авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |

«ИД «АБВ-пресс» представляет Сепсис в торакоабдоминальной онкохирургии р Формат книги: 170 x 220 мм. ...»

-- [ Страница 5 ] --

между MDM2 (HDM2) и р53, в комбинации с ингиби- В основе патогенеза ЛПЗ лежат изменения на уров торами протеосом (бортезомибом) на клеточной линии не человеческого генома. До настоящего времени окон лимфомы из клеток мантийной зоны и множественной чательно неясна роль системы белка р53 в патогенезе миеломе [68]. онкологических заболеваний в целом и ЛПЗ в частно 74 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ сти, ввиду необычайно широкого спектра эффекторных регуляторами и эффекторами в процессе развития ЛПЗ ’ ответов р53. Изучение роли программиру емой клеточ- может открыть новые перспективы не только в диагно ной гибели, взаимоотношений р53-молекулы с генами- стике, но и в лечении этого вида патологии.

ЛИТЕРАТУРА 1. Новиков B.C. Программированная диагностика, лечение). Автореф. дис. … display p53-dependent drug-induced клеточная гибель. СПб.: «Наука», 1996. докт. мед. наук. М., 1985. Puma upregulation. Leukemia 2. Hansen R., Oren M. P53 from inductive 15. Gruszka-Westwood A.M., Hamoudi R.A., Mar;

19(3):427–34.

signal to cellular effect. Curr Opin Genet Matutes E. et al. P53 abnormalities in splenic 27. El-Deiry W.S. Regulation of p 1997;

7:46–51. lymphoma with villous lymphocytes. downstream genes. Semin Cancer Biol 3. Bakhshi A.J., Jensen P., Goldman P. et al. Blood 2001 Jun 1;

97(11):3552–8. 1998;

8:345–57.

Cloning the chromosomal breakpoint of 16. Greiner T.C., Moynihan M.J., 28. Deng Y., Chan S.S., Chang S. Telomere t(14;

18) human lymphomas: clustering around Chan W.C. et al. P53 mutations in mantle dysfunction and tumour suppression:

JH on chromosome 14 and near a transcrip- cell lymphoma are associated with variant the senescence connection. Nat Rev tional unit on 18. Cell 1985;

41:889–906. cytology and predict a poor prognosis. Cancer 2008;

8:450–8.

4. Tsujimoto Y., Gorham J., Cossman J. et al. Blood 1996 May 15;

87(10):4302–10. 29. Halazonetis T.D., Gorgoulis V.G., The t(14;

18) chromosome translocations 17. Sander C.A., Yano T., Clark H.M. et al. Barteck J. An oncogene-induced DNA involved in B-cell neoplasms result from P53 mutation is associated with progression damage model for cancer development.

mistakes in VDJ joining. Science in follicular lymphomas. Blood 1993 Oct 1;

Science 2008;

319:1352–5.

1985;

229:1390–3. 82(7):1994–2004. 30. Martins C.P., Brown-Swigart L., Evan G.I.

5. Deary M., Smith S., Sclar J. Cloning and 18. Villuendas R., Piris M.A., Orradre J.L. Modeling the therapeutic efficacy of p structional analysis of cDNAs Bcl-2 and et al. P53 protein expression in lymphomas restoration in tumors. Cell 2006;

127:1323–34.

a hybrid Bcl-2/immunoglobulin transcript and reactive lymphoid tissue. J Pathol 1992 31. Ventura A., Xu G., Wang H. et al.

resulting from the t(14;

18) translocation. Mar;

166(3):235–41. Expressions of p53 and p21 in nasal NK/ Cell 1986;

47:19–23. 19. Cordone I., Masi S., Mauro F.R. et al. T-cell lymphoma and their relationship 6. Kelekar Т., Thompson C. Bcl-2 family P53 expression in B-cell chronic with the proliferation and apoptosis of cells.

proteins: the role of the BH3 domain in lymphocytic leukemia: a marker of disease Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai apoptosis. Trends Cell Biol 1998;

8:324–30. progression and poor prognosis. Blood 1998 Ke Za Zhi 2009 Jan;

23(2):73–6.

7. Puthalakath H., Huang D., OReily L. Jun 1;

91(11):4342–9. 32. Xue W., Zender L., Miething C. et al.

et al. The proapoptotic activity of the Bcl-2 20. Yu J., Zhang L. No PUMA, no death: Senescence and tumour clearance is family member Bim is regulated by implications for p53-dependent apoptosis. triggered by p53 restoration in murine liver interaction with the dynein motor complex. Cancer Cell 2003;

4:248–9. carcinomas. Nature 2007;

445:656–60.

Mol Cell 1999;

3:287–96. 21. Michalak E.M., Villunger A., 33. Brown J.P., Wei W., Sedivy J.M. Bypass 8. Oltvai Z., Korsmeyer S. Checkpoints Adams J.M. et al. In several cell types of senescence after disruption of p21CIP1/ of dueling dimers foil death wishes. tumour suppressor p53 induces apoptosis WAF1 gene in normal diploid human Cell 1994;

79:189–92. largely via Puma but Noxa can contribute. fibroblasts. Science 1997;

277:831–4.

9. Bellido M., Capello D., Altes A. et al. Cell Death Differ 2008;

15:1019–29. 34. Cosme-Blanco W., Shen M.F., Bcl-6 p53 mutations in lymphomas carrying 22. Garrison S.P., Jeffers J.R., Yang C. et al. Lazar A.J.F. et al. Telomere dysfunction the Bcl-2/Jh rearrangement. Haematologica Selection against PUMA gene expression suppresses spontaneous tumorigeesis in vivo 2002;

87(9):908–17. in Myc-driven B cell lymphomagenesis. by initiating p53-dependent cellular 10. Scorpa A., Moore P.S., Rigaurd G. et al. Mol Cell Biol 2008;

28:5391–402. senescence. EMBO Rep 2007;

8:497–503.

Molecular features of primary mediastinal 23. Labi V., Erlacher M., Krumschnabel G. 35. Van Nguyen T., Puebla-Osorio N., B-cell lymphoma: involvement of et al. Apoptosis of leukocytes triggered by Pang H. et al. DNA damage-induced cellular p16INK4A, p53 and c-myc. Br J Haematol acute DNA damage promotes lymphoma senescence is sufficient to suppress 1999;

107(1):106–13. formation. Genes Dev 2010 August 1;

tumorigenesis: a mouse model. J Exp Med 11. Gaidano G., Volpe G., Pastore C. et al. 24:1602–7;

doi:10.1101/gad.1940210. 2007;

204:1453–61.

Detection of BCL-6 rearrangements and 24. Michalak E.M., Vandenberg C.J., 36. Barboza J.A., Liu G., El-Naggar A.K.

p53 mutations in MALT-lymphomas. Delbridge A.R., Wu L., Scott C.L., et al. p21 delays tumor onset by preservation Am J Hematol 1997;

56(4):206–13. Adams J.M., Strasser A. Apoptosis-promoted of chromosomal stability. Proc Natl Acad Sci 12. Petit B., Leroy K., Kanavaros P. et al. tumorigenesis: gamma-irradiation-induced USA 2006;

103:19842–7.

Expression of p53 protein in T- and natural thymic lymphomagenesis requires Puma- 37. De la Cueva E., Garca-Cao I., Herranz M.

killer-cell lymphomas is associated with driven leukocyte death. Genes Dev 2010 et al. Tumorigenic activity of p21Waf1/Cip some clinicopathologic entities but rarely August 1;

24:1608–13;

doi:10.1101/ in thymic lymphoma. Oncogene 2006 Jul 6;

related to p53 mutations. Hum Pathol 2001 gad.1940110. 25(29):4128–32. Epub 2006 Feb 6.

Feb;

32(2):196–204. 25. Zhu H.J., Xu W., Cao X. et al. Detection 38. Chilosi M., Doglioni C., Magalini A.

13. Kapur S., Tiemann M., Menke M.A. et al. of puma mRNA levels by real-time et al. p21/WAF1 cyclin-kinase inhibitor The role of p53 and anaplastic lymphoma quantitative RT-PCR in chronic expression in non-Hodgkin's lymphomas:

kinase genes in the progression of cutaneous lymphocytic leukemia and its clinical a potential marker of p53 tumor-suppressor CD30(+) lymphoproliferative diseases. significance. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue gene function. Blood 1996 Nov 15;

Indian J Med Res 2005 Jan;

121(1):46–54. Za Zhi 2010 Aug;

18(4):843–8. 88(10):4012–20.

14. Поддубная И.В. Лимфосаркома 26. Mackus W.J., Kater A.P., Grummels A. 39. Xu G., Wang H., He G. et al. Expressions желудочно-кишечного тракта (клиника, et al. Chronic lymphocytic leukemia cells of p53 and p21 in nasal NK/T-cell ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ lymphoma and their relationship with Anticancer Res 1998 Jul–Aug;

18(4A): 64. Tabe Y., Sebasigari D., Jin L. et al.

’ the proliferation and apoptosis of cells. 2403–8. MDM2 antagonist nutlin-3 displays Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai 53. Camacho F.I., Bellas C., Corbacho C. antiproliferative and proapoptotic activity Ke Za Zhi 2009 Jan;

23(2):73–6. et al. Improved demonstration of in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res 40. Go J.H., Yang W.I. Expressions of p53 immunohistochemical prognostic markers 2009 Feb 1;

15(3):933–42.

and p21 in primary gastric lymphomas. for survival in follicular lymphoma cells. 65. Drakos E., Atsaves V., Schlette E. et al.

J Korean Med Sci 2001 Dec;

16(6):731–5. Mod Pathol 2011 May;

24(5):698–707. The therapeutic potential of p53 reactivation 41. Marine J.C., Francoz S., Maetens M. Epub 2011 Jan 14. by nutlin-3a in ALK+ anaplastic large cell et al. Keeping p53 in check: essential and 54. Wang P., Lushnikova T., Odvody J. et al. lymphoma with wild-type or mutated p53.

synergistic functions of MDM2 and MDM4. Elevated MDM2 expression induces Leukemia 2009 Dec;

23(12):2290–9.

Cell Death Differ 2006;

13:927–34. chromosomal instability and confers a 66. Coll-Mulet L., Iglesias-Serret D., 42. Marine J.C., Dyer M.A., survival and growth advantage to B cells. Santidrin A.F. et al. MDM2 antagonists Jochemsen A.G. MDMX: from bench Oncogene 2008 Mar 6;

27(11):1590–8. activate p53 and synergize with genotoxic to bedside. J Cell Sci 2007;

120:371–8. 55. Cui Y.X., Kerby A., McDuff F.K. et al. drugs in B-cell chronic lymphocytic 43. Poyurovsky M.V., Prives C. Unleashing NPM-ALK inhibits the p53 tumor leukemia cells. Blood 2006 May 15;

the power of p53: lessons from mice and suppressor pathway in an MDM2 and 107(10):4109–14.

men. Genes Dev 2006;

20:125–31. JNK-dependent manner. Blood 2009 67. Mohammad R.M., Wu J., Azmi A.S. et al.

44. Toledo F.G., Wahl M. Regulating the p53 May 21;

113(21):5217–27. An MDM2 antagonist (MI-319) restores p pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas. 56. Kojima K., Konopleva M., McQueen T. functions and increases the life span of orally Nat Rev Cancer 2006;

6:909–23. et al. MDM2 inhibitor Nutlin-3a induces treated follicular lymphoma bearing animals.

45. Itahana K., Mao H., Jin A. et al. p53-mediated apoptosis by transcription- Mol Cancer 2009 Dec 3;

8:115.

Targeted inactivation of MDM2 RING dependent and transcription-independent 68. Jones R.J., Chen Q., Voorhees P.M. et al.

finger E3 ubiquitin ligase activity in the mechanisms and may overcome Atm- Inhibition of the p53 E3 ligase HDM- mouse reveals mechanistic insights into p53 mediated resistance to fludarabine in chronic induces apoptosis and DNA damage — regulation. Cancer Cell 2007;

12:355–66. lymphocytic leukemia. Blood 2006 August 1;

independent p53 phosphorylation in mantle 46. Ito A., Lai C.H., Zhao X. et al. p300/ 108(3):993–1000. cell lymphoma. Clin Cancer Res 2008 Sep CBP-mediated p53 acetylation is commonly 57. Senzer N., Nemunaitis J. A review of 1;

14(17):5416–25.

induced by p53-activating agents and contusugene ladenovec (Advexin) p53 69. Petitjean A., Achatz M.I., inhibited by MDM2. EMBO J therapy. Curr Opin Mol Ther 2009;

Borresen-Dale A.L. et al. TP53 mutations 2001;

20:1331–40. 11:54–61. in human cancers: functional selection and 47. Teufel D.P., Freund S.M., Bycroft M. 58. Lain S., Hollick J.J., Campbell J. et al. impact on cancer prognosis and outcomes.

et al. Four domains of p300 each bind tightly Discovery, in vivo activity, and mechanism Oncogene 2007;

26:2157–65.

to a sequence spanning both transactivation of action of a small-molecule p53 activator. 70. Bertheau P., Espie M., Turpin E. et al.

subdomains of p53. Proc Natl Acad Sci USA Cancer Cell 2008;

13:454–63. TP53 status and response to chemotherapy 2007;

104:7009–14. 59. Ringshausen I., O’Shea C.C., Finch A.J. in breast cancer. Pathobiology 2008;

48. Ohkubo S., Tanaka T., Taya Y. et al. et al. MDM2 is critically and continuously 75:132–9.

Excess HDM2 impacts cell cycle and required to suppress lethal p53 activity 71. Sur S., Pagliarini R., Bunz F. et al.

apoptosis and has a selective effect on in vivo. Cancer Cell 2006;

10:501–14. A panel of isogenic human cancer cells p53-dependent transcription. J Biol 60. Brummelkamp T.R., Fabius A.W., suggests a therapeutic approach for cancers Chem 2006;

281:16943–50. Mullenders J. et al. An shRNA barcode with inactivated p53. Proc Natl Acad Sci 49. Tang Y., Zhao W., Chen Y., et al. screen provides insight into cancer cell USA 2009;

106:3964–9.

Acetylation is indispensable for p53 vulnerability to MDM2 inhibitors. 72. Carvajal D., Tovar C., Yang H. et al.

activation. Cell 2008;

133:612–26. Nat Chem Biol 2006;

2:202–6. Activation of p53 by MDM2 antagonists 50. Minsky N., Oren M. The RING domain 61. Selivanova G., Wiman K.G. Reactivation can protect proliferating cells from mitotic of Mdm2 mediates histone ubiquitylation of mutant p53: molecular mechanisms inhibitors. Cancer Res 2005;

65:1918–24.

and transcriptional repression. Mol Cell and therapeutic potential. Oncogene 73. Kranz D., Dobbelstein M. Nongenotoxic 2004;

16:631–9. 2007;

26:2243–54. p53 activation protects cells against S-phase 51. Tzardi M., Kouvidou Ch., Panayiotides I. 62. Drakos E., Atsaves V., Li J. et al. specific chemotherapy. Cancer Res et al. p53 protein expression in non- Stabilization and activation of p53 2006;

66:10274–80.

Hodgkin's lymphoma. Comparative study downregulates mTOR signaling through 74. Gudkov A.V., Komarova E.A.

with the wild type p53 induced proteins AMPK in mantle cell lymphoma. Leukemia Prospective therapeutic applications of p MDM2 and p21/waf1. Clin Mol Pathol 1996 2009 Apr;

23(4):784–90. inhibitors. Biochem Biophys Res Commun Oct;

49(5):278–82. 63. Jin L., Tabe Y., Kojima K. et al. MDM2 2005;

331:726–36.

52. Stefanaki K., Tzardi M., Kouvidou C. antagonist Nutlin-3 enhances bortezomib- 75. Strom E., Sathe S., Komarov P.G. et al.

et al. Expression of p53, p21, MDM2, Rb, mediated mitochondrial apoptosis in TP53- Small-molecule inhibitor of p53 binding Bax and Ki67 proteins in lymphomas of the mutated mantle cell lymphoma. Cancer Lett to mitochondria protects mice from gamma mucosa-associated lymphoid (MALT) tissue. 2010 Dec 28;

299(2):161–70. radiation. Nat Chem Biol 2006;

2:474–9.

76 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ Оценка возможности использования центрифугирования ’ для ускоренного проведения анализа с использованием иммунологических биочипов для исследования клеток крови А.В. Шишкин1, Н.Г. Овчинина1, С.С. Бессмельцев ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия;

ФГУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург Контакты: Александр Валентинович Шишкин Shishkin_lab@mail.ru При исследовании клеток с помощью иммунологических биочипов (микроматриц) достаточно длительным является этап инку бации с клеточной суспензией. Он занимает от 20 до 60 мин, если осаждение клеток на поверхность биочипа происходит за счет силы тяжести. Возможно уменьшение длительности этого этапа с помощью центрифугирования. В данной работе рассматри вается влияние центрифугирования на результаты анализа. Оцениваются изменения морфологических характеристик клеток при их осаждении с различным ускорением. Также показана перспективность использования центрифугирования в тех случаях, когда необходимо добиться высокой плотности связывания в тестовых участках биочипа клеток, присутствующих в исследуе мом образце в малых концентрациях.

Ключевые слова: иммунологический биочип, определение поверхностных антигенов клеток, осаждение клеток Assessment of centrifugation using for accelerated immunological microarray analysis for blood cells investigation A.V. Shishkin1, N.G. Ovchinina1, S.S. Bessmeltsev Izhevsk State Medical Academy;

Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, St.-Petersburg Phase of incubation microarray with cell suspension is prolonged when cells are investigated. It takes from 20 to 60 min if cell sedimentation on the surface of microarray is the result of gravity. Decrease of this stage duration is possible due to centrifugation. In th is article influence of centrifugation on results of analysis is considered. Changes of morphological description of cells are estimated when they a re precipitated with different acceleration. Also availability of centrifugation using when it is necessary to obtain the high density of cell binding in test regions of microarray if cells concentration in sample is small is demonstrated.

Key words: immunological microarray, surface cell antigens detection, cell sedimentation Перспективным направлением иммунодиагности- ственную оценку. Кроме того, ранее была показана ки является исследование клеток с использованием возможность выполнения окрашивания и морфоло иммунологических биочипов, содержащих иммобили- гического исследования связанных клеток при ис зованные антитела, специфичные к поверхностным пользовании биочипов, изготовленных на прозрачных антигенам клеток [1–9]. Такой анализ позволяет одно- химически стойких подложках [7–9].

временно определить множество антигенов на разных В процессе проведения анализа осаждение клеток клетках при очень низком расходе антител. Иммуно- на поверхность биочипа происходит под действием логический биочип данного класса, как правило, силы тяжести. Данный этап обычно занимает от представляет собой твердую подложку, в строго опре- до 60 мин. Поэтому представляется актуальным сокра деленных участках («пятнах») которой иммобилизо- щение времени проведения анализа за счет ускоренного ваны молекулы антител [1–9]. Проведение анализа осаждения клеток. Некоторые иммунологические суб включает в себя инкубацию биочипа с суспензией ис- популяции клеток присутствуют в исследуемом образце следуемых клеток. Клетки оседают на поверхность в небольших концентрациях и заполняют соответствую биочипа и прочно связываются в области тестовых щие тестовые участки биочипа с низкой плотностью.

участков при наличии у них соответствующих анти- Вместе с тем данные клетки могут представлять для ис генов, а несвязавшиеся клетки устраняют при его по- следователя значительный интерес. Поэтому в ряде слу следующей отмывке. Если осаждение клеток осущест- чаев может потребоваться достижение более высокой влялось без перемешивания, плотность заполнения плотности их связывания. В одной из предыдущих работ тестовых участков биочипа оказывается прямо про- [7] была показана возможность подобного концентри порциональна содержанию клеток, имеющих соответ- рования. Его принцип заключался в том, что после ствующие антигены [7, 8]. Это позволяет осуществлять осаждения клеток осуществляли смывание несвязав его качественную, полуколичественную или количе- шихся клеток, а затем вновь осаждали клетки на поверх ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ ность биочипа. При этом анализ выполняли с исполь- чипы не теряли своих свойств по меньшей мере в те ’ зованием инкубационно-отмывочной кюветы или чение 12 мес.

в проточной камере. Недостатком данного подхода яв- Приспособление для ускоренного осаждения клеток лялось значительное увеличение продолжительности на поверхность биочипа. Приспособление (рис. 1а, б) анализа. Особенно длительными были этапы, связанные имеет корпус, состоящий из разъемных секций, и дно с осаждением клеток. В связи с этим представляется (изготовленное из прозрачного материала), к кото перспективной идея использования центрифугирования рому герметично крепится биочип. Приспособление, для их более быстрого выполнения. которое в собранном виде представляет собой ем Цель работы — оценка влияния на результаты ана- кость, крепится на роторе центрифуги ОПН-3 вместо лиза ускоренного осаждения клеток с использованием стакана, предназначенного для размещения пробирки центрифугирования, а также оценка возможности его (рис. 1в). При этом ротор центрифуги должен быть применения в процессе концентрирования клеток тщательно уравновешен. Расстояние от центра ро в области тестовых участков биочипа. тора центрифуги до поверхности биочипа составляет 121 мм. Таким образом, относительное центробежное ускорение при частоте вращения ротора 1000 об/мин Материалы и методы Устройство биочипов и их изготовление. Иммуноло- составляло 135,28 g, при 1500 об/мин — 304,38 g, при гический биочип представлял собой прозрачную пла- 1000 об/мин — 1217,5 g.

стиковую подложку, на которой в строго определенных Приготовление суспензии исследуемых клеток. Лей тестовых участках (пятнах) были иммобилизованы мы- коциты выделялись из периферической крови путем шиные моноклональные антитела (IgG), специфичные центрифугирования в градиенте плотности. Затем вы к следующим поверхностным антигенам лейкоцитов деленные клетки от 1 до 4 раз отмывали 0,9% раствором человека: CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD41, CD44, NaCl для уменьшения содержания в исследу емом об CD45, CD56. Такая панель антител позволяла опреде- разце тромбоцитов и остатков разрушенных лейкоцитов.

лять в исследу емом образце содержание T-, B-, NK- Для этого суспензию клеток переносили в пробирки, лимфоцитов, общее содержание лейкоцитов, относя- разводили изотоническим раствором до объема 10 мл щихся к различным субпопуляциям, а также наличие и центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин.

тромбоцитов. Тестовые участки были отделены друг от Надосадочную жидкость сливали, а осажденные клетки друга фоновыми участками подложки, не содержащими ресуспензировали в 10 мл изотонического раствора, по иммобилизованных антител. сле чего вновь выполняли центрифугирование. Осадок При изготовлении биочипов капли растворов клеток, полученный после последнего центрифугиро антител объемом 0,25 мкл наносили на подложки в за- вания, ресуспензировали в растворе, содержащем 0,1 % ранее отмеченные участки. Далее подложки помещали сухого молока, 20 % (по объему) инактивированной на в камеру со 100 % влажностью и инкубировали при греванием человеческой сыворотки и 1,5 мМ ЭДТА комнатной температуре в течение 1 ч, после чего вы- в PBS. Концентрацию лейкоцитов и объем су спензии сушивали на воздухе и замораживали при – 26 С подбирали таким образом, чтобы осажденные клетки в герметичных контейнерах. При таком хранении био- заполняли всю поверхность дна емкости одним слоем.

а б в Рис. 1. Приспособление для осаждения клеток на поверхность биочипа путем центрифугирования: а — вид сбоку в разрезе;

б — вид сверху в раз резе;

в — приспособление, закрепленное на роторе центрифуги ОПН-3;

1 — центральная секция корпуса;

2 — верхняя секция корпуса;

3 — нижняя (прижимающая) съемная секция корпуса;

4 — съемная вставка;

5 — дно;

6 — биочип;

7, 8, 9 — герметизирующие эластичные прокладки;

10 — крепление;

11 — съемное кольцо;

12 — ротор центрифуги 78 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ В тех случаях, когда выполнялось концентрирование тельно обезжиренными предметным и покровным ’ клеток в области пятен биочипа, использовалась суспен- стеклами в композицию для приготовления долговре зия клеток с концентрацией в 2 раза выше. менных микропрепаратов «Shandon-Mount» («Thermo Подготовка биочипа к проведению анализа. После electron corporation», США). Микропрепарат помеща разморозки биочип закрепляли в инкубационо-отмы- ли под пресс до затвердевания композиции.

вочной кювете или приспособлении для ускоренного Считывание и обработка резу льтата. В каждом осаждения клеток, ополаскивали 1 % раствором BSA пятне биочипа определяли плотность связывания в буфере PBS, затем проводили 3-кратную отмывку клеток — отношение количества клеток, связанных 0,05 % раствором детергента T ween-20 на шейкере. в определенном участке, к площади поверхности дан После этого биочип инкубировали с 1 % раствором ного участка. Для этого на микрофотографии каждого BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 ч пятна выбирали 3–4 участка, соответствующих обла при перемешивании на шейкере. Затем вновь выпол- стям размерами 100 100 мкм, и определяли в каждом няли 3-кратную отмывку 0,05% раствором детергента из них количество связанных клеток. Полученные зна Tween-20 и ополаскивали биочип буфером для удале- чения усредняли. Далее полученные резуль таты вы ния следов детергента. ражали в процентах. За 100 % принимали среднюю плотность связывания клеток в области пятен с анти Инкубация биочипа с клеточной суспензией и его от телами, специфичными к антигену CD45 (присутст мывка при проведении анализа без испо льзования цент рифугирования. В незакрепленное в центрифуге при- вующему на лейкоцитах практически всех типов).

способление с находящимся в нем биочипом вносили Исходя из этого выполняли пересчет в проценты зна клеточную суспензию и инкубировали в течение 60 мин чений плотности связывания клеток в области других без какого-либо перемешивания. После завершения пятен. Ранее было показано [7, 8], что при проведении инкубации биочип несколько раз ополаскивали PBS для инкубации биочипа с клеточной суспензией без пере устранения клеток, не связавшихся в участках с иммо- мешивания, выраженные в процентах значения плот билизованными антителами. Качество отмывки оце- ности связывания клеток в тестовых участках биочипа нивали при помощи инвертированного микроскопа. оказываются весьма близки значениям фактического Отмывка считалась выполненной качественно, если процентного содержания в образце клеток, имеющих клетки отсутствовали в участках подложки, не содержа- соответствующие антигены.

щих иммобилизованных антител. Для апробации предлагаемого метода использова лась кровь здорового человека.

Инкубация биочипа с клеточной суспензией и его от мывка при проведении анализа с использованием центри фугирования. Приспособление для ускоренного осаж- Результаты дения клеток с биочипом закрепляли на роторе При проведении анализа без центрифугирования центрифуги ОПН-3 (рис. 1). В емкость приспособле- лейкоциты не разрушались и хорошо сохраняли свои ния вносили исследуемую клеточную суспензию. Осу- морфологические признаки, что наглядно показано ществляли центрифугирование в течение 2 мин. Затем на рис. 2.

из приспособления сливали жидкость и выполняли Для контроля использовался метод проточной отмывку биочипа от несвязавшихся клеток так же, как цитофлуориметрии. Как видно из рис. 3, результаты было описано выше. оценки содержания клеток, имеющих определяемые антигены, хорошо соответствовали данным проточной Концентрирование клеток в области тестовых цитофлуориметрии.

участков биочипа с использованием центрифугирования.

В течение 1 мин осаждали клетки на поверхность био- Для оценки загрязненности поверхности биочипа чипа, точно так же, как было описано выше. После осевшими тромбоцитами использовалось пятно с анти этого центрифугу останавливали, встряхивали при- телами, специфичными к антигену CD41. В тех экс способление и вновь проводили осаждение клеток. периментах, где центрифугирование не применялось, Данные манипуляции выполняли несколько раз (см. количество тромбоцитов, осевших на поверхность био далее). Затем осуществляли отмывку биочипа от не- чипа, было весьма невелико (рис. 2б) и не могло ока связавшихся клеток. зывать заметного влияния на результат анализа.

Окрашивание связавшихся с биочипом клеток. Сра- Если центрифугирование выполнялось при зу же после завершения отмывки биочипа выполняли 3000 об/мин, происходило значительное повреждение фиксацию клеток метанолом в течение 12 мин. Затем или даже полное разрушение большинства лейкоцитов биочип высушивали на воздухе и окрашивали раство- (рис. 4). Наиболее сильно повреждались CD16+-клетки ром азура и эозина. Далее биочип промывали проточ- (рис. 4б).

ной водой, ополаскивали дистиллированной водой Между тем, если центрифугирование выполнялось и высушивали. при 1500 об/мин, то повреждалось меньшее число кле ток, но полностью данная проблема не решалась. В тех Приготовление из биочипа долговременного препара та для микроскопического исследования. Биочип извле- случаях, когда выполнялось центрифугирование при кали из приспособления и заключали его между тща- 1000 об/мин, лимфоциты сколько-нибудь существен ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ а б ’ Содержание клеток, % CD3 CD4 CD16 CD19 CD20 CD41 CD44 CD45 CD Антиген Рис. 2. Микрофотографии клеток, связавшихся в области тестовых Анализ с помощью биочипа участков биочипа: а — лейкоциты различных типов, связавшиеся Проточная цитофлуориметрия в области пятна с антителами анти-CD45;

б — небольшое количе ство тромбоцитов (экранирующих менее 1 % площади поверхности), Рис. 3. Результат оценки содержания клеток, имеющих определяемые связавшихся в области пятна с антителами анти-CD41. Осаждение клеток выполнялось без использования центрифугирования. Окраска антигены, с использованием биочипа и методом проточной цитофлуо по Романовскому–Гимзе. Увеличение в 1000 раз риметрии ных морфологических изменений не имели (рис. 5). фугирования на поверхность биочипа в значительном Миелоидные клетки (присутствующие в пятнах с анти- количестве осаждались тромбоциты и фрагменты кле телами, специфичными к антигенам CD44 и CD45) ток, разрушившихся на предшествующих этапах ана также не разрушались. По морфологическим призна- лиза. Они были лишены цитоплазмы и ядра, но сохра кам их можно было четко отличить от лимфоцитов. няли антигены, позволяющие им связываться в области В большинстве экспериментов на этапе пробопод- тех или иных участков биочипа с иммобилизован готовки выделение лейкоцитов из крови осуществлялось ными антителами. На рис. 5 видно, что лейкоциты в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-уро- не разрушились в процессе центрифугирования при графина (1077 г/л). В этих случаях на этапе осаждения 1000 об/мин.

клеток на поверхность биочипа пришлось столкнуться Количество осажденных тромбоцитов и фрагментов со следующей проблемой. При использовании центри- разрушенных клеток было особенно велико при цент а б в г Рис. 4. Клетки, связавшиеся в тестовых участках биочипа с различными антителами: а — анти-CD3;

б — анти-CD16;

в — анти-CD19;

г — анти CD45. Осаждение клеток на биочип осуществлялось на центрифуге ОПН-3 при 3000 об/мин 2 мин. Окраска по Романовскому–Г имзе. Увеличение в 600 раз. Клетки деформированы либо полностью разрушены а б в г Рис. 5. Клетки, связавшиеся в тестовых участках биочипа с различными антителами: а — анти-CD3;

б — анти-CD16;

в — анти-CD19;

г — анти-CD45. Осаждение клеток на биочип осуществлялось на центрифуге ОПН-3 при 1000 об/мин. Окраска по Романовскому–Г имзе. Увеличение в 600 раз. Клетки не разрушаются и сохраняют свои морфологические признаки. В области пятен связывается небольшое количество фрагментов клеток, которые подверглись разрушению, вероятно, еще на предшествующих этапах анализа (отмечены стрелками). С целью уменьшенияданной примеси на этапе пробоподготовки выполнялась 4-кратная отмывка выделенных лейкоцитов 80 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ отличались от резуль татов эксперимента, в котором а б ’ центрифугирование не использовалось. Отмечалось «завышение» плотности связывания клеток в области тех участков биочипа, где она должна была являться невысокой. Воспроизводимость результатов, особенно при центрифугировании при 3000 об/мин, была не удовлетворительной.

Ранее была показана возможность повышения плотности связывания в области тестовых участков биочипа клеток, присутствующих в исследу емом об разце в малых количествах, путем многократного че Рис. 6. Микрофотографии, демонстрирующие осаждение на поверх редования осаждения клеток на поверхность биочипа ность биочипа большого количества тромбоцитов и клеток, разру и смывания несвязавшихся клеток [7]. Однако такой шенных на этапе пробоподготовки, при недостаточной очистке ис подход требовал больших затрат времени. Поэтому следуемой клеточной суспензии и центрифугировании при 3000 об/ мин: а — тромбоциты, связавшиеся в области тестового участка была предпринята попытка использования центрифу (пятна) биочипа с антителами, специфичными к антигену CD41;

б — гирования для у скорения данного процесса. В ходе клетки, связавшиеся в области тестового участка (пятна) биочипа проведения анализа этапы осаждения клеток центри с антителами, специфичными к антигену CD45. Фрагменты клеток, фугированием при 1000 об/мин в течение 1 мин чере лишенные ядра, отмечены стрелками. Увеличение в 1000 раз. Окраска по Романовскому–Гимзе. довались со встряхиванием емкости (которое выпол нялось после полной остановки ротора центрифуги).

После выполнения 12 циклов осаждения и смывания (% от максимально возможной) Плотность связывания клеток удавалось добиться практически предельного заполне 80 ния клетками всех тестовых участков биочипа (рис. 7).

Обсуждение Таким образом, использование ускоренного осаж 30 дения клеток крови позволило практически на 1 ч уменьшить время проведения анализа. В то же время точность результатов снизилась. Вероятно, одной из CD3 CD4 CD16 CD19 CD20 CD41 CD44 CD45 CD56 основных причин этого была вибрация центрифуги.

Антиген Поэтому данный подход может быть использован только в тех случаях, когда необходимо быстро полу Рис. 7. Заполнение связанными клетками тестовых участков биочипа количественно или качественно определить наличие после выполнения концентрирования с использованием центрифугиро вания или отсутствие в образце той или иной субпопуляции клеток.

рифугировании при 3000 об/мин и в тех случаях, когда При центрифугировании происходит удар движу после выделения тромбоцитов отмывка выполнялась щихся с у скорением клеток о твердую и недеформи всего 1–2 раза (рис. 6). Тромбоциты и фрагменты раз- руемую поверхность биочипа. При большом ускорении рушенных клеток частично экранируют поверхность может происходить разрушение клеток. Вопрос о раз биочипа и не дают связаться с иммобилизованными личной устойчивости к такому воздействию у разных антителами части исследуемых клеток. Поэтому плот- типов лимфоцитов требует дальнейшего изучения. Лим ность связывания лейкоцитов (рис. 6б) оказывалась фоциты здорового человека не разрушались, если их меньше максимально возможной. Для того чтобы осаждение на поверхность биочипа осуществлялось цен уменьшить содержание этих примесей в исследу емом трифугированием при 1000 об/мин (135,28 g). Однако образце, была использована 4-кратная отмывка выде- нельзя исключать, что в случае исследования других ти ленных клеток и уменьшение ускорения при центрифу- пов клеток при данных условиях не будет происходить гировании. Количество осаждаемых на поверхность их разрушения. Поэтому может оказаться целесообраз биочипа тромбоцитов и разрушенных лейкоцитов при ным проведение осаждения с меньшим относительным этом существенно снижалось. Проведение многократ- центробежным ускорением. Это потребует внесения су ной отмывки требует дополнительных затрат времени, щественных изменений в конструкцию центрифуги или а также уменьшает выход выделяемых лейкоцитов, что использования центрифуги другой модели.

требует повышенного расхода клинического материала. При выполнении концентрирования клеток в об Полностью решить указанные проблемы удалось только ласти тестовых участков биочипа за счет использова при использовании 2-ступенчатого градиента на этапе ния центрифугирования продолжительность исследо фракционирования клеток. вания сократилась на несколько часов по сравнению При проведении анализа с использованием цен- с исходной методикой, описанной в работе [7]. Тем не трифугирования получаемые результаты значительно менее при этом требовалась многократная остановка ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ центрифуги для встряхивания емкости с биочипом, генов. От нормальных клеток они отличаются комби ’ что приводило к дополнительным затратам времени. нациями антигенов. Для того чтобы отличить опухо Для того чтобы устранить данный недостаток, не- левую клетку от нормальных клеток, имеющих один обходимо или встряхивать ротор в процессе вращения и тот же определяемый антиген, потребуется опреде (вызывать вибрацию) или кратковременно снижать ление коэкспрессии нескольких антигенов. Для этого частоту его вращения (выполнять торможение). Дан- после завершения концентрирования клеток и про ные процессы должны контролироваться, чтобы не ведения отмывки может быть выполнена обработка происходило отрыва специфически связанных клеток. поверхности тест-системы мечеными антителами.

Это также требует внесения существенных изменений в конструкцию центрифуги. Выводы Представляется перспективным использование опи- 1. Использование центрифугирования для осаж санного подхода для диагностики минимальной оста- дения клеток на поверхность биочипа значительно точной болезни при многих онкогематологических за- ускоряет проведение анализа, но снижает воспроиз болеваниях. Однако в связи с малым содержанием таких водимость результатов и точность оценки содержания клеток (порядка 1 на 10 6 клеток и менее) потребу ется клеток, имеющих определяемые антигены. Такой под выполнение множества циклов осажде ния-смывания ход не может быть использован в тех случаях, когда и использование суспензии со значительно большей об- необходима точная количественная оценка данных щей концентрацией клеток. Кроме того, существенным показателей.

изменениям придется подвергнуть конструкцию тест- 2. Разрушение лейкоцитов не отмечается при их системы. Вместо биочипа с множеством тестовых участ- осаждении на поверхность биочипа с относительным ков, имеющих малые размеры, в этом случае необходи- ускорением центрифугирования 135,28 g. При исполь ма тест-система, вся поверхность которой покрыта зовании центрифугирования для осаждения клеток на антителами, специфичными к одному антигену, или же поверхность биочипа исследуемая суспензия должна тест-система, имеющая несколько тестовых участков быть тщательно очищена от примеси тромбоцитов очень больших размеров и практически полностью ли- и клеток, разрушенных на этапе пробоподготовки.

шенная фоновых участков. Это необходимо для того, 3. Ускоренное осаждение клеток центрифугирова чтобы с антителами связалось как можно большее нием может применяться при выполнении концентри количество клеток, среди которых будет проводиться рования клеток в области тестовых участков биочипа, поиск минорных субпопуляций. требующего выполнения нескольких этапов осажде Клетки опухолевых заболеваний системы крови не ния/отмывки.

содержат каких-то уникальных поверхностных анти ЛИТЕРАТУРА 1. Belov L., de la Vega O., dos Remedios C.G. 4. Ellmark P., Belov L., Huang P. et al. Некоторые новые подходы к проведению et al. Immunophenotyping of leukemias Multiplex detection of surface molecules анализа. LAP Lambert Academic Publishing using a cluster of differentiation antibody on colorectal cancers. Proteomics 2006;

& Co. KG, 2010. 158 с.

microarray. Cancer research 2001;

6:1791–802. 8. Шишкин А.В., Шмырев И.И., 61:4483–9. 5. Woolfson A., Stebbing J., Tom B. et al. Кузнецова С.А. и др. Иммунологические 2. Belov L., Huang P., Barber N. et al. Conservation of unique cell-surface CD биочипы для параллельного определения Identification of repertoires of surface antigen mosaics in HIV-1-infected поверхностных антигенов и морфологи antigens on leukemias using an antibody individuals. Blood 2005;

106(3):1003–7. ческого исследования клеток.

microarray. Proteomics 2003;

3:2147–54. 6. Liu A.Y. Differential Expression of Cell Биол мембр 2008;

4:277–84.

3. Belov L., Huang P., Chrisp J.S. et al. Surface Molecules in Prostate Cancer Cells. 9. Шишкин А.В., Шмырев И.И., Screening microarrays of novel monoclonal Cancer Research 2000;

60:3429–34. Кузнецова С.А. и др. Иммунологиче antibodies for binding to T-, B- and myeloid 7. Шишкин А.В. Иммунологические ские биочипы для исследования leukaemia cells. J Immunol Methods биочипы для исследования клеток. эритроцитов человека. Биол мембр 2008;

2005;

305:10–9. Собственный опыт разработки. 4:267–76.

82 ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ Молекулярные механизмы лейкозогенеза ’ Лекция № Гемобластозы миелоидного происхождения Д.А. Домнинский ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздравсоцразвития России, Москва Контакты: Дмитрий Анатольевич Домнинский D7777777@yandex.ru Molecular mechanisms of leukaemogenesis 3. Myeloid hematological malignancies D.A. Domninsky Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow и лимфоидного происхож дения. Понятно, что такие Предисловие В 2 предыдущих лекциях были рассмотрены мутации являются прогностическим фактором, а не основные клеточные механизмы, нарушение которых диагностическим. Можно предположить, что к диагно способно вызвать индукцию онкогенных процессов стическим аберрациям относятся нарушения, которые в кроветворных клетках. Геномные аберрации, веду- инициируют онкогенез в клетках, имеющих миелоид щие к развитию гемобластозов, у словно подразделя- ную или лимфоидную природу и находящихся на раз ются на 2 группы (мутации класса I и класса II), кото- ных уровнях диффе ренцировки, что и обу славливает рые взаимно дополняют онкогенный потенциал друг фенотип опухоли. К аберрациям, имеющим прогности друга (см. лекции № 1 и № 2 в журнале «Онкогемато- ческое значение, следует отнести дополнительные он логия» № 4 за 2010 г. и № 1 за 2011 г. соответственно). когенные мутации, которые могут быть комплементар В этой лекции будут обсуждаться основные типы ре- ны инициирующим (диагностическим) мутациям куррентных геномных аберраций, встречающихся при (мутация класса I + мутация класса II) и оказывать вли лейкозах миелоидного происхождения, а также ме- яние на характер протекания болезни.

ханизмы реализации онкогенного потенциала этих В таблице приведен список рекуррентных генных генетических нарушений. аберраций при гемобластозах миелоидного происхож дения, которые согласно рекомендациям ВОЗ имеют диагностический характер [1, 2]. Краткое описание Глава I. Современные принципы классификации понятий и терминов, применяемых для описания ге гемобластозов В последние годы молекулярно-генетическая харак- нетических аномалий, приведено в Приложении. Под теристика опухолевых клеток становится ключевым разделение острого миелолейкоза (О МЛ) на различ диагностическим и прогностическим фактором. Про- ные варианты, приведенное в таблице, основано на гностическая составляющая этой характеристики за- рекуррентных геномных изменениях в лейкозных ключается в высокой степени корреляции между нали- клетках. В одних случаях классификация ВОЗ почти чием определенного набора геномных аберраций полностью совпадает с FAB-классификацией, состав и особенностями заболевания. Диагностическая состав- ленной на основе цитоморфологической характери ляющая позволяет вносить уточнения в существующую стики опухоли. Например, при M3-типе ОМЛ по FAB классификацию гемобластозов, выделяя специфичные классификации (ОПЛ, острый промиелоцитарный варианты заболеваний, которым присуще наличие опре- лейкоз) хромосомная транслокация t(15;

17)(q22;

q12), деленных генетических аномалий [1]. Отдельным вопро- связанная с образованием химерного гена PML-RARA, сом является соотношение между этими двумя состав- встречается у 98 % больных. У 2 % пациентов также вы ляющими и то, какие мутации можно считать являются транслокации, которые затрагивают локу с диагностическими (т. е. определяющими вариант забо- 17q12 и приводят к рекомбинации гена RARA с иными левания), а какие — прогностическими. Очень часто генами-партнерами. В других случаях FAB-классифи рекуррентные аберрации имеют как диагностическое, кация является очень «широкой» — некоторые типы так и прогностическое значение, но есть и исключения. ОМЛ не всегда сочетаются с какой-либо одной спе Например, мутации гена FLT3 часто встречаются при цифичной геномной аберрацией. Например, только разных вариантах острого лейкоза как миелоидного, так в 40 % случаев M2-типа О МЛ по F AB-классифика ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ Подтипы ОМЛ, выделенные в отдельные группы по классификации ВОЗ [1] (*), и подтипы миелопролиферативных заболеваний [2], ’ характеризующиеся специфичными рекуррентными генными аберрациями Химерные гены % (**) Заболевание, хромосомная транслокация RUNX1-RUNX1T ОМЛ, t(8;

21)(q22;

q22) [M2] CBFB-MYH ОМЛ, inv(16)(p13.1q22) или t(16;

16)(p13.1;

q22) [M4Eo] MLL-MLLT ОМЛ, t(9;

11)(p22;

q23) [M4, M5] DEK-NUP ОМЛ, t(6;

9)(p23;

q34) [M2] RPN1-EVI ОМЛ, inv(3)(q21q26.2) или t(3;

3)(q21;

q26.2) [M0, M4] RBM15-MKL ОМЛ, t(1;

22)(p13;

q13) [M7] PML-RARA ОПЛ, t(15;

17)(q22;

q12) [M3] ОМЛ с мутациями в гене NPM ОМЛ с мутациями в гене CEBPA Миелопролиферативные заболевания BCR-ABL Ph+ ХМЛ, t(9;

22)(q34;

q11) Истинная полицитемия, мутация JAK2 V617F мутации в 12-м экзоне гена JAK Эссенциальная тромбоцитемия, мутация JAK2 V617F Хронический идиопатический миелофиброз, мутация JAK2 V617F мутация MPL W515L/K Хронический нейтрофильный лейкоз, мутация JAK2 V617F FIP1L1-PDGFRA Хронический эозинофильный лейкоз с del14q варианты химерного гена PDGFRB Хронический эозинофильный лейкоз с перестройками в локусе 5q варианты химерного гена FGFR1 Лейкоз/лимфома стволовых клеток с перестройками в локусе 8p Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, мутации в гене PTPN мутации в гене NF мутации в гене RAS Системный мастоцитоз, мутации гена KIT (*) В квадратных скобках указан тип ОМЛ по FAB-классификации, из которого выделен указанный подтип ОМЛ. (**) Частота встречаемости геномных аберраций при данном типе заболевания.

Аббревиатуры: BCR – breakpoint cluster region;

CBFB – core binding factor ;

CEBPA (C/EBP) – CCAAT enhancer binding factor ;

EVI1 – ecotropic viral integration site 1;

FGFR1 – fibroblast growth factor receptor 1;

FIP1L1 – FIP1 like 1 (где FIP1 – factor interacting with PAP);

MKL-1 – megakaryoblastic leukemia (также известен как MAL, megakaryocytic acute leukemia);

MLL – mixed lineage (myeloid/lymphoid) leukemia;

MLLT3 – mixed-lineage leukemia translocated to chromosome 3 (также известен как AF9 – ALL1-fused gene from chromosome 9, где ALL1 – старое название гена MLL);

MPL – myeloproliferative leukemia virus, human homolog (также известен как TPOR, рецептор тромбопоэтина);

MYH11 – smooth muscle myosin heavy chain 11;

NF1 – neurofibromin 1;

NPM1 – nucleophosmin 1;

NUP214 – nucleoporin 214kDa;

PDGFRB – platelet-derived growth factor receptor ;

PDGFRA – platelet-derived growth factor receptor ;

Ph – филадельфийская хромосома (22q–);

PML – promyelocytic leukemia;

PTPN11 – protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11;

RARA – retinoic acid receptor ;

RAS – rat sarcoma virus;

RBM15 – RNA binding motif protein 15 (также известен как OTT, one twenty-two);

RPN1 – ribophorin 1;

RUNX1 – runt-related transcription factor 1 (также известен как AML1 – acute myeloid leukemia 1);

RUNX1T1 – runt-related transcription factor 1;

translocated to 1 (также известен как ETO – eight twenty one).

84 ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ ’ П р и л о ж е н и е. Основные типы геномных аберраций Геномные аберрации можно условно подразделить на крупные (хромосомные) аберрации, ко торые выявляются цитогенетическими методами, и более мелкие (скрытые, криптические) аберрации, которые можно выявить только молекулярными методами, типа ПЦР и с еквенирования ДНК. На рис. I показаны 2 основных типа хромосомных аберраций: (1) Сбалансированные (реципрокные) хромосомные транслокации не приводят к изменению коли чества генетического материала. В области хромосомной рекомбинации могут образовываться химерные гены, одна часть которых («голова», N-концевая часть гибридного белка) принадлежит гену из одной хромосомы, а другая («хвост», C-концевая часть гибридного белка) – гену из другой хромосомы. С химерных генов экспрессируются гибридные (или «слитные», fusion) белки. Химерные гены образуются на обеих рекомбинантных хромосомах, но только один из них, как правило, обладает онкогенным потенциалом. Ген на другой хромосоме, так называемый реципрокный г ен, может кодировать гибридный реципрокный белок, с труктура которого является зеркальным отражением онкобелка (см. рис. I, слева внизу). Если хромосомы обмениваются фрагментами разной величины, то хромосома, получившая больший фрагмент, обозначается как «Nq+» (или «Np+», если транслокация затронула короткое плечо хромосомы N), а другая, уменьшившаяся в размере хромос ома, обозначается как «Nq–» или «Np–». (2) Несба лансированные аберрации могут приводить к увеличению (gain) или потере (loss) генетического материала. Увеличение генетического материала (помимо полной или частичной трисомии) может представлять собой внутри- или внехромосомную амплификацию, приводящую к возникновению однородно окрашенных локусов (HSR, homogeneously staining regions) или двойных минихромосом (dmin, double-minute chromosomes) соответственно. Потеря генетического материала может быть разного размера – от потери целых хромосом (моносомия) до потери всего лишь нескольких нуклеотидов ДНК (микроделеции).

36. 36. 36. 34. 34. 34. q+ p q– центромера q Рис. I. Основные типы хромосомных аберраций. Рисунок адаптирован из обзора S. Frohling & H. Dohner [37] В хромосомах выделяют короткое (p, в акроцентрических хромосомах оно почти отсутствует) и длинное (q) «плечи», разделенные центромерой. Хромосомы содер жат участки с более (г етерохроматин, «молчащая» ДНК) и менее (эухроматин, содержит активные гены) плотной упаковкой, которые отличаются по интенсивности окрашивания (полосы, бэнды, рис. I, слева). Нумерация этих полос (от центромеры к полюсам каждого плеча) позволяет указывать положение локусов хромосомных аберраций или месторасположение генов. Например, t(9;


22)(q34.1;

q11.23) означает транслокацию между хромосомами 9 и 22 с разрывами в локусах 9q34.1 и 22q11.23;

inv(16)(p13.11q22.1) – инверсия хромосомы 16 с разрывом в локусах 16p13.11 и 16q22.1;

del(5)(q13q35) – делеция в длинном плече хромосомы 5 с потерей материала между 5q13 и 5q35 локусами.

Однонуклеотидные (точковые) мутации подразделяют на: нейтральные (не изменяют кодируемую аминокислоту), миссенс (missense, изменение смысла кодона, коди рование другой аминокислоты), нонсенс (nonsense, бессмысленные, возникновение стоп-кодона, обрыв белкового синтеза).

Небольшие вставки (или дупликации) и делеции (если их размер не кратен 3) могут приводить к «сдвигу рамки считывания» (frameshift) и синтезу, после сайта мута ции, другой белковой последовательности.Клетки опухоли генерируют большое число мутаций, но только небольшая их час ть индуцирует или поддерживает онкоге нез — «движущие» (driver) мутации — остальные мутации относятся к нейтральным, «пассажирским» (passenger) мутациям. Онкогенные мутации подразделяются на активирующие мутации (gain of function) и мутации инактивирующие (loss of function), частично или полностью, функции гена. Активирующие мутации, свойственные онкогенам, являются доминантно-негативными и обладают гаплонедостаточностью (haploinsufficient), когда одного нормального аллеля недостаточно для выполнения обычной клеточной функции (онкобелок всегда побеждает). Для нейтрализации активности генов-супрессоров опухолей требуется инактивация (мутации или делеции) обеих аллелей.

ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ ции выявляется хромосомная транслокация t(8;

21) фосфат, т. е. «добавление» еще одной фосфатной груп ’ (q22;

q22), сопровождаемая возникновением химерно- пы в белковый комплекс) в G-белках также приводит го гена RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO). Еще 1 % боль- к их активации (см. лекцию № 2). В этой главе будут ных ОМЛ M2 имеет t(6;

9)(p23;

q34) транслокацию рассмотрены основные механизмы онкогенной акти и химерный ген DEK-NUP214 (DEK-CAN), а в остав- вации генов, кодирующих сигнальные белки, которые шихся 59 % случаев ОМЛ M2 специфичных генетиче- наиболее часто встречаются в гематологических опу ских аберраций не обнаруживается. Это может быть холях. Из данных, приведенных в таблице, к мутациям связано или со слишком «грубыми» цитоморфологи- класса I относятся все рекуррентные геномные абер ческими критериями FAB-классификации, приведши- рации, которые характерны для миелопролифератив ми к объединению в одну группу целого ряда различ- ных заболеваний. При О МЛ часто встречающиеся ных по своей этиологии заболеваний, или с наличием мутации I класса в генах FLT3, KIT и RAS не являются при ОМЛ M2 каких-то трудно выявляемых (крип- специфичными только для этого вида лейкоза, на тических) мутаций. В классификации ВОЗ лейкозы основании этого они относятся к прогностическим с t(8;

21)(q22;

q22) и t(6;

9)(p23;

q34) хромосомными признакам и не включены в классификацию ВОЗ.

транслокациями выделены в отдельные диагностиче Протеинкиназы — фосфатазы ские варианты (100 % в таблице). В некоторых случаях обнаружение в схожих по цитоморфологическим «Все активные киназы похожи друг и иммунофенотипическим показателям заболеваниях на друга, каждая неактивная киназа нескольких вариантов геномных аберраций еще не неактивна по-своему»

является причиной подразделять их на разные подти- (своеобразный «научный» парафраз первых пы, так как результатом всех этих мутаций могут быть, строк романа «Анна Каренина», приведен например, нарушения в одном и том же пути сигналь- ный в обзоре Луизы Джонсон и др. [3]).

ной трансдукции. В главе II будет приведен пример такого заболевания, при котором идентичная консти- Активные протеинкиназы обладают высоким онко тутивная активация одного из триггеров сигнальной генным потенциалом. Поэтому в клетке существу ет трансдукции (белка RAS) вызывается несколькими много механизмов контроля их активности: от удаления генетическими нарушениями в разных генах. активирующих фосфатных групп фосфатазами до пол Использование данных молекулярно-генетического ной деградации активированных белков убикви тин тестирования делает классификацию гематологических протеасомной системой. Однако основным механизмом опухолей сложнее, но такой подход имеет большие пер- защиты является «самоконтроль» протеинкиназ — в от спективы, так как уже сегодня позволяет точнее диф- сутствии внешних воздействий они находятся в состоя ференцировать гемобластозы, выделяя группы с раз- нии автоингибирования [4]. Все известные онкогенные личным прогнозом. А в недалеком будущем такая аберрации, затрагивающие гены протеинкиназ, приво классификация поможет при планировании индивиду- дят к разрушению конформации автоингибирования. А альной терапевтической тактики с применением таргет- так как в стабилизации такого автоингибирующего со ных препаратов, мишенями которых являются онкоген- стояния в разных ферментах участвуют различные ные продукты конкретных геномных аберраций. белковые домены (см. эпиграф к этой главе и лекцию № 2, рис. 3), то и механизмы разрушения этой кон формации (онкогенная активация) в разных протеин Глава II. Мутации I класса К мутациям I класса относятся генетические на- киназах могут существенно отличаться [4, 5].

рушения, которые увеличивают пролиферативный На рис. 1А показана схема организации активной потенциал и жизнеспособность клеток, повышая их конформации киназного домена протеинкиназ. У всех способность не отвечать на проапоптотические сигна- исследованных протеинкиназ структурные особенно лы. В гематологических опухолях рекуррентные абер- сти этой конформации подобны независимо от их рации I класса активируют гены, которые кодируют специфичности (тирозиновые или серин-треониновые околомембранные компоненты путей сигнальной киназы) или особенностей клеточной локализации (цитозольные или рецепторные — RTKs, receptor трансдукции — рецепторы и медиаторы (см. лекцию tyrosine kinases) [6, 7]. К основным структурным эле № 1, рис. 1). Основные механизмы передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру связаны, так или иначе, ментам киназного домена, определяющим его актив ность, относятся: ( 1) петля активации (А-петля) с переносом фосфатных групп с одного белка на дру гой. Это может быть прямое фосфорилирование бел- в C-половине киназного домена, представляющая со ков протеинкиназами, т. е. перенос фосфатных групп бой подвижную пептидную цепь, несущую аминокис с АТФ на аминокислотные остатки белков-акцеп- лотные остатки, способные к фосфорилированию торов, что приводит к активации последних. Кроме (тирозин или треонин в зависимости от типа протеин того, активацию некоторых сигнальных белков можно киназ);

(2) в основании А-петли содержатся 2 консер формально приравнять к фосфорилированию — за- вативных мотива из 3 аминокислот — HRD (Г ис-Арг мена ГДФ (гуанозиндифосфата) на ГТФ (гуанозинтри- Асп) и DFG (Асп-Фен-Глу), которые принимают участие 86 ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ А Б В ’ TEL K72 С спираль PDGFRB P-петля E D TK АТФ (DFG) ITD / JM–PM Mg2+ N A-петля TDK C KIT FLT Рис. 1. Схематическое изображение протеинкиназы в активной конформации (А) и различных вариантов онкогенной активации рецепторных протеинкиназ (Б и В): (А) Основные структурные особенности активной конформации протеинкиназ на примере протеинкиназы А. Указан о положение консервативных аминокислотных остатков (международная система обозначения аминокислот): D – аспарагиновая кислота, E – глутаминовая кислота, K – лизин, T – треонин. Подробности см. в тексте лекции;

(Б) Схема активации тирозинкиназного рецептора P DGFRB в результате хромосомной транслокации t(5;

12)(q33;

p13), которая приводит к образованию химерного гена TEL-PDGFRB, с которого эк спрес сируется гибридный белок TEL-PDGFRB, содержащий N- и C-концевые области TEL- и PDGFRB-белков, соответственно. В гибридном белке внеклеточный домен PDGFRB заменен на последовательность TEL-белка (голубой цвет), которая содержит домен димеризации, опосредующий димеризацию и онкогенную активацию белка TEL-PDGFRB, при которой сближенные киназные домены (ТК) гибридных рецепторов перекрест но активируют (Р, фосфорилируют) друг друга. TEL – translocation ets leukemia (также известен как ETV6, ETS variant gene 6);

(В) С хема строения рецепторов KIT и FLT3. Голубым цветом окрашен внеклеточный домен, зеленым – подмембранный (JM) домен, красным – C- и N-половины ки назного домена, соединенные между собой подвижным белковым «шарниром» (черная вертикальная полоса между «N» и «C»). Стрелками у азанок местоположение онкогенных мутаций, обнаруженных в генах KIT (зеленые стрелки) и FL (красные стрелки). Подробности см. в тексте лекции.

T Рисунок адаптирован из работ N. Jura et al. [6] и R. Schwartz [17] в формировании каталитического (активного) центра раскрыл широко рот (верхнее и нижнее «небо», E белка (на рис. 1А активный центр фермента очерчен ро- и HRD/DFG, соответственно, формируют «активный зовым кругом);

(3) подвижная C спираль в N-половине центр»). В общем, как на знаменитой фотографии киназного домена осуществляет перемещения консер- «Эйнштейн показывает язык» (рис. 1).

вативного остатка глутаминовой кислоты (E91 на Как же в рамках программы строгого самоконтроля рис. 1А), который также формиру ет каталитический формируется огромное разнообразие неактивных кон центр. Активная конформация киназного домена вы- формаций протеинкиназ? Если продолжить аналогию глядит следующим образом: А-петля подвергнута фос- с человеческой головой, то эти процессы можно описать форилированию (по тирозину или треонину, в зави- примерно так: широко открытый рот (увеличение «ще симости от типа протеинкиназы) и находится за ли» между C- и N-половинами киназного домена, ко пределами каталитического центра;


HRD и DFG участки торое обеспечивается подвижным белковым «шарни C-половины и глутамат C спирали N-половины киназ- ром» между ними, при этом пептидные мотивы, ного домена «сдвинуты» друг к другу, формируя актив- формирующие активный центр, расходятся в разные ный центр, способный связывать белок-субстрат и АТФ стороны), но этого мало — образовавшаяся щель запол (в связывании АТФ также участвует «фосфатная петля», няется близлежащими белковыми фрагментами. Как P-петля). Такое взаиморасположение белковых участков было показано ранее (см. лекцию № 2, рис. 3), разру внешне напоминает человека (голова — киназный до- шенный каталитический центр может стабилизировать мен), который высунул язык (А-петля) и при этом не ся путем проникновения в эту область различных под ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ вижных пептидных участков белка: А-петли (как, сказать местоположение возможных онкогенных ’ например, в случае FGFR и рецептора инсулина), мутаций в этих белках. Если, например, неактивная кон C-концевого «хвоста» (TIE2 рецептор ангиопоэтинов, формация киназы стабилизируется JM-доменом (тиро MET/HGFR и RON/MST1R рецепторы) и подмембран- зинкиназные рецепторы KIT FLT3 и PDGFR), то мож, ного домена (JM, juxtamembrane domain;

KIT, PDGFR но ожидать, что мутации будут затрагивать именно этот и FLT3 рецепторы) в случае RTKs [4], или фрагментов участок рецептора. Действительно, онкогенные мутации других (регуляторных) субъединиц ферментов [6]. Про- в генах, кодирующих KIT и FLT3 рецепторы, затрагива теинкиназы семейства JAK для стабилизации автоин- ют всего 2 участка белковой молекулы — JM-домен гибирующей конформации используют свой 2-й (не и А-петлю (рис. 1В) [8]. Причем если в области А-петли рабочий) киназный домен, который в процессе эволю- выявляются в основном точечные онкогенные мутации (TKD, tyrosine kinase domain), локализованные около ции приобрел регуляторные функции. А в случае ц-АМФ-зависимой протеинкиназы A (PKA) киназный остатка аспартата (D835), то в JM-домене могут проис ходить как точечные мутации ( JM-PM, JM single point домен ингибируется взаимодействием с регуляторной mutations), так и более крупные изменения (делеции субъединицей этого фермента.

Конформация автоингибирования протеинкиназ и вставки). Наиболее часто в гене FLT3 обнаруживаются внутренние тандемные дупликации ( ITDs, internal является энергетически более выгодной, т. е. равновесие tandem duplications — дублирование небольшого, коди между активной и неактивной формой фермента сдви нуто в сторону неактивной конформации. Для измене- рующего 3–10 аминокислот, участка ДНК) в JM-домене, ния этого равновесия и разрушения стабильных инги- которые имеют различное положение и размер. Наличие бирующих конформаций протеинкиназ требу ется ITDs-мутации в гене FLT3 существенно ухудшает про внешнее воздействие [6]. Такое воздействие могут осу- гноз. Все мутации в генах этих рецепторов (TDK и ITD/ ществлять другие активированные киназы, например, JM-PM) затрагивают область контакта А-петли и JM RTKs при их связывании с лигандом, которые фосфо- домена, который играет ключевую роль в формировании рилируют в белках-мишенях А-петлю (или другие за- неактивной конформации белка. Нарушение такого полняющие «щель» пептидные фрагменты, например контакта вследствие изменения аминокислотных по JM-домен), что приводит к вытеснению А-петли и фор- следовательностей в этой области приводит к дестаби мированию активного каталитического центра. Цито- лизации неактивной конформации, конститутивной зольные киназы, например SRC или ABL, могут акти- активации рецепторов и онкогенезу [9–11]. Похожий вироваться субстратами этих ферментов или тип нарушения ингибирующих белок-белковых взаимо адапторными белками, которые рекрутируют к своим действий наблюдается при мутациях в гене JAK2, ко стыковочным сайтам регуляторные SH2- и/или SH3- торые являются рекуррентными аберрациями при не домены фермента, что приводит к разрушению ингиби- которых миелопролиферативных заболеваниях (см.

рующей конформации «широко открытый рот» (см. лек- таблицу). Так как в формировании конформации авто цию № 2, рис. 3А). Циклин-зависимые киназы (CDKs, ингибирования активное участие принимает 2-й (не ра cyclin-dependent kinases), играющие ключевую роль бочий) киназный домен белка, то все выявленные в гене в регуляции клеточного цикла, активируются белками JAK2 онкогенные мутации (включая V617F) локализу циклинами. Циклины имеют участки связывания в рай- ются в области, которая кодирует N-концевую (регуля оне C спирали CDKs. Их связывание с киназой приво- торную) часть псевдокиназного домена [12].

дит к транслокации C спирали в область активного Наиболее частым механизмом активации генов (от центра, вытеснению из нее А-петли, формированию носящихся к мутациям как класса I, так и класса II) при каталитического центра и активации CDK. Высокая гемобластозах являются сбалансированные (реципрок внутриклеточная концентрация ц-АМФ вызывает ак- ные) хромосомные транслокации, приводящие к воз тивацию PKA — ц-АМФ связывается с регуляторной никновению химерных генов (см. Приложение и табли субъединицей киназы, это приводит к изменению кон- цу) [5, 13, 14]. При этом обычно ген-партнер по формации белка и освобождению активной PKA [6]. транслокации привносит в гибридный белок домены Онкогенными мутациями в генах, кодирующих про- димеризации, что приводит к образованию димеров теинкиназы, являются только те, которые приводят между мутантными протеинкиназами (аналогично ди к дестабилизации неактивной конформации фермента меризации RTKs при связывании с лигандом) и консти и, следовательно, к его неконтролируемой, конститутив- тутивной активации ферментов. Именно таким образом ной (постоянной) активации. То есть при таких мута- активируется цитозольная киназа ABL при хромосом циях изменениям подвергаются участки белка, которые ной транслокации t(9;

22) и тирозинкиназные рецепторы отвечают за стабильность конформации автоингибиро- FGFR1 (около 10 типов транслокаций локуса 8p11 с раз вания, что делает эту конформацию энергетически не- ными геномными локусами, приводящими к рекомби выгодной, и равновесие между активной и неактивной нации гена FGFR1 с различными генами-партнерами) формой фермента сдвигается в сторону активной кон- и PDGFRB (более 20 разных хромосомных транс формации. Зная особенности формирования неактив- локаций с участием локу са 5q33). Все эти гибридные ных структур протеинкиназ, можно в принципе пред- белки имеют сходное строение: N-концевая часть белка 88 ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ («голова») принадлежит белку-партнеру и несет домены рым относится, например, иматиниб) в той или иной ’ димеризации, C-концевая часть белка («хвост») пред- степени инактивирует целый ряд нормальных клеточ ставляет собой часть протеинкиназы с киназным доме- ных киназ, что приводит к побочным цитотоксическим ном. При этом в рекомбинантных RTKs, как правило, эффектам препарата. Учитывая разнообразие неактив отсутствует большая часть внеклеточного домена (ко- ных конформаций протеинкиназ, следует ожидать, что торая заменяется фрагментом белка-партнера), все препараты, мишенью которых будут конкретные струк остальные домены RTK сохраняются, что позволяет ги- туры неактивных белков, и которые будут способны бридному белку функционировать в качестве лиганд- переводить онкогенные киназы в неактивное состояние независимого, конститутивно активированного рецеп- и фиксировать их в этой конформации, будут более тора (рис. 1Б) [5, 13–15]. специфичны и могут совершить прорыв в онкологии Достаточно необычен механизм онкогенной акти- [6, 19]. Но об этом речь пойдет в заключительной лек вации рецептора PDGFRA при хроническом эозино- ции нашего цикла.

фильном лейкозе. Ген PDGFRA и его ген-партнер FIP1L Комплексные мутации, затрагивающие расположены недалеко друг от друга на 14-й хромосоме.

RAS-сигнализацию Образование химерного гена FIP1L1-PDGFRA проис ходит в результате несбалансированной внутрихромо- Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз сомной перестройки (делеции del14q12 размером (ЮММЛ) является примером гемобластоза, развитие 800 тыс. пар нуклеотидов), которая приводит к стыков- которого связано с онкогенными мутациями в различ ке участков ДНК, кодирующих N-конце вую область ных генах, но все эти мутации приводят к активации белка FIP1L1 и C-концевую область белка PDGFRA. одного сигнального белка (RAS) и одного сигнального Однако белок FIP1L1 не имеет доменов димеризации, пути (RAS-RAF-MAPK) (см. лекцию № 2, глава III).

поэтому онкогенный потенциал гиб ридного белка Чаще всего при ЮММЛ выявляются активирующие FIP1L1-PDGFRA реализуется с помощью другого ме- мутации в генах RAS (N-RAS и K-RAS) и PTPN ханизма. В белке FIP1L1-PDGFRA отсутствует (частич- (кодирует фосфатазу SHP2, SH2 do main-containing но или полностью) JM-домен от PDGFRA, который phosphatase 2), а также инактивирующие мутации в гене у рецептора PDGFRA отвечает за автоингибирование, NF1 [20]. Активность малых G-белков, к которым отно поэтому киназный домен FIP1L1-PDGFRA находится сятся белки RAS-семейства, контролируется на несколь в активном состоянии. Но так как в белке FIP1L1- ких уровнях: собственной ГТ Фазной активностью PDGFRA также отсутствует и трансмембранный домен G-белков, факторами, увеличивающими ГТ Фазную (который расположен «выше» JM-домена и в гибрид- активность G-белков (G AP, супрессоры G-белков) ный белок не включается), то он не может связываться и факторами обмена Г ДФ на ГТФ (GEF, активаторы с мембраной подобно рецептору и функциониру ет в G-белков) (лекция № 2, глава III). NF1 относится клетке как конститутивно активированная цитозольная к белкам GAP-семейства и является ингибитором протеинкиназа [16].

Интересно, что при других хромо- RAS-белков, поэтому его инактивация приводит к уве сомных транслокациях, в которых участвует ген личению активности RAS. Фосфатаза SHP2 «по опреде PDGFRA, в образующихся химерных генах также отсут- лению» должна относиться к супрессорам опухолей, как ствует трансмембранный домен PDGFRA, а JM-домен и все остальные фосфатазы, но в случае ЮММЛ она может сохраняться полностью, но в этих случаях белок- выступает в роле онкогена, что является первым опи партнер (STRN, TEL или BCR) содержит домен диме- санным примером такой неожиданной метаморфозы ризации, что позволяет гибридному цитозольному бел- фосфатаз [21]. Действительно, фосфатазы, осуществляя ку находиться в активированном состоянии [18]. дефосфорилирование сигнальных и адапторных белков, Знание структурных особенностей разнообразных прерывают цепь сигнальной трансдукции, так как уни неактивных конформаций протеинкиназ позволяет не чтожают активирующие сайты (фосфорилированные только предсказывать расположение возможных онко- аминокислотные остатки в А-петле протеинкиназ) генных мутаций в этих белках (и наоборот, знание рас- у первых, и стыковочные сайты (фосфотирозины) — положения онкогенных мутаций позволяет судить об у вторых.

автоингибирующей структуре фермента), но может по- На рис. 2 показан процесс активации RAS-RAF мочь при проектировании нового поколения высоко- MAPK пути сигнальной трансдукции, в котором в ка специфичных ингибиторов для различных вариантов честве активатора участвует SHP2-фосфатаза.

мутантных белков. Первые ингибиторы протеинкиназ Было предложено несколько гипотез для объясне были спроектированы таким образом, что их мишенью ния активации SHP2-фосфатазой RAS-сигнального являлись АТФ-связывающие «карманы» в активном пути, но ни одна из них не нашла пока эксперименталь центре ферментов. Такие ингибиторы моделировать до- ного подтверждения [22, 23]. Во всяком случае, установ статочно просто, так как у исследователей есть струк- лено, что конститутивно активированная SHP2 турный прототип лекарственного препарата — А ТФ. фосфатаза формирует «шунт» (своеобразное «короткое Однако все протеинкиназы имеют участки связывания замыкание», исключающее из сигнальной цепи активи АТФ, поэтому первое поколение ингибиторов (к кото- рованный рецептор), который индуциру ет последова ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ А ’ Б Рис. 2. Схема 3 вариантов конститутивной активации RAS-RAF-MAPK сигнального пути (А) и активации SHP2 фосфатазы при мутагенезе (Б):

(А) Активация тирозинкиназного рецептора (RTK) приводит к фосфорилированию сигнальных и адапторных белков. Активная фосфатаза S HP в этом процессе функционирует как индуктор сборки комплекса из адапторного белка GRB2 (growth factor receptor-bound protein 2) и GEF-белка SOS (son of sevenless), что приводит к активации SOS-белком G-белка RAS и «запуску» RAS-RAF-MAPK-пути сигнальной трансдукции (см. также лекцию № 2, рис. 4). Ингибитором этого процесса является GAP-белок NF1. Мутации, активирующие SHP2- или RAS-белки и инактивирующие белок NF1, приводят к одному и тому же результату – конститутивной активации RAS-RAF-MAPK-сигнального пути и индукции онкогенеза;

(Б) Схема формирования неактивной структуры SHP2. Взаимодействие N-концевого SH2-домена (N-SH2) белка SHP2 с C-концевыми стыков оч ными сайтами (P, фосфотирозин) приводит к экранированию каталитического домена (PTP) и к автоингибированию фосфатазы (схема внизу, справа). Онкогенные мутации (обозначены звездочкой на схеме вверху, справа) изменяют ключевые аминокислотные остатки в N-SH2-до мене (D61-E76), которые отвечают за связь с фосфотирозином (схема слева). Это приводит к дестабилизации инактивирующей конформации S HP и конститутивной активации фосфатазы. Рисунок адаптирован из работы T. Matozaki et al. [22] тельную лиганд-независимую реакцию: формирование большому числу очень тонких белок-ДНК и белок стабильного комплекса из GRB2 адапторного белка белковых взаимодействий, нарушение которых (напри и GEF белка SOS активация RAS-белка MAPK кас- мер, в результате мутаций в генах, кодирующих белки кад сигнализации. этих комплексов) может привести к фатальным для клетки последствиям, а в некоторых случаях — к раз витию опухолеродных процессов. Так как все эти белки Глава III. Мутации II класса Из данных, приведенных в таблице, к мутациям формируют своеобразный эпигенетический «ланд класса II относятся все диагностические рекуррентные шафт», определяющий постоянно меняющуюся на раз геномные аберрации при О МЛ. Мутации класса II, ных этапах развития клетки картину (паттерн) генной влияющие на процессы дифференцировки и самопод- экспрессии, то кодирующие их гены можно условно от держания клеток крови, чаще всего происходят в генах, нести к «эпигенетическим» онкогенам и генам-супрес кодирующих белки-регуляторы генной экспрессии. Бел- сорам опухолей [24].

ки, регулирующие синтез мРНК, образуют в районе В рамках данного курса лекций подробно рассмо генных промоторов сложные комплексы, состоящие из треть все лейкозогенные мутации класса II, приведен активаторов и коактиваторов (репрессоров и корепрес- ные в таблице, не представляется возможным. Поэто соров) транскрипции, белков-модификаторов хромати- му основные механизмы реализации онкогенного на, белков комплекса инициации транскрипции (PIC) потенциала мутаций этого класса будут рассмотрены и других белков (см. лекцию № 1, Приложения 3 и 4). на примере гена MLL, геномные аберрации с участием Такие активирующие (или репрессирующие) транс- которого инициируют развитие опухолей как миело крипцию белковые комплексы собираются благодаря идного, так и лимфоидного происхождения.

90 ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ ОЛЛ А B ’ SET ОMЛ Б EPS SEPT MLLT FNBP Рис. 3. Структурная организация нормального ML L-белка (А) и 2 типов мутантных ML L-белков (Б);

частота встречаемости различных ре комбинантных MLL-генов при острых лейкозах (В):

(А) Доменная организация MLL-белка и схема его созревания. Сверху показана структура ML L-белка с указанием некоторых его функциональных доменов. Стрелками отмечена область, которая соответствует точкам разрыва ДНК при хромосомных аберрациях, а также участок рас щепления MLL-белка протеазой при его созревании. Внизу показан зрелый белок, состоящий из 2 половин (MLLN и MLLC фрагменты), которые соединены мотивами димеризации (FYRN и FYRC), образуя стабильный комплекс. Разноцветные кружки обозначают различные белки, кото рые взаимодействуют с MLL при формировании транскрипционных комплексов. Аббревиатуры: AT – AT-hooks (мотивы связывания с AT-богатыми участками ДНК);

BD – bromodomain (узнавание ацетильных групп);

CxxC – цинк-пальцевый мотив (связывание с неметилированными CpG участками промоторов);

FYRN/C – FY rich N/C terminus (где F – фенилаланин, Y – тирозин);

PHD – plant homeodomain (домен связыва ия с раз н личными регуляторными «метками» на гистонах, например, с H3K4me3);

SET – Su (var) 3-9, enchancer of zeste, trithorax (названиедомен получил по 3 белкам, у которых впервые был обнаружен;

обладает HMT-активностью);

TAD – trans-activation domain (белок-белковые взаимодействия, например, с гистон-ацетилтрансферазой CBP/P300);

(Б) Вверху – типичная структура гибридного белка, состоящего из N-концевой час ти MLL-белка и C-концевой части белка-партнера. Видно, что большая часть белок-взаимодействующих доменов в рекомбинантном ML L-белке заменяется последовательностями белка-партнера. Внизу – мутантный MLL-белок с частичной тандемной дупликацией (MLL-PTD), которая сопровождается дублированием участка с 3-го по 9-й экзон;

(В) Диаграмма, показывающая результаты исследования частоты встречаемости различных хромосомных транслокаций, затрагивающих локус 11q23 [29]. Определенные типы транслокаций (в порядке уменьшения частот ы встречаемости) у смешанных групп (дети и взрослые) больных ОЛЛ и ОМЛ распределились следующим образом (в скобках приведены другие рас пространенные названия генов-партнеров, жирным шрифтом выделена транслокация t(9;

11), вошедшая в классификацию ВОЗ):

– ОЛЛ (6 транслокаций составили ~94 % всех случаев): t(4;

11) – ген-партнер A FF1 (AF4);

t(11;

19) – MLLT1 (ENL1);

t(9;

11) – ML LT3 (AF9);

t(10;

11) – MLLT10 (AF10);

t(6;

11) – MLLT4 (AF6);

t(1;

11) – EPS15. Было выявлено еще 17 других уникальных транслокаций (17u), изних 4 транс локации являлись общими для ОЛЛ и ОМЛ (4s);

– ОМЛ (9 транслокаций составили ~80 % всех случаев): t(9,11) – ML LT3;

t(10;

11) – MLLT10;

t(11;

19) – ELL;

t(6;

11) – MLLT4;

t(11;

19) – MLLT1;

t(11;

17) – MLLT6 (AF17);

t(1;

11) – MLLT11 (AF1Q);

t(X;

11) – SEPT6;

t(1;

11) – EPS15. Еще 20 уникальных транслокаций (20u) и 4 общих (4s).

Рисунок адаптирован из работ M. Cosgrove & A. Patel [28] и R. Marschalek [29] Онкогенные аберрации в локусе 11q23 го числа генов, связанных с дифференцировкой кле Ген MLL (myeloid/lymphoid или mixed lineage ток и контролем клеточного цикла. Важнейшими leukemia), расположенный в 11-й хромосоме (локу с генами-мишенями MLL-регуляторных комплексов 11q23), участвует в огромном числе (более 60) реци- (которые относятся к Триторакс группе, см. лекцию прокных хромосомных транслокаций, в резуль тате № 1, Приложение 4) являются гены, содержащие которых MLL образует химерные гены с разными ДНК-последовательности так называемых «гомеобок сов» (HOX, homeobox). Гомеобоксы кодируют очень генами-партнерами. Белок MLL является одним из ключевых факторов регулировки экспрессии большо- консервативные белковые ДНК-связывающиеся до ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ мены (гомеодомены), присутствующие в группе фак- части белка и привнесения на ее место чужеродных ’ торов активации транскрипции (HOX-белках), кото- последовательностей (хромосомные транслокации).



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.