авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. Резяпкин ...»

-- [ Страница 3 ] --

С помощью клеточных культур удалось получить разнообразные рекомбинантные белки. Синтезированы белки, состоящие из нескольких субъединиц. Для того чтобы клетки животных культур продуцировали белки, образованные двумя полипептидными цепями, необходимо в них ввести два вектора, которые содержали по одному гену каждой полипептидной цепи или один вектор, в составе которого представлены оба гена. Второй вариант предпочтительнее, потому что в этом случае легче достичь образования полипептидных цепей в одинаковых количествах.

Глава 7. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ Одной из важнейших особенностей растительной клетки является ее тотипотентность, благодаря которой из соматической клетки возможна регенерация фертильного растения. Поэтому, трансформировав одну отдельную клетку, можно из нее получить трансгенное растение, которое далее может размножаться и передавать трансген своим потомкам. Введение новых генов в геном растений осуществляют с различными целями:

• для улучшения сельскохозяйственных или декора тивных характеристик культурных растений;

• для получения чужеродных белков или других важных веществ;

• для научных исследований.

Первое в мире трансгенное растение санбин было получено Д.Кемпом и Т.Холлом в 1983 г в результате пере носа гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника. К настоящему моменту времени получены тысячи различных трансгенных растений. Некоторыми из них засеяны сотни миллионов гектаров.

Для конструирования трансгенного растения нужно:

• выделить или синтезировать ген;

• разработать методы введения гена в клетки растения;

• регенерировать из единичных клеток растение с из мененным генотипом.

Весьма сложной задачей является поиск генов, позволяющих придать растению какой-либо полезный признак. Например, устойчивость к гербицидам, насекомым, болезням и др. Обнаружив такие гены, необходимо получить их в достаточном количестве. Подробнее способы получения генов рассмотрены в теме «Получение генов». На следующем этапе необходимо ввести ген в растительную клетку. С этой целью широко применяются векторы, созданные на основе Ti-плазмиды Agrobackteria tumefaciens (см. тему «Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений»). Наиболее простым вариантом создания ре комбинантного вектора на основе Ti-плазмиды является 12 Прикладная молекулярная биология встраивание чужеродного гена в состав Т-ДНК. Обработка клетками Agrobackteria tumefaciens, содержащими такую ре комбинантную плазмиду, растительных клеток приведет к встраиванию в растительный геном Т-ДНК и вместе с ней чужеродного гена. Однако такие векторы имеют ряд недостатков. В составе Т-ДНК в клеточный геном интегри руют наряду с чужеродным геном и гены, ответственные за синтез фитогормонов. Последние затрудняют регенерацию зрелых растений из трансформированных клеток. Кроме того, Ti-плазмиды имеют значительные размеры, что вно сит определенные неудобства при работе с ними.

При создании более эффективных векторов на основе Ti-плазмиды из нее удаляют гены фитогормонов и другие несущественные последовательности ДНК. С целью прида ния способности таким векторам реплицироваться в клетках E.coli, в их состав вводится сайт инициации репликации E.coli. Также в состав вектора вводятся селективные маркеры, позволяющие отобрать клетки, содержащие вектор, и в пределах Т-ДНК полилин кер, необходимый для встраивания чужеродных генов (рис. 7.1). Такие векторы способны существовать как в клетках E. coli, так и в клетках Agrobackteria tumefaciens.

Все операции по клонированию проводят в клетках E.coli, а затем вектор вводят в Agrobackteria tumefaciens.

Рис. 7.1. Схема организации вектора на основе Ti-плазмиды 12 Глава 7. Генная инженерия растений Рассмотренные выше векторы на основе Ti-плаз миды не содержат vir-область, поэтому не способны самостоятельно обеспечивать транспорт и интеграцию Т ДНК в растительный геном. Чтобы решить эту проблему, разработано два подхода. В первом случае рекомбинантный вектор вводят в клетки Agrobackteria tumefaciens, содержа щие модифицированную неонкогенную Ti-плазмиду, в которой сохранена vir-область, но удалена часть ее Т-ДНК, в результате последняя (Т-ДНК) не может быть транспорти рована и интегрирована в геном растения. Неонкогенная плазмида, обеспечивая синтез всех белков, необходимых для транспорта Т-ДНК, выступает в качестве помощника, способствуя интеграции Т-ДНК рекомбинантного вектора в геном растения. При использовании второго подхода после введение рекомбинантного вектора в клетки Agrobac kteria tumefaciens, содержащие неонкогенную Ti-плазмиду, происходит гомологичная рекомбинация, в результате которой обе плазмиды объединяются. Вновь образованная плазмида несет чужеродный ген. В то же время она способна обеспечить транспорт и интеграцию Т-ДНК, содержащую чужеродный ген, в растительный геном.

Перенос генов с использованием Agrobackteria tumefaciens эффективны в случае работы с двухдольными растениями.

Что касается однодольных растений, то использование этих бактерий для их трансформации ограничено. В связи с этим применяются и другие методы переноса генов в растительные клетки. Наиболее широко используется метод биобаллистической трансформации. Также применяются векторы на основе вирусов, методы электропорации, микро инъекции, слияния липосом. Попав в клетку, чужеродная ДНК может интегрировать в растительный геном.

Для идентификации и отбора трансформированных клеток необходимы маркерные гены. Их продуктами являют ся легко идентифицируемые белки. В трансформированных клетках в отличие от нетрансформированных будет присут ствовать маркерный ген, а следовательно, и синтезироваться легко тестируемый белок. Учитывая эту особенность можно отличить трансформированные клетки от нетранс формированных. В качестве маркеров используются, как отмечалось ранее, гены люциферазы и GFP-белка. Могут для 12 Прикладная молекулярная биология этой цели применяться гены ферментов. Наличие фермен тов легко выявить по их каталитической активности.

Перед чужеродным геном должен располагаться промотор, узнаваемый растительной РНК-полимеразой. В генной инженерии растений применяются конститутивные (постоянно функционирующие в клетке) или регулируемые (функционирующие на определенных стадиях развития растения, или в определенных тканях, или под действием некоторых факторов) промоторы. С целью усиления экспрессии чужеродных генов в вектор могут быть ин тегрированы энхансер, а также последовательности ДНК, кодирующие участки иРНК, обеспечивающие более эффективную трансляцию.

Чужеродные гены могут быть интегрированы в хлоропластную ДНК растений. С этой целью конструиру ется плазмидный вектор, содержащий чужеродный ген и селективный маркер, фланкированные нуклеотидными сегментами хлоропластной ДНК (рис. 7.2). Затем с использованием метода биобаллистической трансформации плазмидный вектор вводят в хлоропласты. Где посредством гомологичной рекомбинации между хлоропластной ДНК и сегментами хлоропластной ДНК плазмиды происходит интеграция чужеродного гена и селективного маркера в геном хлоропластов. Так чужеродный ген может быть включен в состав хлоропластной ДНК. Поскольку промото ры хлоропластных генов сходны с прокариотическими, но не с ядерными, перед чужеродным и маркерным генами необходимо поместить соответствующие нуклеотидные последовательности, обеспечивающие их транскрипцию.

Рис. 7.2. Схема организации плазмидного вектора, используемого для введения чужеродного гена в хлоропластную ДНК. ЧГ – чужеродный ген, СМ – селективный маркер, схДНК – сегменты хлоропластной ДНК 12 Глава 7. Генная инженерия растений Практическое применение трансгенных растений Если первое трансгенное растение было получено в 1983, то в продаже первые трансгенные продукты появились в 1994 г. Ими были гербицид-устойчивая соя и томаты Fla vr Savr с замедленным созреванием. В настоящее время на сельскохозяйственных полях выращиваются генетически модифицированные кукуруза, соя, томаты, хлопчатник, картофель, табак, рапс, кабачки, редис и др. Общая пло щадь, занимаемая трансгенными растениями, составляет более 100 млн. га. С каждым годом происходит увеличение площадей, засеваемых генетически модифицированными растениями. Распределение выращиваемых культур сле дующее: соя – около 52 %, кукуруза – около 30 %, хлопок – около 13 %, рапс – около 5 %.

Одни трансгенные растения содержат дополнитель ные гены, улучающие их качества (гены устойчивости к гербицидам, вредителям, болезням, неблагоприятным условиям окружающей среды и др.). Другие выступают в качестве «биореакторов», производящих вещества, используемые в различных отраслях народного хозяйства.

К таким веществам могут относиться белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, жирные кислоты, модифицированные полисахариды, вакцины, антитела, интерфероны и др.

Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам Гербициды в сельском хозяйстве применяются для борьбы с сорняками. Следует отметить, что гербициды способны подавлять рост не только сорных растений, но и культурных. Создание растений, устойчивых к гербицидам, позволяет решить проблему борьбы с сорняками. При обработке гербицидами посевов культур, устойчивых к ним (гербицидам), сорняки будут избирательно подавляться, а культурные растения будут нормально развиваться.

12 Прикладная молекулярная биология Устойчивость к гербицидам можно достичь за счет:

• снижения проникновения гербицида в растение;

• инактивации гербицида в растении;

• изменения структуры белка (или фермента), на который гербицид оказывает повреждающее действие.

В результате такого изменения белок (или фермент) оказывается полностью или в значительной степени не чувствительным к гербициду;

• усиленного синтеза белка (или фермента), чув ствительного к гербициду. В этом случае повышенное содержание белка (или фермента) нивелирует действие гербицида.

При создании растений, устойчивых к определенному гербициду, необходимо:

• идентифицировать мишень (белок или фермент), на которую воздействует гербицид;

•выявить организмы, устойчивые к гербициду;

•выделить ген из организмов, не чувствительных к гербициду, продукт которого определяет устойчивость к гербициду;

• создать вектор, содержащий ген, определяющий устойчивость к гербициду;

• ввести с помощью вектора в геном растения ген, определяющий устойчивость к гербициду.

В сельском хозяйстве нашел широкое применение гербицид глифосат. Он ингибирует фермент 5-енол пирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ЕПШФ), и тем самым подавляет синтез ароматических аминокислот. Гербицид воздействует только на растения, грибы и бакте-рии.

Кроме того, он быстро разрушается после попадания в почву. В связи с этим считается, он не опасен для человека.

Выявленные случаи устойчивости к глифосату связаны либо с повышением уровня синтеза ЕПШФ, либо с наличием в клетках растений мутантного фермента, нечувствительного к гербициду. Для создания трансгенных растений, устойчивых к этому гербициду, используют мутантные гены ЕПШФ.

С этой целью из организмов, устойчивых к глифосфату, 12 Глава 7. Генная инженерия растений выделяют ген, который используют для создания рекомбинантного вектора. С помощью рекомбинантного вектора в геном растения встраивают мутантный ген ЕПШФ, который и определяет у трансгенных растений устойчивость к глифосату. Трансгенные растения, устойчивые к глифосату, были получены также в результате сверхпродукции в их клетках фермента ЕПШФ или введения гена глифосфатокси доредуктазы, разрушающей гербицид.

Примером еще одного гербицида, устойчивость к которому достигается в результате его деградации, является бромоксинил. Бромоксинил подавляет фотосинтез. Устой чивость трансгенных растений к этому гербициду может быть достигнута в результате интеграции в их геном гена нитрилазы. Нитрилаза осуществляет разрушение бромоксинила.

Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям Бактерия Bacillus thuringiensis продуцирует протоксин (Bt-протеин), являющийся токсичным белком для насекомых, в то же время для млекопитающих он безопасен. Попав в пищеварительный тракт насекомого, молекула протоксина подвергается модификации (от нее отщепляется часть полипептидной цепи) и превращается в токсин. Токсин образует поры в клетках кишечника насекомых, что приводит к их лизису. Насекомое при этом погибает. В природе найдены различные штаммы В. thuringiensis. Интересно, что они синтезируют разные токсины, каждый из которых действует только на определенный вид насекомых.

Гены Bt-протеина были выделены из различных штаммов, в некоторых случаях они были существенно модифицированы, и использованы для создания трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Наиболее широко в сельском хозяйстве используются устойчивые к насекомым кукуруза и соя. При создании трансгенной кукурузы был использован промотор гена фосфоенол 12 Прикладная молекулярная биология пируваткарбоксилазы, обеспечивающий экспрессию генов Bt-протеина только в зеленых тканях растения.

Получен также устойчивый к колорадскому жуку картофель. При создании трансгенного картофеля перед ге ном Bt-протеина поместили фоточувствительный промотор малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбокси лазы, обеспечивающий синтез Bt-протеина на свету в более эффективно, чем в темноте. В связи с этим в клубнях картофеля содержание Bt-протеина приблизительно в раз меньше, чем в листьях.

Для получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, могут быть использованы гены ингибиторов амилаз и протеаз. Насекомые, поедающие трансгенные растения, продуцирующие такие ингибиторы, не способны переваривать пищу, потому что ингибиторы будут подавлять пищеварительные ферменты и тем самым препятствовать гидролизу крахмала и растительных белков.

Трансгенные растения, устойчивые к вирусам Вирусы, также как насекомые и сорняки, существенно снижают урожайность культурных растений. В связи с этим создание трансгенных растений, устойчивых к вирусам, позволяет сохранить значительную часть урожая.

Устойчивость растениям к вирусам можно придать за счет введения в их геном генов, кодирующих белки оболочки вируса или других вирусных генов, а также антисмысловых последовательностей генома вирусов.

Трансгенное растение, продуцирующие белок обо лочки какого-либо вируса, оказывается защищенным от этого вируса. Способность вируса инфицировать такие растения часто значительно ослаблена. Механизм защиты точно не установлен. Посредством введения генов белков оболочки вирусов получены многочисленные трансгенные растения, устойчивые к вирусам. Некоторые из них нашли промышленное применение.

1 Глава 7. Генная инженерия растений Для получения трансгенных растений, устойчивых к вирусам, могут быть использованы антисмысловые РНК.

Антисмысловая РНК комплементарна иРНК и способна с ней образовывать дуплекс, предотвращая тем самым трансля цию иРНК. В присутствии антисмысловой РНК синтез белка, закодированного в иРНК, подавляется. Если ввести в геном растений гены антисмысловых РНК, комплементарных к вирусным иРНК, то можно ожидать, что синтез вирусных белков ослабнет и, соответственно, развитие вирусов в клетках растений будет затруднено. Используя этот подход, можно защитить растения от вирусов.

Устойчивость растений к вирусам может быть также достигнута за счет введения в их геном генов про тивовирусных белков, синтезируемых растениями. Так, в клеточной стенке фитолакки американской присутствуют три противовирусных белка. Гены этих белков можно использовать для получения устойчивых к вирусам растений.

Трансгенные растения, устойчивые к патогенным грибам и бактериям Грибковые и бактериальные заболевания являются причиной существенных потерь урожая. С помощью методов генной инженерии возможно создание трансгенных растений, устойчивых к патогенным грибам и бактериям.

После проникновения патогенных организмов в клетки растений в них (растениях) образуются специфические белки, воздействующие на патогены. К таким белкам относятся хитиназа (разрушает хитин – основной компонент гри бов), -1,3-глюканаза (разрушает клеточную стенку грибов), тауматин (небольшой, сладкий на вкус белок, слаще сахарозы в 200 000 раз), ингибиторы протеаз.

Гены этих белков можно использовать для создания трансгенных растений. Так, введение генов хитиназы и -1,3-глюканазы в геном растений придает последним устойчивость к патогенным грибам.

1 Прикладная молекулярная биология Большой ущерб приносит урожаю картофеля бактерия Erwinia carotovora. С целью защиты картофеля в его геном был введен ген лизоцима (разрушает клеточную оболочку бактерий) бактериофага Т4. К гену был пришит промотор вируса мозаики цветной капусты, сигналы терминации и полиаденилирования и сигнальный пептид a-амилазы ячменя. Промотор обеспечивал транскрипцию, а сигнальный пептид – секрецию лизоцима в межклеточное пространство, в которое проникает патогенная бактерия.

Трансгенный картофель оказался устойчивым к Erwinia carotovora. Такой принцип создания трансгенных растений можно распространить и на другие объекты.

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям В процессе жизненного цикла растения подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высоких и низких температур, засухи, засоления почв и т.д. Некоторые из растений приспособились преодолевать их негативное воздействие, другие – нет. Неблагоприятные факторы могут существен но снизить урожайность сельскохозяйственных культур.

С использованием методов генной инженерии возможно повысить устойчивость у растений к стрессовым условиям.

Можно повысить устойчивость растений к пони женным температурам. Бактерии Pseudomonas syringae сосуществуют с растениями и способствуют повреждению растений заморозками. В клетках этого микроорганизма синтезируется белок, молекулы которого находятся во внешней мембране и являются центром кристаллизации льда. Формирование кристаллов льда является фактором, определяющим повреждение тканей растений. Известны мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезиро вать этот белок. Растения с такой микрофлорой оказались более устойчивыми к заморозкам.

Важно получить растения, устойчивые к засухам, поскольку они могут все усилия производителей свести 1 Глава 7. Генная инженерия растений на нет. Одним из веществ, способных защитить растения от засухи или при высокой засоленности, является бетаин.

Он способствует поглощению и удерживанию воды растением. В одних растениях это вещество синтезируется в ощутимых количествах, в тоже время некоторые важные культурные растения (картофель, томаты, рис) не способ ны его накапливать. Придать растениям устойчивость к засухе и высокой засоленности почв можно введением в их геном генов ферментов, синтезирующих бетаин. Последний синтезируется из холина в две стадии. Первую стадию у растений катализирует фермент холинмонооксигеназа, вторую – бетаинальдегиддегидрогеназа. У E.coli обе стадии синтеза бетаина катализирует один фермент холиндегидрогеназа. Очевидно, что при создании транс генных растений предпочтительнее использовать ген холиндегидрогеназы. Растения, в геном которых был перенесен ген холиндегидрогеназы, были более устойчивы к высоким концентрациям солей, чем нетрансгенные растения.

Трансгенные растения с измененными пищевыми качествами Используя ДНК-технологии, можно повлиять на пищевую ценность растений: изменить аминокислотный состав пищевых белков, получить плоды с измененным жирнокислотным составом, создать сорта картофеля с улучшенным качеством крахмала, придать определенный вкус плодам.

Растения являются продуцентами наиболее дешевых белков. Однако их пищевая ценность невысока, поскольку они не содержат все незаменимые аминокислоты. Для получения полноценных растительных белков необходимо изменить нуклеотидную последовательность их генов так, чтобы закодированные в них белки содержали все незаменимые аминокислоты. Полноценные растительные белки можно получить и другим способом. В этом случае в геном растения следует ввести гены других запасных белков. В результате 1 Прикладная молекулярная биология в растении будут синтезироваться свои собственные и трансгенные запасные белки, которые в совокупности будут содержать все незаменимые аминокислоты.

Качество растительного масла зависит от содержания в его составе различных жирных кислот. При создании трансгенной сои в ее геном был введен ген десатуразы. В результате такого переноса ее собственный ген перестал экспрессироваться. Десатураза катализирует превращение одинарной связи между атомами углерода в двойную.

Подавление собственного гена десатуразы привело к тому, что содержание полиненасыщенных жирных (лино левой и ленноленовой) кислот в соевом масле снизилось, а содержание мононенасыщенной кислоты (олеиновой) возросло. Потребительские свойства соевого масла с таким жирнокислотным составом оказались выше, чем масла нетрансгенных сортов сои.

Получен трансгенный рапс с измененным составом растительного масла, содержащим до 45 % жирной кислоты (С12) лаурата. Это жирная кислота широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики. В геном трансгенного рапса был интегрирован ген тиоэстеразы из растения Umbellularia califomica. Выбор на это растение пал, потому что содержание лаурата в масле его семян достигает 70 %. Введение гена тиоэстеразы в геном рапса привело к увеличению содержания лаурата в составе и его масла.

С помощью трансгенных растений возможно полу чение крахмала с заданными свойствами. Крахмал состоит из двух компонентов амиилопектина и амилозы. Раствор амилопектина менее вязкий и более прозрачный, чем раствор амилозы, и его предпочтительнее использовать в пищевой промышленности. В связи с этим перспективно создание крахмалнакапливающих культур, синтезирующих преимущественно амилопектин.

Созревшие фрукты и овощи имеют более короткий срок хранения, чем несозревшие. С целью продления продолжительности хранения томатов были созданы трансгенные растения с замедленным сроком созревания.

1 Глава 7. Генная инженерия растений Таким томатам был введен ген, кодирующий антисмысловую РНК полигалактуроназы, фермента, разрушающего пектин и способствующего созреванию томатов. Трансген подавлял синтез полигалактуроназы за счет образования дуплекса между антисмысловой РНК и иРНК фермента.

Ацетилен, активируя гены, ответственные за созревание, ускоряет этот процесс. Блокируя синтез ацетилена введением в томаты генов антисмысловых РНК ферментов, отвечающих за его (ацетилена) продукцию, были получены трансгенные растения с замедленным сроком созревания. Такие томаты были также получены в результате введения в их геном генов, ответственных за деградацию предшественника ацетилена.

Принципиальные подходы, используемые для созда ния трансгенных томатов с замедленным сроком созревания, можно распространить и на другие растения.

Методами генной инженерии можно улучшить внеш ний вид плодов, а также их вкус. Например, за счет введения генов сладких белков монеллина и тауматина. Земляника с геном тауматина оказалась более устойчива к болезням, чем нетрансгенная.

С помощью ДНК-технологий можно ввести гены, ответственные за азотфиксацию, в геном культурных растений и добиться их экспрессии. Тем самым решить проблему нехватки азотных удобрений. Манипуляции с ДНК могут привести к повышению эффективности фотосинтеза, и, следовательно, к увеличению биоорганической продукции.

Получены трансгенные растения, плоды которых яв ляются партенокарпическими, то есть сформировавши мися без опыления. Для партенокарпических плодов характерно либо полное отсутствие семян, либо наличие их незначительного количества.

Созданы трансгенные растения с измененными декора тивными свойствами. Например, петунии с разноцветными цветками или гвоздики с генами из других цветов, отвечающих за голубую и фиолетовую окраски. Получен генетически модифицированный рис, способный без ущерба провести под водой до двух недель.

1 Прикладная молекулярная биология Трансгенные растения «биореакторы»

Перспективно использование растений в качестве «биореакторов» для синтеза каких-либо белков или других веществ, поскольку они (растения) быстро растут, и их выращивание не требует высококвалифицированного труда. В настоящее время получены трансгенные растения, синтезирующие чужеродные белки, использование которых возможно в различных областях народного хозяйства.

Удалось достичь продукции в растениях человеческого -интерферона. С помощью растений можно получать бактериальные антигены и использовать их в качестве вакцин. Создан трансгенный картофель, продуцирующий субъединицу -токсина холеры, которую возможно использовать в качестве вакцины от холеры. В растениях получена продукция антител, специфичных для Strepto coccus mutans – бактерий, вызывающих зубной кариес. Не исключено их использование в зубных пастах.

В геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus был встроен химерный ген, состоящего из части гена запасного белка арабидопсиса и кодирующей части гена нейропепти да – энкефалина. В белковом продукте этого химерного гена два структурных домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином. Действием этого протеолитического фермента на гибридный белок можно из него вычленить энкефалин.

Российские ученые создали трансгенную морковь, способную стимулировать иммунитет. Морковь продуци рует иммуномодулирующие белки человека интерлейкины.

1 Глава 8. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ Генная инженерия животных позволяет преодолеть межвидовые барьеры. С помощью ДНК технологий можно животным переносить гены не только других видов животных, но и гены растений и прокариот. Если чужеродный ген интегрирован в геном животного, то такой ген называется трансгеном, а животное, содержащее в геноме трансген, – трансгенным. Белок, кодируемый трансгеном, носит название трансгенный белок.

Трансгенных животных создают с целью:

• изучения функций генов и особенностей их экс прессии;

• получения животных с улучшенными харак теристиками;

• получения моделей для изучения генетических забо леваний и разработки способа их лечения;

•получения трансгенных белков.

При получении трансгенных животных для переноса генов в их геном используют следующие подходы:

•микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы;

• введение чужеродной ДНК с помощью ретровирус ных векторов в клетки эмбриона на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента;

• введение генетически модифицированных эмбрио нальных стволовых клеток (ЭСК) в эмбрион на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента.

Рассмотрим последовательность действий при созда нии трансгенных животных с использованием метода микроиньекции ДНК в пронуклеус зиготы (рис. 8.1). В начале из яйцевода самки извлекают зиготы. Затем под объективом микроскопа в микронуклеус зиготы с помощью микропипетки вводится генетическая конструкция, содер жащая чужеродный ген. Мужской пронуклеус значи тельно крупнее женского, поэтому в него легче ввести препарат ДНК. В качестве генетической конструкции для доставки генов может использоваться плазмидный вектор, содержащий трансген и промотор, способный обеспечивать экспрессию чужеродного гена в клетках млекопитающих.

В пронуклеус вводится до 100 и более копий гена. На следую 1 Прикладная молекулярная биология щем этапе зиготу трансплантируют ложнобеременной самке другой генетической линии. В случае нормального течения беременности суррогатные матери рождают дете нышей, развившихся из реконструированных зигот. Для подтверждения интеграции чужеродного гена в геном новорожденных животных, из них извлекают биологические образцы для ДНК-диагностики на наличие трансгена в их геноме. При использовании рассмотренного подхода, выход трансгенных животных, как правило, не превышает 5 % от исходного числа зигот. При этом не у всех животных трансгены экспрессируются с образованием функционально активного продукта. На заключительном этапе трансген ные животные с экспрессирующимся чужеродным геном используются для получения трансгенного потомства.

Рис. 8.1. Схема получения трансгенных животных методом микроинъекций чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы 1 Глава 8. Генная инженерия животных Метод введения чужеродной ДНК с помощью рет ровирусных векторов в клетки эмбриона характеризуется высокой эффективностью. Однако размер встраиваемой чужеродной ДНК ограничен и составляет до 8 т.п.н. При использовании этого метода последовательность этапов получения трансгенных животных следующая. Эмбрион, как правило, на стадии 8 клеток инфицируют рекомбинантным ретровирусом, содержащим трансген. Ретровирусный вектор способен не только доставить чужеродные ген во все клетки эмбриона, но и обеспечить его встраивание в ДНК. После инфицирования эмбрион имплантируют суррогатной мате ри. При удачном стечении обстоятельств плод развивается и рождается трансгенное животное, которое затем используют для получения трансгенного потомства (рис. 8.2).

Рис. 8.2. Схема получения трансгенных животных с использованием метода введения чужеродной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки эмбриона 1 Прикладная молекулярная биология Метод получения трансгенных животных с ис пользованием ЭСК нашел широкое применение.

ЭСК являются полипотентными, так как могут диф ференцироваться в клетки всех зародышевых листков. Если их (ЭСК) ввести в полость бластоцисты, то они могут дать начало любым органам и тканям химерных животных. ЭСК получены из различных животных: из мышей, золотистого хомячка, свиньи, овцы, коровы, обезьяны, человека и др.

Рассмотрим этапы получения трансгенных животных с использованием ЭСК (рис. 8.3):

• получение ЭСК;

• введение в ЭСК генетической конструкции, содер жащей трансген. Трансформацию ЭСК осуществляют с помощью электропорации или микроинъекций ДНК в ядро клетки;

• получение от животных-доноров бластоцист для микроинъекции в них трансформированных ЭСК;

• конструирование химерных эмбрионов, посредством микроинъекции трансформированных ЭСК в полость бластоцист;

• имплантация химерных эмбрионов суррогатной матери;

• получение химерного потомства от суррогатной матери;

• генетический анализ родившихся животных на наличие в их геноме трансгена, выявление трансгенных животных, в ДНК половых клеток которых присутствует трансген;

•получение гомозиготных трансгенных потомков в результате скрещивания химерных животных, в половых клетках которых выявлен трансген.

1 Глава 8. Генная инженерия животных Рис. 8.3. Схема получения трансгенных животных с использованием ЭСК ЭСК можно направлено модифицировать с помощью методов генной инженерии. Созданы векторы, которые способны обеспечивать встраивание трансгена в строго определенные участки генома (сайты-мишени) ЭСК. Такие сайт-мишени находятся в участке ДНК, которые не кодируют белков, необходимых для жизнеобеспечения ЭСК. В связи с этим встраивание трансгена в эти области не влияет на функционирование ЭСК. В состав таких векторов входят:

•трансген;

• два блока нуклеотидных последовательностей (НВ 1 Прикладная молекулярная биология и НВ2), гомологичных участкам сайта-мишени. Эти блоки обеспечивают интеграцию трансгена в хромосому, за счет гомологичной рекомбинации;

• ген Neor, обуславливающий устойчивость к соеди нению G-418;

•два разных гена тимидинкиназы вируса простого герпеса типов 1 и 2 HSV-tk1 и HSV-tk2. Тимидинкиназа способна катализировать превращение ганцикловира в токсический для ЭСК продукт. Следовательно, добавление ганцикловира в культуру клеток, в которой синтезируется тимидинкиназа, приведет к гибели клеток.

Трансген и ген Neor расположены между блоками НВ и НВ2, а гены HSV-tk1 и HSV-tk2 по обеим сторонам этой конструкции (рис. 8.4).

Рис. 8.4. Схема интеграции трансгена в геном ЭСК. А – интеграция посредством гомологичной рекомбинации фрагмента вектора непосредственно в сайт мишень, Б – неспецифическая интеграция вектора в хромосому. ТГ – трансген 1 Глава 8. Генная инженерия животных После попадания вектора в ядро ЭСК возможна интеграция посредством гомологичной рекомбинации (рис. 8.4А) фрагмента вектора, расположенного между НВ и НВ2 и содержащего трансген и ген Neor, непосредственно в сайт-мишень. В этом случае гены HSV-tk1 и HSV-tk не будут интегрированы в хромосому. Возможна также и неспецифическая интеграция вектора в хромосому, приводящая к встраиванию в нее трансгена, гена Neor и генов тимидинкиназы (рис. 8.4Б). Следует отметить, что в некоторых ЭСК векторная ДНК вообще не интегрирует в хромосому. Следовательно, в их геноме будут отсутствовать и трансген, и гены Neor, HSV-tk1, HSV-tk2. С помощью G- и ганцикловира можно отобрать ЭСК, в которых произошла интеграция трансгена в сайт-мишень за счет гомологичной рекомбинации. Такие клетки растут в присутствии обоих этих веществ. Ген Neor обеспечивает их устойчивость к G-418, а отсутствие генов тимидинкиназы определяет устойчивость к ганцикловиру, поскольку последний в от сутствии тимидинкиназы не превращается в токсическое вещество. В то же время ЭСК со встроенным вектором за счет неспецифической интеграции при выращивании в среде с G-418 и ганцикловиром погибнут, поскольку в них при сутствует ген тимидинкиназы и, соответственно, синтезирует ся тимидинкиназа, превращающая субстрат (ганцикловир) в токсическое соединение. ЭСК, не приобретшие ген Neor, погибнут при выращивании в присутствии G-418 из-за отсутствия устойчивости к этому веществу. Используя рассмотренный подход, можно получить ЭСК с сайт специфической вставкой.

В качестве сайта-мишени может выступать и функционально активный ген. И тогда встраивание в него какой-либо нуклеотидной последовательности приведет к его инактивации. Таким образом, можно направленно осуществлять подавление («нокаут») гена. Используя такой прием, можно изучать функции тех или иных генов.

Созданы сотни линий мышей с «нокаутированными» генами, используемые в качестве моделей для изучения генетиче ских болезней человека.

1 Прикладная молекулярная биология Перспективы использования трансгенных животных Несмотря на то, что трансгенные животные не имеют столь широкого практического применения как трансгенные растения, перспективы их использования многообразны.

Трансгенные животные – биореакторы В качестве лекарственных препаратов в медицине широко используются белки человека. Эти белки могут быть получены из тканей человека. Очевидно, что при таком способе их получения возникают проблемы. Можно также получать белки с помощью генетически модифицированных бактерий. Однако часто такие белки не идентичны белкам, синтезируемым в клетках человека. Эти отличия могут определяться тем, что в клетках прокариот отсутствуют системы, обеспечивающие посттрансляционные моди фикации белков. Кроме того выделение и очистка белков, синтезированных в бактериальных клетках, является трудо емкой и дорогостоящей процедурой.

С помощью методов генной инженерии можно соз давать трансгенных животных, синтезирующих белки человека. Более того можно добиться выделения чужеродных белков с молоком животных. Это обстоятельство позволяет значительно упростить их получение. Для обеспечения экспрессии трансгена в молочной железе и выделение белка с молоком перед трансгеном следует поместить промотор гена одного из белков, секретируемых с молоком (например, промотор гена казеина).

Наиболее перспективно с целью получения чужеродных белков создание трансгенных коз или коров, поскольку они дают достаточно много молока. Так, корова может ежегодно продуцировать до 10 000 и более литров молока. В течение одного года от одной коровы можно получить несколько десятков килограмм рекомбинантного белка. В настоящее время получены трансгенные животные, синтезирующие белки человека: антитрипсин, интерферон, 1 Глава 8. Генная инженерия животных фактор свертываемости крови IX, сывороточный аль-бумин, трофобластин, интерлейкин-2, некоторые иммуноглобули ны, тканевой активатор плазминогена, урокиназа и многие другие.

Использование всего нескольких трансгенных коров позволит решить проблему получения некоторых белков человека. Так, заболевание гемофилия связано с нарушением синтеза некоторых факторов свертываемости крови. Мировая потребность в факторе свертываемости крови VIII в год составляет около 7 кг. Эту потребность может обеспечить одна трансгенная корова. Годовая потребность в факторе свертываемости крови IX составляет около 85 кг. Для ее удовлетворения достаточно нескольких коров. Потребность в фибриногене (около 3 т в год) может обеспечить несколько сот трансгенных коров.

Созданы трансгенные коровы, в молоке которых образуется человеческий белок лактоферрин. Этот белок обладает антивирусной, антибактериальной, анти паразитарной, различными каталитическими активностями, радиопротективными свойствами и противораковым, ан тиаллергическим, иммуномодулирующим действиями.

Перспективно использование лактоферрина для про филактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больных СПИДом, недоношенных младенцев, больных, прошедших радио терапию.

С помощью трансгенных коров можно получать содержащийся в молоке человеческий альбумин. Альбумин используется в медицине для поддержания осмотического давления крови.

Трансгенные животные с улучшенными характеристиками Непереносимость молока у некоторых людей связана с нарушением синтеза фермента лактазы, расщепляющего молочный сахар лактозу на моносахариды глюкозу и галактозу. У таких людей после приема молока наблюдается 1 Прикладная молекулярная биология желудочное расстройство, сопровождающееся неприятными последствиями. У них поступающая с молоком лактоза не расщепляется, поскольку отсутствует гидролизующий ее фермент лактаза. В связи с этим микроорганизмы кишечника начинают ее использовать в качестве источника энергии и бурно расти, что сопровождается соответствующими симптомами. Если же в геном коровы ввести ген лактазы и заставить его экспрессироваться в молочной железе, то присутствующая в молоке лактоза будет расщеплена до глюкозы и галактозы. Такое молоко без всяких последствий смогут употреблять люди, у которых нарушен синтез лактазы.

Перспективно создание трансгенных коров, про дуцирующих молоко, по своему составу приближенное к молоку человека. С этой целью необходимо выключить некоторые гены коров и ввести несколько генов человека.

В составе человеческого грудного молока содержится антибактериальный фермент лизоцим, в то время как в молоке животных его содержание значительно ниже. Так, в молоке козы лизоцима приблизительно в 3 тысячи раз меньше, чем в человеческом грудном молоке. Посредством введения гена лизоцима получены трансгенные козы, продуцирующие молоко, содержание лизоцима в котором близко к таковому в грудном человеческом молоке.

Сыр является важнейшим продуктом питания.

Его получают из молока. Количество получаемого сыра пропорционально содержанию казеина в молоке.

Содержание казеина в молоке можно увеличить, увеличив число копий гена этого белка, и тем самым усилив его биосинтез.

В начале 80-х годов ХХ века Р.Д.Пальмитером и сотрудниками были получены трансгенные мыши, в геном которых был введен ген гормона роста крысы с металлотиониновым промотором. Последний является регулируемым промотором и обеспечивает экспрессию генов при повышенной концентрации тяжелых металлов.

Трансгенным мышатам давали корм с высоким содер жанием цинка. В результате экспрессия гена гормона роста 1 Глава 8. Генная инженерия животных резко возрастала и, соответственно, возрастала концентрация гормона роста в крови. В связи с этим трансгенные мышата росли значительно быстрее, чем контрольные, у которых повышенная экспрессия гормона роста отсутствовала.

После этих экспериментов были созданы трансгенные сельскохозяйственные животные с повышенной продукцией гормона роста. Однако они были обычных размеров, у некоторых из них наблюдались нарушения в росте, строении костей. Отсутствие увеличения размера у них очевидно связано с тем, что потенциал их роста выбран многовековой селекцией. В то же время были созданы быстрорастущие трансгенные лососи.

Получена трансгенная мышь, способная выполнять повышенные физические нагрузки. Ей был введен ген PGC1B (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 beta), кодирующий белок (PGC1-beta). Этот белок активирует транскрипционные факторы, отвечающие за регуляцию жирового и углеводного обменов и состав мышечных волокон. Увеличение экспрессии гена PGC1B повлияло на физические возможности мышей. Трансгенные мыши способны пробегать более длинные дистанции и с более высокой скоростью, чем контрольные мыши.

Выведены трансгенные комары, невосприимчивые к возбудителю малярии. Они оказались более жизнеспособными, чем обычные насекомые. Поэтому трансгенные комары могут постепенно вытеснить обычных комаров и помочь в борьбе с малярией. Кроме того комарам введен ген, придающий зеленый блеск глазам. Так можно отличить трансгенных комаров от нетрансгенных.

В мире существует дефицит органов для пересадки их человеку. Перспективно создание трансгенных животных, являющихся донорами органов. Наиболее близки человеку по размеру, строению, биохимическим показателям органы свиньи. Очевидно, что пересаженные органы от обычной свиньи будут эффективно отторгаться иммунной системой человека, произойдет быстрая потеря органа. В связи с этим необходимо сконструировать трансгенную свинью, органы которой не отторгались бы иммунной системой человека.

1 Прикладная молекулярная биология Недостаток аминокислот цистеина и метионина в организме овцы задерживает рост шерсти. В связи с этим введение в геном овцы дополнительных генов ферментов, ответственных за синтез указанных аминокислот, возможно, повысит качество шерсти.

Созданы трансгенные животные, которые светятся в темноте. Свиньям и цыплятам был введен ген медузы, продукт которого и определял их способность светиться в темноте.

Трансгенные животные, устойчивые к заболеваниям Существуют породы сельскохозяйственных жи вотных, устойчивых к определенным заболеваниям.

Идентификация генов, определяющих такую устойчивость, а затем их использование в качестве трансгенов при создании генетически модифицированных животных позволит получить линии животных, не восприимчивые к заболеваниям. Такой подход окажется приемлемым только в том случае, когда устойчивость определяется одним или небольшим числом генов.

Другой подход, позволяющий получить устойчивых к заболеваниям животных, заключается в интеграции в их геном генов иммуноглобулинов, специфичных к тем или иным возбудителям инфекционных заболеваний.

Экспрессия этих генов защитит животных от болезнетворных микроорганизмов.

К защитным белкам относятся интерфероны, они защищают организм от вирусных заболеваний. В связи с этим можно ожидать, что трансгенные животные с геном интерферона будут менее подвержены вирусным инфекциям, чем нетрансгенные.

Еще одно направление, которое может повысить устойчивость животных к вирусным заболеваниям, заключается во введении в их геном генов, кодирующих антисмысловую РНК. Синтез последних приведет 1 Глава 8. Генная инженерия животных к блокированию иРНК возбудителя заболевания и, соответственно, понизит их жизнеспособность.

Создание животных – генетических моделей заболеваний человека С целью изучения течения генетических болезней и разработки способов их лечения целесообразно создание животных, представляющих собой модели генетических заболеваний. Генетические болезни бывают моногенными и полигенными. Очевидно, что в настоящее время о создании трансгенных животных, моделирующих полигенные на следственные болезни, говорить еще преждевременно.

Могут быть созданы два типа трансгенных животных, моделирующих моногенные генетические болезни:

• животные с функционирующим «больным» транс геном (животным вводится человеческий ген, ответственный за заболевание);

• животные, у которых выключен ген, аналогичный тому, который вызывает данное заболевание у человека.

Созданы модели многих наследственных болезней человека, а именно: болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, нейродегенеративные нарушения, сердечно сосудистые заболевания и др. Несмотря на то, что резуль таты, полученные на модельных животных, нельзя однозначно экстраполировать на человека, тем не менее, полученные знания позволят выявить фундаментальные причины развития болезни и разработать подходы к их лечению.

1 Глава 9. ГЕНОТЕРАПИЯ К настоящему времени выявлены тысячи наследствен ных заболеваний. Для многих из них идентифицированы гены, определяющие данное заболевание. Разработаны методы их диагностики. Приблизительно каждый двадца тый ребенок рождается с наследственным заболеванием.

При этом каждый сотый ребенок получает в наследство серьезный генетический дефект. Несмотря на то, что о наследственных заболеваниях известно много, достаточно эффективных методов их лечения с помощью традиционных методов медицины не найдено. Проблему таких заболева ний можно решить с помощью генотерапии.

Под генотерапией понимают совокупность генно инженерных подходов, обеспечивающих внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека с целью лечения заболеваний. Задачами генотерапии являются исправление дефектов в структуре ДНК или придания клеткам новых характеристик.

В современных условиях с помощью генотерапии удалось достигнуть успеха только при лечении моногенных наследственных заболеваний. Лечение же полигенных заболеваний и заболеваний, возникших в результате хромосомных аберраций (изменение числа и структуры хромосом), станет возможным при дальнейшем развитии науки.


Лечебный эффект при лечении моногенных нас ледственных заболеваний может быть достигнут за счет следующих подходов:

•введения неповрежденной копии гена;

• подавления экспрессии или разрушения дефектного гена;

• замены дефектного гена неповрежденным. Этого можно достичь в результате гомологичной рекомбинации «лечебного» и «больного» генов, с помощью которой пов режденный ген будет заменен на нормальный;

• введения несвойственных организму генов, обус лавливающих лечебный эффект. Так можно будет ле чить онкологические, инфекционные, аутоиммунные заболевания.

1 Глава 9. Генотерапия В современных условиях реализован в основном только первый подход: лечение наследственного заболевания посредством введения в клетки неповрежденной копии гена. Для достижения лечебного эффекта с помощью такого подхода нужно:

• идентифицировать ген, ответственный за забо левание;

• создать генетическую конструкцию, содержащую неповрежденный ген и участки ДНК, обеспечивающие его экспрессию;

• разработать методы введения генетической конструкции в клетки больного.

Очевидно, прежде чем приступить к разработке метода лечения наследственного заболевания посредством генотерапии, необходимо идентифицировать ген, с нару шением организации которого связана патология. Для многих наиболее распространенных заболеваний такие гены уже установлены (таблица 9.1).

Таблица 9. Наследственные заболевания и гены, нарушение в организации которых приводит к патологии Ген, с нарушением организации Симптомы Заболевание которого связано заболевания заболевание Муковисцидоз Ген Нарушения функционирования трансмембранного органов дыхания и желудочно регулятора (CFTR) кишечного тракта Болезнь Гоше Ген глюкоцереб- Накопление глюкоцереброзидов розидазы в макрофагах. Порожение печени, селезенки, костей Эмфизема Ген a1-антитрипсина Дефицит ингибитора сыворо точных протеаз. Поражение легких, цирроз печени Фенилкетонурия Ген фенилаланингид- Нарушение метаболизма роксилазы фенилаланина, нарушение умственного развития и различные психические расстройства 1 Прикладная молекулярная биология Ген, с нарушением организации Симптомы Заболевание которого связано заболевания заболевание Несиндромальная Ген коннексина 26 Врожденная и ранняя детская нейросенсорная (GJB2) глухота тугоухость Поражение эмбрионального нервного валика, нарушение Нейрофибро- Ген нейрофибро миграции, роста и матоз 1-го типа мина (NF1) дифференцировки клеток.

Ген филаггрина (FLG). Этот Поражение кожи, при котором белок участвует в Вульгарный нарушается процесс ее ороговения, дифференцировке ихтиоз приводя к образованию чешуек по клеток эпидермиса всему телу.

и его барьерной функции.

Ген дистрофина Характеризуется Мышечная (DMD). Этот белок прогрессирующей мышечной дистрофия стабилизирует атрофией, приводя к полной Дюшенна мембрану деградации мышечной ткани мышечных клеток к 20-30-ти годам.

Ген фактора Гемофилия А свертываемости Нарушение свертываемости крови крови VIII Ген фактора Гемофилии Б свертываемости Нарушение свертываемости крови крови IХ Тяжелый Ген аденозиндеза комбинорованный Утрата Т- и В-лимфоцитов миназы иммунодефицит Ген рецептора Повышенный уровень Семейная гипер- липротеина низкой холестерина в крови.

холестеролемия плотности Ишемическая болезнь сердца На основании сведений об организации генов, оп ределяющих наследственное заболевание, необходимо создать генетическую конструкцию, в состав которой входят неповрежденный ген и нуклеотидные последовательности, обеспечивающие его экспрессию в клетках человека. Эта конструкция также должна обеспечивать доставку генов в клетки. Такие генетические конструкции созданы. С использованием их в принципе «лечебные» гены можно 1 Глава 9. Генотерапия вводить и в половые клетки. Методы переноса генов в половые клетки широко используются при создании трансгенных животных. При таком переносе приобретенные гены будут передаваться потомству. Этот подход вполне оправдан при работе с животными. При лечении же человека на современном этапе развития науки такой подход неприемлем. Неизвестно как поведет себя перенесенный ген.

Может произойти гиперэкспрессия гена, или же он может нарушить работу других генов.

В настоящее время при лечении человека с ис пользованием методов генотерапии, гены вводят в соматические клетки. Поскольку при этом не транс формируются половые клетки, приобретенные гены не мо гут передаваться по наследству. Потомство, таким образом, оказывается защищенным от ошибки.

Введение генетической конструкции в соматические клетки осуществляется двумя способами:

• в предварительно выделенные и культивируемые клетки пациента, которые после трансформации возвращают в организм (генотерапия ex vivo);

• «лечебный» ген может быть введен в клетки непо средственно в организме больного (генотерапия in vivo).

Последовательность этапов генотерапии ex vivo сле дующая:

1) извлечение клеток из организма больного;

2) введение генетической конструкции в изолированные клетки;

3) отбор и наращивание «вылеченных» клеток;

4) возвращение генетически исправленных клеток в организм пациента.

Использование собственных клеток больного при проведении генно-терапевтических процедур не приводит к их отторжению иммунной системой после возвращения в организм.

Удобным объектом для проведения генотерапии ex vivo являются клетки костного мозга. В костном мозге присутствуют стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток: В- и Т-лимфоциты, эритроциты, 1 Прикладная молекулярная биология макрофаги, тромбоциты, остеокласты. Если патология связана с нарушением генетических функций вышеуказан ных клеток, то введение в стволовые клетки соответствующих конструкций может оказать лечебное действие. Проведение терапии включает следующие этапы: извлечение костного мозга из организма больного, выделение из него стволовых клеток, введение в них конструкции с «лечебным» геном, возвращение трансформированных стволовых клеток на прежнее место. «Вылеченные» стволовые клетки дадут начало клеткам, в которых исходный генетический дефект отсутствует. Так может быть достигнут лечебный эффект.

Еще одним объектом для генотерапии ex vivo могут являться клетки печени. При проведении генно-терапевти ческих процедур у пациента отсекают 10 – 15 % печени. Затем из нее выделяют гепатоциты. На следующем этапе в культиви руемые гепатоциты вводится генетическая конструкция. На заключительной стадии трансформированные гепатоциты возвращают в печень через кровеносные сосуды.

В случае генотерапии in vivo введение генетической конструкции осуществляется в клетки пациента непо средственно в составе ткани без их выделения из органа.

Генетическая конструкция должна содержать «лечебный»

ген и промотор, обеспечивающий его экспрессию. Разрабо таны разнообразные методы доставки чужеродной ДНК в клетки тканей различных органов (мышцу, легкие, селезенку, печень, мозг, кожу, кишечник и др.).

Способы доставки «лечебных генов» в клетки пациентов Введение «лечебных генов» в клетки пациентов может быть осуществлено с использованием рекомбинантных вирусов. На основе генетического материала вирусов создано множество генно-инженерных конструкций, используемых для доставки генов в клетки. Наибольшее распространение имеют векторы, полученные на основе ретровирусов. Эти векторы обеспечивают высокую эффективность доставки ДНК в клетки и ее интеграцию в клеточный геном. Они при этом не наносят ощутимых повреждений клетке. При создании ретровирусных векторов удаляют нуклеотидные последовательности, кодирующие вирусные белки, обес 1 Глава 9. Генотерапия печивающие формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток. Взамен удаленного материала вводится «лечебный» ген. В составе ретровирусного вектора сохраняют элементы генома вирусов, обеспечивающие перенос и экспрессию трансгена. Сконструированный ретровирусный вектор дефектен. Он способен обеспечить доставку трансгенов, но не способен самостоятельно раз множаться. Размножаться же он может только в присутствии недефектного вируса-помошника. Еще к недостаткам ретровирусного вектора относится и то, что ретровирусы эффективно инфицируют только активно делящиеся клетки, и то, что ретровирусная ДНК интегрирует в геном клеток беспорядочно. Беспорядочное включение ретровирусной ДНК может привести к ее интеграции в функционирующий клеточный ген и подавить его активность.

С целью получения рекомбинантных ретровирусов, свободных от недефектных вирусов-помощников, были созданы «упаковывающие клетки». Они содержат гены ретровирусов, удаленные при создании ретровирусных векторов и, соответственно синтезируют ретровирусные белки, необходимые для формирования ретровирусной частицы. После введения в «упаковывающие клетки» ДНК ретровирусного рекомбинантного вектора она встраивается в хромосому и транскрибируется с образованием рекомбинантной векторной ретровирусной РНК. Пос ледняя, взаимодействуя с ретровирусными белками, синтезируемыми «упаковывающими клетками», формирует вирусные частицы. Такие вирусные частицы способны заражать клетки-мишени и их можно использовать для доставки «лечебных» генов в геном клетки-мишени. Следует отметить, что «упаковывающие клетки» не способны продуцировать вирусные частицы дикого типа. Что является весьма важной особенностью, потому что они (вирусные частицы дикого типа) могут нанести вред клеткам пациента.


Для доставки «лечебных» генов могут быть также использованы векторы, созданные на основе аденовирусов.

Аденовирусы способны инфицировать неделящиеся клетки.

Кроме того, они обладают широкой видовой и тканевой 1 Прикладная молекулярная биология специфичностью. При создании векторов, из генома аденовирусов удаляют часть генетического материала, и вместо него вводится «лечебный» ген. Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусных в геном не интег рируют, они присутствуют в ядре клеток, где осуществляется их транскрипция.

Получены векторы, используемые для доставки «лечебных» генов, и на основе других вирусов, например, на основе аденоассоциированных вирусов и вируса простого герпеса.

Наряду с вирусными векторами разработаны не вирусные методы доставки «лечебных генов». К таким методам относится обычная инъекция генетической конструкции (например, плазмидного вектора) в ткань какого-либо органа. Чужеродная ДНК при этом проникает только в часть клеток. Использование липосом, заполненных раствором векторной ДНК, может облегчить проникнове ние трансгена внутрь клеток. Это определяется тем, что липосомы способны сливаться с клеточной мембраной.

Можно использовать также метод биобаллистики для доставки трансгена в клетки тех или иных тканей. Введен ные таким образом «лечебные» гены в тканях-мишенях могут экспрессироваться. Для доставки «лечебного» гена в культивируемые клетки может использоваться также кальцийфосфатная трансфекция или метод электропора ции. Введение трансгена можно осуществлять с использованием комплекса ДНК с белками, для которых на поверхности клеток имеются соответствующие рецепторы.

После связывания белка с рецептором чужеродная ДНК проникает в клетку-мишень.

Следует отметить, что невирусные системы доставки трансгенов характеризуются низкой частотой трансформации и короткой продолжительностью экспрессии «лечебного»

гена. Эти два серьезных недостатка существенно влияют на перспективность их использования в генотерапии.

1 Глава 9. Генотерапия Достижения и перспективы генотерапии Первый пациентом генетических терапевтов (14.09.90) была четырехлетняя девочка с наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аде нозиндезаминазы. Ей были пересажены ее собственные лимфоциты, трансформированные ex vivo геном аде нозиндезаминазы в составе ретровирусного вектора.

Терапевтический эффект наблюдался несколько месяцев, поэтому терапевтическая процедура повторялась через 3 – 5 месяцев. За три года терапии ей были проведены процедуры. Девочка, благодаря лечению, смогла вести нормальный образ жизни.

В последствие проводилось лечение и других пациен тов с наследственным иммунодефицитом. Им «лечебный»

ген вводили в Т-лимфоциты или в стволовые клетки костного мозга, которые предварительно извлекали и культивировали в пробирке. Неповрежденный ген аденозиндезаминазы в клетки вводили при помощи ретровирусного вектора. После трансформации клетки возвращали в организм больных.

После такой процедуры наблюдался лечебный эффект.

Болезнь Гоше или глюкозилцерамидный липидоз является одной из лизосомных болезней накопления. В лизосомах содержится около 40 ферментов, ответственных за внут риклеточное расщепление различных макромолекул.

Мутации генов, кодирующих эти ферменты, приводят к тому, что субстраты этих ферментов накапливаются в лизосомах. Болезнь Гоше связана с недостаточностью фермента глюкоцереброзидазы. Глюкоцереброзидаза ката лизирует в макрофагах расщепление глюкоцеребрози-да, поэтому при недостаточности этого фермента в клетках накапливается глюкоцереброзид, а клетки в свою очередь постепенно оседают в печени, селезенке, костном мозге и иногда в легких. Происходит поражение органов. Возможно лечение данного заболевания с помощью методов гено терапии. С этой целью в культивируемые клетки костного мозга необходимо ввести ген глюкоцереброзидазы и затем генетически скорректированные клетки доставить в организм больного.

1 Прикладная молекулярная биология Семейная гиперхолестеринемия является наслед ственным заболеванием. У больных на мембранах клеток печени отсутствует рецептор липопротенов низкой плотности (ЛПНП-рецептор). Как известно ЛПНП являются переносчиками холестерина в крови. ЛПНП-рецептор связывает ЛПНП и обеспечивает поглощение холестерина клетками печени посредством эндоцитоза. При отсутствии или недостатке рецептора в крови повышается содержание ЛПНП, что значительно увеличивает риск возникновения атеросклероза. Радикальное лечение семейной гиперхо лестеринемии возможно с помощью генотерапии. В этом случае лечение осуществляется следующим образом. У больных отсекают около 15 % печени (200 – 300 г). Отсеченную часть промывают раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов, которые затем выращивают на питательной среде. В процессе роста в культуре, в клетки вводят в составе ретровирусного вектора недефектный ген ЛПНП-рецептора.

После трансформации модифицированные гепатоциты через воротную вену возвращают в печень. После опи санной процедуры, часть клеток печени больного начинают продукцию ЛПНП-рецептора, что обеспечивает снижение холестерина в крови пациентов.

Муковисцидоз – наследственное заболевание, обуслов ленное мутацией гена муковисцидозного трансмембранного регулятора, приводящее к тяжёлым нарушениям функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. При лечении муковисцидоза методами генотерапии in vivo неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в виде аэрозоля в дыхательные пути больного.

Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна – за болевание мальчиков, определяется дефектом гена дист рофина, находящегося в Х-хромосоме. Дети с этим за болеванием испытывают прогрессирующую слабость мышц, обычно приводящую к их гибели от дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте до 30 лет. При геннотерапевтическом лечении данного заболевания использовали два похода:

1 Глава 9. Генотерапия •недефектный ген дистрофина вводили in vivo с помощью инъекций в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо в составе аденовирусного вектора;

• недефектный ген дистрофина в составе ретровирус ного вектора вводили ex vivo в миобласты, которые после генетической коррекции трансплантировали больному.

В обоих случаях удавалось получить временный лечебный эффект. После лечения дети могли двигаться, однако терапевтическая процедура должна неоднократно повторяться.

Смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний.

Причиной онкологических заболеваний являются му тации, затрагивающие генетический аппарат клетки, и приводящие к трансформации нормальных клеток в злокачественные. Последние, с одной стороны, теряют способность к апоптозу, а с другой стороны – приобретают способность к бесконтрольному делению. Если иммунная система организма не распознает злокачественные клетки вовремя, то они начинают размножаться и метастазировать, образуя многочисленные опухоли. Онкологические забо левания часто заканчиваются летальным исходом. В настоящее время используют различные приемы для их лечения. Также разрабатываются приемы их генотерапии.

Для достижения лечебного эффекта можно генетически модифицировать как опухолевые клетки опухоли, так и нормальные клетки, например, клетки иммунной системы с целью активации иммунного ответа, направленного против опухоли. Возможны следующие приемы генетической коррекции лечения онкологических заболеваний:

• предотвращение экспрессии онкогенов в опухолевых клетках. Онкогены кодируют онкобелки, участвующие в трансформации нормальных клеток в опухолевые. Экс прессию онкогенов можно блокировать, если ввести гены, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК онкобелков. Для подавления экспрессии онкогенов в геном опухолевых клеток можно также ввести гены, продукты которых будут связывать онкобелки и таким образом их инактивировать;

1 Прикладная молекулярная биология • введение в опухолевые клетки генов-супрессоров опухолевого роста. В опухолевых клетках часто гены-суп рессоры повреждены. Поэтому замена дефектной копии гена на нормальную может оказать терапевтический эффект.

Значительная часть онкологических заболеваний связана с нарушением экспрессии гена p53. Его важнейшей функцией является запуск апоптоза в клетках с измененным геномом.

Оказалось, что восстановление экспрессии гена p53 может привести к уменьшению или исчезновению злокачественных опухолей;

• введение в опухолевые клетки «генов-убийц», про дукты которых обеспечивают гибель опухолевых клеток.

Тимидинкиназа вируса простого герпеса модифицирует субстрат ганцикловир в токсический для клетки продукт.

Введение гена тимидинкиназы в опухолевые клетки делает их чувствительными к ганцикловиру. Они погибают в присутствии этого вещества;

• активация клеток иммунной системы. В этом случае подразумевается введение в клетки иммунной системы генов стимуляторов иммунного ответа (интерферонов, интерлей кинов);

• повышение иммунореактивности опухолевых клеток за счет введения в них таких чужеродных генов, продукты которых, оказавшись на поверхности опухолевых клеток, позволят вызвать или усилить на них (опухолевые клетки) иммунный ответ;

• защита стволовых клеток от токсического действия химиотерапии. Для достижения этой цели в геном стволовых клеток вводят гены, определяющие устойчивость к лекарствам. При использовании этого подхода можно проводить химиотерапию более интенсивно.

Амавроз Лебера (врожденная слепота) – наследственное заболевание сетчатки глаза, проявляющееся уже в мла денчестве. Причиной заболевания является наличие дефект ного гена RPE65 (Retinal Pigment Epithelium, 65 kDa). Дефект гена RPE65 приводит к нарушению синтеза ферментов, участвующих в образовании светочувствительного пиг мента, и гибели светочувствительных клеток. Лечение 1 Глава 9. Генотерапия этого заболевания возможно с помощью генотерапии.

Положительный результат был получен после инъекции вирусного вектора, содержащего исправленный ген в эпителий пигментного слоя сетчатки пациентов. У некоторых пациентов зрение восстановилось до такой степени, что они могли нормально учиться в школе и заниматься спортом.

Гемофилия является наследственным заболеванием, при котором нарушен процесс свёртывания крови. При этом заболевании могут происходить кровоизлияния в различных органах человека. Причиной гемофилии является мутация в генах свертываемости крови. Различают гемофилию А и гемофилию В. Гемофилия А связана с мутацией в гене фактора свертываемости крови VIII и, соответственно, с отсутствием этого белка в крови больно го. Причиной гемофилии В является мутация в гене фактора свертываемости крови IX. Лечение гемофилии в настоящее время осуществляют с помощью инъекций факторов свёртываемости крови, обычно выделенных из донорской крови. При генотерапии гемофилии В трансформации подвергали клетки кожи фибробласты. В норме эти клетки не производят фактор свертываемости крови IX. После введения гена фактора IX фибробласты имплантировали в кожу. Трансформированные фибробласты осуществляли синтез фактора IX.

Гемоглобин состоит из четырех субъединиц (двух альфа-глобинов и двух бета-глобинов) и гема. У больных бета-талассемией нарушен синтез бета-глобин, из-за мутации в его гене. Для генетической коррекции необходимо ввести ген бета-глобина и добиться, чтобы белок синтезировался в равных количествах с альфа-глобином.

Болезнь Паркинсона – нейродегенеративное заболева ние, характеризующееся прогрессирующим разрушением и гибелью дофаминовых нейронов в центральной нервной системе. В развитии болезни Паркинсона определенную роль играют генетическая предрасположенность и воздействие нейротоксинов, образующихся в самих дофаминовых нейронах. Причинами проявлений этого заболевания могут быть и факторы воздействия окружающей среды, хрони 1 Прикладная молекулярная биология ческая цереброваскулярная недостаточность, употребление некоторых лекарств. Инъекции гамма-аминомасляной кислоты (нейромедиатора, оказывающего тормозящее действие, ГАМК) в мозг приводят к подавлению симптомов болезни Паркинсона (скованности движений, нарушений координации движений, дрожи и т.д.). Эффект такого лечения непродолжителен, так как нейромедиатор быстро выво дится. Синтез ГАМК осуществляет глутаматдекарбоксилаза.

В связи с этим введение дополнительных копий генов этого фермента в клетки должно привести к продолжительному увеличению продукции ГАМК.

Алкоголизм имеет огромное негативное влияние на все человечество. Общество испокон веков ведет борьбу с ним, но по большей части безуспешно. Возможно, в этой борьбе окажут помощь ДНК-технологии. В организме человека этанол при действии фермента алкогольдегидрогеназы превращается в ацетальдегид, который далее метаболи зирует в уксусную кислоту. Последнюю реакцию катализирует фермент альдегиддегидрогеназа. Ацеталь дегид значительнее токсичнее этанола и уксусной кислоты.

Его накопление в организме приводит к тяжелому отравле нию, сопровождающемуся головокружением, тошнотой, рвотой и другими неприятными симптомами. Если снизить скорость утилизации ацетальдегида, то при приеме алкого ля он будет накапливаться в большем количестве, чем обычно, что приведет к резкому ухудшению самочувствия. Снизить скорость утилизации ацетальдегида можно за счет пониже ния выроботки альдегиддегидрогеназы. Можно ожидать, что увеличение содержания ацетальдегида в организме приведет к формированию стойкого отвращения к алкоголю. Синтез альдегиддегидрогеназы можно подавить, если в клетки ввести генетические конструкции, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК альдегиддегидрогеназы. Та кие эксперименты были проведены на животных. Ученым удалось у крыс с врожденной склонностью к алкоголизму снизить потребление алкоголя на 50 %.

С целью иммунизации человека и животных является перспективным создание ДНК-вакцин. ДНК 1 Глава 9. Генотерапия вакцины представляют собой генетические конструкции, кодирующие антигены возбудителей инфекционных за болеваний. При иммунизации конструкции должны быть доставлены в ядра клеток in vivo. В качестве клеток-мишеней при ДНК-вакцинации предпочтительнее использовать мышечные или эпителиальные клетки. Доставка может осуществляться методом биобаллистики или с помощью липосом, содержащих вакцину. Внутри клеток генети ческие конструкции обеспечивают синтез чужеродного белка, на который иммунная система способна вырабатывать антитела. Эти антитела и будут обеспечивать иммунитет к соответствующим возбудителям инфекционного забо левания. Возможна разработка многокомпонентных вак цин, генетические конструкции которых содержат гены, кодирующие антигены нескольких возбудителей инфекци онных заболеваний.

1 Рекомендуемая литература* 1. Баранов, В.С. Пренатальная диагностика наследственных и врож денных болезней в России. Реальность и перспективы / В.С. Баранов // Соровский образовательный журнал. – 1998. – № 10. – С. 32 – 36.

2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред.

Е.С. Северина, А.Я. Николаева. – М.: Гэотар-Мед. 2001. – 448 с.

3. Бокуть, С.Б. Молекулярная биология / С.Б. Бокуть, Н.В. Ге расимович, А.А. Милютин. – Минск: Выш. шк., 2005. – 463 с.

4. Глазер, В.М. Конверсия гена / В.М. Глазер // Соросовский образо вательный журнал. – 2000. – № 1. – С. 23 31.

5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и приме нение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М., 2002. – 585 с.

6. Гончаренко, Г.Г. Основы генетической инженерии / Г.Г. Гон чаренко. – Минск: Выш. шк., 2005. – 183 с.

7. Ермишин, А.П. Генетически модифицированные организмы / А.П. Ермишин. – Минск: Тэхналогiя, 2004. – 118 с.

8. Инге-Вечтомов, С.Г. Введение в молекулярную генетику / С.Г. Инге-Вечтомов. – М.: Высшая школа. 1983. – 343 с.

9. Коничев, А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А. Се вастьянова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 400 с.

10. Кухта, В.К. Биологическая химия / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович. – М., Минск: Бином. 2008. – 688 с.

11. Ленинджер, Л. Основы биохимии / Л. Ленинджер. – М.: Мир, 1985. – Т. 1 – 3.

12. Льюин, В. Гены / В. Льюин. – М.: Мир, 1987. – 544 с.

13. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс [и др.]. – М.: Мир, 1986 – 1987. – Т. 1 – 5.

14. Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот / В.И. Агол;

под ред. А.С. Спирина. – М.: Высшая школа. 1990. – 352 с.

15. Сингер, М. Гены и Геномы / М. Сингер, П. Берг. – М.: Мир, 1998.

16. Халимская, Л.М. Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов / Л.М. Халимская // Соровский образовательный журнал. – 2000. – № 10. – С. 37 – 42.

17. Шелкунов, С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Шелкунов. – Но восибирск: Сиб. унив. изд-во, 2008. – 514 с.

18. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жиму лев. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 458 с.

19. Янковский, Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего рос сийского императора / Н.К. Янковский // Соровский образовательный журнал. – 1996. – № 2. – С. 21 – 27.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.