авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
-- [ Страница 1 ] --

Проблема

митогенетического

излучения

как аспект

молекулярной

биологии

А. А. Гурвич

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

ИЗДАТЕЛЬСТВО.МЕДИЦИНА' ЛЕНИНГРАДСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

1968

УДК 612.014.483 : 577.23

Гурвич А. А. Проблема митогенетического излучения как

аспект молекулярной биологии, 14 л.

В монографии излагается основной фактический материал

по проблеме митогенетического излучения, открытого профес-

сором А. Г. Гурвичем в 1923 г.

В специальной главе рассматривается механизм возникно вения излучения, основанный на рекомбинациях свободных радикалов.

В последующих главах рассматривается вопрос о биоло гическом значении излучения. Митогенетическое излучение яв ляется обязательным звеном в цепи процессов, приводящих клетку к делению, оно предшествует первым фазам митоза и может быть зарегистрировано па синхронно делящихся клет ках в виде «премитотической» вспышки. Следовательно, энер гетическая роль фотонов митогенетического излучения в про цессе клеточного деления нормальных и малигнизирующихся тканей очень существенна.

Спектральный анализ митогенетического излучения яв ляется тонким индикатором функциональных состояний нерв ной и мышечной систем, включая и сердечную мышцу. Ха рактеризуя некоторые структурно-энергетические параметры молекулярного субстрата, спектры позволяют составить пред ставление о связи лабильных молекулярных структур субстра та с функциональными состояниями.

В монографии рассматривается концепция А. Г. Гурвича о специфическом для живых систем неравновесно-упорядочен ном состоянии молекулярного субстрата. Значительное место уделено изложению общебиологических представлений А. Г. Гурвича, подводящих к этой концепции и к теории био логического поля. Достаточно подробно изложены и основные положения теории поля Необходимость анализа биологических явлений с точки зрения непрерывного сопряженного взаимодействия различных уровней — системного, клеточного, молекулярного, — вытекаю щая из этих биологических построений, обосновывается раз нообразными фактическими данными и позволяет рассмат ривать проблему митогенеза как одно из принципиальных направлений молекулярной биологии.

В книге приводится также основной материал, характе ризующий «раковый тушитель» митогенетического излучения, на примере которого видно практическое значение теоретиче ских и экспериментальных исследований проблемы митогенеза.

В книге имеется 51 таблица, 35 рисунков, библиография — 108 названий.

Издание одобрено и рекомендовано к печати Редакционыо-издательским советом при Академии медицинских наук СССР 5-3- 52- Предисловие Одним из крупных достижений советской теоретиче ской биологии является открытие покойным А. Г. Гур вичем феномена митогенетического излучения. В орга нической связи с этим открытием в результате много летнего упорного анализа процессов эмбриогенеза им была создана теория биологического поля.

В свете современных достижений молекулярной био логии взгляды А. Г. Гурвича приобретают новый инте рес и с точки зрения понимания сути химических (био химических) и энергетических реакций, протекающих на уровне молекул, и с точки зрения взаимоотношений явлений молекулярного уровня с высшими иерархиче скими уровнями организма, как клеточным, так и охва тывающим организм как целое.

В монографии доктора биологических наук А. А. Гур вич — дочери и продолжательницы идей А. Г. Гурви ча— в сжатой форме изложены его представления о сущности и биологическом значении митогенетиче ского излучения и основные положения теории биоло гического поля. Вместе с тем она творчески дополнила эти материалы итогами собственных многочисленных исследований, в значительной степени углубившими представления и теоретические обобщения и показав шими большое значение идей А. Г. Гурвича для совре менной молекулярной биологии. В этом, с моей точки зрения, заключается ценность и интерес труда А. А. Гур вич, который с большой пользой прочтут не только спе циалисты по молекулярной биологии, но и многие био химики, биофизики, общие биологи, физиологи, пато физиотоги, любознательные студенты биологических и медицинских высших учебных заведений Действ. чл. АН СССР В. В. Парин От автора Учение о митогенетическом излучении излагается в виде монографий в шестой раз, начиная с 1932 года.

Структура предшествующих книг, авторами которых являлись А. Г. Гурвич и Л. Д. Гурвич — создатели всего направления исследований, менялась в зависимости от поставленных целей. В двух первых изданиях (1932, 1934 гг.) излагалась, по существу, вся совокупность зна ний в новой тогда области. В последующих (1945, 1959 гг.) давалась исчерпывающая трактовка несколь ких основных направлений проблемы митогенеза.

В 1948 г. авторы дали в небольшой монографии введе ние в учение о митогенезе, излагающее необходимые основы для более подробного ознакомления.

Настоящая небольшая монография построена анало гично изданиям 1945, 1959 годов, т. е. дает возможно бо лее полное изложение современного состояния отдель ных вопросов. При этом большой упор сделан на описа ние фактов, характеризующих молекулярный субстрат живых систем, и на их трактовку, вытекающую из обще биологических представлений А. Г. Гурвича. Именно по этому в книгу введена глава, рассматривающая пред посылки теории биологического поля, созданной А. Г. Гур вичем, и основные положения этой концепции.

Такой характер монографии обусловливает и данное ей заглавие, — митогенез, несомненно, является одним из направлений широко рассматриваемого понятия «моле кулярной биологии».

Все данные последних лет, изученные как методом биологической детекции излучения, так и путем регистра ции излучения на чувствительных фотоэлектронных умно жителях, могли быть получены только благодаря тесной совместной работе с сотрудниками лаборатории В. Ф. Ере меевым и Ю. А. Карабчиевским, которым приношу за это большую благодарность.

А. А. Гурвич.

Введение Длительное разностороннее изучение проблемы ми тогенетического излучения позволило уже лет тридцать тому назад поставить вопрос о его биологическом зна чении. Биологическое значение излучения — ясного по своей физической природе явления — двояко по своему смыслу. Ультрафиолетовые фотоны играют роль энерге тических факторов высокого потенциала, значительно превышающих по своему уровню макроэргические связи.

При их поглощении молекулами возникают не только первичные элементарные акты (диссоциация молекул, ионизация, возбуждение), но и вторичные последствия, развивающиеся в биологических субстратах в виде цеп ных процессов.

Наряду с этим, излучение дает сведения о чрезвы чайно лабильных структурных состояниях молекуляр ного субстрата, позволяя сопоставить их изменения с физиологической сменой функциональных состояний.

Ультрафиолетовое излучение очень малой интенсив ности (несколько десятков тысяч фотонов /см /сек) вы зывает в соответствующих субстратах разветвленные цепные химические процессы.

Эти явления лежат в основе стимуляции клеточных делений, т. е. оказывают «митогенетическое» действие.

Задачи, ставящиеся при изучении молекулярных процессов на живых системах методом излучения, от личаются от постановок вопросов, характеризующих современные генетические и биохимические исследо вания, авторы которых видят прямую зависимость вто ричных и третичных молекулярных (белковых) струк тур от химического строения первичных цепей, г. е.

держатся в своих построениях исключительно в преде лах молекулярного уровня.

А. Г. Гурвич видел, напротив, сущность задачи в изу^ чении взаимоотношений молекулярного уровня с выше стоящими— клеточным уровнем и уровнем целого орга низма. Истоками такого подхода являлись результаты долголетнего последовательного анализа процессов эм бриогенеза, заставившие А. Г. Гурвича прийти к выводу о необходимости допущения непрерывного регулирую щего («нормирующего») действия целого на простран ственные параметры поведения клеток.

Принципы теории биологического поля были постро ены именно на этой основе.

Возможность анализа молекулярных процессов на живых объектах при помощи митогенетического из лучения позволила прийти к следующему выводу. Пред ставление о молекулярных структурах, специфичных для живых систем, должно быть расширено по суще ству: наряду с равновесными структурами любой сте пени устойчивости необходимо допустить существование неравновесной молекулярной упорядоченности1.

Это значит, что какая-то статистически постоянная доля высокомолекулярных элементов поддерживается за счет энергии метаболизма в состоянии взаимной ла бильной ориентации, создавая системы общих энерге тических уровней. Пространственные параметры таких «неравновесных молекулярных констелляций», обладая известными степенями свободы, зависят вместе с тем от воздействия вышестоящих уровней — клеточного уровня, уровня целого. Целое выступает, таким обра зом, и относительно молекулярного субстрата, как не прерывно «работающий, нормирующий» фактор.

Вместе с тем, определение упорядоченности как неравновесной подчеркивает динамичность всего поня тия. Представление о молекулярном субстрате неотде лимо от представления о молекулярных процессах, включая и процессы деформаций молекулярных ком плексов, т. е. непрерывные модификации стерических состояний. Отсюда понятие «физиологической теории протоплазмы».

Введение в биологию совершенно необходимых ей физических и химических понятий нужно рассматривать, с точки зрения А. Г. Гурвича, не как самоцель, а как путь для построения по возможности единой системы молекулярных представлений, соответствующей биологи ческим требованиям.

Нужно отметить близость в этом отношении взглядов А, Г. Гурвича и Э. С. Бауэра.

Физические и физико-химические основы ГЛАВА 1.

митогенетического излучения и фотохимические последствия его действия В этой главе, где будут подробно разбираться кон кретные вопросы механизма возникновения излучения и фотохимических процессов, возникающих в результа те облучения, можно сразу же выделить основные вехи:

а) свободнорадикальный механизм возникновения излучения, б) значение фотона излучения как энергетического фактора, значительно превышающего по своему уров ню макроэргические связи и вызывающего процессы цепного характера.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС ИЗЛУЧЕНИЯ Наиболее общее определение митогенетического из лучения сводится к следующему — это ультрафиолето вое излучение широкого диапазона, возникающее при экзотермических химических реакциях, протекающих in vitro и в живых системах и характеризующееся очень малой интенсивностью. Поглощение молекулами такого слабого потока высокоэнергетичных фотонов приводит к ряду последствий, выливающихся в живых системах в различные макроявления. Стимуляция излучением клеточных делений является как раз одним из таких, биологически наиболее важных явлений.

Однако, несмотря на определенность наблюдаемых явлений, создание конкретной энергетической схемы возникновения излучения представляло затруднение, так как митогенетическое излучение с средней энергией фотонов в 100 ккал/моль систематически обнаружива лось и изучалось на ферментативных процессах с вало вым тепловым эффектом всего в несколько ккал/моль.

Выход был указан фотохимиком Frankenburger (1933), к общим положениям которого позднее были высказаны Н. Н. Семеновым и Я. Б, Зельдовичем очень существенные дополнения (см. А. Г. Гурвич, Л. Д. Гур вич, 1945).

Frankenburger, исходя из очень слабой теплотности процессов, дающих митогенетическое излучение, и при нимая, вместе с тем, во внимание ничтожную интенсив ность излучения1 пришел к выводу, что единственным энергетическим источником могут быть лишь процессы с высокой теплотностью, сопровождающие основной ход реакции, но возникающие, однако, настолько редко, что они не отражаются сколько-нибудь заметным об разом на валовом термическом балансе реакции. Таки ми процессами могут быть лишь рекомбинации свобод ных радикалов, появляющиеся в ничтожных количе ствах при ферментативных реакциях. Речь может идти о наиболее простых, реакционноспособных радикалах или атомах: радикалах гидроксила, карбонильной груп пе, амино- или иминогруппе, атомах водорода или кис лорода.

Согласно представлению Frankenburger, энергия возникающая при их рекомбинациях не излучается не посредственно. Как правило, она поглощается теми или иными из молекул субстратов реакции и высвечивается ими с характерным для них спектром. Гипотеза Fran kenburger содержала, таким образом, два допущения, доступных экспериментальной проверке: появление в реакциях свободных радикалов или атомов и поглоще ние энергии их рекомбинаций молекулами субстрата с ее последующим высвечиванием.

Мы приведем экспериментальные обоснования этих положений, предпослав им сначала те необходимые до полнения, которые были сделаны Н. Н. Семеновым и Я. Б. Зельдовичем. Ими было указано на то, что в реакциях с крайне слабым положительным энергетиче ским балансом не могут возникать радикалы в боль По оценке физиков, работавших между 1930—1940 гг. со счетчиками фотонов Гейгера — Мюллера (Rajewski, Г. М. Франк и С. Ф. Родионов, Barth, Siebert, Audubert) интенсивность излучения порядка нескольких тысяч фотонов от квадратного сантиметра ис точника в 1 сек. Получаемые в настоящее время результаты на фотоумножителях подтверждают эти данные.

шем количестве, чем они представлены в самом субст рате без прибавления фермента, так как фермент лишь катализирует, т. е. ускоряет реакцию. Для возникнове ния в большем количестве свободных радикалов необ ходимы, таким образом, еще какие-то дополнительные источники энергии, которые вовлекаются в общий процесс.

Внимательное изучение условий, при которых на блюдается высвечивание ферментативных реакций, по казало, что необходимым условием является наличие атмосферного кислорода, а в большинстве изученных реакций и видимого света 1.

Наиболее вероятным является следующее представ ление: фермент вызывает в субстрате АВ какие-то из менения, которые могут идти и без участия видимого света или кислорода и которые можно обозначить как АВ1 или расщепление на А +В. Расщепление молекул или их отдельных функциональных групп до радикалов (т. е. дальнейшие изменения АВ1 или А + В) происхо дят редко и только при наличии света или кислорода.

Экспериментальное обоснование второго положения Frankenburger, утверждавшего, что энергия рекомби наций радикалов поглощается окружающими молеку лами с последующим высвечиванием, было получено следующим образом. К системе фермент + субстрат прибавлялось третье вещество, заведомо не участвую щее в данной реакции, спектр излучения которого был известен из предшествующих исследований. Производи лось наблюдение за тем, не возникают ли в спектре, характерном для данной реакции добавочные полосы, типичные для прибавленного вещества.

Ряд положительных результатов говорил о правиль ности этого допущения и, по-видимому, о всеобщности этого принципа. В качестве излучающих систем чаще всего брались предварительно облученный ослаблен ным ультрафиолетовым излучением, т. е. фотовозбуж денный, раствор гликокола, приобретающий способ ность к слабому длительному последующему высвечи ванию в ультрафиолетовой области, и классическая Опыты проводят, как правило, при рассеянном дневном свете (при закрытых окнах) и отсутствии в комнате источников ультра фиолетового излучения.

ферментативная система — уреза + мочевина. Спектры излучения обеих систем предварительно тщательно изу чались. Прибавление к той и другой системе неболь ших концентраций глюкозы меняло спектральную кар тину — наряду с типичными для обеих систем полоса ми, возникали и полосы, характерные для глюкозы (рис. 1) (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1939). Излучение, или флуоресценция, вещества за счет поглощения им Рис. 1. Примеры спектров сенсибилизирован ной флуоресценции, полоса 2290—2300 (за штрихованная) характеризует излучение гли [кокола (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945).

1 — облученный гликокол +радикал PO 4 (раствор ортофос форной кислоты);

2 — излучение при ферментативном рас щеплении нуклеиновой кислоты или лецитина;

3—облу ченный гликокол+ фосфорнокислый натрий;

4 — облучен ный гликокол + хлористый натрий.

энергии, выделяющейся при химической реакции, было обозначено по предложению физика А. Н. Филиппова как «сенсибилизированная» флуоресценция. По своему существу оно равнозначно понятию хемилюминес ценции.

Описанные данные являются лишь частью более широких исследований, показавших, что именно этот механизм передачи энергии является общим принципом возникновения митогенетического излучения.

Разумеется, предварительная контрольная проверка — прибав ление глюкозы к необлученному предварительно гликоколу или к раствору уреазы (отдельно) и к раствору мочевины (отдельно) — не давала положительных результатов, Исследования E. А. Гордон (1940) показали хоро шее совпадение спектра бензола, изученного физиче ским методом (Pringsheim), со спектром сенсибилизи рованной флуоресценции, возникающим при прибавле нии бензола к ферментативной системе (рис. 2). Таким образом, было обнаружено сходство между флуорес ценцией, наблюдаемой митогенетическим методом, и флуоресценцией в обычном физическом смысле слова.

Рис. 2. Спектры бензола (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гур вич, 1945) / — спектр флуоресценции паров бензола (по Prlnqshelm);

2 —спектр излучения водного раствора бензола при раство рении в нем предварительно облученного гликокола.

Основные митогенетические данные могли быть по этому рассмотрены с этой же точки зрения.

Исследование различных химических соединений показало, что далеко не все вещества являются флуо ресцентами. В частности, представляющие особенный биологический интерес высокомолекулярные соедине ния — гликоген, белки, нуклеиновые кислоты — не флу оресцируют как целые молекулы. Их элементы, особен но ясно это показано для нуклеиновой кислоты, обла дают, однако, способностью к сенсибилизированной флуоресценции. При прибавлении фермента фосфата зы (кашица печени) к раствору дезоксирибонуклеино вой кислоты от крупного органического ядра отщеп ляется входящий с ним в эфирную связь радикал фос форной кислоты — PO 4. При этом возникает излучение, характеризующееся определенным спектром. Идентич ный спектр получается и при ферментативном расщеп лении лецитина, также заключающего радикал фосфата в эфирной связи. Одно это уже показывает, что излуче ние как-то связано с свободным радикалом фосфата, т. е. что флуоресцентом является именно он. Действи тельно, при прибавлении к излучающему гликоколу следов фосфорно-кислого натрия в спектре возникают полосы, наблюдающиеся при действии фосфатазы и, наряду с этим, ряд новых полос, которые предположи тельно можно связать с ионом натрия.

Это предположение подтвердилось, когда к излу чающему гликоколу вместо фосфорнокислого натрия прибавляли некоторое количество хлористого натрия.

В возникающем при этом спектре излучения обнаружи вались все те полосы, которые приписывались иону натрия (см. рис. 1).

Из этих данных следует, что самая характерная часть нуклеотида — пуриновые основания — не находит отражения в спектре сенсибилизированной флуоресцен ции. Вместе с тем, способностью к флуоресценции об ладают простые ионы и радикалы. Кроме того, совпа дение спектра излучения глюкозы, наблюдаемого при ее прибавлении к чуждой ей ферментативной системе, со спектром, возникающим в системе глюкоза — зима за, показывает, что и во втором случае флуоресцируют именно не затронутые ферментативным расщеплением молекулы глюкозы.

Другими словами, для различных, не высокомолеку лярных, химических соединений (элементов) вероятность возникновения излучения под влиянием поглощенной ими химической энергии велика. Закономерностью об щего характера является то, что высокомолекулярные соединения как целое не флуоресцируют.

Наряду с этим в составе пептидов обнаружено на личие так называемой флуорофорной группы. Пептид ная связь — функциональная группа, соединяющая два соседних пептида, обладает способно стью к высвечиванию поглощенной ею химической энергии. На это указывает совпадение спектров сенси билизированной флуоресценции двух различных дипеп тидов: глицил-глицина, состоящего из двух остатков гликокола, и глицил-тирозина, состоящего из остатков гликокола и тирозина. Общей для этих веществ являет ся только пептидная связь (гликокол, входящий в со став обоих пептидов, не флуоресцирует). При фермен тативном расщеплении этих дипептидов возникают полосы, характерные для пептидной связи. И в этом случае флуоресцируют элементы (в данном случае от дельные входящие в молекулы функциональные груп пы, а не молекулы целиком), не расщепляющиеся не посредственно ферментами.

Описанные факты достаточно обосновывают право рассматривать излучение, возникающее при фермента тивных процессах, как флуоресценцию тех или иных при сутствующих в растворах веществ независимо от того, участвуют ли они в данной реакции или нет. Сами же радикалы, рекомбинация которых дает необходимую энергию, остаются при этом как бы в тени, за исклю чением радикала гидроксила, полоса которого обнару живается во многих случаях ферментативного расщепле ния. Описание методов обнаружения радикалов являет ся задачей настоящей главы. Расчет энергетического баланса будет производиться с учетом участия в реак ции видимого света и атмосферного кислорода.

Первый этап состоял в определении спектров-этало нов трех радикалов, наиболее существенных для ана лиза ферментативных реакций: гидроксила, свободной карбонильной группы и свободной амино- или имино группы. Определение было основано на том, что при фотодиссоциации данного тела возникают следующие возможности:

1) энергия фотона облучения достаточно велика для расщепления данного соединения и для возбуждения одного из возникающих при этом радикалов, 2) энер гии фотона не хватает для этих двух актов, т. е. ради калы освобождаются в невозбужденном состоянии. Но можно предположить, что при достаточно интенсивном облучении свободный радикал поглотит второй фотон, которым и будет возбужден.

Из интересующих нас радикалов только гидроксил удовлетворяет первому условию. Если исходить из пе рекиси водорода, на диссоциацию которой на два гид роксила нужно затратить приблизительно 52 ккал/моль, и из энергии возбуждения гидроксила, равной прибли зительно 93 ккал/моль, то при подсвечивании полосой ультрафиолетового, даже очень слабого излучения в обла сти 1900 А, соответствующей 150 ккал/моль, поглощение одного фотона может сразу привести к появлению возбужденного радикала гидроксила. Действительно, облучение перекиси водорода излучением ферментатив ных процессов, субстраты которых содержат глюкозу или мочевину (вещества, в спектры флуоресценции ко торых входит полоса 1900 ), приводит к возникновению возбужденного гидроксила, — возникает полоса его флуо ресценции 3060.

В противоположность этому возникновение свобод ной карбонильной группы в возбужденном состоянии, которая может быть получена при диссоциации ацето на, возможно только при облучении ацетона более ин тенсивным ультрафиолетовым источником. Это объяс няется тем, что для расщепления ацетона тре буется фотон значительно большей энергии (порядка 140 ккал/моль) и, следовательно, для возбуждения сво бодной карбонильной группы необходимо практически одновременное поглощение второго, тоже высокоэнер гетического, фотона. Полоса излучения возбужденной карбонильной группы лежит в области 2020—2040.

Таким же методом обнаруживается эмиссионный спектр свободной аминогруппы. Он возникает при под свечивании водного раствора аммиака достаточно ин тенсивным ультрафиолетовым облучением коротковол новой области с энергией фотонов порядка 150 ккал/моль или при одновременном подсвечивании двумя полоса ми: одной, лежащей у границы сплошного поглощения аммиака (2260 ), и второй, соответствующей полосе ис пускания аминогруппы (2530 ). Таким образом, и в этом случае речь идет о двухактном процессе, т. е. сначала об отщеплении аминогруппы, а затем о ее возбуждении.

Таким образом, спектры-эталоны трех наиболее важных для ферментативных реакций радикалов да вали возможность изучения светящихся фаз реакций.

Приведем пример одного из опытов с системой глю коза + зимаза (из дрожжевой вытяжки). Спектр излу чения данной реакции, включающий в основном полосы, характерные для глюкозы, состоит из 4 полос: 1900— 1920, 1940—1950, 1960—1970, 2160—2170 и, кро ме того, из полосы 3060—3070, типичной для свобод ного радикала гидроксила.

Раствор глюкозы (5%) подсвечивается полосой 2030—2040 от значительно ослабленного излучения водородной лампы. При этом констатируется отсутствие излучения раствора. Затем к такому же раствору глю козы прибавляется фермент (в отношении 1 : 100) и повторяется подсвечивание. В растворе возникает из лучение, содержащее спектральную полосу 2030—2040.

Наконец, фермент прибавляется в таком же отношении к воде, при подсвечивании этой системы излучение не возникает. Ниже приводится излучение полосы 2030— 2040 при подсвечивании растворов той же полосой:

% Раствор глюкозы без фермента.. » » + фермент.. Вода+фермент... Аналогичным образом была обнаружена карбониль ная группа в системах пептон + пептидаза и мочеви на + уреаза;

в них, при соответствующем подсвечива нии, возникала также полоса 2530, характерная для аминогруппы (или иминогруппы).

Наличие свободных радикалов при протекании фер ментативных реакций было показано, таким образом, с достаточной достоверностью. Объяснение этих фак тов не встречает затруднений с энергетической точки зрения, если принять во внимание участие в реакциях видимого света и атмосферного кислорода. Исследован ные ферментативные реакции ведут себя в этом отно шении, однако, неодинаково. Система глюкоза + зима за сохраняет способность к излучению при наличии кислорода и в полной темноте, в то время как для из лучения систем мочевина + уреза и пептиды + пепти даза требуется и видимый свет, и кислород.

При расчете энергетического баланса делаются сле дующие допущения. Молекула фермента действует на молекулу субстрата совместно с двумя фотонами види мого света, величину которых можно определить уста новлением длинноволновой границы активно действую щей области. В эту реакцию вовлекаются атмосферный кислород и вода.

Наиболее простая схема расчета, особенно если принять во внимание, что отдельные этапы фермента тивных процессов не являются еще в некоторых слу чаях до конца расшифрованными, состоит в следую щем: составляется общий расходный баланс из расче та, что молекулы субстрата, О2 и Н 2 О разлагаются на атомы или сравнительно простые радикалы (О, ОН, NH2, CO). Вычисляется энергия, освобождающаяся при соединении радикалов в химически регистрируемые продукты реакции. Наряду с этим, учитывается энер гия, возникающая и при предположительных рекомби нациях радикалов в другие соединения, не обнаружи ваемых химическим анализом вследствие редкости их возникновений, т. е. ничтожности концентраций возник ших соединений. Энергия рекомбинаций некоторых ра дикалов, которая, судя по спектру митогенетического излучения реакции, является как раз необходимой для этой эмиссии, при этом не учитывается. Получаемый таким образом дефицит (при вычитании из общего рас ходного баланса общего приходного баланса) покры вается (расчетным образом) энергией двух фотонов видимого света.

Такая схема расчета приводит к выводам, доступ ным экспериментальной проверке.

Приведем в качестве примера наиболее простой слу чай— расщепление мочевины ферментом уреазой. Про дуктами гидролиза являются NH 3 и СО2, реакция сла бо экзотермическая, порядка 2 ккал/моль. Спектр излучения доходит при этой реакции до 1940 в корот коволновую сторону. Необходимо поэтому предполо жить появление, по крайней мере, двух видов свобод ных радикалов, рекомбинация которых может дать со ответственную энергию. В данном случае речь может идти о свободном карбониле и об атомарном кисло роде, рекомбинация которых дает энергию порядка 167 ккал/моль.

При расщеплении мочевины, воды и молекулярного кислорода затрачивается следующая энергия:

Отрыв от функциональной карбонильной группы двух аминогрупп 120 ккал/моль Расщепление молекулы воды Н 2 О — Н + Н + О...220 »

Расщепление молекулярного О 2 — - O + O.... 118 »

Всего.. —458 ккал/моль Предполагаются следующие побочные процессы ре комбинаций:

NH 2 +NH 2 — N 2 H 4 (гидразин) +69 ккал/моль 2 (H+ О) — 2 (ОН) +220 »

ОН+ОН —• Н 2 О 2 +51 »

Всего... +340 ккал/моль При этом неиспользованными остаются радикалы Дефицит, равный 118 ккал/моль, предположительно покрывается двумя фотонами видимого света, около 60 ккал каждый, соответствующих примерно 4700А, т. е. зелено-голубому участку спектра. Эти расчеты можно подтвердить экспериментально двумя путями:

1) обнаружить путем резонансного подсвечивания (опи санного выше) радикал 2) определить эффектив ную границу видимого света.

В виде примера приводится одна из серий опытов, в которой производилось подсвечивание ферментатив ной системы уреаза + мочевина различными (близки ми) областями видимого спектра:

% 4250—4300А (фиолетовый)... 4700 А ( г о л у б о в а т о - з е л е н ы й ) 5000А (зеленый) Разберем аналогичным образом реакцию расщепле ния дипептида глицил-глицина эрепсином.

Предположим, что произошел разрыв связей, обо значенных буквами а—е. Энергия диссоциации выра жается следующими величинами:

а —60 ккал/моль;

в —60;

с —93;

d — 93;

в — 71.

Кроме того, Н2О — Н + ОН —110 ккал!моль О2 — • О + О — 118 »

Общая сумма затраты энергии 605 ккал/моль Предположительные рекомбинации:

1) Присоединение —Н к —NH правой половины расщепленного дипептида, т. е. восстановление моле кулы гликокола + 87 ккал/моль;

2 А. А. Гурич 2) свертывание двух валентностей свободного 4- 120 ккал/моль;

3) соединение возникшего в результате преды дущего акта, с О-^СО + 167 ккал}моль;

4) Н + Н-Н 2 +108 ккал/моль. В результате ре комбинаций выделилось 482 ккал/моль. Дефицит в 123 ккал покрывается двумя фотонами с энергией не меньше 60 ккал/моль, соответствующими 4600 А (сине зеленая область). При этом остаются свободные ради калы NH2, СО, ОН, О. Как видно из приводимых ре зультатов, совпадение между рассчитанной и обнару женной эффективностью видимого света не является таким близким, как в предыдущей группе. Разница при близительно в 10 ккал/моль может быть объяснена не точностью определения энергии некоторых связей.

При подсвечивании системы белок + желудочный сок различными спектральными областями были полу чены следующие величины эффекта излучения:

% 5000А (зеленый) 6000А (красный) На этой же системе была показана так называемая квадратическая зависимость интенсивности митогене тического излучения системы от интенсивности подсве чивания, указывающая на то, что речь идет именно об утилизации энергии двух, почти одновременно попа дающих фотонов видимого света. Для этого фермента тивный процесс подвергался освещению зеленым све том определенной интенсивности I, затем интенсивность уменьшалась в 1,5 раза. Необходимая для обнаруже ния митогенетического излучения длительность экспо зиции возрастала в (1,5)2 раза (табл. 1).

Действительно, пороговая экспозиция для обнару жения излучения системы при полной интенсивности подсвечивания равна 4—5 мин, при подсвечивании, ос лабленном в 1.52 раза,— 10—12 мин, т. е. отношение интенсивностей излучения, обратно пропорциональное экспозициям, равно приблизительно 2,5 или иначе 1,52.

Несомненно, что работу в этом направлении, т. е.

проведение расчетов с последующей экспериментальной ТАБЛИЦА Митогенетическое излучение системы при различной интенсивности подсвечивания Излучение системы при интенсивности подсвечивания в % Время экспозиции в минутах • I/1. l 3 4 10 • В этих опытах применялась другая модификация методики, требующая более длительных экспозиций.

проверкой нужно продолжать. Интересным в этом от ношении является, например, то, что для излучения реакции гликолиза не требуется активация видимым све том. Полученный за последние годы в биохимии боль шой фактический материал относительно последова тельности этапов и их связей в гликолитических и фосфоролитических процессах мог бы быть очень по лезен для расчета энергетики хемилюминесценции, воз никающей при этих реакциях.

Обширные исследования митогенетического излуче ния при реакциях окисления (А. Е. Браунштейн и А. П. Потоцкая, 1934) были посвящены изучению спек тральной специфичности излучения при окислительных процессах. Вопрос ставился при этом следующим об разом: что играет решающую роль.в возникновении Хемилюминесценции и в определении ее спектрального состава — донатор или акцептор электрона? Неоргани ческие и простые органические системы исследовались поэтому на электрохимических моделях, показавших, что излучение возникает только на катоде. При окисли тельно-восстановительных реакциях спектр излучения определяется акцептором электрона, т. е. окислителем, и не зависит от донатора электрона, т. е. восстанови теля.

2* Применение чувствительных счетчиков фотонов Гей гера-Мюллера для изучения излучения ультрафиолето вой хемилюминесценции, возникающей при различных химических реакциях (Audubert, 1938, 1939), дало боль шой достоверный материал, подтверждающий основные факты, полученные митогенетическими методами. Рас сматривая механизм возникновения излучения, автор связывает его в основном с рекомбинациями свободных радикалов и атомов. Оценка интенсивности излучения (несколько тысяч фотонов с 1 см2 источника в 1 сек) аналогична данным, полученным другими исследовате лями, и соответствует квантовому выходу в 10 -12 —10 - фотонов на 1 молекулу или обратно — возникновению одного фотона на 1012—1013 прореагировавших молекул.

Свободнорадикальный механизм хемилюминесцен ции рассматривается в настоящее время как основной.

Свободные радикалы возникают при излучении окисли тельных процессов углеводородов в жидкой фазе и окислении липидов в модельных опытах и в живых си стемах.

Основной смысл выводов первой группы работ (P. Ф. Васильев, А. А. Вичутинский, 1962;

P. Ф. Ва сильев, Аллабуттаев, А. А. Вичутинский, Русина, 1965), основанных на большом экспериментальном материале, следующий: окисление углеводородов в жидкой фазе представляет собой цепную радикальную реакцию;

цеп ной процесс ведется углеводородными и перекисными радикалами;

свечение реакции идет за счет энергии освобождающейся при рекомбинациях радикалов. Об щий выход хемилюминесценции при этих процессах ра вен приблизительно 10 -8 фотонов на одну образующуюся молекулу, т. е. интенсивность видимого излучения превышает на несколько порядков интенсивность ми тогенетического излучения, квантовый выход которого оценивается, как говорилось выше, в 10 -12 —10 -13 фото нов на одну молекулу.

Вторая группа исследователей (Б. H. Тарусов и др., 1961, Б. H. Тарусов, А. И. Журавлев, 1965), изучающих видимую хемилюминесценцию, связанную с окислением липопротеидов, рассматривает акт высвечивания как результат взаимодействия естественных антиокислите лей с перекисными радикалами, присутствующими в биолипидах организмов. Биологический смысл таких взаимодействий авторы видят в постоянном поддержи вании этим путем низкого уровня окисления биолипи дов, особенно липопротеиновых комплексов.

Изучение коллоидных процессов и процессов кри сталлизации (А. И. Рабинерсон, M. В. Филиппов, 1939, А. И. Рабинерсон, M. А. Владимирская, 1939;

А. И. Ра бинерсон, 1940) показало, что как при процессах коа гуляции, так и при образовании трудно растворимых осадков, т. е. образовании ионных и молекулярных решеток, возникает ультрафиолетовая хемилюминесцен ция митогенетической интенсивности. Если для коагу ляционных процессов и для процесса формирования молекулярной решетки вопрос о возникновении боль ших квантов энергии не является еще и в настоящее время достаточно ясным, то сам факт излучения, заре гистрированного параллельно биологическим методом и счетчиками Гейгера-Мюллера, представляет большой интерес.

Изучаемое в настоящее время (Сафонов, Шляпин тох, Энтелис, 1964) с помощью фотоэлектронных умно жителей явление кристаллолюминесценции, т. е. лю минесценции, сопровождающей возникновение кристал лической решетки, захватывающей видимую и близкую ультрафиолетовую область, подтверждает значение и интерес прежних данных.

Ограничиваясь этим сравнительно кратким изложе нием физико-химических основ митогенетического излу чения, мы хотим со всей определенностью подчеркнуть несомненность тесной связи между различными подхо дами к изучению этого широко распространенного яв ления и принципиальное значение митогенетических исследований, в которых, в сущности говоря, впервые был широко рассмотрен свободнорадикальный механизм хемилюминесценции.

СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ВТОРИЧНОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ Приводя отдельные примеры, связанные с энергети ческими схемами, мы затрагивали спектральные дан ные. Рассмотрим основные факты подробнее, так как спектральное разложение имеет очень большое значе ние для любого направления исследования, связанного с излучением Мы ограничимся здесь сущностью явле ния, а методическую сторону разберем в отдельной главе.

Возможность спектрального разложения столь мало интенсивного излучения, каким является митогенетиче ская хемилюминесценция, обусловлена высокой чувст вительностью биодетекторов, стимуляция клеточных де лений которых может быть вызвана поглощениями от дельными клетками одного-двух фотонов излучения.

Поэтому и в предшествующие годы и в настоящее время рабочим методом исследования является метод биоде текции '.

При спектральном анализе митогенетического излу чения интерес может концентрироваться на изучении конечных или промежуточных продуктов реакции, т. е.

стойких или мимолетных флуоресцентов, поглощающих химическую энергию и высвечивающих ее с специфи ческим спектром. О таких примерах мы говорили, раз бирая отдельные ферментативные реакции, и таким образом был изучен ряд спектров, которые можно рас сматривать как определенные ориентиры для расшиф ровки более сложных спектров, получаемых при извест ных условиях 2 на биологических объектах (рис. 3).

Спектральное изучение излучения органов на жи вом животном при возможно близких к физиологиче ским условиям дает результаты, требующие другой трактовки. Вследствие диффузности спектральных мак симумов выделение отдельных полос, характерных для свободных флуоресцентов, становится невозможным На первый план выступает другой критерий — оценка рас положения полос и их ширины, достигающей часто зна чительных величин, позволяющая составить суждение о структурно-энергетическом состоянии субстрата. Этот аспект спектрального анализа подробно обсуждается в главах, посвященных анализу молекулярного субст рата живых систем и излучению нервной и мышечной систем. Здесь мы лишь подчеркнули общий характер яв ления.

Высокочувствительные фотоумножители дают возможность приблизительной оценки спектральных областей при помощи свето фильтров.

Например, спектры излучения нервов (см. главу о излучении нервной и мышечной систем).

Специальной областью спектрального анализа яв ляется анализ так называемого селективного рассеяния и проведения. При этом растворы веществ (в очень малых концентрациях) или биологические объекты, подвергаясь ослабленному освещению от физического Рис. 3. Спектры-эталоны ферментативных ре акций (А. Г. Гурвич, Л Д Гурвич, 1945) 1 — расшепление креатинфосфата (является ли флуорес центом вся молекула или продукты расщепления, осталось не вьпсненным), 2 —расщепление глюкозы (флуоресцент глюкоза), 3 —расщепление нуклеиновой кислоты и леци тина (флуоресценция группы PO 4 ), 4 — расщепление пепти дов (флуоресценция пептидной свлзи), 5 — расщепление мальтозы (флуоресцирует, по-видимому, молекула цели ком), 6 — расщепление сахарозы (флуоресцирует, по види мому, молекула целиком), 7 — расщепление мочевины (флуоресцируют радикалы R - C O и R - N H 2 ), 8 — расщеп ление липидов (флуоресценты не ясны) По оси абсцисс — длина волн в ангстремах источника ультрафиолетового излучения с панхромати ческим характером спектра, высвечивают ультрафиоле товое излучение митогенетической интенсивности, спек тры которого состоят из различных, для каждого дан ного объекта, набора полос, т. е. спектры селективны.

Другими словами, в этом случае речь идет о явле нии, отличающемся от хемилюминесценции в строгом смысле слова, которую именно и характеризуют спек тры двух первых типов. Необходимость светового возбуждения для возникновения селективных спектров, несколько нарастающая по мере распространения на большие объемы интенсивность излучения, необходи мость присутствия атмосферного кислорода для воз никновения излучения — все это заставляет предполо жить, что речь идет о сопряженных лучистых и хими ческих процессах. Последние нужно понимать как цепные процессы разветвляющегося характера, в кото рых роль энергетических стартов играют фотоны. По терминологии, предложенной Я. И. Френкелем, такое явление в целом можно охарактеризовать как диффузию фотонов.

Сопряженность связи химических и физических ак тов принципиально важна, она лежит в основе многих наблюдаемых митогенетическими методами явлений и в живых системах обуславливает переход микроявлений в макроявления. Мы остановимся на этом вопросе под робно после описания основных результатов, получен ных методом спектрального анализа селективного рас сеяния. (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945, 1959).

Существенным и новым по сравнению с эмиссион ными хемилюминесцентными спектрами является то, что этот метод выявляет, благодаря первичному фото возбуждению, те элементы, которые в первом случае как бы остаются в тени. Именно так обстояло дело, как мы знаем, с обнаружением свободных радикалов при ферментативных реакциях, не обладающих без подсве чивания достаточной для митогенетического излучения энергией. Как показывает большой экспериментальный материал, «селективные» спектры делятся на два ос новных типа: аддитивные и интегральные. Совокупность полос в первых является как бы суммой спектров от дельных, входящих в данную молекулу и связанных с ней функциональных групп1 — гидроксильной группы, карбонильной группы, аминогруппы. Аддитивные спект ры характерны для открытых цепей — спиртов, жирных кислот, аминокислот, пептидов, белков. Интегральные спектры характеризуют молекулу как целое, они типич ны для циклических и гетероциклических соединений и для некоторых простых молекул (гидроксиламина, гид разина, формальдегида, муравьиной кислоты).

Не являющихся, другими словами, свободными радикалами, Определение спектров отдельных функциональных групп, входящих в молекулу, основывается на следую щем: сравниваются спектры соединений, отличающиеся какой-нибудь одной группой. Например, сравнение спектров мочевины и гуанидина дает предварительную ориентацию относительно того, какие полосы соответствуют аминогруппе (совпадение Рис.. 4. Спектры селективного рассеяния раст воров гуанидина и мочевины (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945).

1 —гуанилин;

2 — мочевина.

По оси абсцисс — длина волн в ангстремах.

полос) и какие карбонильной группе O = C и группе N = C (различное положение полос в обоих веществах (рис. 4).

Правильность такого вывода проверялась дальней шим сопоставлением спектров других соединений. Так, например, полосы, предположительно характеризуемые как типичные для группы C = N, содержатся также в спектрах аргинина и креатина, но не содержатся в спектрах других аминокислот. Полосы, приписываемые аминогруппам, не содержатся в спектрах жирных кис лот и т. д.

Последовательное изучение спектров целого ряда со единений позволило составить небольшой спектральный атлас, отдельные данные которого были с успехом при менены для анализа молекулярных состояний субстра та живых систем (рис. 5).

Вернемся к очень важной связи между химическими явлениями и излучением, так как она лежит в основе возникновения митогенетических эффектов, остающихся на уровне микроявлений в неорганизованных системах, по приводящих в живых системах к различным макро проявлениям.

Возникновение макроявлений обуславливается раз витием цепных процессов разветвленного характера.

Фотоны излучения яв ляются при этом стар товыми факторами хими ческих процессов — мо лекулы, возбужденные поглощенной энергией, становятся центрами заро Рис. 5. Спектры селективного рассеяния и хемилюминесцен ции различных соединений:

1/ — карбонильной группы;

2 — амино группы;

3 —гидроксильной группы;

4 — лактимной формы пептидной связи;

5— лактамной формы пептидной связи;

6—метальной группы;

7 —метилового спирта;

8 — гидроксиламина;

Р—гидра зина;

10 — формальдегида;

/7 —индола, 12 — пиррола;

13 — фенильной группы;

/4 —оксифенильной группы;

15— аде нина, 16 — дикетопиперазина;

17 — глю козы;

IS- триптофана;

19 — ацетилхо лина;

20 — бензола.

ждения цепей. U разветвляющемся характере цепных процессов говорит в первую очередь основной митоге нетический эффект, т. е. стимуляция митогенетическим излучением клеточных делений. Действительно, деление клетки — процесс, связанный с перестройкой всего кле точного субстрата, вызывается поглощением клеткой лишь одного-двух фотонов излучения1.

На это же указывает широко распространенное яв ление вторичного излучения, возникающего при облу чении соответствующих субстратов источниками мито генетического излучения. Вторичное излучение распро Подробное изложение фактов дается в главе, посвященной клеточному делению.

страняется на большие объемы и по мере распростра нения не только не затухает, но даже несколько нара стает в своей интенсивности.

Другими словами, облучение субстрата вызывает в нем фотохимические цепные процессы, сопровождаю щиеся излучением. Вторичное излучение распространя ется в растворах со скоростью порядка 30 ж в 1 сек.

Латентный период, отделяющий вспышку вторичного излучения от подаваемого в виде короткой вспышки первичного облучения, порядка 0,001 сек.

При облучении субстрата источником митогенетиче ской интенсивности важно, чтобы в спектр источника входили хотя бы некоторые полосы, соответствующие спектру вторичного излучения субстрата. При облуче нии более интенсивным физическим источником ультра фиолетового излучения это условие не является обяза тельным.

Принципиально важным является тот факт, что способность к вторичному излучению характерна толь ко для свежих или приготовленных недавно растворов.

Так, например, растворы глюкозы, мочевины, нуклеи новых кислот, белка (особенно при их хранении на свету и в присутствии атмосферного кислорода) сохраняют свою способность к вторичному излучению лишь в течение нескольких часов. Параллельно с такой ла бильностью соединений наблюдается и свойство быст рой утомляемости растворов, т. е. потери ими способ ности к вторичному излучению, наступающей, как правило, через 15—20 мин после начала облучения ми тогенетическими источниками.

Больше того, утомленный раствор обладает свойст вами гасителя излучения (т. е. оптической непрозрачно. йости) по отношению к свежеприготовленным. Так, например, раствор глюкозы, облучавшийся длительное время, гасит вторичное излучение свежего раствора при прибавлении к нему в отношении 1 : 100. Такой же эф факт гашения наблюдается и при прибавлении необлу ченных растворов, но хранившихся длительное время на свету. Эти результаты позволяют, таким образом, сделать вывод, что в обоих случаях происходят одина ковые химические изменения.

Вторичным излучением не исчерпываются те несом ненные фотохимические эффекты, которые вызывает митогенетическое облучение объектов, но во всех слу чаях поглощение фотона должно быть стартом цепной реакции с выходом во всяком случае больше единицы.

Другими словами, первичный элементарный акт приводит к большему числу вторичных актов, а при облучении живых систем к значительно большему числу.

Мы подчеркиваем эту формулировку, так как именно в митогенетических исследованиях анализируется во прос о роли редких событий в развитии биологических явлений, вовлекающих несоизмеримо большее число молекул, по сравнению с активизированными вначале.

Специфические условия молекулярного субстрата жи вых систем, благоприятствующие развитию процессов, будут поэтому рассматриваться весьма подробно.

Цепные реакции, доступные нашему наблюдению, разделяются во-первых, на реакции, сопровождающие ся излучением (вторичное излучение) и протекающие без излучения;

во-вторых, они различаются по харак теру конечных продуктов на реакции с образованием продуктов фотодиссоциации и реакции синтетического характера.

Все полученные до сих пор результаты говорят о том, что реакции, сопровождающиеся излучением, отно сятся к процессам диссоциаций, а реакции, не сопрово ждающиеся излучением, являются реакциями синтеза.

В сложных субстратах живых систем, несомненно, осу ществляется сопряженность этих явлений.

РЕАКЦИЯ СИНТЕЗА Разберем вопрос о поликонденсации пептидов, об наруживаемой в модельных опытах. Конденсация свя зана с установлением связи между мономерами путем выделения молекулы воды:

НО—CH 2 -ОН+НО—CH 2 -OH — ОН—CH 2 -О—CH 2 -ОН+Н 2 О При обычных условиях воздействия, например на греве, конденсация не представляет собой цепного про цесса, так как совокупность актов, приводящих к фор мированию пептидной связи, приблизительно термоней тральна, т. е. при этом не освобождается энергия для построения дальнейшей пептидной связи. При воздей ствии фотонами митогенетического излучения процесс приобретает цепной характер. Это является понятным, так как поглощенная аминокислотой достаточно высо кая энергия фотона, дающая начало процессам пере стройки, освобождается при завершении этих актов и может быть использована для построения следующей пептидной связи. Другими словами, при облучении и небольшой непрерывной энергии активации процесс конденсации может распространиться, несмотря на из вестный градиент падения, на измеримые объемы Рис. 6. Трубка с кранами (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945).


Объяснение в тексте (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945, 1959). Это подтверди дается экспериментально. Трубка длиной в 20 см, раз деленная кранами на три отдела, заполнялась раство ром пептона. Во время короткого (1—2 мин) облучения пептона в отделе «а» отделы «а» и «б» оставались со общенными, отдел «в» был отделен. После облучения отдел «б» отделялся от «а», и через 10 мин на корот кое время открывался отдел «в». Примерно через 30 мин из отдела «в» бралась проба пептона, которая при соединении с пепсином (желудочный сок) давала вспышку митогенетического излучения. Присоединение пепсина к необлученному пептону не давало излучения (рис. 6). Таким образом, цепной характер поликонден сации является несомненным.

Наряду с пептоном, облучению подвергались с поло жительным результатом и смеси аминокислот — дикар боновые кислоты и гликокол, иногда включалась и цик лическая аминокислота (тирозин).

Образующиеся в очень малых концентрациях кон денсаты высокомолекулярны, на что указывает их не способность к диализу через коллодийную пленку. При прибавлении пепсина к отделенному диализом синте тическому продукту возникает митогенетическое излу чение со спектром, характерным для пептидной связи.

Продукт конденсации пептона обнаруживается, по мимо митогенетического спектрального анализа, и по увеличению поглощения в области, типичной для бел ковых тел (2400—2800 ). Судя по спектрам-эталонам, полученным при прибавлении к пептону белка в очень малых количествах, увеличение поглощения в облучен ном пептоне соответствует приблизительно 10 -5 раство рам белка по весу (рис. 7).

В противоположность фотохимическим реакциям, сопровождающимся вторич ным излучением и возни кающим преимущественно при облучении субстратов соответствующими резонанс ными спектральными по Рис. 7. Спектр поглощения пеп лосами, реакция синтеза тона (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гур пептидов не обнаруживает вич, 1945) (точная обрисовка никакой избирательности микрофотометрических кривых со сглаживанием мелких зуб- относительно длин волн об цов). лучения. Однако эффектив ность облучения резко па а —до, б — после облучения.

дает в длинноволновой об ласти, причем границы эффективности различны в полной темноте и при подсвечивании видимым светом.

В первом случае эффективность прекращается у 2700 А, что соответствует приблизительно 105 ккал/моль, во вто ром — у 3260, т. е. приблизительно соответствует 87— 90 ккал/моль'.

Таким образом, процесс синтеза при добавочной ак тивации видимым светом возникает под действием ме нее энергетичных ультрафиолетовых фотонов, чем в от сутствии света. Разница в энергии составляет примерно 18 ккал/моль. Это заставляет думать, что энергия фо тона в 105 ккал/моль используется на два раздельных акта;

один из них требует основной порции энергии по рядка 87 ккал/моль, второй — небольшую энергию в 18 ккал/моль.

Из расчета энергетического баланса реакции мы ви дели, что 87 ккал соответствуют энергии связи N—H.

Эти определения не превышают точности примерно в 20.

Поэтому можно предположить, что начальное звено фотохимического процесса состоит именно в отщепле нии атома водорода от N—H. Правильность этого пред положения подтверждается различными видоизмене ниями комбинаций облучения. Было показано, например, что к фотону ультрафиолетового излучения с энергией 87 ккал (3260 ) достаточно добавить действительно только 18 ккал, т. е. ближний инфракрасный свет (при близительно 15 000 ). К одинаковым результатам приводят и другие комбинации двух фотонов, удовле творяющие одному условию, — достаточной энергетично сти ультрафиолетовых фотонов, равной или превышаю щей 87 ккал/моль. При анализе этих фактов нужно, конечно, принять во внимание поглощение аминокислот в области ультрафиолетового излучения. Известно, что у неароматических аминокислот степень поглощения в сторону длинноволнового ультрафиолета постепенно уменьшается, однако без резкого перелома в области 3260. (рис. 8).

Поэтому резкое уменьшение эффективности излуче ния именно в этой области не может быть объяснено изменениями в поглощении. Приведенные факты гармо нируют с изложенными выше данными, говорящими о цепном характере реакции фотосинтеза пептидов.

С точки зрения двухактного действия фотонов (боль шого, дающего старт реакции, и малого, активирую щего весь процесс) становится понятной достаточность короткого облучения ультрафиолетовыми фотонами, на ряду с необходимостью непрерывного подсвечивания видимым или инфракрасным светом.

Чем обуславливается низкий концентрационный уро вень поликонденсата, не представляется пока ясным.

При рассмотрении этого вопроса следует принять во внимание и возможность обратных процессов, т. е. раз рывов пептидных связей при поглощении фотонов. Не исключена возможность, что большое значение может иметь фактор времени — общее количество фотонов, под веденное к данному объему субстрата за короткое время, может дать менее благоприятные результаты, чем более растянутая по времени подача того же коли чества фотонов.

Эти соображения приобретают интерес при обсуж дении вопроса о значении митогенетического режима для пептидного синтеза в живых системах. Возможно, что постоянный, хотя и слабый, лучистый режим под держивает процессы синтеза на большей высоте, чем это достигается в модельных опытах при кратковремен ном, хотя и более сильном облучении.

Рис. 8. Спектры поглощения воды (а) и 2 % гликокола (б).

Толщина слоя 19 см. Снимки произведены через ступенчатую шель кол лиматора. Обратить внимание на очень незначительное различие в сте пени поглощения предельной активной полосы 3260 и инактивной полосы 3342 А (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945).

Мы не касались до сих пор вопроса, имеющего большое биологическое значение, — состояния динами ческого равновесия между лактам-лактимной формами пептидной связи.

Рассмотрим относящиеся к этому модельные дан ные. На этом примере будут также конкретно разобраны предпосылки, необходимые для оценки спектров селек тивного рассеяния. Сдвиг равновесия в сторону лак тимной (енольной) формы пептидной связи определя ется по усилению спектральных полос, характеризую щих функциональную группу R - C = N - R и группу R—ОН, и ослаблению полос, характерных для карбо нильной группы R—C = O, соответствующей лактамной (кето) форме пептидной связи.

Очевидно, что вопрос о роли лучистого фактора мо жет быть решен с достаточной степенью однозначности при исследовании более сложных субстратов только при сравнении данных, полученных до и после облучения.

Именно таким образом были проведены сериальные опыты с облучением раствора альбумина яичного бел ка. После длительного (30—60 мин) митогенетического облучения раствора в нем методом селективного спект рального анализа обнаруживался ясный сдвиг равно весия в сторону лактимной формы пептидной связи (E. И. Терновская, 1959).

ПОЛИКОНДЕНСАЦИЯ ОДНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ Образование пептидов при облучении смеси амино кислот является лишь частным случаем более общего про цесса поликонденсации одной аминокислоты (А. Г. Гур вич, Л. Д. Гурвич, 1940).

Основным признаком такой поликонденсации являет ся длительное последующее излучение аминокислоты, возникающее через некоторое время после ее облуче ния. Факты, показывающие на связь этого явления с возникновением в аминокислоте высокомолекулярного вещества, заключаются в следующем: 1) излучение об лученной аминокислоты исчезает после нагревания до 70—80°, но сохраняется при осторожном высушивании при 37° и растворении осадка;

2) после диализа облу ченной аминокислоты через коллодийную пленку излуче ние сохраняет только фракция, заключенная внутри ди ализационной гильзы, что указывает на связь излучения 41 высокомолекулярным телом;

3) энергетические усло вия облучения, т. е. ограничение эффективности облу чения в длинноволновую сторону и участие видимого или инфракрасного света, вполне совпадают с теми, которые требуются для получения поликонденсатов из смеси ами нокислот.

Большинство этих данных получено при облучении гликокола. Из первичных продуктов фото диссоциации гликокола, среди которых есть и свободные радикалы, строится молекула полипептида, для которого, как 3 А. А. Гурвич показывает спектральный анализ, характерно преобла дание лактимной формы пептидной связи. Последующее длительное излучение гликокола, связанное с наличием такого поликонденсата, проявляется, однако, только при притоке атмосферного кислорода. Другими слова ми, излучение возникает при окислении субстрата (мо лекул гликокола), идущем, однако, не спонтанно, а при наличии возникшего высокого полипептида. Спектраль ный анализ излучения показал, что при этом с доста точной ясностью обнаруживается только одна полоса с максимумом в области 2290—2300. Вся совокупность условий, при которых проявляется активность поликон денсата, допускала возможность окислительного деза минирования в гликоколе и соответствие полосы флуо ресценции молекул аммиака. Действительно, модельные опыты по спектральному изучению слабого раствора аммиака показали тот же спектр излучения, т. е. под твердили это предположение (Б. Никаноров, 1945).

Эти результаты приводят к очень важному выво ду— возникающий полипептид аналогичен по своему действию ферменту дезаминазе. В этой связи представ ляет интерес ясный сдвиг лактам-лактимного равнове сия в образовавшемся конденсате в сторону лактим ной формы пептидной связи. Неустойчивость этой фор мы связи, т. е. ее большая реакционная способность, соответствует активному характеру поликонденсата.


Для процесса поликонденсации характерна еще одна очень важная черта: процесс может продолжаться во времени без всякого ограничения, т. е. он имеет цепной характер. Это с особенной ясностью проявляется при применении так называемых переносов (пассажей) об разовавшегося поликонденсата в свежий раствор гли кокола.

Приведем в качестве примера одну из эксперимен тальных серий. Раствор гликокола (0,5—1%) испыты вается на излучение через некоторое время после его предварительного облучения каким-нибудь митогенети ческим источником и после этого прибавляется к необ лученному раствору гликокола в объемных отношениях 1 : 10. Немедленное испытание излучения этого раство ра даст отрицательный результат, но по истечении при близительно получаса обнаруживается ясное излучение раствора. Новые разбавления, в тех же временных и объемных отношениях, приводят к тем же результатам без всякой тенденции к ослаблению излучения в по вторных переносах, т. е. при номинальном разведении исходного облученного раствора по крайней мере на не сколько порядков (табл. 2).

ТАБЛИЦА Излучение растворов гликокола после внесений предшествующих порций (затравок) Излучение в % Излучение в % Порядковые Порядковые номера номера сразу после сразу после через переносов переносов через внесения внесения 30—40 мин 30—40 мин затравки затравки 1 8 2 14 55 7 3 7 8 0 9 4 10 П р и м е ч а н и е. 5-й и 6-й переносы не испытывались на излучение.

Но, несмотря на явный цепной характер процесса конденсации, концентрация возникающего полипептида держится на очень низком уровне, обусловленном, по видимому, частичной обратимостью процесса. На это указывают результаты, получаемые при повторных ад сорбциях образующегося конденсата на каолин. В элюи рующей жидкости, промывающей каолин, содержится приблизительно десятикратная концентрация конден сата.

«Ферментативные» свойства возникающего из ами нокислоты поликонденсата и цепной характер его воз никновения, т. е. неограниченная способность к само воспроизведению за счет аминокислоты, заставили расширить и углубить изучение этого принципиального явления.

Были проведены широкие исследования в двух направлениях: изучалась возможность аналогичного самовоспроизведения (аутокализа) активных групп фер ментов и, наряду с этим, более общий вопрос о возмож ности самовоспроизведения более сложных органиче ских соединений из более простых.

3* АНАЛИЗ САМОВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИИ ИЗ АМИНОКИСЛОТ В настоящее время на основании ряда исследова ний (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1938, 1945, 1947;

3. В. Малеева, 1944, 1947;

П. А. Шершнев, 1947) твердо установлено, что при прибавлении ничтожных количеств различных нативных ферментов (вытяжки из тканей, кровь) к растворам простых аминокислот (применялся, главным образом, гликокол) в последних появляются и при повторных переносах неограниченно размножают ся конденсаты, обладающие некоторой ферментативной активностью, охарактеризованные поэтому как «фермен тоиды» (П. А. Шершнев) Критерием соответствия ферментоида ферменту явля ется то, что при воздействии того и другого на адекват ный ферменту субстрат возникает излучение одинако вого спектрального состава, указывающее на развитие одного и того же процесса. Другими словами, возник ший конденсат аналогичен активной группировке фер мента.

Ничтожные количества конечного продукта расщеп ления субстрата заставляют думать о неустойчивости возникшего активного начала в данных конкретных условиях опыта. Однако способность его к неограни ченному воспроизведению в растворах аминокислот сле дует из возможности многих повторных переносов ак тивной затравки в свежую аминокислоту, аналогичных тем, которые были описаны в связи с поликонденсацией облученного гликокол а. Таким путем были изучены пе реносы уреазы (вытяжка из соевой муки), дрожжевой зимазы, пепсина (желудочный сок), протеазы и фосфа тазы крови.

В табл. 3 приведены данные одного сериального опыта с ферментоидом уреазы (3. В. Малеева, 1947).

Контролями к таким опытам являются переносы не в растворы гликокола, а в воду.

Если принять во внимание, что предельная концен трация нативной уреазы, действие которой на субстрат обнаруживается митогенетическим методом, близка к 10-5 (по весу соевой муки), то положительный эффект в переносе 12-го порядка означает, что концентрация активной группы фермента возросла приблизительно в ТАБЛИЦА Излучение, возникающее при прибавлении свежеприготовленного и созревшего переноса к раствору мочевины Эффект излучения в % Порядковый номер свежеприготов переноса созревшего ленного переноса переноса 0 4 8 7 12 3 107 раз. Это колоссальное увеличение должно идти, ко нечно, постепенно, т. е. при каждом переносе возрастать приблизительно в 10 или в несколько десятков раз, од нако окончательная концентрация устанавливается на низком уровне.

Можно было предположить, что идет не процесс само воспроизведения активного начала, а какого-то рода ак тивация затравки в аминокислоте. Однако факты го ворят именно в пользу построения новых активных сое динений, т. е. самовоспроизведения затравки.

Через несколько минут после внесения затравки в свежую аминокислоту возникает митогенетическое излу чение, длящееся несколько минут, которое, как мы зна ем из основного механизма излучения, связано с ре комбинациями свободных радикалов. Действительно, при этом в эмиссионном спектре обнаруживается поло са, характерная для свободного гидроксила;

примене ние же метода селективного спектрального анализа об наруживает полосы свободной карбонильной группы и аминогруппы.

Другими словами, одной из первых фаз процесса является расщепление аминокислоты на отдельные ре акционноспособные элементы, которые с большим осно ванием можно рассматривать как адекватный строи тельный материал для формирования по определенному образцу более высокомолекулярного соединения. Извест ное количество свободных радикалов, не утилизируемое на построение сложных соединений, рекомбинируется, давая при этом фотоны митогенетического излучения.

Энергия фотонов очень существенна, по-видимому, для дальнейшего течения процесса, так как подавление из лучения путем введения тушителя прекращает, или, во всяком случае, значительно ослабляет процесс аутоката лиза (П. А. Шершнев, 1947).

Способность различных нативных ферментов к са мовоспроизведению в различных аминокислотах (вклю чая, как мы знаем, и самые простые) позволяет оха рактеризовать последние как своеобразные субстраты для ферментов. Другими словами, понятие активных центров ферментативной молекулы расширяется этими данными и, вместе с тем, подчеркивается необходи мость допущения взаимной зависимости центров.

Принципиальный интерес этих данных и их значе ние для биохимии являются, с нашей точки зрения, не сомненными.

Остановимся коротко на некоторых фактах, еще больше обосновывающих существенную аналогию фер ментоидов с активными центрами истинных ферментов.

Общность свойств уреазы и ее ферментоида, помимо полного совпадения спектров излучения, возникающего при прибавлении к мочевине, заключается в следую щем: фермент и ферментоид несут одинаковый заряд (отрицательный). Оба активируются прибавлением не большого количества цианистого калия и угнетаются анионами никеля, кадмия и цинка. Активирующее дей ствие цианистого калия наблюдалось также и при его добавлении к ферментоиду (так же как к ферменту), уже инактивированному действием солей перечислен ных металлов (3 В. Малеева, 1947).

Как известно, молекула аргиназы содержит в рыхлой связи атом марганца, отделимый от нее, например, пу тем диализа, после чего фермент инактивируется Ис ходя из этого, были проведены опыты по активации пе реносов аргиназы прибавлением некоторого количества марганца в виде сернокислой закисной соли (П А. Шерш нев, 1947).

Перенос ферментоида давал при этих условиях при прибавлении к аргинину явную вспышку митогенетиче ского излучения Митогенетические данные были подтвер ждены для ферментоидов уреазы и фосфатазы методом микрохимического анализа (A M Кузин, О И Поля кова, 1947). В системах высокий перенос+ соответствую щий субстрат1 авторы определили возникновение очень небольшого количества аммиака и свободного фосфо ра. Результаты, несмотря на их небольшую величину, были реальны. Соответственные разведения ферментов в физиологическом растворе не дали при прибавле нии к субстрату достоверных результатов ни в одном случае.

Оптическим методом (спектрами поглощения) было показано также небольшое увеличение поглощения рас твора глюкозы в области, типичной для поглощения молочной кислоты, после прибавления к глюкозе фер ментоида гликолитического фермента (А. Г. Гурвич, А. А. Гурвич, 1945).

Переносы ферментоидов всех испытанных фермен тов термолабильны в такой же степени, как и истин ные ферменты.

Приведенные нами фактические данные, представ ляющие часть накопленного материала, не оставляют, таким образом, по нашему мнению, никакого сомнения в самой тесной связи между истинными ферментами и их ферментоидами.

Самовоспроизведение тирозина в гликоколе. Поста новка вопроса вытекала из предыдущих данных — в со став молекулы ферментоида входит, как показал спек тральный анализ, оксифенильная группа, которую можно было приписать тирозину. Изучение возможности само воспроизведения в растворе гликокола свободного тиро зина (вернее его оксифенильной группы) являлось по этому не только естественным, но представляло и боль шой интерес Преимущества работы с таким простым соединением заключались в следующем 1. Таким путем можно было составить представле ние о степени универсальности явления аутокатализа.

Как матричный принцип построения подобных себе мо лекул, так и возможность построения молекул одного типа «ведущими» молекулами другого типа широко изу чаются и дискутируются в настоящее время. При этом речь идет о больших молекулах (ДНК или даже моле кулярные комплексы) Рассмотрение и эксперименталь ное исследование, с этой точки зрения, простых молекул, Высокими переносами считают пассажи, начиная с 8-го и далее.

которые могли бы внести ясность в энергетику и меха низм явления, однако, не проводится.

2. Вместе с тем, представлялось возможным, что изучение аутокатализа тирозина может быть доступно, наряду с митогенетическим методом, и другим методом исследования.

Начнем с спектрального анализа переносов тиро зина (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959). Предвари тельное изучение водных растворов тирозина показало, что пороговой концентрацией, при которой еще ясно об наруживается типичный для него спектр, является при близительно 10-9 по весу. Тирозин в растворе глико кола еще обнаруживается спектральным методом при разведениях в 1012—1014 раз. Приведем результаты опы та, в котором исследовался перенос тирозина с разве дением в 1012 раз (табл. 4).

ТАБЛИЦА Спектр излучения переноса (разведение в 10 раз) тирозина в гликоколе Эффект излучения в % Длины волн сейчас же после через 30 мин прибавления к гликоколу 7 2720— 2770— 2780— Утверждение, что самовоспроизведение тирозина (ок сифенильной группы) идет за счет гликокола, позволяет сделать некоторые, доступные экспериментальной про верке, выводы. Является вполне правдоподобным, что молекула тирозина строится за счет восьми молекул гликокола (по числу СН2 групп), кроме того, при этом используются одна аминогруппа, одна карбоксильная группа и одиннадцать атомов водорода. Таким образом, наряду с построением молекулы тирозина, могут идти еще другие реакции, т. е. дополнительные рекомбина ции неиспользованных свободных радикалов и атомов.

Можно ожидать, что по крайней мере некоторые из воз никших таким путем соединений могут быть обнару жены. Примерный энергетический расчет показывает, что общий баланс при допущении таких побочных рекомбинаций резко положителен, т. е. затрата энер гии на расщепление восьми молекул гликокола по крывается с избытком приблизительно в 100 ккал/моль образованием молекулы тирозина и следующих воз можных молекул: муравьиной кислоты, формальде гида, гидразина, гидроксиламина, аммиака, окиси угле рода.

Таким образом, легко представить условия, при которых процесс аутокатализа тирозина является термо динамически выгодным. Методом спектрального ана лиза удалось действительно обнаружить в высоких переносах, наряду с оксифенильной группой, и полосы, характерные для гидроксиламина и формальдегида.

В случае тирозина, так же как и при аутокатализе ферментоидов, первые фазы процесса представляют со бой активную реакцию между затравкой и субстратом, которая должна быть связана с возникновением излуче ния. При проведении экспериментов выяснилась следую щая интересная закономерность: внесение в гликокол циклических соединений (пиридин, пролин, триптофан, индол, тимин, глицил-ангидрид, пиррол, тирозин, аденин) сопровождается вспышкой излучения, в то время как при внесении соединений с открытой цепью излучения не возникает (аргинин, креатин, глютамингидрохлорид, глицил-глицин).

Применение метода переносов к аденину, пирролу и индолу показало их способность к аутокатализу в растворе гликокола. Остальные соединения пока не ис следованы.

Описанные факты, с нашей точки зрения, убедительно показывают возможность самовоспроизведения простых циклических органических соединений за счет глико кола. Энергия активации, обуславливающая возникно вение первых фаз процесса (возникновение свободных радикалов и их рекомбинаций), приводящих к возник новению митогенетического излучения, дается, по-види мому, длинноволновым ультрафиолетом, присутствую щим в дневном свете и поглощаемым циклическими соединениями. Это следует из того, что внесение цикли ческих соединений в гликокол в полной темноте не приводит к возникновению вспышки митогенетического излучения.

Исследованные циклические соединения соответст вуют тем требованиям, которые, судя по литературным данным, предъявляются к молекулам-матрицам: они плоски и доступны с обоих сторон к подходу для эле ментов субстрата.

Дальнейшая работа развивалась в различных мето дических направлениях и показала возможность приме нения и других методов — химического и оптического.

При этих условиях процесс аутокатализа тирозина изу чался в первом переносе.

Спектры поглощения в ультрафиолетовой области.

Раствор тирозина в разведении 10 -5 прибавлялся к рас творам гликокола различных концентраций (А. Г. Гур вич, А. А. Гурвич, 1959). Молярное соотношение тиро зина к гликоколу выражалось при этом в следующих цифрах:

0,025% гликокола... 1 : 6 0,5% »... 1: 2,0% »... 1: Параллельно делались идентичные растворы тирози на в воде. Поглощение тех и других растворов фотогра фировалось в толстом слое (15 см). Стабилизированный источник излучения обладал непрерывным эмиссионным спектром. Измерение поглощения производилось фото метрическим путем, при этом из величины, характери зующей поглощение тирозина в гликоколе, вычиталась величина поглощения гликокола (снималась в том же опыте, на той же пластинке) и из поглощения тирозина в воде вычиталось поглощение воды. Экспозиции про изводились через 30—40 мин после присоединения ти розина к гликоколу и соответственно к воде. Кривые характеризующие результаты и являющиеся средними из большого числа опытов, показывают, что поглоще ние тирозина в характерной для него области (2700— 2800 А) проявляется яснее всего в 2% растворе глико кола. При этом увеличение поглощения по сравнению с поглощением тирозина в воде или в наиболее слабом растворе гликокола достигало 50—80% (рис. 9).

Метод бумажной хроматографии. Большое число опытов было проведено на нисходящих хроматограм мах. Растворителем служил воднонасыщенный раствор бутанола, проявителем — нингидрин. Молярное соот ношение тирозин-гликокол (1%) лежало в границах 1 : 300—1 : 500. Смесь тирозина и глнкокола приготовля лась за 30—40 мин до нанесения на хроматограмму.

Контролями служили соответственные водные рас творы тирозина. На бумагу повторно, с промежуточ ными высушиваниями, наносились небольшие объемы Рис. 9. Кривые поглощения тирозина при его самовоспроизведении в растворах гли кокола (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959).

Нарастание поглощения при увеличении концентра ций гликокола. Контрольная кривая дана пунктиром.

По оси ординат — коэффициент поглощения.

смеси с таким расчетом, чтобы контрольное пятно содер жало 12—15 у тирозина. В большинстве опытов для полной сравнимости диффузии аминокислот на бумаге на высохшее пятно тирозина наносилось соответствую щее количество гликокола.

Рис. 10 иллюстрирует один из большого количества опытов. Здесь ясно видно увеличение пятна тирозина отдиффундировавшего из опытной смеси. В преоблада ющем числе опытов были получены положительные ре зультаты с различной степенью яркости.

Адсорбция тирозина на угольной колонке и после дующая его элюация. Результаты, полученные этим методом, кажутся нам наиболее убедительными, так как они позволяли количественные промеры прироста ти розина по сравнению с исходным. Сравнивались три порции с равными количествами тирозина (8 мг), одна из которых содержала, кроме того, гликокол (2,5% рас Рис 10 Хроматограмма тирозина (А. Г Гурвич, Л Д Гурвич, 1959) Слева (внизу) —после самовоспроизведения в рас творе гликокола справа (внизу) — контрольный тирозин (гликокол нанесен на бумагу после того как раствор тирозина высох) твор), две других соответственные объемы воды. Мо лярное соотношение тирозина к гликоколу равнялось 1 600. Опытный раствор и один из водных растворов пропускались после соответствующей выдержки через угольные колонки, тирозин элюировался, и после соот ветствующей обработки и окраски всех трех порций они фотометрировались при разных разбавлениях. Не ТАБЛИЦА Тирозин, элюированный с угольных колонок Содержание тирозина в % Номер опыта в опытном в контрольном растворе растворе (в гликоколе) (в воде) 1 108 2 11О 3 104 4 102 5 6 7 104 _ 8 9 10 103 11 112 12 97 100 105, Среднее 91, пропущенный через колонку водный раствор тирозина считался 100%, с ним сравнивались второй водный кон троль и опытная порция Приведенные цифры в конт рольной колонке таблицы (табл. 5) (все ниже 100%) по казывают на неизбежные потери некоторого количества тирозина, в большинстве опытов, наоборот, получился прирост, который можно рассматривать только как ре зультат увеличения количества тирозина после его пре бывания в гликоколе. Таким образом, средняя разница достигает почти 15%, т. е. является совершенно досто верной величиной.

Применение меченого гликокола. Результаты, полу ченные этим методом, нельзя рассматривать как закон ченные, но они позволяют думать, что и этим методом аутокатализ тирозина в гликоколе может быть показан с полной отчетливостью. Употреблялся гликокол с ме ченым углеродом (С ) в карбоксильной группе. Радио активный гликокол смешивался с обычным в отношении 1 : 10. Молярные соотношения тирозина к гликоколу равнялись приблизительно 1 :500. Контролем в дан ной серии опытов служила такая же смесь простого и радиоактивного гликокола (без тирозина). Для воз можно более полного отделения тирозина от гликокола, что в данном случае было особенно важно, производи лось повторное хроматографирование и опыта, и кон троля. Для этого участки бумаги первых хроматограмм, соответствующие тирозиновому уровню, вырезались, тща тельно отмывались в горячей воде, отмывы концентри ровались и наносились на вторую бумажную ленту.

Рис. 11. Самовоспроизведение тирозина в меченом гликоколе (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959).

а —без гидролиза;

б —после гидролиза.

По оси ординат — концентрация в условных единицах (сплошная линия — опытная смесь, пунктирная — контрольная смесь).

О — гликокол;



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.