авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение

Гематологический Научный Центр

Минздрава России

На правах

рукописи

Колосова Екатерина Николаевна

«Морфометрические характеристики тромбоцитов

у больных с первичной иммунной тромбоцитопенией»

Гематология и переливание крови – 14.01.21.

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук Москва 2013 -2 Работа выполнена в ФГБУ ГНЦ МЗ РФ Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ковалева Лидия Григорьевна доктор медицинских наук, профессор Василенко Ирина Анатольевна Официальные оппоненты Доктор медицинских наук, профессор Погорелов Валерий Михайлович Доктор медицинских наук, профессор Сметанина Наталия Сергеевна -3 Оглавление Стр.

Список сокращений…………………………………………………………….. Введение………………………………………………………………………... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………. 1.1Историческая справка, эпидемиология, патогенез………………………. 1.2 Классификация……………………………………………………………… 1.3 Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза……………………………………………………………………….. 1.4 Мегакариоцитопоэз………………………………………………………… 1.5 Антитромбоцитарные антитела…………………………………………… 1.6 Лечение……………………………………………………………………… ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………. 2.1 Объекты исследования …………………………………………………….. 2.2 Методы исследования…………………………………………………….. 2.3 Специальные лабораторные исследования. Методика компьютерной морфометрии тромбоцитов……………………............................................. 2.4 Методы статистической обработки результатов………………………... ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…... 3.1 Клиническая характеристика пациентов……………………………..….. 3.2 Витальная компьютерная фазово-интерференционная микроскопия тромбоцитов периферической крови у практически здоровых людей …… Оценка морфометрических показателей тромбоцитов крови у 3. пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией методом компьютерной морфометрии…………………………………………………. 3.4 Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии…………………………………………………………. 3.4.1. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии глюкокортикостероидами………………... -4 3.4.2. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне спленэктомии…………………………………...…… 3.4.3. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии внутривенным иммуноглобулином….

..…. 3.4.4. Динамика морфоцитометрических показателей тромбоцитов у больных ИТП на фоне терапии агонистами тромбопоэтина………………. 3.5.Морфоцитометрические показатели тромбоцитов у больных ИТП в зависимости от уровня антитромбоцитарных антител…………………...… Глава 4. ОЦЕНКА МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ВТОРИЧНЫМИ ТРОМБОЦИТОПЕНИЯМИ МЕТОДОМ КОМПЬЮТЕРНОЙ МОРФОМЕТРИИ……………………………………………………………… Заключение……………………………………………………………………... Выводы…………………………………………………………………………. Практические рекомендации…………………………………………………... Библиография…………………………………………………………………... -5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТА – антитромбоцитарные антитела ГПр – мембранные гликопротеиды ИТП – первичная иммунная тромбоцитопения ИФА – иммуноферментный анализ МКЦ – мегакариоцит ПФ – плазмоферез РИА – радиоимунный анализ ТА-IgG – тромбоцит-ассоциированных иммуноглобулины Тц – тромбоцит ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы MPV – средний объём тромбоцитов ГКС – глюкокортикостероиды СЭ – спленэктомия ВИГ – внутривенный иммуноглобулин ТПО – агонисты тромбопоэтинов АФС – антифосфолипидный синдром АА – апластическая анемия КФМ – метод компьютерной морфометрии -6 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Первичная иммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуются срывом толерантности к собственным антигенам тромбоцитов. Несмотря на многочисленные исследования, причины этого процесса к настоящему времени остаются не установленными.

Специалисты отмечают неоднородность патогенетических механизмов, лежащих в основе ИТП, отсутствие достоверных клинических и лабораторных показателей, позволяющих прогнозировать рецидивирование заболевания. Всё это диктует необходимость проведения широкого дифференциального поиска, внедрения новых высокочувствительных лабораторных методов обследования.

Не вызывает сомнения, что новые и информативные данные об особенностях патогенеза этого заболевания можно получить, изучая морфофункциональное состояние тромбоцитов. До последнего времени с этой целью использовали визуальный анализ микроскопического изображения, который не позволял с достаточной надежностью количественно оценить изменения элементов структуры тромбоцитов, их роль в различных нарушениях, в том числе и иммунологических конфликтах.

С появлением современных компьютерных технологий, основоположником которых в нашей стране является профессор Г.И. Козинец, принципиальным образом расширились возможности количественного изучения морфологии клеточных элементов системы кроветворения. Применение новых объективных количественных показателей позволило повысить информативность микроскопического исследования поверхности, формы, площади, объема, высоты и оптических свойств цитоплазмы тромбоцитов, а также изучить, каким образом изменения указанных параметров отражают функциональные особенности кровяных пластинок.

-7 Изучение морфо-функционального состояния тромбоцитов методом компьютерной морфометрии имеет как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку способствует углублению представлений о патогенезе и особенностях течения первичной иммунной тромбоцитопении, проведению дифференциальной диагностики с другими тромбоцитопениями на качественно новом уровне, более детальному пониманию механизмов развития заболевания и оптимизации проводимой патогенетической терапии.

В связи с этим, несмотря на достигнутый за почти 25 лет прогресс в изучении механизмов развития, клинических особенностей и подходов к лечению, ИТП продолжает оставаться одной из актуальных дисциплинарных проблем современной гематологии, требующих разработки и внедрения в практическое здравоохранение новых информативных критериев, исследовательских методик и современного диагностического оборудования.

Цель исследования Установить диагностическую и клиническую значимость витальных (прижизненных) показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у больных первичной иммунной тромбоцитопенией.

Задачи исследования 1.Выявить особенности витального морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией при установлении диагноза до терапии, сравнить полученные данные с аналогичными показателями у здоровых лиц.

2.Сравнить особенности морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией и тромбоцитопениями другого генеза.

3.Оценить динамику морфометрических показателей тромбоцитов при различных видах терапии больных с первичной иммунной тромбоцитопенией -8 (глюкокортикостероиды, спленэктомия, иммуноглобулин, агонисты тромбопоэтина).

4.Оценить взаимосвязь уровня антитромбоцитарных антител и морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов у больных с иммунной тромбоцитопенией.

5.Определить диагностическую и прогностическую ценность метода в сравнении с другими диагностическими тестами.

Научная новизна Выявлены и количественно оценены структурные особенности и функциональная активность тромбоцитов периферической крови при первичной иммунной тромбоцитопении. Установлено, что при ИТП, нарушения в тромбоцитарном звене связаны с изменениями функционального состояния клеток и морфологического состава циркулирующей популяции.

Впервые проведена комплексная оценка тромбоцитов периферической крови у пациентов с первичной и вторичной тромбоцитопенией, а также установлена возможность их дифференциации на основе морфометрических параметров клеток.

Выявлена корреляция между титром антитромбоцитарных антител и нарушениями морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови.

Проведен мониторинг динамики показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у пациентов с ИТП в зависимости от методов лечения. Установлено, что показатели морфофункционального состояния тромбоцитов могут служить критериями эффективности проводимой терапии. При этом в более ранние сроки нормализация морфометрических параметров циркулирующих тромбоцитов наблюдалась у больных при использовании внутривенного иммуноглобулина по сравнению с проведением спленэктомии или терапии ГКС.

-9 Практическая значимость Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в клинической практике как скрининговый при обследовании больных с первичной иммунной тромбоцитопенией.

Повышение эффективности диагностики первичной иммунной тромбоцитопении на основе использования витальной компьютерной фазометрии позволяет своевременно выявлять нарушения, проводить адекватную профилактическую или лечебную их коррекцию, способствует уменьшению количества больных с тяжелыми формами заболевания, сокращению сроков временной нетрудоспособности, а также своевременной смены лечебной тактики терапии.

Основные положения, выносимые на защиту Изменения тромбоцитов у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией заключаются в нарушении функциональной полноценности и морфологической структуры клеток, увеличении гетерогенности циркулирующей популяции.

Предикторами тяжести заболевания у больных с ИТП могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).

Характер изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с первичной иммунной тромбоцитопенией непосредственно определяется глубиной тромбоцитопении и титром циркулирующих антитромбоцитарных антител.

Публикации Результаты исследований отражены в 7 публикациях, из них две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

- 10 Апробация работы Апробация диссертации проведена 19 ноября 2012 года на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ “Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения;

ТКМ;

миело- и лимфопролиферативные заболевания;

опухоли лимфатической системы;

патология красной крови;

ИТП;

порфирии)”.

Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на II научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине:

фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009);

III Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине:

фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 49 отечественных и 76 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 18 таблицами.

- 11 Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Первичная иммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Верльгофа) (ИТП) представляет собой заболевание аутоиммунной природы, вызываемое антитромбоцитарными антителами и/или циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК), воздействующими на мембранные гликопротеиновые комплексы тромбоцитов и вызывающие разрушение их клетками ретикулоэндотелиальной системы [4, 19, 22].

Впервые заболевание, связанное с недостаточностью тромбоцитов, в 1735г.

выделил F.G.Werlhoff и назвал его как «болезнь пятнистых геморрагий» у молодых женщин. В дальнейшем оказалось, что в основе этой болезни лежит количественная недостаточность тромбоцитов, и заболевание было названо эссенциальной или идиопатической тромбоцитопенией.

В 1915г. E.Frank предположил, что в основе болезни лежит нарушение созревания мегакариоцитов каким-то фактором, возможно, находящимся в селезенке. В 1946 году W.Dameshic и Е.В.Miller установили, что количество мегакариоцитов при тромбоцитопенической пурпуре увеличено. Они не видели тромбоцитов, окружающих мегакариоциты, и на этом основании предположили, что нарушена отшнуровка тромбоцитов от мегакариоцитов. В 1916г Р.Kaznelson предположил, что при тромбоцитопенической пурпуре имеет место повышенное разрушение тромбоцитов в селезенке. Гипотеза Франка многие годы была более популярной. Казалось, в ее пользу свидетельствует наличие в костном мозге большого количества молодых мегакариоцитов, отсутствие венчика тромбоцитов вокруг мегакариоцита.

Однако исследования с меткой тромбоцитов показали, что во всех случаях тромбоцитопенической пурпуры отмечается резкое укорочение продолжительности жизни тромбоцитов до нескольких часов вместо 7-10 дней [15, 19, 98, 104, 106].

Доказано, что в большинстве случаев первичной иммунной тромбоцитопении количество тромбоцитов, образующихся в единицу времени, - 12 не уменьшается, как это предполагалось раньше, а значительно увеличивается по сравнению с нормой – от 2 до 6 раз. Увеличение количества мегакариоцитов и гиперпродукция тромбоцитов связаны с увеличением количества тромбоцитопоэтинов в ответ на низкое количество тромбоцитов [11, 15, 58, 69, 83, 117, 119].

Количество деятельных мегакариоцитов не уменьшено, а увеличено.

Большое количество молодых мегакариоцитов, быстрое отщепление тромбоцитов от мегакариоцитов и быстрый их выход в циркуляцию создают визуально ошибочное впечатление, что мегакариоциты при первичной иммунной тромбоцитопении недеятельны.

Разнообразные механизмы развития первичной иммунной тромбоцитопении свидетельствуют в пользу гетерогенности болезни. Более 50 лет назад W.J.Harrington доказал наличие гуморального фактора в плазме больного ИТП. В 1951г. W.J.Harrington продемонстрировал, что фактор, находящийся в плазме крови от больных первичной иммунной тромбоцитопенией, вызывает тромбоцитопению у здоровых субъектов. Он ввел себе плазму больного ИТП, и сразу после этого у него развилась кратковременная тромбоцитопения с клиническими проявлениями болезни [19, 83, 84].

Частота ИТП колеблется от 1-2 до 13 на 100000 населения [16, 20, 22, 60, 72, 109], не имеет географических особенностей распространения, в то же время имеются явные различия по полу: мужчины болеют ИТП в 3-4 раза реже, чем женщины, а в репродуктивном возрасте эта разница еще больше в 6-8 раз. Цепа Л.С. полагает, что преимущественное поражение ИТП женщин может быть объяснено довольно частым развитием у них эндокринных нарушений в пубертатном возрасте. Развитие тромбоцитопении по аутоиммунному механизму, характерному для ИТП, может наблюдаться и при других патологиях, таких как системная красная волчанка, сывороточные гепатиты, лимфопролиферативные заболевания и др. В последнем случае главной причиной снижения числа тромбоцитов в крови является угнетение мегакариоцитарного ростка костного мозга, однако присоединение иммунного механизма усиливает тромбоцитопению.

- 13 В этих случаях речь идет о вторичной, в отличие от первичной аутоиммунной тромбоцитопении [4, 54, 122].

В качестве основного патофизиологического механизма ИТП сегодня рассматривается срыв периферической толерантности с последующей активацией продукции антитромбоцитраных антител. Главным анатомическим резервуаром В-лимфоцитов, продуцирующих антитромбоцитарные антитела, служит селезенка. «Нагруженные» антителами тромбоциты после связывания с Fc рецептором поглощаются макрофагами селезенки и, гораздо реже, печени или лимфоузлов [19, 44, 76, 85, 90, 104].

Провоцирующими факторами, как правило, являются следующие: ОРВИ, детские инфекции (ветряная оспа, корь, краснуха), вакцинация, персистенция вирусов CMV, EBV, беременность [18, 21, 32, 39, 45, 66, 83, 84]. Беременность, роды, искусственное прерывание беременности могут способствовать первому выявлению ИТП. Наиболее угрожаемые по обострению заболевания в период беременности являются I и II триместры [32, 45, 46, 56, 118, 124].

Дифференциальная диагностика ИТП должна быть направлена в первую очередь на доказательство ее иммунной природы и исключение диагнозов тромбоцитопении 1) вследствие угнетения мегакариоцитопоэза 2) наследственной тромбоцитопении, ассоциированной с тромбоцитопатиями. При анализе истории болезни необходимо обратить внимание на время начала и длительность заболевания, возможные ассоциации с приемом лекарств, вирусными инфекциями, вероятность ВИЧ-инфицирования, историю предшествующих переливаний тромбоцитов, наличие тромбоцитопении и гематологических заболеваний у родственников. Для ИТП характерен микроциркуляторный тип геморрагического синдрома с наличием синяков, экхимозов, петехий, носовых и десневых кровотечений, обильных и длительных меноррагий [4, 14, 22, 42, 62, 94].

Клинические проявления и течение болезни у детей и взрослых различаются. У детей, как правило, наблюдается острое течение заболевания с - 14 тенденцией к самопроизвольному спонтанному разрешению. Для взрослых характерно хроническое течение с постепенным началом [16, 18, 20, 23, 94].

Осложнения. В случае значительного снижения числа тромбоцитов возрастает риск профузных кровотечений с развитием тяжелой постгеморрагической анемии. Основная причина смерти, хотя и достаточно редкая (менее 1% при ИТП), внутричерепные кровоизлияния. Факторы риска последнего следующие: крайняя степень выраженности кожного геморрагического синдрома с локализацией петехий на слизистых полости рта, кровоизлияния в склеру, кровотечения из слизистых при количестве тромбоцитов менее 10-20000/мкл. У пожилых больных геморрагические осложнения встречаются чаще, чем у молодых с тем же числом тромбоцитов [16, 21, 49, 62, 72, 83, 109].

В формировании синдрома кровоточивости, кроме снижения уровня тромбоцитов в пределах 30-50тыс, играют роль и такой фактор как выраженная хрупкость капилляров;

эта механическая слабость объясняется тем, что тромбоциты, кроме репарации поломок эндотелия, несут функцию поддерживания эндотелиального гомеостаза. [4, 10, 22, 47, 48, 76].

При тромбоцитопении во время беременности редко наблюдается истинная ИТП. Примерно в 75% случаев это тромбоцитопения беременных (обычно незначительное снижение числа тромбоцитов в поздние сроки беременности, спонтанно исчезающее после родов). Уменьшение числа тромбоцитов у 12% беременных объясняется возникновением гемоделюции, так как объем плазмы увеличивается быстрее объема клеточных элементов крови [12, 21, 32, 38, 45, 46, 118, 122, 124]. У новорожденных, чьи матери больны ИТП (в отличие от детей, родившихся у женщин с тромбоцитопенией беременных) может также наблюдаться транзиторная тромбоцитопения и повышенный риск развития внутричерепных кровоизлияний во время родов или после них. [45, 56, 84].

- 15 Классификация.

По продолжительности течения выделяют 3 варианта: острую I.

(продолжающиеся менее 3 месяцев), персистирующую (от 3 до месяцев) и хроническую формы ИТП.

Хроническая форма ИТП, свойственная взрослому населению подразделяется на варианты:

- легкая форма (с единичными рецидивами и количеством тромбоцитов выше критического уровня);

- средне-тяжелая форма (рецидивы до 2-3-х раз в год);

- тяжелая форма (более 3-х рецидивов в год) По периоду болезни выделяют рецидив, клиническую компенсацию II.

(отсутствие каких-либо проявлений геморрагического синдрома при сохраняющейся тромбоцитопении выше критического уровня) и клинико гематологическую ремиссию [20, 22, 60, 74, 76, 79, 94].

Диагностика ИТП основывается на установленных лабораторных критериях, отражающих повышенную продукцию и усиленный распад тромбоцитов. Они включают изолированную тромбоцитопению периферической крови, неизмененный костный мозг с нормальным или увеличенным количеством мегакариоцитов, наличие свободных или связанных антитромбоцитарных антител [6, 16, 19, 22, 60, 74, 94].

Структура тромбоцитов. Функции тромбоцитов и их роль в механизмах гемостаза.

Тромбоциты, или кровяные пластинки, представляют собой третий форменный элемент крови, являясь цитоплазматическими осколками гигантских клеток костного мозга – мегакариоцитов. Тромбоциты выполняют в организме важные биологические функции, главным образом в процессах гемостаза. Их физиологическая активность связана с содержанием большого количества ферментов – тромбоцитарных факторов, которые определяют - 16 фибринопластические, тромбопластические, антигепариновые, адгезивные, ретрактильные, сосудосуживающие свойства тромбоцитов. [11, 12, 13, 47, 48].

Тромбоциты продуцируются в органах кроветворения гигантскими полиплоидными клетками - мегакариоцитами, от цитоплазмы которых они отшнуровываются в виде округлых или овальных плоских дисков диаметром от до 4 мкм. В норме основным источником тромбоцитов служат зрелые, богатые зернистостью мегакариоциты, но при необходимости интенсивного воспроизводства их (например, при большой убыли из крови под влиянием антитромбоцитарных антител или при потреблении в процессе массивного свертывания крови) происходит отшнуровка частиц от более молодых клеток мегакариоцитарного ряда, в результате чего в циркуляции появляются крупные с базофильной цитоплазмой и незначительной зернистостью клетки протромбоциты [11, 15, 48].

Продолжительность жизни тромбоцитов человека составляет 7-10 дней.

После выхода из костного мозга они циркулируют в крови и частично депонируются в селезенке и печени (около 20-25% всех клеток), откуда происходит вторичный их выход в кровоток. В среднем мегакариоцит высвобождает до 3000 тромбоцитов [11, 13, 48].

В крови здоровых людей содержится 150-400x109/л тромбоцитов. Общая популяция тромбоцитов представлена циркулирующими в крови (70%) и находящимися в селезенке (30%). Накопление тромбоцитов в селезенке возникает из-за их медленного движения через извилистые селезеночные корды, занимающего до 8 мин.

Уменьшение их количества ниже 50-30x109/л способствует появлению кровоточивости, риск которой резко возрастает при уровне ниже 20х109/л, а увеличение выше 800x109/л создает угрозу развития тромбозов. Однако эти цифры условны, поскольку важны качественный состав циркулирующих в крови тромбоцитов, наличие в крови ингибиторов их функции, выраженность нарушений в других звеньях системы гемостаза и т.д. Так, при иммунной тромбоцитопении угроза серьезной кровоточивости часто, возникает лишь при - 17 содержании этих клеток в крови ниже 10-20x109/л, тогда как при ДВС-синдроме из-за наличия комплексных нарушений в системе гемостаза тяжелая кровоточивость может существенно усиливаться при снижении числа тромбоцитов в крови до 50x109/л [4, 16, 20, 22, 60, 62, 76, 94].

Тромбоциты выполняют различные функции in vivo:

1) запуск первичного гемостаза, за счет адгезии и агрегации тромбоцитов, с дальнейшим формированием тромбоцитарной пробки;

2) местное выделение вазоконстрикторов для уменьшения кровотока в пораженном участке;

3) катализ реакции гуморальной системы свертывания с образованием в конечном счете фибринового сгустка;

4) инициирование репарации тканей;

5) регулирование местной воспалительной реакции и иммунитета [10, 11, 12, 14, 35, 48].

При рассматривании под микроскопом в мазке крови, окрашенного по методу Романовского-Райта-Гимза тромбоциты представляют собой мелкие гранулированные клетки, в количестве от 3 до 10 штук в визуальном поле.

Тромбоциты являются безъядерными клеточными фрагментами диаметром 2-3,5 микромитрон (мкм) и толщиной 0,5 – 0,75 мкм. Объем тромбоцита варьирует в пределах 3,6-9,4 мкм3. Визуально тромбоциты выглядят полиморфными образованиями с ясно очерченными зонами: периферическая, гиаломер, окрашенный в голубой цвет и центральная зона – грануломер с азурофильной зернистостью. Форма их варьирует от эллипсоидной до шарообразной в зависимости от метода выделения и фиксации.

Тромбоцит окружен двухслойной фосфолипидной мембраной, в которую встроены рецепторные гликопротеины (ГП), взаимодействующие со стимуляторами (агонистами) адгезии и агрегации этих клеток. К основным видам мембранных гликопротеидов (ГПр) относят несколько типов. ГПр I, состоящий из двух субъединиц – Iа и Iв. Первая из них является рецептором для фактора Виллебранда, необходимая для адгезии, вторая для тромбинагрегации. ГПр II, - 18 также состоящий из двух субъединиц, необходим для всех видов агрегации. ГПр III, необходим для большинства видов агрегации и ретракции сгустка.

Функциональное значение ГПр IV и V нуждается в уточнении. Из мембранных ГПр наиболее важны ГПр Ib, взаимодействующий с фактором Виллебранда и коллагеном, и ГПр IIb/IIIа, связывающиеся с аденозиндифосфатом (АДФ), адреналином и другими агонистами агрегации. В процессе активации тромбоцитов меняются свойства этих рецепторов.

К мембране тромбоцита прилегает аморфный белковый слой, имеющий толщину 15-20 нм, получивший название «плазматической атмосферы» или «гликокаликса». Этот слой отличается более высоким, чем в плазме, содержанием ряда белков, в том числе факторов свертывания крови, транспортируемых тромбоцитами в места остановки кровотечения. Цитоплазматическая мембрана тромбоцитов образует множество проникающих вглубь клетки каналов с наружными выходами, в виде узких устьев.

На цитоплазматической мембране обнаружены рецепторы для адреналина двух классов – альфа-2 и бета-2, функционально связанных с аденилатциклазой.

Активация альфа-2 рецепторов ингибирует синтез цАМФ, что ведет к активации Тц и их агрегации, а активация бетта-2 рецепторов повышает синтез цАМФ и снижает агрегацию тромбоцитов.

Гиаломер Тц на ультратонких срезах представляет собой гомогенную или тонко гранулярную субстанцию, в нем локализованы микротрубочки и филаменты. Грануломер Тц представляет собой комплексную структуру, состоящую из различных по величине и плотности гранул, которые в зависимости от величины и строения разделяются на альфа, бета, эпсилон, гамма гранулы. До 80% гранул Тц относятся к альфа-гранулам, которые содержат факторы свертывания [10, 11, 12, 13, 14, 26, 27, 35, 38, 47, 48, 95, 103, 123].

В «состоянии покоя» тромбоцит представляет собой дискообразную клетку с гладкой цитоплазматической мембраной, поддерживаемой микротубулиновым кольцом. Мембрана клетки инвагинирует и соединяется с сетью многочисленных каналов, с так называемой открытой канальцевой системой (ОКС).

- 19 В цитоплазме не активированных тромбоцитов можно обнаружить 4 вида гранул: а-гранулы, плотные гранулы, лизосомы и пероксисомы.

Наиболее многочисленные а-гранулы содержат тромбоцитоспецифические и тромбоцитонеспецифические пептиды, участвующие в механизмах коагуляции, воспаления;

иммунитета и репарации и модулирующие эти процессы. Плотные гранулы, названные так сообразно их внешнему виду под электронным, микроскопом, представляют собой богатое хранилище АДФ и серотонина — веществ, способствующих агрегации тромбоцитов, а также антиагреганты АТФ и основного кофактора коагуляции Са2+. Лизосомальные гранулы содержат гидролитические ферменты, а пероксисомы — каталазу [14, 47, 48, 123].

Как уже говорилось ранее не стимулированные тромбоциты циркулируют в виде гладких дискоидных клеток с незначительной метаболической активностью.

Такие тромбоциты не вступают в физиологически значимое взаимодействие с другими форменными элементами периферической крови или монослоем эндотелиальных клеток, который выстилает эндоваскулярное пространство.

Физиологическая активация тромбоцитов начинается только тогда, когда поврежден сосудистый эндотелий и обнажен субэндотелиальный внеклеточный матрикс. Адгезия тромбоцитов сама по себе, а также посредством участия в запуске гемостаза инициирует процесс активации тромбоцитов, который выражается в существенном изменении их формы, необратимой секреции содержимого плотных и a-гранул, агрегации тромбоцитов с образованием гемостатической тромбоцитарной пробки. Изменение формы представляет собой раннее и обратимое проявление активации тромбоцитов, которое опосредовано внутриклеточной системой сократительных микрофиламентов. В тромбоцитарной мембране возникают волны возбуждения, и формируется большое количество коротких нитевидных псевдоподий или филоподий, продвигающихся по открытой канальцевой системе. В результате этого процесса значительно увеличивается площадь поверхности тромбоцитарной мембраны [10, 11, 14, 47, 48].

- 20 Oтечественные авторы [1, 2, 3, 25, 30, 31, 40, 41] для изучения морфологических и функциональных свойств Тц использовали подсчет тромбоцитарной формулы в мазке крови и электронную микроскопию, однако некоторые исследователи считали, что для точной морфологической характеристики одной тромбоцитарной формулы не достаточно. А.А.Тоцкая упростила подсчет тромбоцитарной формулы. Приняв за основу только размер Тц, при этом производила измерение площадей Тц, используя автоматический анализатор объемов, по полученным тромбоцитометрическим кривым распределения Тц по площадям и эквивалентным диаметрам. Таким образом, впервые были получены тромбоцитограммы у здоровых доноров, что дало возможность выделить классификацию по форме: микро-, мезо-, макро- и гигантские формы Тц.

При световой микроскопии выделяют 4 основные формы тромбоцитов в крови здорового человека:

- нормальные (зрелые) тромбоциты (87,0±0,13%) круглой или овальной формы диаметром 3-4мкм;

при микроскопии в них видна бледно-голубая наружная (гиаломер) и центральная (грануломер) с азурофильной зернистостью зоны.

- юные (незрелые) тромбоциты (3,20±0,13%), несколько больших размеров с базофильной цитоплазмой и чаще расположенной в центре азурофильной грануляцией (мелкая и средняя).

- старые тромбоциты (4,10±0,21%) могут быть круглой, овальной, зубчатой формы с узким ободком темной «цитоплазмы», содержащей обильную грубую грануляцию, а иногда и вакуоли.

- формы раздражения (2,50±0,1%) больших размеров, вытянутые, колбасовидные хвостатые;

«цитоплазма» в них голубая или розовая, азурофильная зернистость рассеяна или разбросана неравномерно.

По функциональной активности выделяют 4 морфологических типа тромбоцитов: клетки «покоя» (I тип), тромбоциты с низким уровнем активности морфологический тип), высоко активированные тромбоциты (III тип) и (II - 21 дегенеративно-измененные клетки (IV морфологический тип). Нормальное соотношение составляет 63, 24, 12 и 4% соответственно[6, 11, 12, 28, 47, 48, 96, 123].

Мегакариоцитопоэз Своеобразие мегакариоцитарных клеток заключается в непрекращающейся цитоплазматической дифференцировке, которая заканчивается тромбоцитообразованием. Каждый мегакариоцит в зависимости от своей величины (плоидности) образует от 2000 до 8000 тромбоцитов. Содержание мегакариоцитов в костномозговом пунктате из грудины у здоровых лиц подвержено небольшим колебаниям и составляет 51,8-216,2 в 1 мкл, на долю зрелых мегакариоцитов приходится 76%. Образование клеток-предшественниц мегакариоцитопоэза осуществляется по общему для всех гранулярных клеток принципу: избыток тромбоцитов в циркулирующей крови в норме тормозит тромбоцитопоэз, а тромбоцитопения его стимулирует. Гуморальная регуляция тромбоцитопоэза происходит с участием тромбопоэтина, а также ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-11. Наиболее быстрый путь увеличения количества тромбоцитов – ускоренное созревание мегакариоцитов и тромбоцитообразование, связанное со способностью ядра мегакариоцита к заключительному эндомитозу. Созревание мегакариоцитов имеет свои закономерности, которые модифицируются в экстремальных условиях: ускоряются при усилении нормальной регенерации (при кровопотере), замедляются под воздействием внешних и внутренних факторов (химиотерапевтических препаратов, дефицита витаминов и пищевых ингредиентов, антитромбоцитарных антител). Митотический индекс мегакариоцитов не превышает 0,5%. В цитоплазме зрелых мегакариоцитов всегда содержатся морфологически зрелые тромбоциты, по количеству и состоянию органелл не отличающиеся от периферических тромбоцитов. Единственным отличием является отсутствие широкого рыхлого слоя наружной мембраны, гликокаликса, что делает тромбоциты, находящиеся в цитоплазме мегакариоцита, морфологически не сформированными. В образовании этого наружного слоя, - 22 необходимого для обособления тромбоцитов, играет роль заключительный эндомитоз, во время которого образуется поверхностная система микротрубочек и гликокаликс тромбоцитов. Высвобождение тромбоцитов происходит из длинных цитоплазматических отростков, выпускаемых мегакариоцитами в костномозговой синус. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что отростки мегакариоцитов состоят из цепочки тромбоцитов [11, 15, 47, 48, 58, 61, 117, 123].

При ИТП, количество мегакариоцитов увеличено, реже остается нормальным.

Антитромбоцитарные антитела Разрушение тромбоцитов при иммунной тромбоцитопении происходит так же, как разрушение эритроцитов при иммунной гемолитической анемии. Однако антитела к тромбоцитам изучены хуже, чем антитела к эритроцитам, а методы их выявления более трудоемки. Разрушение тромбоцитов, опосредованное иммунными механизмами, лежит в основе острой и хронической иммунной тромбоцитопенической пурпуры, тромбоцитопении новорожденных, вызванной материнскими антителами, лекарственной иммунной тромбоцитопении [13,19, 24, 30, 56, 85, 100].

Остается неясным вопрос о воздействии антител на мегакариоциты, поскольку тромбо- и мегакариоциты имеют общие антигены: вызывают ли они не только ускоренный распад, но и снижение продукции клеток. С помощью иммунофлюоресценции при использовании меченых антисывороток удалось продемонстрировать аутоантитела на мегакариоцитах. Анализ данных позволяет предположить, во-первых, повреждение мегакариоцитов (недостаточная способность организма компенсировать цитолиз периферической крови), во вторых, дефект их созревания. Тем не менее, у значительного числа обследованных больных отмечают тенденцию к повышению показателя мегакариоцитов [13, 19, 61, 102].

Образующиеся аутоантитела относятся к IgG- или IgM-классам. Так как антитела взаимодействуют с антигенами на клетках своими Fab-фрагментами, то - 23 агрегированных молекул антител активируют систему Fc-фрагменты комплемента. В процессе активации комплемента образуется цитотоксический мембраноатакующий комплекс, разрушающий клетку-мишень. Помимо комплементзависимых, существуют цитотоксические реакции без участия комплемента. Лизис клетки, покрытой антителами, могут вызывать любые лейкоциты (К-клетки - цитотоксические клетки: NK, ЦТЛ, моноциты, макрофаги, нейтрофилы), несущие Fc-рецепторы, способные прикрепляться к клетке-мишени, повреждать ее цитоплазматическую мембрану и таким образом лизировать мишень. Это и есть механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности [19, 61, 64, 82, 85, 91, 92, 101, 114].

Антитромбоцитарные антитела впервые были обнаружены группой Харрингтона в 1951г. (W.J.Harrington, C.C.Sprague, V.Minnich et al, 1953), которая назвала их «циркулирующий антитромбоцитарный фактор». Авторы наблюдали развитие транзиторной тромбоцитопении у 63% реципиентов после переливания им плазмы от больных с ИТП. Уменьшение числа тромбоцитов началось тотчас же, достигнув минимума через 1-3 ч, а спустя 4-6 дней показатель вновь соответствовал исходному уровню. В периферической крови обследуемых лиц обнаруживали антитромбоцитарный фактор с активностью антител класса IgG.

Глубина тромбоцитопении зависела от количества перелитой плазмы и была менее выражена у лиц, подвергшихся спленэктомии или леченых кортикостероидами [83, 84].

Первоначальный иммунный ответ на тромбоцитарный антиген возникает в селезенке, после чего на протяжении нескольких недель накапливаются циркулирующие клетки-памяти (Т и В лимфоциты). Деструкция сенсибилизированных тромбоцитов является результатом фагоцитоза или комплимент-зависимого лизиса. Фагоцитоз осуществляется за счет Fc фрагмента фиксированного на тромбоцитах иммуноглобулина G и активации комплимента с фиксацией С3в компонента к поверхности тромбоцита, рецепторы к которым имеются на макрофагах. Фагоцитоз сенсибилизированных тромбоцитов клетками - 24 ретикулоэндотелиальной системы может осуществляться с активацией или без активации комплемента [13, 19, 91, 100].

Деструкция тромбоцитов происходит в трех главных органах ретикулоэндотелиальной системы: селезенке, печени и костном мозге. В основном тромбоциты разрушаются в селезенке, так как в этом органе интенсивно секретируются антитела, концентрация которых значительно превышает таковую в плазме. Кроме того, как уже указывалось ранее, в селезенке постоянно присутствует 1/3 количества тромбоцитов (селезеночный пул) и циркуляция крови в ней замедлена. Все это создает оптимальные условия для фагоцитоза. Напротив, в печени, если и продуцируются антитела, то в очень незначительной степени, отсутствует постоянный пул тромбоцитов и циркуляция клеток ускорена. Тем не менее, элиминация тромбоцитов больных с высоким уровнем антитромбоцитарных антител происходит и в печени, являющейся самым сильным фагоцитирующим органом [19, 76, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 99]. В связи с тем, что антитромбоцитарные антитела направлены к антигенам тромбоцитов и мегакариоцитов, в костном мозге может иметь место, как деструкция тромбоцитов, так и подавление тромбоцитопоэза [19, 102, 117]. Если костным мозгом при ИТП продуцируется количество тромбоцитов в 4-5 раз больше по сравнению с нормой, а в циркуляцию поступает только половина их, то это означает наличие внутрикостномозгового разрушения тромбоцитов. В случае если выход тромбоцитов из костного мозга эквивалентен их продукции, то элиминация тромбоцитов в костном мозге не происходит.

Основной мишенью, против которой направлены антитромбоцитарные антитела, является гликопротеин GP IIb/IIIa, GP Ib/IХ и GP Iа/IIa b [19, 30, 76, 82, 85, 91, 95, 100], которые сосредоточены на поверхности тромбоцитов.

Подтверждением диагноза должно служить обнаружение в крови больных антитромбоцитарных тромбоцитоассоциированных (TpA-IgG) или сывороточных антител по данным иммунологического исследования. У большинства пациентов одновременно присутствуют различные виды антитромбоцитарных антител. Для этих целей используется следующие методы диагностики: разработаны методы - 25 радиоиммунологического и иммуноферментного анализов (соответственно РИА и ИФА), метод Диксона, иммунофлюоресцентный метод, а также методы, основанные на использовании меченного I 125 C3-фрагмента комплемента и меченного I 125 стафилококкового протеина А, метод тромбоагглютинации [19, 24, 31, 43, 90, 91]. Ранее эти методы использовались для определения антител как в сыворотке (непрямой метод), так и на поверхности тромбоцитов (прямой метод).

Идентификация антитромбоцитарных антител представляет значительную сложность, что связано, прежде всего, с лабильностью и спонтанной агглютинацией тромбоцитов. Фактически до сих пор отсутствует оптимальный метод для определения их активности. Общепринятые диагностические тесты зачастую нельзя воспроизвести из-за низкого уровня тромбоцитов в крови. Кроме того, недостаточное отмывание не удаляет связанных на клетках неспецифических компонентов, а многократное приводит к агрегации клеток.

Возможность неспецифической адгезии циркулирующих факторов, а также связывания на Fc-рецепторах вносит определенные коррективы в интерпретацию данных, поэтому особое значение приобретают адекватные контроли.

До открытия собственно тромбоцитарных антител диагноз «аутоиммунная тромбоцитопения» ставили, ориентируясь на признаки увеличения иммуноглобулинов IgG на поверхности тромбоцитов, которые определяли с помощью количественного метода Диксона и Росса.

Метод Диксона основан на количественном определении антител на поверхности тромбоцитов. Установлено, что содержание иммуноглобулина класса G на поверхности тромбоцита у здорового человека достигает 14*10-15 г.

При иммунных тромбоцитопениях количество его возрастает до 20*10-15 — 250*10-15 г. Данный метод обнаружения антитромбоцитарных антител наиболее информативный, но очень трудоемкий и поэтому не может быть рекомендован для широкого применения в практике. Кроме того, существует определенная нижняя граница количества тромбоцитов, при которой можно исследовать - 26 количество антител на их поверхности. При очень низком содержании тромбоцитов (менее 50000 в 1 мкл) метод Диксона неприемлем[19, 43].

На определенном этапе для выявления антитромбоцитарных антител использовали иммунофлуоресцентный метод, предложенный в 1978г von dem Borne, который позволяет обнаружить антитела как связанные с тромбоцитами, так и циркулирующие в кровяном русле больного. В данной методике используется параформальдегид, который гасит неспецифическое свечение, образующееся при образовании комплексов «антиген + антитело», оставляя лишь связанное с антитромбоцитарными антителами. Это исследование может выполняться даже при низком содержании тромбоцитов в периферической крови.

Метод иммунофлуоресценции тромбоцитов состоит в обнаружении тромбоцитарных антител с помощью меченных люминесцентным красителем иммунных сывороток против глобулинов человека. Прямой иммунофлуоресцентный тест позволяет выявить фиксированные на тромбоцитах антитела. Непрямой иммунофлуоресцентный тест дает возможность обнаружить тромбоцитарные антитела в сыворотке после ее инкубации с аутологичными или аллогенными тромбоцитами. Чувствительность метода составляет 85%[Катаджан1985].

К числу положительных характеристик этого метода следует отнести возможность идентификации находящихся на тромбоцитах антител класса IgG, IgМ, IgА. Однако этот метод имеет определенные ограничения, поскольку для получения положительной реакции на поверхности тромбоцита должно находиться, по крайней мере, 1000молекул IgG [19].

В последние годы применение усовершенствованного метода – иммуноферментного анализа (ИФА)(ELISA – enzyme-linked immunosorbent расширило клинико-диагностические возможности выявления assay) антигенспецифических АТ-антител. Методические подходы, используемые в ИФА позволяют: 1) различать выработку специфических антитромбоцитарных антител от неспецифического повышения уровня тромбоцитассоциированного иммуноглобулина G;

2) отличать специфические антитела тромбоцитов от анти - 27 HLA антител при рефрактерности к переливаниям тромбоцитов и 3) проводить аллотипирование индивидуальных белков при неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении. В последнее время наибольшее распространение получили несколько модификаций "сэндвич" ИФА с использованием моноклональных антител для иммобилизации антигена. В наиболее простой модификации “сэндвич” ИФА антигены иммобилизуют путем инкубации лизата тромбоцитов больного (прямой вариант) или донора (непрямой вариант) с сорбированными на пластик моноклональными антителами против антигенов мембраны тромбоцитов (ГП IIb-IIIa, ГП Ib и др.). В непрямом варианте тромбоциты донора предварительно обрабатывают сывороткой больного или проводят инкубацию с сывороткой после фиксации антигенов. Затем тромбоцит-ассоциированные антитела (прямой вариант) или сывороточные антитела (непрямой вариант), связанные с антигеном, выявляют с помощью меченых общевидовых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с «проявителем» (чаще – щелочной фосфатазой или пероксидазой). В более сложных модификациях моноклональные антитела (в непрямом варианте вместе с сывороткой) сначала инкубируют с цельными тромбоцитами, а уже затем лизируют тромбоциты и фиксируют антигены на поверхности с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека или мыши. При ИТП положительные ответы в антиген- специфических тестах регистрируются у 80% больных при исследовании тромбоцит- ассоциированных антител и у 30-50% больных при исследовании сывороточных антител[24].

Радиоимунный анализ (РИА). Данный метод был изобретен в 1950-х годах прошлого столетия Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. РИА основывается на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с последующей их детекцией на специальных счетчиках, так называемых, радиоспектрометрах. Таким образом, главное отличие радиоиммунного анализа от иммуноферментного анализа (ИФА) заключается в том, что вместо фермента антитело помечается изотопом. Как правило, для метки - 28 антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.

Радиоиммунный анализ обладает довольно высокой чувствительностью и специфичностью. Неоспоримым преимуществом РИА является возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Что касается недостатков, то они, как правило, связываются с ограничениями, определяемыми режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно коротким сроком годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки. Кроме того, диагностика посредством радиоиммунного анализа предусматривает наличие специализированной лаборатории, а также использование дорогостоящего оборудования (гамма счетчиков). Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью. В основе метода лежит использование поликлональных антител, меченных радиоактивным йодом I125 и направленных против иммуноглобулинов человека. К исследуемым тромбоцитам добавляют антитела против иммуноглобулинов класса G человека, меченные I125. После инкубации взвесь тромбоцитов, несущих на своей поверхности IgG, пропускают путем центрифугирования через раствор сахарозы для отделения не связавшихся с тромбоцитами меченных I125 антител (125I-АТ).

Частота выявления антител, фиксированных на поверхности тромбоцитов, при проведении РИА значительно превышает частоту выявления циркулирующих сывороточных антител. Чувствительность метода 85% [31].

Метод проточной цитофлюорометрии. Стал применяться для диагностики тромбоцитопений в последнее десятилетия. Он является наиболее чувствительным для выявления тромбоцитассоциированных антител при любых тромбоцитопениях ( первичных и вторичных);

при этом чувствительность метода - 29 с объективизацией учёта результатов составляют более 90 – 95%. Однако для выявления больных с первичной ИТП этот метод необходимо дополнять иммуноферментным анализом для мембраноспецифических антител, свойственных ИТП. Как и при других методах (ИФА, РИА), существуют подварианты: прямой метод выявляет антитела на тромбоцитах, непрямой – свободные сывороточные антитела.

Для выявления антител обогащённую тромбоцитами плазму инкубируют с фикоэритрин-конъюгированными моноклональными антителами (антиСД61) и/или FITC-конъюгированными козьеми анти-IgG-антителами. Проявителем реакции является флуоресцеин, с помощью которого выявляются окрашенные комплексы. Характер и интенсивность свечения оцениваются проточным спектрофотометром.

Согласно результатам исследования итальянских и японских ученых, возможно, существует связь между инфекцией, вызванной Helikobacter pylori, и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой. Оказалось, что эрадикация H.

Pylori и развитием ИТП, вероятно, откроет новые перспективы терапии ИТП с использованием антибактериальных препаратов, используемых для лечения H.

pylori [68, 89, 105].

Определение времени жизни тромбоцитов проводят с использованием меченных 51Cr или 111In аутологичных или донорских тромбоцитов.

Иммунофермнтным анализом (ИФА) повышенного разрушения тромбоцитов определено, что время их жизни при иммунных тромбоцитопениях укорочено.

Однако этот метод в настоящее время применяется редко (главным образом, в связи с необходимостью введения в организм радиоизотопной метки).

- 30 Лечение Специфическая патогенетическая терапия ИТП до последнего десятилетия была направлена на угнетение продукции антитромбоцитарных антител и сокращение разрушения тромбоцитов. Как всякая терапия, она небезразлична для организма больного, сопровождается побочным действием и невысокой избирательностью. Поэтому при компенсированном состоянии больного, отсутствии геморрагического синдрома и стабильном количестве тромбоцитов на уровне 30-50х109/л, можно ограничиться наблюдением за больным и назначением сосудоукрепляющей терапии [5, 21, 23, 60, 67, 74, 94, 110, 115, 122].

Основные методы лечения ИТП — глюкокортикоиды, внутривенное введение иммуноглобулина G, спленэктомия. Другие методы используются лишь при неэффективности основных;

к ним относятся лечение имураном (азатиоприном) в дозе 2мг/кг/сут, циклофосфаном по 200-400мг в сутки в курсовой дозе 6-8г, винкристином 1,5мг один раз в неделю курсом продолжительностью 1-1,5 месяца, интерфероном-альфа, мабтерой, назначение циклоспорина, плазмаферез, удаление добавочной селезенки.

В большинстве исследований эффективность лечения оценивается по косвенному критерию — увеличению или нормализации числа тромбоцитов [18, 22, 53, 71, 75, 86, 112, 115, 121].

Базовым лечением ИТП является глюкокортикостероидная терапия (ГКС) в дозах 0,5-1,0мг/кг массы тела в сутки, при этом повышение уровня тромбоцитов проявляется в течение 2-3 недель и обычно коррелирует с быстрым снижением связанных антитромбоцитарных антител[5, 21, 23, 60, 94, 107, 115].


Эффективная ГКС терапия у больных ИТП, характеризуется исчезновением пурпуры, уменьшением уровня антитромбоцитарных антител, подъемом уровня тромбоцитов. Механизм действия ГКС комплексный:

1. нарушение взаимосвязи между поверхностью тромбоцитов и антитромбоцитарными антителами;

2. уменьшение антитромбоцитарной продукции антител В-лимфоцитами селезенки, печени, костным мозгом;

- 31 3. снижение селезеночной секвестрации пластинок;

4. ангиотрофичекая функция ГКС.

[21, 22, 60].

Благоприятным прогностическим признаком применения ГКС являются:

быстрое купирование геморрагического синдрома, параллельное снижение уровня антитромбоцитарных антител.

Поддерживающая терапия ГКС осуществляется длительно, в среднем 4- мес. и более, в дозах 10-15мг в сутки, затем через день. В процессе лечения малыми дозами стероидных препаратов наблюдается значительное снижение содержания антитромбоцитарных антител, причем отмечено прямо пропорциональная зависимость клинического состояния больных, стабилизации уровня тромбоцитов, обеспечивающего купирование геморрагического синдрома[22, 115, 121].

Введение анти-D Ig в/в является эффективным, относительно дешевым и безопасным методом лечения ИТП. Основным механизмом действия является кратковременная блокада макрофагов селезенки «сенсибилизированными»

эритроцитами. Препарат назначается однократно в стандартной дозе 50-75 мкг/кг, ответ на терапию достигается через 2-4 дня. Недостатками данного препарата является то, что он может применяться только у резус-положительных пациентов, неэффективен у спленэктомированных больных и противопоказан пациентам со сниженным 100г/л уровнем гемоглобина, так как может вызвать гемолиз эритроцитов [73, 93, 108, 113].

Начальной или альтернативной терапией может быть введение внутривенного иммуноглобулина (IgG в/в) — это наиболее важное достижение в лечении ИТП за последнее десятилетие. Препарат эффективен у первичных больных и у больных, резистентных к терапии кортикостероидами [21, 37, 42, 60, 77, 114, 121].

Механизм действия иммуноглобулинов при ИТП основан на блокировке Fc рецептора мононуклеаров макрофагальной системы селезенки, что препятствует преждевременной элиминации покрытых антителами тромбоцитов и - 32 способствует сохранению их в кровеносном русле. Кроме этого не исключается инактивация антитромбоцитарных аутоантител антиидиотипическими антителами, содержащимися в препаратах ВИГ, в результате чего IgG связывает рецепторы макрофагов и блокирует фагоцитоз тромбоцитов, а также иммуномоделирующее действие в отношении Т-хелперов и Т-супрессоров с угнетением патологического аутоиммунного ответа. Скорее всего имеет место сочетание всех этих механизмов, что определяет быстрый эффект увеличения количества тромбоцитов и купирование геморрагического синдрома.

Доза IgG в/в — 0,4 г/кг/сутки в течение 5 дней. ВИГ способен очень быстро (через 24–48 часов) повышать количество тромбоцитов у большинства больных ИТП до уровня более 100 000. Преимуществами IgG в/в является отсутствие токсичности, высокая эффективность, не передается ВИЧ;

недостатками — длительная инфузия (несколько часов), высокая стоимость. Однако несмотря на высокую стоимость препарата, целесообразность его применения не вызывает сомнений, в частности, при подготовке к оперативному вмешательству (в том числе, к оперативному и естественному родоразрешению и спленэктомии).

Эффективность применения препарата 80-85%. Несмотря на это при лечении нужно учитывать тот факт, что повышение количества тромбоцитов носит временный характер и составляет от 18 до 60 дней [22, 37, 42, 77].

В случаях неэффективности комплексной консервативной терапии, наличии выраженной тромбоцитопении и угрозы опасных для жизни кровотечений, больным проводиться хирургическое лечение, которое включает спленэктомию.

Результаты лапароскопических и традиционных трансабдоминальных хирургических подходов сопоставимы, однако после лапароскопических вмешательств восстановление проходит быстрее. Эмболизация селезенки и ее облучение в настоящее время практически не применяются [22, 49, 59, 70, 80, 88, 99, 106, 115].

Эффект спленэктомии связывают, в основном, с выпадением двух функций селезенки: источника антитромбоцитарных антител и органа деструкции - 33 тромбоцитов вследствие частичной утраты макрофагами селезенки способности к элиминации антител.

Вероятность ответа не может быть определена доступными методами, однако, если пациент был тотально рефрактерен к предыдущей терапии, прогноз хорошего результата невысок, особенно у пожилых, больных с вторичными формами ИТП и, возможно, у тех, чей клиренс разрушения тромбоцитов в печени высок В качестве прогностических факторов спленэктомии выделяют: повышение уровня тромбоцитов в периферической крови в раннем послеоперационном периоде;

положительный ответ на предварительную терапию стероидными препаратами;

менее тяжелое течение заболевания;

более молодой возраст пациентов [22, 88, 99].

Потенциальная опасность спленэктомии заключается как в технических сложностях во время операции, включающих кровотечения, так и в послеоперационных осложнениях. По данным различных авторов послеоперационные осложнения составляют от 5 до 20%, а послеоперационная летальность – менее 1% [21, 49, 80, 99]. Наибольший риск при спленэктомии – это тяжелый бактериальный сепсис, который развивается менее чем у 1% больных с ИТП. В связи с чем, как минимум за 2 недели до спленэктомии рекомендовано проведение иммунизации поливалентной пневмококковой, Haemophilus influenza тип В, четырехвалентной комбинированной менингококковой вакциной к Neisseria meningitidis [22, 54, 111].

У прооперированных больных возможен рецидив заболевания через несколько лет и даже месяцев после спленэктомии, особенно при наличии дополнительных селезенок.

Возникновение рецидива после спленэктомии связывают с продолжающейся выработкой антител печенью, костным мозгом, другими лимфоидными органами. Довольно часто даже если удается достигнуть клинико гематологическую ремиссию, антитромбоцитарные антитела продолжают вырабатываться. Предполагается, что первично антителогенез при ИТП - 34 происходит в селезенке, а в дальнейшем, благодаря клеткам памяти, становится генерализованным. В связи с этим довольно часто используют глюкокортикостероидные гормоны, как в предоперационном, так и в послеоперационном периоде.

Одной из причин неэффективности спленэктомии - наличие не удаленных добавочных селезенок, частота выявления которых варьирует от 10 до 25%[23, 53, 88, 99, 121].

Для купирования профузных маточных и желудочно-кишечных кровотечений в последнее время используется рекомбинантный фактор VIIа (препарат Ново Сэвен) по 30-50мкг/кг 3 раза в день [8, 51, 55, 63, 125] Плазмаферез был впервые предложен в 1914г. двумя независимыми дург от друга группами авторов: В.А. Юревичем и И.К.Pозенбергом и J.J.Abel с соавт (США). Лечебный плазмаферез представляет собой операцию по избирательному удалению плазмы из периферической крови больного с целью лечебной коррекции ее белкового или клеточного состава. Плазмаферез, наряду с коррекцией гемостазиологических нарушений, купированием патологических изменений микроциркуляции и стаза, позволяет нормализовать иммунологический статус больных посредством удаления из кровотока аутоантител, иммунных комплексов, иммуногенных плазменных белков, вызывающих повреждение клеточных мембран и, в частности, эндотелия при аутоиммунных процессах [9, 17, 45].

Целью плазмафереза при ИТП является удаление антитромбоцитраных антител и циркулирующих иммунных комплексов с плазмой больных, резистентных к общепринятой терапии. Больным необходимо проводить от 3-х до 6 процедур с интервалом 3-5 дней на протяжении 1-1,5мес. Плазмаферез при ИТП используется чаще не как самостоятельный метод лечения, а как предварительное или параллельное терапевтическое воздействие с целью удаления имеющихся антител с последующим назначением гормональной терапии или ВВИГ для улучшения эффекта, эффект сохраняется обычно в течение 2-6мес. Показано последовательное уменьшение и исчезновение сначала фиксированных и только - 35 затем возросших циркулирующих антитромбоцитарных антител. При этом была отмечена отдаленная гематологическая эффективность данного метода [9, 17].

К препаратам второй линии терапии относят ритуксимаб – моноклональное химерное антитело к СD 20-антигену, который экспрессируется исключительно на В-лимфоцитах. Препарат неселективно элиминирует весь В-клеточный пул, в том числе и клоны В-лимфоцитов, продуцирующие антитромбоцитарные антитела. Вероятность достижения полного и частичного тромбоцитарного ответа при лечении ритуксимабом (в разовой дозе 375мг/м2 2-4 введения) составляет 30 60%, однако стойкая (более 1 года) ремиссия наблюдается только у 30-50% ответивших [78, 116].

Изучение и сопоставление новых данных, касающихся иммунопатогенеза ИТП, а также клеточных и молекулярных механизмов, принимающих участие в мегакариоцитопоэзе и циркуляции тромбоцитов, позволило сместить акцент патогенетической терапии с предотвращения или снижения повышенной деструкции нагруженных антителами тромбоцитов на воздействие на клеточную кинетику при мегакариоцито- и тромбоцитопоэзе.

Вывод об имеющей место неадекватности тромбопоэза натолкнул исследователей на мысль о целесообразности применения тромбопоэтина (ТПО) в качестве регулятора патологической продукции мегакариоцитов и тромбоцитов в организме, на фоне чего появился новый класс лекарственных средств, возникший при клонировании тромбопоэтина, экспрессируемый мегакариоцитами и тромбоцитами, который индуцирует рост и созревание мегакариоцитов, в результате чего повышалось количество тромбоцитов у здоровых лиц [21, 22, 36, 58, 65, 76, 79, 81, 94, 119].

Данный вид лекарственных препаратов, является агонистами рецептора тромбопоэтина (пептидными и непетидными) действуют так же, как эндогенный тромбопоэтин, вызывая пролиферацию и дифференцировку МКЦ из клеток предшественников костного мозга, а как следствие – зависимое от дозы увеличение числа тромбоцитов.


- 36 Препарат элтромбопаг имеет удобную таблетированную форму для приема внутрь в дозе 25 (ранее 30) мг, 50 мг и 75 мг 1 раз в день [57, 87].

Другим аналогичным по действию агонистом рецептора тромбопоэтина является препарат энплейт (ромиплостим), для подкожного введения. Препарат вводится в возрастающей дозе от 1 мкг/кг до 10 мкг/кг максимально подкожно раз в неделю под контролем уровня тромбоцитов. Максимальная доза обычно не используется из-за угрозы тромбозов (3-4%)[21, 22].

Перспективами применения элтромбопага и ромиплостима являются:

лечение постоянно-рецидивирующих и резистентных форм ИТП;

использование при подготовке к инвазивным вмешательствам короткими курсами;

возможность использования в терапии первой линии, при непереносимости других методов терапии [21, 36, 57, 58, 120].

Тромбопоэтические препараты представляются многообещающими в новой терапевтической стратегии больных ИТП, которые не ответили на лечение второй и третьей линии, а также у пациентов с непереносимостью ГКС и ВИГ.

Таким образом, клиническая гематология в настоящее время располагает довольно широким арсеналом лечебных средств патогенетического действия.

Однако, диагностические критерии ИТП недостаточно информативны, поэтому диагноз ИТП остается диагнозом исключения. Не установлены прогностические факторы, которые способствовали бы выбору наиболее эффективного вида патогенетической терапии для конкретного больного.

Поэтому мы предприняли наше исследование по изучению морфофункционального состояния тромбоцитов при ИТП, рассчитывая получить дополнительные критерии диагностики и прогноза.

- 37 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Объекты исследования В диссертации обобщены данные обследования 175 пациентов с тромбоцитопениями, находившихся на обследовании и лечении в научно клиническом отделении амбулаторно-поликлинической помощи ГНЦ в период с 2007 по 2011 гг. Из них 135 пациентов с диагнозом первичная иммунная тромбоцитопения, 40 – с вторичными тромбоцитопениями: 10 пациентов с аплазией кроветоворения, 10 пациентов с вирусным гепатитом «В» или «С», пациентов с антифосфолипидным синдромом, 10 с постцитостатической тромбоцитопенией. Для получения нормативных характеристик компьютерной морфометрии тромбоцитов взрослых здоровых лиц в контрольную группу были включены 30 доноров - практически здоровые лица без признаков аутоиммунного заболевания, тромбозов и не принимавшие на момент исследования какие-либо лекарственные препараты, средний возраст их составил 36,1±10,5 лет. Общая характеристика больных с тромбоцитопенией, включенных в исследование по возрасту и соотношению полов представлена в таблице 1.

Таблица 1.Общая характеристика больных с тромбоцитопенией Постцито Характеристика Аплазия Вирусный статическая ИТП АФС кроветворения гепатит больных тромбоци топения Число больных(175) 135 10 10 10 Мужчина:женщина 33:102 5:5 2:8 5:5 5: Средний возраст 35,7±11,5 27±5,4 26,8±6,3 33,9±7,7 33,7±6, (лет) - 38 Диагноз ИТП устанавливался согласно классификации на основании общепринятых критериев:

-изолированное снижение уровня тромбоцитов в периферической крови (с допустимой гипохромной анемией вследствие выраженного геморрагического синдрома), -раздражение или сохранение мегакариоцитарного ростка, -отсутствие увеличения размеров селезенки, -отсутствие диагностических признаков системных, эндокринологических и онкогематологических заболеваний, способных вызвать вторичную иммунную тромбоцитопению.

2.2 Методы исследования Обследование больных проводили согласно стандартному протоколу, включающего в себя:

-сбор анамнестических данных, клинического статуса по выраженности основной клинической -оценку симптоматики, (ручной, неаппаратный) просмотр и подсчет показателей -визуальный периферической крови -биохимическое исследование крови с включением функциональных проб печени, почек, состояния поджелудочной железы и хотя бы основных показателей гемостаза - цитологическое исследование пунктата костного мозга - тесты на исключение СКВ и других коллагенозов, -постановка реакции Вассермана, теста на ВИЧ-инфекцию и выявление антигенов вирусных гепатитов, - определение антител к фосфолипидам, -определение функционального состояния щитовидной железы и антитиреоидных антител - 39 Помимо общепринятых клинических методов обследования больных применялись специальные методы:

- определение антител против гликопротеинов мембраны тромбоцитов методом радиоиммунного анализа, - для исследования морфофункционального состояния тромбоцитов использовали метод витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии на базе отечественного компьютерного лазерного фазово интерференционного микроскопа (КФМ) “Цитоскан” (МГИРЭА, Москва)(Василенко И.А., Тычинский В.П.) 2.3. Специальные лабораторные исследования 2.3.1 Методика проведения РИА Для каждого определения использовалось 30 мл крови. После выделения тромбоцитов, к суспензии отмытых тромбоцитов добавляют 20мкл I125-AT против IgG и инкубировали при 37С в течении 30 минут. Несвязавшиеся I125 – антитела IgG отделяли от тромбоцитов центрифугированием через 20% раствор сахарозы. Далее просчитывали отдельно верхние и нижние части пробирки, определяя таким образом, связанную с клетками и свободную радиоактивность.

Исследование выполнялось в лаборатории клеточной адгезии Института экспериментальной Кардиологии РКНПК МЗМП РФ (Зав.лаб. Мазуров А.В.).

2.3.2. Методика компьютерной морфометрии тромбоцитов Внедрение компьютеров позволило не только ускорить проведение рутинных исследований, но и открыло перспективы изучения новых характеристик клеток и клеточной физиологии. На основе данных многомерного анализа возможно создание математических моделей, которые помогут не только прогнозировать течение болезни, предсказывать успех терапии, но и раскрыть многие фундаментальные аспекты патогенеза исследуемых заболеваний. По определению Г.Г.Автандилова, применение компьютеров в анализе изображения цитологических и гистологических препаратов позволяет проводить количественный системный анализ биологических объектов с использованием - 40 современных статистических методов, без чего немыслим прогресс в раскрытии новых закономерностей патологических процессов, в их распознавании и ранней диагностике.

Для прижизненной оценки морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови использовали метод витальной компьютерной лазерной морфометрии (Василенко И.А. и др., 1995), проводимый в динамическом режиме:

накануне начала терапии, через 1 неделю и 1 месяц от начала терапии в лаборатории компьютерной цитоморфометрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова (Руководитель - д.м.н. Василенко И.А.). Выбор КФМ в качестве метода исследования был продиктован следующими его преимуществами: возможностью изучения живых нативных тромбоцитов, не подвергавшихся предварительной обработке, окрашиванию или фиксации;

реализацией принципа индивидуального подхода к детальному анализу характеристик каждого клеточного объекта;

оперативному получению высокоточных и объективных количественных данных на основе компьютерной технологии (в течение 2-х часов);

использованию универсальных критериев оценки клеток, характеризующих как морфологические, так и функциональные их особенности;

потребностью малого (не более 1-1,5 мл) объема крови для проведения анализа;

отсутствием необходимости использования дорогостоящих реактивов или длительной пробоподготовки.

При исследовании использовали венозную кровь, заготавливаемую в пробирку из ареактивного пластика с антикоагулянтом (ЭДТА). Исследования проводили на базе отечественного компьютерного лазерного фазово интерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва), представляющего собой интерферометр Линника на базе модифицированного и автоматизированного МИИ-4 (ЛОМО, РФ). В микроинтерферометре «Цитоскан»

использован метод регистрации фазы света путем модуляции опорной волны, т.е.

аппаратный способ (Тычинский В.П., 1989). Источником света служит лазер с длиной волны 6ЗЗнм. Для приготовления плазмы, обогащенной тромбоцитами, кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5-7 минут. Взвесью клеток - 41 заполняли камеру Горяева, рабочая поверхность которой имеет зеркальное напыление. После 3-5 минутного интервала, необходимого для оседания клеток, производили съемку изучаемых цитообъектов. Оптимальный объем выборки составляет 50 — 100 клеток. Для проведения исследований использовали штатный 30-кратный микрообъектив с числовой апертурой 0,65. Увеличение в канале регистрации составляет 500х. В основе принципа действия микроскопа, содержащего идентичные объективы в сигнальном и реперном плечах, лежит сравнение волнового фронта, прошедшего через объект, с опорным, отраженным от высококачественного зеркал (рисунок 1A, 1B).

Прозрачный объект (живая клетка) в иммерсионной среде представляет собой локальную оптическую неоднородность, которая деформирует его волновой фронт. Его деформация в интерференционном микроскопе воспринимается как фазовое изображение объекта.

Рисунок 1A. Метод витальной компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) - концепция КФМ;

- 42 Рисунок 1B. Метод витальной компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) - принцип действия фазово-интерференционного комплекса «Цитоскан»

Преобразование сигнала состоит в его дискретизации с последующей записью распределения фаз в виде цифровой матрицы х,у размером m х n, где m — число строк, n — число столбцов. Значения х,у представляют собой, оптическую толщину объекта Н в точке с координатами х,у: Н(Х,У)=[п(х,у) пс]h(х,у), где п(х,у) - показатель преломления, h(х,у) — физическая толщина в направлении Z, пс — показатель преломления среды. Результат обратного преобразования цифрового массива в видимое изображение и восстановление фазового портрета объекта отображался на экране монитора компьютера.

Количественный анализ данных производили отдельно с помощью программных средств, разработанных в среде МАТLАВ: Результаты расчетов выводятся на дисплей в виде таблицы параметров каждого объекта и серии графиков.

Комплексный алгоритм фазометрии предполагал автоматическое определение заданных размерных параметров изучаемых цитообъектов, статистическую обработку данных и документирование результатов в виде протоколов I, II и I I I уровней:

- 43 I уровень обеспечивал визуализацию фазово-интерференционного образа клетки (топограмму, 3-мерное изображение, профиль, гистограмму распределения фазовых высот).

II уровень – расчёт морфометрических показателей отдельных клеток (диаметр – Dmax, периметр – Per, высота – Height, площадь – Area, объем – Vol);

оценку распределения объема и площади фазово-интерференционного образа клетки по уровням сканирования (взаимодействие с чужеродной поверхностью);

контурное изображение топографии интерференционного поля (послойная интерферограмма клетки в псевдоцвете).

III уровень – интегральный анализ клеточной популяции по мерным признакам (Dmax, Per, Height, Area, Vol), построение тромбоцитограмм.

2.4.Статистическая обработка результатов Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения.

Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

Различия признавали достоверными при значении р 0,05.

- 44 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Клиническая характеристика пациентов Из клинической характеристики больных следует, что возраст больных с ИТП включенных в исследование, колебался от 17 до 77 лет (средний возраст 35,7±11,5лет).

Как видно из приведенных данных в таблице №2, наибольшая частота встречаемости данного заболевания наблюдалась в возрасте от 20 до 40 лет и составила 68,9 %, что соответствует данным многих авторов. Несколько реже первичная иммунная тромбоцитопения встречалась у пациентов в возрасте - от до 50 лет (14,1%). Наименее часто заболевание встречается в возрасте после лет и составляет 2,9%.

Таблица 2. Распределение пациентов с ИТП по возрасту:

Общее кол-во больных Возраст абс. % всего 135 100% 17-20 5 3,7% 20-30 48 35,6% 30-40 45 33,3% 40-50 19 14,1% 50-60 7 5,2% 60-70 7 5,2% 70-77 4 2,9% - 45 При выполнении данного исследования учитывалась и степень тяжести течения ИТП. Критериями для условной оценки степени тяжести течения заболевания явились данные объективного осмотра, клинико-лабораторного обследования пациентов.

Под легкой степенью тяжести течения понималось отсутствие геморрагического синдрома, снижение уровня тромбоцитов не более чем до 50тыс (тромбоцитопения в пределах 50-170х109/л).

Под течением средней тяжести – понимается наличие кожно геморрагического синдрома в виде геморрагической сыпи на коже нижней половине туловища;

умеренной интенсивности носовые, десневые кровотечения, а также наличие тромбоцитопении (уровень тромбоцитов колеблется в пределах 20-50x109/л). Количество рецидивов не более двух раз в год.

При тяжелой степени – выражен геморрагический синдром в виде геморрагической сыпи на верхней половине туловища, маточных, желудочно кишечных, профузных носовых кровотечений, жалоб на головную боль, снижения остроты зрения с и/или снижением уровня тромбоцитов ниже 20тыс (20x109/л).

Течение заболевания постоянно рецидивирующее (более 3-х рецидивов в год).

Распределение больных по группам в зависимости от тяжести течения заболевания представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, наибольшее количество пациентов, принимавших участие в исследовании было со средней степенью тяжести течения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры— 56 (41,48 %), с легким течением наблюдались 38 пациент (28,15 %) и с тяжелой степенью течения в исследовании приняли участие 41 пациент, что составило (30,37%).

- 46 Таблица 3. Распределение больных по группам с первичной иммунной тромбоцитопенией по тяжести течения заболевания Общее кол-во больных Характеристика больных абс. % всего 135 100% легкая 38 28,15% средняя 56 41,48% тяжелая 41 30,37% При анализе анамнестических факторов, которые предшествовали началу заболевания и могли спровоцировать его дебют, выявлено, что у 59% больных с ИТП началу заболевания предшествовала острая респираторно-вирусная инфекция, либо обострение хронических заболеваний;

у 12% заболевание возникло в период гормональных перестроек (менархе, беременность, послеродовый и послеабортный период);

после стрессовых ситуаций, на фоне психоэмоционального и физического напряжения у 15%;

у 4% проявилось после оперативных вмешательств;

у 2% - после профилактического введения сывороток и вакцин (рисунок 2).

2% 4% ин-ции 15% бер-ть стресс 12% хир.вмеш вакц-ции 59% Рисунок 2. Факторы непосредственно предшествующие ИТП у обследуемых пациентов.

- 47 Клиническая картина заболеваний была разнообразной. Геморрагические осложнения в виде кровотечений и кровоточивости наблюдались у 78% больных.

Бессимптомно заболевание протекало у 22% больных с ИТП. Клинико лабораторные проявления обострений заболеваний в период наблюдения представлено на рисунке 3.

бессимптомно кожные кровоизлияния 6% 12% 22% носовые и десневые кровотечения 42,3% менноррагии 17% кровотечение после экстракции зуба Рисунок 3 Клинико-лабораторные проявления обострений заболевания в период наблюдения Поскольку показаниями к началу лечения первичной иммунной тромбоцитопении является наличие геморрагического синдрома и/или снижении уровня тромбоцитов ниже 20-30 тысяч, то дальнейшие исследования мы проводили у пациентов со средней и тяжелой степенью заболевания. Все пациенты (97 человек) с ИТП, которым проводилась терапия, были разделены на 4 группы.

В первую группу были включены 66 пациентов, получавших традиционную глюкокортикостероидную терапию. Вторую группу составили 15 пациентов, у которых с лечебной целью была выполнена спленэктомия. Третью группу - пациентов, получавших внутривенный иммуноглобулин. Четвертую группу составили 6 пациентов, которые получали терапию агонистами тромбопоэтина ( пациента на терапии ромипластином, 3 пациента на терапии элтромбопагом).

- 48 3.2.Витальная компьютерная фазово-интерференционная микроскопия тромбоцитов периферической крови у практически здоровых людей Для проведения полноценного анализа состояния системы гемостаза, нами было проанализировано состояние ее клеточного звена — тромбоцитов методом компьютерной морфометрии (КФМ). Ретроспективный анализ литературы и полученная нами база данных фазово-интерференционных изображений клеток позволили выделить и идентифицировать 4 морфологических типа живых тромбоцитов, характеризующих ту или иную степень их активации. Основой для дискриминации структурно измененных клеток служили различные варианты их формы, характера рельефа поверхности, наличие псевдоподий, их количество и величина.

Важно учитывать, что параметры фазового изображения содержат информацию не только о пространственно-объемных характеристиках живой клетки, но и ее оптических свойствах в частности внутриклеточной анизотропии.

Величина показателя преломления, измеряемая в каждой точке цитообъекта, непосредственно зависит от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия или отсутствия органелл и включений. Изменение любого из указанных условий находит отражение в характерных локальных трансформациях фазового изображения клетки.

В условиях физиологической нормы (рисунок 4) подавляющее большинство тромбоцитов представлено плоскими, округлыми клетками с гладкой или складчатой поверхностью — «гладкие» и «рифленые» дискоциты, соответствующие I типу.

Ко II морфологическому типу тромбоцитов были отнесены клетки округлой или неправильной формы с гладкой или складчатой поверхностью и 1- короткими (меньше диаметра клетки) отростками-псевдоподиями, являющимися выростами поверхностной мембраны — «эхиноциты» 1 класса.

Клетки, имеющие около 2-5 длинных (больше диаметра клетки) отростков «антенн», представляли III тип и отличались большим многообразием форм: от - 49 плоских дисков до клеток неправильной причудливой формы — «эхиноциты» класса.

Тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной длины и многочисленными вакуолями были отнесены к IV морфологическому типу - дегенеративно измененным клеткам.

I тип II тип III тип IV тип Схема Топограмма реконструкция 3D Рис.4 Схема и фазово-интерференционные портреты морфофункциональных типов тромбоцитов периферической крови: I – тромбоцит «покоя»;

II – тромбоцит с низким уровнем активности;

III – высоко активированный тромбоцит;

IV – дегенеративно-измененные тромбоциты - 50 Следует отметить, что гладкие и рифленые дискоциты являются так называемыми формами «покоя». Тромбоциты II - III типов, отличающиеся появлением отростков различного числа и длины, а также изменением их формы, связанной с перестройкой цитоскелета и структуры грануломера, проявляют внешние признаки функциональной активности. Клетки IV типа -тромбоциты, исчерпавшие свой функциональный потенциал.

Установлено (рисунок 5), что процентное соотношение морфологических типов тромбоцитов у практически здоровых лиц выглядит следующим образом:

63% тромбоцитов представлено клетками «покоя», 21% - тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип). Количество клеток с длинными отростками – «антеннами» - высоко активированные тромбоциты – составляет 12% (III тип), а дегенеративно-измененные (IV тип) – всего 4%.



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.