае, когда 50 % генов в по пуляции содержит в данной позиции нуклеотид А (аденин), 40 % генов — ну клеотид Г (гуанин), а 10 % — нуклеотид Ц (цитозин). Позиции нуклеотидов, в которых более 1 % генов имеют последовательность, отличающуюся от таковой у большинства генов, называются п о л и м о р ф н ы м и с а й т а м и. Лишь одна из каждых 200 или 500 нуклеотидных позиций классифицируется как полиморф ная. Большинство нуклеотидных позиций сравнительно неизменны, т. е. в подав ляющем большинстве случаев образуют одну и ту же последовательность. Ос тальные позиции варьируют с промежуточной частотой. Вариации нуклеотидных последовательностей больше представлены в нефункциональных частях генома и меньше в тех его областях, которые кодируют белковые последовательности или выполняют другие важные функции. В результате каждая копия генома чело века отличается от любой другой копии миллионами комбинаций последователь ностей. Вариации нуклеотидов можно рассматривать как серийный номер, состоя щий из многих миллионов цифр, выбитый на каждой копии генома человека.

Вариабельность первичных последовательностей простирается далеко за преде лами одноосновных изменений вплоть до наличия или отсутствия целых сегмен тов ДНК. В действительности длина генома человека может заметно варьиро вать. Наблюдаются и другие виды вариаций, такие как инверсии последователь ности ДНК и транслокации между хромосомами.

Второй вид генетических вариаций относится к воздействию на фенотип.

Изменение единственного нуклеотида или единственного гена может приводить к драматическому эффекту. В самом деле, изменение определенной последователь ности ДНК может оказаться летальным на стадии гаметы, оплодотворенного яйца или нредимплантационного эмбриона. Эти феномены, когда единственное изменение оказывает значительное воздействие на фенотип, относятся к одноген ным нарушениям;

вплоть до настоящего времени одногенные нарушения лежат в фокусе большинства попыток понять природу генетических болезней человека.

Однако большинство различий в нуклеотидных последовательностях между ге номами людей не приводит к заметному воздействию на фенотип. Существует непрерывная последовательность вариаций ДНК, фенотипический эффект которых простирается от нуля до незначительного, до малого, до умеренного, до значи тельного, до катастрофического. Во многих случаях многочисленные генетиче ские лакусы должны взаимодействовать друг с другом и/или с факторами внеш ней среды, чтобы оказать воздействие на фенотип. Например, подверженность атеросклерозу, вероятно, определяется взаимодействием вариаций генов липопро теина, липопротеиновых рецепторов, генов, определяющих промежуточный мета болизм, и многих других с внешними факторами (питание, курение и т. д.). Таким образом, вариации последовательностей ДНК совместно с теми биологическими эффектами, которые вызываются этими вариациями, создают индивидуальность.

Люди, вероятно, так же различаются по склонности к гипертензии, атеросклерозу, раку, ожирению и психическим расстройствам, как по внешности и отпечаткам пальцев.

Анализ генома человека Мощь методов рекомбинантной ДНК. Размеры, сложность и вариабельность генома человека служат препятствием для анализа индивидуальных особенностей и генов. Выполнимость такого анализа стала реальной в основном благодаря развитию техники рекомбинантной ДНК. Эта техника, позволяющая за один раз анализировать по одному фрагменту ДНК, приписала индекс геному человека и дала возможность находить и изолировать отдельные гены, сегменты генов и последовательности нуклеотидов из обширной библиотеки ДНК. Один из наибо лее мощных методов, так называемый метод клонирования ДНК, позволяет изо лировать индивидуальные гены или части генов, создавать неограниченное коли чество копий таких фрагментов ДНК, транскрибировать и транслировать изоли рованные гены. Различные гены и их продукты могут затем использоваться для разнообразных исследований структуры и функции генов в нормальных и пато логических состояниях. Другие методы рекомбинантной ДНК дают возможность анализировать генетические варианты у индивидов, непосредственно используя клинические препараты. Используя метод ДНК-гибридизации и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), описываемые ниже, можно анали зировать болезнетворные признаки как непосредственно, так и по генетическому сцеплению полиморфных сайтов.

Клонирование ДНК состоит и ИЗОЛЯЦИИ фрагментов ДНК, включении их в нуклеиновую кислоту от другого биологического источника (вектор) для мани пуляции и размножения. Чаще всего в качестве векторов для этих целей исполь зуют илазмиды бактерий, геном которых состоит из небольшой кольцевой двух нитевой ДНК. Кроме прочих достоинств, эти плазмиды могут кодировать рези стснтность к многочисленным антибиотикам, а бактерии, содержащие эти плаз миды, могут быть легко изолированы по их резнстентности к антибиотику. Плаз миды содержат сайт начала репликации ДНК и существуют в бактериальной клетке как внехромосомная ДНК. Одна бактерия может содержать много копий млазмидного генома, что обеспечивает как высокий уровень экспрессии клониро ванного гена, так и простоту выделения плазмидной ДНК.

Другая группа векторов производится из модификаций бактериофага Я,.

Эти бактериофаги могут усвоить до 15 000 пар оснований вводимой ДНК и удоб ны для создания библиотек ДНК. Коемидные векторы конструируются из фраг ментов бактериофагов и плазмид, такие космиды могут усваивать даже более длинные сегменты вводимой ДНК и объединяют в себе многие технические досто инства как Х-векторов, так и плаэмидных векторов. Молекулы рекомбинантной ДНК выращиваются и манипулируются в организме-хозяине, таком как Е. coli.

Часто для рекомбинации используют штаммы микроорганизмов с поврежденными генами, что понижает вероятность перестройки клонируемой «чужой» ДНК.

Развитие методов клонирования геноэ и других сфер применения техники рекомбинантной ДНК опирается -на специфичность гибридизации нуклеиновых кислот и использование ферментов, расщепляющих ДНК в специфических сайтах (рестрикционные эндонуклеазы).

Г и б р и д и з а ц и я н у к л е и н о в ы х к и с л о т. Многие этапы анализа методом рекомбинантной ДНК основаны на том, что природа комплементарного взаимодействия нуклеиновых кислот есть не что иное, как спаривание оснований при синтезе ДНК и РНК (см. гл. 57). Линейные отрезки двухнитевой (нативной) ДНК подвергают тепловой обработке или обработке щелочью, при этом две нити разъединяются и образуется однонитевая (денатурированная) ДНК. Денатуриро 6—77 Нае III 5'-Г-Г I Ц-Ц-3Ц-Ц-3 Рис. 58-1. Специфичность последова З ' - Ц - Ц I Г - Г - 5' тельностей Д Н К и нуклеазная актив З'-Ц-Ц ность для трех рестрикционных эндо нуклсаз.

Нае III образует слепые концы, а два дру гих фермента — однонитевые.

Hind m. S ' - A I A - Г - Ц - Т - Т - З ' 3' - Т - Т - Ц - Г - А IА - 5' 5'-Ц-Ц|Т-1Ч-А-Г-Г-3' MSt " 3'-Г-Г-А-гУ-Т|Ц-Ц-5' ванную Д Н К инкубируют при таких условиях, когда происходит гибридизация нуклеиновых кислот, т. с. взаимное распознавание двух комплементарных нитей и реформация двухнитевой молекулы посредством спаривания оснований. Гибри дизация нуклеиновых кислот столь чувствительна, что однонитевую молекулу Д Н К можно специфически гибридизировать с комплементарной нитью Д Н К или РНК, даже если эта специфическая нить одна на 10 000 неспецифических.

Часто при исследованиях методом рекомбинантной Д Н К приготавливают одну радиоактивную нить нуклеиновой кислоты, которую затем используют при анализе в качестве зонда. Можно идентифицировать и различать как полностью, так и частично гомологические последовательности. Специфичность гибридизации ну клеиновых кислот, иногда в совокупности с другими методами, позволяет обна ружить единственный ген среди десятков тысяч или вирусную последователь ность в массе других последовательностей нуклеиновых кислот.

Р е с т р и к ц и о н н ы е '• н д о н у к л е а з ы. Открытие в микроорганизмах рестрикционных эндонуклеаз, широко известных под названием ферментов ре стрикции, или рестриктаз, обеспечило возможность манипуляций рекомбинантной Д Н К. Эти ферменты опознают специфическую олигонуклеотидную последователь ность в двухнитевой Д Н К и разрезают Д Н К в данном сайте. Многие рестрик тазы опознают различные последовательности Д Н К (рис. 58-1). Некоторые фер менты распознают только четырехнуклеотидные последовательности. Например, фермент Нае I I I разрезает последовательность 5'ТГЦЦ-З'. Другие ферменты — последовательности из шести нуклеотидов. Рестриктаза Hind I I I разрезает после довательность 5'-ААГЦТТ,-3' (Т-тимин). Другие рестриктазы, например Mst I I, распознают последовательность из семи пар оснований, но при этом безразличны к паре нуклеотидов по средней позиции. Специфичность рестриктаз по отноше нию к последовательностям является мощным инструментом для расщепления больших геномов. Когда Д Н К человека расщепляется любой конкретной рестрик тазой, образуются сотни тысяч фрагментов Д Н К, причем с замечательной вос производимостью. Длина фрагментов может варьировать от единиц до несколь ких тысяч нуклеотидов в зависимости от выбранной рестриктазы. Ферменты, опознающие четырехосновные последовательности, разрезают Д Н К на меньшие фрагменты, чем ферменты, опознающие последовательности из шести пар нуклео тидов. Использование разнообразных рестриктаз при анализе конкретного сег мента Д Н К дает возможность построить подробную карту рестриктазочувстви тельных сайтов данного сегмента. Такая карта может покрывать область от не скольких сот до десятков тысяч пар оснований Д Н К. Как будет описано ниже, вариации последовательностей этих сайтов можно использовать для анализа вариаций генома человека. Кроме того, специфичность рестрикционных эндо нуклеаз и последовательности нуклеотидов используется, как это будет проде монстрировано ниже, для анализа различий в последовательностях конкретных сайтов в геноме человека.

С а у з е р н - б л о т т и н г (блоттинг по Саузерну). Многие виды анализа генома человека основаны на специальном приложении Д Н К - Д Н К гибридиза ции, так называемой блоттинг-процедуре, предложенной Е. М. Southern. В клини ГЕНОМНАЯ ДНК РАСЩЕПЛЕНИЕ РЕСТРИКТАЗОЙ ПДРФ t ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ВГЕЛЕАГАРОЗЫ© МЕМБРАНА АВТОРАДИОГРАММА ГИБРИДИЗАЦИЯ С РАДИО АКТИВНЫМ ЗОНДОМ Рис. 58-2. Анализ геномной Д Н К блоттин!-методом по Саузерну.

ческих приложениях Саузерн-блоттинг (рис. 58-2) начинается с выделения геном ной Д Н К из таких клеток,-как лейкоциты периферической крови или клетки амниотической жидкости. Высокомолекулярную геномную Д Н К расщепляют подходящей рестриктазой на серии воспроизводимых фрагментов. Фрагменты Д Н К разделяют электрофорезом на агаровом геле. После электрофореза Д Н К переносят с геля на мембрану, которая связывает Д Н К. Мембрану обрабаты вают для денатурации Д Н К и пропитывают раствором, содержащим зонд из радиоактивной однонитевой нуклеиновой кислоты. Зонд формирует двухнитевой комплекс нуклеиновой кислоты в тех местах мембраны, где имеется гомологич ная Д Н К. Затем мембрану промывают для удаления несвязанной радиоактив ной нуклеиновой кислоты, а те участки мембраны, которые содержат гомологич ную Д Н К и, следовательно, зонд, определяются с помощью рентгеночувствитель ной пленки. Высокая чувствительность Саузерн-блоттинга достигается расщепле нием Д Н К на малые фрагменты, фракционированием фрагментов и использова нием высокочувствительного метода детектирования искомых специфических фраг ментов (гибридизированной нуклеиновой кислоты). В целом этим методом можно обнаружить фрагменты геномной Д Н К, представляющие собой одиночный ген, или, например, одну миллионную часть генома. Клиническая мощь Саузерн-блот тинга заключается в возможности анализировать крохотную часть геномной Д Н К, взятой у больного.

Аналогичная процедура анализа РНК была названа н о р с е р н - б л о т т и н г о м (по контрасту с Саузерн). С помощью этой процедуры можно обна ружить наличие или отсутствие конкретной РНК. а также ее примерный размер.

Термин в е с т е р н - б л о т т и н г описывает производную процедуру, предназ Т а б л и ц а 58-1. Аналитические блоттинг-процедуры Блот-метод ' Фракциони Анализируе- Детектирование мый мате- рование риал Саузерн Электрофо- Гибридизация нуклеиновой кислоты ДНК рез Норсерн Электрофо- Гибридизация нуклеиновой кислоты РНК рез Вестерн Электрофо Белок Иммунологическое рез П р и м е ч. п е р е в. В названии методов обыгрывается смысловое значение фами лии Sauthern • - южный, отсюда Northern северный и Western западный.

наченную для анализа белковых антигенов. При этом белки разделяют электро форезом и переносят на твердую мембрану. Мембрана инкубируется с антите ламп, а затем связанные антитела детектируются ферментным или радиоактивным анализом. Таким образом, Саузерв-блоттинг, норсерн-блоттинг и вестерн-блот тинг включают в себя фракционирование и технику детектирования и обеспечм иают чувствительные методы для анализа соответственно ДНК. РНК и белкой (табл. 58-1).

И л л ю с т р а ц и я с т р а т е г и и к л о н и р о в а н и я Д Н К. Техниче ские аспекты клонирования ДНК будут описаны вкратце, подробно см. Watson.

Многие из ранних успешных попыток клонирования генов эукариотов состояли в выделении мРНК из гех тканей, в которых содержалось большое количество соответствующего генного продукта, например глобина, иммуноглобулина или альбумина. С помощью обратной транскриптазы создавалась копия первой нити ДНК. комплементарный мРНК (кДНК). Вторая нить ДНК копировалась по пер вой с помощью ДНК-полимеразы К. coli. ДНК-вставка и ДНК-вектор гибрнди зировались и вводились в Е. coli, где мозаичные молекулы репарировались, сли вались и образовали плазмиды рекомбинантной ДНК, содержащие чужерод ную ДНК-вставку. В процессе последующего роста и размножения Е. coli проду цировала нелимитированные количества искомой последовательности ДНК. Такая генеральная стратегия клонирования последовательностей кДНК может оказаться полезной и сейчас.

Современные стратегии клонирования генов или последовательностей ДНК используют ту или иную комбинацию следующих подходов: доступность антител к генному продукту;

доступность данных об аминокислотных последовательностях генных продуктов;

специфичность нуклеинокислотной гибридизации;

знания о биологии дифференцированных систем;

анализ биологической функции продукта клонированного гена.

Для частичного выделения специфической мРНК, которую можно использо вать для клонирования по описанному выше методу, может быть применена им мунопреципитация полисом с антителами к белку. Другая стратегия опирается на приготовление библиотек кДНК по мРНК, выделенных из специфических источ ников, таких как печень, мозг или культура фибробластов человека. Каждая мРНК будет представлена приблизительно в соответствии с ее содержанием в каждой ткани. После клонирования эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу для идентификации последовательностей, экспрессированных в соот ветствующих тканях.

Иногда клонированию ДНК могут способствовать функциональные свойства самого клонируемого гена. Продуцируемые ферменты способны компенсировать дефициты, присущие бактериям, или продукты эукариотических гонов, производи мые бактериями, могут иметь легко тестируемые биологические свойства или могут быть идентифицированы специфическими антителами. Если известна ами нокислотная последовательность белка, то специфичность генетического кода допускает обратную трансляцию этой последовательности в последовательность нуклеотидов с приемлемой неопределенностью. Затем можно синтезировать одно нитевые олигонуклеотидные зонды и использовать их для скрининга клониро ванных библиотек Д Н К методом гибридизации с целью идентификации последо вательностей, кодирующих данный белок (см. гл. 57). С помощью различных стратегий к настоящему времени удалось клонировать более 300 генов млекопи тающих. Изоляция клонированного гена какого-либо вида млекопитающих обыч но достаточна для изоляции его эквивалента у человека путем использования нечеловеческого клона в качестве зонда для скрининга человеческой к Д Н К и би блиотек геномной Д Н К методом нуклеинокислотной гибридизации.

Создание библиотек рекомбинантной Д Н К является существенной частью любой стратегии исследования биологии человека методом рекомбинантной Д Н К ;

для большинства тканей человека библиотеки к Д Н К уже имеются и доступны.

Создание библиотек геномной Д Н К необходимо для' получения серий клонов, которые включили бы в себя все последовательности Д Н К человека безотноси тельно их экспрессии.. Такие библиотеки обычно конструируются путем расщеп ления полного генома человека рестриктазой с последующей вставкой фрагментов в соответствующие векторы рекомбинантной Д Н К. Библиотеки геномной Д Н К создаются и для отдельных хромосом человека, которые перед клонированием сепарируются флюоресцент-активационным методом.

Для более детального анализа генов или Д Н К фрагменты клонированной Д Н К могут быть расцеплены на последовательности, допускающие определение ' их нуклеотидной структуры. Использование этих методов позволило определить нормальные и мутантные последовательности для многих генов человека.

ПДРФ-карта генома. В 1978 г. Кап и Dozy продемонстрировали генетиче скую вариацию размеров фрагментов, получаемых при расщеплении рестрик ционными эндонуклеазами нормальной человеческой Д Н К. Эти различия вызы ваются полиморфизмами последовательностей Д Н К, обсужденными выше. Рас щепление рестриктазой и Саузерн-блоттинг позволяют идентифицировать эти по лиморфизмы и использовать их в качестве маркеров специфических сайтов внутри генома. Если одна из пар оснований той последовательности, которая распоз нается рестриктазой, варьирует от одной копии генома к другой или^если Д Н К варьирует по длине, то будут варьировать и размеры фрагментов, получаемых при расщеплении Д Н К рестриктазой. Если при Саузерн-блоттинге зонд иденти фицирует уникальную последовательность Д Н К, то паттерн получающихся фраг ментов прост. Эти ПДРФ отражают полиморфизмы нормальной Д Н К и наследу ются в соответствии с законами Менделя. Типичные П Д Р Ф приведены на рис. 58-3. Высокополиморфный сайт получается тогда, когда некоторая последо вательность повторяется тандемом несколько (и при том разное число) раз;

это приводит к значительным вариациям длины в данном сайте. Хотя каждая рес триктаза обнаруживает только одну «порцию» вариации нуклеотидов, сейчас имеется большое число различных рестриктаз, что при значительной генетиче ской гетерогенности позволяет детектировать практически неограниченное число ПДРФ.

Способность анализировать первичную структуру Д Н К в клинических образцах и наличие генных маркеров в виде ПДРФ создают возможность для построения подробной карты гена человека. Многочисленные П Д Р Ф, обнару живаемые в некоторой малой области, могут оказаться сцепленными так, что они формируют гаплотип, т. е. серию или кластер тесно связанных маркеров Д Н К. Такие гаплотипы значительно повышают информативность анализа (см. ниже «Дефекты генов глобина») и являются эквивалентными небольшой части «серийного номера» каждой копии генома. Можно продемонстрировать также связь П Д Р Ф с генами, ответственными за болезни человека. При хорее Гентингтона, кистозном фиброзе и поликистозе почки взрослых наличие ПДРФ позволило получить клонированные маркеры Д Н К вблизи" болезнетворных генов еще до того, как были идентифицированы мутантные гены или изучены их нормальные аллели. «Прогулка по хромосоме» (клонирование непосредственно фланкирующих фрагментов Д Н К ) на короткие расстояния возможна уже сей час, и предложены стратегий для «перепрыгиваний» на более удаленные участ ки Д Н К. Со временем станет возможным клонировать ген, ответственный за любое «менделевское» заболевание. Подробная карта генов человека даст также возможность изучить роль индивидуальных локусов в случаях с полигонной, D|O ко или РИС. 58-3. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в Д Н К человека.

Сплошные блоки — сегменты Д Н К. используемые в качестве зонда, а — родители гомо зиготны, дети гетерозиготны: б - родители гетерозиготны, а дети гомозиготны. Сим волы над стрелками указывают на перерезку ( + ) или отсутствие перерезки (—) рест риктазами. Цифрами указана длина фрагментов Д Н К (в килобазах).

или многофакторной, этиологией. Не следует путать ПДРФ- с мутантными генами. Как правило, болезнетворные мутации слишком редки, чтобы их можно было классифицировать как полиморфизм;

лишь в отдельных случаях они могут быть детектированы непосредственно рестриктазами.

Генетическое сцепление и неравномерность сцеп л е н и я. Общие концепции генетической рекомбинации и сцепления обсужда лись в гл. 57. В случае аутосомных генов индивид наследует от каждого роди теля по одной копии каждой хромосомы. Каждая хромосома представляет собой уникальную мозаику полиморфных последовательностей Д Н К, получающихся в результате кроссинговера хромосом прародителей в процессе мейотической рекомбинации (рис. 58-4). Гены различных хромосом наследуются независимо, однако соседствующие гены одной и той же хромосомы наследуются совместно, если только пара подобных генов не будет разделена мейотическим кроссинго вером. Поскольку вероятность мейотического кроссинговера между удаленными локусами велика, то гены, находящиеся на одной и той же хромосоме, но на большом расстоянии друг от друга, наследуются так же, как если бы они принадлежали разным хромосомам. Генетические расстояния выражаются в сан тиморганах (сМ) и являются мерой вероятности кроссинговера между двумя локусами. Обычно клинициста интересует вопрос: передал ли данный индивид потомству нормальный или болезнетворный ген? Это справедливо в случае пренатальной или пресимптоматической диагностики и при определении гете розиготности. Ксли интересующий мутантный ген можно обнаружить прямым анализом Д Н К, то нет необходимости рассматривать генетическое сцепление.


Однако клиническая диагностика часто опирается на анализ генетических вариаций вблизи болезнетворного локуса. Практически это обычно означает, что нужно использовать ПДРФ в качестве близкого генетического маркера.

НОРМАЛЬНЫЙ АЛЛЕЛЬ ЦЕНТРОМЕРА ПДРФ#1 ПДРФ#2 ПДРФЛЗ ' В N Z zztzzzzmzzzzzcz:zzzzzzzzzz:zzz:zc=z БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ I АЛЛЕЛЬ I а МЕЙОЗ-ТРИКРОССИНГОВЕРА НОРМАЛЬНЫЙ АЛЛЕЛЬ ПДРФ#1 ПДРФ#2 ПДРФ#. В N Y "- Е= z^-sz zatzzzzi:

БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ АЛЛЕЛЬ Рис. 58-4. Демонстрация двух хромосом (одна обозначена сплошными линиями, другая — пунктирными) одного индивидуума до (а) и после (б) мейотического кроссинговера.

Индивидуум гетерозиготен но болезнетворному локусу с нормальным, аллелем (черный квадрат) и болезнетворным аллелем (белый квадрат) и в трех ПДРФ с аллелями А/В, M/N и Y/Z (см. текст).

Если имеется клонированный болезнетворный ген, то его можно использовать как зонд;

при этом вероятность кроссинговера между этим геном и ближайшим ПДРФ ( П Д Р Ф ^ Н, см. рис. 58-4) пренебрежимо мала. Если клонированного болезнетворного гена пет, то можно использовать другой клонированный фрагмент Д Н К, расположенный вблизи болезнетворного гена. В этом случае могут иметь место редкие кроссинговеры между болезнетворным локусом и ПДРФ (ПДРФ # 2, см. рис. 58-4). Другие ПДРФ могут оказаться столь удаленными от болезнетворного локуса, что никакой функциональной связи не проявят ( П Д Р Ф # 3, см. рис. 58-4). При мейозе происходит в среднем 30 35 кроссинговеров у мужчин и, возможно, примерно вдвое больше у жен щин. Частота мейотических кроссинговеров неодинакова по длине хромосомы.

При использовании сцепления в клиническом анализе существенно, чтобы вблизи болезнетворного гена имелся некоторый информативный генетический маркер. Это означает, что индивид, гетерозиготный по болезнетворному локусу, должен быть также гетерозиготным по ближнему генетическому маркеру.

Большинство анализов могут быть информативны, если ПДРФ достаточно часты и если можно идентифицировать полезные полиморфизмы в главных сайтах.

Второе условие успешности генетического анализа состоит в том, что нужно знать ф а з у между двумя локусами. Например, если ПДРФ дает фрагмент длиной 10 ко и фрагмент длиною 5 ко, то необходимо знать, сцеплен ли болезнетворный ген соответственно с первым, а нормальный • со вторым фрагментом или наоборот. Если известна фаза и анализ определил размер унаследованного индивидом фрагмента, то это сразу же показывает, какой им унаследован ген — нормальный или болезнетворный. Точность предсказания зависит от близости двух генных локусов и от вероятности кроссинговера. Опре деление фазы обычно основано на изучении предыдущих случаев заболевания в семье или на использовании биологических тестов для определения фенотипа или генотипа. Примеры ПДРФ-анализов в клинических ситуациях приводятся нцже.

Принятие неравновесности сцепления основано на том, что определенные гены в гомогенных популяциях встречаются совместно гораздо чаще, чем это может быть объяснено теорией случайных процессов. Всякая новая мутация происходит в хромосоме с определенным генотипом и вблизи ранее сущест вующих полиморфных сайтов. В отсутствие кроссинговера через несколько поколений все дочерние хромосомы, содержащие мутантний ген, будут содер жать и те же самые близлежащие последовательности ДНК. При редких кроссинговерах степень ассоциации с ближними соседями будет частично на рушена. Неравновесность сцепления отражает тот факт, что два тесно сцеп ленных признака имеют тенденцию встречаться совместно чаще, чем в соот ветствии со средней частотой образования данной пары в генной популяции, вычисленной в предположении о случайном (т. е. равновесном) распределении каждого гена. Паттерны ассоциативности огражают историю кроссинговеров между двумя очень близкими генетическими локусами. Таким образом, конкрет ный гаплотип ПДРФ может часто наследоваться совместно с болезнетворным геном.

Неравновесность сцепления была продемонстрирована уже в первых ПДРФ, описанных Кап с сотр., вблизи ft-глобинного локуса. Фермент Нра I производит фрагменты гена {J-глобина длиной 13;

7,6 или 7 ко, определяемые полиморфиз мом в З'-фланкирующей области этого гена. В некоторых западноафриканских и средиземноморских популяциях мутация серповидных клеток связана преиму щественно с фрагментом длиной 13 ко. На результаты клинических анализов неравновесность сцепления воздействует в оенонним двумя способами. Во-пер вых, при образовании гаплотипов соседних ПДРФ весьма распространена значительная неравновесность сцепления, так что наблюдается лишь часть всех возможных гаплотипов (т.е. комбинаций ПДРФ). Во-вторых, случайная силь ная неравновесность сцепления между ганлотином ПДРФ и болезнетворным аллелем может иметь самостоятельную диагностическую ценность, как это описано ниже в случае дефицита ai-антитрипсина.

Определение ДНК-маркера, близкого к болезнетвор н о м у г е н у. Разработка подробной карты генома человека с помощью ДНК-маркеров позволяет отыскать генетические сцепления для всех важней ших распространенных заболеваний, наследуемых по законам Менделя. Рис. 58- демонстрирует схему анализа на наличие сцепления с использованием двух случайно выбранных ДНК-маркеров, один из которых расположен вблизи болезнетворного гена на одной с ним хромосоме и имеет аллели А и В. а второй расположен на другой хромосоме и имеет аллели X и Y. Полученные от семьи сведения позволяют говорить о наличии сцепления между маркером с аллелями А и В и болезнетворным локусом, а анализ достаточно длинной родословной решительно свидетельствует о том, что полиморфный ДНК-маркер расположен вблизи от болезнетворного гена. Для оценки генетического расстояния между двумя маркерами можно использовать частоту кроссинговеров. Любой клон ДНК может быть картирован на хромосому. Такая стратегия использовалась для идентификации анонимного (случайного) ДНК-сегмента, сцепленного с ло кусом хореи Гентингтона,_ расположенного на коротком плече хромосомы на расстоянии от 3 до 5 сМ. Точно так же область высокополиморфной ДНК вблизи a-глобинного кластера сцеплена с локусом поликистозя почки взрослых на хромосоме 16. Аналогичные усилия могут быть приложены и для диагно UNHо UNHN D - БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ АЛЛЕЛЬ A !I ri В JJ^lr N-НОРМАЛЬНЫЙ АЛЛЕЛЬ • •-БОЛЕЗНЕННЫЙ ФЕНОТИП DO- НОРМАЛЬНЫЙ ФЕНОТИП А/В V/2 V/Y А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А*- КРОССИНГОВЕР V/Z Y/Z Y/Y Y/Y Y/Z Y/Z Y/Z Y/Y Y/Z Y/Y Y/Y Y/Z Рис. 58-5. Сцепление ДНК-маркера с аутосомно-доминантным заболеванием.

А и В — маркерные аллели в одном сайте, Y и Z — аллели в другом сайте. Приведена паре хромосом каждого родителя. Гаплотип В и болезнетворный аллель наследуются совместно от отца, за исключением младшего ребенка, у которого произошел крос еннговер и болезнетворный аллель унаследовался с гаалотипом А.

РНК, Рис. 58-6. Типичный ген, РНК Концевой кодирующий белковый Поли А участок контроль продукт.

АУГ Незаштрихованные участ ЦААТ ТАТА ки — наследственности, включаемые в зрелые мРНК (экзоны), сужение участ ТРАНСКРИПЦИЯ ка - нетранслируемые по следовательности;

заштри хованные участки - интро ПЕРВИЧНАЯ РНК ны (вставочные последова тельности).

ПРОЦЕССИНГ-РНК ЗРЕЛАЯ мРНК С || | ^3 А А А А стики аутосомно-рецессивных заболеваний;

так, с помощью этой стратегии ген кистозного фиброза был картирован на хромосому 7.

Современная картина типичного гена. Типичный ген производит мРНК.

которая затем транслируется в белок (рис. 58-6;

см. также гл. 57). Тот конец гена, в котором начинается транскрипция (синтез РНК), называют концом 5' относительно ориентации мРНК. Сайт, в котором начинается транскрипция, называют стартовым сайтом (Cap-сайтом). Для инициации и управления транскрипцией необходимы по крайней мере еще несколько последовательно стей Д Н К, расположенных выше «по течению» от этой области (т. е. в направ лении, противоположном направлению транскрипции, и на левой части рис. 58-6).

Многие верхние области содержат последовательности, называемые боксами ТАТА и боксами ЦААТ, которые участвуют в инициации и управлении транс крипцией. Важные для регуляции гена последовательности могут находиться еще далее вве ix и вниз от стартового сайта. Те сегменты последовательностей Д Н К, которые переводятся в зрелую процессированную мРНК. называются экзонами. Экзоны разделены сегментами, которые называют вставочными после довательностями (ВП), или нитронами. Интроны вначале также копируются на РНК. но при формировании зрелой мРНК — процессинге — они вырезаются, т. е. начальный транскрипт содержит РНК-копии как интронов, так и экзонов, в то время как зрелая мРНК содержит только копии экзонов. Зрелая мРНК содержит также нетранслируемые последовательности РНК, которые располага ются выше кодона инициации синтеза белка (АУГ) и ниже кодона терминации (УАА, УАГ или УГА). Транскрипция распространяется за пределы сайта, в котором окончится зрелая мРНК. Начальный РНК-транскрипт процессируется посредством расцепления нуклеазами, опознающими сайты поли-А с последу ющим добавлением нуклеотида А (аденина) к З'-концу мРНК.


Известно много типов мутации. Ген может подвергнуться полной делеции.

Ген может быть перестроен частичной делецией, вставками или инверсией значащих сегментов. Одноосновные изменения в кодирующих областях при водят к образованию миссенс- или нонсенс-кодонов, что в свою очередь вызы вает подмену аминокислоты или преждевременную терминацию цепочки. Мута ции инициатора и терминатора также могут вызывать заболевания. Кроме того, мутации могут приводить к аномальностям сплайсинга мРНК, обычно МУТАЦИЯ Рис. 58-7. Мутация сплай синга в гене ft-глобина (экзоны пронумерованы, интроны заштрихованы). -ЮМАЛ АНОМАЛЬНЫЙ СПЛАЙСИНГ НОРМАЛЬНЫЙ СПЛАЙСИНГ Мутация в первом нуклео тиде второго интрона приво Ж ГГ дит к образованию двух ано мальных продуктов мРНК (справа).

изменением сохраняемых последовательностей вблизи границ интрон — экзон.

Эти аномальности сплайсинга обычно приводят к образованию мРНК, не спо собной производить функциональный продукт (рис. 58-7). Мутации могут наблюдаться и в управляющих областях, и в сегментах поли-А. Кроме того, болезнетворные мутации способны происходить и в тех частях генома, которые не кодируют белок, хотя таких примеров немного. Разнообразие мутаций означает, что задача обнаружения мутантных генов на уровне ДНК может оказаться весьма сложной.

Клиническое приложение молекулярной диагностики Дефекты генов глобина. Наиболее обширный опыт молекулярного анализа заболеваний накоплен в области изучения аномальностей цепи глобина;

пони мание природы функционирования других генов в значительной мере опреде лилось результатами исследований именно этих мутаций. При значительной делеции основных участков кластера глобинной цепи для демонстрации наличия гомозиготных дефектов можно использовать Саузерн-блоттинг. Деления гена является обшей причиной а-талассемии, и пренатальная диагностика этих дефектов выполняется непосредственно с использованием зонда из кДИК либо из геномной ДНК. Идентификация гетерозиготных делений требует либо тща тельного количественного анализа, либо демонстрации аномально соединенных фрагментов из мутантного сайта. Обширные делеции редко бывают причиной мутаций в кластере р-глобина, но они характерны при наследственной персистен ции фетального гемоглобина (рис. 58-8) и при некоторых формах А-р-талассемии.

Саузерн-блоттинг, напротив, неэффекти вен для обнаружения большинства одно л- основных изменений генома. Первый метод ^ молекулярной диагностики серповидно-клеточ ной анемии включал в себя ранее упомя нутое ПДРФ-фланкирование З'-конца гена iff р-глобина. Этот тип анализа оказался про дуктивным в случае лишь нескольких семей, поскольку зачастую невозможно надежно определить фазу (см. выше и ниже в под а 20,8 — — разделе «Аутосомно-рецессивные наруше ния»). Одна из альтернативных процедур, разработанных для прямой демонстрации серповидно-клеточной мутации, заключается в модификации Саузерн-блоттинга, при кото рой в качестве зонда используется синтети ческий 19-основный олигонуклеотид, sобразу /93, ющий превосходящую пару либо с p :, либо с рА-последовательностям и (рис. 58-9). Оли —.. 42,1 гонуклеотидный метод может оказаться эф фективным также и в других случаях.

41, Рис. 58-8. Пример анализа генов глобина 20,8 • человека блоттинг-методом по Саузерну.

а — ДНК, выделенные у нормального индивида и у лиц с гомозиготной наследственной персис тенцией фетального гемоглобина (НПФГ) или « с гомозиготной (i-талассемией. ДНК расщеплена ферментом EcoRI. Смешанный ДНК-зонд изго 2,11.6 товлен обратной транскрипцией мРНК ретикуло •5,5—J-3.7H h-И- цитного глобина, б — стрелками показаны те t t сайты областей а- и р-глобина, которые перере заются EcoRI;

цифрами указана длина фрагмен тов ДНК (в килооснованиях) (по Y. W. Кап, fi А. М. Dozy. • Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1978, 75. 5631).

Hj319A1 б Н/819S Г.

I 77, со ел со со Рис. 58-9. Саузерн-блоттинг с использованием олигонуклеотидных зондов для диагностики серповидно-клеточной анемии.

Использованы зоилы из 19 оснований: Н|Я9А' для нормальной поглсловательности и Нр19S — для гена серповидно-клеточной анемии. Генотипы индивидуумов указаны над каждой линией;

Д Н К расщеплена рестриктазой. HjiGl обозначает клонированную Д Н К гена нормального глобина. Темные пятна в верхней части рисунка — результат неспецифической гибридизации (по В. J. Conner et al. • - Proc. nat. Acail. Sci., USA.

1983. 80, 278).

когда значительная часть заболеваний в популяции вызывается конкретной мутацией, однако ему присущи два недостатка: во-первых, большинство гене тических болезней на молекулярном уровне гетерогенны и для каждой мутации нужен специфический нуклеотид;

во-вторых, широкому применению метода пре пятствует его техническая сложность.

Есть другой метод прямого обнаружения серповидно-клеточной мутации.

обходящий эти технические трудности. Часть нуклеотидной последовательности н (V -гене - это 5'-ЦЦТГАГТ-3', а соответствующая последовательность в серпо видном гене - 5'-ЦЦТПТГ-3'. Замена ГАГ на ГТГ приводит к производству валина вместо глутаминовой кислоты. Рестриктаза Msi II разрезает последо вательность 5'-ЦЦТМАГГ-3' (N любое основание) и, следовательно, разрежет в этом сайте последовательность р\ но.не ps (рис. 58-10а). Расцепление геном ной Д Н К ферментом Mst II приводит к образованию фрагментов длиной 1,15 ко при нормальном гене и длиной 1,35 ко при рЛгене. Саузерн-блоттинг с исполь зованием Mst II и подходящим фрагментом (J-глобина в качестве ДНК-зонда позволяет идентифицировать генотипы AS, AA и SS (рис. 58-106). Этот метод можно рекомендовать для пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии, но он неприменим для диагностики большинства других болезней.

Действительно, для мутации не свойственно быть болезнетворной и одновременно достаточно распространенной, чтобы вызывать ПДРФ.

Молекулярная гетерогенность при (3-талассемии иллюстрирует объем задач, возникающих при применении анализа Д Н К для генетической диагностики.

Для аллелей р-талассемии характерны небольшие изменения Д Н К. и в первую очередь одноосновные, вызывающие преждевременную терминацию и аберрации сплайсинга. Талассемия вызывается также мутациями регуляторных областей, расположенных выше 5', и мутациями поли-А сигналов. В целом для гена р-глобина известно 17 различных мутаций сплайсинга, 10 разных сдвиговых, или нонсенс-мутаций, и 6 различных мутаций транскрипции (рис. 58-11). Один из методов генетической диагностики р-талассемии основан на ПДРФ-анализе Р-глобинного кластера. Такие вариации можно сгруппировать в гаплотип для каждой хромосомы (рис. 58-12). Предполагая, что анализ ганлотипа окажется информативным, можно поставить пренатальный диагноз в тех случаях, если в семье уже был пораженный ребенок. В общем же, всякая новая мутация Фланкирующая область Ген ^-глобина 5' — д5.6. •0 П 1. Мм И-фрагмент 1. 1.Э ffit- -I Рис. 58-10. Саузерн-блоттинг для прямой AS AS AA SS диагностики мутации аномального глоби Источник- на (серповидно-клеточная анемия).

Стрелками указаны сайты M s t l l, включая один, соответствующий аминокислотным по зициям 5, 6 и 7. Зондом служит Mstll-фраг мент длиной 1,15 килооснований (объяснение в тексте) (по J. С. Chang, Y. W. Кап. — New Engl. J. Med., 1982, 307, 30).

Ген /J-глобинэ 11910 Ivsll 11 Рис. 58-11. Локализация 30 мутаций, вызывающих (j-талассемию.

Белый треугольник — мутации со сдвигом рамки;

белый ромб — мутации сплайсинга РНК, заштрихованный круг — транскрипционные, белый круг — мутации расщепления РНК (из S. E. Antonarakis et al. — Hum. Genet.,.1985, 69, 1).

ассоциирована с конкретным гаплотипом и имеет определенное географическое распределение. В изолированных популяциях при помощи гематологического анализа можно выявить гетерозигот, а анализом гаплотипа идентифицировать носителей и предполагаемую генетическую фазу с целью последующего скри нинга гетерозигот и предотвращения талассемии. Такой анализ значительно осложняется при смешении различных талассемических мутаций в результате движения населения. Например, для греческой и итальянской популяций в Се верной Америке пренатальная диагностика затруднена, если только у данной пары уже не было пораженного ребенка, что позволяет установить фазу. Пря мая демонстрация мутантных генов с использованием олигонуклеотидных зондов, диагностическая обработка ферментами рестрикции и некоторые другие 3' Рис. 58-12. RFLP-гапло- fi Gy Ay гипы в кластере (5-гло- окна.

tt tt t ft Длины рестрикцнонных Hd III Hd l Ava II Bam HI Hlnc II фрагментов указаны стрел- Hlnc II ками. Представлены только rifjnjjjunbi три из многих возможных ганлотипов: ( + ) — рас щепление ферментом рест рикации;

( • ) — отсутствие • Ill рестрикции (из S. И. Orkin ct al. — Nature. 1982, 296.

627).

методы имеют преимущества, поскольку не требуют наличия информативных маркеров и определения фазы. Тем не менее из-за гетерогенности молекулярных дефектов каждая семья представляет собой существенную диагностическую проблему. Сравнение серповидно-клеточной анемии, при которой единственная мутация предопределяет весь фенотип заболевания, с [5-талассемией, при ко торой конкретный фенотип определяется обширной молекулярной гетероген ностью, — это важный урок для изучения других локусов.

Другие одногенные дефекты. Термин аутосомно-доминантный характеризует условия, при которых гетерозиготный индивид имеет выраженный болезненный фенотип. При аутосомно-рецессивных дефектах гетерозиготный индивид оста ется здоровым, и заболевают лишь гомозиготы или компаунл-гетерозиготы (см. гл. 57). Эти различия существенны для молекулярной диагностики одно генных нарушений.

А у т о с о м н ы е р е ц е с с и в н ы е н а р у ш е н и я. В некоторых случаях анализ ДНК клеток плода дает возможность провести пренатальную диагностику аутосомно-рецессивных заболеваний, таких как дефицит ui-антитрипеина, фенил кетонурия и кистозный фиброз. Хотя эти заболевания проявляются различной степенью тяжести, а те немногие пары, которые находятся в группе риска, могут согласиться, а могут и не согласиться на преиатальную диагностику, тем не менее эти болезни хорошо иллюстрируют основные принципы, характер ные для аутосомно-рецессивных заболеваний. На рис. 58-13 приведена гипо тетическая серия семей с фенилкетонурией. Дефектным ферментом в этом случае является фенилаланннгидроксилаза;

при использовании клонированной комплементарной к гену кДНК проявляются по крайней мере t восемь ПДРФ. Каждая изобра ШЛ Bib женная семья имеет ребенка с фенилкетонурией. Для семьи I анализ информативен и можно КО определить генетическую фазу;

оба родителя гетерозиготны по ПДРФ, а по первому поражен ному ребенку определяем, что фрагмент длиной 5 связан с бо лезнетворным геном у обоих ро ПгЭ Рис. 58-13. Гипотетические семьи с ребенком, страдающим фенил кетонурией.

— — Примеры Саузерн-блоттинга с ис- пользованием в качестве зонда к ДНК фенилаланингидроксилазы.

Семьи пронумерованы цифрами сверху, размеры рестрикционны\ фрагментов указаны в килобаза.х (см. текст). ФЕРМЕНТ^ ФЕРМЕНТ»

дителей. Для семьи 2 анализ информативен лишь в отношении отца. В семье оба родителя гетерозиготны по ПДРФ, но адекватно определить фазу нельзя, и анализ информативен лишь частично. Для семьи 4 анализ неинформативен, поскольку оба родителя гомозиготны в ПДРФ-сайте. Для семьи 5 полна» ин формация может быть получена посредством двух ПДРФ. поскольку один ана лиз информативен в отношении отца,..а другой - в отношении матери-. По скольку потенциально информативны более одного ПДРФ, то и у большинства семей анализ полностью информативен, и в большинстве семей, уже имеющих пораженного ребенка, можно поставить пренатальный диагноз. В этих семьях анализ Д Н К может также выявить и гетерозиготных родственников, таких как дяди, тети, сестры, братья.

При дефиците ц-антитрипсина точный генотипический диагноз и выявление гетерозиготности могут быть выполнены постнаталыю с помощью электро фореза белков. В большинстве случаев это заболевание вызывается несколь кими мутациями, в первую очередь Z-аллелем (одноосновное изменение с под меной аминокислоты). Пренатальная диагностика может быть осуществлена с помощью олигонуклеотидных зондов, позволяющих различить, что передал каждый из родителей плоду Z-аллель или нормальный. Кроме того, в 5'-флан кирующей области гена «i-антитрипеина имеет место неравновесность сцепления ПДРФ, и наличие специфического гаплотипа П Д Р Ф в этой зоне может служить диагностическим индикатором наличия Z-аллеля. Степень этой неравновесное™ сцепления необычайно высока. Реальная осуществимость массовой индикации специфических аллелей ui-антитрипсина может позволить предложить пренаталь ную диагностику всем парам, в которых оба супруга имеют MZ-генотип, даже если у них нет пораженных детей.

При аутосомно-рецессивных нарушениях диагностика с использованием сцепленных Д Н К зондов широкого применения не имеет, но идентификация ДНК-маркеров, близких к гену кистозного фиброза, должна изменить эту ситуацию. Онкоген met и случайный ДНК-маркер тесно (около 1 сМ) сцеплены с геном кистозного фиброза на хромосоме 7. Эти ДНК-маркеры обеспечивают возможность пренатальной диагностики и выявления гетерозиготности в семьях с кистозным фиброзом. Принципы те же самые, что и для фенилкетонурии (см. рис. 58-13), за исключением того обстоятельства, что между ДНК-марке ром и геном кистозного фиброза могут происходить кроссинговеры. При по пытках пренатальной диагностики в семьях, уже имеющих пораженного ребен ка, следует учитывать возможность четырех кроссинговеров: двух у первого пораженного ребенка, используемых для определения фазы родителей, и двух у плода. Если ДНК-маркер находится на расстоянии I сМ от болезнетворного гена, то вероятность ошибочного диагноза составляет почти 4 %. Таким обра зом, сцепленный диагноз этого типа требует ПДРФ-маркеров, близких к мутант ному гену, Такие ДНК-маркеры позволяют выявить гетерозиготность в поражен ных семьях, но не в популяции вообще.

Одна редкая рецессивная форма дефицита гормона роста вызывается гомозиготной делецией гена гормона роста. Этот дефект является показатель ным примером эффективности молекулярного анализа. Во-первых, ДНК-анализ может установить этиологию задержки роста у больного ребенка. Во-вторых, он имеет прогностическую ценность, поскольку у таких детей весьма вероятно вырабатываются антитела на экзогенные гормоны роста и они могут оказаться резистентными к гормональной терапии. В-третьих, анализ идентифицирует это состояние как рецессивный дефект с высоким риском рецидива. В-четвер тых, ДНК-анализ обеспечивает возможность пренатальной диагностики в таких семьях, он эффективен также для пренатальной диагностики рецессивных дефектов типа дефицита карбамилфосфнтсинтетазы, при которых активность фермента не экспрессируется в культивированных амниотических клетках.

А у т о с о м н о - д о м и н а н т н ы е н а р у ш е н и я. Некоторые гены, от ветственные за аутосомно-доминантные нарушения, удалось клонировать, примером чему служат рецептор низкоплотного липопротеина (НПЛ) и анти тромбин I I I. Для рецептора НПЛ характерна генетическая гетерогенность:

большинство случаев семейной гиперхолестсринемии обязано своим происхож дением унаследованным мутантным аллелям, а не новым мутациям. Для ре цептора Н П Л идентифицирован по крайней мере один ПДРФ с использованием Ри,с 58-14. Гипотетиче ские семьи, страдающие хореей Гентингтона.

А, В и С — гаплотипы ПДРФ, обнаруживаемые сцепленными ДНК-зондами.

Черные круг и квадрат — пораженные члены семьи;

Р - беременность (см текст).

генного зонда, так что в некоторых случаях может появиться возможность для пресимптоматической диагностики.

Идентифицированы сцепленные ДНК-маркеры для хореи Гентингтона и гюликистоза почки взрослых. Как было установлено в 1985 г., ближайшие ДНК-маркеры находятся на расстоянии от 2 до 6 сМ от болезнетворного локуса.

Хотя эти маркеры служат ценным исследовательским инструментом, их клини ческое применение осложнено высокой вероятностью кроссинговеров. Необ ходима идентификация более -близких маркеров или самих болезнетворных генов. При хорее Гентингтона пресимптоматическая диагностика обычно не желательна, поскольку она может привести к излишней психологической на грузке на больных, однако возможность как пресимптоматического, так и пре матального определения диагноза существует. На рис. 58-14 приведены гипо тетические примеры семей с хореей Гентингтона и гаплотипные анализы, осно ванные на ПДРФ. В этих иллюстрациях предполагается, что ДНК-маркер находится на расстоянии 3 сМ от болезнетворного гена и что вероятность кроссинговера при мейозе равна 3 % как для мужчин, так и для женщин.

Для семьи 1 анализ информативен, и болезнетворный аллель находится в фазе с гаплотипом В. Можно предсказать с доверительностью примерно 97 %, что беременная женщина унаследовала хорею Гентингтона, а пренатальный диагноз выполняется примерно с 94 % уверенностью. Многие члены семьи 2 умерли, и пресимптоматическая диагностика для беременной женщины невозможна, но можно предложить одну из форм пренатальной диагностики. Пели плод наследует через мать дедовский гаплотип В, то риск заболевания велик, на против, если плод наследует через мать бабушкин гаплотип А, то риск заболе вания мал. Далее, если для этой пары все беременности с гаплотипами плодов ВВ или ВС были бы прерваны, а с гаплотипами АВ или АС продолжены, то половина всех плодов была бы абортирована, но зато риск передачи хореи Гентингтона был бы заведомо незначителен даже при неизвестной степени риска для матери. При использовании такого подхода абортированные плоды, весьма вероятно, были бы поражены хореей Гентингтона в половине тех семей, в которых поражен родитель, но были бы не поражены в половине семей с непораженным данным родителем. Ввиду ранней смерти пораженных инди видов ситуация с семьей 2 может оказаться типичной. При поликистозе почки взрослых ситуация аналогична, но отличается тем, что пресимптоматическая диагностика с помощью ультразвукового исследования почек оказывается достаточно точной. С локусом поликистоза почки взрослых тесно сцеплен высоко полиморфный маркер, появляющийся в результате вариации длины в тандеме повторных последовательностей (рис. 58-15). Наличие сцепленных зондов обес печивает возможность пренатальной диагностики этой болезни, однако вопрос о допустимости пренатального тестирования в пораженных семьях пока не решен. В заболеваниях, наследуемых по аутосоммо-доминантному типу, можно усмотреть некоторые основные особенности. Например, при заболеваниях типа дефекта рецептора НПЛ, для которых характерна высокая молекулярная гетерогенность, должен оказаться эффективным гаплотипный анализ с исполь Рис. 58-15. Саузерн-блотти/нг "- g ? § o™ " — —— — семьи, пораженной поликис/го зом почек взрослых., v Аллели С, D. С и Н обнаружива ются сцепленным высокополимЬрф к ' ным зондом. Обозначения над.каж до —48 С ™ линией относятся к поэиции в родословной;

каждый индиви дуум с аллелем С страдает поли — 35 D кистозом (из S. Т. Reeders et al. — -29 G Nature, 1985, 317, 542).



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 23 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.