авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. Резяпкин ...»

-- [ Страница 2 ] --

Рекомбинантный вектор можно получить с исполь зованием рестриктаз (рис. 4.13). В этом случае вектор и чужеродную ДНК, из которой получают ДНК-вставку, встраиваемую в вектор, разрезают с помощью одной и той же рестриктазы. В результате этого образовавшиеся липкие концы вектора и ДНК-вставки оказываются комп лементарными. При их смешивании в присутствии ДНК лигазы происходит объединение вектора и ДНК-вставки с образованием рекомбинантного вектора.

Рис. 4.13. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмиды с использованием рестриктазы Помимо образования рекомбинантного вектора воз можно внутримолекулярное лигирование вектора и ДНК вставки. В результате этого может произойти восстановление структуры исходного вектора или замыкание в кольцо ДНК вставки. Для увеличения выхода рекомбинантного вектора  Прикладная молекулярная биология его после рестрикции обрабатывают фосфатазой с целью удаления 5’-фосфомоноэфирных групп. При отсутствии последних ДНК-лигаза не может осуществлять лигирование, поскольку для образования фосфодиэфирных связей необходимо наличие 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной групп соседних нуклеотидов. Таким образом, после обработки фосфатазой становится невозможным восстановление исходной структуры вектора, что приводит к увеличению выхода рекомбинантного вектора.

Рекомбинантные векторы могут быть получены после их разрезания с образованием тупых концов и последующим лигированием с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с чужеродной ДНК по тупым концам (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмид с использованием ДНК-лигазы фага Т4, сшивающей ДНК по тупым концам Для создания рекомбинантного вектора может быть использована терминальная дезоксинуклеотидилтранс фераза. С ее участием можно нарастить липкие концы, с помощью которых можно объединить молекулы ДНК. Особенности этого подхода описаны выше в теме «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза» и пред ставлены на рис. 4.8 и 4.15.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.15. Получение рекомбинантного вектора с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы Плазмидные векторы Плазмиды представляют собой автономно репли цирующиеся внехромосомные обычно кольцевые двух цепочечные молекулы ДНК. Природные плазмиды могут быть использованы в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК. Однако они не всегда высокоэффективны.

В связи с этим для достижения высокой эффективности функционирования плазмидные векторы создаются с помощью методов генетической инженерии. Плазмидные векторы должны:

 Прикладная молекулярная биология • иметь небольшой размер, с увеличением размера вектора снижается размер встраиваемой в него чужеродной ДНК;

• иметь в своем составе сайт рестрикции, по которому может быть осуществлено встраивание чужеродной ДНК;

• иметь в своем составе селективные маркеры, не обходимые для идентификации клеток, захвативших рекомбинантную ДНК.

В настоящее время сконструировано множество плаз мидных векторов, используемых в генетической инженерии.

Широкое применение нашел плазмидный вектор pBR (p – от англ. plasmid, BR – инициалы создателей – Ф.Боливара и Р.Радригиса, 322 – число, взятое из исследовательских протоколов). Его размер составляет 4361 п.н. Эта плазмида (рис. 4.16) несет ori, обеспечивающий репликацию плазмиды только в клетках E.coli, два селективных маркера – гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрацикли ну, по одному сайту рестрикции для нескольких рестриктаз (среди них в гене устойчивости к тетрациклину для Hind III, BamH I и Sal I, а в гене устойчивости к ампициллину – для Pvu I и Pst I). Плазмида в клетках может реплицироваться с образованием большого числа копий, что обеспечивает присутствие в бактериальной клетке чужеродной ДНК в составе рекомбинантной pBR322 также в большом числе копий.

Рис. 4.16. Плазмида pBR322. ГУТ – ген устойчивости к тетрациклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину. Указаны сайты узнавания для рестриктаз  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Клетки E.coli, содержащие pBR322, способны расти в среде, содержащей как ампициллин, так и тетрациклин, или оба эти антибиотика. Напротив, бактериальные клет ки, в которых данная плазмида отсутствует, не растут в среде, содержащей любой из этих антибиотиков или оба антибиотика.

В то же время бактериальные клетки, содержащие плазмиду, в области гена устойчивости к тетрациклину которой осуществлена вставка чужеродной ДНК, будут устойчивы к ампициллину, но не будут расти в присутствии тетрациклина (рис. 4.17). Если же ввести чужеродную ДНК в состав гена устойчивости к ампициллину, то наблю дается обратная картина (рис. 4.17). Таким образом, чув ствительность клеток E.coli к указанным антибиотикам позволяет идентифицировать в них наличие или отсутствие рекомбинантной или интактной pBR322.

Рис. 4.17. Вставка чужеродной ДНК в область генов устойчивости к антибиотикам плазмиды pBR322 влияет на чувствительность бактериальных клеток к соответствующим антибиотикам. ГУТ – ген устойчивости к тетра циклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину  Прикладная молекулярная биология Находят свое применение плазмидные векторы, содержащие в своем составе в качестве селективного мар кера ген lac-Z, кодирующего фермент -галактозидазу.

Этот фермент катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. В качестве примера рассмотрим организацию вектора pUC (рис. 4.18). Эта плазмида имеет размер 27 000 п.н. и содержит в своем составе помимо гена lac-Z, ген устойчивости к ампициллину. В гене lac-Z расположен участок, называемый полилинкер, в котором находятся сайты узнавания для рестриктаз. Именно в него осуществляют вставку чужеродной ДНК. В результате такой вставки нарушается организация гена lac-Z и он теряет способность экспрессироваться с образованием функционально активной -галактозидазы.

Рис. 4.18. Плазмида pUC 18. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Бактериальные клетки, содержащие как реком бинантный со вставкой чужеродной ДНК, так и нерекомбинантный векторы pUC 18, в отличие от бес плазмидных клеток способны расти в среде с ампициллином.

При этом колонии клеток с нерекомбинантном вектором окрашены в голубой цвет, а колонии с рекомбинантной плазмидой будут белыми (рис. 4.19). Так селективные маркеры позволяют идентифицировать наличие вектора в бактериальных клетках.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.19. Вставка чужеродной ДНК в область гена lac-Z плазмиды pUC нарушает его экспрессию. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Фаговые векторы Фаговые векторы предпочтительнее использовать, чем плазмидные векторы, при клонировании более крупных фрагментов чужеродной ДНК. Наиболее распространен ными фаговыми векторами для E.coli являются векторы, созданные на основе фагов и М13.

Для фага характерно два альтернативных пути раз вития: литический и лизогенный. В случае литического пути развития после проникновения фага в клетку его гены начинают экспрессироваться в определенной последовательности. Результатом их экспрессии является образование порядка 100 фаговых частиц на клетку. Затем происходит лизис клетки и фаговые частицы оказываются в окружающей среде. При лизогенном пути развития ДНК фага встраивается в ДНК бактерии и реплицируется вместе с ней. Спонтанно или под действием каких-либо факторов фаг может перейти на литический путь развития.

Геном фага может быть представлен множественными формами (рис. 4.20). Внутри фаговой частицы геном фага находится в линейной форме. При попадании фага в клетку, его ДНК замыкается в кольцо за счет липких концов. Во время репликации ДНК фага образует длинные конкатемеры, которые затем разрезаются на индивидуальные геномные ДНК фага. И четвертая форма – интегрированная форма ДНК фага в клеточном геноме.

 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.20. Геном фага может быть представлен линейной (1), кольцевой (2), конкатемерной (3) и интегрированной (4) в клеточный геном формами Геном фага полностью расшифрован и его размер составляет 48502 п.н. (рис. 4.21). ДНК фага содержит область начала репликации (ori), гены структурных белков, участвующих в формировании вирусной частицы, гены ферментов, принимающих участие в репликации, гены, обеспечивающие лизис инфицированных клеток, и гены, ответственные за установление лизогении. Около 1/3 части генома между точками 20 – 38 т.п.н. являются не обязательной для установления литической инфекции. В этом участке генома представлены гены, необходимые для установления лизогенного состояния. Несущественной является также область ДНК вблизи точки 43 т.п.н. При конструировании векторов на основе ДНК фага, все гены или часть генов, необходимых для лизогении, удаляются.

Поэтому инфицирование всегда сопровождаются лизисом клеток. Для успешной упаковки ДНК фага в вирионе ее длина должна составлять 38 – 52 т.п.н. В связи с этим все  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии удаленные последовательности ДНК при конструировании рекомбинантного вектора могут быть заменены сегментом чужеродной ДНК соответствующей длины.

Рис. 4.21. Линейный геном фага. Необязательные для литической инфекции участки генома показаны широкими линиями На основе фага создано множество -векторов. Эти векторы подобно фагу могут размножаться посредством литической инфекции. Наличие сайтов рестрикции в их геноме позволяет осуществить удаление несуществен ной области и обеспечить встраивание чужеродной ДНК (рис. 4.22). Размер встраиваемого фрагмента может составлять до 24 т.п.н.

Рис. 4.22. Схема встраивания чужеродной ДНК в l-вектор. СР – сайт рестрикции  Прикладная молекулярная биология Некоторые -векторы содержат ген -галактозидазы.

При создании рекомбинантного -вектора вместе с несу щественной областью удаляется и ген -галактозидазы. При инфицировании бактериальных клеток, выращиваемых на среде с X-gal, нерекомбинантным -вектором, на их колониях будут формироваться голубые бляшки. При инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным -вектором – будут формироваться бесцветные бляшки. Так можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный -векторы.

Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, сконструированные на основе фага М13.

Геном фага представлен кольцевой одноцепочечной ДНК, размер которой составляет около 6 400 нуклеотидов.

После инфицирования клеток E.coli одноцепочечная ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. Затем происходит репликация таких молекул с образованием приблизительно 300 копий, которые впоследствии исполь зуются в качестве матриц для синтеза одноцепочечных фаговых ДНК. Одновременно с синтезом ДНК происходит экспрессия фаговых генов. Одноцепочечные фаговые ДНК совместно с белками капсида формируют зрелые фаговые частицы, которые покидают клетки, образуя на бактериальной колонии мутные бляшки. Бактериальные клетки при этом не погибают, хотя их рост замедляется.

При создании рекомбинантной ДНК используют двухцепочные репликативные формы ДНК фага М13. Од ноцепочечные же ДНК фага не применяются в качестве векторов, поскольку не могут быть разрезаны с помощью рестриктаз.

В геноме фага М13 имеется некодирующая область, длина которой составляет 507 нуклеотидов. В этот сайт может быть встроена вставка, не приводящая к нарушению репликации ДНК фага. Часто в эту область при создании векторов встраивают фрагмент lac-оперона E.coli, содержа щий часть гена -галактозидазы, и так называемый полилин кер (рис. 4.23). Полилинкер содержит сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Именно в полилинкер при создании  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рекомбинантного вектора встраивают чужеродную ДНК. В отсутствии в составе полилинкера вставки чужеродной ДНК векторный геном детерминирует синтез -галактозидазы.

При наличии в среде субстрата Xgal, бляшки окрашиваются в голубой цвет. При наличии же вставки чужеродной ДНК в составе полилинкера синтез -галактозидазы нарушается и формируются бесцветные бляшки (рис. 4.23). Таким образом, можно различить бляшки, содержащие рекомбинантный и нерекомбинантный векторы.

Рис. 4.23. Схема получения рекомбинантного вектора на основе фага М13.

1 – введение в некодирующую область генома фага фрагмента lac-оперона E.coli, содержащего часть гена -галактозидазы, и так называемый полилинкер.

2 – введение в область полилинкера чужеродной ДНК Космиды Космиды являются гибридными векторами, состоящи ми из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага (рис. 4.24).

Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая – соединенные липкие концы (cos-сайт). Космиды реплицируются по плазмидному типу репликации и способны упаковываться в оболочки фага. В состав космидного вектора может быть включена вставка чужеродной ДНК до 45 т.п.н.

 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.24. Космида Клонирование чужеродной ДНК при использовании космид осуществляют следующим образом (рис. 4.25). Вна чале космиду разрезают с помощью рестриктазы. Далее линейную космиду смешивают с чужеродной ДНК, липкие концы которой комплементарны липким концам космиды.

После отжига и лигирования образуются конкатемеры.

Обработка конкатемеров белками, осуществляющими упаковку ДНК фага, приводит к вырезанию из конкатемеров по cos-сайтам фагового генома, содержащего ДНК-вставку. Наличие cos-сайтов является единственным необходимым требованием для упаковки ДНК в фаговые частицы. Таким образом, последовательность нуклеотидов ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, может быть упакована в фаговые частицы. Фаговая частица, содержащая между cos-сайтами только чужеродную ДНК, будет нежизнеспособной. В то же время после адсорбции такой фаговой частицы на поверхности клетки, заключен ная в ней ДНК поступает внутрь бактерии, где она начинает реплицироваться как плазмида. Поскольку плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры – генов устойчивости к антибиотикам – бактериальные клетки выращивают на среде с соответствующими антибиотиками.

С одной стороны, наличие плазмиды обеспечивает выжи вание бактериальных клеток, а выращивание бактерий на среде с антибиотиками, с другой стороны, – обеспечивает сохранение таких плазмид в клетках.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Упаковка ДНК космид в фаговые частицы необходима только для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток.

Проникшая внутрь клетки рекомбинантная космида может в ней существовать как плазмида и не может быть упакована в фаговую частицу.

Рис. 4.25. Схема клонирования чужеродной ДНК при использовании космид  Прикладная молекулярная биология Фазмиды Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага.

Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага, содержащие гены, необходимые для литической инфекции, а в центральной части – плазмидный сегмент, обычно сос тоящий из нескольких повторов последовательностей плазмидной ДНК. В процессе получения рекомбинантной фазмиды, один или несколько повторов плазмидной ДНК заменяется чужеродной ДНК. Попадая в клетку, фазмида в зависимости от ее конструкции и от условий выращи вания бактерий может реплицироваться либо как фаговая ДНК, либо как плазмида. Таким образом, фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других – как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки.

Челночные векторы Особенностью челночных векторов является способ ность их реплицироваться в двух разных видах организмов.

Такие векторы содержат две области начала репликации, соответствующие каждому из обоих видов хозяев. Существу ют челночные векторы, способные существовать как в клетках двух видов прокариот, так и в клетках прокариот (обычно в E.coli) и эукариот (дрожжи, растения, животные).

Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных Для введения чужеродной ДНК в клетки животных часто используют векторы, сконструированные на основе вирусов. Широкое применение нашли векторы, созданные на основе SV40. Геном этого вируса представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, размер которой составляет 5243 пн.

В геноме имеется ori и закодировано 5 белков: малый Т антиген, большой Т антиген и три белка капсида VP1, VP и VP3. Большой Т антиген необходим для репликации ДНК  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вируса. В инфицированной клетке образуется около 100 000 вирусных частиц, которые покидая клетку, вы зывают её гибель. При создании векторов на основе SV40 удаляют определенные нуклеотидные последо вательности ДНК-вируса и вместо них в геном встраивают другие фрагменты ДНК.

Существуют три типа векторов, созданных на основе SV40:

•трансдуцирующие SV40-векторы. Такие векторы способны реплицироваться в клетках-хозяинах и упако вываться в вирионы. При их создании осуществляют замену кодирующих последовательностей ДНК вируса на фрагмент чужеродной ДНК эквивалентного размера.

В результате такой замены вектор теряет способность формировать вирусные частицы, из-за утраты способности обеспечивать синтез белка(ов), ген(ы) которого(ых) был(и) удалены из генома. Компенсировать утраченный синтез белка(ов) может вирус-помощник дикого типа. Последний, находясь в клетке совместно с трансдуцирующим вектором, способен обеспечить синтез всех белков, необходимых для удовлетворения как своих потребностей, так и потребностей трансдуцирующего SV-вектора. Таким образом, в присут ствии вируса-помощника трансдуцирующий вектор будет упакован в вирион;

• плазмидные SV40-векторы. В их составе присутству ет ori и ген большого Т антигена, в то же время гены белков капсида VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. В связи с этим плазмидные векторы способны реплицироваться, но не упаковываться в вирионы. Плазмидные векторы могут быть челночными и содержать последовательности ДНК, позволяющие им реплицироваться как в клетках прока риот, так и клетках эукариот;

• пассивные трансформирующие векторы. Они не спо собны ни реплицироваться, ни упаковываться в вирионы.

Такие векторы представляют собой молекулы ДНК, которые содержат сегменты генома SV40, ответственные за экспрес сию генов. Пассивные векторы способны осуществить доставку чужеродной ДНК и внедрить ее в клеточную ДНК.

 Прикладная молекулярная биология Широкое применение в генетической инженерии наш ли векторы, созданные на основе ретровируса. Геномной НК ретровирусов является РНК. Их жизненный цикл следующий. После адсорбции вириона на поверхности клетки и проникновения в нее происходит копирование РНК в результате обратной транскрипции с образованием двухцепочечной ДНК, которая затем интегрирует в клеточный геном. Интегрированная ДНК транскрибируется с образованием геномных и субгеномных РНК. Оба типа РНК служат матрицами для синтеза белка. После накопления вирус-специфических белков происходит формирование вирусных частиц и высвобождение их из клетки (рис. 4.26).

Рис. 4.26. Жизненный цикл ретровирусов При конструировании векторов на основе ретровирусов обычно часть ретровирусных генов удаляют. При этом опре деленные нуклеотидные последовательности, необходимые для обратной транскрипции, экспрессии генов, упаковки генома в вирионы должны быть сохранены. При получении рекомбинантного ретровирусного вектора чужеродные  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии нуклеотидные последовательности встраивают, замещая удаленные области генома. Далее рекомбинантный вектор с помощью различных ухищрений упаковывается в вирион, который способен обеспечить доставку генетического материала в клетку и его интеграцию в клеточный геном.

Таким образом, векторы, созданные на основе ретровирусов, способны не только доставлять чужеродный генетический материал в клетку, но и интегрировать его в ДНК клетки хозяина. Интегрированная чужеродная ДНК будет ре плицироваться вместе с клеточной ДНК, и передаваться при делении материнской клетки потомкам.

Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений В генетической инженерии растений для транс формации растительных клеток используют векторы, созданные на основе вирусов. Например, вируса мозаики цветной капусты и др. Преимущество вирусов, используемых в качестве векторов, заключаются в том, что они легко проникают в клетку и в ней размножаются. При этом число копий вирусного генома в клетке может достигать десятков тысяч. Следовательно, число копий чужеродного гена в клетке достигает такого же значения. Наличие большого числа копий генов может обеспечить сверхсинтез белкового продукта. К недостаткам вирусных векторов относится огра ниченный размер вводимых в них чужеродной ДНК и то, что вирусы имеют ограниченный круг хозяев.

В настоящее время считается, что для доставки генетического материала в растительные клетки наиболее перспективно применение векторов, сконструированных на основе Ti- плазмиды Agrobackteria tumefaciens. Эти почвенные бактерии способны вызывать образование опухолей (ко рончатых галлов) у растений. Клетки корончатых галлов так же, как и раковые клетки животных, способны к неограниченному росту. Опухолеродным агентом у Agro backteria tumefaciens является ее Ti-плазмида. После того как бактерии попадают в пораженные ткани растений,  Прикладная молекулярная биология Ti-плазмида проникает в растительные клетки. Затем часть ДНК плазмиды, так называемая Т-ДНК, интегрирует в геном растения. В результате экспрессии интегрированной Т-ДНК образуются белки, которые обеспечивают трансформацию растительных клеток в клетки корончатых галлов.

Ti-плазмида представляет собой кольцевую двухцепо чечную молекулу ДНК, длина которой составляет 150 – т.п.н. В ее состав входят:

• T-ДНК (12 – 20 т.п.н.). T-ДНК встраивается в геном растений и кодирует ферменты биосинтеза фитогормонов и опинов (производных аминокислот). Продукты генов Т-ДНК вызывают образование корончатых галлов;

• vir-область, содержит гены, ответственные за перенос Т-ДНК в геном растений;

• tra-область, включает гены, контролирующие конъю гацию бактерий;

• ori-область, содержит последовательности ДНК, от ветственные за репликацию Ti-плазмиды.

Ti-плазмида содержит два набора генов: один из кото рых экспрессируется в клетках бактерий, другой – в клетках растений. Регуляция экспрессии генов в составе Т-ДНК осу ществляется посредством элементов, функционирующих в клетках растений, в то время как остальные гены находятся под контролем бактериальных промоторов. Необходимо обратить внимание, что для образования корончатых галлов необходимы гены обеих групп.

Возможность использования Ti-плазмид в качестве вектора обусловлена тем, что • круг хозяев агробактерий широк;

• они способны трансформировать практически все двудольные растения, кроме того можно добиться транс формации однодольных растений, в том числе злаков;

• интегрированная в геном Т-ДНК наследуется как доминантный признак.

При создании рекомбинантных векторов на основе Ti-плазмиды чужеродную ДНК встраивают в состав Т-ДНК.

Способность последней интегрировать в геном растений обеспечивает внедрение и чужеродной ДНК.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Векторная система, созданная на основе Ti-плазмид, должна:

• содержать сигналы для переноса и интеграции Т-ДНК в ядерный геном растений;

• содержать промотор, обеспечивающий экспрессию чужеродных генов. Промотор должен обладать достаточной силой и узнаваться РНК-полимеразой растений. Может использоваться регулируемый промотор. Например, промотор генов белков теплового шока. Гены с таким промотором будут экспрессироваться при повышенной температуре. Другой регулируемый промотор – промотор гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбок силазы (фермент, участвующий в фотосинтезе) активен только в фотосинтезирующих тканях. Часто в генетической инженерии используется промотор гена вируса мозаики цветной капусты. Гены с таким промотором активно экспрессируются во всех тканях;

• содержать маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток. В качестве маркеров могут быть использованы гены lux A и lux B, выделенные из ДНК светлячков, и контролирующие синтез люциферазы. Этот белок обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в восстановленную форму. Такой переход соп ровождается свечением. Также в качестве маркера применяется ген pgfp, выделенный из медузы Acquorea victo ria, контролирует синтез GFP-белка. Трансгенные растения с этим геном светятся зеленым светом в ультрафиолете;

• не содержать онкогенов, подавляющих дифферен цировку растительных клеток.

Рекомбинантные Ti-плазмиды используют для полу чения трансгенных растений. С этой целью раститель ные клетки обрабатывают бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду. Последняя обеспечивает дос тавку чужеродных генов в составе Т-ДНК в растительный геном. Затем из отдельных клеток выращивают трансгенные растения. Следует отметить, что в результате эксперимента не все растительные клетки подвергаются трансформации.

Отбор трансгенных растений от нетрансформированных  Прикладная молекулярная биология можно осуществить с помощью маркеров. Если в качестве маркера использовался ген pgfp, то трансгенные растения в отличие от нетрансгенных растений будут светиться в ультрафиолете.

Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма Гены как в прокариотические, так и экариотические клетки могут быть введены с использованием векторов, сконструированных на основе вирусов. Вирусы способны обеспечить проникновение рекомбинантного вектора внутрь клетки. При этом каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. Более того, в некоторых случаях вирусы обеспечивают встраивание чужеродного гена в состав клеточного генома.

Возможна доставка чужеродной ДНК в клетки и без участия вирусов. Этот процесс называется трансфекция.

Существуют несколько методов доставки чужеродной ДНК в клетки на основе трансфекции: кальций-фосфатная трансфекция;

микроинъекция;

электропорация;

биобал листическая трансформация, липофекция и др.

Кальций-фосфатная трансфекция является одним из самых простейших методов доставки чужеродной ДНК в клетки. В этом случае к раствору, содержащему ДНК и фосфат, добавляют хлорид кальция. В результате образуются частицы кальциевого преципитата, состоящего из фосфата кальция и ДНК. Преципитатом обрабатывают клетки, которые путем фагоцитоза поглощают частицы.

В составе преципитата внутрь клеток проникает и ДНК.

Эффективность трансформации клеток таким способом невелика. Ее можно несколько увеличить, используя какие либо вещества, например, глицерин, или этиленгликоль.

Метод микроиньекций широко используется при переносе генов в процессе получения трансгенных животных.

Определенное количество копий генетического материала инъецируется при помощи микропипетки в клеточное ядро (рис. 4.27). Чужеродную ДНК обычно вводят в одноклеточный эмбрион – зиготу.

 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.27. Метод микроинъекций. С помощью микропипетки в ядро клетки вводится раствор ДНК Метод электропорации основан на способности кле точной мембраны становиться проницаемой для молекул ДНК под действием импульсов тока высокого напряжения.

В результате воздействия тока, в мембранах клеток формируются поры, через которые способны проходить молекулы ДНК. При проведении эксперимента (рис. 4.28) в среду вносят клетки и чужеродную ДНК, которую необ ходимо ввести в эти клетки. Через среду пропускают вы соковольтные импульсы электрического тока, приводящие к образованию пор в мембране. Через эти поры ДНК проникает в клетку. Электропорация успешно используется для введения молекул ДНК в клетки животных, простейших, растений, дрожжей, бактерий.

Рис. 4.28. Электропорация  Прикладная молекулярная биология Принцип метода биобаллистической трансформации (рис. 4.29) основан на том, что на мельчайшие частички металла (вольфрама, платины или золота) наносится чуже родная ДНК. Металлические частички, покрытые ДНК, помещаются внутрь биобаллистической пушки. В пушке уменьшается давление до 0,1 атм. В этот момент частички металла с огромной скоростью выстреливаются из пушки и, пробивая мембраны, попадают в цитоплазму и ядра клеток.

Так чужеродная ДНК проникает внутрь клеток.

Рис. 4.29. Биобаллистическая трансформация Метод липофекции основан на использовании липосом для доставки ДНК в клетки. Липосомы представляют собой сферические структуры, оболочки которых образованы бислоем фосфолипидов (рис. 4.30). Их получают в результате обработки ультразвуком или резкого встряхивания водных эмульсий фосфолипидов. При осуществлении липофекции ДНК помещают в липосомы. Таким образом, генетический материал защищается от действия нуклеаз. Липосомы способны сливаться с клеточной мембраной, после чего их содержимое проникает в клетки. Так ДНК доставляется внутрь клеток.

Рис. 4.30. Липосома  Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Судьба чужеродной ДНК, внесенной в клетку в резуль тате трансфекции, может быть двоякой. В связи с этим различают стабильную трансфекцию и транзиентную тран сфекцию. В случае транзиентной трансфекции переносимая ДНК не включается в ядерный геном и не реплицируется.

В связи с этим она быстро теряется по мере размножения клеток. При стабильной трансфекции чужеродная ДНК интегрирует в клеточный геном, реплицируется вместе с ним и не теряется в процессе деления клеток.

Получение ГМО Конечной задачей генетической инженерии явля ется получение ГМО. Для решения этой задачи после трансформации клеток чужеродным генетическим мате риалом, необходимо отобрать клетки с приобретенными генетическими свойствами. С этой целью могут быть использованы, как указывалось ранее, различные подходы.

На следующем этапе трансформированные клетки яв ляются основой для получения ГМО. Так из отдельной трансформированной растительной клетки можно получить фертильное трансгенное растение. При получе нии же трансгенных животных необходимо предварительно трансформировать половые клетки или зиготу, поскольку из соматических клеток животных нельзя вырастить животное.

 Глава 5. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРОКАРИОТ Генетическая инженерия прокариот зародилась в 70-х годах XX века. Наиболее излюбленным объектом ее исследования с тех пор является E.coli. К настоящему вре мени получены и другие генетически модифицированные бактерии: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus brevis, Acremonium chrysogenum, Zymomonas mobilis, Erwinia herbicola, Corynebacterium glutamicum и др.

Конечной целью генетической инженерии бактерий обычно является получение продуцентов каких-либо белков, например, инсулина, гормона роста и др., а также получение генетически модифицированных микроорганизмов, создан ных для решения определенных задач, например, были генетически модифицированы некоторые штаммы Co rynebacterium glutamicum с целью повышения продукции определенных аминокислот. Получены также штаммы бактерий, которые эффективно разрушают токсичные отхо ды, деградируют целлюлозу до низкомолекулярных соеди нений и т.д. Кроме того генетически модифицированные бактерии широко используются в научных исследованиях.

Получение генетически модифицированных бактерий включает следующие этапы:

• получение гена;

• введение чужеродного гена в вектор;

• введение рекомбинантного вектора в бактериальную клетку;

• идентификация клеток, содержащих рекомбинант ный вектор;

•размножение генетически модифицированных бактерий.

Гены могут быть синтезированы или выделены из биологических объектов. Синтез гена возможен, если известна его нуклеотидная последовательность или же первичная структура в нем закодированного белка. В последнем случае первичная структура синтезированного гена может отличаться от первичной структуры природного гена. Это определяется тем, что генетический код вырожден.

 Глава 5. Генная инженерия прокариот В связи с этим по первичной структуре белка практически невозможно воссоздать первичную структуру природного гена. Также возможен синтез гена с использованием ПЦР или с помощью обратной транскрипции иРНК. Кроме того гены могут быть выделены из библиотеки генома или из препаратов ДНК того или иного живого организма. С целью успешной экспрессии, гены должны содержать кроме кодирующих последовательностей и регуляторные области:

промоторы, участки, кодирующие последовательность Шай на-Дальгарно и др. При использовании эукариотических генов последние не должны содержать интронов, поскольку у прокариот отсутствует эукариотическая система сплайсинга.

Исключение интронов из состава генов возможно в процессе их химического синтеза, когда синтезируются нуклео тидные последовательности, соответствующие только экзонам. кДНК, синтезированная в результате обратной транскрипции иРНК, также будет соответствовать кодирую щим последовательностям и отличаться от природного гена отсутствием в своем составе интронов. Таким образом, кДНК может быть использована для синтеза эукариотических белков в бактериальных клетках.

Для доставки чужеродных генов в прокариотические клетки используются векторы, созданные на основе плазмид или вирусов. Разработаны различные подходы введения чужеродного гена в вектор с целью получения рекомбинантного (химерного) вектора. Для решения этой задачи могут быть использованы рестриктазы, полинуклетидполимераза, лигазы. Более подробно вопрос об организации векторов и способах введения в их состав чужеродной ДНК рассмотрен ранее в теме «Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора».

Рекомбинантный вектор на следующем этапе необходимо доставить в бактериальную клетку. Векторы, созданные на основе вирусов, проникают внутрь клетки, используя способность вирусов инфицировать бактерии.

Для введения химерных векторов на основе плазмид в бактериальные клетки могут быть использованы метод электропорации или высокотемпературное воздействие в сочетании с обработкой клеток хлоридом кальция. Следует отметить, что эффективность трансформации при этом  Прикладная молекулярная биология невысока. В связи с этим на следующем этапе возникает необходимость отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду.

При трансформации бактериальных клеток с помощью pBR322 чужеродный ген в этот вектор встраивают в один из двух генов устойчивости к антибиотику. Тогда бактерии, захватившие рекомбинантную плазмиду, приобретут устойчивость только к одному антибиотику, ген которого остался интактным. Поскольку при создании рекомбинантного вектора не все молекулы pBR подвергаются рекомбинации, поэтому в среде, в которой обрабатывают бактериальные клетки при их трансформации, будут присутствовать молекулы и нерекомбинантного вектора pBR322. Такие векторы могут быть также захвачены бактериями. По завершению процедуры трансформации в среде будут присутствовать три вида клеток: клетки, не захватившие плазмиду pBR322, клетки, захватившие рекомбинантную плазмиду pBR322, и клетки, захватившие нерекомбинантную плазмиду pBR322. Из этой смеси необходимо отобрать клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. С этой целью бактерии высевают на среду, содержащую тот антибиотик, ген устойчивости к которому интактен в обеих плазмидах. В этих условиях бесплазмидные клетки не способны расти. Клетки же бактерий, содержащие как рекомбинантную, так и нерекомбинантную плазмиду, образуют колонии. На основании чувствительности к антибиотику, ген устойчивости к которому нарушен в рекомбинантной плазмиде, можно различить колонии кле ток с рекомбинантной и нерекомбинантной плазмидами.

Для этого часть клеток каждой колонии тестируют на их чувствительность к данному антибиотику. Клетки бактерий, содержащих нерекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии данного антибиотика, в то время как клетки с рекомбинантной плазмидой в этих условиях не растут.

В генетической инженерии широко используют векторы, несущие одновременно ген устойчивости к антибиотику и ген бета-галактозидазы, например вектор pUC 18. Бета-галактозидаза катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. Последний придает колониям клеток  Глава 5. Генная инженерия прокариот голубую окраску. При использовании таких векторов встраивание чужеродной ДНК осуществляют в ген бета галактозидазы. Бактерии, содержащие рекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии соответствующего антибиотика, и будут при этом бесцветными. В то время как бактерии, содержащие нерекомбинантную плазмиду, будут также расти в присутствии антибиотика и будут при этом голубыми. При этом бесплазмидные бактериальные клетки в присутствии антибиотика погибнут. Используя вышеописанную особенность, можно после трансформации бактериальных клеток из смеси клеток (бесплазмидных клеток, клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду, и клеток, содержащих нерекомбинантную плазмиды) выде лить клетки с рекомбинантной плазмидой.

Экспрессия генов, клонированных в клетках прокариот Интеграция гена в состав вектора не гарантирует того, что он будет экспрессироваться с образованием функционально активного продукта. Чтобы обеспечить экспрессию чужеродного гена, необходимо перед ним поместить бактериальный промотор и регуляторные участ ки (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Для успешной экспрессии перед чужеродным геном должен располагаться промотор и последовательность ДНК, кодирующая участок связывания с рибосомой в составе иРНК  Прикладная молекулярная биология С целью повышения эффективности транскрипции чужеродных генов перед ними размещают сильные промоторы. Такие промоторы благодаря высокому сродству к РНК-полимеразе обеспечивают высокую скорость синтеза иРНК. Предпочтительнее использовать регулируемые про моторы. Экспрессию генов с таким промоторами можно регулировать. При определенных условиях гены будут молчать, при других – эффективно транскрибироваться.

В генной инженерии прокариот широко используются промоторы lac- и trp-оперонов E.coli и др. Промотор lac оперона обеспечивает эффективную транскрипцию при высокой концентрации лактозы (или изопропил--D-тио галактопиранозида) и цАМФ и при низкой концентрации глюкозы. В других условиях он обуславливает низкий уровень транскрипции. Иным способом регулируется промотор trp-оперона. Он выключается при наличии в среде высокой концентрации триптофана. При удалении триптофана или добавлении в среду 3-индолакриловой кислоты происходит активация данного промотора.

Часто стоит задача перед исследователями – получение большого количества белка. Для достижения этой цели необходимо соблюсти следующие условия: поместить перед геном сильный промотор и добиться наличия большого числа копий молекул вектора в клетке. Для получения большого количества белкового продукта была создана плазмида рСР3. В ее состав входят сильный промотор, ген устойчивости к ампицилину, сайт инициации репликации, обеспечивающий при повышении температуры увеличение на порядок числа копий плазмиды в клетке, полилинкер с несколькими сайтами узнавания для рестриктаз, по которым встраивают чужеродный ген. Бактерии, содержащие такие плазмиды, вначале выращивают при 28 °С, а затем – при 42 °С. При низкой температуре клетки делятся, при этом промотор не функционирует, и в клетке содержится обычное число копий плазмиды. Повышении температуры до 42 °С приводит к увеличению на порядок числа копий плазмиды и активации промотора. В результате в клетке происходит сверхсинтез белкового продукта. Его выход может составлять около 20 % от общего количества белка.

 Глава 5. Генная инженерия прокариот Увеличить количество копий гена в клетке можно не только за счет увеличения копийности плазмид, но и в результате встраивания в состав вектора нескольких копий генов. Очевидно, увеличение числа генов в клетке обычно сопровождается усилением экспрессии генов и повыше нием синтеза чужеродного белка.

Эффективность экспрессии чужеродных генов зависит не только от силы промотора и числа копий гена в клетке, но и от первичной структуры участка связывания с рибосомой (последовательность Шайна-Дальгарно), расположенной перед инициирующим кодоном в иРНК.

Этот участок закодирован в составе вектора и находится сразу же за промотором. Последовательность Шайна Дальгарно состоит из 6 – 8 нуклеотидов, которые спарива ются с комплементарной последовательностью рРНК малой субъединицы рибосомы. Прочность связывания между мРНК и рРНК определяет эффективность трансляции. Чем прочнее связывание между иРНК и рРНК, тем эффективнее трансляция. Кроме того, для успешной трансляции необ ходимо, чтобы инициирующий кодон находился на опре деленном расстоянии от последовательности Шайна Дальгарно.

Экспрессию генов в прокариотических клетках можно оптимизировать с помощью подбора при их синтезе таких кодонов, которые наиболее эффективно транслируются. Одна и та же аминокислота в силу вырожденности кода может быть закодирована разными кодонами, которые прочитываются соответственно разными тРНК. Концентрации последних в клетках прокариот могут значительно отличаться. Если в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в клетке в больших концентрациях, то в этом случае синтез белка будет осуществляться эффективно.

Если же в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в низких концентрациях, то синтез белка будет осуществляться не эффективно. Т.е. кон центрация тРНК может определять скорость синтеза белка.

Чужеродные белки в прокариотических клетках могут подвергаться деградации. В этом случае получить их  Прикладная молекулярная биология в ощутимых количествах не удается. Решить эту проблему можно путем интеграции чужеродного гена в экспрес сирующийся ген вектора. Тогда будет синтезироваться гибридный белок, содержащий полипептидные фрагменты чужеродного (маркерного) и бактериального белков (рис. 5.2).

Такие гибридные белки устойчивы в бактериальных клетках.

При интеграции чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора существует опасность попадания не в рамку считывания. Синтезированный белок с такой ДНК не будет иметь ничего общего с чужеродным белком. В связи с этим при встраивании чужеродного гена необходимо убедиться, чтобы он попал в рамку считывания.

Рис. 5.2. Интеграция чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора обуславливает синтез гибридного белка Гибридные белки часто не обладают биологической активностью чужеродных белков, поэтому существует необходимость выщепления последних из гибридных белков.

Эту проблему можно разрешить, если к белку клетки-хозяина присоединить короткий пептид, узнаваемой протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение программируется на уровне ДНК. После синтеза и очистки гибридного белка фрагмент белка клетки-хозяина и пептид отделяется с помощью специфической протеазы (рис. 5.3).

Так можно выщепить чужеродный белок из гибридного.

 Глава 5. Генная инженерия прокариот Рис. 5.3. Схема, иллюстрирующая кодирование гибридного белка, экспрессию сконструированной генетической конструкции с последующим выщеплением чужеродного белка с помощью специфической протеазы В некоторых случаях гибридные белки сохраняют актив ность чужеродного белка. Тогда возможно их использование без удаления маркерного пептида.

В процессе роста популяции часть клеток может утра тить рекомбинантную плазмиду. Бесплазмидные клетки, как правило, растут быстрее и постепенно вытесняют клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. Через какое-то время количество продукта клонированного гена в культуре постепенно снижается. И в конечном итоге он вообще перестает синтезироваться. Для решения проблемы утраты рекомбинантной плазмиды в вектор можно встроить ген устойчивости к антибиотику, и выращивать бактерии в среде с антибиотиком. Тогда рекомбинантная плазмида в культуре клеток будет сохраняться. В то время как клетки, утратившие ее, погибнут из-за наличия антибиотика в среде.

Использование антибиотиков в промышленных условиях  Прикладная молекулярная биология сильно увеличивает стоимость конечного продукта. С целью удешевления используют другие селективные среды, на которых бактерии без рекомбинантной плазмиды расти не могут, или встраивают ген в хромосому. Интеграция чужеродного гена в хромосому бактериальной клетки позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты клони рованных генов. Для интеграции в хромосому вводимый чужеродный ген должен иметь полинуклеотидную последовательность (приблизительно 50 нуклеотидов) сходную с полинуклеотидной последовательностью участ ка хромосомы, в пределах которого планируется его встраивание. Интеграция гена в хромосому осуществляется в результате гомологичной рекомбинации. После встраива ния чужеродного гена трансформированные клетки отбирают и далее используют.

Можно добиться секреции чужеродных белков бактериальными клетками в окружающую среду. Секре тируемые белки часто оказываются более стабильными, чем не секретируемые. Кроме того, для выделения и очистки чужеродных белков не нужно разрушать клетки, что значительно упрощает эти процедуры. Для получения секретируемых белков нужно присоединить к чужеродному гену участок ДНК, кодирующий сигнальную последовательность. Эта последовательность обеспечивает секрецию белков. В процессе секреции белков сигнальная последовательность отщепляется, а чужеродный белок выходит из клетки. Следует отметить, что наличие сигнальной последовательности не всегда определяет эффективную секрецию чужеродных белков. Особенно сложно добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями, к ним относится и E.coli. Грамотрицатель ные бактерии окружены двумя мембранами: внутренней и внешней. Между ними находится периплазматическое пространство, заполненное периплазмой. Для получения секретируемого интерлейкина-2 поступили следующим образом. Ген интерлейкина-2 соединили с геном пол норазмерного предшественника мальтозосвязывающего белка, содержащего сигнальную последовательность.

 Глава 5. Генная инженерия прокариот Между этими генами поместили сегмент ДНК, кодирую щий сайт узнавания для протеазы Ха. Такой химерный ген интегрировали в вектор. Затем им трансформировали E.coli.

В периплазме трансформированных клеток был выявлен химерный белок. После его обработки специфической протеазой был получен функционально активный интер лейкин-2.

Интересен еще один подход, позволяющий добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями. Известно, что белок грамотрицательных бак терий – бактериоцин – активирует локализованную во внутренней мембране фосфолипазу А. В результат такой активации наружная и внутренняя мембраны становятся более проницаемы для белков. Если ген бактериоцина встроить в вектор и им трансформировать клетки E.coli, то мембраны последних станут более проницаемыми. Можно также в состав того же самого (или другого вектора) ввести ген чужеродного белка с присоединенной нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид.

Бактерии, содержащие активно транскрибирующие гены бактериоцина и чужеродного белка, будут секретировать последний в окружающую среду.

Наличие в клетке чужеродных генов и их экспрессия часто приводят к метаболической перегрузке и ухудшению роста клеточной культуры. Что в конечном итоге может привести к снижению выхода чужеродного белка. В случае метаболической перегрузки возрастает вероятность тран сляционных ошибок, что может сказаться на качестве белка. Метаболическую перегрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмиды или встроить чуже родные гены в хромосому. Уменьшить метаболическую перегрузку можно и используя регулируемые промоторы.

В этом случае во время роста клеточной культуры промотор находится в выключенном состоянии. После наращивания клеточной массы промотор включается в результате воз действия какого-либо фактора.

Таким образом, процесс получения генетически модифицированных бактерий, обладающих полезными  Прикладная молекулярная биология характеристиками, является сложнейшей процедурой, тре бующей огромных затрат интеллектуального труда.

Практическое применение генетически модифицированных бактерий Генетически модифицированные бактерии находят широкое применение во многих областях деятельности человека. Их используют для получения лекарственных препаратов, создания вакцин, для синтеза витаминов, аминокислот, антибиотиков и многих других веществ. Они оказывают неоценимую услугу при деградации токсических соединений и утилизации биомассы, в сельском хозяйстве.

Генетически модифицированные бактерии на службе медицины Лекарственные препараты В настоящее время с помощью ДНК-технологий удается получать лекарственные препараты на основе белков человека в ощутимых количествах, достаточных для полного удовлетворения в их потребности. В то время как до эры ДНК-технологий были серьезные ограничения при лечении некоторых заболеваний человека, связанные с недостатком такого рода лекарств. В настоящее время клонировано сотни генов белков человека, которые потенциально могут быть использованы в медицине. Для десятков белков уже получено одобрение на их применение в качестве ле карственных препаратов (таблица 5.1). Надо отметить, что прежде чем какой-либо белок будет использован для лечения человека, он подвергается тщательной проверке.

Вначале проводят ее на животных, и только потом осуществляются продолжительные клинические испытания.


Пройдет не один год с тех пор, как белок, полученный с помощью генетически модифицированных бактерий, после интенсивных исследований будет использован для лечения человека.

Глава 5. Генная инженерия прокариот Таблица 5. Белки, разрешенные для использования в качестве лекарственных препаратов для лечения человека Белок Заболевание Инсулин Сахарный диабет Гормон роста Дефицит гормона роста у детей Антигемофильный фактор Гемофилия А Интерлейкин-2 Рак почки Интерферон a2a Волосистая лейкоплакия, саркома Капоши Интерферон a2b Волосистая лейкоплакия, саркома Капоши, остроконечная кондилома, гепатиты В и С Интерферон 1b Рецидивирующий рассеянный склероз Интерферон 1b Хронический гранулематоз Тканевой активатор плазминогена Острый инфаркт миокарда, острая обширная эмболия легочной артерии Глюкоцереброзидаза Болезнь Гоше ДНКаза 1 Муковисцидоз Эритропоэтин Анемия, заболевание почек Рассмотрим в качестве примера биотехнологические способы получения инсулина и гормона роста.

Инсулин Инсулин является гормоном поджелудочной же лезы. Он регулирует углеводный обмен и поддерживает нормальный уровень глюкозы в крови. Его недостаток в организме приводит к тяжелому заболеванию сахарному диабету, который является широко распространенным недугом и как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. В настоящее время более 100 млн. человек болеют диабетом.

Простое введение инсулина в организм человека позволяет Прикладная молекулярная биология нивелировать данное заболевание. В связи с широкой распространенностью сахарного диабета, существует необхо димость в получении инсулина в больших количествах. Эту проблему позволяет решить биотехнологический синтез гормона.

Молекула инсулина образована 51 аминокислотным остатком и состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.

Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, цепь В – остатков. Синтезируется он в клетках островков Лангерганса в виде одноцепочечного предшественника препроинсулина.

В процессе созревания (рис. 5.4) вначале отщепляется N-кон цевой сигнальный пептид (24 аминокислотных остатка) и образуется проинсулин (86 остатков), в котором А- и В-цепи соединены С-пептидом. Затем происходит удаление С-пеп тида, в результате проинсулин превращается в инсулин.

Рис. 5.4. Процессинг инсулина Глава 5. Генная инженерия прокариот Инсулин является первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием генетически модифицированных бактерий. Существует две основные стратегии для получения инсулина человека с помощью ДНК-технологий. В соответствии с первой стратегией в различные штаммы-продуценты вводятся по отдельности последовательности ДНК, кодирующие соответственно А- и В-цепи инсулина. В результате одни продуценты синтезируют только А-цепи, другие – В-цепи. Далее синтезированные А- и В-цепи выделяют и из них собирают функционально активный гормон. При этом между цепями также как и в природном гормоне формируются дисульфидные мостики.

Согласно второй стратегии с помощью генетически моди фицированных бактерий получают проинсулин (рис. 5.5), из которого с помощью протеаз вычленяют инсулин.

Более предпочтительной является вторая стратегия, обес 0печивающая более эффективный синтез гормона.

При использовании обеих стратегий возможно как индивидуальное получение исходных полипептидов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков.

При использовании определенных подходов из гибридного белка вырезают инсулин (рис. 5.5). В составе гибридных белков могут содержаться также последовательности, обеспечивающие его транспорт в периплазматическое про странство клетки или культуральную среду.

10 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.5. Схема получения инсулина согласно второй стратегии.

Амп – ген устойчивости к ампицилину. -гал – ген -галоктазидазы 10 Глава 5. Генная инженерия прокариот Гормон роста (соматотропин) Гормон роста синтезируется клетками гипофиза в виде предшественника с относительной молекулярной массой 28 000. В процессе созревания от предшественника отщепляются полипептидные последовательности. Гор мон роста состоит из 191 аминокислотного остатка и имеет относительную молекулярную массу около 22 000.

Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости, которое встречается с частотой 1 случай на 5 000 человек. Поскольку гормон обладает видовой специфичностью, указанное заболевание можно лечить, используя лишь человеческий гормон. Раньше его полу чали из гипофиза трупов. Гормона хватало лишь для лечения трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Больному требуется для лечения в течение года гормон роста в количестве, полученном из гипофизов 60 умерших.

В настоящее время гормон роста синтезируют с помощью ДНК-технологий. Одна из многочисленных схем получения гормона роста с помощью ДНК-технологий представлена на рис. 5.6. На первом этапе из клеток гипо физа выделяли мРНК предшественника гормона. Далее, используя метод обратной транскрипции, синтезировали кДНК, из которой на следующем этапе удаляли область, кодирующую сигнальный пептид. Полученный ген, ко дирующий полипептидную последовательность гормона, интегрировали в вектор, так чтобы перед геном находились промотор и последовательность Шайна-Дальгарно. Затем рекомбинантным вектором трансформировали клетки E.coli. Трансформированные клетки осуществляли синтез гормона роста. Так с помощью методов генетической инженерии удалось получить гормон роста.

10 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.6. Схема получения гормона роста человека с помощью ДНК технологий Рекомбинантные вакцины Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения вакцин. Последние применяются для формирования иммунитета к патогенным микроорганизмам. В ответ на введение вакцины в организме вырабатываются антитела к патогенным микроорганизмам, которые впоследствии защищают его (организм) от инфекционного заболевания, обеспечивая обезврежи вание патогенных микроорганизмов. С появлением вакцин многие инфекционные заболевания удалось взять под контроль и многократно снизить число заболевших. В настоящее время большинство вакцин создаются на основе либо инактивированных, либо невирулентных штаммов.

10 Глава 5. Генная инженерия прокариот Существуют еще так называемые химические вакцины.

Они представляют собой извлеченные из микроорганизмов отдельные компоненты, которые и определяют иммуноген ные свойства микроорганизма.

Несмотря на огромное значение вакцин в подавлении инфекционных заболеваний, их использование сдержи вается некоторыми ограничениями:

• при нарушении технологического процесса в вакци ны могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, которые способны вызвать тяжелые заболевания и привести к распространению инфекции;

• невирулентные штаммы могут ревертировать к ис ходному штамму;

• не все патогенные микроорганизмы удается куль тивировать, поэтому для заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, вакцины не созданы;

• для некоторых заболеваний нельзя создавать тради ционные вакцины (СПИД).

С помощью ДНК-технологий можно получить новое поколение вакцин. Для достижения этой цели используют методы генной инженерии. Существует разные подходы для получения таких вакцин:

• из генома патогенного микроорганизма удаляется ген, ответственный за вирулентность. Такой микроорганизм можно использовать в качестве живой вакцины, потому что он не вызывает заболевание, но сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Кроме того он не может ревертировать к исходному штамму, потому что у него удален целый ген, определяющий заболевание;

•можно создать непатогенные системы, обес печивающие перенос отдельных антигенных детерминант какого-либо патогенного микроорганизма. Такие системы могут обеспечить развитие иммунного ответа на патоген ный микроорганизм, при этом являться безопасными;

• можно поступить и следующим образом: выделить ген, кодирующий белок патогенного микроорганизма. Кло нировать его (ген) в альтернативном хозяине (например, в E.coli) и добиться его экспрессии с образованием 10 Прикладная молекулярная биология микроорганизменного белка. Последний после выделения и очистки можно использовать в качестве вакцины. В этом случае необходимо работать с генами белков, определяющих антигенные свойства микроорганизма. Только такие белки могут вызвать стойкий иммунитет. Такие вакцины безопасны, поскольку в них отсутствуют дополнительные белки и НК, которые могли бы являться причиной нежелательных побочных явлений у вакцинируемых.

• в качестве вакцин перспективны пептидные вак цины. Определенные домены белковой молекулы могут выступать в качестве антигенной детерминанты и вызы вать образование антител. В связи с этим возможно вакцинирование не полномерной молекулой белка, а лишь ее частью – доменом. Выработанные на него антитела будут обезвреживать патогенный микроорганизм, домен белка которого был использован в качестве вакцины. При получении пептидных вакцин с помощью ДНК-технологий клонируется не целый ген, а лишь последовательности ДНК, кодирующие его домен. Очевидна безопасность таких вакцин и их перспективность.

Роль генетически модифицированных бактерий при создании диагностических средств в медицине Важную роль генетически модифицированные бак терии играют при создании диагностических средств в ме дицине. Широкое применение для выявления возбудителей инфекционных заболеваний имеет так называемый иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. en zyme-linked immunosorbent assay, ELISA). О наличии того или иного возбудителя в организме человека можно судить по наличию антител в крови к этому возбудителю, потому что после проникновения патогенного микроорганизма в организм человека его иммунная система вырабатывает антитела, специфичные к данному возбудителю. В случае наличия антител можно говорить об инфицировании человека соответствующим микроорганизмом.


10 Глава 5. Генная инженерия прокариот В основе метода ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Существует несколько способов постановки ИФА. Рассмотрим наиболее часто используемый подход для выявления специфических антител в крови, включающий следующие этапы (рис. 5.7).

• Антиген возбудителя фиксируется на твердой под ложке, обычно в лунке тест-планшета.

•В лунку добавляется тестируемая сыворотка или плазма крови. При наличии в них специфических антител (первых антител) к антигену возбудителя происходит их связывание с образованием двойного комплекса «антиген – первое антитело». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал.

• В лунку добавляют вторые антитела, к которым присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Вторые антитела специфичны к первым. Происходит образование тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело-фермент». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал.

•В лунку добавляют неокрашенный субстрат. При нали чии тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело – фермент» происходит превращение неокрашен ного субстрата в окрашенный продукт.

• Осуществляют качественное или количественное определение продукта реакции. Количество окрашенного продукта пропорционально количеству антител к антигену возбудителя. Чем выше концентрация антител в крови, тем будет большим образование продукта.

При отсутствии антител в исследуемой сыворотке или плазме двойной и тем более тройной комплексы образовываться не будут. Следовательно, окрашенный продукт в лунке не будет образовываться. Так по наличию или отсутствию окраски можно судить о присутствии или отсутствии в крови антител к возбудителю. И в конечном итоге о присутствии или наличии возбудителя в организме человека.

10 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.7. Принципиальная схема ИФА. АГ – антиген, АТ 1 – первые антитела, АТ 2 – вторые антитела, ЩФ – щелочная фосфатаза В качестве антигенов при ИФА могут быть использованы нативные антигены, полученные при раз рушении возбудителя инфекции, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом, и являющиеся белками-аналогами определенных антигенов возбудителя, и химически синтезированные фрагменты белков возбуди теля. В настоящее время в качестве антигена все больше и больше используются рекомбинантные белки, потому что технология их получения позволяет их синтезировать в чистом виде и достаточном количестве. Специфичность некоторых рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

С помощью ИФА осуществляется диагностика раз личных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

С помощью генетически модифицированных бак терий также получают ДНК-зонды, используемые в ДНК диагностике. С целью получения зонда, специфичного Глава 5. Генная инженерия прокариот к ДНК какого-либо возбудителя поступают следующим образом. ДНК патогенного микроорганизма с помощью рестриктазы расщепляют на фрагменты. Фрагменты вводят в вектор, которым трансформируют бактериальные клетки.

Затем бактерии, содержащие рекомбинантный вектор, размножают. С увеличением числа клеток увеличивается также число молекул рекомбинантного вектора, а сле довательно, и число фрагментов ДНК патогенных бактерий.

Далее из бактериальных клеток выделяют рекомбинантный вектор и из него с помощью той рестриктазы, которая использовалась для фрагментации ДНК, вырезают фрагмент ДНК патогенного микроорганизма, который в последствие используют в качестве зонда.

Использование генетически модифицированных бактерий для получения продуктов немедицинского назначения Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения продуктов немедицинского назначения. С их помощью могут быть синтезированы продукты как белкового происхождения, так и небелкового (витамины, аминокислоты, красители, антибиотики и т.д.).

С целью получение рекомбинантных ДНК ис следователи в своей работе применяют сотни различных рестриктаз. Многие из них синтезируют с помощью ДНК технологий. Однако такой способ получения рестриктаз сталкивается с определенными проблемами. Введение гена рестриктазы в составе рекомбинантного вектора в бактерию может оказаться губительным для нее, потому что в ее геномной молекуле ДНК будут присутствовать сайты ре стрикции, узнаваемые рестриктазой, экспрессирующейся с чужеродного гена. Тогда хозяйская ДНК будет расщеплять ся ею. Одним из подходов, позволяющих защитить бак териальную ДНК от деградации рестриктазой, является введение в бактериальную клетку гена гомологичной Прикладная молекулярная биология метилазы – фермента метилирующего ДНК в области сайтов рестрикции. Метилированная ДНК не расщепляется рестриктазой. Таким образом, наличие соответствующего гена метилазы защитит клетку.

Аминокислоты имеют широкое применение в различных отраслях промышленности. Они используются в качестве усилителей вкуса и аромата, пищевых и кормовых добавок, в медицине, в химической промышленности при синтезе полимеров и т.д. В промышленности, главным образом, аминокислоты получают из белковых гидролизатов или как продукты метаболизма Corynebacterium или Brevibac terium. С целью повышения продуктивности этих бактерий, целесообразно введение в них модифицированных генов ферментов биосинтеза аминокислот. Направленная моди фикация генов может обеспечить повышенный синтез соответственной аминокислоты.

Широкое применение в фармацевтической, пере рабатывающей и пищевой промышленности имеют биополимеры. Некоторые из них получают с помощью микроорганизмов. С использованием ДНК-технологий существует возможность создания генетически модифи цированных бактерий, продуцирующих биополимеры с улучшенными характеристиками и в больших количествах.

Бактерия Xanthomonas campestris продуцирует био полимер ксантановую слизь (полисахарид). Ее можно использовать в качестве стабилизирующего, загущающего, эмульгирующего или суспендирующего вещества. С целью удешевления производства ксантановой слизи бактерии целе сообразно выращивать на дешевой питательной среде – молочной сыворотке – побочном продукте, образующемся при производстве сыра и содержащем лактозу. Однако X. campestris не могут в качестве источника углерода эффективно использовать этот дисахарид. Проблему можно разрешить, если в бактериальные клетки ввести в составе рекомбинантного вектора гены ферментов, участвующих в метаболизме лактозы, -галактозидазы и Глава 5. Генная инженерия прокариот лактозопермиазы. Таким образом трансформированные бактерии приобретают способность расти на сыворотке и продуцировать ксантановую слизь в больших количествах.

Еще один полимер, значение которого трудно переоценить, это каучук, также может быть получен с помощью трансгенных бактерий. Его биосинтез включает 17 ферментативных стадий. В связи с этим очевидно, какую сложную задачу нужно решить, чтобы получить микроорганизмы, продуцирующие этот полимер.

Можно создать с помощью ДНК-технологий мик роорганизмы, синтезирующие другие полимеры и низкомолекулярные вещества (витамины, антибиотики).

Для достижения этой цели в микроорганизмы необходимо ввести все или часть генов ферментов, ответственных за синтез вещества, которое исследователь хочет получить с помощью трансгенного микроорганизма.

Биодеградация токсических веществ с помощью генетически модифицированных бактерий Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных токсических веществ.

Например, бактерии рода Pseudomonas содержат плазмиды, кодирующие ферменты, разрушающие ароматические и галогенсодержащие органические соединения. Природную способность таких бактерий можно усилить, используя приемы генной инженерии. Так Чакрабарти и его сотрудники создали бактериальный штамм, расщепляющий большинство углеводородов нефти, и получивший название «супербациллы». Штамм был получен благодаря манипуляциям с плазмидами, кодирующими ферменты деградации определенных углеводородов. Результатом таких манипуляций явилось объединение нескольких плазмид в одной клетке. Созданный штамм растет на нефти лучше, чем исходные штаммы, послужившие донорами плазмид.

11 Прикладная молекулярная биология Большинство бактерий, разрушающих токсические вещества, хорошо растут при температуре 20 – 40 °С. В природ ных условиях обезвреживание токсических веществ прихо дится осуществлять при более низких температурах – 0 – 20°С.

С целью создания бактерий, способных расти при низких температурах, плазмиду TOL, ответственную за разрушение толуола мезофильного (хорошо растущего при средних температурах) штамма Pseudomonas putida, перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (хорошо растущий при низких температурах) штамм. Трансформированный штамм обладал способностью утилизировать толуол при низкой температуре.

Усилить природную способность микроорганизмов к деградации токсических веществ можно также в результате модификации генов, кодирующих ферменты какого-либо метаболического пути.

11 Глава 6. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ Не всегда удается в прокариотических клетках получить рекомбинантные эукариотические белки, обладающие биологической активностью. В связи с этим были разработаны эукариотические системы эксп-рессии чужеродных генов. В качестве эукариотических систем синтеза чужеродных белков используются дрожжи и культуры клеток животных. Отсутствие биологической активности эукариотических белков, синтезированных в клетках прокариот, определяется отсутствием у них систем, обеспечивающих посттрансляционные модификации белков (гликозилирование, образование дисульфидных мостиков, ограниченный протеолиз, фосфорилирование, ацетилирование и др.). К эукариотическим векторам предъявляются следующие требования. Они должны иметь эукариотический селективный маркер, эукариотический промотор, эукариотические сайты терминации транс ляции и транскрипции, сигнал полиаденилирования иРНК.

В качестве векторов могут быть использованы плаз миды. Они должны нести сайт инициации репликации, функционирующей в эукариотической клетке. Вектор может быть также предназначен для встраивания в ге номную ДНК эукариот. В этом случае он должен иметь нуклеотидную последовательность, гомологичную тако вой участку ДНК, в который планируется встраивание вектора. Интеграция вектора в геном будет происходить по механизму гомологичной рекомбинации. Часто используют челночные векторы, способные существовать как в клетках прокариот, так и в клетках эукариот (рис. 6.1).

11 Прикладная молекулярная биология Рис. 6.1. Схема организации челночного вектора. ГУА – ген устойчивости к антибиотику (селективный маркер E.coli), ori Euk – эукариотический сайт инициации репликации, ori E.coli – сайт инициации репликации E.coli Для введения вектора в клетки эукариот используют различные подходы. При трансформации дрожжей в одних случаях векторную ДНК добавляют к их протопластам – клеткам, у которых удалена клеточная стенка химическим или ферментативным способом. В других случаях клетки дрожжей предварительно (перед добавлением экзогенной ДНК) обрабатывают ацетатом лития или используют метод электропорации. В клеточные культуры животных введение чужеродной ДНК осуществляют посредством инкубации клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕ-АЕ-декстраном, а также с помощью электропорации.

Для доставки ДНК в эукариотические клетки могут быть также использованы вирусы.

Генная инженерия дрожжей Широко используются в генной инженерии обычные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это обусловлено рядом причин:

• они хорошо изучены;

•содержат 2 мкм-плазмиды, которые можно исполь зовать для создания экспрессирующихся векторов;

• в клетках дрожжей осуществляются различные пост трансляционные модификации.

Некоторые белки, полученные с помощью трансгенных дрожжей, нашли практическое применение.

11 Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В качестве вакцин используются поверхностный антиген вируса гепатита В, белок малярийного плазмодия, белок HIV-1. Как лекарственные препараты применяются инсулин, тромбоцитарный фактор роста, фактор XIIIа системы свертываемости крови, a1-антитрипсин, коло ниестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов и др. В молекулярной диагностики используются белок виру са гепатита С и антигены HIV-1.

В генной инженерии дрожжей для доставки чуже родной ДНК используют плазмидные векторы, векторы, интегрирующие в геномную ДНК, и искусственные дрожжевые хромосомы (YAC). Последние применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (порядка 100 т.п.н.). YAC-вектор содержит сайт инициации реп ликации, центромерную область и теломеры, может нести селективный маркер.

В клетках дрожжей удаление интронов происходит не эффективно, в связи с этим при клонировании генов целесообразно использовать кДНК или химически синтезированные гены.

Чужеродные белки, синтезируемые в клетках дрожжей, могут аккумулироваться в них или секретироваться в окружающую среду. Гликозилированию в дрожжевых клетках подвергаются только секретируемые белки. С це лью получения секретируемых белков перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей чужеродный белок, нужно расположить нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность. Последняя способна обеспечить транспорт рекомбинантного белка через клеточную мембрану. В процессе транспорта через мембрану в молекуле белка образуются дисульфидные связи, осуществляются другие посттрансляционные модификации, а также отщепляется сигнальная последовательность.

Кроме Saccharomyces cerevisiae могут использоваться и другие дрожжевые системы экспрессии чужеродных генов.

Так, в генной инженерии нашли применение дрожжи Kluyveromes lactis, Schizosaccharomyces pombe и др.

11 Прикладная молекулярная биология Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток насекомых В клетках насекомых могут развиваться бакуловирусы.

Они способны существовать в двух формах. Первая форма представлена отдельными вирионами, вторая – множеством вирионов, объединенных белковым матриксом. Матрикс образован белком полиэдрином. Сразу после инфекции формируются отдельные вирионы, которые, высвобождаясь из инфицированных клеток, заражают другие клетки насекомого. По прошествии определенного времени начинается синтез полиэдрина. После лизиса клеток вирионы высвобождаются и оказываются заключенными в белковый матрикс, защищающий их от гибели. Если другое насекомое поглотит такую частицу, то после солюбилизации полиэдрина высвободившиеся вирионы способны начать новый цикл инфекции.

Ген полиэдрина находится под контролем чрез вычайно сильного промотора. При этом цикл развития бакуловирусов не зависит от присутствия в его геноме гена полиэдрина. В связи с этим инфицирование куль туры клеток насекомого рекомбинантным вирусом, в геноме которого ген полиэдрина заменен чужеродным эукариотическим геном, может привести к синтезу боль шого количества рекомбинантного белка. Поскольку системы посттрансляционных модификаций насекомых и млекопитающих сходны, то рекомбинантный белок, синтезированный в клетках насекомых, может оказаться по своей организации близким или идентичным природному белку, образующемуся в естественных условиях. Опираясь на вышеизложенную стратегию, в настоящее время на основе бакуловирусов разработаны векторы для экспрес сии генов млекопитающих. При использовании векторов, созданных на основе бакуловирусов, получены сотни различных белков, более 95 % из которых имели правиль ные посттрансляционные модификации.

11 Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В генной инженерии нашел широкое применение вирус множественного ядерного полиэдроза Autogra pha californica (AcMNPV). Одна из стратегий создания рекомбинантного AcMNPV следующая. Вначале на основе плазмиды E.coli создается так называемый транспортный вектор. В составе транспортного вектора (рис. 6.2) содер жатся промотор бакуловируса, сайт клонирования, в который встраивается чужеродный ген, сайт терминации полиаденилирования, обеспечивающий терминацию транс крипции и полиаденилирование иРНК. Перед промотором и за сайтом терминации-полиаденилирования встраивают фрагменты ДНК бакуловируса AcMNPV, прилегающие к гену полиэдрина. На следующем этапе в сайт клонирова ния транспортного вектора встраивают чужеродный ген (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Схема организации транспортного вектора и встраивания в него чужеродного гена 11 Прикладная молекулярная биология Транспортный вектор с чужеродным геном используют для введения последнего в состав ДНК бакуловируса (рис. 6.3).

Между ДНК AcMNPV и транспортным вектором возможна гомологичная рекомбинация, поскольку их молекулы имеют гомологичные последовательности нуклеоти дов. В результате такой рекомбинации ген полиэдрина замещается чужеродным геном. При этом рекомбинантный вирус приобретает способность обеспечивать синтез чуже родного белка и в то же время становится не способным продуцировать полиэдрин.

Рис. 6.3. В результате гомологичной рекомбинации между транспортным вектором и AcMNPV ген полиэдрина замещается чужеродным геном В настоящее время разработаны и другие методики получения рекомбинантных бакуловирусов. Созданы чел ночные векторы, позволяющие осуществлять все манипу ляции с генами в клетках Е.coli, а синтез белка проводить в клетках насекомых.

Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток млекопитающих В настоящее время созданы внехромосомные векторы млекопитающих. Основное их назначение: полу чение рекомбинантных белков в медицинских целях и использование для исследования функций и регуляции генов млекопитающих. По своей организации они сходны с дру гими экспрессирующимися эукариотическими векторами (рис. 6.1). Они могут быть челночными и содержать два сайта инициации репликации, один из которых ответственен за репликацию вектора в клетках прокариот, другой – эукариот, два селективных маркера (прокариотический и эукариотический), полилинкер, в состав которого встраи вается чужеродный ген, эукариотический промотор и сайт терминации-полиаденилирования. В качестве регуляторных последовательностей эукариотических генов (промоторы, сайт терминации-полиаденилирования) обычно применяют таковые млекопитающих или вирусов животных. При этом предпочтительнее используются сильные промо торы и эффективные сигналы полиаденилирования.

В качестве селективного прокариотического маркера часто используются гены устойчивости к антибиотикам.

В качестве эукариотических селективных маркеров могут использоваться различные гены, например, гены неомицинфосфотрансферазы (НФТ), глутаминсинтетазы (ГС), дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и др.

НФТ способна фосфорилировать токсичное вещество генетицин, которое в результате этой процедуры теряет свою токсичность. В связи с этим клетки, продуцирующие НФТ, способны расти в среде, содержащий генетицин, в то время как клетки, не синтезирующие этот фермент, гибнут в присутствии данного токсина. Эту особенность можно использовать для отбора клеток, содержащих реком бинантный вектор с селективным геном НФТ, от клеток, не содержащих соответствующий вектор.

Прикладная молекулярная биология Другой селективный маркер ген ГС обус лавливает устойчивость к токсическому действию метионинсульфоксимина. Используя способность клеток, содержащих этот маркерный ген в составе рекомбинантного вектора, выживать в среде с указанным токсином, можно их отделить от клеток, не содержащих рекомбинантную плазмиду.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.