авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 23 |

«КНИГА 2 Harrison's PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Eleventh ...»

-- [ Страница 8 ] --

Щ—2'5 J i — 24 H L зованием П Д Р Ф. В таких случаях, как хорея Гентингтона, при которой боль шинство случаев заболевания у потомков обязано своим происхождением одной или нескольким мутациям у предков (т. е. молекулярная гетерогенность невелика или отсутствует), большую важность приобретает клонирование болез нетворного гена и идентификация молекулярного дефекта. Прямая иденти фикация мутации дает возможность осуществлять пресимптоматическую и пре натальную диагностику во всех подобных случаях. Можно ожидать, что при болезнях типа ахондропластической карликовости, вызываемых новыми мута циями, анализ Д Н К будет иметь ограниченную ценность. Поскольку пред сказать появление новой мутации невозможно, то пренатальная диагностика, новых мутаций потребовала бы тестирования всех молекулярных дефектов и должна была бы проводиться при всех беременностях, что совершенно не реально. Таким образом, клонирование гена ахондроплазии с точки зрения практической нренаталыюй диагностики бесполезно. Далее, диагностика посред ством ДНК-анализа будет, вероятно, весьма осложнена большой молекулярной гетерогенностью при таких болезнях, как синдром Марфана, туберозный склероз и некоторых других, при которых в каждой семье поражается лишь незначительное число ее членов. Особенно сложна молекулярная диагностика при болезнях, вызываемых генами коллагена, ввиду больших размеров и слож ности этих генов и высокой степени молекулярной гетерогенности (см. гл. 319).

Некоторые мутации в гене коллагена вызывают аутосомно-доминантмые забо левания, а другие мутации в том же самом гене приводят к образованию аутосомно-рецессивных фенотипов.

Х - с ц е п л е н н ы е н а р у ш е н и я. Те же принципы с некоторыми модификациями приложимы и к Х-сцеплекным заболеваниям, для которых получены клонированные гены, например, для дефицита фактора V I I I (гемо филия А) и дефицита фактора IX (гемофилия В). Деления, значительная перестройка гена или иногда мутация в рестрикционном сайте в некоторых случаях дают возможность прямого детектирования мутации. В других случаях возникает необходимость воспользоваться сцепленным анализом- с использо ванием ПДРФ и клонированного гена в качестве зонда. Поскольку мужчина имеет единственную Х-хромосому, то для них анализ определяет фазу сцепления между П Д Р Ф с болезнетворным геном даже тогда, когда отец не передает заболевание детям. На рис. 58-16 представлены гипотетические семьи с гемо филией А, в качестве зонда используется клонированный ген фактора V I I I.

Для семьи 1 анализ информативен, а фаза (между геном гемофилии и гапло типом В) может быть определена из анализа пораженного внука непораженной бабушки. Семья 2 иллюстрирует преимущества прямого обнаружения мутации по сравнению с анализом П Д Р Ф в тех случаях, когда неясно, вызвано ли заболевание унаследованной или новой мутацией. Определить, является ли беременная гетерозиготом, можно только прямым, но не ПДРФ-анализом.

Если прямое детектирование невозможно, то тест на гетерозиготность этой женщины зависит от анализа активности фактора VIII и наличия антигена.

Пренатальная диагностика для семьи 2 должна опираться на утверждение: если мать является носителем, то только плоды мужского пола с гаплотипом В входят Рис. 58-16. Семьи, стра дающие гемофилией А.

Гаплотипы А и В основаны на П Д Р Ф с использованием гена фактора V I I I в каче стве зонда. Черные квадра ты — пораженные мужчины, кружок с точкой — женщи на — облигатный носитель;

Р — беременность (см, В В текст).

Рис. 58-17. Факторы, ис пользуемые для определе &T ния фазы сцепления (на примере Х-сцепления).

АиВ гаплотипы ПДРФ, i 0 ®-HZl обнаруживаемые с исполь A AB АВ А зованием ДНК-маркера, рас- АВ А положенного в 10 см от бо Л лезнетворного локуса;

Р p вв беременность (см. текст). p P A A в группу риска по данному заболеванию, а если мать носителем не является, то плоды мужского пола в группу риска не входят. В семье 3 два брата, один здоровый, другой пораженный, унаследовали один и тот же гаплотип. Поскольку вероятность кроссинговера в пределах гена фактора V I I I невелика, то ребенок, по-видимому, поражен новой мутацией, мать носителем не является, а риск еще одной новой мутации при этой беременности пренебрежимо мал. Опреде ление гетерозиготности с помощью гормонального анализа при Х-сцепленных •заболеваниях осложняется случайными инактивациями Х-хромосом, поэтому там, где это возможно, для определения гетерозиготности следует предпочесть ДНК-анализ.

Некоторые трудности, возникающие при определении фазы сцепления ме тодом сцепленного анализа, иллюстрируются гипотетическими Х-сцепленными дефектами, изображенными на рис. 58-17. В каждом примере беременная жен щина является обязательным носителем дефекта, а ДНК-маркер находится в 10 сМ от болезнетворного гена. Для семьи 1 вероятность того, что гаплотип А существует совместно с болезнетворным геном в генотипе матери, составляет 90 %. Это утверждение основано на исследовании внука;

точность пренаталь ной диагностики для мужских плодов составляет примерно 81 % из-за комби нированной неопределенности^ фазы и вероятности кроссинговера для плода.

Семья 2 идентична семье 1, за исключением того, что имеющаяся информация о гаплотипе относится к деду и указывает на то, что болезнетворный ген находится в фазе с гаплотипом у матери. Поражение ребенка в семье 2 должно быть результатом кроссинговера, а точность пренатальной диагностики для мужских плодов составляет примерно 90 %. Обратите внимание на прогноз, что плоды с гаплотипом А будут поражены в семье 1 и не поражены в семье 2.

Для семьи 3 вероятность того, что болезнетворный аллель сцеплен с гапло ПДРФ ПДРФ # ОДИН МАРКЕР ИНФОРМАТИВЕН -100 % СЕМЕЙ, ДОСТОВЕРНОСТЬ 90 % Рис. 58-18. Эффект флан кирующих сцепленных ге ДВА МАРКЕРА ИНФОРМАТИВНЫ нетических маркеров при - 81 % СЕМЕЙ, ДОСТОВЕРНОСТЬ 99 % Х-сцепленном заболева нии (см. текст). - 19 % СЕМЕЙ. ДИАГНОЗА НЕТ типом В, составляет 99 %, поскольку два пораженных сына проявляют одну и ту же фазу (обратите внимание на разницу с семьей 1, в которой только один пораженный ребенок). Точность пренатальной диагностики у плодов муж ского папа составит примерно 90 %. Аналогичные принципы используются и для определения фазы с аутосомными маркерами.

Преимущество двух фланкирующих сцепленных маркеров иллюстрируются на рис. 58-18 на примере Х-сцепленной наследственности. F-сли предположить, что каждый маркер отстоит от болезнетворного локуса на 10 сМ, пренатальный диагноз будет иметь точность 90 % в том случае, если только один маркер информативен. Если информативны оба маркера, то вероятность кроссинговера между двумя ДНК-маркерами составит 2 0 %, а вероятность двойного кроссин Та б л и ц а 58-2. Роль молекулярного анализа при диагностике генетической болезни Примечания Детекти- ПДРФс ПДРФ со Болезнь рование 1 сцеплен генным мутации' ным мар зондом кером Анализ с Mst II Серповидно-клеточная анемия Очень гетерогенна (5-Талассемия Много делений а-Талассемия Гемофилия А Гемофилия В Фенилкетонурия ai-Антитрипсин ZZ Важны биологиче Дефицит антитромби на III ские тесты То же Семейная гиперхолесте ринемия Редкая форма Дефицит гормона роста Определение гетеро Синдром Леша — Нихена зиготности Наследуемая форма Ретинобластома Задержка по этиче Хорея Гентингтона ским соображе ниям Миотоническая дистро фия Поликистоз почки взрос лых Дефицит орнитинтранс- Пренаталыю и на карбамилазь) гетерозиготность Дефицит карбамилфос фатсинтетазы Х-сцепленная пигмент ная ретинопатия Ломкий Х-синдром Кистозный фиброз " Символ «плюс» отражает относительную важность иоялола на конец 1985 г. Допол нительные заболевания, новые клоны и методы должны быстро изменить вид этой таблицы.

говора-- 1 %. Таким образом, примерно для 'Д. всех семей анализ будет не определенным, но зато и тех случаях, когда фаза сцепления между двумя фланкирующими маркерами сохраняется, точность диагноза составит 99 %.

Руководство к клиническому применению. Некоторые болезни, при диагно стике которых анализ ДНК'достаточно информативен, перечислены в табл. 58-2.

Семьям, члены которых страдают заболеваниями, следует предложить молеку лярные исследования как часть предрспродуктивной оценки и консультации.

Кровь для исследований рекомендуется брать у лиц, пораженных хореей Ген тингтопа, мышечной дистрофией Дюшснна. кистозным фиброзом и поликистозом почки. Отсутствие Д Н К от пораженных индивидов или от старших членов семьи может сделать невозможным генетическое диагностическое тестирование млад 1 И членов семьи.

ПХ В заключение можно сказать, что ПДРФ-анализ со сцепленным маркером достаточно эффективен, но цел»ччхбразнео проводить ПДРФ-анализ с болезне творным геном в качестве зонда;

прямое детектирование мутации оптимально, но более сложно, так как требует кпк изоляции самого гена, так и метода идентификации каждой мутации. Приведенные примеры подчеркивают также сложность идентификации новых мутаций, определения гетерозиготного статуса, установления фазы сцепления и установления информативности анализа по сцеплению.

Молекулярная цитогенетика. Метод рекомбинантной Д Н К перекидывает мост между одногенными дефектами и цитогенетикой (см. гл. 60). Генетические нарушения простираются от одногенных изменений до приобретения или утраты целой хромосомы. Например, у некоторых больных с мышечной дистрофией Дюшенна в большей степени выражены цитогенетические аномалии, у других наблюдаются значительные делении Д Н К при очевидно нормальных результатах цитогенетических анализов, а у третьих, вероятно, будут иметь место одно основные изменения.

Патогенетические аномалии можно изучать, используя либо Саузерн-блот тинг, либо гибридизацию in situ. Саузерн-блоттинг можно использовать для количественного анализа в отношении любых уникальных сегментов Д Н К, как что показано на рис. 58-19. Для любой хромосомной делении, дупликации или транслокации можно определить, попадает ли данный ДНК-зонл на ано мальную область. В самом деле, ДНК-анализ обнаруживает гетерозиготные делении, которые слишком малы для индикации стандартными методами цито генстики. Например, около половины пациентов с синдромом Прадера--Вилли имеют делении или другие аномалии в проксимальной части длинного плеча хромосомы 15, причем необходимо отметить, что результаты цитологического анализа у части из них не выявили нарушений. В то время как при помощи молекулярных исследований таких пациентов возможно обнаружить делении, которые слишком малы для микроскопической идентификации. В исследователь ских целях Саузерн-блоттинг можно применить для анализа гибридов сомати ческих клеток, которые содержат транслоцированные или перестроенные хро мосомы, отсепарированные от их нормальных гомологов. С помощью этих ме тодов можно определить положение любого ДНК-маркера относительно любого цитогенетическрго нарушения.

В методе гибридизации in situ радиоактивный ДНК-зонд используется для прямой ренатурации хромосомной Д Н К в фиксированных тканевых пре паратах. Такую ренатурацию можно обнаружить при помощи радиоавтографии в тех областях хромосомы, которые содержат уникальные последовательности комплементарной Д Н К. В клинических целях этот метод можно использовать для определения наличия или отсутствия в пределах аномальной хромосомы некоторого сегмента Д Н К и, таким образом, определить, не подвергся ли этот сегмент делении, или найти положение этого сегмента относительно точки балан сированной транслокации. ДНК-анализ применялся также для детектирования Х-хромосомных специфических последовательностей у мужчин с 4fi XX геноти пом и у истинных гермафродитов с тем же генотипом (см. гл. 3.33).

Молекулярная онкология. Известно по крайней мере три типа молекулярных изменений, ассоциированных с опухолями человека, каждое из которых меняет экспрессию онкогенов (см. гл. 59). Сюда входят одноосновные изменения коди рующей области нормальных онкогенов, амплификация числа копий и хромосом 47, XX,+ 48, XY, +2,+ Xp Рис. 58-19. Пример количественного анализа с использованием цитогенетически аномальных клеточных линий.

Саузерн-блоттинг выполнен с кДНК-зондом, перекрестно реагирующим с последова тельностями геномной Д Н К II различных хромосом, включая X и Y. Хромосомный состав указан над каждой линией (а). Ясно видна разница для ДНК-сайтов хромосом 2, Xp, Xq и Y;

в то же время плотности для сайта хромосомы 9 совпадают (б) (из Т. S. Sn et al. — Am. J. Hum, Genet., 1984, 36, 954).

ные транелокации с точкой разрыва в онкогене или рядом с ним. Каждое из этих изменений может быть обнаружено посредством Саузерн-блоттинга.

Анализ опухолевой Д Н К на изменение последовательностей в онкогене, на ам плификацию онкогена и на относительные транслокации обеспечивает в конеч ном итоге получение диагностической и тера/ц?втической информации о данном больном.

Другие опухоли ассоциированы с утратой функции обоих аллелей в специ фических сайтах генома, например, тех, которые в норме подавляют образовав ние опухоли. Если один нормальный аллель такого гена инактивирован, то утрата или деформация сегмента в этой области другой хромосомы будет со провождаться утратой супрессивной функции. Впервые это было показано на примере ассоциации ретинобластомы с определенной областью хромосомы 13q, а затем и ассоциации опухоли Вильмса с областью хромосомы 11р.

Утрата второго функционального гена часто запускает механизм, воздейству ющий на примыкающие участки Д Н К (например, цитогенетическая деления).

Сравнивая опухолевую и неопухолевую Д Н К одного и того же пациента, можно вывести заключение о том, имела ли место утрата гетерозиготпости вблизи локуса-cynpeccopa. В случае доминантно наследуемой ретинобластомы генети ческая консультация может опираться на аиализ по сцеплению с использованием ДНК-маркеров;

для определения фазы сцепления можно использовать анализ опухоли на гетерозиготность, при этом сохранившийся аллель маркирует дефектную хромосому, а утраченный •• конститутивно нормальную.

Диагностическая вирусология и микробиология. Всякий микроорганизм имеет ДНК- или РНК-геном, который можно обнаружить методом гибридизации нуклеиновых кислот. Как уже обсуждалось выше, методы гибридизации чув ствительны и специфичны, и их вполне можно использовать для определения присутствия последовательностей нуклеиновых кислот микроорганизмов в биоло гическом материале, взятом у человека (например, кал, моча, кровь, биопсия тканей). Такие методы могут оказаться особенно эффективными при диагностике цитомегаловируса, ротовируса, вируса Эпстайна — Барра и др.

Другие сферы приложения молекулярного анализа. Фрагменты ДНК, кото рые гибридизируются с многочисленными, повторяющимися, высокополиморф ными последовательностями генома, можно использовать для определения полиморфных различий между двумя индивидами в рамках единственного анали за и даже в том случае, когда варианты фрагментов нелегко приписать к конкрет ным хромосомным сайтам. Анализ такого типа применяется, например, для быст рого определения неидентичности двух индивидов. Например, методом Саузерн блоттинга можно различить неидентичных близнецов или клетки донора и хозяина после пересадки костного мозга. Такие зонды имеют существенные преиму щества перед обычными генетическими маркерами и могут оказаться эффектив ными при определении отцовства и в практике судебной экспертизы для иден тификации индивида по образцам спермы, крови и корней волос. Возможна также типизация тканей по HLA-локусам с использованием ПДРФ;

такие ана лизы ДНК могут дополнить или заменить иммунологические методы.

Клинические продукты рекомбинантной ДНК. Клонированные последова тельности ДНК можно использовать для синтеза белков и пептидов. Основные преимущества этого метода заключаются в возможности производства неогра ниченного количества чистого неконтаминиро'ванного вещества. Продуцентами этих веществ могут служить бактерии или дрожжи.

Правильный сплайсинг эукариотической мРНК в бактериях невозможен, поэтому кодирующие области обычно представлены клонами кДНК или после довательностями синтетической ДНК. Кодирующая область должна быть сцеп лена с теми сегментами бактериальной ДНК, которые управляют транскрип цией и инициируют трансляцию. Основная трудность состоит в нехватке эука риотических механизмов посттрансляционного процессинга. Почти все бактери альные и эукариотические белки подвергаются протеолитическому расщеплению в аминотерминаторах с удалением инициатора метионина, при этом расщепления могут быть многочисленными, как это имеет место при производстве различных гормонов гена проопиомеланокортина. Другие формы посттрансляционной модификации включают в себя добавление углеводов, фосфорилирование, окисление, формирование дисульфидных мостиков и витамин К-зависимое кар боксилирование. Неправильно или не полностью процессированные белки не могут функционировать нормально, но могут обладать антигенными свойствами.

Все эти трудности были преодолены при синтезе человеческого инсулина.

Обычно образование зрелого инсулина состоит в формировании трех дисульфид ных мостиков в одиночной полипептидной цепи с последующим протеолитиче ским расщеплением для.удаления С-пептида и сшиванием а- и Р-цепей. Одна стратегия состояла в раздельном продуцировании а- и р-цепей последователь ностями синтетической ДНК. Поскольку цепь зрелого инсулина не содержит аминокислот метионина и триптофана, то метионин-инициатор оказалось воз можным удалить химически. Затем цепи сшивались, а дисульфидные мостики формировались in vitro.

При производстве гормона роста бактериальная пеитидаза не удаляет из белка амино-терминальный метионин, что. приводит к продуцированию гормона роста с излишним метиониновым остатком в амино-терминале. Хотя метиони лированный гормон роста активен в организме человека, иммунологические соображения препятствуют его широкому применению. Гормон роста может служить примером чрезвычайной дефицитности натурального продукта, а случаи болезни Крейтцфельда — Якоба среди пациентов, получивших гормон роста, выделенный из тканей человека, подчеркивают потенциальные преимущества продукта рекомбинантной ДНК (см. гл. 322). Производство продукции реком бинантной ДНК в метках культуры ткани позволило бы обойти большинство неприятностей, связанных с посттрансляционным процессингом, но при этом мо жет возрасти вероятность контаминации человеческими патогенами. Фактор VIII и фактор IX, полученные методом рекомбинантной ДНК в клетках культуры тканей, проявляют коагулирующую активность.

Некоторые белки, производимые технологией рекомбинантпой Д Н К, более других подходят дли клинического'использования. Те белки, которые присут ствуют в кровяном русле, наиболее пригодны для наметающей терапии. Инсу лин, гормон роста, факторы свертывания крови, ui-антитрипсин, антитромбин I I I и другие белки плазмы крови - все что примеры продуктов, пригодных для парентеральной замещающей терапии. Кроме того, фармакологическое при менение могут иметь продукты, действующие в сосудистой системе и внеклеточ ном пространстве. Например, при остром инфаркте миокарда многообещающим выглядит тромболитическое лечение активатором плазминогена тканевого типа.

Аналогично, предварительную опенку и качестве средств лечения злокачест венных заболеваний проходят интерфероны (u-.-fi- и у-), фактор некроза опухоли и интерлейкин-2. Менее явна ценность продуктов рекомбинантной Д Н К. которые должны функционировать внутриклеточно. Рекомбинантные гормоны для заме щающей терапии получить можно, но остается проблема прицельной внутри клеточной тка«еепецнфичной доставки. Например, можно производить в боль ших количествах u-галактозидазу Л и глкжоцереброзидазу для лечения соот ветственно болезни Фабри и болезни Гоше, но нет достоверной системы до станки этих гормонов. Белки, для которых нет механизма эндоцнтоза. и белки, функционирующие в центральной нервной системе, вряд ли могут рассматри ваться как подходящие кандидаты для заметающей терапии. Хотя большинство продуктов рекомбинантной Д Н К. проходящих в настоящее время испытания, не доведены полностью до зрелого поеттрансляционного состояния, большая их часть биологически активна.

Метод рекомбинантной Д Н К эффективен также при приготовлении диагно стических реагентов и вакцин. Рутинным методом производства вакцин, состоя щим в инактивации вирусных частиц или в выращивании ослабленных живых вирусных штаммов, присущ определенный риск. В ряде случаев имеет место неполная инактивация вируса или контаминация вмкцины другими вирусами.

Кроме того, вакцина против гепатита В, приготовляемая из человеческой плаз мы, может быть загрязнена белками, что вызовет аллергическую реакцию у части полей. Живые ослабленные вирусные штаммы склонны к изменчивости и могут вызывать заболевания у реципиентов с иммунологическим компромиссом. Про шводство же вирусных белков с применением рекомбинантной технологии позво лит получить антигены, приемлемые для вакцинации. В настоящее время имеется вакцина против ящура и проходит испытание на людях антиген гепатита В, продуцентом которого послужили дрожжи. Альтернативным подходом в произ водстве новых, в частности поливалентных, вакцин является введение в геном вирусов вакцинного штамма одной или более последовательностей Д Н К, коди рующих антигены. Например, последовательность Д Н К вируса гриппа реком бинируется с вакциной, чтобы получить вакцину, защищающую и от гриппа, и от возможных последствий вакцинации. ', Технологией рекомбинантной Д Н К могут быть получены также диагно стические реагенты. Например, можно получить антигены вирусов синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и гепатита В для использования их в раднонммуиологических тестах при вирусной диагностике. Многие ферменты, используемые в диагностических тестах, и многие рестрнктазы и полимеразы нуклеиновых кислот, используемые в диагностике методом рекомбинантной Д Н К.

также получены с помощью клонированных генов этих ферментов.

Перспективы исследований Возможности ген-замещающей терапии. Если для некоторого генетического дефекта человека идентифицирован мутантный ген и можег быть получен клонированный нормальный ген, то имеет смысл рассмотреть ряд стратегий для ген-замещающей терапии (табл. 58-3). Основное теоретическое преиму щество ген-замещающей терапии перед фермент- или фактор-замешающим видом терапии заключается и том, что единственное терапевтическое воздей ствие может обеспечить постоянную коррекцию. Helm заболевание вызнано простым недостатком продукта, как при большинстве ферментных дефицитов и болезней свертывания крови, то любое восстановление синтеза нормального Болезни человека, требующие ген-замещающей терапии Т а б л и ц а 58-3.

Болезнь Степень Тканевая специ-, Регуляция Альтернативное ле- Частота встречаемости Сравнитель тяжести чение и его эффект болезни фичность ная осущест вимость!

++ Гемоглобинопатии Большая Трансфузия;

сред- Необходима 1 на 600 в этнических Эритроциты ний до слабого группах ++ Синдром Леша—Ни- Большая Слабый Редко встречаю- Мозг, ?другие Не существенно хена щийся ++++ Лдеиозиндеаминаза и Большая Трансплантация;

Очень редко встре- Костный мозг » »

нуклеозидфосфори- средний до сла- чающиеся лаза бого ++ Фенилкетонурия Малая до Диета;

положи- 1 на 1100 Печень, ? другие средней тельный +++ ui -Антитрипсин Средняя Слабый 1 на 3500 Печень, ? другие ++++ Гемофилия А и В Средняя до Замещение;

слабый 1 на 10 000 мужчин ?Любой орган;

бол ьшой (СПИД) фактор VI + Болезнь лизосомаль- Большая Слабый 1 на 1500 для всех Мозг во многих ного накопления типов случаях ++ Семейная гиперхоле- Большая Диета, лекарствен- 1 на 500 гетерозигот Печень, ?Дру- До некоторой стеринемия ная терапия;

гие степени важ средний но 5 ?

Кистозный фиброз Большая Поддерживающее;

1 на 2000 представи- Нет клона средний до сла- телей белой расы бого э Мышечная дистрофия Большая ? Мышцы Слабый 1 на 10 000 мужчин Нет клона Дюшенна Хорея Гентингтона Большая Слабый 1 на 20 000 ? Мозг р Нет клона Относительная осуществимость отражает попытку принять во внимание необходимость в регуляции, способдоставкн к органу, наличие /альтернативных методов лечения и отношение риск—польза.

Рис. 58-20. Одна из страте КЛЕТКА гий попытки ген-заместитель УПАКОВЩИК ной терапии.

СТВОЛОВАЯ ПАЦИЕНТ КЛЕТКА продукта может иметь благотворные последствия;

при этом обеспечение нормаль ной тканеспепифической экспрессии и точной регуляции экспрессии гена может оказаться не столь уж абсолютно необходимым. Для других генных продуктов, таких как глобины, соответствующий уровень генной и тканеспецифической экспрессии может оказаться критическим. Если продукт мутантного гена ока зывает разрушительное воздействие на организм, то элиминация дефектного гена может оказаться стиль же или даже более необходимой, чем его заме щение. В этой связи усилия генной терапии прежде всего должны быть со средоточены на пациентах с тяжелыми заболеваниями, представляющими угрозу для жизни.

Можно рассмотреть но крайней мере три тина замещений Д Н К. В первом случае кДНК могла бы вводиться под контролем инородного промотора, но в этом случае продукт будет синтезироваться без правильной регуляции. При второй стратегии в геномную Д Н К могли бы включаться последовательности.

необходимые для правильной регуляции уровня и тканевой специфичности экспрессии. Искусственная «минигенная» структура, связывающая геномные регуляторные области с кДНК, обеспечила бы создание конструкции приемле мого размера с правильной регуляцией функции. Такие стратегии, как правило, предполагали бы наличие включений в хромосому случайных последователь ностей Д Н К, хотя возможна и экспрессия экстрахромосомных последователь ностей. Третья стратегия могла бы основываться на использовании сайт-специ фических рекомбинаций, которые удаляли бы мутантную область и замещали ее на нормальные последовательности Д Н К. Однако этот феномен трудно реализовать в животных клетках.

Потенциальными агентами для генной терапии являются ретровирусные векторы. Такие векторы располагают механизмами хромосомной интеграции и способны производить вирусные частицы, кодирующие чужеродную нуклеино вую кислоту. Одна из современных стратегий рассматривает включение кДНК или минигенной ДНК-конструкции в плазменный вектор между двумя вирусными длинными терминальными повторами (ДТП) (рис. 58-20). Эти конструкции можно ввести в культуры клеток, которые обеспечат производство вирусных белков, необходимых для упаковки псевдовирусных частиц, содержащих инте ресующие нас генные последовательности. Например, у больного со специфиче ским дефектом можно было бы взять клетки костного мозга, заразить их по добиымн вирусными частицами, а затем «перезаселить» костный мозг этого больного «перестроенными» клетками. Введение гена в такие ткани, как пече ночная, более сложно, но и тут существуют некоторые возможности.

Рис. 58-21. Стратегия для ИНЪЕКЦИЯ вставочного мутагенеза у мы ДНК ши с последующим клониро или ванием поврежденного ал леля. РЕТРОВИРУС т ВСТАВОЧНЫЙ ЭМБРИОН МЫШИ МУТАГЕНЕЗ ДОМИНАНТНАЯ ИЛИ РЕЦЕССИВНАЯ МУТАЦИЯ У МЫШИ ФОРМИРОВАНИЕ СКРИНИНГ КЛОНОВ БИБЛИОТЕКИ ДНК С ЗОНДАМИ ДНК Альтернативные стратегии могут заключаться в упаковке Д Н К в липосомы, наработке вирусных векторов и использовании векторов, остающихся в экстра хромосомном состоянии. Однако всякий раз отношение польза -риск при соматической ген-замещающей терапии должно оцениваться индивидуально.

Случайные включения в геном последовательностей Д Н К связаны с возможным риском карциногенеза. Опираясь на опыт использования ретровирусов, не со держащих онкогенов, можно утверждать, что риск может быть сравнительно невелик, если вирусы не репродуцируются в организме реципиента. Такой риск может быть оправдан для больных с угрожающим жизни заболеванием, осо бенно при отсутствии разумной терапевтической альтернативы. Возможным кандидатом для первых попыток в этой области может явиться дефицит адено зиндеаминазы, а также и другие дефициты ферментов и факторов свертывания.

В том случае, если окажется возможным обеспечить правильную регуляцию генов глобина, важными претендентами окажутся такие заболевания, как сер повидно-клеточная анемия и талассемия, поскольку, во-первых, костный мозг доступен для манипуляций in vitro, во-вторых, заболевания эти относительно широко распространены и, в-третьих, природа их достаточно сложна. Серьез ным вызовом для исследователя являются нарушения, требующие точной регу ляции генной и тканеспецифической экспрессии, что характерно для заболеваний центральной нервной системы.

Фундаментальные исследования. В настоящее время клонировано более 300 генов человека и других млекопитающих. Многие из этих генов являются частью сложных функциональных систем, природу которых мы понимаем лишь частично. Клонирована группа генов, управляющих сегментом дифференциации у дрозофилы;

гомологичные последовательности имеются и у человека, и они могут обладать сходными функциями. Изучение и клонирование генов, ответ ственных за развитие хореи Гентингтона, поликистоза почки, кнетозного фиброза и мышечной дистрофии Дюшенна, способствуют углублению нашего понимания биологии нормальных аллелей этих генов и могут привести к разработке новых методов терапии хотя бы некоторых из этих заболеваний.

Метод рекомбинантной Д Н К может оказаться мощным инструментом изучения нейробиологии и биологии развития. Можно создать библиотеку клонированных к Д Н К для специфических участков ЦНС и для специфических этапов эмбриогенеза. Другая стратегия рассматривает генерацию новых му таций у мыши методом вставочного мутагенеза (рис. 58-21). Чужеродную Д Н К можно в случайном порядке ввести в геном раннего эмбриона мыши либо прямой инъекцией, либо с помощью ретровирусного заражения. При этом функциональные области Д Н К способны разрываться, образуя. рецессивные или доминантные фенотипы. Затем можно отобрать те фенотипы, которые представляют биологический интерес, например, связанные с аномалиями разви тия или неврологическими нарушениями. Вставочную чужеродную Д Н К можно использовать в качестве зонда для клониропания поврежденных участков Д Н К.

Таким образом можно создавать информативные мутантныо фенотипы и сразу же клонировать интересующий ген. Клонированные последовательности можно использовать для поиска последовательностей мРНК, а по ним определять сайты тканеспецифической экспрессии и временные характеристики экспрессии гена. Если данный участок кодирует белок, то по последовательностям нуклеи новых кислот можно определить структуру пептидов, которые затем можно синтезировать и использовать для наработки антител, с помощью которых мож но было бы определить тканеспецифическое и клеточноспецифическое размещение этого белка. Например, метод вставочного мутагенеза был использован для идентификации летальной эмбриональной мутации в гене коллагена типа I у мыши. Перечисленные средства позволяют создавать информативные фено типы, исследовать молекулярную основу фенотипа и делать заключения о соот ветствующей нормальной биологии и физиологии.

Наличие подробных генных карт человека значительно упрощает поиски генетических вариаций, ассоциированных с предрасположенностью к заболе ванию. Тот факт, что многие известные болезни ассоциируются с HLA-локусом, может объясняться либо тем, что гены предрасположенности к заболеваниям локализуются преимущественно в этой области, либо тем, что для высоко полиморфных маркеров проще получать данные. По мере картирования посред ством ПДРФ других частей генома могут проявиться дополнительные ассоциа ции между заболеваниями и генетическими маркерами. Такие ассоциации будут способствовать идентификации тех генов, вариации которых предрасполагают к полигенным или многофакторным заболеваниям.

Этические соображения. В настоящее время пренатальную диагностику осуществляют при болезнях различной степени тяжести, таких как дефицит ai-антитрипсина, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия, мышечная дистрофия и семейная гиперхолестеринемия. В вопросе о допустимости искус ственного прерывания беременности по поводу этих заболеваний мнения обще ственности и отдельных лиц разделились. Развитие ген-замещающей терапии и других методов лечения неизлечимых ныне генетических заболеваний может выразиться в конечном итоге и в снижении частоты абортов.

Возможности ген-замещающей терапии затрагивают и другие этические проблемы. Соматическая ген-замещающая терапия связана с индивидуальной оценкой соотношения «риск -польза» для каждого больного. До тех пор пока не затрагивается Д Н К половых клеток, людей обычно интересует лишь один серьезный этический вопрос: наилучшим ли образом соответствует данный метод лечения интересам пациента? Опыт химиотерапии рака позволяет предполагать, что небольшой уровень ненамеренных повреждений Д Н К половых клеток вос принимается как нежелательный, но оправданный риск такой терапии, если она приносит больному существенную пользу. Можно представить, что в будущем методы сайт-специфической рекомбинации позволят замещать мутантную Д И К в половых клетках нормальным материалом. Если кто-то раз и навсегда сможет корректировать в половых клетках человека мутации, приводящие к кистозному фиброзу, хорее Гентингтона или серповидно-клеточной анемии, и если лечение будет эффективным и безопасным, то будет ли общество рассматривать такую терапию как грубое вмешательство?

Список литературы Antonarakis S. E. et. al. DNA polymorphism and molecular pathology of the human globin gene clusters. -Hum. Genet., 1985, 69, 1.

Beaudet A. L. Bibliogeaphy of cloned human and other selected DNAs. — Am. J.

Hum. Genet., 1985, 37, 386.

Botstein D. et. al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. — Am. J. Hum. Genet., 1980, 32, 314.

Gill P. et al. Forensicapplication of DNA „fingerprints". - Nature, 1985, 318, 577.

GusellaJ. F. et al. DNA markers for nrvous system diseases. — Science, 1984, 225, 1320.

Lawn R. M. et al. The molecular genetics of hemophilia: Blood clotting factors VIM and IX. - Cell, 1985, 42, 405.

Monaco A. P. ct al. Detection of.deletions spanning the Duchenne muscular dystro phy locus using a tightly linked DNA segment. - Nature, 1985,.416,' 8\2.

Newmark P. Testing ior cystic fibrosis. -- Nature, 1985, 318. 309.

Reciters S. T. et al. A highly polymorphic DNA marker linked to adult polycystic kidney disease on chromosome 16. - Nature, 1985, 317, 5-12.

Walson J. D. et al. Recombinant DNA. A Short Course. - Scientific American Books. Distributed by W. A. Freeman Co., New York, 1983.

Williams D. A. et al. Introduction of new genetic material into pluripotent haema topoietic stem cells of the mouse. Nature, 1984, 310, 476.

Г Л А В А ОНКОГЕНЫ И НЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ Поль Нейман (Paul Neiman) При делении раковые клетки передают дочерним клеткам неоиластический фенотип. По этой причине получило всеобщее распространение мнение о том, что наследование неоплаетического фенотипа предопределяется специфическими генами. Это предположение объясняет чрезвычайный интерес исследователей онкологов к онкогенным вирусам. Несмотря на сравнительную генетическую простоту, они вызывают все патологические и клинические изменения, ассоцииро ванные с неопластическим заболеванием, и в некоторых случаях вирус способен вводить в нормальную клетку единственный ген (онкоген), продукт которого инициирует и поддерживает неопластическое состояние. Онкогены представляют собой измененные формы клеточных протоонкогенов, которые в норме выпол няют в клетке важные функции. Человеческие гомологи некоторых ни этих онкогенов могут играть определенную роль в раковых заболеваниях человека.

Эта ситуация поднимает ряд вопросов относительно природы онкогенов, управ ления их экспрессией, биохимической природы их генных продуктов и механизмов взаимодействия с метаболизмом клетки-хозяина.

Ретровирусные онкогены. Взаимодействие ретровирусов с к л е т к о й - х о з я и н о м. Открытие онкогенов явилось результатом изуче ния молекулярной биологии РНК опухолевых вирусов (ретровирусов). Ретро вирусы широко распространены в природе и инфицирование некоторыми из них ассоциируется с новообразованиями у животных;

другие же опухолегенными свойствами не обладают. Геном ретровируса представляет собой молекулу РНК длиной от 8000 до 10 000 нуклеотидов. Отличительной особенностью жизненного цикла ретровирусов является то обстоятельство, что после проникновения вируса в клетку геномная молекула РНК копируется на ДНК (обратная транс крипция), и ДНК-копия интегрируется с хромосомной ДНК клетки-хозяина (отсюда и название ретровируе) (рис. 59-1). Эта интегрированная ДНК назы вается провирусом. Структура типичных провирусов схематически изображена на рис. 59-2. Длинные терминальные повторы (ДТП) содержат последователь ности, скопированные с обоих концов геномной РНК вируса, размещены па каждом конце ДНК провируса и сцеплены непосредственно с ДНК хозяина.

ДТП содержат последовательности, регулирующие экспрессию генов при репли кации вирусов: gag кодирует внутренние структурные белки, pol - обратную транскриптазу, env — гликопротеин вирусной оболочки. В регуляторные после довательности включены сигналы инициации и терминации транскрипции. Обыч но они содержат также могучий ген усилитель, способный настолько повысить темп транскрипции вирусных генов, что провирусный РНК-транскрипт будет составлять от 0,1 до 1 % полного клеточного содержания мРНК. Промоторы и усилители транскрипции обычно включаются лишь в клетках определенного типа, чем и определяется тканеспецифичность вирусных генов. В других случаях активность последовательностей-усилителей реализуется стероидными гормонами.

В отличие от многих других вирусов ретровирусы обычно не приводят клетку хозяина к гибели после завершения репликации;

вместо этого они встраиваются в экзогены, вызывают их экспрессию и тем самым меняют фенотип клетки хозяина.

) Клеточный V Провирус/Я Геном / Рис. 59-1. Репликация ретровирусов.

(1) Оболочечный гликопротеин на поверхности вирусных частиц (вирионов) опознает рецепторы, способствующие входу в клетку, и освобождает вирусную геномную РНК.

(2) Каждый вирион содержит две молекулы вирусной РНК, которые в клетке копи руются обратной транскриптазой в циклические скрученные молекулы вирусной Д Н К.

(3) Некоторые из циклических молекул Д Н К встраиваются в хромосомную Д Н К хозяина в строго определенных точках молекулы.вирусной Д Н К и в случайном, или почти слу чайном, сайте хромосомы хозяина. (4) Интегрированная копия вирусной Д Н К. или провирус, транскрибируется как в мРНК, которая транслируется на клеточных полисо мах в вирусные белки ( 5 ), так и в полимерную геномную вирусную РНК, которая содержит специфические последовательности, служащие сигналами упаковки при сборке вируса. (6) Вирусные РНК и белки собираются в частицы, которые затем покидают клетку. Весь процесс может не сопровождаться цитонатическими эффектами для клетки хозяина.

Остротрансформирующие ретровирусы и их онко г е н ы. Заражение животных ретровирусами, содержащими только гены gag, pol и env, сопровождается новообразованиями лишь после долгого латентного периода. Напротив, остротрансформирующие ретровирусы в считанные дни или недели могут вызвать неоплазию in vivo или привести к перерождению клеток в культуре in vitro. Прототипом этого.класса вирусов служит вирус саркомы Рауса. Структура провирусов из этих двух классов онкогенных агентов при ведена на рис. 59-2. Почти все известные остротрансформирующие ретровирусы дефективн'ы, т. е. они утратили часть генов, необходимых для репликации, и, следовательно, их распространение возможно лишь путем коинфекции со стандартными ретровирусами-хелперами. Такие дефекты являются результатом замещения репликативных генов вируса на онкоген, который играет роль по средника для непосредственно трансформирующих свойств вируса. Исключения из этого общего правила представлены некоторыми штаммами вируса саркомы Рауса, которые имеют как репликативные гены, так и онкогены. Хотя конкрет ный сегмент вирусного генома, который замещается на онкоген, может варьиро вать, общая конфигурация остротрансформирующих вирусов такова, как это показано на рис. 59-2. В этом случае онкоген спаян с 5'-областью вирусного гена gag, в результате чего синтезируется трансформирующий белок с пепти дами gag в аминотерминале.

В табл. 59-1 приводится список некоторых вирусов онкогенов, их природных Стандартный недефективный ретровирус: Развитие _,_ опухоли.. 9*0 pol env ЩЩ 1 1 рут Длинный, 1~У • „, •• латентный,_.. период Остротрансформирующий ретровирус |дтп|. | ВИРУСНЫЙ ОНКОГЕН I Rrnj Короткий.,.,,,,,,.,,,, ~^*, „т. латентный период Рис. 59-2. Сравнительные структуры провирусов со стандартной компетентной репликацией и остро трансформирующих ретровирусов.

В обоих случаях провирус окаймлен прямыми последовательностями длинных терми нальных повторов ( Д Т П ), которые содержат основные элементы регуляции: включая промоторы и усилители транскрипции, сигналы терминации транскриптов вирусной Р Н К (сигналы добавки поли-А) и сигналы интеграции в Д Н К хозяина. Между Д Т П стандартного ретровируса находятся три гена: gag (внутренние структурные белки), pol (обратная транскриптаза) и env (гликопротеин оболочки), которые необходимы для инфекции и репликации. У остротрансформирующих вирусов все или часть репли кативных генов замещены трансформирующим онкогеном, который и определяет онко генные свойства вируса. Наиболее общей структурой является спайка 5'-участка гена gag с онкогеном. Стандартный провирус транскрибируется в полномерную вирусную РНК и в мРНК для синтеза вирусных белков. Остротрансформирующий провирус часто чкспрессирует только один сайт РНК-транскрипта. В этом случае репликация дефек тивна и для размножения требуется коинфекция со стандартным ретровирусным «хел пером». Символ Agag означает, что часть последовательности gag исчезла в резуль тате дслеции.

хозяев и типов опухолей, которые они вызывают. В случае вируса саркомы Рауса роль гена src в неопластических трансформациях была установлена средствами генетики и биохимии. Известны мутации, вызывающие обратимую инактивацию продуктов гена src при повышении температуры (так называемые темиературочувствительные мутации). Эти мутации переводят трансформиро ванный фенотип в. нормальное состояние, если инфицированные клетки под вергаются воздействию повышенной температуры. При понижении температуры клетки снова возвращаются в трансформированное состояние. Аналогичные, хотя и не столь полные, данные получены и для других вирусов, перечисленных к табл. 59-1.

Почти все трансформирующие вирусы могут быть обнаружены in vitro по их способности вызывать перерождение клеток в культуре. Стандартный тест со стоит в формировании инфицированными фибробластами (или линиями фибро бластоподобных клеток) морфологически измененных клеток. Некоторые из по рождающих лейкемию вирусов могут трансформировать макрофаги и/или кроветворные клетки in vitro" Протоонкогены. Онкогены ретровирусов находятся в близком родстве с нор мальными генами клеток. Это родство было установлено в результате открытия гомологичности в нуклеотидных последовательностях трансформирующего онко гена вируса саркомы Рауса v-src (вирусного src) и нормального гена цыпленка с-сгс (клеточного src). Очевидно, вирус саркомы Рауса явился результатом рекомбинаций между c-src и древним стандартным ретровирусом птиц. Такой механизм - рекомбинация между вирусным геном и геном хозяина — служит очевидным объяснением образования трансформирующих вирусов (см. табл. 59-1).

По этой причине функции нормальных генов и их роль в невирусных ново образованиях вызывают повышенный интерес исследователей.

В природе нормальные формы онкогенов весьма консервативны. Для каж дого из них существуют человеческие гомологи, а гомологи некоторых из них присутствуют во всех эукариотических организмах, до беспозвоночных и дрож жей включительно. Такой консерватизм наводит на мысль, что эти гены вы полняют в нормальных клетках жизненно важные функции, и предполагает, Т а б л и ц а 59-1. Вирусные онкогены, вызывающие острые трансформации Onyxo.in in vivo Название Вирус Цыплята src Вирус саркомы Рауса Саркомы yes Вирус саркомы Y73 Саркомы ips'/fes Вирус саркомы Fujinami Саркомы ros Вирус птичьей саркомы URI1 Саркомы erb/B Вирус птичьего эритробластоза (AEV) Эритрондный лейкоз myb Вирус птичьего миелобластоза (AMV) Миелоидный лейкоз myc Вирус птичыто миелоцитоза (МС-29) Лейкоз, эндотелиома sci Птичий вирус- SKV/770 Неизвестно Индюки rel Вирус ретикулочндотелиоза (REV) Лимфомы Мыши аЫ Вирус лейкоза Abelson В-лимфомы mos Вирус мышиной саркомы Саркомы Молони (MoMSV) fos Вирус остеосаркомы FBj Остеосаркома raf Вирус мышиной саркомы 3611 Саркомы Крысы Вирус мышиной саркомы Саркомы, зритроид Ha-ras- Гарвея (HaMSV) ный лейкоз Ki-ras-2 Вирус мышиной саркомы Саркомы, эритроид Кирстеиа (KiMSV) ный лейкоз Кошки Вирус кошачьей саркомы Саркомы ies/fps Snycler Thiplen ST-FeSV fms Вирус кошачьей саркомы Саркомы McDonough (SM-FeSV) fgr Вирус кошачьей саркомы Саркомы Gardner—Rasheeds (GR-teSV) Обезьяны Саркомы sis Вирус обезьяньей саркомы (SSV) что онкогенный потенциал приобретается генами только после функционально значимых изменений (таких, например, какие происходят при рекомбинации с ретровирусом). О таких генах говорят как о пр от о о н к о г е н а х (е-опс).

Нуклеотидные последовательности белков кодирующих областей вирусных онкогенов отличаются от таковых для протоонкогенов. Существуют также прин ципиальные различия.в регуляции экспрессии вирусных и клеточных генов.

Например, нормальные клеточные формы онкогена могут экспреесироваться без трансформации клетки, хотя обычно экспрессия протекает на более низком уровне и/или с более жесткой регуляцией, чем для вирусных онкогенов, экс прессируемых провирусами. Относительные вклады сверхэкспрессии, измененной регуляции и структурных мутаций в трансформирующую активность вирусных онкогенов не вполне ясны. Все эти элементы могут обладать той или иной степенью важности в зависимости от конкретного онкогена и типа клетки-ми шени.

Инфицирование ретровирусами. не содержащими онкогенов, может вызвать новообразования у некоторых животных, но после долгого латентного периода.

Общим механизмом такой онкогенной активности является активация клеточ ных протоонкогенов, на что указывает образование лимфом в фабрициевой сумке цыплят, зараженных вирусом лейкоза птиц (ВЛП). При этих новообра зованиях протоонкоген, называемый с-тус, экспрессируется с высоким уровнем в результате интеграции промотора-усилителя ВЛП-генома вблизи с-тус. Тот Т а б л и ц а 59-2. Протоонкогены и предполагаемые протоонкогены, активирующиеся в опухолях путем интеграции с ретровирусными провирусами Локус- или Вирус Опухоль 1 ой-мишень с-тус Вирус птичьего лейкоза Лимфомы В-клеток (цыплята) Вирус кошачьего лейкоза Лимфомы (кошки) с-тус Вирус мышиного AKR-лейкоза Лимфомы Т-клеток (мыши) с-тус Вирус птичьего лейкоза Эритроидный лейкоз (цыплята) c-erb В Вирус мышиного AKR-лейкоза Лимфома Т-клеток (мыши) Pim- Вирус мышиного лейкоза Мо- Лимфома Т-клеток (крысы) Mbvi- лони Вирус мышиного лейкоза Мо Mbvi-2 Лимфома Т-клеток (крысы) лони Вирус опухоли молочной железы Аденокарцинома молочной желе Int- мыши зы (мыши) Вирус опухоли молочной железы Аденокарцинома молочной желе Int- мыши зы мыши факт, что эти опухоли клонируются и активация с-тус наблюдается только в опухолевых клетках, вкупе с известным онкогенным потенциалом v-myc под тверждает идею о том, что с-тус играет важную роль в образовании этих опухолей. В табл. 59-2 приведен список протоонкогенов, о которых известно, что они активируются в порождаемых ретровирусом опухолях с большим ла тентным периодом. Некоторые из- них (myc, erb В) гомологичны известным вирусным онкогенам. Другие (Int-1, Int-2, Pim-I, Mlvi-1, Mlvi-2) не иденти фицированы как части геномов остротрансформирующих вирусов. Их онкоген пый потенциал выводится по аллелям.

Ретровирусы человека. Вирусы лейкоза Т-клеток человека (HTLV) являются ретровирусами, реплицирующимися преимущественно в лимфоцитах человека.

Инфицирование HTLV типа I ассоциировано с развитием специфического типа лейкемии Т-клеток у взрослых, которая с нарастающей частотой встречается в южной Японии и странах Карибского бассейна. Инфицирование in vitro штаммом HTLV-I культуры Т-клеток человека подтверждает способность вы зывать рост независимо от экзогенных факторов роста Т-клеток (иммортали ация). Инфицирование другим вирусом, называемым HTLV-I1I, ассоциируется с синдромом приобретенного иммунодефицита. То же самое справедливо для вируса LAV, ранее ассоциированного с лимфаденоиатией. По-видимому, HTLV не содержат клеточно-зависимых онкогенов. Вместо этого они меняют поведение клетки-хозяина уникально взаимодействующими вирусными регуляторными бел ками.

Нормальная человеческая Д Н К содержит структуры, которые могут оказать ся провирусами и генетически передаются половыми клетками. Значимость таких структур неизвестна.

Транс Активированные клеточные онкогены, детектируемые трансфекцией.

ф е к ц и о н н ы й т е с т на о.н к о г е н ы. Некоторые из известных клеточных линий обладают способностью инкорпорировать экзогенную Д Н К в свой хромо сомный аппарат с такой эффективностью, что появляется возможность экспе риментального введения гена (трансфекции) непосредственно в культуру тканей.

Технология трансфекции обычно заключается в осаждении Д Н К на поверх ность клеток-мишеней фосфатом кальция с последующим- поглощением Д Н К внутрь клетки посредством пиноцитоза. Некоторые из поглощенных молекул /ДНК транспортируются в клеточное ядро и интегрируются в хромосомную Д Н К.

Если трансфектированная Д Н К содержит ген, который может экспрессироваться в клетке-реципиенте как доминантный селектируемый маркер, то клетки, экс прессирующие этот признак, могут быть обнаружены в культуре с эффектив ностью до одной клетки на каждые. 105 событий трансфекции. Многие из вирус Т а б л и ц а 59-3. Онкогены, обнаруженные в опухолях человека трансфекцией клеток Nill ЗТЗ Онкоген Опухоли или опухолевые линии клеток Линии клеток из карциномы мочевого пузыря EJ/T24, карциномы с-гас легкого и карциносаркомы молочной железы Карциномы легкого, толстой кишки, мочевого пузыря, поджелу с-гас дочной железы и яичника;


рабдомиосаркома Нейробластома, фибросаркома, промие.юцитарный и острый мие лоцитарный лейкоз, лимфома Беркитта и карцинома толстой кишки HuBlym-1 Несколько линий клеток из лимфомы Беркитта Tlym-1 Линии клеток из Т-клеточной лимфомы' Клонированный ген Tlym-1 мышиного происхождения. Судя по паттернам инактивации рестриктазами, аналогичный трансформирующий ген активирован в линиях из Т-клеточ ных лимфом человека.

ных онкогенов, (см. табл. 59-1) могут вызвать трансформации и тестах описан ного типа. Трансформация такого рода имеет место как при использовании чистой онкогенной ДНК, так и при использовании хромосомной ДНК клеток, трансформированных ретровирусами.

С помощью данной технологии можно обнаружить также активированные клеточные онкогены в ДНК опухолей, вирусная природа которых не доказана.

Например, трансформирующие гены содержатся в ДНК химически трансформи рованных клеток животных и в ДНК клеток разнообразных опухолей человека и животных нативного происхождения. Нормальная высокомолекулярная ДНК человека не трансформирует клеток, однако трансформирующие гены можно активировать фрагментацией нормальной клеточной ДНК. Эти результаты подтверждают концепцию об активации протоонкогенов нормального генома при формировании опухоли, но они ничего не говорят о том, является ли акти вация трансформирующих генов причиной или следствием неопластического фенотипа. Хотя лишь небольшая часть ДНК опухолей человека проявляет транс формирующие свойства при трансфекции, эти наблюдения открывают новые пути исследования молекулярной генетики новообразований человека.

С е м е й с т в о к л е т о ч н ы х о н к о г е н о в r a s. Некоторые и з транс формирующих генов, обнаруженные путем трансфекции клеток с помощью ДНК, взятой из клеток опухолей человека, в настоящее время идентифицированы (табл. 59-3). В основном "эти онкогены принадлежат к семейству генов, назы ваемому «гас». Первым был идентифицирован человеческий гомолог онкогена вируса мышиной саркомы Гарвея (см. табл. 59-1), названный с-гас", коди рующий белок с мол. массой 21 000, названный р21. Этот онкоген был активи рован в линии клеток, выделенных из карциномы мочевого пузыря человека.

Уровень экспрессии белка р21 в клетках, трансформированных вирусом саркомы Гарвея, достаточно высок, и высокоуровневая экспрессия с-гас, вызываемая в эксперименте сцеплением этого клеточного гена с вирусными регуляторными элементами, достаточна для индуцирования трансформации клеток. Однако в тех линиях клеток опухолей человека, в которых с-гас!' обнаруживается, он не про являет высокого уровня экспрессии. Вместо этого способность к трансформации клеток определяется, по-видимому, точечными мутациями, которые приводят к подмене аминокислот в 12-й или 61-й аминокислотной позиции белка р21.

Таким образом, этот протоонкоген активируется либо изменением регуляции, либо мутациями в структуре белка.

Чаще активирован в человеческих опухолях второй ген семейства гас — человеческий гомолог трансформирующего гена вируса мышиной саркомы Кир стена, названный с-гас. Около 10—20 % ДНК из различных новообразований человека содержит ген с-гаск, трансформирующий клетки при трансфекции (см. табл. 59-3). Белок, кодируемый геном с-гас\ — это та же самая молекула р21, и его трансформирующая активность связывается се структурной мутацией белка, подобной той, что наблюдается для гена с-rac". Эта мутация отсутствует в ДНК, извлеченной из нормальных тканей больных, пораженных карциномами, которые содержат активированный ген с-rac";

это обстоятельство свидетельствует.

что активация является соматическим событием, происходящим в процессе формирования опухоли. И наконец, в других экспериментах с трансфекцией ДНК, извлеченной из некоторых опухолей, трансформация индуцируется третьим членом этого семейства, называемом ras N. Активация ras N имеет место в 10 — 20% случаев острых миелоидных лейкемий человека.

Активация генов ras обычна для некоторых химически индуцированных эпителиальных карцином у грызунов, что предполагает активацию этих генов химическими карциногенами. Однако у человека активированные ras-гсны най дены лишь в небольшой части опухолей. Это означает, что в человеческих опухолях имеют место еще не идентифицированные изменения генов ras, либо то, что в процессе развития опухолей вместо изменения генов ras происходит изменение других генов. Ни одна из этих вероятностей не может быть опреде лена посредством стандартных опытов по трансфекции. Возможна и другая альтернатива - активация всех онкогенов может оказаться результатом неопла стического состояния, а не его первопричиной. Формального доказательства причинной роли активированных ras-генов в тех опухолях человека, в которых они обнаруживаются, не имеется.

В о з м о ж н ы е к л с т о ч и о с п е ц и ф и ч е с к и е о н к о г е н ы. В отли чие от генов семейства ras, проявляющих активность при новообразованиях многих типов, активация других онкогенов может оказаться специфичной для нсопластических состояний клеток определенного типа. Первым из этой группы был идентифицирован ген, названный ChBlym-1. ДНК из лимфом цыплят, индуцированных вирусом птичьего лейкоза, трансформирует клетки при транс фекции, в то время как ДНК из нормальных тканей тех же самых птиц этим свойством не обладает. Ген Ch Blym-I, который, как полагают, отвечает за эту активность, был получен из клеток, трансформированных ДНК, выделенной из клеточных линий лимфомы фабрициевой сумки. Этот ген, по-видимому, не имеет отношения к ras или другим вирусным онкогенам, описанным в табл." 59-1. Как и для других онкогенов, нуклеотидные последовательности ChBlym-1 законсервировались в процессе эволюции и постоянно присутствуют в ДНК человека.

Как. и вирусиндуцированные лимфомы цыплят, человеческая лимфома Гэеркитта состоит из тех же самых В-клеток, находящихся примерно на той же стадии дифференциации. ДНК, извлеченная из клеток большинства линий лимфомы Беркитта, может трансформировать клетки при трансфекции. Это свойство объясняется, по-видимому, активностью гена, называемого HuBlym-l, который на уровне последовательностей ДНК на 50 % гомологичен гену ChBlym-1. Таким образом, онкогены Blym активированы в В-клеточных лимфо мах как цыплят, так и людей, но в опухолях других типов их не обнаруживают.

Поскольку характеристики'нормальных гомологов этих трансформирующих генов неизвестны, то неизвестны и молекулярные причины их активации.

Другие В- и Т-клеточные новообразования и аденокарциномы молочной железы содержат трансформирующие гены, которые, похоже, различны для каждого типа опухоли. Например, трансформирующий ген новообразований с промежуточной стадией дифференциации Т-клеток, называемый Tlym-1, отличен от других известных онкогенов.

Онкогены, участвующие в образовании опухолей, вызываемых хромосом ными транслокациями и другими перестройками. Третья волна свидетельств об активации онкогенов в процессе формирования опухоли возникла из анализа цитогенетических изменений в новообразованиях человека. Большинство опухолей человека являются клепальными, или олигоклональными, т. е. в популяции составляющих их клеток доминирует потомство одной или нескольких клеток.

В определенных новообразованиях доминантные клеточные клоны маркированы существенными хромосомными аномалиями, такими, например, как реципрокные транслокации между хромосомами 9 и 22 при хроническом миелогеином лейкозе (с образованием филадельфийской хромосомы, Ph') или между хромосомами и 14 в случае лимфомы Беркитта. В настоящее время характеристические 7-77 Локализация некоторых протоонкогенов в хромосомах Т а б л и ц а 59-4.

человека Ген Хромосома Сублокализация в хромосоме или зона 8 q с-тус с-аЫ q c-mos (] c-fes 15 q24—q c-myb q22—q c-mil (raf) p N-ras cen--p c-ras" 11 pl4. K c-ras 12 p 12.05 -vter c-etc 11 q23 —q c-erbB pter-q c-erbA q21—q HuBlum-1 p c-fms q c-fos 14 q21--q c-ski NA c-sis qll-*ter c-src-I p34—p c-src-2 ql2^ter короткое плечо хромосомы, сел — центромер, ter — q — длинное плечо хромосомы, р терминал, NA — неизвестно.

неслучайные хромосомные изменения идентифицированы для многих новообразо ваний. Гены, находящиеся в сайте перестроенной Д Н К или рядом с ним и явля ющиеся первопричиной этих онтогенетических изменений, могут играть опреде ленную роль в развитии опухолей. Успехи гибридизации in situ и других методов генетики соматических клеток дали возможность определить приблизительные положения ряда протоонкогенов в хромосомах человека (табл. 59-4). Некоторые из этих генов расположены вблизи точек разрыва хромосом, трансформируемых при определенных опухолях.

П е р е с т р о й к а л о к у с а с-т у с в к л е т к а х л и м ф о м ы Б е р к и т т а. Как показано в табл. 59-4, с-тус ген человека расположен на хромо соме 8. Эта хромосома неизменно участвует в транслокации клеток лимфомы Беркитта. На уровне Д Н К транслокация состоит в рекомбинации между с-тус локусом хромосомы 8 и локусом гена иммуноглобулина, расположенного обычно вблизи гена тяжелой цепи в хромосоме 14 или, реже, вблизи гена легкой цепи в хромосомах 2 или 22. По-видимому, эта транслокация не влияет на ту часть с-тус локуса, которая кодирует белок, но воздействует на регуляцию его экс прессии. Аналогичные транслокации, приводящие к рекомбинации между с-тус и генами иммуноглобулина имеют место и в плазмацитомах мышей.


А л ь т е р а ц и и э к с п р е с с и и г е н а c - a b l в р е з у л ь т а т е хро м о с о м н о й т р а н с л о к а ц и и при х р о н и ч е с к о м м и е л о л е й к о з е.

У большинства больных с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) хромосома P h ' присутствует как в пораженных клетках, так и в поколениях нормальных клеток костного мозга. Считается, что при этом заболевании костный мозг и перифери ческая кровь заселены потомками кроветворной стволовой клетки, которые сохра няют способность дифференцироваться в красные кровяные клетки, мегакариоциты и гранулоциты. Однако пролиферация гранулоцитов аномальна и чрезмерна, что и вызывает клинические проявления ХМЛ. Гены, экспрессия которых аль терируется вследствие формирования филадельфийской хромосомы, должны рассматриваться как возможные виновники развития ХМЛ. Человеческий го молог протоонкогена с-аЫ (см. табл. 59-1) расположен вблизи точки разрыва хромосомы 9 при транслокации 9—22 и при обмене переходит в хромосому 22.

Оказалось, что в Ph'-хромосоме экспрессия с-аЫ претерпевает количественные и качественные изменения. Уровни с-аЫ РНК возрастают, а оба предоминант ных РНК-транскрипта гена и с-аЫ белка становятся больше, чем с-аЫ РНК и белковые молекулы нормальных клеток. Полагают, что РНК и белковые про дукты с-аЫ локуса клеток ХМЛ включают в себя совокупный продукт с-аЫ и гена, называемого bcr (breakpoint claster region — область разрывного кластера), расположенного в точке разрыва на рекомбинантной Ph'-хромосоме Если эта альтерация с-аЫ и играет роль в развитии ХМЛ, то это должно про являться на ранней стадии заболевания.

А м п л и ф и ц и р о в а н н ы е п р о т о о н к о г е н ы в о п у х о л я х че л о в е к а. Увеличение числа копий гена на клетку (амплификация гена) иногда проявляется на цитогенетическом уровне формированием небольших хромосомо подобных структур, называемых двойными малыми хромосомами, или появлением гомогенно окрашенных участков (ГОУ) в регуляторных хромосомах. ГОУ появляется в результате амплификации сегментов ДНК до такой степени, что это обнаруживается цитогенетически. Как следствие такая структура содержит множественные копии гена (генов), закодированных в данном сегменте ДНК.

В нетрансформированных клетках амплификацию гена можно иногда индуциро вать выращиванием клеток в специальных условиях. Например, клетки с ампли фицированным геном дигидрофолатредуктазы, которая необходима для реплика ции ДНК, можно получить, если выращивать их (с последующим отбором) в присутствии небольшого количества метотрексата ингибитора дигидрофолат редуктазы. При увеличении числа копий гена возрастает производство фермента в клетке и тем самым компенсируется действие ингибитора. Двойные малые хромосомы и ГОУ присутствуют во многих разновидностях опухолевых клеток, так что можно предположить, что гены, критические для роста неопластических клеток, могут амплифицироваться в процессе формирования опухоли.

Первым амплифицированным онкогеном, опознанным в опухолевых клетках человека, был ген с-тус, который экспрессировался на высоком уровне в одном случае промие.лоцитарного лейкоза как в исходных опухолевых клетках, так и в производных линиях клеток. Амплификация с-тус при этом заболевании оказалась редким событием и в других случаях промиелоцитарного лейкоза не наблюдалась. Однако двойные малые хромосомы, амплификация с-тус генов и повышенный уровень с-тус РНК наблюдались в ряде случаев рака желудка и мелкоклеточного рака легкого, а амплификация протоонкогена наблюдалась в двух линиях клеток из карциномы толстой кишки человека. Высокая частота двойных малых хромосом и ГОУ характерны для нейробластом человека. Ген, называемый N-myc и родственный гену с-тус, имеет высокий уровень амплифи кации и/или экспрессии в большинстве нейробластом, в производных от ней робластом линиях клеток и в других нейроэндокринных опухолях. Степень амплификации и/или экспрессии N-myc может сильно варьировать в пределах популяции опухолевых клеток.

Функция онкогенов. Изучение белков, кодируемых вирусными онкогенами и их нормальными клеточными гомологами, проясняет механизмы функциони рования этих генов. Белковый продукт гена v-src вируса саркомы Рауса рабо тает как тирозинпротеинкиназа, ферментная активность которой определяет онкогенные свойства v-src. Белковые продукты пяти других вирусных онкогенов (с шифрами fes/fps, yes, ros, abl, fgr) также оказались тирозинпротеинкина зами. Проблема состоит в том, чтобы идентифицировать ее клеточные белки, которые модифицируются этими киназами и являются критическими для транс формации. Например, в клетках, трансформированных вирусами саркомы Рауса, число клеточных белков модифицируется добавлением фосфатных групп к остат кам тирозина, однако роль таких изменений в онкогенезе не установлена.

Ф а к т о р ы р о с т а и р е ц е п т о р ы. Существенный концептуальный прогресс произошел в результате сравнения двух различных направлений иссле дования: механизмов функционирования онкогенов и механизмов функциони рования фактора роста (рис. 59-3). Пролиферация и дифференциация нормаль ных клеток регулируется сигналами, поступающими от связей факторов роста с рецепторами на поверхности клеток. Наиболее изучены два фактора роста:

тромбоцитарный фактор роста (ТФР), стимулирующий рост клеток соеДйнитель 7*,1 Z ЭКЗОПЛАЗМА S i ЦИТОПЛАЗМА ЯДРО ЭФФЕКТЫ СО Аденилат- Протеин циклаза киназа Г-белки: (Ras) Активация Мус Факторы роста — Myb Рост (Sis) ^ Дифференци Fos ровка Тирозинпротеинкиназы (Src, Yes, Fes/Fps, )В ITO Fgr, АЫ. Ros) С • Рис. 59-3. Возможное отношение молекулярной биологии факторов роста к функ ции онкогенов.

Факторы роста — это небольшие молекулы, которые генерируют сигналы активации, репликации и дифференциации клетки, связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клетки-мишени. Как показано, многие белки, производимые онкогенами, соответствуют генеральным путям активности фактора роста. Занимая на этих путях определенные позиции, онкогены могут трансформировать клетку, передавая консти тутивные нерегулируемые сигналы роста. Подробности в тексте.

ной ткани и гладких мышц, и эпидермальный фактор роста (ЭФР), необходимый для оптимального роста эпителиальных клеток in vitro. Рецепторы ТФР и ЭФР содержат тирозинпротеинкиназу, которая активируется связыванием с одним или с другим фактором роста соответственно. Имеют ли тирозинпротеинкиназы рецепторного и онкогенного происхождения общие белковые мишени внутри клеток, неизвестно.

Белок, кодируемый онкогеном вируса саркомы обезьян sis, состоит в близком родстве с ТФР. Онкоген erb/B вируса эритробластоза птиц является, по-види мому, усеченной формой молекулы рецептора для ЭФР. Онкоген fms одного из штаммов вируса кошачьей саркомы может оказаться родственным рецептору фактора роста макрофагов, называемому CSF-1. Эти наблюдения позволяют предположить, что нерегулируемый рост при неонластических трансформациях определяется сигналом, поступающим от изменений в факторах роста, их рецеп торах или в промежуточных элементах.

Б е л к и о н к о г е н а r a s. Белки, кодируемые онкогеном ras, ассоцииро ваны с внутренней поверхностью клеточной мембраны, их функциональная активность, состоящая в связывании гуанозинтрифосфата (ГТФ), является вкладом в функциональную активность ГТФ-связывающих, или Г-белков. Обна ружено, что Г-белки могут ассоциировать с аденилатциклазным комплексом на внутренней поверхности клеточной мембраны и принимают участие в пере даче сигналов от поверхности клетки, что в результате приводит к изменениям уровней внутриклеточных циклических нуклеотидов (см. гл. 67). В дрожжах гены ras действуют через пути аденилатциклазпротеинкиназы. Таким образом, может оказаться, что трансформирующие белки ras относятся к классу изменен ных Г-белков, передающих конститутивный сигнал роста.

О н к о г е н н ы е б е л к и в к л е т о ч н о м я д р е. Белки, кодируемые тремя онкогенами — myb, myc, fos, — размещаются в клеточном ядре. В некото рых, но не во всех, клетках нормальный гомолог myb экспрессируется в фазе G клеточного цикла. Функционирование двух других генов представляется тесно связанным с механизмами действия фактора роста. Если фибробласты с оста новленным ростом подвергнуть воздействию ТФР, то начинается экспрессия специфического набора генов (по оценкам, от 10 до.30), включая протоонкогены c-fos и с-тус, и уровни клеточной мРНК этих генов нарастают. Экспрессия с-тус стимулируется также в покоящихся Т- и В-лимфоцитах после воздействия соответствующими митогенами. После вхождения клетки в цикл роста экспрес сия с-тус остается практически постоянной. После того как клетка утрачивает способность делиться, как, например, постмитотические, дифференцированные клетки, экспрессия с-тус прекращается. Таким образом, эти протоонкогены могут нормально функционировать как регуляторы «активации» роста и диффе • ренциации клеток и служить ядерными мишенями для сигналов, генерируемых фактором роста. При альтерации или разрегулировании они могут обеспечить определяющий стимул нерегулируемого роста клетки и аномальной дифферен циации, что характерно для неопластических состояний. Активность как туе-, так и myb-белков ДНК-зависима, но механизм действия ядерных белков неизвестен.

Экспериментальное введение активных онкогенов в половые клетки и в со матические стволовые клетки тканей. Один из способов исследования онкогенного потенциала опухоль-ассоциированных онкогенов заключается во введении активи рованных онкогенов в нормальные клетки in vivo и наблюдении за воздействием этих генов на дальнейшее развитие. В оплодотворенные яйцеклетки мышей методом микроинъекций было введено несколько различных генов, определяющих специфичность иммуноглобулина и гормона роста. Введенные «транс-гены»

интегрировались в геном потомства и в некоторых случаях экспрессировались в клетках соответствующего типа (например, транс-гены иммуноглобулина экспрессировались преимущественно в В-лимфоцитах).

Введение посредством этой технологии гена Т-антигена из Д Н К опухолевого вируса SV 40 в эмбрионы мышей привело к формированию папиллом сосудистой оболочки глаза у взрослых особей. Аналогично введение в эмбрионы мышей измененных с-тус транс-генов, содержащих промотор-усилительные последова тельности, выделенных из вируса опухолей молочной железы мышей, вызывало развитие этой опухоли у некоторых из особей. По-видимому, введенный онкоген действовал как предрасполагающий фактор ускоренного развития карцином молочных желез, однако для полного развития опухолей у этих животных нужны, вероятно, какие-то дополнительные факторы.

Введение онкогенов в пригодные для трансплантации стволовые клетки костного мозга и лимфоидных органов было осуществлено путем инфицирования стволовых клеток ex vivo вирусными векторами, содержащими эти гены, с по следующей трансплантацией зараженных клеток в ткани соответствующим образом подготовленных хозяев. Введение посредством этой методики гена v-myc в стволовые клетки фабрициевой сумки цыплят привело к образованию пренеопластических пролиферирующих повреждений, предшествующих развитию В-клеточных лимфом. При этом отсутствовала активация трансформирующих генов типа Blym-1, которая наблюдалась при более развитых новообразованиях данного вида. Следовательно, в этой системе активированный онкоген туе может быть ответственным за ранние пренеопластические стадии формирования лимфомы, в то время как для прогресса неоплазмы могут требоваться другие факторы, такие как активация Blym-1.

Онкогены и многостадийный опухолегенез. Рак у человека и химически индуцированные новообразования у животных обычно развиваются как много стадийный процесс, при котором аномальная пренеопластическая клетка раз растается в клеточную популяцию с преобладанием клонов со все более нара стающей злокачественностью. Считается, что эволюции развития опухоли пред шествует латентный период, и весь процесс может занять значительную часть времени жизни пораженного индивида. Напротив, остротрансформирующие виру сы несут активированные формы тех онкогенов, которые участвуют в развитии рака невирусного происхождения и индуцируют новообразования в течение дней или недель;

такая кинетика наводит на мысль об одностадийном процессе.

Это различие может определяться несколькими факторами. Во-первых, многие вирусные онкогены кодируют, киназы с многочисленными мишенями в клетке и поэтому могут вызывать • резкие изменения, для реализации которых при медленно развивающихся новообразованиях потребовалось бы несколько различ ных мутаций. Во-вторых, экспрессия вирусных онкогенов управляется мощными регуляторами (промоторами и усилителями в провирусных ДТП). Трансформи рующий потенциал клеточных гомологов тех же самых генов может активи роваться механизмами, не вызывающими столь высокого уровня экспрессии, например, точечными мутациями в 12-й или 61-й аминокислотных позициях белков, кодируемых человеческими опухоль-ассоциированными онкогенами ras.

В таких ситуациях для образования трансформированного фенотипа может потребоваться согласованная активность нескольких генов, в то время как остро трансформирующие ретровирусы могут породить тот же фенотип за счет очень высокоуровневой нерегулируемой экспрессии всего одного из таких генов.

Эту точку зрения иллюстрируют эксперименты по трансфекции, в которых показана кооперация генов в процессе трансформации культуры клеток фибро бластов. Активированные гены ras из клеток человеческой опухоли способны трансформировать иммортализованные линии клеток, но не могут вызвать полной морфологической трансформации первичных культур клеток. В то же время комбинация клонов с активированными генами туе и ras приводит к полной трансформации в первичных культурах клеток. Таким образом, в этой системе гены туе (и другие онкогены, которые сами по себе не альтерируют клетки) могут дополнить трансформирующую активность человеческих онкогенов ras.

Однако, когда в активированный онкоген ras встраиваются мощные усилители транскрипции, этот ген может и сам трансформировать первичные культуры фибробластов, предположительно благодаря высокому уровню экспрессии этого онкогена. Таким образом, необходимость участия в трансформации многих генов может определяться, в частности, уровнем экспрессии онкогена, и в ново образованиях in vivo может активироваться более одного клеточного онкогена.

Исследование онкогенов и клиническая онкология. Вклад идентификации и анализа человеческих онкогенов в клинику может оказаться весьма значитель ным и даже революционным. Так, усилия по идентификации и контролю тех факторов питания и окружающей среды, которые могут вызывать или предотвра щать рак, в основном опираются на методы эпидемиологии, опыты на животных и клинические испытания, при которых конечным пунктом измерений являются уровни заболеваемости и смертности. Знание же специфических протоонкогенов, служащих мишенями для внешних канцерогенов, и природы наведенных изме нений может обеспечить лучшие методы для установления истинной роли канди датов в канцерогены и для выработки превентивных мер. Новое слово в диаг ностике может сказать связь молекулярной анатомии неопластических изменений с определенными фазами последовательности клеточных поколений. Примером могло бы служить быстрое обнаружение альтераций с-аЫ РНК и/или белка для анализа клеток хронического миелояейкоза. Знание молекулярных механиз мов, посредством которых онкогены трансформируют клетки, позволило бы также более точно и специфично определить мишени для фармакологического воздействия.

Список литературы Bishop J. M., Varmus H. Functions and origins of retroviral transforming genes. — In:Molecular Biology of Tumor Viruses: RNA Tumor Viruses, 2d ed./Eds.

R.Weiss et al. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 999—1108.

Cohen S. The epidermal growth factor (EGF). — Cancer, 1983, 51, 1787.

Cooper G. M., Lane M. A. Cellular transforming genes and oncogenes, — Biochim.

biophys. Acta, 1984, 738, 9.

Fialkow P. J. Clonal origin of human tumors. Ann. Rev. Med., 1979, 30, 135.

Hunter T. The proteins of oncogenes. -r- Sci. Amer., 1984, 251, 70.

Land H. et al. Cellular oncogenes and multistep carcinogens. — Science, 1983, 222, 771.

Leder P. et al. Translocation among antibody genes in cancer. — Science, 1983, 222, 765.

Stiles С D. The molecular biology of platelet-derived growth factor. — Cell, 1983, 33, 653.

Weinstein I. B. Multistage carcinogenesis involves multiple genes and multiple mechanisms. — In: Cancer Cells/Eds. A. J. Leyine et al. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1984, 229—237.

YunisJ.J. The chromosomal basis of human neoplasia. — Science, 1983, 221, 227.

Г Л А В А ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА Джеймс Л. Герман III (James L. German HI) Хромосомный набор человека, как и всех других видов, тщательно оберегается от изменений;

почти всякое изменение числа или структуры хромосом губительно.

Лишь изредка сбалансированные структурные перестройки, не связанные с уничто жением или дупликацией значительного сегмента хромосомы, вновь вводятся в популяцию и передаются затем от поколения к поколению. (На рис. 60-1 показан нормальный набор хромосом человека. В подписи под рисунком дается определение нескольких терминов, используемых в цитогенетике.) Как правило, аномальный набор аутосом приводит к ранней смерти;

исключением является трисомия самой короткой хромосомы. Напротив, аномальный набор половых хромосом часто со вместим с жизнью, хотя обычно и сопровождается частичным или полным беспло дием. Тем не менее у человеческих эмбрионов аномалии числа и структуры хромо сом достаточно обычны, что и служит основной из ныне известных причин гибели эмбрионов и ранних плодов. Однако не каждый плод с аномальным набором хромо сом абортируется, и выжившие представляют собой объект исследований медицин ской генетики.

Несбалансированность хромосомного набора сопровождается разнообразными клиническими признаками, включая аномальности анатомического развития, ум ственную отсталость, поведенческие нарушения, аномалии роста и сексуального развития. Иногда физическое и умственное развитие самого индивида с аномаль ным хромосомным набором в общем нормально, но сопровождается бесплодием, повторными абортами или рождением детей-уродов.

Вышеописанные нарушения вызываются хромосомным дисбалансом, отражаю щимся на всем организме. Однако изменению может подвергнуться и хромосомный набор единственной клетки какой-либо соматической ткани. Такая мутантная клетка может получить пролиферативное преимущество перед нормальной клеткой, когда в популяции нормальных клеток может развиваться клон с аномальным хромосомным набором. Хотя в большинстве случаев такие мутантные клоны клини чески несущественны, но ряд данных позволяет предполагать, что они могут играть важную роль в этиологии рака.

Эта глава посвящена таким аспектам структуры и функций нормальных хро мосом, которые составляют основу для понимания роли хромосомных нарушений в заболеваниях человека, а также играют существенную роль в заболеваемости взрослого населения и возможных последствиях.

Структура и функции хромосом. Человеческие аутосомы обозначаются номе рами от 1 до 22, а половые — буквами X и Y (рис. 60-1). Каждую хромосому можно распознать микроскопически по морфологическим признакам, таким как относи тельная длина и положение центромера, и по характеру окраски (полосковый пат терн). Хромосома млекопитающих состоит из одной двойной цени дезоксирибо нуклеиновой кислоты (ДНК), которая простирается от одного конца хромосомы через центромер до другого конца.



Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 23 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.