авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

Министерство образования Республики Беларусь

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

«ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ»

В.И. Резяпкин

ПРИКЛАДНАЯ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Пособие

по курсам «Молекулярная биология»,

«Основы молекулярной биологии»,

для студентов специальностей:

1-31 01 01 – Биология,

1-33 01 01 – Биоэкология

Гродно 2011

УДК 54(075.8) ББК 24.1 Р34 Рекомендовано Советом факультета биологии и экологии ГрГУ им. Я. Купалы.

Рецензенты:

Заводник И.Б., доктор биологических наук, доцент;

Буко В.У., доктор биологических наук, профессор.

Резяпкин, В.И.

Прикладная молекулярная биология : пособие / В.И. Резяпкин. – Р Гродно : ГрГУ, 2011. – 167 с.

ISBN 978-985-515-430- В книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Адресовано студентам специальностей: «Биология», «Биоэкология».

УДК 54(075.8) ББК 24. © Резяпкин В.И., © Учреждение образования «Гродненский государственный университет»

ISBN 978-985-515-430-4 имени Янки Купалы, ВВЕДЕНИЕ Знания, полученные при изучении фундаментальных основ хранения, передачи и реализации генетической информации, на современном этапе развития науки нашли широкое применение в различных областях практической деятельности человека. С помощью методов, разработанных молекулярными биологами, созданы многочисленные живые организмы с измененным генетическим мате риалом, обладающие разнообразными полезными ха рактеристиками. Разработаны многочисленные средства диагностики, широко применяемые в медицине, сельском хозяйстве, криминалистике и других сферах. Особый интерес представляют современные, основанные на принципах генотерапии, подходы профилактики и корректировки генетических заболеваний.

В предлагаемой книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы полу чения рекомбинантных векторов, генетическая инже нерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии.

Пособие написано в соответствии с учебной программой по курсу «Молекулярная биология» для студентов специа льностей: «Биология», «Биоэкология» и является продолже нием ранее изданного пособия: «Основы молекулярной биоло гии» / В.И. Резяпкин. – Гродно: ГрГУ, 2010. – 220 с.

 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ А – аденин А – аденин АМФ – аденозинмонофосфат АМФ – аденозинмонофосфат АДФ – аденозиндифосфат АДФ – аденозиндифосфат АТФ – аденозинтрифосфат АТФ – аденозинтрифосфат Г – гуанин Г – гуанин ГДФ – гуанозиндифосфат ГДФ – гуанозиндифосфат ГМФ – гуанозинмонофосфат ГМФ – гуанозинмонофосфат ГТФ – гуанозинтрифосфат ГТФ – гуанозинтрифосфат дАДФ – дезоксиаденозиндифосфат дАДФ – дезоксиаденозиндифосфат дАМФ – дезоксиаденозинмонофосфат дАМФ – дезоксиаденозинмонофосфат дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дГДФ – дезоксигуанозиндифосфат дГДФ – дезоксигуанозиндифосфат дГМФ – дезоксигуанозинмонофосфат дГМФ – дезоксигуанозинмонофосфат дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат дНДФ – дезоксинуклеозиддифосфат дНДФ – дезоксинуклеозиддифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНМФ – дезоксинуклеозидмонофосфат дНМФ – дезоксинуклеозидмонофосфат дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфат дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфат дТДФ – дезокситимидиндифосфат дТДФ – дезокситимидиндифосфат дТМФ – дезокситимидинмонофосфат дТМФ – дезокситимидинмонофосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дЦДФ – дезоксицитидиндифосфат дЦДФ – дезоксицитидиндифосфат дЦМФ – дезоксицитидинмонофосфат дЦМФ – дезоксицитидинмонофосфат дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат иРНК – информационная РНК иРНК – информационная РНК МГЭ – мобильные генетические МГЭ – мобильные генетические элементы элементы мРНК – матричная РНК мРНК – матричная РНК НДФ – нуклеозиддифосфат НДФ – нуклеозиддифосфат НК – нуклеиновые кислоты НК – нуклеиновые кислоты НМФ – нуклеозидмонофосфат НМФ – нуклеозидмонофосфат НТФ – нуклеозидтрифосфат НТФ – нуклеозидтрифосфат П.н. – пара нуклеотидов П.н. – пара нуклеотидов РНК – рибонуклеиновая кислота РНК – рибонуклеиновая кислота рРНК – рибосомная РНК рРНК – рибосомная РНК Т – тимин Т – тимин тРНК – транспортная РНК тРНК – транспортная РНК У – урацил У – урацил УДФ – уридиндифосфат УДФ – уридиндифосфат УМФ – уридинмонофосфат УМФ – уридинмонофосфат УТФ – уридинтрифосфат УТФ – уридинтрифосфат Ц – цитозин Ц – цитозин цАМФ – циклическая АМФ цАМФ – циклическая АМФ ЦМФ – цитидинмонофосфат ЦМФ – цитидинмонофосфат ЦДФ – цитидиндифосфат ЦДФ – цитидиндифосфат ЦТФ – цитидинтрифосфат ЦТФ – цитидинтрифосфат  Глава 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК является сложнейшей процедурой, так как эта молекула имеет громаднейшие размеры. Например, у цветковых растений размер гаплоидного генома может достигать до 1011 п.н. Несмотря на это исследователи придают большое значение установлению последовательности нуклеотидов ДНК, поскольку информация о первичной структуре ее молекулы или ее фрагмента позволяет судить о ее непосредственной функции в живом организме.

Определение первичной структуры ДНК осуществля ют в несколько этапов.

Этап 1. Фрагментация ДНК с помощью рестриктаз.

В связи с тем, что в одном эксперименте можно определить последовательность ДНК, состоящую только из нескольких сотен пар нуклеотидов, ее молекулу предварительно фрагментируют. Для фрагментации ДНК обычно используют рестриктазы. Эти ферменты обладают специфичностью к первичной структуре ДНК и разрезают эту молекулу в строго определенных участках. При этом одна рестриктаза разрывает цепь ДНК в одних участках, другая – в других местах. Для фрагментации используют, как минимум, две различные рестриктазы. В результате их действия образуются перекрывающиеся фрагменты (рис. 1.1).

Этап 2. Определение нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов.

Существуют два принципиально отличающихся друг от друга подхода определения первичной структуры ДНК:

химический метод, разработанный А.Максомом и В.Гилбер том, и ферментативный метод, предложенный Ф.Сангером.

Последний метод наиболее распространен. Оба метода в настоящее время полностью автоматизированы, что зна чительно повысило эффективность определения первич ной структуры ДНК.

 Прикладная молекулярная биология Метод А.Максома и В.Гилберта (химический метод) Данный метод основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. В этом случае используются подходы, обеспечивающие выщепление опре деленного нуклеотида (либо по А, либо по Г, либо по Т, либо по Ц) и как следствие этого разрыв цепи ДНК. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в 4 стадии.

Рис. 1.1. Схема, иллюстрирующая фрагментацию ДНК с помощью рестриктаз Стадии 1. На этой стадии двухцепочечные ДНК разделяют с помощью денатурации. Затем в 5’-конец цепи ДНК вносят метку (рис. 1.2).

Стадии 2. Анализируемый образец делят на 4 порции.

Каждую порцию подвергают химической обработке, в результате ДНК распадается на фрагменты различной длины  Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 1.2) за счет статистического выщепления остатков Ц (порция 1), Т (порция 2), Г (порция 3), А (порция 4).

В результате фрагментации образуются фрагменты как несущие метку, так и не несущие. В каждой порции образуется несколько меченых фрагментов, отличающихся друг от друга размером. Число таких меченых фрагментов будет равно числу нуклеотидов, по которым осуществлялось расщепление. Если в первой порции расщепление проводили по Ц, а таких нуклеотидов в анализируемой цепи два, то и меченых фрагментов образовалось также (рис. 1.2).

Стадии 3. На этой стадии проводят электрофорез полученных фрагментов (рис. 1.2). Скорость перемещения фрагментов обратно пропорциональна их длине. Чем короче фрагмент, тем с большей скоростью он перемещается. С помощью электрофореза можно разделить фрагменты, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид. По окончанию электрофореза по длине перемещения опре деляют размер в данном эксперименте только меченных с 5’-конца фрагментов.

Стадии 4. По результатам электрофореза меченых фрагментов определяют первичную структуру ДНК. В первой порции, где расщепление проводили по Ц, выявлено два меченных фрагмента, состоящих из трех и шести нуклеотидов. Поскольку расщепление цепи осуществляли за счет статистического выщепления Ц, то этот нуклеотид в анализируемой цепи будет занимать положение 4 и 7.

Аналогично, по длине фрагментов, образующихся во 2-й порции, определяем положение Т в анализируемой цепи ДНК. Этот нуклеотид занимает 3 и 8 позиции. Подобным образом устанавливаем положения Г (6 и 10) и А (2, 5 и 9). Таким образом, устанавливается первичная структура неизвестной нуклеотидной последовательности ДНК.

 Прикладная молекулярная биология Рис. 1.2. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода А.Максома и В.Гилберта (химический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. 1 – стадия 1, 2 – стадия 2, 3 – стадия 3, 4 – стадия Метод Ф.Сангера (энзиматический метод) В его основе лежит принцип копирования анали зируемой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Этот фермент осуществляет наращивание цепи ДНК в результате присоединения очередного дезоксинуклеотида к 3’-гидро  Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК ксильной группе последнего дезоксинуклеотида. ДНК полимераза может использовать в качестве субстратов не только дезоксинуклеозидтрифосфаты, но и дидезоксинукл еозидтрифосфаты. У последних отсутствует гидроксильная группа в 3’-положении (рис. 1.3). Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывается, потому что в 3’-положении отсутствует гидроксильная группа, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен (рис. 1.4).

Рис.1.3. У дидезоксинуклеозидтрифосфата в отличие от дезоксинуклеозидтрифосфата гидроксильная группа в 3’-положении При определении первичной структуры ДНК по данному методу образец ДНК разделяют на четыре порции.

Во все порции добавляют:

• ДНК-полимеразу;

•дНТФ (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ);

•меченую затравку – олигонуклеотид, комплемен тарный 3’-концу анализируемой цепи ДНК.

Затем в первую порцию добавляют ддАТФ, во вторую – ддТТФ, в третью – ддЦТФ, в четвертую – ддГТФ.

Рассмотрим события, происходящие в первой пробе (рис. 1.5). Затравка гибридизуется с участком ДНК анализируемой цепи в области ее 3’-конца. После этого ДНК полимераза будет включать в растущую цепь нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности. Напротив Т она может включить либо дАМФ, либо ддАМФ. Процесс включения является вероятностным. Если в растущую цепь ДНК включится ддАМФ, то синтез ДНК оборвется. Если же в растущую цепь ДНК включится дАМФ, то синтез ДНК будет продолжен. В результате в пробе будут содержаться  Прикладная молекулярная биология фрагменты вновь синтезированной цепи ДНК различной длины. При этом все они будут заканчиваться ддАМФ.

После денатурации двухцепочечной ДНК с помощью электрофореза определяют длину вновь синтезированных фрагментов. Если длина фрагментов ДНК равна 13, 18 и 23 нуклеотидам, следовательно, в 13, 18 и 23 положении фрагмента будет находится А, а в анализируемой цепи Т.

Аналогично определяют положение других нуклеотидов в анализируемой цепи ДНК. Таким образом, устанавливается первичная структура ДНК.

Рис. 1.4. Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывется, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Рис. 1.5. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода Ф. Сангера и Д. Коулсона (энзиматический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента.

Этап 3. Установление первичной структуры ДНК по средством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных пос ледовательностей.

После определения последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК необходимо определить их очередность в интактной молекуле ДНК. Порядок их чередования устанав Прикладная молекулярная биология ливают на основании того, что фрагменты, полученные в результате разрезания разными рестриктазами, имеют идентичные фрагменты нуклеотидных последовательностей (рис. 1.6).

Рис. 1.6. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей Глава 2. СИНТЕЗ ДНК Химический синтез ДНК В настоящее время разработаны методы химического синтеза как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и двухцепочечных ДНК. Синтез двухцепочечных ДНК осуществляют в два этапа. На первом этапе синтезируют одноцепочечные олигонуклеотиды с заданной после довательностью нуклеотидов. На втором этапе синте зированные олигонуклеотиды используются для конструирования протяженных двухцепочечных ДНК.

Используя данный подход, можно синтезировать гены или другие последовательности ДНК, применяемые в генетической инженерии, биотехнологии, в ДНК-диаг ностике инфекционных и генетических заболеваниях, для идентификации личности и др. В настоящее время проце дура химического синтеза ДНК автоматизирована. При боры, в которых осуществляется синтез ДНК, называются ДНК-синтезаторами.

Рассмотрим принцип метода, используемого для синтеза олигонуклеотидов (рис. 2.1). В начале этой процедуры первый мономер присоединяют к твердой фазе (нерастворимому носителю), который затем помещают в колонку-реактор. Далее через колонку пропускают второй мономер и другие химические реагенты. В результате второй мономер присоединяется к первому, образуя димер. Потом колонку промывают, с целью удаления непрореагиро вавших реагентов и побочных продуктов реакции. На этом завершается первый цикл. Затем осуществляют следую щий цикл, пропуская через колонку очередной мономер.

Циклы многократно повторяют до завершения синтеза олигонуклеотида с заданной первичной структурой. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от твердой фазы и подвергают очистке. Полученные олигонуклео тиды могут быть использованы в качестве зондов при ДНК диагностике, в качестве праймеров при секвенировании ДНК, а также для синтеза генов и др.

1 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.1. Схема синтеза олигонуклеотида. N – азотистое основание, 1 – присоединение первого мономера к твердой фазе, 2 – присоединение второго мономера, 3 – присоединение третьего мономера, 4 – отделение олигонуклеотида от твердой фазы Олигонуклеотиды могут быть использованы для синтеза двухцепочечных ДНК. Стратегии синтеза коротких и протяженных двухцепочечных ДНК отличаются. Для получения коротких двухцепочечных молекул (60 – 80 п.н.) вначале синтезируют комплементарные цепи, которые затем подвергают гибридизации (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Схема синтеза коротких двухцепочечных молекул ДНК 1 Глава 2. Синтез ДНК В случае синтеза более протяженных двухцепочечных ДНК (более 300 п.н.) применяют другие подходы. Необ ходимость их использования связана с тем, что при хими ческом синтезе олигонуклеотидов происходят ошибки, в результате которых синтез протяженного олигонуклеотида сопровождается крайне низким выходом. В связи с этим длинные двухцепочечные ДНК собирают из коротких одноцепочечных фрагментов, размер которых составляет 20 – 100 нуклеотидов. Сборку двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных фрагментов можно осуществлять разными способами. Один из способов подразумевает получение набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.3). Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК.

Имеющиеся в ее молекуле одноцепочечные разрывы далее сшивают с помощью ДНК-лигазы. Другой подход, используемый для синтеза протяженных двухцепочечных ДНК, также подразумевает синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.4). Однако после гибридизации таких фрагментов в молекуле ДНК образуются большие бреши. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНК-полимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНК лигазы.

1 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.3. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с разрывами, которые сшивают с помощью ДНК-лигазы Рис. 2.4. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с брешами. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНК полимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНК-лигазы 1 Глава 2. Синтез ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании определенного участка ДНК. В течение нескольких часов с помощью этого метода можно получить более 50 млрд. копий специфических нуклеотидных после довательностей (рис. 2.5). Этот метод широко используют для синтеза генов. Однако только этим применение ПЦР не ограничивается.

Рис. 2.5. В результате ПЦР можно получить множество копий специфических последовательностей ДНК При проведении ПЦР в реакционную смесь добавляют следующие компоненты:

•ДНК-матрицу, содержащую тот участок ДНК (ДНК мишень), который требуется амплифицировать;

• праймеры – искусственно синтезированные олиго нуклеотиды (15 – 30 нуклеотидов), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени и способные с ними образовывать гибриды (рис. 2.6);

• Tag-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая реакцию полимеризации ДНК и выдерживающая нагревание до 95 °С;

• дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) – субстраты для синтеза ДНК.

1 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.6. Праймеры – олигонуклеотиды, комплементарные концевым участкам ДНК-мишени. После плавления ДНК и последующего отжига они способны с последними образовывать гибриды. Р1 и Р2 – праймеры При проведении ПЦР осуществляют многократное по вторение циклов, каждый из которых состоит из трех ста дий: денатурация, отжиг и элонгация. Рассмотрим подроб нее эти стадии.

• Денатурация. На этой стадии реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для ПЦР, нагревают до 92 – 95 °С, в результате происходит плавление ДНК и ее цепи расходятся (рис. 2.7).

• Отжиг. Реакционную смесь охлаждают прибли зительно до 55 °С, при этом праймеры гибридизуются с комплементарными последовательностями ДНК (рис. 2.7).

• Элонгация. Температуру реакционной смеси на этой стадии повышают приблизительно до 75 °С, поскольку активность Tag-полимеразы в таких условиях оптимальна.

ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК (рис. 2.7).

На рис. 2.7 показаны события, происходящие на первом цикле ПЦР. Как видно из рисунка после первого 1 Глава 2. Синтез ДНК цикла длина каждой из синтезированных цепей ДНК больше длины нуклеотидной последовательности ДНК-мишени.

Таким образом, на этой стадии не происходит образования первой копии фрагмента ДНК, который требуется получить в результате амплификации.

Рис. 2.7. События, происходящие на первом цикле ПЦР. Р1 и Р2 – праймеры Первая же копия фрагмента амплификации образуется только после третьего цикла ПЦР (рис. 2.8). Для получения большого количества копий фрагмента амплификации цикл повторяется 30 – 35 раз. На рис. 2.9 показаны события, осуществляющиеся при протекании поздних циклов ПЦР.

В это время в реакционной смеси содержатся главным обра зом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени.

Каждый цикл длится около 3 – 5 мин. К концу 30 цикла число копий превышает 106. ПЦР является высокочувствитель ным методом, позволяющим при наличии ничтожного количества ДНК в пробе получить огромное число копий интересующих исследователя фрагментов ДНК.

1 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.8. Первая копия фрагмента амплификации образуется после третьего цикла ПЦР. Р1 и Р2 – праймеры ПЦР в настоящее время широко используют для проведения различных видов анализа. Во многих случаях в анализируемых образцах требуется выявить наличие определенных последовательностей ДНК. Например, при идентификации патогенных микроорганизмов в биологических объектах достаточным является выявление ДНК этого возбудителя в исследованных образцах. С этой целью может быть использован ПЦР-анализ.

ПЦР-анализ проводят в три стадии. На первой стадии осуществляют подготовку образцов ДНК. Они могут быть выделены из любого биологического объекта. На второй стадии осуществляют амплификацию специфических нуклеотидных последовательностей. В этом случае необхо димо использовать праймеры, комплементарные к искомой ДНК. Если в исследуемом образце присутствует искомая ДНК, то праймеры в процессе отжига будут с Глава 2. Синтез ДНК ней гибридизоваться и Tag-полимераза сможет начать синтез ДНК. Тогда в результате ПЦР будут синтезированы многочисленные копии фрагмента амплификации. При отсутствии искомой ДНК в исследуемых образцах праймеры не будут гибридизоваться с ДНК и не смогут выступать в качестве затравки для полимеразы. Синтез ДНК не будет осуществляться.

На третьей стадии посредством электрофореза в ага розном геле выявляют наличие или отсутствие в реакцион ной смеси продукта амплификации (рис. 2.10). При наличии продукта амплификации делается заключение о том, что в исследуем образце присутствует искомая ДНК.

Рис. 2.9. При протекании поздних циклов ПЦР в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени.

Р1 и Р2 – праймеры Прикладная молекулярная биология Рис. 2.10. Выявление наличия или отсутствия в реакционной смеси продукта амплификации посредством электрофореза в агарозном геле.

Стрелкой указано направление электрофореза. 1 – положительный контроль, 2 – отрицательный контроль, 3 – отрицательный образец, 4 – положительный образец ПЦР-анализ нашел и находит применение в различных областях: при диагностике инфекционных, генетических и онкологических заболеваний, диагностике патогенов в пищевых продуктах, диагностике генети чески модифицированных продуктов, идентификации личности и т.д.

При диагностике инфекционных заболеваний ис пользуются праймеры, специфичные к участкам ДНК потенциального возбудителя, но не пациентов. При наличии ДНК возбудителя в биологических образцах, полученных от больного, ПЦР-анализ даст положительный результат, при отсутствии такой ДНК – отрицательный. Таким образом, на основании ПЦР-анализа можно сделать вывод о причине заболевания. ПЦР-анализ позволяет выявить возбудителя заболевания в очень низкой концентрации.

Соответственно, при диагностике генетических и онкологических болезней используются праймеры, специ фичные к генам, обуславливающим данные заболевания. А при диагностике патогенов в пище используются праймеры, специфичные к ДНК патогенов.

Глава 2. Синтез ДНК ПЦР с обратной транскрипцией Геномы многих вирусов представлены РНК. В их жизнен ных циклах может отсутствовать промежуточная фаза превращения РНК в ДНК. В связи с этим при выявлении РНК таких вирусов ее необходимо перевести в форму ДНК. Для этого используют термостабильную обратную транскриптазу (ревертазу) – фермент, использующий в качестве матрицы одноцепочечную РНК для синтеза двухцепочечной ДНК.

При проведении обратной транскрипции в реакционной среде должны присутствовать праймеры и дНТФ. После обратной транскрипции полученная комплементарная ДНК (кДНК) может быть амплифицирована с помощью ПЦР (рис. 2.11).

Рис. 2.11. ПЦР с обратной транскрипцией Рассмотренный выше метод может быть применен также для синтеза кДНК при использовании в качестве матрицы иРНК или других типов РНК.

2 Прикладная молекулярная биология ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять детекцию продуктов амплификации во время проведения эксперимента. Этот метод исключает стадию электрофореза, что способствует существенному сокращению продолжитель ности эксперимента. Накопление продуктов ПЦР пропор ционально числу копий исследуемой ДНК (или РНК) в анализируемом образце. В связи с этим возможно коли чественное определение ДНК или РНК.

Существует множество подходов регистрации продук тов амплификации в процессе ПЦР. Рассмотрим один из таковых, получивший название «Выщепление 5’-концевой метки» (рис. 2.12). При использовании этой методики в реак-ционную смесь добавляют ДНК-зонды, содержащие на 5’-конце флуоресцентную метку (флуорофор), а на 3’-конце – гаситель флуоресценции. ДНК-зонды комплементарны участку амплификации. В ходе ПЦР на стадии отжига ДНК зонды присоединяются к участку амплификации. В таком состоянии гаситель поглощает излучение, испускаемое флуоресцентной меткой. На стадии элонгации ДНК-поли мераза, используя праймер в качестве затравки, начинает синтез комплементарной цепи ДНК в направлении ДНК зонда. При его достижении благодаря 5’-экзонуклеазной активности этот фермент выщепляет флуорофор. В ре зультате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что сопровождается свечением. Интенсивность свечения с каждым циклом ПЦР будет усиливаться. В то же время интенсивность свечения будет зависеть и от числа копий анализируемых ДНК в образце. Чем интенсивнее свечение, тем больше число копий. Таким образом, по ин тенсивности свечения можно судить о количественном содержании анализируемой ДНК в исследуемых пробах.

2 Глава 2. Синтез ДНК Рис. 2.12. Регистрация продуктов амплификации в процессе ПЦР в реальном времени при использовании методики «Выщепление 5’-концевой метки»

2 Глава 3. ДНК-ДИАГНОСТИКА Первичная структура ДНК индивидуумов, отно сящихся к одному или различным видам живых существ, в определенной степени уникальна. На этой особенности основана ДНК-диагностика. Последняя включает группу методов, позволяющих установить истину в результате исследования ДНК. Сегодня ДНК-диагностика нашла широкое применение при выявлении возбудителей ин фекционных заболеваний, обнаружения генетических забо леваний, установлении биологического родства, иденти фикации личности и т.д.

Образцы ДНК для исследования могут быть выделены из любого биологического материала: из крови, волоса, мочи, мокроты, соскоба с внутренней стороны щеки или мочеиспускательного канала и т. п. Оказываются пригодными для ДНК-диагностики биологические образцы, сохраняющиеся в течение сотен и тысяч лет. Количество ДНК, необходимое для проведения анализа может быть ничтожно малым. Возможно успешная диагностика, даже если в образце имеется только одна молекула ДНК. ДНК-диагностика является не только чрезвычайно чувствительным методом, но высокоточным. Ее точность приближается к 100 %.

При ДНК-диагностике широко используется метод ПЦР. Его принцип и применение были рассмотрены в предыдущей главе. ПЦР может быть применен при анализе ДНК в сочетании с другими подходами. Об этом поговорим подробнее в следующих разделах. В то же время многие диагностические методы основаны на использовании ме ченых гибридизационных зондов, комплементарных к иско мой молекуле ДНК.

ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов Этот метод основан на использовании гибри дизационных зондов, комплементарных к искомым пос ледовательностям ДНК. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК. Они 2 Глава 3. ДНК-диагностика могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов). Они могут представлять собой продукт химического синтеза или являться клонирован ными копиями интактных генов или их фрагментов. Гибри дизационный зонд должен быть высокоспецифичным, т.е.

он должен спариваться только с искомой нуклеотидной последовательностью. Кроме того зонд должен содержать радиоактивную (или нерадиоактивную) метку.

Последовательность действий при данном методе диагностики следующая (рис. 3.1):

• получение образца ДНК из биологического объекта;

• денатурация ДНК;

• фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мем бранном фильтре;

• нанесение на фильтр меченого одноцепочечного ДНК зонда, который при определенных условиях гибридизуется с ДНК-мишенью;

• промывание фильтра для удаления избытка не связав шейся меченой ДНК-зонда;

• детекция гибридных молекул зонд/мишень.

Рис. 3.1. ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов 2 Прикладная молекулярная биология Выявление на последней стадии эксперимента гиб ридных молекул зонд/мишень свидетельствует о наличии искомой ДНК в исследуемой пробе. Об отсутствии тако вой ДНК в анализируемой пробе позволяет судить отрицательный результат детекции. Таким образом, с помощью меченого зонда можно выявить (или не выявить) определенные последовательности ДНК в образце и на ос новании этого сделать соответствующий вывод.

В качестве гибридизационных зондов часто исполь зуют зонды, меченные радиоактивным изотопом 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и в связи с этим легко детектируются. Радиоактивную метку на фильтре после удаления несвязавшегося зонда выявляют с помощью радиоавтографии. Однако, радиоактивно мече ные зонды несут определенную экологическую опасность.

По этой причине в настоящее время все чаще используют зонды, меченные другим способом. Нашли широкое применение зонды, меченые биотином. Последовательность действий при использовании таких зондов следующая (рис. 3.2):

• гибридизация зонда, меченного биотином, с ДНК мишенью;

• удаление промыванием избытка несвязавшегося зонда;

• добавление авидина (белка куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина), эти белки имеют несколько центров сродства к биотину, и благодаря им связываются с биотинилированным зондом;

• добавление связанного с биотином фермента.

Обычно для этих целей используют щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. Биотинилированный фермент свя зывается с сайтом связывания биотина, расположенном в молекуле стрептавидина (или авидина);

• добавление субстрата, который под действием ис пользуемого фермента превращается в окрашенный или хемилюминесцентный продукт;

• регистрация изменения окраски либо люминес ценции.

Нерадиоактивные зонды не только более экологичны, чем радиоактивные, но и более стабильны. Долговечность 2 Глава 3. ДНК-диагностика зондов меченных Р ограничена быстрым распадом радиоактивного изотопа, период полураспада 32Р составляет 14,3 суток. Биотинилированные же зонды стабильны не менее чем год. В то же время нерадиоактивные зонды по чувствительности не уступают радиоактивным.

Рис. 3.2. ДНК-диагностика с использованием гибридизационного зонда, меченого биотином. Б – биотин, С – стрептавидин, ЩФ – щелочная фосфатаза Еще одним методом нерадиоактивной детекции яв ляется подход, основанный на использовании зонда – «мо лекулярного маяка» (рис. 3.3). Этот зонд состоит из нескольких десятков нуклеотидов. Нуклеотиды, расположенные во внутренней части зонда, комплементарны ДНК-мишени.

Нуклеотиды же, находящиеся на концах зонда, взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5’-концу зонда присоединен флуорофор, испускающий излучение, а к 3’-концу – тушитель, поглощающий испускаемое флуорофо ром излучение. После гибридизации зонда – «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью, происходит пространственное разобщение флуорофора и тушителя, и зонд начинает испускать свет. Испускаемое свечение свидетельствует о том, что между зондом и ДНК-мишенью произошла гибридизация (рис. 3.3).

2 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.3. В результате гибридизации зонда – «молекулярного маяка»

с ДНК-мишенью наблюдается флуоресценция ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг (или геномная дактилоскопия) применяется для генетической идентификации личности, установления отцовства и в криминалистике.

Последовательность процедур при использовании метода ДНК-фингерпринтинга следующая:

• подготовка образца крови или ткани;

• выделение ДНК из образца;

• фрагментация ДНК рестриктазой;

• электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле;

• перенос ДНК из геля на мембрану;

• гибридизация на мембране ДНК с одним или не сколькими зондами, комплементарными определенным нуклеотидным последовательностям. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК;

• отмывка избытка меченого зонда;

• выявление полос гибридизации;

• анализ полученного результата.

 Глава 3. ДНК-диагностика Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у раз личных индивидуумов различно (рис. 3.4), но для разных тканей одного и того же индивидуума, оно остается постоянным и не зависит от возраста. В связи с этим данный метод может быть использован для создания ДНК-паспортов, которые представляют собой спектр распределения гибри дизационных полос, полученный рассмотренным выше методом. Этот спектр остается постоянным на протяжении всей жизни, поэтому ДНК-паспорт нельзя потерять и его нельзя подделать.

Рис. 3.4. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов, 1, 2, 3 – образцы ДНК, полученные от различных индивидуумов ДНК-фингерпринтинг используется в судебной медицине для идентификации личности. Сравнивая полу ченные методом ДНК-фингерпринтинга результаты анализа ДНК подозреваемого и ДНК, выделенной из биологических образцов (крови, спермы, кусочка кожи, волос и т.д.) с места преступления, можно сделать вывод о причастности подозреваемого к преступлению (рис. 3.5). Если спектры гибридизационных полос при анализе ДНК подозреваемого  Прикладная молекулярная биология и ДНК образцов с места преступления совпадают, то можно с высокой долей вероятности судить о причастности подозреваемого к преступлению. Если же спектры не совпадают, то эти данные свидетельствуют о непричастности подозреваемого к преступлению.

Рис. 3.5. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК, выделенной из биологического образца с места преступления (БО) и из тканей подозреваемого 1 (П1) и подозреваемого 2 (П2). Совпадение спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, с таковым подозреваемого 2 свидетельствует о причастности его к преступлению. Отличие спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, от такового подозреваемого свидетельствует о его непричастности к преступлению ДНК-фингерпринтинг может быть применен для установления отцовства. Поскольку распределение полос гибридизации наследуется по законам Менделя, то потомки от матери и отца наследуют по половине полос. Сравнивая полученные результаты ДНК-анализа предполагаемого отца, матери и ребенка можно определить является ли предполагаемый отец биоло гическим отцом или нет (рис. 3.6).

 Глава 3. ДНК-диагностика Рис. 3.6. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК матери (М), ребенка (Р) и двух предполагаемых отцов. Из анализа результатов следует, что ребенок унаследовал половину полос от матери и половину полос от П1.

Следовательно, он и является биологическим отцом Диагностика инфекционных заболеваний В настоящее время зонды широко используются для диагностирования инфекционных заболеваний. В качестве зондов, используются нуклеотидные последовательности, комплементарные к ДНК возбудителя, но не к ДНК человека или к ДНК организмов, которые могут присутствовать в биообразцах взятых для ДНК-диагностики. При этом предпочтительно использовать зонды, комплементарные к высокоповторяющимся последовательностям ДНК возбудителя, что значительно повышает чувствительность метода диагностирования. Получены и охарактеризованы более сотни ДНК-зондов, позволяющих идентифицировать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших.

ДНК-диагностика генетических заболеваний ДНК-диагностика генетических болезней позволяет на уровне ДНК идентифицировать ту или иную патологию.

На основании ДНК-теста можно сделать вывод о том,  Прикладная молекулярная биология что причиной заболевания являются или не являются нарушения в организации ДНК. Многие наследственные заболевания проявляются не сразу, а по прошествии доволь но продолжительного времени. ДНК-диагностика же поз воляет выявить болезнь, когда еще признаки заболевания не проявились. В связи с этим ДНК-диагностика в раннем возрасте позволит заблаговременно предпринять опреде ленные меры при лечении данного заболевания. Кроме того, используя ДНК-диагностику, можно выявить носителей «дефектных» генов, и в последствие на основании диагноза планировать семью. Возможна ДНК-диагностика до рождения. В этом случае ДНК плода выделяют из хориона, пуповины или омниотической жидкости. Более того, возможна преимплантационная ДНК-диагностика. В этом случае яйцеклетки оплодотворяют in vitro. Из зародыша на стадии 8 клеток извлекают 1 или 2 клетки и анализируют их ДНК на наличие поврежденного гена. Зародыш, содер жащий неповрежденный ген, имплантируют в матку.

Гены, вызывающие генетические заболевания, отли чаются от нормальных генов первичной структурой. При чиной генетического заболевания может являться также и нарушение в регуляции экспрессии генов или же отсутствие самих генов. Обнаружить такие заболевания можно, выявив отличия в организации дефектного гена от нормального.

ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов Диагностировать генетические заболевания можно с помощью гибридизационных зондов. С этой целью из клеток больного выделяют ДНК. Затем ее фрагментируют, используя рестриктазу. Полученные фрагменты разделяют с помощью электрофореза. Далее фрагменты переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтр наносят зонд, несущий радиоактивную метку. В качестве зонда могут быть использованы последовательности ДНК, комплементарные дефектному или нормальному гену. Зонд при наличии комплементарных последовательностей в исследуемой ДНК,  Глава 3. ДНК-диагностика гибридизуется с ней, при отсутствии – не гибридизуется.

После отмывки не связавшегося зонда методом авто радиографии выявляют наличие полосы гибридизации.

Если при использовании зонда, комплементарного к дефект ному гену, полоса гибридизации не выявляется (рис. 3.7), это свидетельствует об отсутствии дефектного гена в исследуемом образце ДНК пациента. На основании этих результатов, можно сделать вывод о том, что у пациента не обнаружено диагностируемое генетическое заболевание. Если же гибридизационная полоса выявляется, то делается вывод о том, что пациент является носителем дефектного гена.

Рис. 3.7. Идентификация генетического заболевания с помощью гибри дизационного зонда, комплементарного дефектному (но не нормальному) гену.

Наличие полосы гибридизации при анализе образца ДНК свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (1), является носителем дефектного гена. Отсутствие полосы гибридизации свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (2), не является носителем дефектного гена Гибридизацию меченого зонда с ДНК можно проводить на хромосомных препаратах. В этом случае меченый зонд наносят на препараты специально приготовленных метафазных хромосом. После отмывки не связавшегося зонда выявляют места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому зонду. Выявление таких мест осуществляют в случае использования радиоактивной  Прикладная молекулярная биология метки, посредством нанесения светочувствительной эмуль сии на препараты хромосом, при использовании же биотин меченных или флюоресцирующих ДНК-зондов посредством проведения соответствующей обработки препаратов.

ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии Серповидноклеточная анемия – генетическое заболева ние, причиной которого является замена одного нуклеотида в -глобиновом гене (А заменяется на Т). В результате такой замены мутантный гемоглобин перестает эффективно транспортировать кислород. С заменой одного нуклеотида в -глобиновом гене связано исчезновение сайта узнавания для рестриктазы Cvn1. Этот фермент распознает нуклеотидную последовательность CCTGAGG, которая в результате му тации превращается в последовательность ССТGTGG.

Последнюю указанная рестриктаза не способна узнавать, и соответственно, не способна разрезать ДНК в этом участке.

В процессе ДНК-анализа на наличие мутантных генов с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент -глобинового гена (рис. 3.8). Такой фрагмент нормального гена содержит 3 сайта узнавания рестриктазы Cvn1, мутантного же – на один меньше, т.е. 2 сайта. Амплифицированные фрагменты на следующей стадии обрабатывают рестриктазой Cvn1, в результате фрагмент, амплифицированный с нормального гена, расщепляется на 4 более мелких фрагмента ДНК, а фрагмент, амплифицированный с мутантного гена, – на (рис. 3.8). Продукты рестрикции далее разделяют с помощью электрофореза. На электрофореграмме после окраски ДНК определяют число полос. Если анализировалась ДНК инди видуума, гомозиготного по нормальному гену (АА), то на электрофореграмме будут выявлены 4 полосы. При анализе ДНК индивидуума, гомозиготного по мутантному гену (SS), на электрофореграмме будут обнаружены 3 полосы. В случае же анализа ДНК индивидуумов, гетерозиготных по данному гену (АS), на электрофореграмме будут выявлены полос (рис. 3.8).

 Глава 3. ДНК-диагностика Рис. 3.8. ДНК-анализ, направленный на выявление мутантного -глобинового гена.

АА – гомозиготность по нормальному -глобиновому гену, SS – гомозиготность по мутантному -глобиновому гену, АS – гетерозиготность  Прикладная молекулярная биология Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ) Метод ПЦР/ЛОЗ используется для идентификации му тантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов. Предположим, что нормальный ген отличается от мутантного тем, что в определенном участке вместо пары АТ в нормальном гене в мутантном гене находится ГЦ-пара. При анализе методом ПЦР/ЛОЗ с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент исследуемого гена, содержащий пару нуклеотидов, по кото-рой отличается нормальный и мутантный ген (рис. 3.9).

Рис. 3.9. Амплификация методом ПЦР фрагментов нормального и мутантного генов, отличающихся одной парой нуклеотидов Полученные в результате амплификации фрагменты гибридизуют с двумя зондами (рис. 3.10). При отжиге этих зондов с фрагментом нормального гена происходит их полная гибридизация. При этом 3’-конец зонда-1 гиб ридизуется с нуклеотидом (Т), который в мутантном гене заменен на Ц. А 5’-конец зонда-2 образует комплементар ное взаимодействие с нуклеотидом, примыкающим к Т. В случае фрагмента мутантного гена 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным нуклеотиду Ц (рис. 3.10). К зонду-1 присоединен биотин, а к зонду-2 – диго  Глава 3. ДНК-диагностика ксигенин. При добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент нормального гена, зонды-1 и 2 ковалентно сши ваются. В то время как при добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент мутантного гена, этого не происходит, т.к. 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказыва ется не комплементарным соответствующему нуклеотиду (рис. 3.10). После обработки лигазой проводят денатурацию ДНК, в результате которой происходит высвобождение зондов. Затем содержимое проб переносят в пластиковые лунки, покрытые стрептавидином. С последним связываются меченные биотином зонды (рис. 3.10). После связывания лунки промывают с целью удаления не связавшегося материала. Затем в них добавляют соединенные со щелоч ной фосфатазой антитела к дигоксигенину. Антитела при наличии дигоксигенина взаимодействуют с ним, образуя комплекс, содержащий в своем составе щелочную фосфатазу (рис. 3.10). Для удаления не связавшегося материала лунки снова промывают. После этой процедуры в них добавляют субстрат. При наличии щелочной фосфатазы субстрат превращается в окрашенный продукт (рис. 3.10). Появление окраски в лунке свидетельствует о связывании антитела с зондом, меченным дигоксигенином, и, следовательно, о том, что произошло лигирование зонда-1 и зонда-2. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что анализу в этом случае подвергся нормальный ген. Если же окрашивания не произошло (рис. 3.10), значит, лигирования не было. Анализу в этом случае подвергся мутантный ген.

Метод ПЦР/ЛОЗ является высокоэффективным и высокоспецифичным методом. Все его стадии автома тизированы.

 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.10. Идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов метод ПЦР/ЛОЗ. Б – биотин, Д – дигоксигенин, АТ – антитело, ЩФ – щелочная фосфатаза  Глава 3. ДНК-диагностика Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов Многие генетические заболевания связаны с мутациями в разных участках одного и того же гена. Такие мутантные гены отличаются от нормального гена и между собой нуклеотидными заменами в определенных сайтах. В свою очередь от комбинации мутантных и нормальных генов в геноме индивидуумов зависит проявление генетического заболевания. В связи с этим крайне важным для коррекции патологии является установление генетического статуса больного.

С целью идентификации в разных сайтах гена мутаций синтезируют набор специфических зондов, каждый из которых комплементарен фрагменту гена, несущему извест ную мутацию. К 3’-концу каждого зонда присоединяют poly(dT) (около 400 нуклеотидов), с помощью которых ДНК зонды связываются с определёнными точками на мембране (рис. 3.11). Далее амплифицированные с помощью ПЦР и помеченные биотином фрагменты анализируемого гена (каждый из которых содержит по одному мутантному сайту) гибридизуют с зондами, пришитыми к мембране (рис. 3.11).

Затем добавляют стрептавидин, связанный с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). Там, где произошла гибридизация фрагмента мутантного гена с зондом, стрептавидин связывается с биотином, образуя комплекс, состоящий из зонда, фрагмента мутантного гена, биотина, стрептавидина и фермента (рис. 3.11).

Мембрану промывают, и добавляют неокрашенный субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный продукт (рис. 3.11). На точке фильтра, где наблюдается окрашивание, имеет место соответствие между амплифицированным фрагментом мутантного гена и специфическим зондом. Что свидетельствует о наличии соответствующего мутантного сайта в анализируемом гене.

Таким образом, проанализировав результаты эксперимен та, можно идентифицировать наличие мутантных сайтов в гене.

 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.11. Идентификация мутаций в разных участках одного гена.

Б – биотин, С – стрептаведин, ЩФ – щелочная фосфатаза Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье Идентификацию костных останков с целью установления их принадлежности к определенной семье можно проводить в 3 этапа:

• установление половой принадлежности останков;

• выявление генетического родства между индиви дуумами, останки которых исследуются;

 Глава 3. ДНК-диагностика • установление принадлежности выявленных гене тически родственных индивидуумов к определенной семье.

Рассмотрим подробнее все эти этапы. Предположим, что поставлена задача проанализировать костные останки десяти человек: выявить их половую пренадлежность, уста новить или опровергнуть генетическое родство между индивидуумами, останки которых обнаружены, и устано вить принадлежность выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье.

Определение половой принадлежности останков может быть осуществлено по анализу организации гена амелогенина – белка зубной эмали. Этот ген локализован в половых хромосомах X и Y. Ген амелогенина в Y-хромосоме оказывается на 6 п.н. длиннее, чем в X-хромосоме. После выделения ДНК из костных останков получают с помощью ПЦР фрагменты генов амелогенина. При этом фрагмент гена Y-хромосомы состовляет 112 п.н., а Х-хромосомы – 106 п.н.

Поскольку у мужчин присутствуют X и Y хромосомы, то в результате ПЦР образуются оба фрагмента. У женщин присутствует только X хромосома, поэтому у них образуется только один фрагмент, размером 106 п.н. Длину фрагментов определяют с помощью электрофореза. Результаты иссле дования десяти гипотетических останков представлены на рис. 3.12. Они свидетельствуют о том, что останки принадлежат четырем мужчинам и шести женщинам.

Рис. 3.12. Установление половой принадлежности костных останков на основе определения длины фрагмента гена амелогенина  Прикладная молекулярная биология Для выявления генетического родства обычно исполь зуют локусы ДНК, находящиеся в 5 и более аллельных состояниях. С этой целью может быть использован локус (ТН01), имеющий 5 аллельных состояний, в которых динуклеотид ЦА повторяется от 6 до 10 раз: (ЦА)6, (ЦА)7, (ЦА)8, (ЦА)9, (ЦА)10. В составе генома каждого человека могут присутствовать из всех возможных только 1 или аллельных локуса. Аллели легко различить по размерам ПЦР-фрагментов, определяемых с помощью электрофореза (рис. 3.13). Наличие двух полос на электрофореграмме указывает на гетерозиготное состояние локуса, одной – гомо зиготного.


Сравнивая распределение фрагментов ДНК на электро фореграмме, можно сделать вывод о возможном родстве (или опровергнуть его) по вертикали (родитель – ребенок).

У ребенка размер одного фрагмента должен совпадать с размером одного из фрагментов матери, а размер друго го – с одним из фрагментов отца. Если у индивидуумов отсутствуют одинаковые полосы, то они родственниками по вертикали не являются, а если таковые присутствуют, то родство по вертикали возможно. Об отсутствии родства по вертикали (если отсутствуют одинаковые аллели локу са) можно судить со 100 %-й вероятностью. О наличие же родства по вертикали (при наличии одинаковых аллелей локусов) можно говорить с определенной вероятностью.

Поэтому для установления родства по вертикали с высокой долей вероятности, как правило, анализируют картины распределения аллелей нескольких полиморфных локусов.

На рис. 3.13 представлен анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков.

Внимательно рассмотрев электрофореграмму, можно сде лать вывод о том, что индивидуумы 3 и 7 по отдельности являются возможными родственниками по вертикали индивидуумам 4, 5 и 6. В то же время индивидуумы 3 и между собой не являются родственниками по вертикали.

На основании этих результатов с определенной долей вероятности можно полагать, что индивидуум 3 является отцом, индивидуум 7 – матерью, а индивидуумы 4, 5 и  Глава 3. ДНК-диагностика 6 – дочерьми. Таким образом, результаты анализа поз волили выявить семейную группу. На следующем этапе необходимо идентифицировать ее. С этой целью нужно сравнить ДНК представителей этой семейной группы с ДНК предполагаемых родственников. Для этого можно использовать различные подходы. Одним из таких подходов является исследование митохондриальной ДНК. Известно, что митохондриальная ДНК передается потомкам по материнской линии. В связи с этим сравнение первичной структуры митохондриальной ДНК членов семейной группы с таковой предполагаемых родственников по материнской линии позволит идентифицировать семейную группу.

Рис. 3.13. Анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков. Внизу показана идентифицированная на основе анализа семейная группа. П – отец, М – мать, Д – дочь  Глава 4. ФЕРМЕНТЫ И МЕТОДЫ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Генетическая инженерия представляет собой отрасль молекулярной биологии, целью которой является получение орга низмов с новыми комбинациями генов с помощью направленного манипулирования фрагментами НК.

Посредством экспериментальных процедур, ис пользуемых в генетической инженерии, возможен перенос генетического материала из одного организма в другой. Конечным результатом деятельности гене тических инженеров является получение генетически модифицированных организмов (ГМО). В настоящие время под ГМО понимают организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи приемов генетической инженерии.

Последовательность приемов генетической инженерии, используемая при создании ГМО в общем виде следующая:

• получение изолированного гена (или другого ге нетического материала);

• введение гена (или другого генетического материала) в вектор, обеспечивающий его доставку в клетки трансфор мируемого организма. Результатом этого этапа является по лучение рекомбинантного (химерного) вектора, содержаще го чужеродную ДНК;

• введение рекомбинантного вектора в клетки мо дифицируемого организма;

• получение ГМО.

На рис. 4.1 представлена схема получения генетически модифицированных бактерий.

Для достижения поставленных целей в генетической инженерии используются разнообразные ферменты и ме тоды. Информация о них представлена ниже.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.1. Получение генетически модифицированных бактерий Ферменты в генетической инженерии В экспериментах по генетической инженерии ферменты являются инструментами молекулярного манипулирования.

Ферменты, применяемые в генетической инженерии, можно разделить на четыре основные группы:

• ферменты, фрагментирующие НК;

• ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК;

• ферменты, лигирующие фрагменты ДНК;

• ферменты, модифицирующие концы НК.

Следует отметить, что все эти ферменты не обладают видовой специфичностью, и поэтому могут быть исполь зованы в экспериментах по генетической инженерии как прокариот, так эукариот.

 Прикладная молекулярная биология Ферменты, фрагментирующие ДНК Нуклеазы Нуклеазы катализируют гидролитическое расщеп ление фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Они могут разрезать НК с образованием 3’- гидроксильной или 5’- гидроксильной группы.

 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Нуклеазы в зависимости от типа НК, которую они расщепляют, могут быть разделены на две группы:

НУКЛЕАЗЫ ДНКазы РНКазы ДНКазы катализируют расщепление ДНК, а РНКазы – РНК. Нуклеазы могут быть специфичными к одноцепочечным или двухцепочечным НК (ДНК или РНК).

Существуют нуклеазы, способные гидролизовать как ДНК, так и РНК.

По месту расщепления НК нуклеазы могут быть разделены на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы:

НУКЛЕАЗЫ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ Эндонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные свя зи внутри молекулы НК. Они могут расщеплять также кольцевые молекулы. В результате действия эндонуклеаз образуются полинуклеотидные фрагменты различной длины. Экзонуклеазы в отличии от эндонуклеаз расщепляют НК с концов цепей. Различают 5’3’-экзонуклеазы и 3’5’-экзонуклеазы. 5’3’-экзонуклеазы расщепляют полинуклеотидную цепь, начиная с 5’-конца, а 3’5’ экзонуклеазы – в обратном направлении. При этом одни экзонуклеазы отщепляют по одному нуклеотиду, другие – олигонуклеотиды. Существуют экзонуклеазы, действующие в двух направлениях. Известна ДНКаза, которая является эндонуклеазой по отношению одноцепочечной ДНК и экзонуклеазой по отношению двухцепочечной ДНК.

Существуют ферменты, способные расщеплять РНК в составе гибрида ДНК-РНК. Такие ферменты получили название РНКазы Н. Среди них различают эндонуклеазы и 3’5’-экзонуклеазы. Активностью РНКазы Н обладает обратная транскриптаза.

 Прикладная молекулярная биология Среди эндонуклеаз выделяют особую группу фер ментов – рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции). Они входят в состав системы рестрикции-модификации, которая присуща бактериям. Основная задача системы – разрушение чужеродного генетического материала, проникшего в клетку (фагов и плазмид). В ее состав входят ферменты метилаза и рестриктаза. Система способна распознавать определённые полинуклеотидные последовательности, называемые сайтами рестрикции. Если ДНК не метилиро вана, то рестриктаза вносит в ДНК двуцепочечный разрыв, что приводит к нарушению ее биологической функции.

Если же метилированы одна или обе цепи ДНК, рестриктаза не способна ее разрезать. Поскольку ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо метилирована только одна из ее цепей (сразу после репликации), рестрикции она не подвергается. Образовавшаяся после репликации полуметилированная ДНК метилируется при участии метилтрансферазы, в результате обе цепи ДНК оказываются метилированными. Чужеродная же ДНК, проникшая в клетку, не метилирована, и поэтому подвергается рестрикции. Так система рестрикции-моди фикации обезвреживает чужеродную ДНК, не разрушая собственную.

Различают несколько типов рестриктаз:

• рестриктазы первого типа узнают определённую по следовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от нее в произвольной точке;

• рестриктазы второго типа узнают определённую последовательность и разрезают ДНК в фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого класса распознают в большинстве случаев палиндромные после довательности, состоящие обычно из 4-8 нуклеотидов;

• рестриктазы третьего типа узнают асимметричные последовательности и разрезают ДНК, отступив опреде лённое число нуклеотидных пар от её конца (или в несколь ких точках на разном удалении от сайта узнавания).

В экспериментах по молекулярной биологии и гене тической инженерии обычно используются рестриктазы второго класса.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Названия рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции) образу ются от названия их продуцента. Первая буква названия рестриктазы совпадает с первой буквой названия рода, а следующие две – с первыми двумя буквами вида организма, в котором фермент был обнаружен. Дополнительные буквы (могут отсутствовать в названиях) обозначают конкретный штамм или серотип. Римские цифры в конце названия указывают порядковый номер обнаружения фермента у конкретного организма. Например: BsuI – первый фермент, обнаруженный у Bacillus subtilis, EcoRV – пятый фермент, выделенный из Escherichia coli штамма RY13.

Рестриктазы, расщепляя ДНК, вносят разрывы в обе цепи. В результате разрезания ДНК могут образовываться липкие и тупые концы (рис. 4.2). Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. Могут образо вываться липкие концы с 5’-выступающими или 3’-высту пающими нуклеотидными последовательностями. Тупые концы образуются тогда, когда рестриктаза вносит разрывы в цепи ДНК строго друг напротив друга. Тупые концы не имеют выступающих нуклеотидных последовательностей. В таблице 1 представлены данные о некоторых рестриктазах, об их сайтах узнавания и о характере расщепления ДНК.


Рис. 4.2. Рестриктазы расщепляют ДНК с образованием липких концов (с 5’-выступающими (А) или 3’-выступающими (Б) нуклеотидными последовательностями) и тупых концов  Прикладная молекулярная биология Таблица 4. Характеристика некоторых рестриктаз Рестриктаза Сайт узнавания Организация образующихся в результате рестрикции концов Липкие концы с EcoRI 5’-выступающими нуклеотидными последовательностями Липкие концы с PstI 3’-выступающими нуклеотидными последовательностями PvuII Тупые концы Рестриктазы используются для фрагментации ДНК.

С их помощью возможно расщепление протяженных молекул ДНК на фрагменты длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Полученные после рест рикции фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле. Скорость перемещения фрагментов при электрофорезе обратно пропорциональна их размерам. Чем меньше размер фрагмента, тем больше его скорость перемещения, тем большее расстояние он пройдет.

Сравнивая расстояние, пройденное фрагментом в процессе электрофореза, с расстояниями, пройденными фрагментами ДНК с известными размерами, можно определить размер каждого из фрагментов ДНК, образовавшегося в результате рестрикции. После разделения фрагменты можно элюи ровать из геля и затем использовать в дальнейших иссле дованиях.

В результате расщепления образца ДНК опреде ленной рестриктазой всегда образуется один и тот же набор фрагментов. Различные рестриктазы, имеющие неодинаковые сайты узнавания, расщепляя один и тот же образец ДНК, будут образовывать наборы фрагментов, отличающиеся по размеру. Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного образца ДНК несколькими рестриктазами (по отдельности и со  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вместно), позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано расположение каждого сайта рестрикции на исследуемой молекуле ДНК.

Рестриктазы используют для построения рестрик ционных карт. Рассмотрим, как это делается. Предположим, что ДНК, размер молекул которой составляет 3300 п.н., обработали по отдельности рестриктазой 1 и рестрикта зой 2 (рис. 4.3). В результате расщепления рестриктазой получили три фрагмента длиной 1 700, 1 000 и 600 п.н., а при расщеплении рестриктазой 2 получили также три фраг мента, но их длина соответственно составила 1 900, 1 200 и 200 п.н. При расщеплении этого же образца ДНК смесью рестриктаз 1 и 2 получили пять фрагментов, размеры которых соответственно равны 1 200, 800, 600, 500 и 200 п.н.

На основании установленных размеров фрагментов ДНК необходимо далее определить их очередность расположения в исследуемой молекуле ДНК и определить расположение сайтов рестрикции для рестриктазы 1 и рестриктазы 2.

Образование трех фрагментов при действии каждой из рестриктаз свидетельствует о том, что в исследуемой ДНК имеется по два сайта узнавания для каждой из рестрик таз. Образующийся в результате действия рестриктазы фрагмент размером 600 п.н. не расщепляется при гидролизе смесью обеих рестриктаз (рис. 4.3), следовательно, он не будет содержать сайт рестрикции для рестриктазы 2.

Фрагменты размером 1 700 и 1 000 п.н. расщепляются смесью рестриктаз, следовательно, каждый из них имеет по сайту узнавания для рестриктазы 2. При этом фрагмент размером 1 700 п.н. распадается на куски по 500 и 1 200 п.н., а фрагмент 1000 п.н. на куски по 200 и 800 п.н. (рис. 4.3). Образующийся в результате действия рестриктазы 2 фрагмент размером 1 900 п.н. при гидролизе смесью рестриктаз распадается (рис. 4.3) на три фрагмента (500+600+800 = 1 900), следовательно, он будет иметь два сайта узнавания для рестриктазы 1.

Соответствие между положением сайтов рестрикции и размером фрагментов, образующихся в результате действия рестриктаз (по отдельности и совместно), представлено на рестрикционной карте (рис. 4.3).

 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.3. Построение рестрикционной карты. Р1 – рестриктаза 1, Р2 – рестриктаза На практике при построении рестрикционных карт могут быть применены и другие подходы. Например, может быть использовано более двух рестриктаз, в этом случае этот процесс становится довольно непростой процедурой. Также может быть осуществлено неполное расщепление ДНК  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рестриктазами, что в определенной степени может упростить решение поставленной задачи. Еще один прием, который используется при составлении карт рестрикции – введение радиоактивной концевой метки. В этом случае определяют размеры полученных в результате рестрикции меченых фрагментов. Кроме того, перекрывающиеся фрагменты могут быть установены благодаря способности комплементарных последовательностей ДНК гибридизоваться.

Рестрикционные карты нашли широкое применение в молекулярной биологии и генетической инженерии.

Сравнение карт рестрикции родственных генов позволяет оценить степень гомологии между ними. Идентичность рестрикционных карт свидетельствует о высокой сте пени гомологии или может быть об идентичности исследуемых генов. Напротив, различие рестрикцион ных карт родственных генов позволяет предположить наличие значительных отличий в их нуклеотидных по следовательностях.

Поскольку рестрикционная карта отражает распо ложение определенных нуклеотидных последовательнос тей в образце ДНК, она может быть использована для определения первичной структуры данной ДНК. С этой целью вначале исследуемая ДНК разрезается с помощью рестриктаз. Затем полученные ее фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Далее определяется первичная структура каждого фрагмента. На заключительном этапе, ис пользуя рестрикционную карту, расшифрованные нуклео тидные последовательности фрагментов располагают в очередности в соответствии с картой рестрикции. И так первичная структура ДНК определена.

Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК ДНК-полимераза Широко в генной инженерии используется ДНК полимераза I E. coli (Pol I). Этот фермент обладает  Прикладная молекулярная биология тремя активностями: полимеразной и 5’3’- и 3’5’-эк зонуклеазными активностями. Благодаря полимеразной активности ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК и превращать липкие концы в тупые (рис. 4.4).

Рис. 4.4. ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК (А) и превращать липкие концы в тупые (Б) В результате совместного действия полимеразной и 5’3’- экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный раз рыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК (рис. 4.5). Этот процесс называется ник-трансляция.

Рис. 4.5. В результате совместного действия полимеразной и 5’ 3’ экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии ДНК-полимераза 1 состоит из одной полипептидной цепи, которая образует три домена. N-концевой домен легко отделяется с помощью протеолитических ферментов.

Оставшаяся часть получила название (по фамилии одного из авторов, описавших ее) – фрагмент Кленова (Pol IK).

Последний обладает полимеразной и 3’ 5’-экзонуклеазной активностями. Фрагмент Кленова обычно используют для достройки одноцепочечных 5’-концов до тупых, для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК и для гидролиза одноцепочечных 3’-концов на двухцепочечных молекулах ДНК.

При проведении ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы: Tag ДНК-полимераза и Vent ДНК-поли мераза.

Обратная транскриптаза Обратная транскриптаза (ревертаза) обладает ДНК полимеразной активностью, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК, и активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК – ДНК.

Для инициации синтеза ревертазе необходима затравка (праймер). Роль праймера может выполнять как РНК, так и ДНК.

Ревертазу главным образом используют для обратной транскрипции иРНК (рис. 4.6) в комплементарную ДНК (кДНК). В качестве затравки при обратной транскрипции иРНК, содержащих на 3’-конце полиА-последовательность, используют поли-дT-последовательность. После синтеза це пи ДНК комплементарной иРНК образуется гибрид ДНК РНК. РНК в составе гибрида разрушают. Обычно для этой цели применяют щелочь. Далее осуществляют синтез второй цепи ДНК. В качестве матрицы при ее синтезе выступает первая цепь кДНК. В этом случае используют способность ревертазы образовывать на 3’-концах одноцепочечных кДНК шпильку, которая выполняет функцию праймера.

Синтез второй цепи может катализировать как обратная транскриптаза, так и ДНК-полимераза I E.coli. По окончании синтеза цепи кДНК остаются ковалентно связанными. Петлю, связывающую цепи, разрезают с помощью эндонуклеазы  Прикладная молекулярная биология S1, специфически гидролизующей одноцепочечные последовательности. Концы ДНК, образующиеся при расщеплении, могут оказаться выступающими. Превратить их в тупые можно с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I E.coli. Полученную кДНК можно использовать для дальнейших исследований.

Рис. 4.6. Синтез кДНК с использованием ревертазы Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК ДНК-лигаза ДНК-лигазы катализируют образование фосфо диэфирных связей между 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов. В генетической ин женерии и молекулярной биологии часто используются ДНК-лигаза фага Т4. Этот фермент способен катализировать  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии лигирование одноцепочечных разрывов, липких концов и двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.7).

Рис. 4.7. ДНК-лигаза фага Т4 катализирует лигирование одноцепочечных разрывов (А), липких концов (Б) двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (В) Ферменты, модифицирующие концы НК Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не нуждается в матрице, но требует затравку для своей работы. Этот фермент катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-концу ДНК. При использовании в качестве субстрата одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 3’-концы.

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза мо жет быть использована для конструирования липких концов в молекулах ДНК с целью их объединения (рис. 4.8). С этой целью образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии одного дезоксинуклеотида (например, дТТФ). В результате в молекуле ДНК на 3’-концах образуются поли-дТ-последовательности.

Другой образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии комплементарного дезоксинуклеотида (дАТФ).

В этом случае на 3’-концах образуются комплементарные поли-дА-последовательности. Смешивание таких молекул ДНК при определенных условиях приведет к образованию за счет липких концов гибридных молекул ДНК (рис. 4.8).

 Прикладная молекулярная биология При гибридизации липких концов возможно образование брешей. Для их ликвидации применяют ДНК-полимеразы (рис. 4.8). Оставшиеся разрывы в цепях ДНК сшивают при помощи ДНК-лигазы (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Объединение молекул ДНК с помощью терминальной нуклеотидилтрансферазы Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может использоваться для введения в 3’-концы ДНК радиоактив ной метки в составе меченых дезоксинуклеотидов.

ПолиА-полимераза ПолиА-полимераза использует в качестве суб страта АТФ (но не другие НТФ и дАТФ), катализирует присоединение к 3’- концу одноцепочечных молекул РНК полиА-последовательностей (рис. 4.9). Применяется для присоединения полиА-последовательности к РНК при подготовке их молекул к копированию с помощью ревертазы  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии с целью получение кДНК. ПолиА-полимераза применяется также для введения в 3’-конец РНК радиоактивной метки.

Рис. 4.9. ПолиА-полимераза катализирует присоединение к 3’-концу РНК полиА-последовательности Фосфатазы Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) катализируют гид ролитическое расщепление 5’- фосфомоноэфиров или 3’- фосфомоноэфиров.

Фосфатаза используется для удаления 5’-концевого фосфата с целью предотвращения лигирования двух соседних дезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы.

 Прикладная молекулярная биология Последняя, как указано выше, может катализировать обра зование фосфодиэфирных связей меж-ду 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами, но не между 5’- и 3’-гид роксильными группами.

Полинуклеотидкиназа Полинуклеотидкиназа катализирует фосфорилирова ние 5’-концевых (но не 3’-концевых) гидроксильных групп ДНК и РНК. Этот фермент используется для мечения 5’- конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактив ного Р-32 в составе АТФ:

Полинуклеотидкиназа Введение меченого фосфата осуществляют после удаления немеченого 5’-фосфата с помощью фосфатазы.

Методы в генетической инженерии Получение генов Гены для генно-инженерных экспериментов могут быть получены в результате их синтеза или выделены из природных источников. Синтез гена может быть осуществлен химическим способом или с помощью ПЦР. Эти подходы рассмотрены в главе «Синтез ДНК». Химический синтез гена возможен при условии, что известна его первичная структура или первичная структура полипептида, закодированного в нем. Для осуществления синтеза гена с использованием ПЦР требуется в качестве матрицы наличие самого гена и праймеров, комплементарных к его флангам. Кроме того, возможен синтез гена с помощью обратной транскриптазы на матрице иРНК, выделенной из клеток. Синтезирован ная таким образом ДНК будет отличаться от реального гена отсутствием регуляторных последовательностей и интронов.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Ген может быть выделен из библиотеки генома. Прежде чем выделить ген из библиотеки генома, необходимо ее создать. Далее рассмотрим, каким образом создается библиотека генома (рис. 4.10). Вначале очищенную ДНК, выделенную из какого-либо организма, фрагментируют обычно с помощью рестриктаз. Далее фрагменты ДНК встраивают в вектор, например, плазмиду. Полученные химерные векторы вводят в бактериальные клетки. Затем клетки высевают на питательную среду и получают колонии, каждая из которых представляет собой клон, клетки которого являются потомками одной клетки. Все клетки одного клона имеют рекомбинантные плазмиды с идентичными фрагментами встроенной чужеродной ДНК. Совокупность клонированных фрагментов и называют библиотекой генома. При создании библиотеки генома с вероятностью 99 % попадания в нее всей ДНК необходимо получить число клонов для E.coli – 1 500, дрожжей – 4 600, дрозофил – 48 000, млекопитающих – 800 000. Такие библиотеки созданы. При создании библиотеки генома могут быть использованы и вирусные векторы.

Рис. 4.10. Схема получения библиотеки генома  Прикладная молекулярная биология Из библиотеки генома можно выделить искомый ген. В этом случае поступают следующим образом (рис. 4.11). На чашки Петри с клонами бактерий, содержащие определенные фрагменты чужеродной ДНК, накладывается нитроцеллю лозный фильтр. В результате на фильтре получается слепок колоний. Затем осуществляют лизис клеток, денатурацию и фиксацию ДНК на фильтре. Далее проводят гибридизацию с зондом, комплементарным искомому гену. После анализа результатов гибридизации выявляют колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду с искомым геном. Клетки этой колонии отбирают и культивируют в питательной среде с целью увеличения их биомассы. Затем из бактериальных клеток выделяют рекомбинантную плазмиду, и из нее вырезают искомый ген с помощью той рестриктазы, кото рую использовали для получения библиотеки генома.

Недостатком использования библиотек генома для выделения генов является то, что в результате дробления ДНК образуется огромное число фрагментов, и для их кло нирования необходимо использовать большое количество клонов. Последнее обстоятельство затрудняет поиск нужного фрагмента ДНК в библиотеке. Кроме того, фрагменты ДНК обычно не полностью соответствуют искомому гену. Фрагмент может содержать нуклеотидные последовательности, не входящие в состав гена. А также, поскольку разрезание ДНК носит случайный характер, фрагменты могут содержать только часть гена.

Рис. 4.11. Выделение гена из библиотеки генома. 1 – перенос колоний на фильтр, 2 – лизис клеток, денатурация ДНК и ее фиксация на фильтре, 3 – гибридизация ДНК с зондом и выявление результата гибридизации, 4 – культивирование клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду с искомым геном, 5 – выделение рекомбинантной плазмиды из культуры клеток, 6 – вырезание с помощью рестриктазы из рекомбинантной плазмиды ДНК, содержащей искомый ген  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Кроме библиотеки генома может быть создана биб лиотека кДНК (рис. 4.12). При создании такой библиотеки необходимо из клеток живого организма выделить содер жащиеся в них иРНК. Потом при использовании их в качестве матрицы с помощью ревертазы осуществляют синтез кДНК.

Затем кДНК встраивают в плазмиды и рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки. Далее, размно жая клетки, получают клоны бактерий, содержащих реком бинантные плазмиды со строго определенной кДНК. Поиск и выделение кДНК из библиотеки кДНК осуществляют ана логичным образом, как и в случае с библиотекой генома.

Преимущество библиотеки кДНК перед библио текой генома заключается в том, что нуклеотидные после довательности кДНК полностью соответствуют кодирующим последовательностям гена. кДНК в отличие от реального гена не содержит интроны, поэтому ее можно использовать в генетической инженерии прокариот. Последние не способны осуществлять сплайсинг эукариотических РНК.

Рис. 4.12. Схема получения библиотеки кДНК  Прикладная молекулярная биология Определенный ген можно выделить из геномной ДНК.

С этой целью вначале из клеток организма выделяют ДНК.

Затем ее подвергают рестрикционному расщеплению. Полу ченные фрагменты подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. После электрофореза на гель накладывают мембрану. В результате на ней обра зуется слепок, на котором фрагменты ДНК занимают те же положения, что и на электрофореграмме. Затем мембрану обрабатывают радиоактивно меченым зондом, комплементарным искомому гену. После гибридизации зонда на мембрану накладывают рентгеновскую пленку.

После экспозиции на пленке проявляются засвеченные места, соответствующие расположению фрагмента ДНК, комплементарному зонду. Данный метод полу чил название Саузерн-блоттинг в честь ученого, разра ботавшего его – Э.Саузерна. По расположению полосы гибридизации на фильтре устанавливают нахождение на электрофореграмме фрагмента ДНК, содержащего искомый ген. Извлекают его из геля и затем используют в дальнейших экспериментах.

Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора Под вектором понимают небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться и обеспечивать размножение и функционирование встроенных в них генов.

Вектор должен обладать следующими характе ристиками:

• иметь точку начала репликации (ori) и автономно реплицироваться;

• содержаться в многочисленных копиях в клетке хозяине;

• сохраняться в дочерних клетках при делении мате ринской;

• обладать достаточной емкостью, позволяющей встраивать в них гены;

• содержать сайты рестрикции, используемые для встраивания гена в вектор;

• иметь маркеры, позволяющие осуществлять отбор клеток, содержащих рекомбинантный вектор.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Для доставки чужеродных генов в клетки используют векторы, созданные на основе плазмид, вирусов и др. С этой целью в структуру вектора интегрируют чужеродную ДНК. Вектор, содержащий чужеродный ген, называется рембинантный или химерный вектор. Существует несколько способов введения генов в вектор. Рассмотрим их.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.