авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

П.Ф. Забродский, Л.В. Мысник

ВОЗДЕЙСТВИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ

© П.Ф. Забродский, 2010

© Л.В. Мысник, 2010

ISBN 978–5 –91272-254-25

УДК 612.014.46:616–076

ББК 52.84+52.54+52.8 Я 40

з–110

Cаратов – 2010

2

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

Перечень сокращений……………………………………………………… 5 Введение……………………………………………………………………. 6 Глава 1. Современные представления о нарушениях иммунного статуса под влиянием токсикантов общеядовитого действия 10 1.1. Общая токсикологическая характеристика токсикантов общеядовитого действия …………………………………………………… 1.2. Токсикологическая характеристика нитрила акриловой кислоты… 1.3. Влияние нитрила акриловой кислоты на систему иммунитета……… Глава 2. Материал и методы исследований……………………………….. Глава 3. Влияние острого отравления нитрилом акриловой кислоты на состояние неспецифической и иммунологической резистентности организма 3.1. Влияние НАК на неспецифическую резистентность организма к инфекции 3.2. Влияние острого, подострого и хронического отравления НАК на обсемененность селезенки и циркулирующей крови E. сoli 3.3. Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните после острой интоксикации НАК 3.4. Влияние НАК на антиинфекционную неспецифическую и иммунологическую резистентность организма при экспериментальной пневмонии 3.5. Влияние острого, подострого и хронического воздействия НАК на сывороточную активность лизоцима 3.6. Изменение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов при интоксикации НАК…………………………………………………... стр.

Глава 4. Влияние нитрила акриловой кислоты на содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета 4.1. Изменение лимфоидных индексов тимуса и селезенки 4.2. Содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета 4.3. Изменение под влиянием НАК цитограмы тимуса и селезенки Глава 5. Воздействие нитрила акриловой кислоты на гуморальные иммунные реакции 5.1. Влияние на тимусзависимый гуморальный иммунный ответ 5.2. Влияние на тимуснезависимый гуморальный иммунный ответ Глава 6. Влияние нитрила акриловой кислоты на клеточный иммунный ответ 6.1. Оценка функции Т-лимфоцитов 6.2. Изменение функции Th1-лимфоцитов 6.3. Оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности 6.4. Нарушение НАК функции естественных клеток-киллеров Глава 7. Механизмы формирования вторичного иммунодефицита при действии нитрила акриловой кислоты 7.

1. Влияние НАК на миграции колониеобразующих единиц в селезенку 7.2. Оценка кооперации Т- и В-лимфоцитов 7.3. Оценка способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ 7.4. Оценка массы надпочечников 7.5. Действие НАК на концентрацию кортикостерона в плазме крови 7.6. Изменение активности эстераз Т-клеток, моноцитов и макрофагов под влиянием НАК 7.7. Влияние НАК на показатели перекисного окисления липидов 7.8. Роль супрессии функции Тh1- Th2-лимфоцитов в редукции иммунных реакций под влиянием НАК стр Заключение Выводы Практические рекомендации Литература ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность АОК - антителообразующие клетки ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ЕКК - естественные клетки-киллеры ИКК – иммунокомпетентные клетки К-клетки – клетки-киллеры (лимфоциты, определяющие АЗКЦ) КОЕ - колониеобразующая единица КОЕс - колониеобразующая единица селезенки КС - кортикостерон ЛИ – лимфоидный индекс НАК – нитрил акриловой кислоты НИРО - неспецифическая и иммунологическая резистентность организма НРО - неспецифическая резистентность организма ОДЛТА – отрицательный двоичный логарифм титра антител ПЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов Тh1 – Т-лимфоциты- хелперы типа Тh2 – Т-лимфоциты- хелперы типа ЦНС - центральная нервная система ЭБ - эритроциты барана ЭК - эритроциты кур LD50 - средняя смертельная доза, вызывающая смертельный исход у 50% отравленных ВВЕДЕНИЕ Важной и актуальной проблемой общей и факториальной экологии является изучение действия веществ антропогенного (техногенного) происхождения на биологические системы различных уровней организации – молекулярные, субклеточные, клеточные, системные, органные и организменные. К числу таких веществ относится нитрил акриловой кислоты (НАК, акрилонитрил), который используется как сырье для производства полиакриловых и модакриловых нитей, синтетических каучуков, нитриловых эластиков, акриламида, клея, оргстекла и других материалов, а также применяется в синтезе ароматических веществ. На Конференции ООН по окружающей среде и развитию (Рио-де-Жанейро, 1992) акрилаты, в частности, НАК включены в перечень приоритетных химических загрязнителей (Курляндский и др., 2005). Данные литературы свидетельствуют о том, что в последнее время загрязнение окружающей среды токсикантами общеядовитого действия, в частности, НАК, существенно увеличилось. Это обусловлено постоянно растущим широким использованием акрилонитрила в промышленности (Саватеев, Куценко, 1982, 1993;

Забродский, 1993, 2002;

Германчук, 2000;

Tarskikh, 2006).

Наиболее чувствительной к действию экотоксикантов является иммунная система человека и животных, изменения в функционировании которой предваряют различные патологические состояния (Сиротинин, 1979;

Петров и др., 1987;

Хаитов и др., 1995;

Ройт и др., 2000). При этом ответные реакции организма достаточно информативно могут характеризовать специфику воздействия экотоксикантов и могут быть использованы для оценки экологического риска ксенобиотиков, в том числе НАК. Высокая чувствительность факторов неспецифической резистентности организма и системы адаптивного иммунитета к действию токсикантов позволяет оценить нарушения иммунного гомеостаза после действия акрилонитрила в условиях экологического неблагополучия (Сидорин и др., 1996;

Забродский, 1993, 2002;

Descotes, 1986;

Kimber, 1996;

Friedman et al., 2003). Загрязнение окружающей среды НАК, как и другими веществами общеядовитого действия, может вызвать формирование вторичных иммунодефицитных состояний и развитие обусловленных ими различных заболеваний (Шубик 1976;

Хаитов и др., 1995;

Забродский, 1998;

Descotes, 1986;

Luster et al., 1987).

Однако на настоящий момент особенности действия НАК на неспецифическую резистентность организма и систему адаптивного иммунитета животных изучены недостаточно. В этой связи представляется актуальным исследование нарушений иммунного гомеостаза организма животных на фоне экологического действия акрилонитрила.

Цель исследования: имунотоксикологическое исследование острого, подострого и хронического воздействия нитрила акриловой кислоты на активность факторов естественной резистентности и механизмы адаптивного иммунитета в организме экспериментальных животных.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НАРУШЕНИЯХ ИММУННОГО СТАТУСА ПОД ВЛИЯНИЕМ ТОКСИКАНТОВ ОБЩЕЯДОВИТОГО ДЕЙСТВИЯ (обзор литературы) 1.1. Общая токсикологическая характеристика токсикантов общеядовитого действия Вещества, способные в результате взаимодействия с различными биохимическими структурами вызывать острое нарушение энергетического обмена, которое является в тяжелых случаях одной из основных причин смерти отравленного (пораженного) называются общеядовитыми (Куценко, 2004). Образование АТФ (энергообразование) в организме включает следующие стадии: появление в результате метаболизма субстратов, способных окисляться, отдавая электроны и водород, транспорт электронов и водорода по цепи дыхательных ферментов, акцепция электронов и водорода кислородом, механизм сопряжения транспорта электронов по цепи дыхательных ферментов с синтезом АТФ (Саватеев, 1978;

Лужников, 1982;

Лудевиг, Лос, 1983;

Могуш, 1984;

Лужников, Костомарова, 1989, 2000;

Маркова и др., 1998). Основным генератором энергии в организме являются митохондрии, содержащие весь набор ферментов цикла Кребса (цикла трикарбоновых кислот) – основного источника субстратов для окисления, способствующему получению энергетических запасов клетки. Во внутренней мембране митохондрий локализованы энзимы дыхательной цепи, осуществляющие транспорт электронов и водорода от субстрата на кислород (Ленинджер, 1974;

Ройт и др., 2000).

Снижение энергообмена может происходить вследствие острого дефицита кислорода в тканях (при затруднении или прекращении транспорта кислорода кровью), повреждения цепи дыхательных ферментов (ингибирование НАД, ФАД, цитохрома Q, компонентов b, с, а, а3), нарушения механизмов сопряжения, окисления и фосфорилирования, истощения запасов субстратов для процессов биологического окисления.

К веществам общеядовитого действия относятся гемолитические токсиканты (анилин, мышьяковистый водород, медный купорос, уксусная кислота);

яды, действующие на гемоглобин (оксиды азота, сернистый ангидрид, оксид углерода);

ингибиторы ферментов дыхательной цепи (цианиды, сероводород, акрилонитрил, ацетонитрил, аммиак, некоторые антибиотики, барбитураты);

разобщители окисления и фосфорилирования (динитрофенол, динитроортокрезол);

вещества, истощающие запасы субстратов для процессов биологического окисления (этиленхлоргидрин, этиленфторгидрин и др.) (Куценко, 2004).

Некоторые из указанных в классификации веществ, помимо общеядовитого, обладают выраженным раздражающим, а при высоких концентрациях и удушающим действием. Следует отметить, что большинство ТХВ в той или иной степени оказывают влияние на тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование (Ротенберг, 1982;

Саватеев, Куценко, 1993).

Самая обширная группа промышленных ядов объединяет вещества, способные при ингаляционном воздействии вызывать формирование токсического отека легких, а при резорбции во внутренние среды организма нарушать энергетический обмен по одному их указанных выше механизмов.

К ним относятся НАК, ацетонитрил, сероводород, сернистый ангидрид, аммиак, азотная кислота и оксиды азота. Интоксикация этими веществами сопровождается тяжелейшей гипоксией смешанного типа: гипоксической (дыхательной, гемической и/или гистотоксической (тканевой), а поскольку при этом всегда развиваются нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы, то и циркуляторной. Многие ядовитые соединения этой группы обладают сильнейшим прижигающим действием (Саватеев, Куценко, 1982;

Куценко, 2004).

1.2. Токсикологическая характеристика нитрила акриловой кислоты Нитрил акриловой кислоты (НАК, акрилонитрил, цианэтилен, 2-про пеннитрил, цианвинил) - летучая, бесцветная, горючая жидкость с характерным слабым сладковатым запахом;

слабо растворим в воде, смешивается с большинством органических растворителей. Пары НАК взрываются с образованием цианистого водорода. Температура кипения при 760 мм рт ст 77,3°С, плотность при 20°С 0,8060 кг/м3. Температура замерзания – минус 83,55°С;

температура воспламенения - 481°С;

молекулярная масса - 53,06 Да. Смесь паров НАК с воздухом (от 3 до 17% по объему) является взрывоопасной (American Cyanamid, 1974).

Впервые акрилонитрил был получен в 1893 г. К 1976 г. в мире произведено около 2400000 т. НАК. НАК широко используется в промышленности как сырье для производства полиакрилонитрильных и модакриловых нитей, синтетических каучуков, нитриловых эластиков, акрилоамида, клея, оргстекла и других материалов (Шустов и др., 1985;

Бирбин, 2002).

В экспериментах на животных было продемонстрировано ковалентное связывание акрилонитрила с компонентами тканей организма (Иванов, 1987;

Nilsen et al., 1980;

Appel et al., 1981;

Guengerich, et al., 1981;

Ghanayem, Ahmed, 1982;

Silver, Szabo, 1982;

Peter et al., 1983;

Tucek et al., 2002;

Wang et al., 2002). Прямое окисление акрилонитрила гидроперекисными соединениями происходит с вовлечением цианогруппы, хотя в биологических объектах, вероятно, происходит окисление двойной связи в окcиран глицидонитрила (Kopecky, 1982).

Отравление НАК возможно при поступлении яда ингаляционным путем, через кожные покровы и желудочно-кишечный тракт (Бирбин, 2002;

Willhite, Smith, 1981). Острые отравления акрилонитрилом возникают, как правило, в результате возникновения аварийных ситуаций на химических производствах, нарушений техники безопасности в лабораториях или при «ошибочном» употреблении внутрь. Пороговая величина по запаху для акрилонитрила в среднем составляет 40,4 мг/м3 (18,6 ч/млн), интервал от 0,007 до 109,4 мг/м3 (0,0031-50,4 ч/млн) (Baker, 1963).

НАК относится к веществам второго класса токсичности – высокотоксичным и высокоопасным. ПДК НАК в воздухе рабочей зоны составляет 0,5 мг/м3. (Шустов и др., 1985). При пероральном поступлении для мышей LD50 НАК составляет 25- 48 мг/кг, для крыс – 78-186 мг/кг (при внутрибрюшинном введении – 65-110 мг/кг). Для морских свинок при подкожном введении – 99 мг/кг (Германчук, 2000;

Беликов, 2001;

American Cyanamid, 1974).

Среднелетальные дозы НАК при остром воздействии варьируют для различных видов лабораторных млекопитающих от 25 до 186 мг/кг. При нанесении жидкого НАК на кожу хвоста крыс-самцов среднесмертельная доза составляет 282 мг/кг (Зотова, 1976). Отчетливой зависимости между LD50 и путем поступления акрилонитрила в организм, видом растворителя, полом животных не отмечено. Мыши более чувствительны к токсическому действию акрилонитрила по сравнению с крысами, морскими свинками и кроликами. Гибель собак наступала после внутривенного введения акрилонитрила в дозе 300 мг/кг (Graham, 1965).

После внутривенного или внутрибрюшинного введения концентрация НАК в крови и печени достигала более высоких значений, чем после пероральной затравки;

однако быстро снижалась в крови (период полужизни t0,5 составляет 19 мин) и печени (t0,5 равен 15 мин после внутривенного введения и 21 мин после внутрибрюшинного введения) (Nerudova et al., 1980;

Gut et al., 1981). Период полужизни после перорального отравления в крови составляет 61 мин, а в печени - 70 мин, что, видимо, обусловлено более медленным всасыванием, чем выведением. Доказательством более быстрого метаболизма акрилонитрила в печени, чем в крови, является большая площадь под кривой "концентрация - время" для содержания вещества в крови, чем в печени, как после перорального, так и после внутривенного и внутрибрюшинного введения (Gut et al., 1981;

Tucek et al., 2002;

Wang et al., 2002).

Токсикокинетика НАК характеризуется довольно равномерным распределением этого вещества, а также тем, что максимальные уровни его накопления в некоторых органах и эритроцитах обусловлены реакцией метаболитов акрилонитрила с растворимыми и белковыми молекулами, содержащими сульфгидрильные группы (Шустов и др., 1985;

Nerudova et al., 1981;

Wang et al., 2002;

Jacob, Ahmed, 2004). Показано, что в печени под влиянием НАК увеличивается содержание сульфгидрильных групп, не связанных с белками (Vainio, Makinen, 1977).

В тканях мозга и мышцах зарегистрирована относительно более длительная задержка НАК. В цитозольных фракциях мозга, печени и почках крыс выявлено повышенное содержание НАК, меченым С (Ahmed et al., 1982;

Sato et al., 1982;

Sandberg, Slanina, 1990).

Экспериментальные данные относительно распределения НАК в организме, тканевые повреждения, вызванные его воздействием, не указывают на повышенную кумуляцию этого вещества в каком либо определенном органе или ткани (за исключением эритроцитов) при его хроническом воздействии (Ефремов, 1976;

Quast et al., 1977;

Kedderis et al., 1996).

В организме биотрансформация акрилонитрила протекает довольно интенсивно. Так, при внутрибрюшинном введении НАК мышам в дозе 20 и 35 мг/кг наблюдается превращение в метаболиты соответственно 88 и 55% яда. Мeтаболизм акрилонитрила происходит в печени, корковом и мозговом слое почек, легких, селезенке, эпителии желудочно-кишечного тракта, коже (Parsons, Mitzners, 1975;

Appel et al., 1981;

Tucek et al., 2002;

Wang et al., 2002).

Основными метаболитами НАК являются меркаптуровые кислоты, образующиеся в результате реакции соединения акрилонитрила или глицидонитрила с глутатионом, которые катализируются глутатион-S трансферазами (Ефремов, 1976;

Thier et al., 2000). Выделены и идентифицированы из мочи животных по меньшей мере 10 метаболитов НАК (Kopecky et al., 1980;

Kedderis et al., 1993), в том числе - цианид, глицидонитрил, 2-цианэтанол, циануксусная кислота, уксусная кислота, которые значительно токсичнее НАК (Sapota, Chmielnicka, 1981;

Fennell et al., 1991;

Ghanayem et al., 1992). НАК и его метаболиты снижают содержание глютатиона в различных тканях у грызунов (Cote et al., 1984).

Токсикодинамика НАК обусловлена поражением мембран эритроцитов и ингибированием циан-ионом компонента а3 энзимов системы тканевого дыхания митохондрий клеток различных органов (Fennell et al., 1991;

Ghanayem et al., 1992;

Tarskikh, 2006).

Цианид, образующийся in vivo при участии тиосульфаттрансферазы, последовательно превращается в тиоцианат и выводится с мочой (опыты на животных). У крыс после введения НАК в дозе 60 мг/кг экскреция тиоционата с мочой наблюдалась с постоянной скоростью - 0,53 мг/ч, а период полувыведения составлял 13 ч (Ahmed, Patel, 1981).

Сульфгидрильные соединения (цистеин, унитиол, тиосульфат натрия) повышают активность тиосульфатсульфидтрансферазы в превращении цианида в тиоцианат как в условиях in vitro, так и in vivo (Frankenberg, 1980).

Аналогичного эффекта в отношении НАК наглядно показать не удалось (Gut et al., 1975), возможно, вследствии ингибирующего влияния акрилонитрила на тиосульфатсульфидтрансферазы. В этом отношении интересны результаты иммунотоксичности НАК в комбинации с тиосульфатом натрия (Забродский, Ромащенко, 1998;

Бирбин, 2002), свидетельствующие о том, что исследуемый антидот усиливает некоторые иммунотоксические эффекты НАК, вероятно, вследствие собственных отрицательных иммунотоксичных свойств в больших дозах, используемых для антидотной терапии.

Канцерогенные эффекты НАК обусловлены эпоксидированием акрилонитрила микросомами печени (Kedderis, Batra, 1993;

Kedderis et al., 1993). При этом существуют различия эпоксидирования НАК у мышей, крыс и людей (Roberts et al., 1991). Данный эффект сопровождается нарушением функции цитохрома Р-450 печени (Emmert et al., 2006).

К основным синдромам при отравлении акрилонитрилом относятся:

угнетение функции ЦНС, гастроэнтерит, нарушение функции печени и почек, сердечно-сосудистой системы (Лазарев, 1976;

Шустов и др., 1985;

Brieger et al., 1952;

Graham, 1965). НАК способен в летальных дозах вызывать поражение надпочечников (Бирбин, 2003;

Szabo, Selye, 1971, 1972;

Szabo, 1980). Это обстоятельство дает основания полагать, что иммунотоксичность НАК не связана с активацией ГГНС (Забродский, Киричук, 1998). Однако, данное предположение требует доказательства.

Острое действие паров НАК сопровождается поражением ЦНС, сердечно-сосудистой системы, кожных покровов и органов дыхания, в частности, слизистых оболочек верхних дыхательных путей (Бабанов, 1957;

Бабанов и др., 1959;

Шустов, Маврина, 1975;

Шустов и др. 1985;

Sartorelli, 1966).

Существует предположение о возможном механизме повреждающего действия НАК на надпочечники, которое реализуется в результате активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Шустов и др., 1985;

Silver, Szabo, 1982), что может иметь значение в механизмах реализации иммунотоксических эффектов. Известно, что гормоны коры надпочечников в физиологических концентрациях необходимы для реализации иммунного ответа, в то же время при стресс-реакции (в частности, на острое отравление) они способны оказывать иммуносупрессивное действие (Корнева и др., 1978;

Корнева, 1985;

Лазарева, Алехин, 1985;

Корнева и др., 1988;

Забродский, 1998;

Забродский, Киричук, 1998;

Забродский, Германчук, 2000).

Хроническое воздействие НАК сопровождается увеличением мутаций в геноме хромосом (Meester et al., 1978;

Lambotte-Vandepaer, et al., 1980), в частности, в клетках печени (Meester et al., 1979) и реализацией канцерогенных эффектов (Ward, Starr, 1993;

Huff, 2002). Показано, что повреждение генома различных органов тканеспецифично (Butterworth et al., 1992).

Таким образом, НАК обладает выраженной токсичностью при различных путях поступления в организм. Острые отравления акрилонитрилом отличаются от интоксикаций промышленными растворителями и пластмассовыми мономерами тяжестью, высокой летальностью и связаны с действием как самого яда, так и его метаболитов (глицидонитрила, 2-цианэтанола, циануксусной кислоты, уксусной кислоты, циан-иона).

1.3. Влияние нитрила акриловой кислоты на систему иммунитета Данные о влиянии НАК на иммунный гомеостаз до 90-х г.г. прошлого столетия были весьма ограниченны (Бравве и др., 1989;

Забродский, 1998;

2002;

Германчук, 2000). Существуют основания предполагать, что в целом, как у большинства ксенобиотиков иммунотоксичность НАК обусловлена супресcией преимущественно Т-звена иммунитета (Савченко и др., 1995;

Литовская и др., 1997;

Забродский, 1993, 2002;

Descotes, Mazue, 1987;

Willem et al., 1996).

Показано, что у рабочих, подвергающихся хроническому воздействию акрилонитрила в производственных условиях, наблюдалась пониженная функциональная активность Т-лимфоцитов (Иванов, 1980;

Шустов и др., 1985;

Шустов, Довжанский, 1987). При остром отравлении акрилонитрилом в опытах на мышах происходит блокирование способности селезеночных Т клеток супрессоров подавлять иммунный ответ (Tucker et al., 1987).

Эпидемиологические и экспериментальные исследования влияния циан ионов на клеточное звено иммунного ответа при хроническом действии в малых дозах противоречивы. При изучении на жителях Либерии хронического действия цианидов, потреблявших с пищей умеренные и высокие количества цианидов, было установлено повышение у них уровней IgA, IgG, IgM (Jackson et al., 1985). При осмотре рабочих, контактирующих с роданидом аммония, было установлено снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и концентрации IgA у 60% рабочих (Савченко, 1987)..

Исследования на морских свинках показали, что тиоциан и цианат селена ( мг/кг) угнетали антителообразование, а цианат селена в дозе 4 мг/кг его усиливал (Kramer et al., 1984).

Действие циан-иона на клеточный иммунный ответ следует рассматривать не только как проявление изолированного эффекта, но и как влияние на Т-лимфоциты, К-клетки и ЕКК роданидов (SCN), образующихся в процессе биотрансформации. Скорость этого процесса, представляющего собой обезвреживание яда, составляет 1 мг/кг CN в час (Лудевиг, Лос, 1983).

Возможность реализовать иммунотоксический эффект у НАК может быть связана с ЦНС. В настоящее время тесная связь действия токсикантов с функцией ЦНС доказана (Корнева, 1985;

Петров, 1987;

Иванова, 1998;

Забродский, 1998;

2002;

Hart и др, Zsuzsanna F., 1995;

Husband, 1995;

Wilson, Mireile, 1995). Воздействуя на процессы тканевого дыхания, химические вещества общеядовитого действия оказывают токсическое действие на ЦНС, изменяя выработку медиаторов и нарушая процесс нервной регуляции, что приводит к потере контроля над функционированием иммунной системы (Иванова, 1998;

Забродский, 1998, 2002;

Shrikant, Benveniste, 1996).

Гормоны ГГНС контролируют деятельность иммунокомпетентных клеток и при определенном режиме введения способны проявлять иммуностимулирующие свойства (Корнева, 1985;

Корнева и др., 1988;

Claman 1972). На различных стадиях созревания иммунокомпетентных клеток и по отношению к различным субпопуляциям лимфоцитов действие глюкокортикоидов может быть стимулирующим или угнетающим (Юрина, Тамахина, 1996;

Ягмуров, Огурцов, 1996;

Dhabhar et al., 1996;

Mc. Ewen Bruse, et al., 1997;

Ficek, 1997).

Снижение гуморального и клеточного звена иммунного ответа под влиянием НАК может быть связано с общетоксическим действием веществ данной группы: ингибированием цитохром-с-оксидазы (цитохромов а и а3) цианидом в системе ферментов тканевого дыхания митохондрий иммуноцитов и нарушением в результате этого различных биохимических процессов как самими веществами, так и их токсичными метаболитами (Забродский, 1998, 2002;

Hamada et al., 1998).

Эстеразы могут осуществлять различные функции в различных типах клеток. Цитотоксический эффект, осуществляемый Т-клетками против клеток мишеней, ингибируется фосфорорганическими соединениями, являющемися сильными ингибиторами эстеразной активности, что подтверждает участие эстераз в киллерной функции Т-клеток (Ferluga, et al., 1972). 80% моноцитов демонстрируют умеренную и сильную активность -на -нафтил-АS-ацетатэстераза -нафтил фтил-бутиратэстеразы;

и бутиратэстераза локализуются преимущественно в Т-лимфоцитах (Хейхоу, Кваглино, 1983). Возможно, одним из основных механизмов иммунотоксического эффекта НАК является ингибирование данных эстераз, а также ацетилхолинэстеразы Тh-лимфоцитов (Забродский и др., 2000).

Данный вывод нуждается в уточнении при различных видах интоксикации.

Вероятно, нарушение функции иммунной системы под влиянием НАК, наряду с мутагенным действием токсиканта, способствует реализации его онкогенных эффектов (Collins, Strother, 1999;

Schulz et al., 2001;

Johannsen, Levinskas, 2002;

Quast, 2002).

В работах В.Г. Германчука (2000), П.Ф.Забродского и др. (1998, 1999, 2000) показано, что острая интоксикация НАК приводит к снижению иммунной защиты организма, однако при этом остаются невыясненными сравнительные эффекты острой, подострой и хронической интоксикации НАК, важные механизмы его иммунотоксичности: способность макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ, нарушение функции Т- и В-ли мфоцитов в эффекте кооперации клеток, особенности супрессии функции Th1- и Th2-лимфоцитов, роль стресс-реакции (функции коры надпочечников), активности эстераз Т-лимфоцитов и инициации ПОЛ токсикантом.

Таким образом, НАК представляет собой высокотоксичное химическое соединение, которое широко используется в химической промышленности.

Этот токсикант чрезвычайно опасен при загрязнении местности, в случае аварий на химических объектах, обладает выраженной токсичностью при различных путях поступления в организм. Не вызывает сомнения необходимость дальнейшего изучения влияния веществ общеядовитого действия, в частности НАК, на состояние иммунного гомеостаза животных.

Характер формирования иммуносупрессии в зоне экологического неблагополучия при остром, подостром и хроническом воздействии НАК не ясен и нуждается в исследовании.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнялась в 2002-2008 гг. на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института биологической и химической безопасности.

Объекты исследования и применяемые препараты. Исследования проводились на 822 крысах и на 85 белых мышах обоего пола. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г. Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

НАК вводили подкожно в дозах 0.25, 0.5 и 0.75 LD50 (LD50 НАК для мышей и крыс составляла 38+4 и 77+6 мг/кг соответственно). Подострое действие моделировалось введением НАК в течение 6 сут в дозе 1/7 LD50, а хроническое - в дозе 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно.

Эти дозы (соответственно – 0.38 и 0.16 мг/кг для крыс и мышей) обоснованы расчетными данными при аварийных ситуациях на химических объектах общепринятыми методами (Заугольников, 1978). Применяемые методы позволяют перевести ингаляционную токсодозу при экспозиции 24 ч в дозы, получаемые животными однократно в течение определенного времени.

Использованные нами дозы формируют зону экологического неблагополучия и превышают воздействие ПДК в несколько раз (эти дозы соответствуют экологической ситуации при авариях на объектах, соответствующих I и II степени химической опасности).

Роль супрессии функции Тh1- Th2-лимфоцитов в редукции иммунных реакций при действии НАК изучали при подостром отравлении токсикантом.

При этом НАК вводили белым крысам в дозах 1/4 и 1/13 LD50 ежедневно подкожно в течение соответственно 4 и 13 сут для оценки синтеза АОК спленоцитов соответственно IgM и IgG. Эксперименты проводили в светлое время суток (с 9.00. до 15.00 ч), характеризующееся минимальным содержанием кортикостерона в плазме крови крыс (Dhabhar et al, 1985).

Кровь для исследования титра антител получали из подъязычной вены животных. Лимфоидные органы извлекали у животных после цервикальной дислокации в различные сроки после интоксикации.

Исследование интегрального состояния антиинфекционной НРО при действии НАК. Интегральное состояние НРО определяли по показателям течения экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением мышам и крысам суспензии суточной культуры кишечной палочки в дозах 1.5;

2.0;

2.5 млрд. микробных тел без предварительной иммунизации (Забродский, 1987, 1998, 2002). Антиинфекционную НРО оценивали по летальности крыс в течении 48 ч от экспериментальной инфекции, а также по среднелетальной дозе Е. Coli (LD50) и среднеэффективному времени жизни животных (Et50) в опытной и контрольной группах, расчитанных методом пробит-анализа (Беленький, 1963). Введение условно-патогенных микроорганизмов производили через и 6 сут соответственно после острой и подострой интоксикации. При хроническом воздействии иммунизацию проводили на 25 и 55 сут. Следует отметить, что данный показатель характеризует именно НРО, так как иммунная реакция введения микроорганизмов реализуется после 2-х сут (Ройт и др., 2000;

Хаитов и др., 2002).

Обсемененность крови и селезенки бактериями является одним из параметров, характеризующим состояние НРО после воздействия ксенобиотиков (Забродский, 1998, 2002;

Германчук, 2000). Количество микробных тел E.сoli в крови и селезенке белых крыс исследовалось после острого, подострого и хронического отравления НАК общепринятыми методами (Ремезов, Башмаков, 1976). Число колоний E.сoli в крови и селезенке определяли через 1 сут после введения микроорганизмов (суточную культуру E.сoli в дозе 1.5·109 микробных тел в объеме 2 мл вводили внутрибрюшинно через 30 мин после острого отравления или последнего введения токсиканта при подостром и хроническом воздействии).

Исследование интегрального состояния антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при действии НАК. Интегральное состояние НИРО определяли по показателям течения экспериментальной инфекции, вызванной внутриперитонеальным введением крысам суспензии суточной культуры Е. сoli в дозах 4.0;

6.0;

9. млрд. микробных тел в объеме 4-6 мл изотонического раствора хлорида натрия через 4 сут после иммунизации данными микроорганизмами в дозе 106 микробных тел в объеме 0.5 мл. Проводилось также введение Р.vulgaris в дозах 3.5;

5.0;

6.5 млрд. микробных тел в ткань легкого c предварительной иммунизацией данной культурой (106 микробных тел в объеме 0.5 мл изотонического раствора хлорида натрия). Выбор Е. Coli и Р.vulgaris обусловлен большой значимостью условнопатогенной флоры в возникновении различных инфекционных осложнений (Бельцкий, Снастина, 1985).

Антиинфекционную НИРО оценивали по летальности крыс в течении 48 ч от экспериментальной инфекции, а также по среднелетальной дозе Е.

Coli (LD50) и среднеэффективному времени жизни животных (Et50) в опытной и контрольной группах, расчитанных методом пробит-анализа (Беленький, 1963). Введение условно-патогенных микроорганизмов производили через и 6 сут соответстенно после острой и подострой интоксикации. При хроническом воздействии иммунизацию проводили на 25 и 55 сут.

Сывороточная активность лизоцима. Лизоцим (мурамидаза) - один из важных факторов НРО доиммунной защиты организма. Источником лизоцима являются нейтрофильные гранулоциты и моноциты. (Бухарин, Васильев, 1974;

Гембицкий и др., 1987;

Хаитов, 2002). Использование показателя лизоцимной активности для оценки неблагоприятного действия химических факторов на организм свидетельствуют о высокой чувствительности данного теста (Измеров и др., 1977;

Бухарин и др., 1985;

Генес и др., 1981;

Забродский, 1998;

Германчук, 2000). Как правило, химические соединения вызывают снижение лизоцимной активности сыворотки крови (Забродский, 1998, 2002). Однако свидетельством отрицательного воздействия ксенобиотиков на организм может являться также и повышение содержания лизоцима в крови. Некоторые иммунологические реакции связаны с активностью лизоцима. Так, комплекс "IgA-антиген" проявляет антибактериальную и нейтрализующую aктивность после активации комплементом только в присутствии мурамидазы (Nouragargh, Holt, 1986).

Содержание сывороточного лизоцима определяли методом основанным на способности лизоцима растворять индикаторный микрококк (Micrococcus lysodeicticus), измеряя при этом оптическую плотность опытной и контрольной суспензии микроорганизмов (Ремезов, Башмаков, 1976). Взвесь суточной агаровой культуры микрококка на 1/15 М фосфатном буфере (рН 6.2) стандартизировали по левому барабану ФЭК до оптической плотности 0.66. В опытную пробирку вносили 0.4 мл фосфатного буфера, 0.1 мл исследуемой сыворотки и 2 мл стандартной взвеси микрококка. Смесь выдерживали при 370С 30 мин, после чего измеряли ее оптическую плотность на ФЭК по правому барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. Для количественной характеристики лизоцима в исследуемой сыворотке с использованием кристаллического лизоцима строили калибровочную кривую, исходя из активности фермента 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40, 50 мкг в пробе. Во все пробирки с различным содержанием лизоцима вносили с интервалом 30 с по 2 мл стандартизованной суспензии микрококка. Смесь инкубировали при 37С 30 мин и в каждой пробирке, начиная с первой, измеряли оптическую плотность. Каждое последующее измерение выполняли через 30 с после предыдущего. С помощью калибровочной кривой находили количество лизоцима в исследуемой сыворотке, выраженное в абсолютных единицах. Для удобства расчетов зависимости между оптической плотностью микробной взвеси в опыте и контроле, а также содержанием лизоцима в исследуемой сыворотке, использовали таблицу (Ремезов, Башмаков, 1976).

Фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов.

Использованный нами метод оценки фагоцитарной активности нейтрофилов основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции. НСТ-тест, как уже указывалось, интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита (Бровкина и др., 2004;

Рыбников и др., 2004). В исследованиях применялся цитохимический вариант этого метода (Хаитов и др., 1995). Учет результатов проводился путем подсчета в каждом мазке 100 нейтрофилов, среди которых определялся процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ – позитивные нейтрофилы). Далее рассчитывался индекс активности нейтрофилов (ИАН) по формуле:

АхО+Вх1+Сх2+Dх ИАН = ----------------------------------------------, где А - количество клеток, не содержащих диформазоновых отложений или содержащий их в виде пылевидных немногочисленных включений;

В - количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра;

С - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины площади ядра;

D - количество клеток с диформазановыми отложениями, по площади превосходящими площадь ядра.

Фагоцитарно-метаболическую активность ПЯЛ, кроме того определяли путем оценки фагоцитарного показателя (ФП) и фагоцитарного числа (ФЧ) общепринятыми методами в том числе, используя НСТ-тест, в котором нейтрофилы активировались зимозаном (Хаитов и др., 1995;

Сакаева, Лазарева, 1998;

Белокрылов, Попова, 2002;

Бровкина и др., 2004 а,б;

Рыбников и др., 2004).

Оценка лимфоидного индекса тимуса и селезенки и содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета. Массу тимуса и селезенки определяли гравиметрическим методом. ЛИ вычислялся общепринятым способом (Германчук, 2000;

Беликов, 2001) путем деления массы органа в мг на массу тела в граммах. Данные показатели являются косвенными критериями оценки состояния иммунной системы и могут отражать ее функциональное состояние в целом (Александров, 1983).

ЛИ тимуса и селезенки определяли после острого отравления НАК через 1, 3, 6 cут. При хроническом действии НАК показатели оценивали через 30 и 60 сут. Содержание лимфоцитов в лимфоидных органах после различных воздействий отражает, во-первых, процесс их перераспределения между органами системы иммунитета в основном вследствие изменения функционального состояния симпатического, парасимпатического отделов вегетативной нервной системы и ГГНС (Горизонтов, 1981а;

Ройт, 1991), во вторых, их апоптоз (запрограммированную гибель), на который оказывают влияние КС и различные ксенобиотики (Хаитов и др., 1995, 2000).

Содержание Т-клеток в тимусе крыс определяли общепринятым методом подсчета ядросодержащих клеток в органе, учитывая то обстоятельство, что лимфоциты в вилочковой железе представлены в основном (до 90%) их Т- популяцией (Петров, 1987;

Ройт, 1991;

Хаитов и др., 2002). Лимфоциты в селезенке, лимфатических узлах (для изучения брали паховые лимфоузлы) и костном мозге (исследовали клетки костного мозга бедренной кости) подсчитывали, исходя из их относительного содержания в мазках данного органа, окрашенных по Романовскому–Гимзе. Для определения содержания в лимфоидных органах лимфоцитов клеточные суспензии из тимуса, селезенки, костного мозга и паховых лимфоузлов крыс готовили после действия НАК. Содержание лимфоцитов в крови крыс определяли через 1, 3, 6 и 9 сут после воздействия НАК общепринятыми методами (Гембицкий и др., 1987). При хроническом действии НАК показатели оценивали через 30 и 60 сут. Тимограмму (относительное содержание ядросодержащих клеток в органе) и спленограмму оценивали после острого воздействия НАК через 6 и 12 сут (Гольдберг, 1980).

Исследование гуморальных иммунных реакций. Для оценки гуморальных иммунных реакций в качестве антигенов применяли эритроциты барана и брюшнотифозный Vi-антиген (Vi-Ag). Использование данных антигенов позволяет рассмотреть влияние НАК на Т-зависимый или Т-независимый иммунный ответ, а также оценить роль Т-хелперов в реализации гуморального звена иммунного ответа (Утешев, 1984;

Забродский и др., 2005;

Descotes, 1986).

Исследование показателей тимусзависимого гуморального иммунного ответа проводили через 5, 8 и 14 и 20 сут после острой интоксикации НАК.

Иммунизацию ЭБ проводили путем их внутрибрюшинного введения в дозе 2·108 клеток одновременно с введением НАК. Тимуснезависимую гуморальную иммунную реакцию оценивали через 5 и 8 сут после иммунизации брюшнотифозным Vi-антигеном (Vi-Ag) в дозе 8 мкг/кг, так как к 8 сут синтез IgM к данному антигену существенно снижается до значений (оцениваемых по ОДЛТА) несущественно превышающие показатели до иммунизации (Ройт и др., 2000;

Casale et al., 1984). НАК вводили практически одновременно с Vi-Ag. Титры антител к ЭБ и Vi-Ag определяли в реакции гемолиза эритроцитов в присутствии комплемента. Все реакции проводили на стерильных пластиковых микропланшетах.

Гуморальный иммунный ответ, оцениваемый по ОДЛТА, отражает способность органов системы иммунитета синтезировать IgM через 5 сут (для ЭБ и Vi-Ag), IgM (для ЭБ и Vi-Ag) и IgG через 8 сут (для ЭБ и Vi-Ag) и IgG (для ЭБ)– через 14, 20 сут (Ройт и др., 2000;

Хаитов и др., 2002;

Casale et al., 1983).

При подострой интоксикации НАК иммунизацию антигенами осуществляли на 2 сут после первого введения НАК (исследование проводили на 7 сут). При хроническом действии НАК в течение 30 и 60 сут иммунизацию делали соответственно на 26 и 56 сут хронической интоксикации (исследование проводили на 31 и 61 сут соответственно).

Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому и тимуснезависимому антигенам оценивали также через 5 сут по числу АОК в селезенке (Белокрылов и др., 1980;

Jerne, Nordin, 1963) после воздействия НАК с одновременной (или через 3, 25 и 55 сут после действия НАК) внутрибрюшинной иммунизацией крыс ЭБ в дозе 2·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и брюшнотифозного Vi-Ag в дозе мкг/кг (использованный тест отражал синтез IgM B-клетками селезенки).

АОК, характеризующие продукцию IgG к Т-зависимому антигену, определяли в селезенке методом непрямого локального гемолиза в геле (Ройт и др., 2000) через 8 и 14 сут после интоксикации (при подостром действии – в эти же сроки после первого введения НАК). Практически одновременное введение НАК с ЭБ после иммунизации позволяло оценить их влияние на индуктивную фазу гуморального иммунного ответа, а через 3 сут – на продуктивную (Корнева, 1985;

Ройт и др., 2000;

Deskotes, 1986;

).

При оценке хронического действия НАК иммунизацию проводили через 25 и 55 сут после его ежедневного введения. Исследование гуморальной иммунной реакции (АОК, характеризущие продукцию IgM) к тимусзависимому и тимуснезависимому антигенам оценивали через 5 сут после иммунизации (на 30 и 60 сут после действия НАК). При определении числа АОК, характеризущих синтез спленоцитами IgG, иммунизацию ЭБ проводили через 23 и 17 сут при хроническом действии НАК в дозе 0.01 в течение 30 сут и через 53 и 47 сут при хроническом действии НАК в дозе 0.005 LD50.

Оценка функции Т-лимфоцитов. Исследование функции Т-лимфоцитов проводили по РТМЛ периферической крови в присутствии конконавалина А (КонА). РТМЛ основана на способности сенсибилизированнных Т лимфоцитов в реакциях с антигеном или митогенами (ФГА, КонА) in vitro выделять биологически активные субстанции – лимфокины, в том числе фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов (один из лимфокинов воспаления) (Фримель, Брок, 1986).

Для исследования РТМЛ кровь у крыс получали из подъязычной вены через 1, 3 и 6 сут после интоксикации, а также через 30 сут после хронического воздействия. В капилляры для определения С-реактивного белка набирали с часового стекла смесь, состоящую из гепаринизированной крови (0,2 мл) исследуемых крыс (опыт и контроль) и раствора КонА (0, мл). Концентрация митогена (КонА) в растворе составляла 100 мкг/мл.

Капилляры запаивали с одного конца парафином и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, затем в вертикальном положении их инкубировали 24 ч в термостате при температуре 37С. Учет реакции проводили путем измерения длины зоны миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте (Гембицкий и др., 1987).

Результат реакции оценивали в виде индекса миграции (ИМ), выраженного в процентах:

Длина зоны миграции с КонА ИМ = ------------------------------------------- х Длина зоны миграции в контроле Величина ИМ обратно пропорциональна активности Т-клеток.

Исследование функции Th1-лимфоцитов по реакции гипер чувствительности замедленного типа. Оценка формирования ГЗТ после действия НАК позволяет установить действие токсиканта на клеточный иммунитет, в частности на функцию Th1-лимфоцитов (Ройт А. и др., 2000), а также на участвующие в реализации гиперчувствительности IV типа Т клеток памяти и макрофагов (Ройт, 1991;

Хаитов и др., 2002).

ГЗТ оценивали у крыс после иммунизации внутривенным введением 2108 ЭБ в 0.5 мл изотонического раствора хлорида натрия одновременно с действием НАК. Разрешающую (вызывающую реакцию) дозу ЭБ (5·108 в 0. мл изотонического раствора хлорида натрия) вводили под апоневроз задней лапы на 4 сут после иммунизации. Оценку реакции осуществляли через 24 ч по приросту массы стопы задней лапы крыс по сравнению с контрольной (Брюхин и др., 1990). Данный тест отражал функцию Th1 лимфоцитов и способность их к продукции ИЛ-3, -интерферона, -фактора некроза опухоли – лимфотоксина и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Georgiev, Albright, 1993;

Kimber, 1996). При оценке подострого и хронического действия НАК в течение 30 и 60 сут иммунизацию проводили через 2, 25 и 55 сут после ежедневного введения НАК. Исследование ГЗТ осуществляли на 5 сут после иммунизации (на 7, 30 и 60 сут после действия НАК). За 1 сут до исследования вводили разрешающую дозу антигена.

При исследовании формирования ГЗТ у крыс-реципиентов (линии Август) после переноса им спленоцитов (5·108), иммунизированных ЭБ (108) сингенных доноров, подвергавшихся действию НАК, крыс-реципиентов через 1 ч сенсибилизировали внутривенным введением ЭБ (108). Через 4 сут под апоневроз стопы реципиентов вводили разрешающую дозу ЭБ (5·108) с последующей оценкой реакции через 24 ч. Спленоциты получали через 5 сут после иммунизации доноров. В данном эксперименте формирование ГЗТ отражало влияние НАК на вторичный иммунный ответ в модели адаптивной реакции, связанной с переносом иммунных спленоцитов крысам реципиентам. Доноры подвергались воздействию НАК в тех же дозах и при таких же экспозициях, как и при оценке ГЗТ без переноса клеток.

Исследование антителозависимой клеточной цитотоксичности. В настоящее время доказано, что К-клетки – это ЕКК, использующие для усиления реакции антитела (Ройт и др., 2000;

Хаитов и др., 2002). При этом антитела (IgG) привлекают своим Fc-хвостом ЕКК, имеющие для этого соответствующий FcRIII. Возникает комплекс: клетка-мишень – антитело – ЕКК, в котором ЕКК реализует свою киллерную функцию в отношении клетки-мишени. Субпопуляция CD56+ и CD16+ (преимущественно) в АЗКЦ является эффекторной (Хаитов и др., 2002).

АЗКЦ, характеризующую функцию К-клеток (Фримель, Брок, 1986) определяли по методу Ю.И. Зимина, В.Ф. Ляхова (1985) через 5 сут после иммунизации, осуществляемой через 30 мин после введения НАК (оценка действия НАК в индуктивной фазе иммуногенеза). Кроме того, НАК применяли через 2 сут после иммунизации ЭБ (оценка действия яда в продуктивной фазе иммуногенеза). При оценке хронического действия НАК иммунизацию проводили через 25 и 55 сут после ежедневного введения НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 ;

исследование АЗКЦ осуществлялось через 5 сут после иммунизации (на 30 сут после действия НАК).

Крыс иммунизировали ЭБ (5108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия). Через 5 сут извлекали селезенку и тимус, готовили клеточные суспензии в растворе Хенкса, который затем фильтровали через капроновую сетку. Суспензии клеток дважды отмывали изотоническим раствором хлорида натрия по 10 мин при 400 g. Жизнеспособность клеток определяли методом суправитальной окраски 0.1% раствором трипанового синего. В качестве клеток-мишеней использовали трижды отмытые по мин при 400 g ЭБ, которые в 2.5% суспензии смешивали с равным объемом гипериммунной антисыворотки кролика в субагглютинирующем разведении (1:5000). Смесь инкубировали 30 мин при 37°С, а затем отмывали 3 раза раствором Хенкса и доводили до необходимой концентрации. Используемую антисыворотку предварительно инактивировали в течении 30 мин при 56°С.

Спленоциты (тимоциты) смешивали с ЭБ в соотношении 20:1 (абсолютные значения составляли соответственно 20106 и 1106) в 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного и инкубировали 4 ч при 37°С. После инкубации смесь клеток центрифугировали 20 мин при 200 g, собирали супернатант.

Цитопатогенность киллеров оценивали спектрофотометрическим методом по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов. Контролем служили пробы, содержащие эффекторы и интактные ЭБ. Измерения оптической плотности проводили при длине волны 412 нм на спектрофотометре СФ-46.

Уровень АЗКЦ оценивали по индексу цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

Е0 - Ек ИЦ = ------------------- х 100, где Еmax Е0 - оптическая плотность проб, содержащих эффекторные клетки и сенсибилизированные клетки мишени;

Ек - оптическая плотность супернатантов проб, содержащих эффекторные клетки и интактные эритроциты;

Еmax - оптическая плотность при максимальном гемолизе соответствующего числа эритроцитов (гемолиз проводили дистиллированной водой).

Исследование активности ЕКК. Оценка естественной цитотоксичности осуществлялась нерадиометрическим методом (Гордиенко, 1983, 1984), где клетками-эффекторами служили спленоциты крыс, а клетками-мишенями – эритроциты кур (ЭК). Очищенную взвесь лимфоцитов получали, удаляя прилипающие клетки инкубацией в колонках с нейлоновой ватой. Эффекторные клетки взвешивали в концентрации клеток в 1 мл питательной среды следующего состава: среда № 199 с добавлением до 10% истощенной ЭК эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина (300 мкг/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина ( Ед/мл). В ходе опыта обеспечивали соотношение эффектор - мишень 10:1, при этом концентрация клеток-мишеней (ЭК) составляла 106 в 1 мл питательной среды. Цитотоксический тест ставили в пластиковых камерах «Linbro» (76-013-05) с круглым дном. Результаты реакции учитывали по спектрофотометрическому определению концентрации гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЭК. В опытные лунки добавляли по 0. мл взвеси эффекторных клеток и по 0.1 мл взвеси ЭК. Проводили контроля: эффекторные клетки в питательной среде без ЭК;


питательная среда;

взвесь ЭК в питательной среде без эффекторов. В конце инкубации содержимое лунок осторожно ресуспендировали и камеры центрифугировали 5 мин при 100g. 0.2 мл надосадка переносили в другие свободные ряды микропластины, а к осадку приливали 0.2 мл 0.25% раствора додецилсульфата натрия (ДСН) для лизиса ЭК, оставшихся неразрушенными в ходе цитотоксической реакции. Оптическую плотность осадков измеряли в специально изготовленных микрокюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0.1 мл на СФ-46 при длине волны 413 нм.

Определяли количество гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЕКК ЭК, путем лизиса осадка 0.25% ДСН. Индекс цитотоксичности (ИЦ) определяли по формуле:

Ек - Ео ИЦ = ------------------------- х 100, где Ек Ек - оптическая плотность лизированного осадка ЭК контрольной пробы без эффекторов против лизирующего раствора;

Ео - оптическая плотность лизированных оставшихся в осадке опытной пробы неразрушенных ЭК против лизированного осадка эффекторных клеток без ЭК;

Функцию ЕКК оценивали через 1, 3 и 6 cут после острой интоксикации НАК, а также через 30 и 60 сут после хронического ее действия.

Определение КОЕс. Действие НАК на миграцию КОЕс из костного мозга в селезенку оценивали методом эндогенного колониеобразования после летального облучения мышей в дозе 8 Гр при экранировании костного мозга задней конечности до уровня 1/2 голени. Через 30 мин после облучения животных их подвергали действию НАК. Через 8 сут извлекали селезенку, фиксировали ее в растворе Боуэна и подсчитывали число КОЕ (Петров, Хаитов, 1972;

Till, McCulloch, 1961). При изучении хронического действия НАК на показатель миграции КОЕс облучение мышей проводили через 30 и 60 сут после воздействия НАК.

Оценка миграции и кооперации Т- и В- лимфоцитов. При исследовании кооперации Т- и В-клеток использовались клетки мышей в модели ex vivo.

Оценка функции этих популяций лимфоцитов в данной реакции осуществлялась по формированию АОК к ЭБ. Роль Т- и В-клеток определяли путем сравнения числа АОК после инкубации той или иной популяции лимфоцитов c показателем кооперации Т- и В-лимфоцитов после извлечения через 1 сут Т- или В-лимфоцитов из селезенки мышей линии СВА, подвергавшихся действию НАК в дозе 0.75 LD50. При этом соответственно В или Т-клетки для исследования реакции получали от интактных сингенных животных.

Для получения Т-клеток использовали метод фильтрования селезеночной суспензии через нейлоновую вату (“Нитрон”) (Ширшев, 1998).

Для выделения В-лимфоцитов применяли реакцию комплементзависимого масс-цитолиза. В качестве цитотоксической сыворотки использовали моноклональные антитела против Thy 1.2 антигенов Т-лимфоцитов мыши (Cedarlane Laboratories Limited;

London, Canada) (Marshak-Rothstein et al., 1979). Из суспензии спленоцитов макрофаги удаляли методом негативной селекции, используя их способность прилипать к стеклянной поверхности (Ширшев, 1998). Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим (она составляла 95-98%). Инкубируемая по методу J. K. Thomas и T.

Imamura (1986a), культура содержала 106 и 5·105 В- и Т-клеток соответственно, 107 ЭБ в 0.15 мл среды Хенкса. АОК подсчитывали в инкубационных камерах через 4 сут (Thomas, Imamura, 1986а). Данный тест отражает синтез IgM В-клетками селезенки при участии Т-хелперов типа (Тh1-лимфоцитов). Роль антигенпредставляющих клеток выполняли В лимфоциты (Ройт и др., 2000). Миграцию Т- и В-клеток оценивали по методике Хаитова и соавт. (1985).

Изучение способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ. Способность макрофагов 0к индукции гуморального иммунного ответа оценивали через 5 сут по числу АОК к ЭБ у крыс реципиентов Август после введения токсиканта сингенным крысам-донорам.

Макрофаги от крыс-доноров переносили реципиентам через 1 сут после острой интоксикации, через 6, 30 и 60 сут после подострой и хронической интоксикации соответственно. За 1.5 ч до переноса перитонеальных макрофагов в брюшную полость крысам вводили 2.5 108 ЭБ в 0.1 мл изотонического раствора хлорида натрия (Argyris, 1967).

Оценка активности эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов и состояния ПОЛ. Изменение эстеразной активности в клетках системы иммунитета отражает функциональную активность иммуноцитов и может служить количественным критерием Т-клеток в циркулирующей крови (Хейхоу, Кваглино, 1983).

Активность -нафтил-АS-ацетатэстеразы и -нафтил-бутиратэстеразы спленоцитов крысы (Т-клеток, моноцитов и макрофагов) изучали гистохимическим методом (Хейхоу, Кваглино, 1983). Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах крысы определяли методом G.M. Ellman et al (1961), выделяя клетки путем фильтрования селезеночной суспензии через нейлоновую вату (“Нитрон”) (Ширшев, 1998). 1.5 мл суспензии, содержащей 5108 клеток в 1 мл 0.1 молярного фосфатного буфера (рН–8.0), добавляли 20 мкл 0.075 моль ацетилхолин-иодида и 50 мкл 0. моль дитио-бис-нитробензойной кислоты. После 20 мин инкубации при 25С реакция останавливалась добавлением 100 мкл 1,5–дифтор-2,4 динитробензола и регистрировали увеличение оптической плотности спектрофотометрически (420 нм) (Szelenyi et al., 1982). За единицу активности АХЭ принимали мкмоль ацетилхолина, гидролизованного за мин в мл суспензии, содержащей 109 Т-лимфоцитов (Kutty et al., 1976).

Активность эстераз определяли через 2 сут после отравления НАК, а также через 30 и 60 сут после хронического действия НАК. ПОЛ оценивали по активности каталазы и пероксидазы, суммарной продукции радикалов и содержанию малонового диальдегида в крови (Коробейникова, 1989;

Валеева и др., 2002).

Исследование концентрации кортикостероидов в плазме крови.

Состояние ГГНС после действия НАК оценивали путем измерения массового индекса надпочечников у крыс и оценкой уровня КС в плазме крови крыс флюорометрическим методом. Определяли уровень неконъюгированных 11 оксикетостероидов (Давыдов, 1970), в частности, КС через 1 и 5 ч после интоксикации НАК, а также через 30 и 60 сут после его хронического действия.

Экстракция КС из анализируемых образцов плазмы крови проводилась четыреххлористым углеродом. Для удаления пигментов плазмы и нестероидных соединений экстракты промывались с помощью 0.1% раствора NaOH и дистиллированной воды. Затем верхний слой, включающий в себя КС, переносился, выпаривался и повторно экстрагировался 6 мл метиленхлорида или хлороформа. Для образования флюоресцентных комплексов использовалась смесь концентрированной серной кислоты и этанола в соотношении 3:1. После развития флюоресценции растворы исследовались на флюориметре с использованием интерферентных фильтров: первичного с пропусканием волн длиной 470 нм и вторичного – 540 нм.

Методы статистической обработки результатов исследований.

Полученные данные обрабатывались с применением общепринятых статистических методов (Урбах, 1975;

Гублер, 1978;

Лакин, 1980). При этом различия между средними значениями в опытной и контрольной группах считались значимыми при р0.05. Расчеты среднелетальных доз нитрилов проводили по методу Миллера и Тейтнера (Беленький, 1963). В исследованиях использовались параметрические методы исследования с оценкой достоверности различий по t-критерию Стьюдента.

Статистический анализ экспериментальных данных с небольшим числом животных в сериях и при отсутствии нормального распределения показателей осуществлялся с помощью непараметрических методов (Уилкинсон-Манни-Уитни, 2). Расчеты проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ Statgraphics.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ НИТРИЛОМ АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА СОСТОЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА 3.1. Влияние нитрила акриловой кислоты на неспецифическую резистентность организма к инфекции В экспериментах на беспородных мышах и беспородных крысах массой соответственно 18-22 и 180-220 г при введении НАК в дозах 0.25, 0.5 и 0. LD50, исследовалось состояние антиинфекционной неспецифической резистентности организма. В данной экспериментальной модели суточная культура E. сoli вводилась через 1 сут после применения НАК.

НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводил к увеличению летальности мышей и крыс от перитонита (рис. 3.1).

Летальность, % * * 1 2 3 Контроль 0.25 0.50 0.75 LD Рис. 3.1 Влияние острой интоксикации НАК на показатели летальности у мышей.

По оси ординат – показатель летальности у мышей. По оси абсцисс – доза НАК (LD50). В каждой серии использовалось от 15 до 21 животных;

* - различие с контролем достоверно - р0. Так, у мышей показатель летальности по сравнению с контролем, составляющим 50%, увеличивался соответственно на 16.6, 29 и 35%, а у крыс, при летальности в контроле 30% (р0.05) - соответственно - на 3.3, 20 и 31.1%. При этом статистически значимое увеличение данного показателя отмечалось у мышей и крыс при дозах, составляющих соответственно 0.25, 0.50 LD50 и 0.75 LD50.

При введении НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 у мышей и крыс отмечалось уменьшение LD50 E.сoli и Et50 (статистически значимое - р0.05 при дозах 0.50 и 0.75 LD50 ) (табл. 3.1, 3.2).

Таблица 3. Влияние острой интоксикации НАК на показатели неспецифической резистентности у мышей (M+m) Доза НАК, LD Показатель Контроль 0.25 0.50 0. LD50 E. сoli, 2.05+0.22 1.61+0.22 1.43+0.13* 1.20+0.14* 109 микр. тел (21) (18) (15) (15) Et50, ч 16.3+2.3 12.2+2.5 9.8+1.9* 8.5+2.4* (21) (18) (15) (15) Примечание: в скобках число животных в каждой серии;

* - различие с контролем достоверно р0.05.

Таблица 3. Влияние острой интоксикации НАК на показатели неспецифической резистентности у крыс без иммунизации (M+m) Показатель Доза НАК, LD Контроль 0.25 0.50 0. Летальность, % 30.0+8.4 33.3+12.1 50.0+11.2 72.2+10.5* (30) (15) (20) (18) LD50 E. сoli, 2.91+0.27 2.32+0.28 2.02+0.23* 1.87+0.21* 109 микр. тел (30) (15) (20) (18) Et50, ч 20.1+2.0 16.2+2.9 13.1+2.2* 10.5+2.5* (30) (15) (20) (18) Примечание: в скобках число животных в каждой серии;


* - различие с контролем достоверно р0. При подостром (1/7 LD50 в течение 6 сут) и хроническом действии НАК (0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно) летальность крыс увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 33.7, 50.0 и 38.4% (р0.05). При данных воздействиях НАК статистически значимо уменьшались LD50 E. сoli и Еt50 (р0.05) (табл. 3.3).

Таблица 3. Влияние НАК на летальность от экспериментального перитонита (E. сoli,), LD50 E.

сoli, и Еt50 у крыс без иммунизации (M+m) LD50 E.сoli (х Дозы, LD50,;

Летальность, Еt50, ч экспозиция, сут % микр. тел) Контроль 30.0+8.4 2.91+0.27 20.1+2. (30) (30) (30) НАК 73.7+10.1* 2.15+0.21* 13.0+2.2* (1/7 LD50 х 6) (19) (19) (19) НАК 80.0+10.3* 2.05+0.25* 11.2+2.5* (0.01 LD5030) (15) (15) (15) НАК 68.4+10.7* 1.99+0.22* 12.5+2.3* (0.005 LD50 60) (19) (18) (18) Примечание: в скобках - число животных в серии;

* - различие с контролем достоверно р0.05.

Выявленные изменения НРО под влиянием НАК могут быть обусловлены ингибированием многочисленных энзимов (в частности, эстераз) макрофагов, моноцитов и ЕКК и других клеток крови (Забродский, 2002), как самим ядом, так и его метаболитами. Помимо ингибирования эстераз редукция НРО обусловлена снижением процессов тканевого дыхания вследствие взаимодействия цианистого водорода (одного из метаболитов НАК) с компонентом а3 цитохромоксидазы митохондрий клеток крови (Ротенберг, 1980, 1982;

Голиков и др., 1986;

Забродский, 2002).

Таким образом, под влиянием острого, подострого и хронического отравления НАК происходит дозозависимое увеличение летальности крыс и мышей от экспериментального перитонита без предварительной иммунизации, прямо связанное с дозой снижение LD50 E. сoli и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием НАК неспецифической резистентности организма.

3.2. Влияние острого, подострого и хронического отравления НАК на обсемененность селезенки и циркулирующей крови E. сoli Нами установлено (табл. 3.4), что при остром, подостром и хроническом отравлении НАК при экспозиции 30 и 60 сут количество микробных тел E.сoli в крови статистически значимо (р0.05) возрастает соответственно в 2.34, 1.76, 2.08 и 1.61 раза, а в селезенке соответственно – 7.01, 8.75, 6.69 и 6.46 раза (р0.01). Существенных различий исследованных показателей при остром, подостром и хроническом действии НАК при исследованных концентрациях и экспозициях не выявлено.

Таким образом, после острого, подострого и хронического отравления НАК происходит увеличение содержания числа микробных тел E. сoli в циркулирующей крови и селезенке крыс после их введения по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма.

Таблица 3. Влияние НАК на содержание E. сoli в крови и селезенке крыс (M+m) Дозы, LD50,;

Обсемененность, число колоний экспозиция, сут Периферическая кровь Селезенка (в органе), х (0.05 мл) Контроль 32.5+9.1 (10) 10.3+3.3 (10) НАК 76.2+10.2* (8) 72.2+14.6* (8) (0.75 LD50) НАК 57.3+9.1* (8) 90.1+12.3* (8) (1/7 LD50 х 6) НАК 67.5+10.3* (8) 68.9+11.8* (8) (0.01 LD5030) НАК 52.4+9.2* (8) 66.5+12.5* (8) (0.005 LD50 60) Примечание: в скобках число животных в каждой серии;

* - различие с контролем достоверно - р0. 3.3. Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните после острой интоксикации нитрилом акриловой кислоты В экспериментах на белых крысах при подкожном введении НАК в дозе 0,75 LD50 исследовалось состояние антиинфекционной НИРО Нами установлено (рис. 3.2), что НАК приводит к увеличению летальности крыс от экспериментального перитонита. Так, по сравнению с контролем, составляющим 15.5+5.3%, этот показатель увеличивался после острой интоксикации НАК на 22.6% (р0.05). Увеличение летальности животных от экспериментальной инфекции сопряжено с уменьшением LD50 E. сoli и Еt50.

При действии НАК, LD50 E. сoli уменьшалась в 1.55 раза (р0.05), а Еt50 – в 1.34 раза (р0.05).

Летальность, % * * * * Контроль 0.75 LD50 1/7 LD50 х 6 0.01 LD5030 0.005 LD50 Рис. 3.2 - Влияние НАК на летальность от экспериментального перитонита (E. сoli), у крыс после иммунизации.

По оси ординат – показатель летальности у крыс. По оси абсцисс – доза (LD50) и экспозиция (сут). В каждой серии использовалось от 18 до 45 животных. * - различие с контролем достоверно - р0. При подостром (1/7 LD50 в течение 6 сут) и хроническом действии НАК (0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно) летальность крыс увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 34.5, 24.5 и 23.3% (р0.05). При данных воздействиях НАК (табл. 3.5) статистически значимо уменьшались LD50 E. сoli и Еt50 (р0.05).

Таблица 3. Влияние НАК на LD50 E. Coli, и Еt50 у крыс после иммунизации (M+m) LD50 E.сoli (х Серии опытов Еt50, ч микр. Тел) Контроль 8.5+1.1 41.5+4. (45) (45) НАК (0.75 LD50) 5.5+0.6* 30.0+3.1* (21) (21) НАК 4.1+0.7* 25.9+2.8* (1/7 LD50 х 6) (18) (18) НАК 5.0+0.5* 29.1+3.0* (0.01 LD5030) (20) (21) НАК 5.3+0.7* 28.5+2.7* (0.005 LD50 60) (18) (18) Примечание: в скобках - число животных в серии;

* - различие с контролем достоверно р0.05.

Существенных различий исследованных показателей при остром, подостром и хроническом действии НАК при исследованных концентрациях и экспозициях не выявлено.

Таким образом, после острого, подострого и хронического отравления НАК происходит увеличение летальности животных от экспериментального перитонита после предварительной иммунизации, снижение LD50 E. сoli и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием НАК неспецифической и иммунологической резистентности организма.

3.4. Влияние НАК на антиинфекционную неспецифическую и иммунологическую резистентность организма при экспериментальной пневмонии Опыты, проведенные на белых крысах, показали (табл. 3.6), что острое, подострое и хроническое действие НАК приводит к увеличению летальности крыс от экспериментальной пневмонии, вызванной Р. vulgaris.

Так, по сравнению с контролем, составляющим 22.8+7.1 %, этот показатель увеличивался после острой, подострой и хронической интоксикации НАК при экспозиции 30 и 60 сут соответственно на 34.5, 40.0, 30.0 и 33.3 % (р0.05).

Таблица 3. Влияние НАК на летальность от экспериментальной пневмонии (Р. vulgaris), LD50 Р.

vulgaris и Еt50 у крыс после иммунизации (M+m) Дозы, LD50,;

Летальность, % LD50 Р.vulgaris Еt50, ч (х109микр. тел) экспозиция, сут Контроль 20.0+6.8 5.5+0.7 48.4+4. (35) (35) (35) НАК 54.5+11.7* 3.0+0.4* 31.9+3.6* (0.75 LD50) (22) (23) (23) НАК 60.0+12.6* 2.8+0.6* 25.5+3.3* (1/7 LD50 х 6) (15) (15) (15) НАК 50.0+11.2* 3.2+0.5* 33.0+3.0* (0.01 LD5030) (20) (20) (20) НАК 53.3+14.2* 2.9+0.7* 26.1+2.6* (0.005 LD50 60) (15) (15) (15) Примечание: в скобках - число животных в серии;

* - различие с контролем достоверно р0. Увеличение летальности животных от экспериментальной инфекции закономерно сопровождалось уменьшением LD50 Р. vulgaris и Еt50. Так, при остром, подостром и хроническом отравлении НАК при экспозиции 30 и сут соответственно LD50 Р. vulgaris уменьшалась соответственно в 1.83, 1.96, 1.72 и 1.90 раза (р0.05), а Еt50 – соответственно в 1.52, 1.90, 1.47 и 1.85 раза (р0.05). Статистически значимых различий исследованных показателей при остром, подостром и хроническом действии НАК при исследованных концентрациях и экспозициях не выявлено.

Таким образом, после острого, подострого и хронического отравления НАК происходит увеличение летальности животных от экспериментальной пневмонии после предварительной иммунизации, снижение LD50 E. сoli и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о супрессии под влиянием НАК неспецифической и иммунологической резистентности организма.

3.5. Влияние острого, подострого и хронического воздействия НАК на сывороточную активность лизоцима После острого, подострого и хронического воздействия НАК при экспозиции 30 и 60 сут происходит уменьшение сывороточной активности лизоцима. Так, после острой интоксикации (0.75 LD50) через 6 сут показатель снижался в 1.82 раза (р0.05), через 1 сут после подострого отравления – в 2.02 раза (р0.05), а через 1 сут после хронического воздействия (0.01 и 0.005 LD50 в течение соответственно 30 и 60 сут) – в 2.39 и 2.60 раза (р0.05).

При остром действии НАК в дозах 0.25;

0.5 и 0.75 LD50 отмечался дозозависимый эффект: содержание лизоцима в крови снижалось соответственно в 1.26 (р0.05);

1.49 (р0.05) и 1.82 раза (р0.05) (рис. 3.3).

Супрессия активности лизоцима под влиянием НАК может быть обусловлена нарушением биохимических реакций клеток-продуцентов этого энзима (преимущественно нейтрофилов) вследствие инактивации компонента а3 ферментов тканевого дыхания митохондрий, ингибирования неспецифических эстераз клеток крови, а также вследствие эффекта НАК, связанного с гемопоэзом, в частности, созреванием эритроцитов (Ефремов, 1976;

Шустов и др., 1985;

Забродский, 2002). Редукция синтеза лизоцима может происходить также вследствие инициации ПОЛ (Голиков и др., 1986;

Василенко, 2004;

Забродский и др., 2005). Не исключено воздействие токсиканта на ДНК, что приводит к нарушению нуклеинового обмена (Шустов и др., 1985;

Голиков и др., 1986;

Забродский, 2002).

* 6 * * * * 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Рис. 3.3 - Влияние НАК на активность лизоцима сыворотки крови крыс. Варианты опытов: 1- контроль, 2- 0.25 LD50, 3 - 0.5 LD50, 4 -0.75 LD50, 5 - 1/7 LD50 6 сут, 6 - 0. LD50 30 сут, 7 - 0.005 LD50 60 сут По оси ординат – показатель активности лизоцима у крыс, мг/л. По оси абсцисс – доза (LD50) и экспозиция (сут), соответствующие острой, подострой и хронической интоксикации НАК. В каждой серии использовалось от 9 - 10 животных, контроль – особей. * - различие с контролем достоверно - р0. Исследование показателя активности изоцима сыворотки крови крыс при остром действии проводили через 6 сут, а при подостром и хроническом через 1 сут.

Ингибирование тканевого дыхания продуктом метаболизма НАК циан ионом сопряжено с редукцией окислительного фосфорилирования (Ротенберг, 1980, 1982;

Голиков и др., 1986;

Забродский, 2002) и снижением синтеза АТФ в нейтрофилах и других клетках крови. Нарушение продукции лизоцима, вероятно, наряду с действием НАК на клеточном уровне может быть обусловлено изменением активности ГГНС (Бухарин и др., 1974, 1998;

Забродский, 2002).

Таким образом, после острого, подострого и хронического отравления НАК происходит снижение активности лизоцима сыворотки крови, при этом после подострого и хронического действия НАК супрессия показателя приблизительно соответствует острому действию токсиканта (0.75 LD50) при регистрации показателя через 6 сут. Острое действие НАК характеризуется дозозависимым эффектом. Подострое и хроническое действие НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут существенно снижает активность лизоцима, причем степень ее редукции приблизительно соответствует супрессии параметра после острого действия НАК через 6 сут и подострого действия яда через 1 сут.

3.6. Изменение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов при интоксикации нитрилом акриловой кислоты В опытах на крысах показано, что под влиянием острого, подострого и хронического воздействия (при экспозиции 30 и 60 сут) НАК фагоцитарно метаболическая активность нейтрофилов (ФМАН) существенно снижалась.

Воздействие НАК приводило к значительному уменьшению фагоцитарного показателя, фагоцитарного числа и показателя НСТ-теста (спонтанного и индуцированного) в течение 1-9 сут.

Так, показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста под влиянием НАК через 1 сут снижались соответственно в 2.36 и 3.59 раза (р0.05). Восстановление показателей при остром действии НАК отмечалось к 12 сут (табл. 3.7).

После подострого и хронического действия НАК в дозах 0.01 и 0. LD50 (при экспозиции соответственно 30 и 60 сут) показатели ФМАН существенно снижались по сравнению с контролем (р0.05), причем степень их снижения приблизительно соответствовала редукции параметров после острого действия НАК в дозе 0.75 LD50 через 3 сут (табл. 3.8, рис.

3.4).

Таблица 3. Изменение фагоцитарно-метаболической активности ПЯЛ крыс под влиянием острого воздействия НАК (0.75 LD50) через 1-12 сут Срок наблюдения, сут Серии опытов Показатели 1 3 9 ФП 30.2±2. ФЧ 1.83±0. Контроль НСТ сп 0.31±0. НСТ инд 0.61±0. ФП 12.3±1.4* 19.2±1.8* 23.0±2.1* 26.1±2. ФЧ 0.35±0.12* 0.68±0.21* 1.19±0.14* 1.45±0. НАК НСТ сп 0.09±0.02* 0.16±0.02* 0.21±0.02* 0.26±0. НСТинд 0.17±0.03* 0.28±0.04* 0.45±0.04* 0.56±0. Примечание: ФП, ФЧ – соответственно фагоцитарный показатель, фагоцитарное число;

НСТ – НСТ-тест спонтанный и индуцированный – индекс активности ПЯЛ;

в каждой серии использовалось 9-11 животных;

* – различие с контролем достоверно р0. Таблица 3. Изменение фагоцитарно-метаболической активности ПЯЛ крыс под влиянием подострого и хронического воздействия НАК через 1 сут после воздействия НАК НАК НАК Показатели Контроль (1/7 LD50 х 6) (0.01 LD5030) (0.005 LD50 60) ФП 30.2±2.0 17.9±1.5* 20.3±2.0* 18.7±1.7* ФЧ 1.83±0.20 0.69±0.13* 0.77±0.22* 0.65±0.24* НСТ инд 0.61±0.04 0.28±0.03* 0.30±0.04* 0.34±0.04* Примечание: ФП, ФЧ – соответственно фагоцитарный показатель, фагоцитарное число;

НСТ инд. – НСТ-тест индуцированный – индекс активности ПЯЛ;

в каждой серии использовалось 8-11 животных;

* - различие с контролем достоверно р0. Полученные в НСТ-тесте данные могут позволить предположить, что воздействие НАК реализуется вследствие взаимодействия яда с НАДФ·Н, НАДФ+ (Румянцев, 1981;

Брызгина, 1989;

Лим, 2006). Действие НАК, помимо общетоксического эффекта (нарушение тканевого дыхания метаболитом циан-ионом), а также, вероятно, антиэстеразного эффекта (Германчук, 2000) может быть связано и с ингибированием ФАД+, ФАД·Н, восстановленным и окисленнным убихиноном и цитохромом b245 лейкоцитов или иными механизмами нарушения функционирования НАДФ·Н оксидазного комплекса нейтрофилов.

0, 0, 0, 0, * * 0,2 * 0, 0, 0, 1 2 3 4 Контроль 1/7 LD50 х 6 0.01 LD5030 0.005 LD50 Рис. 3.4 – Изменение показателей спонтанного НСТ-теста под влиянием подострого и хронического воздействия НАК (через 1 сут после воздействия).

По оси ординат – показатель индекса активности ПЯЛ (спонтанного НСТ – теста) у крыс, усл. ед. По оси абсцисс – доза (LD50) и экспозиция (сут). В каждой серии использовалось 8 - 11 животных. * - различие с контролем достоверно - р0. Возможно, НАК, кроме кислородзависимых антиинфекционных систем фагоцитоза, поражает и кислороднезависимые микробицидные системы фагоцитов (Забродский, 1998, 2002;

Кадушкин, 2007).

Исследование ФМАН после острого отравления НАК показало прямо связанное с дозой снижение данного параметра через 1 сут (табл. 3.9).

Важную роль в супрессии ФМАН может играть дисфункция ГГНС под влиянием НАК. При этом возможно изменение реактивности организма и снижение функции фагоцитов (угнетение их цитотоксичности) (Петров, 1987;

Брюхин, Михайлова, 1990;

Гребенюк и др., 1998;

Германчук, 2001;

Кадушкин, 2007).

Таблица 3. Изменение фагоцитарно-метаболической активности ПЯЛ крыс после острого отравления НАК в зависимости от дозы через 1 сут, % Срок наблюдения после воздействия: 1сут Доза, LD50 Показатель ФП 30.2±2. Контроль ФЧ 1.83±0. НСТсп 0.31±0. НСТинд 0.61±0. ФП 19.8±1.3* ФЧ 1.23±0.12* 0. НСТсп 0.17±0.02* НСТинд 0.48±0.04* ФП 16.0±1.5* ФЧ 0.79±0.14* 0. НСТсп 0.13±0.02* НСТинд 0.32±0.04* ФП 12.3±1.4* ФЧ 0.35±0.12* 0. НСТсп 0.09±0.02* НСТинд 0.17±0.03* Примечание: ФП, ФЧ – соответственно фагоцитарный показатель, фагоцитарное число;

НСТ – НСТ-тест спонтанный и индуцированный – индекс активности ПЯЛ;

в каждой серии использовалось 8-11 животных;

* - различие с контролем достоверно р0. В экспериментах на животных показано, что глюкокортикоиды снижают суммарную фагоцитарную активность фагоцитов, причем существенную роль в данном феномене играет адреналин (Шилов, 2001).

Данные литературы позволяют полагать, что НАК может снижать функцию ГГНС, однако это не исключает роли гормонов надпочечников в изменении ФМАН. Возможно, снижение продукции кортикостерона (так же как и ее повышение) ингибирует активность фагоцитов. Редукция активности ФМАН может быть связана с мембранотоксическим действием НАК, инициацией ПОЛ мембран нейтрофилов, взаимодействием продуктов метаболизма НАК с различными радикалами на мембране макрофагов и микрофагов, супрессией функции ферментов тканевого дыхания митохондрий продуктом биотрансформации НАК циан-ионом ПЯЛ (Ротенберг, 1980, 1982;

Лудевиг, Лос, 1983;

Голиков и др., 1986;

Забродский, 1998, 2002). Не исключено ингибирование НАК эстераз нейтрофилов (Забродский, 1998, 2002;

Кадушкин, 2007, Li et al., 1973).

Таким образом, после острого отравления НАК происходит дозависимое снижение ФМАН до 12 сут. Подострое и хроническое действие НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут существенно снижает показатели ФМАН, причем степень их уменьшения приблизительно соответствует редукции параметров после острого действия НАК через 3 сут и подострого действия яда через 1 сут.

* * * Полученные результаты исследований показали, что под влиянием острого(0.75 LD50), подострого (1/7 LD50 в течение 6 сут) и хронического отравления НАК (0.01 LD50 в течение 30 и 60 сут) происходит дозозависимое увеличение летальности крыс и мышей от экспериментального перитонита без предварительной иммунизации, прямо связанное с дозой снижение LD E. сoli и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием НАК НРО.

Установлено, что после острого, подострого и хронического отравления НАК происходит увеличение содержания числа микробных тел E. сoli в циркулирующей крови и селезенке крыс после их введения по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении НРО.

После острого, подострого и хронического отравления НАК происходит увеличение летальности животных от экспериментального перитонита и пневмонии после предварительной иммунизации, снижение LD50 E. сoli и P.

vulgaris соответственно и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием НАК НИРО. Степень редукции показателей НРО и НИРО при остром действии НАК (0.75 LD50) приблизительно соответствует снижению параметров при подостром и хроническом эффекте НАК (0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно).

После острого, подострого и хронического отравления НАК происходит снижение активности лизоцима сыворотки крови, при этом после подострого и хронического действия НАК супрессия показателя приблизительно соответствует острому действию токсиканта (0.75 LD50) при регистрации показателя через 6 сут. Острое действие НАК характеризуется дозозависимым эффектом. Подострое и хроническое действие НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут существенно снижает активность лизоцима, причем степень ее редукции приблизительно соответствует супрессии параметра после острого действия НАК через 6 сут и подострого через 1 сут.

Под влиянием острого отравления НАК происходит дозависимое снижение ФМАН до 12 сут. Подострое и хроническое действие НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут существенно снижает показатели ФМАН, причем степень их уменьшения почти соответствует редукции параметров после острого действия НАК через 3 сут и подострого через сут.



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.