авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ К.Д. ГЛИНКИ КАФЕДРА СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ...»

-- [ Страница 3 ] --

По современным представлениям скорость развития мягкой пшеницы находится под контролем четырех независимых систем генов: Vrn – контроль различий по типу развития (яровой или озимый), Ppd – по реакции чувствительности к фотопериоду, Vrd – по продол жительности яровизации озимой пшеницы и Eps – скороспелости per se, не связанной с реак цией генотипов на яровизирующие и фотопериодические воздействия. Каждая из генетиче ских систем вносит свой вклад в общее разнообразие по продолжительности вегетационного периода (5). Гены Vrn, Ppd, Vrd и скороспелости per se, которые контролируют различия по типу и скорости развития мягкой пшеницы оказывают существенное влияние на адаптив ность растений к определенным условиям выращивания (6, 7). Основной эффект указанных генов состоит в контроле различий по продолжительности прохождения отдельных этапов органогенеза [8, 9], а также по количеству развивающихся примордиев и/или скорости за кладки их (10). Подобные генетические различия имеют вторичный эффект на количествен ные характеристики компонентов урожая и конечную продуктивность растений соответст венно возможностям конкретных генотипов противостоять или избегать стрессовых факто ров, обычных для определенных регионов (11). Знание эффектов генов Vrn, Vrd и Ppd по зимо - морозостойкости, продолжительности периода ‘‘всходы-колошение’’, урожаю и его компо нентам (6, 7, 11), а также наличием большого количества идентифицированных сортов яровой и озимой пшеницы по данным системам (12, 13, 14) позволяет целенаправленно использовать конкретные аллели указанных генов при создании новых сортов. Так, показана возможность создания более скороспелых и урожайных аналогов сорта яровой пшеницы Фонтан по гену Vrn-D1 и озимых форм пшеницы, полученных от скрещивания только яровых сортов, с неал лельными, имеющимся, у озимой пшеницы генами морозостойкости (15). Однако целена правленное использование генов Vrn, Vrd и Ppd в селекционных программах ограничено зна чительной временной продолжительностью (1,5 -2,5 года) и невозможностью проработки большого объема материала традиционными методами идентификации генотипов. Для по вышения эффективности идентификации и отбора генотипов необходимо использование но вых молекулярно-генетических методов анализа, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК. ПЦР-анализ успешно применяется для получения ДНК-маркеров к различным генам, в том числе к генам типа и скорости развития мягкой пшеницы. Создание широкого набора маркеров будет способствовать оптимизации методов традиционной селекции, позво лит отбирать растения с необходимым Vrn, Vrd и Ppd генотипом на ранних этапах селекци онного процесса и использовать их в дальнейшей работе.

Необходимым и обязательным условием для выявления ДНК маркеров к конкретным генам является наличие специально созданного генетически идентифицированного материа ла. В качестве такового могут использоваться моносомные, нуллисомные, телоцентрические, замещенные, почти изогенные, рекомбинантно-замещенные, рекомбинантно-инбредные ли нии, удвоенные гаплоиды, а также нулли-тетрасомные и лини с делециями, которые различа ются по аллелям одного гена или наличию/отсутствию хромосомы или её участка, где лока лизован необходимый локус. В таком случае наличие полиморфного ампликона ДНК у раз личающихся по определенному локусу линий гипотетически можно рассматривать в качестве потенциального маркера к указанному локусу. Возможности же практического использова ния такого потенциального маркера к определенному локусу могут быть подтверждены пу тем сопоставления результатов идентификации генотипов при помощи генетического и моле кулярно-генетического анализа расщепляющихся модельных популяций, а также набора сор тов различного происхождения.

Согласно приведенной схемы проводилась работа по поиску молекулярных маркеров к генам Vrn и Vrd с использованием изогенных линий, и к генам Ppd с использованием в ка честве исходного материала замещенных линий. Для выявления маркеров использовали раз личные модификации ПЦР-анализа, в частности, Inter-SSR (Inter-Simple Sequence Repeat), RAPD (random amplified polimorphic DNA), STS (Sequence-Tagged Microsatellite Site) и SSR ПЦР (simple sequence repeat).

Для выявления полиморфизма ДНК исходного генетического материала потребова лось использовать широкий набор праймеров. Методом RAPD- и ISSR анализа выявлено полиморфных фрагментов ДНК среди более 3 тысяч продуктов амплификации. Столь незна чительное количество полиморфных локусов свидетельствует, в первую очередь, о высоком качестве исходного генетического материала. Полиморфные локусы могут иметь отношение к любой части анализируемого генома и детектироваться даже вследствие одной нуклеотид ной замены в сайте праймирования. Из всего разнообразия детектируемых ДНК-локусов, только пять можно было рассматривать в качестве потенциальных ДНК-маркеров, три из ко торых позволяли маркировать ген Vrn-D1 (16, 17), и по одному к генам Ppd-D1a (18, 19) и Vrd1 (20). Так, амплификация с праймером (AG)9C выявила отсутствие у доминантных только по локусу изогенных Vrn-D1 линий сортов Мироновская 808, Одесская 16, Скороспелка зб, Triple Dirk одного из продуктов реакции величиной 850 н.п. Отсутствие фрагмента могло быть вызвано мутацией в сайте праймирования, что также позволяет рассматривать отсутст вие фрагмента как молекулярный маркер к определенному генетическому локусу (21). ISSR анализ ДНК сортов яровой мягкой пшеницы свидетельствовал об отсутствии ампликона ве личиной 850 н.п. только у моногенно доминантных по локусу Vrn-D1 сортов Beacon, Santa Catalina и Cocoraque-F75. На электрофореграммах моногенно доминантных сортов по гену Vrn-A1 или Vrn-B1 (Bledsol, АНК 18А), а также дигенно доминантных сортов с присутствием доминантной аллели гена Vrn-D1 (Эритроспермум 841, Sonalica – Vrn-A1Vrn-D1, Kentana 48 – Vrn-B1Vrn-D1) отсутствие интересующей аллели не обнаружено. Отсутствие ампликона ве личиной 850 н.п. показано и у яровых растений F2 популяции Мироновская808-Vrn D1(яровая)/Мироновская 808 (озимая;

рецессив по vrn-D1), характеризующихся ранними сроками колошения. Согласно генетических эффектов локусов Vrn (11), ранние сроки коло шения характерны для доминантных гомозигот, в данном случае по гену Vrn-D1. У яровых растений с поздними сроками колошения (гетерозиготы по локусу Vrn-D1), а также у не вы колосившихся растений (озимые, рецессивные по гену vrn-D1) отсутствие ампликона величи ной 850 н.п. не наблюдали. Следовательно, применение ISSR анализа позволяет маркировать наличие доминантной аллели гена Vrn-D1 у доминантных гомозигот. Наличие в генотипе сорта наряду с геном Vrn-D1 какой-либо другой доминантной аллели Vrn отрицательно ска зывается на результатах идентификации.

Исходя из этого, нами были предприняты попытки поиска RAPD маркеров, позво ляющих идентифицировать ген Vrn-D1 как у моногенных, так и дигенных генотипов. При использовании произвольного праймера p116 (GGG CCA ACA CTG GAA CAC) был обнару жен полиморфный ампликон величиной 657 н.п. у доминантных только по гену Vrn-D1 изо генных линий четырех сортов пшеницы: Мироновская 808, Одесская 16, Скороспелка 3б, Triple Dirk. При этом RAPD-маркер, в отличие от ISSR-маркера, позволяет идентифицировать доминантную аллель гена Vrn-D1 независимо от наличия/отсутствия доминантных или рецес сивных аллелей других Vrn генов в генотипах сортов различного географического происхож дения. Результаты RAPD анализа растений F2 популяции Мироновская 808-Vrn-D1(яровая) /Мироновская 808 (озимая;

рецессив по vrn-D1) по признаку присутствие/отсутствие маркера и данные гибридологического анализа по типу развития (яровость/озимость) показали соот ветствие фактически полученных распределений теоретически ожидаемому 3:1 по критерию 2. Частота рекомбинации между маркером и локусом Vrn-D1 составляет 3сМ, что является показателем тесного сцепления. Наличие тесного сцепления RAPD-маркера с геном Vrn-D позволяет идентифицировать носителей данной аллели независимо от вида растительного материала (изогенные линии, коммерческие сорта яровой пшеницы, гибридные F2 популяции) и наличия или отсутствия в генотипе других генов Vrn. Однако применение RAPD-маркера имеет ограничения, связанные с его доминантной природой, что не позволяет идентифициро вать гетерозиготные формы. Поэтому более эффективным является использование кодоми нантных маркеров, таких как STS-маркеры. Для получения STS-маркеров использовали сек венирование выше полученного RAPD-фрагмента.

STS-анализ изогенных по генам Vrn-D1 линий сортов озимой мягкой пшеницы Миро новская 808, Одесская 16, Скороспелка 3б, Triple Dirk с одной стороны и их рекуррентных ро дителей с другой позволил выявить наличие полиморфизма между данными группами геноти пов. Для доминантных по гену Vrn-D1 генотипов, независимо от генотипа рекуррентного роди теля, был выявлен фрагмент ДНК 780 п.н., а у соответствующих рекуррентных родителей (ре цессивы по гену vrn-D1) данный фрагмент отсутствовал. Для рецессивов было характерно на личие другого фрагмента 820 п.н., отсутствующего в свою очередь у доминантных по гену Vrn D1 генотипов. Следовательно, STS анализ позволяет маркировать носителей и доминантных и рецессивных аллелей гена Vrn-D1. Подтверждением данного факта могут служить результаты реакции амплификации с направленными праймерами ДНК замещенных линий с нул ли/тетрасомной компенсацией сорта Chinese Spring. Линии, несущие в своем генотипе доми нантную аллель гена Vrn-D1: Н5А/Т5B, H5B/T5A (по две копии гена Vrn-D1 в каждой) и Н5В/Т5D (четыре копии гена Vrn-D1) характеризовались присутствием маркера величиной п.н. Другие замещенные линии, не имеющие в своем генотипе данной доминантной аллели Н5D/Т5B и Н5D/Т5А (у первой доминантная аллель гена Vrn-D1 замещена на рецессивную ал лель гена vrn-B1, у второй - vrn-A1) характеризовались наличием на электрофореграмме фраг мента ДНК 820 п.н., как и рецессивные по гену vrn-D1 рекуррентные родители почти изоген ных линий. Аналогичный анализ на ДНК спектров продуктов реакции растений и исходных родителей комбинации скрещивания Мироновская808-Vrn-D1(яровая)/Мироновская 808 (ози мая;

рецессив по vrn-D1), используемой нами ранее при создании RAPD и ISSR маркеров, сви детельствовал о кодоминантной природе полученного STS-маркера. На электрофореграмме ДНК растений F1 (гетерозигота Vrn-D1/vrn-D1) присутствуют оба фрагмента, и 820 п.н. харак терного для рецессивных гомозигот, и 780 п.н. характерного для доминантных гомозигот. Сле довательно, выявленный STS маркер позволяет идентифицировать рецессивные гомозиготы, доминантные гомозиготы и гетерозиготы по VrnD1.

Использование нескольких методов, основанных на принципах ПЦР, позволило создать три ДНК-маркера к локусу Vrn-D1. Идентификацию доминантной аллели Vrn-D1 можно осуще ствлять как с помощью одного из имеющихся маркеров, так и с каждым из них, учитывая осо бенности анализируемого материала. Представляется наиболее целесообразным применять ком плексное маркирование данного локуса, что позволит проводить более детальную оценку селек ционного материала и в ряде случаев снизит вероятность ошибок при интерпретации данных.

При использовании ISSR–ПЦР с праймером (AG)6C был выявлен полиморфизм ДНК замещенных по 2A, 2B, 2D хромосом линий сорта Mersia и замещенных по 2D хромосоме ли ний сортов Avalon, Norman, Brigant, Brimstoun, Rendezvous. На электрофореграммах ДНК ли ний: Mersia*6/Ciano F67 2D, Mercia*6/RCM-71 2D, Avalon*6/Ciano F67 2D, Avalon*5/RCM- 2D, Brigand*5/RCM-71 2D, Brimstone*5/RCM-71 2D, Norman*5/RCM-71 2D, Rendezvous*6/RCM 71 2D (все носители гена Ppd-D1a) отсутствовал один из продуктов реакции величиной п.н. по сравнению с электрофореграммами ДНК линий Mersia/Chienese Spring 2B (Ppd-B1a), Mersia/C591 2A (Ppd-A1a) и соответствующих рекуррентных родителей сортов Mersia, Avalon, Norman, Brigant, Brimstone, Rendezvous (все Ppd-A1b, Ppd-B1b, Ppd-D1b). Отсутствие фрагмента величиной 350 п.н. отмечали в спектрах продуктов амплификации замещенных линий сортов Mersia и Avalon независимо от происхождения донора хромосомы 2D. Отсутст вие\наличие ISSR-локуса величиной 350 п.н. в дальнейшем обозначали, как 350- \ 350+. При этом наличие аллели 350- рассматривали как нулевой аллель (21).

ISSR–анализ ДНК индивидуальных растений F2 популяции полученной от скрещива ния носителей альтернативных аллелей маркера Avalon*6/Ciano F67 2D (Ppd-A1b Ppd-B1b Ppd-D1a;

слабо чувствительный к фотопериоду)//Одесская 16 (Ppd-A1b Ppd-B1b Ppd-D1b;

сильно чувствительный) позволил разделить расщепляющуюся популяцию по аллельному состоянию ISSR –локуса 350- \ 350+ на два класса. Присутствие нулевой аллели 350(-) выяви ли у слабо чувствительной к фотопериоду родительской формы – замещенной линии Avalon*6/Ciano F67 2D и у 22 (из 104) анализируемых растений F2, как правило, наиболее рано колосящихся. Факт более ранних сроков колошения доминантных гомозигот по генам Ppd по сравнению с гетерозиготами (6) позволяет предположить, что рано колосящиеся растения из анализируемой популяции являются носителями доминантного гена Ppd-D1a в гомозиготном состоянии (теоретически в указанной комбинации скрещивания доминантных гомозигот должно быть 26).

Электрофореграммы остальных 82 растений и их фоточувствительного ро дителя, показали присутствие ISSR-аллели 350+. Расщепление по ISSR-аллелям 350- \ 350+ высоко достоверно соответствует отношению 1:3 (2=0,82), свидетельствуя о моногенном контроле различий по фотопериодической чувствительности в данной популяции. Классиче ский гибридологический анализ также подтвердил моногенные различия по системе генов Ppd между замещенной линией Avalon*6/Ciano F67 2D и сортом Одесская 16, но в соотноше нии 3:1, т.е. обсуждаемый маркер можно было использовать только для идентификации до минантных гомозигот по гену Ppd-D1a.

При использовании амплификации с праймерами к микросателлитному локусу ORS показана идентичность спектров электрофореграмм сортов Norin 1, Бригантина и почти изо генных по Vrd1 гену линий, которые по спектру амплификации отличаются от ДНК сортов рекуррентов Мироновская 808, Эритроспермум 604 и моногенно доминантных по гену Vrd генотипов. Характер полиморфизма заключается в отсутствии одного из продуктов реакции в области 280 п.н. у генотипов доминантных по Vrd1 и наличия полиморфного фрагмента ДНК у остальных анализируемых генотипов. Отсутствие продукта амплификации обозначено как нуль-аллель 280(-).

Для определения сцепления предполагаемого маркера с геном проводили генетиче ский анализ расщепляющейся F2 популяции Эритроспермум 604 (vrd1vrd2)/Triple Dirk C (Vrd1vrd2) как с использованием классического гибридологического анализа, так и с исполь зованием SSR-PCR. Из 104 растений F2 популяции выколосились 77 растений. Остальные находились в фазе кущения. Указанное соотношение (3:1) достоверно соответствует по кри терию 2 теоретически ожидаемому при различиях между родительскими формами по одно му гену. Согласно результатам SSR-PCR у 22 растений F2 показано наличие аллели 280(-), у – 280(+), что тоже достоверно соответствует теоретически ожидаемому расщеплению при различиях родителей по одному гену, но в соотношении 1:3. Следовательно, данный маркер позволяет идентифицировать в гибридной популяции доминантные гомозиготы по гену Vrd1.

Маркер достаточно тесно сцеплен с геном и расстояние между ними составляет 4,6 сМ.

Таким образом, в результате проведенных исследований создана технология иденти фикации и отбора генотипов пшеницы по гену Vrn-D1, Ppd-D1a и Vrd1 при использовании молекулярно-генетических методов анализа полиморфизма ДНК.

Литература 1. Вавилов Н.И. Генетика на службе социалистического земледелия // Труды Всесоюзной конференции по планированию генетико-селекционных исследований. – Л. – 1933. – С. 17-46.

2. Вавилов Н.И. Научные основы селекции пшеницы // Теоретические основы селек ции растений. – М.-Л. – 1935. – Т. 2. – С. 3-244.

3. Вавилов Н.И. Критический обзор современного состояния генетической теории се лекции растений и животных // Генетика. – 1965. – №1. – С. 20-40.

4. Вавилов Н.И., Кузнецова Е.С. О генетической природе озимых и яровых сортов растений // Известия с.-х. факультета Саратовского университета. – 1921. – №1. – С. 1-25.

5. Стельмах А.Ф., Файт В.И., Мартынюк В.Р. Генетические системы типа и скорости развития мягкой пшеницы // Цитология и генетика. – 2000. – Т.34, №2. – С. 39-45.

6. Файт В.И., Федорова В.Р. Влияние различий генов Ppd на адаптацию и урожай в условиях юга степи Украины // Цитология и генетика. – 2007. – Т.41, №. – С 7. Файт В.И. Эффекты генов контроля продолжительности яровизации (Vrd) по агро номическим признакам у озимой мягкой пшеницы // Цитология и генетика. – 2007. – Т.41.

8. Стельмах А.Ф., Мартынюк В.Р. Эффекты доминантных генов Ppd по особенностям органогенеза у озимой мягкой пшеницы // Цитология и генетика. - 1998. - 32, №6. – С. 27-34.

9. Файт В.И., Сухоносенко Н.В. Особенности органогенеза, морозостойкость и уро жайность различных по генам Vrd линий озимой мягкой пшеницы // Вісник українського то вариства генетиків та селекціонерів. – 2006. - №3. – С.

10. Worland A.J. The influence of flowering time genes on environmental adaptability in European wheats: Selec. Pap. EWAC Conf. ‘‘Cereal Aneuploids Genet. Anal. and Mol. Techn.’’, Gatersleben, July 4-8, 1994 // Euphytica. - 1996. - Vol.89. - №1. - P. 49-57.

11. Стельмах А.Ф., Файт В.И. Эффекты локусов Vrn мягкой пшеницы по агрономиче ским признакам в различных условиях // Цитология и генетика. – 1995. – Т.29, № 4. – С.54-61.

12. Каталог сортов яровой мягкой пшеницы по генам системы локусов Vrn (чувствительность к яровизации) / Стельмах А.Ф., Авсенин В.И., Воронин А.Н. - Изд. Третье, доп. – Одесса, 1987. – 111 с.

13. Файт В.И. Генетический контроль продолжительности яровизации сортов озимой пшеницы юга степи Украины // Экологическая генетика.-2006. -№2.

14. Файт В.І., Федорова В.Р. Ідентифікація по генам фотоперіодичної чутливості сортів озимої м’якої пшениці // Збірник наукових праць СГІ – НАЦ НАІС. – Одеса. – 2007. – Вип. 9.

15. Авсєнін В.І., Файт В.І., Стельмах А.Ф. Використання методів цілеспрямованого маніпулювання генами Vrn м’якої пшениці // Вісник аграрної науки. – 2003. – №7. – С. 39-42.

16. Балашова И.А., Сиволап Ю.М., Файт В.И., Стельмах А.Ф. Использование RAPD-метода для создания ДНК-маркеров к Vrn генам // Цитология и генетика. – 2001. – Т.35, №2. – С. 49-52.

17. Балашова И.А., Календарь Р.Н., Файт В. И., Сиволап Ю.М. Создание ДНК-маркера к локусу Vrn-D1 мягкой пшеницы // Биотехнология. – 2002. – №2. – С. 30-36.

18 Балашова И.А., Файт В.И, Сиволап Ю.М. Маркирование гена Ppd-D1a методом ISSR–ПЦР // Вісник Одеського національного університету. Серія: біологія. – 2002. – Т.7, Вип. 1. – С. 69-74.

19 Балашова И.А., Файт В.И., Сиволап Ю.М. Использование ISSR - и SSR – полиме разной цепной реакции для создания ДНК-маркеров к генам Ppd // Біополімери і клітина. – 2003. – Т.19, №3. – С. 257-261.

20 Балашова И. А., Файт В. И., Завиша Е. К., Сиволап Ю.М. Маркирование гена Vrd озимой мягкой пшеницы // Цитология и генетика. – 2006. – Т.40, №6. – С. 11-15.

21 Gupta P.K. & Varshney K.K. The development and use of microsatellite markers for genet ics analysis and plant breeding with emphasis of bread wheat // Euphytica 113. - 2000-P.163-185.

Селекционно-генетический институт – Национальный центр семеноводства и сортоизучения, Овидиопольская дорога, 3, 65036, г. Одесса, Украина т.: +380-482-395-186 (дом.), e-mail: fayt@paco.net УДК 633.63: 575: 632.52. 577. МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА САХАРНОЙ СВЁКЛЫ (BETA VULGARIS L.) Федулова Т.П.

Одним из наиболее важных аспектов практической генетики и селекции является четкая характеристика генетического материала. Различные сорта и гибриды растений, созданные в процессе селекции, сочетают в своем генотипе уникальные комбинации генов, обеспечиваю щих адаптацию к условиям жизни и необходимый уровень развития хозяйственно ценных при знаков. Особенности набора генов и, следовательно, фрагментов ДНК, по сути представляют «генетический паспорт» сорта. Необходимым является создание надёжной системы молекуляр но – генетических маркеров, выявляющих и отражающих эти особенности.

Внедрение новых технологий, основанных на современных достижениях молекуляр ной генетики, позволяет на новом уровне решать целый ряд теоретических и прикладных во просов селекции и семеноводства (Хавкин, 1997, 2003;

Westphal, 1997;

Кочиева, 1999).

Селекция сахарной свеклы на высокий гетерозис требует применения эффективных методов оценки генетического потенциала этой культуры. Разработка и внедрение в селекци онную практику новых технологий связаны с исследованием ДНК-полиморфизма, выявляе мого с помощью амплификации определенных участков генома. Использование различных вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет оценить генетическое разнообра зие, классифицировать исходный селекционный материал, маркировать гены хозяйственно ценных признаков, новые гены, интрогрессируемые из дикорастущих сородичей, а также тес тировать генетическую однородность инбредных линий и уровень гибридности партий семян F1 (Сиволап, 2003).

С учетом этих критериев основное внимание уделяют методам анализа генома расте ний, основанным на амплификации произвольных или заранее выбранных последовательно стей ДНК с помощью ПЦР. Как показали исследования Ю.В. Анискиной с коллегами (2005), в последние годы получил распространение метод анализа полиморфизма рассеянных уме ренно повторяющихся последовательностей генома, который практически не уступает мик росателлитному анализу по разрешающей способности, но существенно доступнее для селек ционных лабораторий.

В этой связи цель настоящей работы заключалась в определении возможности тестиро вания селекционных образцов сахарной свёклы методом анализа рассеянных повторов.

Материалы и методы Объектом исследований служили проростки и листовые пластинки различных селекци онных материалов сахарной свёклы: МС – линии, опылители – закрепители стерильности «Оуэн»

типа, многосемянные опылители, гибриды на МС-основе из коллекции ВНИИСС.

Геномную ДНК выделяли из объединенных проб зеленых листьев нескольких расте ний модифицированным методом Sagai Maroof с соавторами (1984) и дополнительно очища ли фенольной экстракцией. ПЦР-амплификацию проводили в термоциклере МС-2 Терцик («ДНК-технологии», Россия).

Для анализа полиморфизма рассеянных повторов использовали протоколы ПЦР амплификации и праймеры умеренно повторяющихся последовательностей нуклеотидов Paw S5, Paw S6, Paw S14, Paw S16, Paw S17 к семейству ретротранспозонов R173, (сконструиро ванные Роговским и Шефердом, 1992) и гомологичные их консервативным участкам. Учиты вая перекрестный характер опыления сахарной свеклы, была использована геномная ДНК растений каждого образца. Смешанная геномная ДНК успешно использовалась многими ис следователями при RAPD-анализе других видов сельскохозяйственных растений (Yu, Pauls, 1993;

Huff, Rakall, Smouse, 1993;

Yang, Quiros, 1993;

Javornic, Kump, 1993;

Javornic, Kump, Svetes, 1995;

Суворова, Фунатсуки, Терами, 1999).

Для анализа гибридности были исследованы растения гибридных комбинаций и их родительских компонентов с использованием коммерческих олигонуклеотидных праймеров компании "Биоком" (Москва).

Амплифицированные фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 1,3-1,7% горизонтальном агарозном геле при напряженности электрического поля 5-10 в/с.

Для визуализации фрагментов ДНК к агарозному гелю объемом 50 мл добавляли 3 мкл бро мистого этидия.

Результаты и их обсуждение В результате молекулярно-генетического анализа селекционных материалов сахарной свёклы выявлено, что использованные нами произвольные праймеры в изученных инбредных линиях дают четкие спектры с достаточной степенью полиморфизма (рис.1).

б) а) Рис. 1. Спектры амплифицированных фрагментов ДНК у линий сахарной свеклы.

1-3 - инбредные линии: №№199/96(ф), 94376(2), 93128(3);

4, 8 - отрицательный контроль (вода);

5-7 - апомиктичные линии:

-РФ-70-АР, -МС-80-АР, -МС-94-204-АР;

9 - маркер молекулярной массы 1 кв Gene Ruler;

а) с праймерами PawS5 + PawS6;

б) с праймером PawS16.

Указанные произвольные праймеры при амплификации с геномной ДНК сахарной свеклы выявили от 5 до 18 полос (ампликонов) на образец с молекулярной массой от 250 до 300 п.н. Полиморфные фрагменты, соответствующие продуктам ПЦР, расценивали как еди ничные RAPD-локусы. Наши данные согласуются с результатами исследований, полученны ми на других культурах: ржи (Забродина, Шеденков, Хавкин, 1998), косточковых (Арклис, Высоцкий, Цветков, 2005) и др.

Амплификация с произвольными праймерами (RAPD-ПЦР) позволяет тестировать изменчи вость по ряду неидентифицированных диспергированных по геному локусов. При сравнительном анализе RAPD-спектров шести инбредных линий сахарной свеклы наилучшие результаты были по лучены при амплификации с праймерами PawS5, PawS6 и с парами этих праймеров, а также с парой праймеров PawS16 + PawS17. При этом удалось обнаружить как сходство, так и различия между ис следованными формами по продуктам полимеразной цепной реакции.

Так, из приведенных RAPD-профилей видно, что апомиктичные гамма-линии сахарной свеклы характеризуются большей выравненностью - количество амплифицированных ПЦР продуктов варьировало от 2 до 4-х, тогда как у инбредных линий, созданных традиционными методами, их количество достигало 6-ти. Это связано, по-видимому, с тем, что в процессе соз дания -линий были отобраны формы, гомозиготные по изоферментным локусам.

Анализ RAPD-спектров пробных гибридов и их родительских форм подтвердил гиб ридную природу полученных образцов с высоким уровнем интрогрессии геномов. При про ведении ПЦР наиболее информативные спектры были получены с коммерческими олигонук леотидными праймерами №1 и №2 компании «Биоком» из семейства ретротранспозонов (рис.

2). Ретротранспозоны – мобильные генетические элементы, занимающие более половины все го генома высших растений.

Сравнительный анализ RAPD-спектров гибридных генотипов (F1 – МС -2113 x 15465 и F1 – МС - 2113 x 14840) показал наличие специфического фрагмента ДНК, харак терного для материнского компонента. В результате проведенного молекулярного анализа методом ПЦР у генотипов сахарной свеклы обнаружены существенные отличия между МС формой (1, 7) и фертильными многосемянными опылителями (3, 9, 12), как по количеству ам плифицированных продуктов, так и по размеру этих фрагментов. Больший полиморфизм у исследованных материалов обнаружен при использовании праймера №1.

Рис. 2. RAPD-профили геномной ДНК селекционных материалов сахарной свеклы.

М – маркер молекулярной массы 1kb Gene Ruler (размер некоторых фрагментов указан слева)Праймер №1: 1 – ДНК линии -МС-2113;

2 – ДНК гибрида F1 -МС-2113 x 15465;

3 – ДНК линии №15465 (ГО);

4 – ДНК гибрида F2 -МС-2113 x 15465;

5 – ДНК гибрида F1 -МС-2113 x 14840;

6 – отрицательный контроль (вода).

Праймер №2: 7 – ДНК линии -МС-2113;

8 – ДНК гибрида F1 -МС-2113 x 15465;

9 – ДНК линии №15465 (ГО);

10 – ДНК гибрида F2 -МС-2113 x 15465;

11 – ДНК гибрида F -МС-2113 x 14840;

12 – ДНК линии №14840 (ГО);

13 – ДНК линии «О»-типа -РФ-2113;

14 – отрицательный контроль (вода).

Вместе с тем, более четкое отличие всех изученных образцов выявлено при амплифика ции с праймером №2. При этом -МС-линия 2113 отличается от всех исследованных селекцион ных номеров присутствием фрагмента с молекулярной массой 1000 пн. Данный компонент от сутствует в геномной ДНК многосемянных опылителей 14840 и 15465.

Анализируя данные RAPD-анализа, можно отметить отличие линии опылителя закрепителя стерильности «О-типа» от ее МС-аналога по количеству и размеру амплифициро ванных фрагментов. По-видимому, это объясняется влиянием ядерных генов (xxzz/XXZZ), оп ределяющих стерильность или фертильность цитоплазмы. Однако для более точного тестиро вания типа цитоплазмы необходимо использовать анализ митохондриальных фрагментов ДНК.

Молекулярный RAPD-анализ индивидуальных растений сахарной свеклы при использо вании в качестве праймеров для амплификации случайно выбранных последовательностей стан дартных декануклеотидов фирмы "Operon Technologies" (USA) ОРА 15 и ОРК 10 показал значи тельный полиморфизм как внутри линий, так и межлинейный (рис. 3). Это является, вероятно, следствием гетерозиготности растений сахарной свеклы, как перекрестноопыляемой культуры.

а) б) в) г) Рис. 3. RAPD-спектры генотипов сахарной свеклы с праймерами ОРА 15 и ОРК 10.

а), в) г) 1-6 – -РФ-2093 19 – Льговская одн. 7-12 – -МС-2093 20 – гибрид «Русь»

13-18 – -РФ-2113 21 – Мангольд 19-24 – -МС-2113 22 – Столовая свекла 25 – М маркер ДНК (1 тпн) 23 - М маркер ДНК б), г) б) 1-6 – 15202 19 - М маркер ДНК 7-12 – 13-18 – RAPD-профили с участием праймеров ОРА 15 и ОРК 10 характеризовались специфи ческими фрагментами для всех изученных генотипов сахарной свеклы.

В результате проведенных экспериментов мы подобрали RAPD-маркеры, специфиче ские для фертильных и стерильных линий сахарной свеклы, но не можем утверждать, явля ются они таковыми только для этих селекционных номеров или для целой группы популяций.

Мы полагаем, что при использовании большего числа праймеров или же анализа полимор физма микросателлитных локусов можно обнаружить специфические RAPD-или SSRP - мар керы для каждого сорта и гибрида. В дальнейшем планируется использование большего ко личества праймеров и микросателлитных повторов для выявления уникальных локусов гено ма у каждого из селекционных образцов сахарной свеклы.

Не исключено также, что полный анализ ядерного и цитоплазматического геномов может показать иную степень отличия, нежели обнаруженная в данном исследовании.

Таким образом, метод полимеразной цепной реакции расширяет возможности сравни тельного анализа и способствует получению более объективных данных об изменчивости генома сахарной свеклы. Дальнейшие наши исследования будут направлены на совершенствование дан ного метода для решения задач паспортизации, экспертизы районированных сортов и гибридов сахарной свеклы, создания каталогов генотипических формул и компьютерной базы данных.

Заключение Приведенные сведения по использованию ДНК – маркеров, выявляемых на основе RAPD – метода, свидетельствуют, что данный метод высокоэффективен для внутривидового сравнения разных геномов и дает возможность улавливать генетические различия между сор тами, линиями и даже отдельными экземплярами одного и того же вида. Выявление внутри видовых различий на уровне ДНК – маркеров имеет важное практическое значение для ха рактеристики разных линий и создания гетерозисных форм растений.

Анализ генотипов сахарной свеклы с помощью RAPD-технологии показал, что при тщательном подборе условий проведения ПЦР и олигонуклеотидных праймеров удается по лучать -спектры, специфичные для отдельных селекционных номеров. Использование разных праймеров позволяет выявлять степень полиморфизма среди генотипов одного сорта. Выяв ленная нами полиморфность ДНК у изученных генотипов сахарной свеклы свидетельствует о генетической неоднородности исследованного селекционного материала, что во многом оп ределяется методом его создания.

RAPD-технология, использованная нами при анализе генотипов может с успехом применяться для проведения идентификации селекционных материалов, и в перспективе для маркирования хозяйственно ценных признаков. Идентификация сортов и гибридов сахарной свеклы позволяет создать систему регистрации генотипов культурных видов растений и мо жет наряду с другими методами оценки стать средством правовой защиты селекционных дос тижений. Предлагаемая технология может найти самое широкое применение в селекции, се меноводстве и фундаментальных исследованиях генома сахарной свеклы.

Литература 1. Анискина Ю.В. ДНК-генотипирование растений родов Brassica и Solanum /Ю.В.

Анискина, В.А. Бирюкова, Н.С. Велишаева, А.А. Панкин, Т.А. Прибывалова, Э.Е. Хавкин, И.

А. Шилов //Сельскохозяйственная биология. – 2005, №1. – С.110-118.

2. Арклис О.В. Идентификация косточковых культур с помощью молекулярных марке ров / О В. Арклис, Высоцкий В.А., И.Л. Цветков // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы III Моск. Междун. конгресса. – Москва, 14 – 18 марта 2005, М. С. 223.

3. Забродина М.В. Сравнение многолетней и однолетней ржи методом ПЦР амплификации случайных и известных последовательностей / М.В. Забродина, А.А. Шаден ков, Э.Е. Хавкин // Биотехнология. - 1998. - № 3. - С. 82-86.

4. Зайцев В.С. ДНК-генотипирование сортообразцов вишни и черешни /В.С. Зайцев, Д.Н. Мицых, Э.Е. Хавкин //Сельскохозяйственная биология. – 2005, №3. – С.123-125.

5. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома / Е.З. Кочиева // Сельскохозяйственная биоло гия, 1999. - № 3. - С.3-14.

6. Сиволап Ю.М. ДНК i генетична специфiчность /Ю. М. Сиволап // Фактори експе риментально еволюцi организмiв. – Кив: Аграрна наука, 2003. –С. 375 – 380.

7. Суворова Г.Н. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill., установленное на основе RAPD-анализа /Г.Н. Суворова, Х. Фукатсуки, Ф.

Терами // Генетика. - 1999. - Т. 35, № 12. - С. 1659- 1664.

8. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хавкин // Сельскохо зяйственная биология, 1997. - № 5. - С. 3-21.

9. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е. Хавкин //Сельскохозяйственная биология. - 2003.

- № 3. - С. 26-41.

10 Javornic B. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in buckwheat / B.Javornic, B.Kump // Fagopyrum, 1993. - N 3. - P. 35-39.

11. Javornic B. Use of genetic markers in studies of common buck wheat / B.Javornic, B.Kump // Proc. 6th Int. Symp. on Buckwheat. Japan, 1995. -P. 141-147.

12 Rogovsky P.M. // Genome / P.M. Rogovsky, K.W. Sherpherd. – 1992. – V. 35, №4. – P.

621 – 626.

13 Sagai-Maroof M.A. / M.A. Sagai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - V.81, № 12. - P. 8014-8018.

14 Westphal Lore. Genetiche Marker in der Zuchtung / L.Westphal //TASPO- Gartenban mag. - 1995. – 4, № 1. - P. 12.

15 Yang X. Identification and classification of celery cultivars with RAPD markers / X.

Yang, C. Quiros // Theor. Appl. Genet. - 1993. -V.86. - P.205-212.

16 Yu K. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of al falfa by random amplification of bulked genomic DNA samples / K. Yu, K.P. Pauls // Theor. Appl.

Genet. - 1993. -V. 86. - P. 788-794.

ВНИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова 396030, Воронежская область, Рамонский район, п. Рамонь т.: (47340) - 2-18- БИОТЕХНОЛОГИЯ УДК 633.63:631.527. ЭМБРИОКУЛЬТУРА КАК МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Васильченко Е.Н., Жужжалова Т.П., Подвигина О.А.

Межвидовая гибридизация является основным, неисчерпаемым источником получе ния новых форм растений, возникающих в результате рекомбинации наследственного мате риала (Кравченко и др., 1988).

Все виды дикой свеклы обладают рядом ценных признаков и скрещивание их с куль турной свеклой может представлять большую практическую ценность. Так у диких форм свеклы отмечены холодо- и зимостойкость, засухоустойчивость, односемянность, устойчи вость к болезням и вредителям ( в частности к нематоде), склонность к агамоспермии. Нали чие апомиктического размножения установлено у некоторых видов дикой свеклы: Beta corolliflora, Beta trigyna, Beta lomatogona. Многолетние широкомасштабные работы по скре щиванию с видами из секции corollinae с целью передачи склонности к апомиксису культур ным формам сахарной свеклы не увенчались успехом (Jassem, 1976). В настоящее время со временная техника культуры зародышей и тканей делает реальным более интенсивное вовле чение диких сородичей в работу по переносу желаемых генов от диких форм в культурные сорта сельскохозяйственных культур.

Проведенные нами исследования по получению и доращиванию в условиях in vitro не зрелых зародышей межвидовых гибридов Beta vulgaris и Beta corolliflora, показали возможность проведения этих работ и их дальнейшее использование в селекционной практике.

Введение в культуру in vitro незрелых зародышей межвидовых гибридов на разных ста диях развития (5-12 день после опыления) показало их различную отзывчивость на стрессовые условия. Недифференцированные гибридные зародыши (5-ти дневные) прорастали на пита тельной среде с частотой 0,9-7,3 %, но проростки на ранних стадиях развития погибали. С уве личением возраста зародышей их жизнеспособность увеличивалась и достигала 25,0 %. При этом также отмечалась ранняя гибель проростков и образование неморфогенных структур разрастание тканей гипокотиля, витрификация семядольных листочков, точек роста и др. В ре зультате этого выживаемость проростков снижалась до 12,5 %.

Одним из основных факторов при культивировании зародышей является состав пита тельной среды. Экспериментальные данные, полученные нами в ходе исследований, подтвер дили тот факт, что незрелым зародышам в возрасте 3 дней для дальнейшего развития требо валось наличие большого содержания сахарозы и гормонов в питательной среде. Количество нормально развитых проростков при этом не превышало 5%. С увеличением возраста за родышей их потребность в гормонах несколько снижалась, а количество нормально развитых проростков увеличивалось до 12 %. Однако следует отметить, что независимо от возраста зародышей, частота образования проростков увеличивалась при наличии в питательной среде большого количества сахарозы (табл. 1).

Так, культивирование 8-ми дневных зародышей приводило к формированию 10,0-25, % растений на среде с 20 г/л сахарозы, а содержание 40 г/л углеводов стимулировало регене рацию 17,8-48,6 % введенных эксплантов.

Определенное значение при культивировании незрелых зародышей имеет и темпера турно-световой режим. В ходе исследований было выявлено, что незрелые зародыши сахар ной свеклы в условиях культуры тканей развивались как на свету, так и в темноте. В темно вых условиях культивирования происходило формирование большего количества недиффе ренцированных структур - каллусы, разросшиеся и витрифицированные ткани листьев и ги покотилей. Это увеличивало общее количество полученных проростков с 4,0 до 48,6 %, но одновременно снижало и образование нормально развитых регенерантов с 18,9 до 2,7 %.

Культивирование эксплантов на световом режиме снижало формирование недифференциро ванных структур и положительно влияло на развитие жизнеспособных проростков, количест во которых увеличивалось с возрастом зародышей до 2,5-9,0 %.

Таблица 1 - Влияние состава среды и возраста зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro № Гормон. Кол-во 3 дня 5 дней 8 дней состав сахара, Получено проростков среды, мг/л г/л всего, норм. всего, норм. всего, норм.

% разви- % разви- % разви тых,% тых,% тых,% 1 0 20 3,1 1,5 17,1 14,3 10,0 10, 2 0 40 4,0 2,0 2,5 0 17,8 17, 3 Гк, Кн, 20 0 0 1,0 0 33,3 25, БАП-0, 4 Гк, Кн, 40 7,5 5,0 4,0 0 31,1 33, БАП-0, 5 Гк, Кн, 20 1,7 1,7 12,0 12,0 24,4 24, БАП-0, 6 Гк, Кн, 40 1,7 1,7 12,0 12,0 48,6 48, БАП-0, 7 Гк,Кн-0,1 20 3,1 1,5 13,3 6,7 26,7 23, НУК-0, 8 Гк,Кн-0,1 40 8,9 4,5 10,0 10,0 30,0 30, НУК-0, НСР05 0,31 0,31 1,19 1,18 1, Культивирование проростков от межвидовых скрещиваний выявило наличие морфоло гических признаков диких видов свеклы. На начальных этапах своего развития у части регене рантов обнаружилась яркая антоциановая окраска гипокотиля и черешков листьев, которая со хранялась на всех этапах микроразмножения. Внешний вид микроклонов соответствовал ди ким видам свеклы. Растения имели длинночерешковые листья, яйцевидной, стреловидной фор мы, цельнокрайние, остроконечные, основание листа выемчатое, темнозеленой окраски.

Другая же часть микроклонов сохраняла признаки материнской формы: короткоче решковые листья, слабогофрированные, светло-зеленой окраски ( рис.1).

а б Рис. 1. Внешний вид микроклонов в культуре in vitro а - признаки материнской формы;

б - признаки отцовской формы На гистограмме, полученной при проведении проточной цитометрии (ПЦМ), представлены классы клеток разных уровней плоидности исходных форм и межвидового гибрида (рис. 2) а б Обозначения: на оси абсцисс (х-axic) представлены классы клеток разных уров ней плоидности: пик 1 - соответствует уровню плоидности (диплоидный;

тетрап лоидный;

триплоидный);

пик2 - обознача ет количество делящихся клеток. На оси ординат (y- axic) показано количество анализируемых клеток в каждом классе.

в Рис.2. Анализ плоидности растений свеклы а - исходная материнская форма (2n=18);

б - исходная отцовская форма (2n=36) в - межвидовой гибрид (2n=27) Результаты проведенных исследований позволили разработать методику культивиро вания незрелых зародышей сахарной свеклы. Лимитирующими факторами, обеспечивающи ми наибольший уровень регенерации, являются: 8-12 дневный возраст зародыша (период ак тивной дифференциации тканей), температурно-световой режим и состав питательной среды В5 включающей 40 г/л сахарозы.

Дальнейшее культивирование в условиях закрытого грунта позволило выделить три формы растений отличающиеся морфологическими признаками (рис. 3).

Отдельные растения наследовали материнские признаки: диплоидный набор хромо сом (2n=18), зеленую окраску гипокотиля, прямостоячую розетку, слабогофрированную фор му листьев, высокую раздельноплодность - 98 %, стерильность -100 %, коническую форму корнеплода. При самоопылении данные формы завязывали семена, что свидетельствует о склонности к апомиктичному способу размножения.

Другие растения оказались гибридными с триплоидным набором хромосом (2n= 27).

Вместе с тем они имели розовую окраску гипокотиля, удлиненную форму листьев и были похожи на дикую свеклу. Для них была характерна раскидистая розетка, сростноплодность, отсутствие завязываемости семян, мужская стерильность, развлетвленная форма корнепло да. Следует отметить, что развитие межвидовых гибридов сопровождалось образованием многочисленных партикул на цветоносном стебле (рис.4).

а б Рис. 3. Внешний вид растений от межвидовой гибридизации в стадии розетки.

а - мофологические признаки материнской формы;

б - морфологические признаки отцовской формы а б Рис. 4. Растения сахарной свеклы полученные в результате межвидовой гибридизации а - диплоидная форма;

б - триплоидная форма Полученные данные позволили выделить маточные растения сахарной свеклы, обла дающие склонностью к апомиктичному способу размножения и межвидовые гибриды, кото рые требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, метод эмбриокультуры можно использовать для создания принципи ально новых растений сахарной свеклы на основе отдаленной гибридизации, позволяющий объединять в своей наследственности различные ценные признаки и свойства культурных и дикорастущих видов.

Литература 1. Кравченко А.Н. Методы гаметной и зиготной селекции томатов / А.Н. Кравченко, В.А. Лях, Л.Г. Тодераш, Т.И. Салтанович, М.К. Паскал. - Кишинев: Штиинца, 1988. - 152 с.

2. Хохлов С.С. Гаплоидия и селекция / С.С. Хохлов, В.С. Тырнов, Е.В. Гришина. - М.:

Наука, 1976. - 221 с.

3. Jassem B. Embryology and genetics of apomixis in the section Corollinae of the genus Beta / B. Jassem // Acta. Biol. Cracovensia. Ser. Botanica. - 1976. - v.19. - P. 151-172.

ВНИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова 396030, Воронежская область, Рамонский район, п. Рамонь УДК 633.112.9:631. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РАЗНОКАЧЕСТВЕННОСТЬ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА КАК ФАКТОР АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ТРИТИКАЛЕ Высоцкая И.Б., Барыльник К.Г.

При культивировании пыльников злаков исследователи встречаются с рядом трудностей, многие из которых являются общими для всего семейства Gramineae: низкий выход эмбриоидов и каллуса, трудности в регенерации целых растений, высокая доля среди них альбиносов. Из от дельных, зачастую наиболее ценных генотипов вообще не удается получить регенеранты. Не смотря на это, данный метод привлекает к себе внимание в связи с возможностью его использо вания для повышения эффективности селекционной работы, а также для преодоления проблем, решение которых затруднено традиционными способами. Нами сделана попытка адаптировать метод культуры пыльников in vitro для относительно новой сельскохозяйственной культуры, по лученной на основе отдаленной гибридизации – тритикале ( Triticosecale Wittmack).

Исходным материалом для исследований служили 6 сортов однолетних зерновых, 7 сортов однолетних кормовых и 6 линий многолетних гексаплоидных тритикале селекции СНИИСХ (за исключением сорта МАД-1) (таблица 1). В качестве донорных использовали растения выращенные в полевых условиях. Отбор колосьев для культивирования пыльников проводили на стадии поздней одноядерной микроспоры, которую определяли на временных ацетокарминовых препаратах по об щепринятой методике. Этапы созревания пыльцы сопоставляли с морфологическими признаками растений. Применяли 3-х–20-ти дневную предобработку колосьев при температуре +4 оС. В работе использовали картофельные среды Potato-II (Pt-II) и N6. Выход новообразований и регенерантов учитывали в процентах относительно числа посаженых пыльников, а регенерационную способ ность - как процент регенерантов от числа полученных новообразований.

Большинство исследователей сходятся во мнении, что особенности генотипа донорных рас тений являются решающим фактором, определяющим эффективность андрогенетических процессов, протекающих в культуре пыльников [6,11]. В этой связи в задачу наших исследований входила оцен ка рабочей коллекции тритикале с целью выявления наиболее отзывчивых генотипов.

В первой серии опытов удалось выявить различия между тремя группами сортов – кормо выми, зерновыми и многолетними (таблица 2). Указанные группы с высокой степенью достоверно сти отличались по выходу каллусов, регенерантов и зеленых растений на 100 пыльников, а также по выходу регенерантов и зеленых растений к числу образовавшихся каллусов.

По частоте индукции новообразований зерновые формы превзошли кормовые в 1, раза, многолетние – в 7,6 раза;

выход регенерантов у зерновых сортов по сравнению с кормо выми был выше в 5,8 раза, выход зеленых растений – в 20 раз. Также обнаружено, что много летние формы тритикале характеризуются не только низкой индукцией андрогенетических структур на первичных средах, но и полным отсутствием у новообразований регенерационных процессов. Что касается уровня андрогенеза внутри каждой из указанных групп сортов, то ко личество новообразований у зерновых сортов колебалось в пределах от 0,82 до 6,32 %, у кор мовых – от 0 до 2,89 %, у многолетних - от 0 до 0,86 %.

Поскольку процесс индукции андрогенеза связан с влиянием целого ряда неконтролируемых факторов, нами проведено повторное изучение андрогенетической активности четырех кормовых и четырех зерновых сортов из числа изученных ранее. Полученные данные подтвердили выявленные различия между двумя группами сортов, при этом кормовые сорта проявили на порядок меньший уровень андрогенетической отзывчивости по сравнению с зерновыми формами. И хотя однолетние зерновые тритикале достоверно превзошли кормовые и по количеству новообразований на первич ных средах, и по числу регенерантов на 100 пыльников, в том числе зеленых, существенных различий по регенерационной способности между указанными группами не обнаружено.

Таблица 1 - Происхождение сортов и селекционных линий тритикале Сорта однолетних зерновых тритикале МАД-1 (Безостая 1 Саратовская крупнозерная) МТ 39, Bronco 90 (яровые тритикале) Благодарный Ставропольский 3 Ставропольский зерновой АНЦ-18 Тритикале Анциферова (биологические мутанты) 17081 45/7-506 Ставропольский зерновой 16838 АД 206 Градо Ставропольский зерновой (АД 206 Armadillo 133) своб. опыление Сорта однолетних кормовых тритикале Гранник (Безостая 1 Популяция 4 (мн. рожь)) АД Безостая 1 мн. рожь, Популяция Двуручка (Безостая 1 мн. рожь) мн. ПРПГ (82 а) типа ПР-АД Двуручка [(Лютесценс Г-39120 мн. рожь) Ставропольский-1] своб. опыление Ставропольский [(Леукурум 1364/1 S. montanum) S. derzhavinii Tzvel.] (Алабасская S. derzhavinii Tzvel.) Ставропольский (Эритроспермум 49801 Державинская 24) своб. опыление Ставропольский Отбор из Ставропольского-2: (Алабасская S. derzhavinii Tzvel.) {[( Леукурум 1364/1 S. montanum) S. derzhavinii Tzvel.] (Tr. аestivum S. derzhavinii Tzvel.)} Линии многолетних тритикале ЛА (Алабасская S. derzhavinii Tzvel.) (Леукурум 1364/1 S. montanum) С- МАД-1 177 (отбор из остистой гибридн. попул. мн. тритикале) Кл. {(Алабасская мн. рожь) [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь]} (Tr. durum A. intermedium) Кл. 244, С-1593 {{ (Алабасская мн. рожь) [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь]} (Tr. durum A. intermedium)} [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь] Кл. 310, С-1593 {{ (Алабасская мн. рожь) [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь]} (Tr. durum A. intermedium)} [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь] Кл. 354, С-1596 {{ (Алабасская мн. рожь) [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь]} (Tr. durum A. intermedium)} [(Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь[( Леукурум 1364/1 S. montanum) мн. культ. рожь] (Гостианум мн. рожь) Таблица 2 - Андрогенез in vitro сортов тритикале Новообразований Регенерантов Зеленых растений Число изученных ных пыльников, Число посажен % от % от % от числа % от числа Сорта числа числа % от числа генотипов шт. шт. ново- шт. новообразо пыльников пыльни- пыльни образо- ваний ков ков ваний шт.


Зерновые 6 5420 164 3,12 53 1,01 32,31 40 0,76 24, Кормовые 7 5890 104 1,76 9 0,15 8,65 2 0,03 1, Опыт Многолетние 6 4340 18 0,41 0 0 0 0 0 Fфакт. - - - 49,03* - 38,37* 26,40* - 36,19* 38,51* НСР05 - - - 0,29 - 0,14 4,88 - 0,11 3, Зерновые 4 6720 162 2,41 21 0,31 12,96 9 0,13 5, Опыт Кормовые 4 4650 36 0,77 3 0,06 8,33 1 0,02 2, Fфакт. - - - 43,73* - 8,03* 0,61 - 3,95 0, Примечание: *- данные достоверны на 99 % уровне значимости Точно указать причины различной способности к андрогенезу внутри изучаемых групп сортов тритикале на сегодняшний день не представляется возможным. Так, например, низкую частоту индукции андрогенетических структур твердой пшеницы по сравнению с мягкой связывают с ролью хромосом различных геномов. В частности, культивирование пыльников моносомных линий мягкой пшеницы Чайнз Спринг показало значительное влия ние I D хромосомы на индукцию андрогенеза при культивировании пыльников [1]. Имеются сведения о том, что сорта пшеницы, имеющие ржаную транслокацию 1В/1R, характеризуют ся высокими морфогенетическими потенциями в культуре пыльников [9].

На наш взгляд, причины указанных различий могут быть связаны как с генотипиче скими особенностями изучаемых групп, в частности, наличием D/R замещений в геноме зер новых форм, так и с различными требованиями сортов к условиям культивирования. Причи ной низкого андрогенетического потенциала многолетних форм, по-видимому, является сложная структура их генома и, как следствие, хромосомная нестабильность в процессе де ления клеток. Другой причиной может являться отсутствие в геноме многолетних форм три тикале генетического материала мягкой пшеницы и наличие в нем хромосом пырея сизого (A. intermedium), детерминирующих свойство многолетности.

Скрининг материала по эффективности гаплопродукции позволил выделить 5 сортов, характеризующихся высоким уровнем индукции новообразований, стабильной регенерацией и представляющих наибольший интерес в плане включения их в дальнейшую работу по культи вированию пыльников (таблица 3). Изучение андрогенетических характеристик у данных сор тов подтвердило достоверное влияние генотипических различий донорного материала на по казатели андрогенеза in vitro. Несмотря на генетическое родство сортов Благодарный, 17081 и Ставропольский зерновой, между ними имеются существенные различия, как по индукции новообразований, так и по способности к регенерации.

Наибольшей продуктивностью по общему выходу андрогенетических структур и ре генерантов от числа посаженых пыльников выделился сорт 17081. Сорт Двуручка 77 обна ружил максимальный выход регенерантов относительно числа полученных новообразований.

Таким образом, высокий уровень индукции новообразований не всегда сопровождается высо ким процентом их регенерации, что подтверждает ранее высказанное предположение о неза висимом генетическом контроле частоты образования андрогенетических структур и частоты регенерации из них растений [8,10].

В целом, способность тритикале к образованию эмбриогенных структур в среднем по все му материалу составила 2,2 % с колебаниями по группам от 0,41% до 3,12 %, а по отдельным гено типам от 0 до 6,32 %. Сходные результаты получены Т.В. Егоровой при изучении коллекции мест ных сортов и гибридных форм тритикале [2]. В то же время имеются данные о более высоком уровне каллусогенной активности тритикале, который колеблется в зависимости от генотипа и ус ловий культивирования в широких пределах: 1 – 42% [4];

1,53 – 22,78 % [5];

0,6 – 9,1 % - у гомози готных форм и 1,4 – 30,7 % - у гибридов, (в среднем по всему материалу – 2,35%) [3].

Таблица 3 - Влияние генотипических особенностей на формирование андрогенетических структур в культуре пыльников тритикале Результаты морфогенеза Выход но Выход регенерантов, Выход зеленых Выход альбиносов, вообразо Сорт % растений, % % ваний от числа от числа от числа от числа от числа от числа (н/о), % пыльников н/о пыльников н/о пыльников н/о МАД-1 3,77 0,73 10,45 0,22 3,19 0,51 7, Благодарный 1,10 0,05 3,13 0,00 0,00 0,05 3, 17081 8,24 1,85 18,26 1,65 16,25 0,20 2, Ст. зерновой 0,71 0,10 6,25 0,1 6,25 0 Двуручка 77 2,23 1,00 69,44 0,66 28,61 0,34 40, Fфакт. 46,25* 11,69* 4,88* 13,84* 3,00* 2,81 4,4* НСР 1,36 0,57 14,86 0,67 9,23 0,35 9, Примечание: *- данные достоверны на 95 % уровне значимости Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что именно геноти пическая специфичность исходного материала является ключевым моментом в индукции андрогенеза in vitro. А поскольку известно, что способность к культивированию in vitro мож но увеличить комбинационным скрещиванием [1,7], повышать эффективность андрогенеза малоотзывчивых генотипов тритикале необходимо за счет гибридизации с формами, имею щими высокий андрогенетический потенциал.

Литература 1. Дьячук Т.И., Столярова С.В., Носова Н.Н. Культура пыльников межвидовых гибри дов пшеницы и тритикале // Биологические основы селекции. – Саратов: Сб. науч. тр.

НИИСХ Юго-Востока, 1991. - С. 35 - 40.

2. Егорова Т.В. Первичная среда как фактор, влияющий на реализацию потенциальных возможностей различных генотипов тритикале в культуре пыльников // Биотехнология и селекция кормовых культур. - Ставрополь: Сб. научн. тр. СНИИСХ, 1990. - С. 3 – 23.

3. Павлюк Н.Т., Гончаров С.В., Ващенко Т.Г. Андрогенез в культуре пыльников три тикале // Биологические основы и методы селекции и семеноводства культурных растений. – Воронеж: Сб. научн. тр. ВГАУ, 1997. - С. 60-70.

4. Пинчук И.И., Барбул А.И., Смирнов В.А. Культура пыльников тритикале // Генетика и селек ция тритикале в Молдове. – Кишинёв: Институт генетики АН Республики Молдова, 1992. - С. 83-102.

5. Созинов А.А., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Индукция гаплоидных растений три тикале при культивировании пыльников // Генетика, селекция и агротехника тритикале: Сб.

научн. тр. ВСГИ, 1980. С.7 – 20.

6. Baenzieger P. S., Kudirka D. Т., Schaeffer G. W. The significance of doubled haploid variation.

Gen manipulation in plant improvement. 16th Sadler Gen. Symp. N. Y. - L., 1984. - P. 385 - 413.

7. Bullock W.P., Baienziger P.S., Schaeffer G.W. Anther culture of wheat (Triticum aesti vum L.) F1’s and their reciprocal crosses // Theor. Appl. Genet. - 1982. - 62. - P. 155 - 159.

8. Foroughi-Wehr B., Friedt, W., Wenzel G. On the genetic improvement of androgenetic haploid formation in Hordeum vulgare L. // Theor. Appl. Genet. - 1982. - 62. - P. 233 - 239.

9. Henry Y., De Buyser J. Effect on the 18/1R translocation on anther culture ability in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Cell Reports. - 1985. - 4. - P. 307 - 310.

10. Lasar M.D., Baenziger P.S., Schaffer G.W. Combining abilities and habitability of callus formation and plantlet regeneration in wheat (Tr. aestivum L.) anther culture // Theor. Appl. Genet. 1984b. - 68. - P. 131 – 134.

11. Lashermes P., Beckert M. Genetik control of material haploidy in maise (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines // Theor. Appl. Genet. - 1988. - 76. - 3. - P. 401 - 410.

Ставропольский ГАУ, пер. Зоотехнический 12, т.: (8652) 35-64-50;

39-72- e-mail: agrostgau@mail.ru;

cniiiad@stgau.ru УДК 633.853.494:578.083/084.085. КУЛЬТУРА НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ IN VITRO КАК СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОТДАЛЕННЫХ ГИБРИДОВ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА BRASSICACEAE Котлярова Е.Б.

Отдаленная гибридизация является важнейшим методом селекционной работы, уско ряющим и расширяющим возможности изменения генетического потенциала ярового рапса (Brassica napus L.). Она позволяет решить такие задачи селекции рапса, как получение семян с жёлтой семенной оболочкой, в которых содержится больше белка, масла и меньше сырых волокон, чем в таковых чёрной окраски (Потапов, 2004), изменение жирнокислотного состава масла, повышение урожайности и устойчивости к вредителям и болезням и т. д.

Большим препятствием к получению полноценных отдаленных гибридов является проблема постгамной несовместимости, вследствие которой наблюдается недоразвитость гибридных семян, особенно зародышей и отсутствие или неполное развитие эндосперма. В связи с этим в селекции перспективно использование биотехнологических методов, а именно метода эмбриокультуры, или культивирования незрелых зародышей в условиях in vitro.

С целью получения желтосемянных форм рапса, а также переноса устойчивости к альтернариозу, в полевых и тепличных условиях проводили реципрокные межвидовые скре щивания рапса (Brassica napus, 2n = 38, F5 (Харьков 6 Hanna)) с горчицей сарептской (B.

juncea, 2n = 36, сорт ВНИИМК 13) и межродовые скрещивания рапса (F3 (6B F(CHk L159) (ВНИИМК 162 ВНИИМК 109)) с горчицей белой (Sinapis alba, 2n = 24, сорт R 166).

Закладка питомника, наблюдения, уход за посевами и гибридизация проводились со гласно общепринятым методикам (Руководство по селекции и семеноводству масличных культур, 1967). Морфологическое описание гибридов осуществляли по методике ВИРа (Клас сификатор вида Brassica napus L., 1983).

Незрелые зародыши вводили в культуру in vitro на разных стадиях развития (5, 7, 10, 13 и 17 дни после опыления). Культивирование зародышей проводили на агаризованной пи тательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, БАП, кинетина, ГК, НУК и гидролизата казеина в различных количествах и соотношениях. Незрелые зародыши культи вировали в термальной комнате на свету при 16-часовом фотопериоде и в темноте, при тем пературе 23 – 26 С и освещённости 5 тыс. люкс.

Получение истинных межродовых гибридов горчицы белой с рапсом в полевых усло виях затруднено. Проведенные исследования показали, что эффективность гибридизации на ходилась на низком уровне и достигала 1,2 % в прямом и 0,2 % в обратном скрещиваниях. Из за гибели зародышей in vivo образующиеся семена становились стерильными, невыполнен ными или не образовывались совсем.


Применяя культуру незрелых зародышей, регенерацию проростков (1,9 %) наблюдали при использовании рапса только в качестве материнской формы. В обратных скрещиваниях регенерация у гибридных зародышей не отмечалась (табл. 1).

Таблица 1 – Использование эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов рапса Получено Опылено Культиви Комбинация растений Отношение Морфотип цветков, шт ровалось заро скрещивания В/А растения шт (А) дышей, шт % (В) 4 гибридных, B. juncea 98 73 12 16,4 0, материнских B. napus 1 гибридный, B. napus B.

106 129 4 3,1 0, материнских juncea Sinapis alba B.

132 56 0 0 0 napus B. napus 110 155 3 1,9 0,027 3 гибридных Sinapis alba Скрещивания рапса ярового с горчицей сарептской проходили более успешно, но эф фективность гибридизации находилась на невысоком уровне – 5,6 % и 1,7 % в обратных скрещиваниях.

Увеличить жизнеспособность зародышей в 1,8 в прямом и в 2,9 раза в обратном скрещи вании удалось с применением эмбриокультуры. При использовании рапса в качестве отцовского компонента скрещивания средняя частота образования проростков (16,4 %) была в 5,3 раза боль ше, чем в прямых скрещиваниях (3,1 %). Полученные результаты подтверждают литературные данные о получении максимальной частоты образования проростков, если B. juncea использова лась в качестве материнской формы, а B. napus - в качестве отцовской (Bajaj еt al., 1986).

Кроме того, в обратных скрещиваниях было получено больше растений с гибридным морфотипом – 4 из 12 (33,3 %). Таким образом, в скрещиваниях рапса с горчицей белой наи более эффективным оказалось культивирование гибридных зародышей от прямых скрещива ний, а с горчицей сарептской – от обратных скрещиваний.

Результаты проведенных исследований показали, что на развитие оплодотворенных семязачатков в культуре in vitro оказывает влияние целый комплекс лимитирующих факто ров, одним из которых является возраст эксплантов. Известно, что успех культивирования прежде всего зависит от стадии развития зародышей и степени их дифференцировки в мо мент изоляции. Так, недифференцированные гибридные 5-дневные зародыши (ранняя глобу лярная стадия) не прорастали на питательной среде ни в одной из комбинаций скрещивания.

Наиболее эффективным было извлечение недоразвитых зародышей на глобулярной и началь ной сердечковидной стадиях (10 - 17 дни после опыления), что согласуется с литературными данными (Takeshita et al., 1980;

Zhang et al., 2003).

У зародышей, изолированных на 17 день после опыления, наблюдалась наибольшая частота регенерации как в скрещиваниях рапса ярового с горчицей белой (3,5 %), так и с гор чицей сарептской (54,5 %) (рис. 1).

Однако, для прямых скрещиваний B. napus B. juncea наибольшее число регенеран тов было получено при эксплантировании оплодотворенных семязачатков через 13 дней по сле опыления (25 %), а на 17 день, наоборот, не наблюдалось регенерации.

Помимо возраста зародышей, важным фактором при культивировании гибридных за родышей в условиях in vitro являлся состав питательной среды, а вернее, гормональный ком плекс. Было установлено, что большое количество цитокининов в варианте среды № 2 (6 БАП - 0,3 мг/л, кинетин -0,1 мг/л) снижало частоту регенерации до 1,1 %, а количество нор мально развитых проростков – до 0,7 % (табл. 2).

Таблица 2 – Влияние состава среды на жизнеспособность гибридных зародышей в условиях in vitro Соотношение Получено проростков, % Вариант сред БАП:кинетин:НУК:ГК:гидролизат казеина всего нормально развитых 1.(st) Без гормонов 0 2. 0,3 : 0,1 : 0 : 0,1 : 0 1,1 0, 3. 0,3 : 0 : 0,1 : 0 : 0 3,2 1, 4. 0,3 : 0 : 0,1 : 0,1 : 0 4,5 3, 5. 0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 0 12,3 12, 6. 0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 300 6,8 5, 7. 0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 30 8,9 6, НСР05=1,03 НСР05=0, Добавление НУК и ГК стимулировало регенерацию 4,5 % зародышей. Уменьшение концентрации 6-БАП с 0,3 до 0,2 мг/л, а также увеличение концентрации ГК до 0,2 мг/л по зволило получить максимальное количество нормально развитых проростков (12,0 %). При этом добавление 300 мг/л гидролизата казеина снижало общее количество полученных про ростков с 12,3 до 6,8 %. Таким образом, оптимальным оказалось содержание в составе среды 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

54, Комбинация скрещивания:

Р- B. napus B. juncea д 40 Р - B. juncea B. napus д Частота регенерации, % Р- Sinapis alba B. napus 23, д 20 Р- B. napus Sinapis alba д 7,7 10 РB. campestris B. oleracea 3, 2, 2,3 2,6 2 д 00 Рис. 1. Влияние возраста зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro 2 3 71 10 13 Количество дней после опыления Определенное значение при культивировании незрелых зародышей имел и световой режим. В результате проведенных исследований установлено, что незрелые зародыши в ус ловиях культуры тканей развивались как в темноте, так и на свету. Однако, в темновых усло виях происходило формирование большего количества витрифицированных (оводненных) тканей листьев и гипокотилей полученных проростков. При относительно равном количестве общего числа полученных проростков (4,0 % и 4,2 % соответственно) образование нормально развитых регенерантов повышалось с 1,3 % в условиях темноты до 3,7 % на световом режиме.

Наиболее развитые гибридные растения размножали на среде с БАП, кинетином и гиббе реллином до необходимого количества, укореняли на среде с НУК и переносили в грунт, состоя щий из смеси песка и почвы в соотношении 1 : 3. Растения накрывали стеклянными стаканчика ми, которые удаляли по мере акклиматизации и проводили обычный уход за растениями.

В результате исследований было получено 16 растений от скрещивания рапса ярового и горчицы сарептской, большинство из которых (69 %) имели морфологические признаки ма теринской формы. Как в условиях in vitro в фазе 2-3 листьев, так и взрослые растения не от личались от горчицы сарептской по окраске, волнистости и зубчатости края листа, его поло жению на стебле, наличию опушенности и другим признакам (рис. 1).

Рисунок 1. Гибридные растения от скрещивания рапса ярового и горчицы сарептской в условиях in vitro Более 67 % полученных от скрещивания рапса и горчицы белой растений обладали низкой жизнеспособностью в культуре in vitro и в условиях закрытого грунта. Выжившие гибриды на стадии 2 - 3 листьев по некоторым морфологическим признакам были аналогич ны горчице белой (отцовской форме): имели сильное опушение и среднюю степень антоциа новой окраски семядолей. Данные результаты подтверждают истинность полученных гиб ридных растений. Кроме того, морфологическое описание гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового показало промежуточное наследование некоторых признаков (табл. 3).

Промежуточное наследование таких признаков, как характер изгиба верхушки листа и опушенность края первого листа согласуются с описанными в литературе (Жидкова и др., 2005).

Растения первого поколения отдаленных гибридов были стерильными, по-видимому, вследствие нарушения процесса прохождения мейоза. При скрещивании с яровым рапсом наблюдалось завязывание семян и образование стручков, длина створки которых также ха рактеризовалась промежуточным значением между родительскими формами (рис. 2).

Таблица 3 – Промежуточное наследование некоторых признаков гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового Brassica napus Признаки Sinapis alba НСР Brassica napus Sinapis alba 1. Семядоли:

6,9 ± 0,27 7,2 ± 0,13 7,6 ± 0,71 0, - длина, мм 13,8 ± 0,41 15,9 ± 0,74 18,1 ± 0,33 0, - ширина, мм 2. Морфология листа:

- число долей 4,5 ± 0,65 4,9 ± 0,73 5,8 ± 0,17 0, - опушенность края первого листа редкая средняя густая - характер изгиба верхушки средний слабый отсутствует 3. Опушенность стебля отсутствует слабая сильная 4. Высота ветвления, см 47,3 ± 1,93 40,0 ± 1,13 35,4 ± 1,65 1, 5. Длина створки стручка, мм 54,1 ± 0,29 17,6 ± 0,67 14,7 ± 0,65 1, А Б В Рисунок 2. Форма стручка рапса ярового (А), гибрида (Б) и горчицы белой (В) Среди полученных гибридов рапса ярового и горчицы белой выявлены образцы, устойчи вые к тле и с желтой семенной оболочкой. Поскольку семена мелкие, необходимо параллельно вести селекцию на увеличение их массы и улучшение биохимического состава масла.

Таким образом, с помощью культуры незрелых зародышей получены межвидовые и межродовые гибриды растений семейства Brassicaceae, подлежащие дальнейшему изучению и использованию в селекционном процессе.

Литература 1. Потапов Д.А. Инбридинг как метод генотипической дифференциации исходного материала при создании «ООО»-форм ярового рапса / Д.А. Потапов // Сельскохозяйственная биология. – 2004, № 3. – С. 76 – 79.

2. Руководство по селекции и семеноводству масличных культур / Под ред. В.С. Пус товойта. - М.: Колос, 1967. - 351с.

3. Классификатор вида Brassica napus L. (рапс) / Под ред. В.А. Корнейчука. – Л.: ВИР, 1983. – 20 с.

4. Bajaj Y.P.S. Interspecific hybridization of Brassica napus and B. juncea through ovary, ovule and embryo culture / Y.P.S Bajaj, S.K. Mahajan, K.S. Labana // Euphytica. – 1986. – Vol. 35.

– P. 103–109.

5. Takeshita M. Application of ovule culture to the production of intergeneric or interspeci fic hybrids in Brassica and Raphanus / M. Takeshita, M. Kato, S. Tokumasu // Jap. J. Genet. – 1980.

– Vol. 55, № 5. – P. 373 – 387.

6. Zhang G.Q. Plant regeneration from the hybridization of Brassica juncea and B. napus through embryo culture / G.Q. Zhang, W. J. Zhou, H.H. Gu, W.J. Song, E.J.J. Momoh // Journal of Agronomy and Crop Science. – 2003. – Vol. 189, № 5. – Р. 347–350.

7. Жидкова Е.Н. Морфологическое изучение гибридов рапса ярового и горчицы белой / Е.Н. Жидкова, С.А. Шапошникова // Рапс – культура ХХI века: аспекты использования на продо вольственные, кормовые и энергетические цели. – Липецк: ВНИПТИР, 2005. – С. 94-100.

Всероссийский научно-исследовательский и проектно технологический институт рапса, г. Липецк, Боевой проезд, тел.: (4742)34-98-37, e-mail: kate_kotlyarova@mail.ru УДК 63:57:573.9: 633. ДЕЗИНФЕКЦИЯ СЕМЯН ЛИЛИЙ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГИБРИДНЫХ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Лабунская Н.А., Анисимова К.С.

Известно, что растения рода Lilium L. не склонны к самопроизвольному умножению числа хромосом ни в природе, ни в культуре. Сорта-полиплоиды единичны в мировом сорти менте этого рода, поэтому искусственная полиплоидизация очень актуальна.

При получении полиплоидов чаще хотят получить растения не столько с эффектом гигантизма, сколько с другими ценными признаками, такими как более плотные (толстые) листочки околоцветника и листьев, прочный, твердый стебель, обуславливающий более дол гую сохранность цветоносного побега в срезке, устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к вирусным болезням;

более высокая продуктивность.

Были проведены искусственные скрещивания диплоидных сортов - Анастасия, Мичурин ская ода, Осенние грезы, Розовая дымка, Наина, Восточная сказка, Утренняя звезда - с иностран ными сортами-полиплоидами – Fogia, Nove Cento, Tetra 291. Уровень плоидности изученных сор тов был проверен нами ранее с использованием косвенных методов (по длине замыкающих кле ток устьиц в нижнем эпидермисе листовых пластинок и диаметру пыльцевых зерен) и подсчетом числа хромосом на давленых препаратах с окрашиванием ацетокармином.

Выход гибридных семян, после скрещивания тетраплоида на диплоид, оказался ни зок, поэтому возникла необходимость это ценное потомство максимально сохранить и избе жать выпадов при последующем проращивании семян.

С целью ускорения получения гибридов, планируется выращивание гибридных семян лилий на питательной среде, с последующей пересадкой в грунт.

Для отработки данной технологии (начальных этапов культивирования in vitro) семе на от свободного пыления были высажены на питательную среду Мурасиге-Скуга. Вся работа проводилась в стерильных условиях;

пассажи осуществлялись над пламенем спиртовки. Про растание первых высаженных семян отмечено на 9-й день. Некоторые семена в пробирках были отбракованы из-за недостаточной дезинфекции семян, вследствие чего образовались колонии грибов. Процент развившихся семян составил всего 13%. Таким образом, возникла необходимость апробировать различные режимы дезинфекции семян.

Для обеззараживания применяли: 1) 1%, 2% растворы перманганата калия, время вы держки 20 мин.;

2) 70% этиловый спирт, время выдержки 3 мин.;

3) 3% раствор перекиси во дорода, t=38-40C, время выдержки 7 мин.

Цель дезинфекции посмотреть влияние дезинфицирующего вещества на прорастание семян, т.е. насколько безвредна обработка выше перечисленными химическими веществами на жизнеспособность семени. Оказалось, что все дезинфицирующие вещества, которыми мы обрабатывали семена, не оказывают губительное влияние на прорастание семян. Всхожесть была 90-100%. Таким образом, любой из предложенных вариантов можно использовать для дезинфекции семян лилий перед введением в культуру.

Мы использовали в качестве дезинфицирующего вещества 1% раствор перманганата калия. В результате процент развившихся семян составил 50%.

Рисунок 1. Проросток лилии на питательной среде Выращивание гибридных семян в культуре in vitro необходимо, чтобы:

1) сохранить полученные полиплоидные гибридные семена, имеющие пониженную жизнеспособность, и получить от них полноценные сеянцы;

2) сократить прегенеративный период онтогенеза взрослого растения.

Последующая идентификация полученных гибридов по уровню плоидности будет осуществляться путем подсчета числа хромосом и с использованием косвенного метода по длине замыкающих клеток устьиц.

Литература 1. Першина Л.А. Культивирование изолированных клеток и тканей растений. Часть 1.

– Новосибирск, 2000. – 45с.

2. Першина Л.А. Методы культивирования in vitro в биотехнологии растений. Часть 2.

– Новосибирск, 2000. – 69с.

3. Сорокопудова О.А. Биологические особенности лилий в Сибири. – Белгород: Изд во БелГУ, 2005. – 244с.

Белгородский государственный университет г. Белгород, ул. Победы, 85, Биолого-химический факультет Тел.: (4722) 30-11-59, e-mail: Labunskaya@bsu.edu.ru УДК 633.63:631.523. ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Черкасова Н.Н., Федулова Т.П., Стогниенко О.И.

Сахарная свекла является важнейшей сельскохозяйственной культурой, подвержен ной многим бактериальным и грибным болезням, что приводит к значительному снижению урожая и ухудшению качества сырья. В связи с этим большое значение приобретает, прове дение экспериментов по генетической трансформации для повышения устойчивости растений к биотическим стрессам.

Одним из путей в этом направлении является использование присутствующих в неко торых растениях, в частности в семенах редьки, генов природных защитных пептидов (де фензинов). Защитная роль этих белков, выражается в воздействии на различные классы пато генных грибов и бактерий, вызывая остановку линейного роста и ветвления гифов.

Проведенные исследования по экспрессии гена дефензина редьки в трансгенных рас тениях табака подтвердили перспективность использования дефензинов при получении рас тений с устойчивостью заболевания, вызываемым грибами (Terras R.G.).

Цель исследований заключалась в выявлении условий проведения генетической трансформации сахарной свеклы с использованием гена rs дефензина редьки, контролирую щего устойчивость к фитопатогенам, получении генетически модифицированных растений и их оценки на устойчивость к корневым и кагатным гнилям.

Материалы и методы исследований В работе нами были использованы формы сахарной свеклы с ЦМС Рамонского проис хождения. Индукция регенерации проводилась на питательных средах В5 и МS, дополненных необходимыми регуляторами роста и другими компонентами (БАП, ИУК, CuSO4).

Культивирование растений осуществлялось при температуре +23-260 С, 16-часовом фотопериоде с освещенностью 5000 люкс.

Для проведения генетической трансформации была использована векторная система LBA 4404 с встроенной плазмидой рк 22 rs, несущей ген дефензина редьки. Генетическая трансформа ция проводилась по методу РТS (опыление/оплодотворение) (Аветисов В.А. и др., 2000, Collins, Robinson, 2001). Перенос гена осуществлялся путем опыления цветков донорского растения пыльцой опылителя с встроенной Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 и целевым геном rs дефен зина редьки, контролирующим устойчивость к фитопатогенам, двумя способами.

1. Опыление с последующим темпоральным нанесением агробактерии на рыльце пестиков.

2. Опыление пыльцой смешанной с агробактерией.

Оценку генетически модифицированных растений сахарной свеклы в условиях in vitro проводили при использовании канамицина. ПЦР- анализ проводился на базе ВНИИСБ (Цвет ков И.Л., 2000). Оценку и отбор трансгенных растений в условиях ex situ с использованием метода искусственного заражения почвы споровой суспензией. Для инфицирования почвы использовали фон Fusarium + Phoma betae. Почвенная смесь была приготовлена в следующем соотношении почва-перегной-песок (2:1:1).

Пораженность растений учитывали через 7-10 дней после инфицирования почвы ви зуальной оценкой корневой системы по 5 бальной шкале (Нуждина В.В., Матасов А.А.,2003):

0 баллов - инфицирование отсутствует;

1 балл - слабое или среднее поверхностное поражение (степень поражения от 25 % до 50 %);

2 балла - среднее внутреннее поражение (степень поражения от 50 % до 75 %);

3 балла - сильное поражение (степень поражения от 75 % до 100 %);

4 балла - гибель растения.

Процент пораженности растений определяли по формуле:

Р= n.100, где N- общее количество учтенных растений в N пробе, n - количество больных растений.

Результаты исследований В результате проведения генетической трансформации наибольшее количество завя завшихся семян (85,78 %) получено при опылении МС растений смесью пыльцы с трансфор мированной агробактерией при экспозиции 45 мин. (табл.1). Наименьшее количество семян (27,8 %) было сформировано при первом способе опыления и времени экспозиции 30 мин.

Таблица 1 - Влияние времени экспозиции на количество завязавшихся семян при трансформации методом РТS Гетотип Время экспозиции, Количество завязав- Всхожесть семян, % мин. шихся семян,% Первый способ трансформации 39 (р.1) 10 54,5 60, 39 (р.1) 20 63,6 83, 39 (р.2) 10 33,3 42, 39 (р.2) 30 42,9 69, 111 (р.1) 20 37,5 20, 111 (р.1) 30 50,0 50, 111 (р.2) 20 37,5 50, 111 (р.2) 30 27,8 80, 165 60 48,5 8, Второй способ трансформации 111 (р.3) 45 85,7 20, 111 (р.4) 60 50,5 150 30 0 39 (р.3) 45 0 77 45 0 Всхожесть полученных в опытах семян составила 80-83%.

Первичная оценка 18 регенерантов на питательной среде, содержащей канамицин в концентрации 30 мг/л, выявила 10 генотипов с относительной устойчивостью в пределах 5- баллов, согласно шкалы (Рассадина Г.В. и др., 1995). Регенаранты отобранных генотипов имели развитую корневую систему и листовые пластинки, что свидетельствует о передаче в растение гена дефензина редьки rs. Регенеранты остальных генотипов не сформировали кор невой системы, а в дальнейшем полностью некротировали (табл. 2).

Таблица 2 - Оценка степени устойчивости первичных регенерантов сахарной свеклы в условиях in vitro № се- № гено- Анализируемые Характеристика растений по Группа устой лекци- типа растения баллу устойчивости чивости онный некроз, корни нормальное развитие отсутствуют кm 0123456 7 8 39 1 10 2-8---- - - - неуст.

МС 2 -”- 2-8---- - - - неуст.

(Р1) 3 -”- 811---- - - - неуст.

4 -”- -----3- 4 3 - уст.

5 -”- -----32 - 4 1 уст.

6 -”- -----22 - 5 1 уст.

7 -”- 235---- - - - неуст.

8 -”- 253---- - - - неуст.

9 -”- -----22 4 1 1 уст.

10 -”- -----4- 2 2 2 уст.

11 -”- -----24 1 3 - уст.

12 -”- 2422--- - - - неуст.

13 -”- -----5- 2 2 1 уст.

14 -”- 2521--- - - - неуст.

15 -”- 4-42--- - - - неуст.

16 -”- -----32 1 3 1 уст.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.