авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Гематологический научный центр»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Пименова Мария Анатольевна

Цитогенетическая характеристика гемопоэтических и

стромальных клеток-предшественниц у больных

миелодиспластическими синдромами

14.01.21 – гематология и переливание крови

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

академик РАМН доктор медицинских наук, профессор В. Г. Савченко Москва 2014 Оглавление Список используемых сокращений............................................................................. Введение......................................................................................................................... Актуальность проблемы............................................................................................ Цель исследования..................................................................................................... Задачи исследования.................................................................................................. Научная новизна и практическая ценность работы................................................ Основные положения, выносимые на защиту....................................................... Структура диссертации.......................................................................................... 1. Обзор литературы................................................................................................... 1.1. История знаний о МДС.................................................................................... 1.2. Классификация МДС........................................................................................ 1.3. Цитогенетические исследования при МДС................................................... 1.4. Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС......................... 1.4.1. Аномалии хромосомы 5................................................................................... 1.4.2. Аномалии хромосомы 7................................................................................... 1.4.3. Аномалии хромосомы 8.................................................................................. 1.4.4. Комплексный кариотип и клональная эволюция........................................... 1.5. МДС – клональное заболевание стволовой кроветворной клетки............. 1.5.1. Цитогенетические исследования кроветворных клеток-предшественниц. 1.6. Роль стромального микроокружения............................................................. 1.6.1. Строма костного мозга. Мезенхимальные стромальные клетки................ 1.6.2. Функциональные особенности стромы при МДС......................................... 1.6.3. Цитогенетические исследования клеток стромы.......................................... 2. Материалы и методы.............................................................................................. 2.1. Дизайн исследования....................................................................................... 2.2. Характеристика больных................................................................................. 2.3. Лабораторные исследования........................................................................... 2.3.1. Получение фракции мононуклеаров.............................................................. 2.3.2. Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови............................................................................................. 2.3.3. Получение культуры МСК.............................................................................. 2.3.4. Стандартное цитогенетическое исследование.............................................. 2.3.5. Флюоресцентная in situ гибридизация........................................................... 2.4. Статистический анализ.................................................................................... 3. Результаты и обсуждение...................................................................................... 3.1. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга............................. 3.2. Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R.............................................................................................. 3.3. Результаты динамического наблюдения за больными МДС........................ 3.4. Характеристика CD34+ клеток-предшественниц, полученных из костного мозга и периферической крови.............................................................................. 3.4.1. Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови...... 3.4.2. Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках...................... 3.4.3. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического варианта заболевания................................................................................................. 3.4.4. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от их прогностической значимости..................................................................................... 3.4.5. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клеточности костного мозга............................................................................................................ 3.4.6. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге............................................................................................................. 3.5. Характеристика МСК костного мозга............................................................ 3.5.1. Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц............................ 3.5.2. Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза........................................................................................................................ 3.5.3. Стандартное цитогенетическое исследование МСК.................................... 3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH................................. 3.5.5. Клиническое наблюдение пациента с клональными нарушениями кариотипа МСК.......................................................................................................... Заключение................................................................................................................. Выводы........................................................................................................................ Библиографический список....................................................................................... Приложение 1............................................................................................................ Список используемых сокращений МДС – миелодиспластический синдром СКК – стволовая кроветворная клетка МСК – мезенхимальные стромальные клетки РА – рефрактерная анемия РН – рефрактерная нейтропения РТ – рефрактерная тромбоцитопения РЦ – рефрактерная цитопения РЦУД – рефрактерная цитопения с унилинейной дисплазией РАКС – рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов РАИБ-Т – РАИБ в трансформации ОМЛ – острый миелоидный лейкоз ХММЛ – хронический миеломоноцитарный лейкоз КС – кольцевые сидеробласты Алло-ТСГК – трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток – человеческий лейкоцитарный антиген (главный комплекс HLA гистосовместимости) FAB – франко-американо-британская группа ПЦР – полимеразная цепная реакция IPSS – международная прогностическая шкала риска ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения WPSS – прогностическая шкала риска ВОЗ IPSS-R – пересмотренная международная прогностическая шкала риска FISH – флюоресцентная in situ гибридизация ХМПЗ – хронические миелопролиферативные заболевания ЦСА – циклоспорин А МНС – главный комплекс гистосовместимости ЭПО – эритропоэтин Ara-C – цитозин-арабинозид Г-6-ДГ – глюкозо-6-дегидрогеназа CD – кластер дифференцировки Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный КСФ ХМЛ – хронический миелолейкоз ПЦР – полимеразная цепная реакция NK – натуральные киллеры MMP – матриксные металлопротеиназы ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ФГА – фитогемагглютинин ЭПО – эритропоэтин Ara-C – цитозин-арабинозид АЧН – абсолютное число нейтрофилов Введение Актуальность проблемы Миелодиспластические синдромы (МДС) – группа клональных заболеваний системы крови, характеризующихся дисплазией одного или нескольких ростков миелопоэза, неэффективным кроветворением, которое проявляется цитопеническим синдромом, а также повышенным риском развития острого миелоидного лейкоза. Эффективное лечение МДС в настоящее время не разработано. Единственным методом биологического излечения является трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, однако ее эффективность ограничена как возможностью выполнения (отсутствие HLA совместимого донора, пожилой возраст и тяжелый соматический статус больного), так и частотой рецидивов заболевания. Результаты химиотерапевтического лечения остаются крайне неутешительными, что делает необходимым проведение дальнейших исследований в этой области гематологии с целью более глубокого понимания патогенетических путей развития заболевания и разработки принципиально новых подходов к терапии.

Известно, что развитие клональных нарушений, приводящих к диспластическим изменениям в костном мозге, изначально происходит в стволовой кроветворной клетке (СКК) и ранних гемопоэтических (кроветворных) клетках-предшественницах. В то же время функционирование, деление и дифференцировка незрелых кроветворных клеток обеспечивается их взаимодействием со стромальным микроокружением, которое строит «дом» для гемопоэтических клеток и во многом определяет их дальнейшую судьбу.

Согласно данным многочисленных исследований функционирование стромы костного мозга при МДС нарушено, что может быть объяснено участием микроокружения в ходе развития заболевания.

Цитогенетическое исследование клеток костного мозга входит в перечень обязательного обследования на этапе установления диагноза МДС.

Хромосомные аномалии выявляют примерно у половины больных, они являются критерием подтверждения диагноза, фактором прогноза ответа на лечение и продолжительности жизни. Вместе с тем изучение цитогенетических особенностей как кроветворных, так и стромальных клеточных компонентов костного мозга имеет важное теоретическое значение для более глубокого понимания биологических процессов, лежащих в основе заболевания.

Имеющиеся в литературе данные цитогенетических исследований клеток стромы костного мозга противоречивы. В связи с этим для получения более глубокого представления о биологических процессах, лежащих в основе заболевания, представляется важным изучение хромосомных аномалий не только в зрелых кроветворных клетках костного мозга, но и прицельно в популяциях ранних клеток-предшественниц, принимающих непосредственное участие в патогенезе МДС, – CD34+ гемопоэтических клетках и мезенхимальных стромальных клетках (МСК).

Цель исследования Охарактеризовать цитогенетические особенности CD34+ гемопоэтических клеток-предшественниц костного мозга и периферической крови и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных миелодиспластическими синдромами.

Задачи исследования 1. Оценить частоту и спектр хромосомных аномалий у больных МДС в момент диагностики.

2. Сопоставить эффективность выявления хромосомных аномалий в клетках костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и флюоресцентной in situ гибридизации (FISH).

CD34+ Охарактеризовать и сравнить изменения кариотипа в 3.

гемопоэтических клетках-предшественницах костного мозга и периферической крови с помощью метода FISH. Охарактеризовать изменения кариотипа в CD34+ клетках в зависимости от клиникo-лабораторных данных.

4. Оценить свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга по их росту в культуре и исследовать наличие связи с клиническим вариантом заболевания, группой риска IPSS-R и морфологическими особенностями МДС.

5. Изучить и сравнить цитогенетические изменения в МСК костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и FISH у больных МДС и здоровых лиц.

Научная новизна и практическая ценность работы Полученные в исследовании результаты показали, что CD34+ клетки предшественницы содержат хромосомные аберрации (аномалии), определяемые в общей популяции клеток костного мозга. Размер патологического клона в общей популяции клеток костного мозга и CD34+ клетках одинаков.

клональных изменений в циркулирующих клетках Выраженность предшественницах коррелирует с их выраженностью в клетках предшественницах костного мозга. Это имеет практическое значение, так как использование клеток периферической крови для проведения цитогенетических исследований у больных может уменьшить кратность пункций костного мозга.

Установлено, что мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга больных МДС, обнаруживают сниженную пролиферативную способность по сравнению с их аналогами у здоровых доноров костного мозга и проявляют генетическую нестабильность. Определяемые в МСК аномалии кариотипа отличны от аберраций в кроветворных клетках. Аномалии кариотипа МСК наряду с хромосомными нарушениями в клетках костного мозга могут являться факторами, ухудшающими прогноз у больных МДС. Полученные данные позволяют сделать вывод, что МСК костного мозга не являются частью патологического клона при МДС, вместе с тем проявляют функциональные нарушения, которые, несомненно, имеют значение в патогенезе заболевания.

Данные результаты имеют большое теоретическое значение и могут служить заделом для последующих исследований.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Клональные нарушения кариотипа CD34+ клеток-предшественниц, полученных как из костного мозга, так и из периферической крови, соответствуют аномалиям кариотипа общей популяции клеток костного мозга при МДС.

2. Хромосомные аберрации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга выявлены у 9,5% больных МДС;

они отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и одного приложения.

1. Обзор литературы Группа клональных заболеваний кроветворной ткани, объединенных общим названием МДС, характеризуется диспластическими изменениями в миелокариоцитах и неэффективным кроветворением, которое проявляется нарушением процессов образования, дифференцировки и запрограммированной гибели клеточных элементов костного мозга и картиной цитопении в периферической крови, а также повышенным риском трансформации в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Как показано на рисунке 1, начальным звеном патогенеза заболевания является мутация в СКК, которая запускает механизм клонального кроветворения и повышает степень программированной клеточной гибели (апоптоза), приводящей к неэффективному кроветворению в костном мозге. Вместе с этим происходит нарушение функционирования стромального микроокружения, а также процессы гиперметилирования генов. В результате накопление продуктов клонального кроветворения приводит к эволюции опухолевого клона и трансформации заболевания в острый лейкоз.

Рисунок 1. Патогенез развития миелодиспластического синдрома Несмотря на попытки детального изучения патогенетических особенностей заболевания и поиски новых подходов к терапии, результаты лечения больных МДС и продолжительность их жизни остаются неутешительными [6, 12, 79, 144, 146, 162]. В связи с чем очевидна необходимость дальнейших исследований, которые могут внести вклад в понимание биологии заболевания и способствовать улучшению прогноза у больных МДС.

1.1. История знаний о МДС Описания случаев стойкой анемии, не поддающейся доступным методам лечения (сырая печень, соли железа и фолаты), встречаются уже в начале XX века. Именно из-за неэффективности доступной в те времена терапии заболевание приобрело название «рефрактерной» анемии. В 1920 е годы врач Военно-медицинской академии в г. Санкт-Петербурге М.И.Аринкин [21] впервые предложил метод прижизненной стернальной пункции костного мозга.

Стали накапливаться знания об изменениях в кроветворной ткани при рефрактерных анемиях. В 1938 году C.Rhoads [132] опубликовал исследование около 100 случаев рефрактерной анемии, в котором отмечено наличие у этих больных макроцитоза, тромбоцитопении, лейкопении и склонности к лихорадке и кровотечениям, заканчивающихся летальным исходом. Автором также подчеркивался приобретенный, не наследственный характер изучаемого синдрома. Вероятно, часть описанных больных страдала другими заболеваниями (туберкулез, последствия воздействия токсических веществ, острый лейкоз или апластическая анемия), однако состояние остальных было обусловлено рефрактерной анемией, которая в современном понимании является вариантом МДС. Постепенно формулировались критерии дифференциальной диагностики макроцитарной пернициозной (В12-дефицитной) анемии и макроцитарной рефрактерной анемии на основании не только клинической картины, но и лабораторного обследования, включая диаметр эритроцитов, клеточность костного мозга и пр. [61].

В 1942 году были охарактеризованы нормальные сидероциты и «сидеробласты», нагруженные гранулами свободного железа, в костном мозге мышей [70]. Ученые обратили внимание на этот феномен и у людей, страдающих анемией: нарушение созревания нормобластов (эритроидных предшественников), увеличение их количества и накопление в цитоплазме гранул свободного железа, и дали описание рефрактерной анемии с кольцевыми сидеробластами – варианту МДС в современной классификации. Анемия у таких больных зачастую имела доброкачественный характер на протяжении нескольких лет [32].

Дальнейшее наблюдение за больными выявило, что у части из них до появления развернутой картины острого лейкоза имел место разный по длительности период анемии. Возникли термины «предлейкоз», «малопроцентный» и «тлеющий» лейкоз. [35, 76, 91]. Описывали клиническое течение сидеробластной анемии как проявления раннего этапа развития эритробластного лейкоза [44]. Тем не менее, не во всех случаях хронической анемии развивался острый лейкоз;

исследователи предположили, что с прогрессированием заболевания связано увеличение клеточности в костном мозге, выраженность нарушений созревания и количественного содержания аномальных форм миелокариоцитов Таким образом, различия в [64].

клиническом течении рефрактерных анемий диктовали необходимость формулирования классификации этих синдромов с целью как уточнения диагностических критериев вариантов заболевания, так и определения тактики ведения больных.

1.2. Классификация МДС Франко-американо-британская (FAB) группа исследователей в 1976 году охарактеризовала две классификационные категории «синдромов дисмиелопоэза» – рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ) и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) В 1982 году [25].

классификация была расширена, термин «синдромы дисмиелопоэза» заменен на «миелодиспластические синдромы», который используют для обозначения заболевания и в настоящее время [26]. Согласно FAB-классификации 1982 года, было выделено 5 вариантов МДС: рефрактерная анемия (РА), рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами (РАКС), РАИБ, РАИБ в трансформации (РАИБ-Т) и ХММЛ. FAB-классификация использовалась гематологами всего мира на протяжении более 30 лет, ее актуальность не утрачена и до сих пор.

Однако разнообразие клинических вариантов МДС требовало выбора различных терапевтических подходов и, следовательно, определения критериев оценки риска трансформации заболевания. В 1997 году P.Greenberg с соавт. [68] представили прогностическую шкалу риска IPSS (International Prognostic Scoring System), которая позволила на основе трех критериев: количества бластных клеток в костном мозге, кариотипа и степени цитопенического синдрома – выделить 4 категории прогноза: категории низкого, промежуточного-1 и -2 и высокого риска (таблица 1).

Таблица Прогностическая шкала IPSS (1997г.) Количество баллов Фактор 0 0,5 1 1,5 Бластные клетки КМ 5 5-10 - 11-19 20- (%) Хороший Промежуточный Плохой Кариотип - Цитопения 0-1 2-3 - - Примечание: Кариотип – хороший (нормальный кариотип и изолированные del(5q), del(20q) и -Y);

промежуточный (+8 и другие аномалии, сочетание двух аномалий);

плохой (аномалии хромосомы 7 и комплексный кариотип);

Цитопения – гемоглобин 100 г/л, АЧН (абсолютное число нейтрофилов) 1,5х109/л, тромбоциты 100х109/л;

0 баллов – низкий риск, 0,5-1 балл – промежуточный-1 риск, 1,5-2 балла – промежуточный- риск, 2,5 баллов – высокий риск.

Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2000 году была создана новая классификация гематологических заболеваний, внесены изменения и в классификацию МДС: выделены варианты рефрактерной цитопении с мультилинейной дисплазией (РЦМД) с и без кольцевых сидеробластов, МДС с изолированной делецией 5q и неклассифицированный МДС, РАИБ разделена на категории РАИБ-1 и РАИБ-2 в соответствии с количеством бластных клеток, выделена отдельная категория МДС-МПЗ (миелопролиферативные заболевания), ХММЛ удален из классификации, пограничный процент бластных клеток между МДС и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) составил 20% вместо 30%, категория РАИБ-Т удалена [84]. Классификация ВОЗ дополнена в 2008 году: РА была включена в категорию рефрактерной цитопении с унилинейной дисплазией (РЦУД), внутри которой также выделены рефрактерная нейтропения (РН) и рефрактерная тромбоцитопения (РТ), варианты РЦМД с и без КС были объединены (таблица 2) [146].

Таблица Классификация МДС (ВОЗ 2008г.) Тип МДС ПК КМ 1. Рефрактерная 1- или 2-ростковая Дисплазия одного ростка цитопения с цитопения, ( 10% клеток), унилинейной дисплазией БК 1% БК 5% (РА, РН, РТ) 2. Рефрактерная анемия Анемия 15% КС, с кольцевыми БК 1% дисплазия красного ростка, сидеробластами (РАКС) БК 5% 3. Рефрактерная 2- или 3-ростковая Дисплазия 2 или 3 ростков цитопения с цитопения, ( 10% клеток), мультилинейной БК 1%, БК 5%, моноциты 1х109/л дисплазией (РЦМД) ~ 15% КС 4. Рефрактерная анемия с Цитопения, 1-, 2- или 3-ростковая избытком бластов-1 БК 5%, дисплазия, (РАИБ-1) моноциты 1х10 /л БК = 5-9% 5. Рефрактерная анемия с Цитопения, 1-, 2- или 3-ростковая избытком бластов-2 БК = 5-19%, дисплазия, моноциты 1х109/л, (РАИБ-2) БК = 10-19%, палочки Ауэра +/- палочки Ауэра +/ 6. МДС с изолированной Анемия, Нормальное или увеличенное нормальное или число мегакариоцитов, del(5q) (5q-cиндром) повышенное число БК 5%, тромбоцитов, изолированная del(5q) БК 1% Цитопения, Дисплазия 10% клеток 7.МДС неклассифицированный БК 1% одного или нескольких (МДС-Н) ростков БК 5% Примечание: КС – кольцевые сидеробласты, БК – бластные клетки Вместе с пересмотром классификации разрабатывались и более точные прогностические шкалы для больных МДС. Вносимые изменения, прежде всего, имели клиническое значение, так как со временем претерпевали изменения подходы к лечению пациентов [125]. В 2007 году L.Malcovatti с соавт. [101] разработали новую шкалу динамической оценки риска у больных МДС – WPSS, в которой учитывались клинический вариант по классификации ВОЗ, кариотип и наличие зависимости от гемотрансфузий. Согласно этой шкале выделено категорий риска: очень низкий, низкий, промежуточный, высокий и очень высокий (таблица 3).

Таблица Прогностическая шкала WPSS (2007г.) Количество баллов Фактор 0 1 2 РА, РАКС, РЦМД, Категория ВОЗ РАИБ-1 РАИБ- МДС с 5q- РЦМД-КС Кариотип хороший промежуточный плохой Зависимость от нет есть - гемотрансфузий Примечание: 0 баллов – очень низкий риск, 1 балл – низкий риск, 2 балла - промежуточный риск, 3-4 балла – высокий риск, 5-6 баллов – очень высокий риск.

В 2012 году группой ученых из 11 стран мира опубликованы результаты наблюдения более 7000 больных и предложена новая прогностическая шкала IPSS-R [69]. Увеличено с 5 до 16 число специфических цитогенетических аномалий при МДС, определена клиническая значимость редких хромосомных нарушений, а также были учтены показатели возраста и коморбидности (таблица 4).

Таблица Прогностическая шкала IPSS-R (2012г.) Параметр Категории и баллы Группы риска, Очень Хороший Промежу- Плохой Очень плохой хороший точный цитогенетика 0 1 2 3 Бластные 2 2–5 5 – 10 10 – клетки КМ (%) 0 1 2 Гемоглобин 100 80 – 100 (г/л) 0 1 1, АЧН (х109/л) 0,8 0, 0 0, Тромбоциты 100 50 – 100 (х109/л) 0 0,5 Примечание: АЧН – абсолютное число нейтрофилов;

Кариотип – очень хороший (del(11q) и -Y);

хороший (нормальный кариотип, изолированные del(5q), del(12p) и del(20q), сочетание двух аномалий, одна из которых del(5q));

промежуточный (изолированные del(7q), +8, +19, i(17) и другие аномалии, сочетание двух аномалий);

плохой (-7, inv(3)/t(3q), сочетание аномалий, одна из которых -7/del(7q), комплексный кариотип: 3 аномалии);

очень плохой (комплексный кариотип: 3 аномалий);

0-1,5 балла – очень низкий риск, 2-3 баллов – низкий риск, 3,5-4,5 баллов - промежуточный риск, 5-6 баллов – высокий риск, 6,5 баллов – очень высокий риск.

Необходимо отметить, что выше приведены не все существующие варианты стратификации риска у больных МДС. Их многочисленность обусловлена разнообразием клинических вариантов заболевания, однако ни одна шкала в полной мере не отражает всех особенностей МДС. В частности, в классификации ВОЗ не отражено значение гистологической картины костного мозга, вместе с тем показано, что увеличение клеточности и наличие фиброза являются важными факторами, ухудшающими прогноз у больных МДС. Более того, показана необходимость двустороннего исследования трепанобиоптатов подвздошных костей, по крайней мере, в дебюте заболевания [4]. Следует также подчеркнуть, что прогностические шкалы определяют прогноз естественного течения заболевания у больных, не получающих специфическое лечение. А, следовательно, благодаря применению эффективных методов терапии, прогноз у пациентов с МДС может и должен быть изменен.

Анализ прогностической значимости новых исследований – проточной цитометрии [165] и исследования профиля генетических мутаций [24] – у пациентов с МДС продолжен, и, возможно, в скором времени будут предложены новые подходы к классификации и определению прогноза.

1.3. Цитогенетические исследования при МДС В 1956 году двумя группами исследователей независимо друг от друга было установлено, что нормальный кариотип человека состоит из 23 пар хромосом: 22 пар аутосом и 1 пары половых хромосом [57, 152]. Началась эра клинической цитогенетики. Появление метода дифференциального окрашивания хромосом сделало возможным выделение и исследование каждой хромосомы в отдельности [38, 138]. Обработанные трипсином и далее окрашенные хромосомы приобретали специфическую для каждой пары исчерченность, обусловленную чередованием темных полос (G-полосы), содержащих интерстициальный гетерохроматин, и светлых участков. Метод стал стандартом цитогенетического исследования. В дальнейшем появление новых методик, в частности, флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), позволило проводить хромосомный анализ в интерфазных (не делящихся) ядрах. Впервые методика была описана в начале 1980х годов [94]. Наряду с возможностью изучения аномалий морфологии хромосом методом стандартного цитогенетического исследования, метод FISH позволил проводить анализ конкретных специфических последовательностей ДНК и РНК. Методика представляет собой использование флюоресцентных проб (зондов), которые связываются с комплементарными участками ДНК при помощи реакции гибридизации. Метод позволяет более точно определить локализацию и выявлять малые клоны с хромосомными аномалиями.

Идеи о преимущественно клональной природе МДС возникли уже в 1960 е годы. J.Grouchy с соавт. [46] описали аномалии хромосом F-группы (19-20 пары) у 5 из 6 пациентов с сидеробластной анемией (частичные делеции и перицентрические инверсии). Предполагалось, что гены, контролирующие процессы кроветворения, расположены в хромосомах указанной группы.

R.E.Millard с соавт. [107] определили те же аномалии у больных истинной полицитемией, а R.M.Goodman [66] – у 79-летнего пациента с миелофиброзом.

Однако позже стало очевидно, что эти соматические хромосомные аномалии могут быть определены в лимфоцитах периферической крови у лиц, не страдающих гематологическими заболеваниями, и ассоциированы с тяжелыми ментальными расстройствами [60, 51].

В середине 1970х годов были описаны клональные изменения в костном мозге у больных «предлейкозом» – трисомия 8, -7/del(7q), -5/del(5q) [124, 139].

Было подтверждено наличие клональных цитогенетических аномалий у пациентов с рефрактерной анемией, описаны аномалии 1 (дубликация 1q), (t(2;

7), t(2;

21)), 3 (del(3p)), 5 (del(5q)), 20 (del(20q)), 7, 8, 9, 19 и 21 хромосом (трисомии) [22].

1.4. Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС При цитогенетическом исследовании клеток костного мозга у больных МДС на момент установления диагноза клональные изменения кариотипа выявляют в 40-70% случаев в зависимости от варианта заболевания, при прогрессировании заболевания или развитии вторичной миелодисплазии они встречаются чаще – у 70-90% больных [68, 83, 106, 114, 134, 147, 164].

Сбалансированные хромосомные аберрации встречаются при МДС крайне редко;

наиболее характерными являются аномалии с потерей (делеции, моносомии) или добавлением генетического материала (трисомии, изохромосомы, инсерции). Хромосомные аномалии, описанные при МДС, встречаются также и при ОМЛ de novo. Исключением является del(20q), характерная для категории МДС низкого риска, которая описана также у больных ХМПЗ. При МДС не встречаются характерные хромосомные аномалии, соответствующие специфическому варианту ОМЛ – t(15;

17), inv(16), t(8;

21), t(9;

11). Аномалии кариотипа чаще определяют у пациентов с МДС категории высокого риска (РАИБ) в сравнении с категорией низкого риска (РЦ, РЦМД, РАКС). Однако за исключением del(5q), не выявлено связи конкретной хромосомной аномалии с клиническим вариантом МДС [83]. При МДС могут быть выявлены одновременно несколько патологических клонов, определяющихся в разных клетках [83]. Это явление не характерно для ОМЛ de novo.

Показана роль кариотипа как независимого фактора прогноза при МДС [83, 168]. Не всегда присутствие клональных нарушений ассоциировано с быстрой трансформацией в острый лейкоз. Согласно прогностической шкале IPSS кариотип клеток костного мозга распределен на 3 категории:

благоприятный (нормальный кариотип, изолированные del(5q), del(20q), -Y), неблагоприятный (-7/del(7q), комплексный кариотип) и промежуточный (+8 и другие аномалии) [68]. Наиболее распространенными аномалиями кариотипа являются аномалии с вовлечением хромосом 5, 7 и 8, каждая из которых изолированно или в составе множественных нарушений кариотипа встречается примерно у 10% больных МДС.

1.4.1. Аномалии хромосомы Делеция длинного плеча хромосомы 5 – самая частая аномалия, ее наличие определяют у 10-15% пациентов с МДС. Описан только интерстициальный тип делеции без транслокации генетического материала. Выделяют 3 типа делеции:

1-й тип – с вовлечением сегмента q13-q31 или q13-q33;

2-й тип – q12-q31 или q14-q31;

3-й тип – делеция минимального сегмента q23-q32. Какой бы ни был размер делеции, общим участком является регион 5q31, который в свою очередь неоднороден. Делеция может вовлекать центромерную часть региона, что чаще ассоциировано с плохим прогнозом, или теломерную часть (расположенную ближе к региону 5q32), что обычно наблюдают при 5q-синдроме. На длинном плече хромосомы 5 расположены гены EGR-1 и -катенина, их роль в развитии заболевания до конца не ясна. Классический 5q-синдром, или МДС с изолированной del(5q), – это вариант рефрактерной макроцитарной анемии с нормальным или увеличенным числом тромбоцитов, морфологическими признаками дизэритропоэза и увеличенным количеством голоядерных микроформ мегакариоцитов [48, 156]. Морфологические изменения в костном мозге у этих больных имеют сходство с проявлениями при хронических миелопролиферативных заболеваниях. У некоторых пациентов может быть выявлена мутация гена JAK2 в регионе V617F [146]. Заболевание чаще встречается у женщин, преобладает пожилой возраст – всего 15% больных моложе 50 лет. Классический 5q-синдром характеризуется хроническим стабильным течением, отсутствием признаков прогрессирования и трансформации в ОМЛ длительное время. Del(5q) может встречаться не только изолированно, но и в составе множественных аномалий кариотипа. Определение дополнительно к del(5q) второй хромосомной аномалии может существенно не ухудшить прогноз в сравнении с прогнозом при классическом 5q-синдроме. В то же время сочетание del(5q) с аномалиями хромосомы 7 (-7/del(7q)), а также аномалии хромосомы 5 в составе комплексных нарушений кариотипа значительно ухудшают выживаемость больных. Терапией выбора для пациентов с и благоприятным прогнозом в настоящее время является del(5q) иммуномодулирующая терапия леналидомидом, эффективность которой составляет 80% [98].

1.4.2. Аномалии хромосомы Вторая по частоте аномалия при МДС – полная утрата хромосомы (моносомия) или интерстициальная/терминальная делеция участка длинного плеча del(7q) – определяется у 8-11% пациентов. При del(7q) принципиальна потеря регионов 7q22, 7q31-32 и 7q36;

в этих регионах расположены гены EZH и MLL5, отвечающие за эпигенетическую регуляцию процессов клеточной дифференцировки [50, 78, 96]. Опубликованы данные о мутации генов семейства гена и гиперметилировании у больных этой RAS, AML1 p15INK4B цитогенетической категории [41, 42]. Клиническое течение МДС с аномалией хромосомы 7 характеризуется короткой средней продолжительностью жизни больных, выраженным цитопеническим синдромом, тяжелыми инфекционными осложнениями и высокой частотой развития ОМЛ [46, 123]. Значимых отличий клинического течения заболевания при различных локализациях делецированного участка q-плеча хромосомы 7 не выявлено, однако согласно последним данным продолжительность жизни короче и риск трансформации в ОМЛ выше у пациентов с моносомией 7, чем у пациентов с del(7q) [136]. В настоящее время терапией выбора у больных МДС группы высокого риска является применение гипометилирующих препаратов (децитабин, азацитидин) с последующей трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, а также проведение трансплантации в качестве первой линии терапии, так как химиотерапевтическое воздействие в большинстве случаев оказывается неэффективным, а продолжительность полученных ремиссий короткой.

1.4.3. Аномалии хромосомы Увеличение количества (амплификации) генетического материала также характерно для пациентов с МДС. Самой частой амплификацией является трисомия 8, ее встречаемость – 7-9% больных. Следует отметить, что среди характерных для МДС аномалий эта наиболее часто встречается у пациентов с ОМЛ de novo. Определение изолированной трисомии 8 позволяет отнести пациента к группе промежуточного риска с общей продолжительностью жизни 26 месяцев [136]. Ключевым генетическим маркером при данном варианте МДС принято считать ген c-MYC, расположенный в регионе 8q24 и кодирующий фактор транскрипции. Его экспрессия повышена в клетках, содержащих трисомию [141]. У этой категории больных эффективным может быть применение иммуносупрессивной терапии (циклоспорин А (ЦСА), антитимоцитарный глобулин) [92, Механизм действия ЦСА на 141].

кроветворные клетки может быть как опосредованным, так и прямым. К эффектам, опосредованным через Т-лимфоциты, относят следующие: блокада продукции активированными Т-лимфоцитами и NK-клетками интерферона и фактора некроза опухоли;

ингибирование синтеза и секреции интерлейкина- CD4+ лимфоцитами, что ведет к угнетению их активности и апоптозу;

блокада МНС-I-зависимых механизмов ингибирования гемопоэтических клеток цитотоксическими CD8+ лимфоцитами и NK-клетками. Непосредственные эффекты ЦСА связаны с прямым ингибированием митохондриального циклофиллина, участвующего в запуске каскада реакций программированной клеточной гибели, а также с увеличением клоногенной активности клеток предшественниц в культурах, из которых удалены CD4 +/CD8+ клетки. Таким образом, иммуносупрессивные свойства ЦСА оказывают терапевтический эффект при лечении МДС [5, 11].

1.4.4. Комплексный кариотип и клональная эволюция Количество хромосомных перестроек существенно влияет на прогноз при МДС. Так, показано, что у пациентов с комплексным кариотипом он значимо хуже, чем у пациентов с изолированными аномалиями или нормальным кариотипом. Наличие множественных хромосомных аномалий ассоциировано с плохим ответом на проводимую терапию и короткой продолжительностью жизни больных. Комплексным кариотипом является определение 3 и более хромосомных аномалий. Комплексные нарушения, возможно, возникают последовательно в результате многоэтапного процесса клональной эволюции.

Характерны несбалансированные структурные поломки с вовлечением регионов 5q, 7q, 3p, 3q, 12p, 16q, 17p, 18q и 20q, а также появление дополнительных хромосом и их участков – 8/8q, 11q, 17q, 21q [155]. Комплексные аномалии кариотипа чаще ассоциированы с вторичными МДС и ОМЛ, при наличии анамнеза предшествующей терапии алкилирующими агентами и ингибиторами топоизомеразы II, воздействия радиации и токсинов. Агрессивные методы лечения, показанные этой категории больных, не всегда бывают оправданы в силу тяжелого соматического состояния или возраста, что делает необходимым поиск новых подходов к их лечению [72].

Клональная эволюция МДС – это процесс, лежащий в основе прогрессии заболевания. Последовательные цитогенетические исследования клеток костного мозга в динамике позволяют определить появление хромосомных аномалий при ранее нормальном кариотипе или появление новых аномалий дополнительно к уже выявленным [153]. Другой причиной прогрессии заболевания может быть экспансия существующего патологического клона [82]. Так называемую «генетическую нестабильность» (эволюцию клона) выявляют приблизительно у 30% пациентов c МДС [139]. Эволюция патологического клона, как и увеличение процента бластных клеток в костном мозге, значительно увеличивает риск трансформации заболевания в острый лейкоз [154]. Тем не менее, показано также проявление генетической нестабильности при относительно стабильном клиническом течении заболевания [65].

1.5. МДС – клональное заболевание стволовой кроветворной клетки Патогенез заболевания – предмет внимательного изучения со времени выделения самостоятельной нозологической формы. В 1960е годы были опубликованы наблюдения, что у женщин с лейомиомой, гетерозиготных по гену, кодирующему синтез фермента глюкозо-6-дегидрогеназы (Г-6-ДГ), клетки опухоли содержат только один изотип этого фермента вместо двух, как происходит в здоровых клетках, то есть представляют собой клон одной клетки.

Вслед за этим появилось предположение, что все опухоли имеют клональное происхождение [97]. Среди онкогематологических заболеваний это утверждение было впервые проверено у больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) [52, 53].

Чуть позже схожие результаты получены и у больных МДС [127]. W.H.Raskind с соавт. [131] на примере обследования пациентки с миелодисплазией и хромосомными аномалиями в клетках костного мозга (триcомия 8 и del(11q)) показали, что несмотря на отсутствие этих аномалий в фибробластах кожи и В лимфоцитах крови, среди последних определяется гомозиготность по Г-6-ДГ, что доказывало клональное повреждение клетки-предшественницы миело- и лимфопоэза. Отсутствие хромосомных нарушений в других, кроме миелоидной, клеточных линиях, авторы объясняли «многоступенчатостью» патогенеза заболевания, появлением нескольких независимых событий в процессе развития болезни. Происходит ли первоначальное событие в генетическом аппарате стволовой кроветворной клетки или на уровне коммитированных миелоидных предшественниц, остается спорным. Данные, полученные J.T.Prchal с соавт., демонстрируют поражение мультипотентной стволовой клетки при МДС [127].

Подтверждением этого служат и результаты, опубликованные J.W.Janssen с соавт. [86], в которых показано наличие полиморфизма X-сцепленных генов и мутации генов RAS-семейства в клетках костного мозга и различных клеточных линиях периферической крови при МДС. В свою очередь, известны случаи лимфоидной трансформации заболевания, хотя ее частота не столь велика [29, 67], а также выявление одновременно с МДС В- или Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний [23, 112].

Определение хромосомных аномалий и генетических мутаций представляет несомненное доказательство клональной природы МДС. Учитывая разнообразие клинических форм заболевания, представляется вероятным, что патогенез заболевания многоступенчатый, начальное событие которого происходит в отделе полипотентных СКК, а дальнейшие события, приводящие к возникновению хромосомных аномалий, задействуют клетки-предшественницы миелоидной линии гемопоэза. Необходимо отметить, что упомянутые выше исследования не касались непосредственно исследования самих стволовых клеток. Несмотря на то, что МДС принято считать клональным заболеванием СКК, окончательную характеристику начального звена патогенетической цепочки, приводящей к развитию заболевания, еще предстоит узнать.

На поверхности СКК определяют ряд специфических маркеров, в дальнейшем на этапах дифференцировки их иммунофенотип меняется. Общим маркером ранних кроветворных клеток является антиген CD34. Кластер дифференцировки CD34 - это высокогликозилированный трансмембранный протеин с муциноподобной структурой и молекулярной массой 115 кДа. Белок CD34 кодируется геном, расположенным в локусе 1q32. Структура молекулы стала известна в 1986 году, а годом позже эксперименты на летально облученных обезьянах показали, что антиген экспрeссируют мультипотентные СКК, способные дифференцироваться во все клеточные линии, и коммитированные линейные клетки-предшественницы [20, 27]. Антиген CD является, в свою очередь, важным фактором регулирования процесса адгезии незрелых кроветворных клеток в костномозговых нишах [59, 77, 95].

На поверхности СКК также экспрессирован антиген CD90 (Thy-1) и отсутствует экспрессия CD38, CD45RA и Lin. Появление CD38, CD45RA и линейных маркеров происходит в процессе дифференцировки до общих миелоидных, гранулоцитарно-макрофагальных и мегакариоцитарно эритроидных клеток-предшественниц. Показано, что относительное количество общих миелоидных клеток-предшественниц, то есть клеток с фенотипом Lin/CD34+/CD38+/CD123+/CD45RA, в костном мозге больных МДС увеличено по сравнению с нормальным костным мозгом [99]. В то же время наблюдают значительное уменьшение гранулоцитарно-макрофагальных клеток предшественниц с фенотипом Lin/CD34+/CD38+/CD123+/CD45RA+, а количество Lin/CD34+/CD38+/CD123/ мегакариоцитарно-эритроидных предшественниц CD45RA существенно не отличается от нормы [122]. Таким образом, при МДС нарушен путь дифференцировки СКК до коммитированных предшественниц.

Количество CD34+ кроветворных клеток-предшественниц у пациентов с МДС увеличено по сравнению с их количеством у здоровых лиц как в костном мозге, так и в периферической крови [110, 149]. Увеличение числа CD34+ клеток обусловлено повышенной клеточностью костного мозга, нарушением созревания кроветворных клеток и позитивностью по антигену CD34+ бластных клеток.

Исключение могут составлять варианты МДС, протекающие с гипоплазией и фиброзом в костном мозге. Процент CD34+ клеток в костном мозге, определенный с помощью проточной цитометрии, по данным исследования D.

de Smet с соавт. [47] зависит от варианта заболевания: у пациентов в группе низкого риска (РЦ, РЦМД) в среднем определено 1,7% CD34+ клеток, у пациентов с РАИБ – 10,5%, тогда как у здоровых доноров костного мозга в среднем содержится 1,5% CD34+ клеток. Количество циркулирующих CD34+ клеток у здоровых лиц составляет по разным данным 0.015% до 0.5% от всех ядросодержащих клеток Абсолютное число циркулирующих [58, 157].

кроветворных клеток-предшественниц у больных МДС низкого риска вследствие глубокой цитопении обычно меньше или соответствует их числу в крови здоровых лиц, тогда как у пациентов из группы высокого риска значительно превышает его. Наблюдают корреляцию между количеством CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови, а также процентом бластных клеток [105]. Увеличение количества CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови в динамике имеет неблагоприятное прогностическое значение, так как может соответствовать прогрессии заболевания [58, 157].

Механизм «выхода» незрелых клеток-предшественниц в периферическую кровь может быть связан с нарушением их адгезии в костном мозге [159].

Кроветворные клетки-предшественницы, полученные из костного мозга больных МДС, имеют функциональные отличия от их нормальных аналогов.

Так, эффективность колониеобразования и время репопулирования in vitro длительной клеточной культуры у них значительно ниже [99]. Функциональные нарушения кроветворных клеток-предшественниц более выражены у пациентов с аномалиями кариотипа. В недавней работе B.Will с соавт. [167] на примере изучения незрелых кроветворных клеток у нескольких пациентов с аномалиями кариотипа показано, что эти клетки дифференцируются in vitro в миелоидные предшественницы с морфологическими признаками дисмиелопоэза (билобулярность ядра, псевдопельгеризм). В костном мозге пациентов с МДС нарушено функционирование путей передачи сигналов взаимодействия незрелых кроветворных клеток-предшественниц, в частности, интерферонового сигнального пути, путей фактора некроза опухоли- и фактора роста опухоли [116]. Эти механизмы приводят к увеличению степени запрограммированной клеточной гибели – апоптоза, изменению пролиферативного потенциала и процессов самообновления пула клеток-предшественниц гемопоэза, что является одной из причин развития у больных цитопенического синдрома [4].

Таким образом, являясь «субстратом» миелодисплазии в костном мозге и начальным звеном ее развития, незрелые кроветворные клетки демонстрируют различные функциональные особенности, отличающие их от аналогов в здоровом костном мозге. Несмотря на то, что эти особенности несколько отличны у пациентов с разными вариантами заболевания и цитогенетическими аномалиями, общие принципы их функциональной неполноценности одинаковы.

1.5.1. Цитогенетические исследования кроветворных клеток предшественниц Изучение цитогенетических, генетических и эпигенетических изменений в СКК и коммитированных клетках-предшественницах важно для определения уровня возникновения мутаций при МДС. Опубликованы данные, что и CD34+/CD38-, CD34+/CD38+ и клетки-предшественницы содержат цитогенетические аномалии, которые определены в общей костномозговой популяции клеток [73]. Также показано, что трансформация и рецидив заболевания – события, происходящие на уровне клеток-предшественниц [74, Исследование группы пациентов с получивших терапию 75]. del(5q), леналидомидом, показало, что клональные нарушения сохраняются на уровне клеток-предшественниц несмотря на достижение клинико-гематологической и цитогенетической ремиссии заболевания. Это демонстрирует чрезвычайную устойчивость опухолевых клеток к терапевтическому воздействию и сложность достижения полноценных ремиссий [117, 151. Данные, полученные I.Muira с соавт., показывают наличие клональных изменений (моносомии 7) на уровне лимфо-миелоидных клеток-предшественниц [109]. Некоторое время назад считалось, что у пациентов с трисомией 8 мультипотентные СКК свободны от клональных нарушений, и патологический клон при этой аномалии определяется только на стадии миелоидных предшественниц [135]. Этот постулат позднее был опровергнут последующими исследованиями. Однако стоит отметить, что размер патологического клона с трисомией 8, определяемого в незрелых клетках-предшественницах, несколько меньше, чем при других цитогенетических аномалиях [116]. В 2012 году B.Will с соавт. [167] опубликовали исследование, в котором цитогенетические маркеры были обнаружены в СКК и миелоидных предшественницах, которые сохранялись на фоне терапии заболевания гипометилирующими агентами.

Цитогенетические исследования лимфоидной клеточной линии показывают, что аномалии кариотипа в этих клетках не определяются. Это можно было бы объяснить большим периодом жизни лимфоцитов и, таким образом, их способностью «маскировать» имеющиеся клональные изменения в части вновь образованных клеток. Вместе с тем характерные генетические нарушения не выявляют и с помощью высокочувствительной методики ПЦР. С другой стороны, может быть и так, что мультипотентные СКК под воздействием генетических и эпигенетических нарушений теряют способность к лимфоидной дифференцировке при МДС. И, следовательно, гипотеза о возникновении МДС на уровне СКК не может быть отвергнута 87, 118.

С другой стороны, есть исследования, в которых показано присутствие del(5q) и del(20q) в В-лимфоцитах и отсутствие их в Т-лимфоцитах [85, 166].

Однако такие публикации оценивают неоднозначно, так как генетические мутации в В-лимфоцитах могут быть связаны с вирусным воздействием (например, вируса Эпштейна-Барр) и иметь вторичный характер. Вторичный генез может обусловливать и нарушение функции NK-клеток у больных МДС [62, 88, 118].

Не так давно стало известно, что циркулирующие CD34+ клетки пациентов с МДС наравне с клетками костного мозга содержат цитогенетические аномалии [37]. И, следовательно, кроветворные клетки-предшественницы костного мозга и периферической крови при МДС проявляют сходные свойства, в том числе и хромосомные нарушения.

1.6. Роль стромального микроокружения 1.6.1. Строма костного мозга. Мезенхимальные стромальные клетки Строма костного мозга представляет собой основу для кроветворных клеточных элементов. Она состоит из межклеточного матрикса и клеток, выстилающих костномозговую полость (эндост) и стенки синусоидных капилляров, а также жировых клеток и макрофагов. Компоненты стромы создают микроокружение, которое обеспечивает рост, деление и созревание кроветворных клеток. В костном мозге микроокружение представлено несколькими типами клеток: остеобласты, хондроциты, гладкомышечные клетки, адипоциты, эндотелиоциты, ретикулярные клетки и макрофаги.


Микроокружение формирует «ниши» для кроветворных клеток. Показано, что СКК расположены в эндостальных нишах – в близости к выстилающим трабекулярную кость остеобластам и мезенхимальным стромальным клеткам, а созревающие клетки-предшественницы локализуются вблизи кровеносных сосудов – в периваскулярных нишах, вокруг эндотелиоцитов синусоидных капилляров [49]. Клетки удерживаются в нишах при помощи межклеточных контактов;

процессы их деления и дифференцировки регулируются секретируемыми в межклеточное пространство различными паракринными факторами (цитокинами) [16, 163].

В эндостальной нише осуществляется поддержание пула незрелых СКК, их миелоидная дифференцировка посредством синтеза остеобластами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), гранулоцитарно макрофагального КСФ (ГМ-КСФ) и интерлейкина-6. В экспериментах in vitro было показано, что количество CD34+ клеток в длительной клеточной культуре увеличивается вчетверо за 2 недели культивирования в присутствии остеобластов [150]. Взаимодействие паратиреоидного гормона с рецептором на поверхности остеобластов приводит к активации и увеличению их количества, что, в конечном счете, приводит к увеличению числа незрелых СКК [13]. В основе лежит взаимодействие лиганда Jagged 1 с рецептором Notch на поверхности СКК. Остеобласты секретируют цитокины, стимулирующие пролиферацию СКК, в частности, ангиопоэтин. В то же время они продуцируют в межклеточный матрикс белок остепонтин, являющийся обратным регулятором содержания СКК [145]. Негативными регуляторами пролиферации СКК выступают также адипоциты. Чем меньше их количество в костном мозге, тем успешней приживление трансплантата [115].

Рецептор CXCR4 на поверхности СКК имеет сродство к хемокину CXCL12, который наряду с другими стромальными клетками в большом количестве секретируют ретикулярные клетки, окружающие синусоидные капилляры и эндост. Взаимодействие рецептора с лигандом обеспечивает хоуминг СКК (способность мигрировать и оставаться в костном мозге), тем самым сохраняется их пул в костном мозге [148]. Известна роль ретикулярных клеток в продукции интерлейкина-6 и c-kit лиганда (фактора стволовых клеток), Г-КСФ и ГМ-КСФ [71].

СКК и более зрелые клетки-предшественницы локализованы также вокруг синусоидных капилляров в периваскулярных нишах, функция которых наравне с эндостальными нишами заключается в поддержании процессов деления и дифференцировки незрелых кроветворных клеток в костном мозге, а также в экстрамедуллярных очагах кроветворения, в которых отсутствует костная ткань.

Роль регуляторов адгезии и пролиферации CD34+ клеток-предшественниц в периваскулярной нише отведена эндотелиоцитам и мезенхимальным стромальным клеткам. Механизм регуляции тот же, что и в эндостальной нише, показана также роль секретируемого эндотелиоцитами плейотрофина (гепарин связывающего фактора роста), оказывающего индуцирующее влияние на пролиферацию СКК [43].

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) - важный клеточный компонент стромы. Это фракция прилипающих к пластику фибробластоподобных клеток, образующих колонии in vitro с сохранением дифференцировочного потенциала. На поверхности МСК экспрессированы маркеры CD73, CD105, CD90, Stro-1 и отсутствуют маркеры кроветворных клеток CD34, CD45, CD14, HLA-DR [14, 40]. МСК – это мультипотентные клетки-предшественницы зрелых клеточных компонентов стромы. Под воздействием индуцирующих факторов они способны к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты [126]. МСК ответственны за поддержание и регуляцию кроветворения в костном мозге [17, 45, 113]. Они секретируют ростовые факторы, благодаря которым происходит дифференцировка кроветворных предшественниц. МСК экспрессируют рецепторы клеточной адгезии, обеспечивающие миграцию и поддержание пула СКК в костном мозге.

1.6.2. Функциональные особенности стромы при МДС При МДС наряду с функциональными нарушениями в СКК и в коммитированных клетках-предшественницах получены сведения о патологии стромы костного мозга. Возможно, повреждение стромального микроокружения происходит вторично в ответ на дефект взаимодействия клонально-измененных стволовых кроветворных клеток с клетками костномозговых ниш. Существует и обратная точка зрения о возникновении клональных нарушений в СКК в условиях патологии стромы. Еще в конце XIX века S.Paget в своей теории «почвы и зерна» предположил, что в основе сложного многоэтапного процесса канцерогенеза лежит нарушение специфического взаимодействия опухолевых клеток и окружающей ткани Клетки опухоли «строят» свое [121].

микроокружение путем высвобождения в межклеточный матрикс различных факторов, действие которых приводит к нарушению нормального гомеостаза стромы, и поддержанию опухолевого роста, формируя порочный круг обратной связи. Подобные механизмы реализованы при опухолях различного происхождения и локализации и могут лежать в основе как возникновения опухоли in situ, так и образования метастазов [111].

Из многочисленных исследований мы знаем о функциональном влиянии микроокружения костного мозга на процессы персистенции и экспансии злокачественного клона при различных заболеваниях системы крови. Например, описано образование межклеточных связей и взаимодействие посредством цитокинов между плазматическими клетками и клетками стромального микроокружения при множественной миеломе, приводящие к активному ангиогенезу и деструкции кости [108]. У больных ХМЛ показано, что клональное кроветворение обусловлено специфическим взаимодействием кроветворных клеток-предшественниц и макрофагов стромы. Макрофаги – компонент стромы гемопоэтического происхождения, они являются частью патологического клона при ХМЛ и способствуют поддержанию клонального кроветворения за счет подавления роста нормальных кроветворных клеток предшественниц [31]. Формирование обширных зон фиброза обусловлено избыточной продукцией макрофагами и мегакариоцитами цитокинов, таких как полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF), что наблюдают при хронических миелопролиферативных заболеваниях и первичном миелофиброзе [39]. Дисрегуляция матриксных металлопротеиназ (MMP) в межклеточном пространстве у больных острыми лейкозами и МДС среди прочих причин может влиять на клеточность костного мозга [2, 81].

Изучение трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток позволило установить, что компоненты стромы реципиента костного мозга имеют хозяйское происхождение. И тот факт, что в этих условиях донорское кроветворение способно развиться, говорит о функциональности и обратимости нарушений стромы при опухолевых заболеваниях системы крови [130]. С другой стороны, существует проблема отторжения пересаженного костного мозга [103], а также развития лейкоза из клеток трансплантата [18], причину возникновения которых некоторые ученые видят в инициирующем дефекте стромы реципиента.

В пользу этой теории свидетельствует экспериментальное исследование австралийских ученых о возникновения миелопролиферативного синдрома у мышей при инактивировании рецептора к ретиноевой кислоте (RAR), а также работа американских исследователей о развитии индуцированной миелодисплазии в костном мозге мышей, сформировавшейся в результате делеции ответственного за процессинг РНК гена Dicer1 [128, 160].

Изучение функциональных особенностей стромы при МДС необходимо для понимания биологии этого заболевания. В последнее время опубликованы работы о нарушении взаимодействия рецептор-лиганд между СКК и клетками стромы, в частности, значительно увеличена продукция МСК хемокина CXCL [56]. Фактор CXCL12 (SDF-1) ответственен за поддержание СКК в состоянии покоя в костномозговых нишах [120]. На поверхности МСК костного мозга у больных МДС изменена экспрессия молекул адгезии [7, 9]. В свою очередь, MMP могут способствовать нарушенной восприимчивости рецептора CXCR4 и инактивации хемокина CXCL12, что приводит к отрыву и выходу СКК в периферическую кровь [104]. При МДС нарушена регуляция сигнального пути Notch – важного механизма процесса клеточной дифференцировки, и пластичность МСК костного мозга снижена [100, 158]. В длительной культуре костного мозга соответствующие нарушения проявляются сниженной способностью МСК к поддержанию кроветворения in vitro и приводят к появлению блока дифференцировки кроветворных клеток-предшественниц, что имеет место при МДС. Стоит также отметить, что строма костного мозга больных МДС более эффективно взаимодействует с кроветворными клетками предшественницами, выделенными из костного мозга больных, чем с их аналогами от здоровых лиц, и, следовательно, имеет ограниченную способность к поддержанию нормального кроветворения 8, 63, 137.

1.6.3. Цитогенетические исследования клеток стромы Несмотря на общее мезодермальное (мезенхимальное) происхождение кроветворных компонентов костного мозга и клеток стромального микроокружения, попытки определения общей предшественницы, способной дифференцироваться одновременно в обе клеточные линии, не увенчались успехом [161]. Единственным стромальным компонентом, имеющим на этапе эмбрионального развития общее с кроветворными клетками происхождение (из мезангиобласта), является сосудистый эндотелий [93]. В костном мозге взрослого организма отдельно существуют стволовая кроветворная клетка и мезенхимальная стволовая клетка. Тем не менее интересным представляется ответ на вопрос: имеют ли место клональные нарушения в строме больных МДС? МСК костного мозга здоровых лиц способны формировать in vitro клеточные колонии в течение множества, по меньшей мере 10, пассажей, сохраняя при этом стабильный кариотип и не накапливая хромосомные мутации, являясь, таким образом, удобной моделью для изучения [3, 28, 169]. Однако МСК от больных МДС обладают ограниченной пролиферативной активностью.


Имеющиеся сведения о наличии хромосомных аномалий в стромальных клетках на примере МСК противоречивы и не позволяют сделать окончательные выводы. Описанные аномалии кариотипа МСК разнообразны и не отображают характерные для МДС изменения в кроветворных клетках. С другой стороны, опубликованы данные и об отсутствии клональных нарушений в МСК при МДС.

В таблице 5 представлены результаты исследования кариотипа МСК у больных МДС, опубликованные за последние годы:

Таблица Результаты цитогенетических исследований МСК %с Характеристика аномалий Автор, Число Диагноз аномалиями кариотипа МСК год больных кариотипа Число больных Вовлеченные клеток КМ (%), вид хромосомы аномалии МДС E.Flores- 11 7/11 5/9 (56%), -X, -1, -2, -3, -5, -8, клональные и Figueroa, (63%) -10, -11, -12, -13, неклональные 2005 [54] -14, -15, -17, -19, потери хромосом -20, -21, - (гипоплоидия) МДС O.Blau, 31 8/18 13/27 (48%) der(7), t(1;

7), структурные, 2007 [34] (18/31) (44%) t(1;

10), del(17p) клональные – 4/13 (30%), ОМЛ 8/ неклональные (13/31) (61%) t(7;

9), t(4;

7), 8/13 (62%) dic(6;

16), t(7;

19), t(15;

17), t(1;

3), del(2q), del(3p), del(11q), t(2;

13), численные -12, + неклональные - 1/13 (8%) МДС O.Blau, 94 16/43 15/94 (16%) t(1;

2), t(1;

6), клональные 2011 [33] (43/94) (37%) del(7q), t(3;

20), структурные inv(X), del(11q), ОМЛ 25/51 del(13q), del(15q) (51/94) (49%) клональные численные +5, -4, -X, -Y МДС L.-X. 22 13/22 14/22 (64%) -6, -7, -11, -12, -20, клональные, Song, 2012 (59%) -21, - численные, [143] потеря хромосомного материала (гипоплоидия) клональные структурные t(2;

11), dup(1) 2/14 (14%) В работах E.Flores-Figueroa с соавт. 54, 55 на небольшом количестве больных продемонстрировано, что у большинства наблюдались аномалии кариотипа МСК с потерей генетического материала как клональные, так и неклональные. Примерно у половины больных хромосомные нарушения МСК были выявлены в исследовании O.Blau с соавт. 34, в которое включен больной ОМЛ и МДС. Авторами отмечено, что чаще встречались аномалии 1, 7, 10 и 17 хромосом. В последующее исследование этих же авторов 33 были включены почти 100 пациентов;

клональные хромосомные нарушения в МСК обнаружены у 16%: они представлены как структурными (транслокации и делеции), так и численными (моносомии и трисомии) аномалиями, не связанными с возрастом больных, но ассоциированными с неблагоприятным кариотипом в общей популяции клеток костного мозга и с худшей выживаемостью больных. Также авторами не была получена какая-либо закономерность среди различных хромосомных аберраций МСК. В недавнем сообщении китайские исследователи выявили аномалии кариотипа МСК у 70% больных, которые включали комплексные нарушения с потерей генетического материала от нескольких хромосом [143]. Применение метода сравнительной геномной гибридизации позволяет выявить цитогенетические аномалии МСК у 100% больных МДС 100.

В то же время в ряде публикаций продемонстрировано отсутствие в МСК у больных МДС цитогенетических изменений [90, 129, 142]. Наряду с этим в исследовании M.Klaus с соавт. [90 подчеркнуто, что МСК от больных МДС соответствуют по дифференцировочному потенциалу (пластичности) МСК от здоровых доноров, но отличаются от них по пролиферативной активности – время удвоения количества клеток в культуре МСК больных значимо превышало таковое в контрольной группе здоровых лиц. V.Soenem-Cornu с соавт. [142] и A.Ramakrishman с соавт. [129] продемонстрировали одинаковую способность МСК больных МДС поддерживать длительную культуру гемопоэтических предшественниц, как содержащих, так и не содержащих хромосомные аберрации. S.Alvi с соавт. [19] указали, что характеристики МСК в длительной культуре не различаются у больных МДС и здоровых лиц.

Противоречивость характеристик МСК, отраженную в упомянутых выше исследованиях, можно объяснить гетерогенностью включенных больных с учетом клинических вариантов МДС и групп риска;

разным сроком длительности состояния хронического воспаления в строме костного мозга, обусловленного заболеванием;

различиями в методах исследования и, соответственно, в интерпретации полученных результатов.

Таким образом, несмотря на большое число исследований, механизмы развития клонального кроветворения при МДС до сих пор до конца не изучены.

В обзоре литературных источников освещены основные сведения о патогенезе МДС, значимости цитогенетического исследования различных клеточных популяций как инструмента изучения биологии заболевания. Новые знания могут внести существенный вклад в формирование понимания механизмов патогенеза и послужить основой для разработки новых подходов к терапии МДС. Анализ частоты и спектра хромосомных аномалий как в гемопоэтических, так и в стромальных клеточных компонентах костного мозга при МДС представлен противоречиво. В связи с этим целью настоящей работы явился анализ хромосомных изменений в изолированных популяциях незрелых клеток – кроветворных CD34+ клеток-предшественниц и мезенхимальных стромальных клеток у больных МДС.

2. Материалы и методы 2.1. Дизайн исследования Проспективное исследование было начато в июле 2011 года и завершено в марте 2013 года. Дизайн исследования представлен на рисунке 2:

Доноры костного Больные МДС мозга (n=43) (n=7) Костный мозг Костный мозг (3-6 мл) Кровь (10 мл) (1-2 мл ) 1-2 мл 1-2 мл -выделение 1-2 мл выделение получение стандартное фракции получение фракции CD34+ культуры МСК, цитогенетическое CD34+клеток, культуры МСК, исследование, клеток, FISH СЦИ СЦИ, FISH FISH FISH Рисунок 2. Дизайн исследования Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБУ Гематологического научного центра МЗ РФ. Пациентами подписано информированное согласие с доступным изложением целей и значения, а также безопасности исследования.

Все больные, включенные в исследование, находились на этапе диагностики и установления варианта МДС. У пациентов имелся разной длительности анамнез снижения показателей крови, однако они не получали ранее специфическую терапию (химиотерапия, иммуномодулирующая терапия, трансплантация костного мозга) по поводу МДС. Пациентам проводили взятие костного мозга (стернальная пункция) и периферической венозной крови в стерильные контейнеры Vacuette с стандартным количеством антикоагулянта гепарина – Litium Heparin.

Цитогенетические исследования выполнены в кариологической лаборатории ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующая лаб. д. м. н. Е.В. Домрачева).

Выделение изолированной фракции CD34+ клеток-предшественниц костного мозга и периферической крови выполнено в кариологической лаборатории ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Получение культуры МСК костного мозга осуществлено в лаборатории физиологии кроветворения ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующая лаб. д.

б. н. Н.И. Дризе).

2.2. Характеристика больных В исследование включены 43 больных, 20 мужчин и 23 женщины.

Медиана возраста составила 59 лет (от 19 до 77 лет). Распределение по вариантам заболевания следующее: МДС – 36 больных (РA – 2, РАКС – 3, МДС с del(5q) – 3, РЦМД – 14, РАИБ1 – 5, РАИБ2 – 9), ОМЛ из предшествующей миелодисплазии – 7 больных. У двух из указанных больных (РАИБ-2 и ОМЛ) был онкологический анамнез и проводилась химиотерапия по поводу второй опухоли (вторичный МДС и ОМЛ).

Контрольную группу составили 7 здоровых доноров костного мозга и больных лимфопролиферативными заболеваниями (диффузная В крупноклеточная лимфома – 2, лимфогранулематоз – 2).

Обследование и клиническое ведение большинства больных осуществлено в научно-клиническом отделе высокодозной химиотерапии, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга (руководитель д. м. н. Е.Н.

Паровичникова) и в поликлиническом отделении (заведующая д. м. н. А.Л.

Меликян) ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Разработка дизайна исследования, научная и клиническая часть работы выполнена совместно с ведущим научным сотрудником отделения химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения к. м. н. А.В. Кохно.

Вариант заболевания устанавливали на основании критериев классификации ВОЗ Пациентам проводился анализ показателей [146].

гемограммы, цитологическое, цитохимическое и цитогенетическое исследования пунктата костного мозга и гистологическое исследование трепанобиоптата подвздошной кости.

Характеристика включенных больных представлена в таблице 6:

Таблица Характеристика больных Медиана Средняя длительность Диагноз Пол, м/ж возраста, годы цитопении, месяцы МДС, n =36 17/19 59 (29-77) 45 (1-450) ОМЛ из МДС, n=7 3/4 64 (19-77) 6 (1-12) 2.3. Лабораторные исследования 2.3.1. Получение фракции мононуклеаров Фракцию мононуклеаров получали из аспирата костного мозга и CD34+ периферической крови перед селекцией кроветворных клеток предшественниц и культивированием МСК. Клетки выделяли в градиенте 1, г/см3 плотности фиколла (Lympho Separation Medium – LSM, ICN Biomedicals, USA) при 1500 об/мин в течение 35 минут. Пипеткой собирали кольцо из мононуклеаров и отмывали от фиколла добавлением среды RPMI 1640 (Sigma, USA) или MEM (HyСlone, USA). Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут, процедуру повторяли 3 раза.

2.3.2. Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови CD34+ Получение клеток проводили методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием моноклонального антитела к CD34 (MicroBead kit, Miltenyi Biotec, Germany).

Фракция мононуклеарных клеток из костного мозга и периферической крови была пропущена через пресепарационный фильтр для устранения склеивания и закупорки магнитной колонки. Выполняли подсчет количества клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь пропускали через помещенную в магнитное поле и предварительно смоченную буферным раствором колонку.

После удаления негативной немеченой антителом фракции клеток в эпендорф собирали позитивную фракцию.

Для пробы с количеством мононуклеаров до 2х108 использовали колонку MS MACS Column с соответствующим количеством буфера. Буферный раствор готовили из фосфатно-солевого буфера с pH=7,2, 0,5% бычьего альбумина, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), разведенной в основном растворе (MACS BSA Stock Solution) 1:20 с раствором auto MACS Rinsing Solution.

Использовали дегазированный буферный раствор.

Контроль чистоты полученной фракции клеток был выполнен методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител анти-CD34 PE и анти-CD45-FITS (BD, USA). Чистота полученной фракции составила 94,5%.

Результат представлен на рисунке 3:

Рисунок 3. Контроль чистоты изолированной популяции CD34+ клеток с помощью проточной цитометрии Полученную суспензию клеток осаждали при 1000 об/мин в течение минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной (960) кислоты с метиловым спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Фиксированный клеточный осадок распыляли на поверхность адгезивного стекла с помощью цитоспина Shandon Cytospin 4 (Thermo scientific, USA) со скоростью 1000 об/мин в течение 8 минут. Далее выполняли исследование методом FISH.

2.3.3. Получение культуры МСК Для получения МСК использовали аспират костного мозга.

Мононуклеарную фракцию ресуспендировали в стандартной среде для -МЕМ культивирования, состоящей из среды (HyClone, USA), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, USA), 2 мМ L-глутамина (BioWest)), 100 ед/мл пенициллина (Ферейн, Россия) и 50 ед/мл стрептомицина (Ферейн, Россия). Клетки рассаживали в концентрации 1-8x106 клеток во флаконы для культивирования с площадью дна 25 и 75 см2 (Costar) и культивировали в 5% CO2 в воздухе при t=37С. После образования конфлюэнтного монослоя клетки промывали раствором версена (0,02% раствор ЭДТА в физиологическом растворе (Sigma)), а затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина (ICN) и пассировали в концентрации 4x10 3 клеток на 1 см поверхности дна флакона. В работе использовали клетки после 2-3 пассажей (в двух случаях – после 4 и в двух случаях – после 5 пассажей), за которые происходило истощение кроветворных клеточных элементов, и достигалась чистая культура фибробластов. За 16-24 часа до снятия клеток во флакон добавляли колхицин или колцемид в количестве, необходимом для достижения конечной концентрации в среде 1 г/мл. МСК снимали с флаконов 0,05% трипсином. Количество снятых со дна флакона клеток подсчитывали в камере Горяева, их жизнеспособность определяли по отсутствию окраски трипановым синим.

Следующим этапом готовили цитогенетический осадок. Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут и проводили гипотоническую обработку 0,55% (0,07М) раствором калия хлорида в инкубаторе при t=370С в течение минут. Гипотонию прерывали добавлением 0,5 мл 5% уксусной кислоты и осаждали клетки при 1000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной кислоты с метиловым (960) спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Взвесь клеток с небольшом количеством фиксатора хранили в холодильнике при t=-180С до проведения цитогенетических исследований.

Все клетки имели характерную для фибробластов веретеновидную форму.

МСК были охарактеризованы иммунофенотипически на наличие маркеров МСК моноклональными антителами к CD73, CD90, CD105 (BD) и на отсутствие маркеров гемопоэтических клеток антителами к CD45 (Sigma), CD34, CD (BD), HLA-DR (DAKO). Была подтверждена способность полученных МСК к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro.

2.3.4. Стандартное цитогенетическое исследование Суспензию исследованных клеток (общая популяция костного мозга, МСК) наносили пастеровской пипеткой на предварительно смоченное дистиллированной водой предметное стекло с расстояния 15-20 см для лучшего «разбрасывания» хромосом. Стекло промывали фиксатором и высушивали на термоплато при t=650С.

окраску хромосом осуществляли по G-дифференциальную модифицированной методике M.Seabright [138]. Цитогенетические препараты помещали в сухожаровый шкаф при t=950С на 35 минут. Далее стекла погружали на 3-5 сек в 0,025% раствор трипсина (Sigma) с последующим двукратным отмыванием в физиологическом растворе. Стекла окрашивали красителем Wright (Merck, Germany) в течение 1-1,5 минут и сушили под проточным воздухом. Цитогенетическое исследование МСК выполняли по методу, описанному Z.Zhang 169.

Хромосомный анализ проводили под иммерсионным объективом (увеличение 12,5х100). Подсчитывали 20 метафаз. Кариотип анализировали в соответствии с критериями Международной цитогенетической номенклатуры [80]. Клональной считали структурную аномалию и трисомию при обнаружении минимум в двух метафазах и моносомию – минимум в трех. При обнаружении структурной перестройки в одной метафазе ее обозначали как неклональную (спонтанную). Единичные неполные митозы могли не учитываться как неклональные аномалии ввиду возможности потерь хромосом при обработке клеточного осадка.

2.3.5. Флюоресцентная in situ гибридизация Для постановки FISH-исследования использовали следующие ДНК-зонды:

– LSI (5q31-q34) EGR-1 SpectrumOrange / D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe (VysisAbbott, USA) для выявления делеции и моносомии 5;

– LSI (7q31) SpectrumOrange / CEP 7 SpectrumGreen Probe для выявления делеции и моносомии 7;

– CEP 8 SpectrumOrange DNA ProbeKit к центромере 8 для выявления моносомии и трисомии;

– LSI AML1 / ETO Dual Color Fusion Translocation Probe для выявления транслокации (8;

21)(q22;

q12-q21) и моносомии 21;

– CEP X SpectrumOrange / CEP Y SpectrumGreen DNA Probe для выявления моносомии и трисомии X, +Y;

– LSI D20S108 (20q12) SpectrumOrange Probe для выявления делеции и моносомии 20;

– EVI t(3;

3),inv(3)(q21;

q26) Break Dual-Color Probe (Kreatech Diagnostics®) для выявления inv(3)(3q26).

Суспензию клеток наносили на предметное стекло. Под световым микроскопом определяли области нанесения зонда. Зонд предварительно готовили путем разбавления буферным раствором и дистиллированной водой согласно инструкции производителя. На стекло наносили 1,5 л готового зонда, накрывали покровным стеклом и заклеивали. Денатурацию и гибридизацию проводили в приборе TermobriteTM Slide Hybridization / Denaturation System (Abbott), время денатурации – 2 минуты при t=740С, время гибридизации – 16- часа при t=370С. После завершения гибридизации с предметного стекла снимали клей и покровное стекло, затем препарат обрабатывали с целью удаления избытка зонда:

1) в течение 2-х минут, поместив стекло в емкость с раствором 0,4 SSC / 0,3%NP-40 (SSC – Abbott) в паровой бане при t=730С;

2) в течение 1-й минуты в растворе 2 SSC / 0,1%NP-40 при комнатной температуре.

После высушивания на препарат наносили раствор DAPI II (Abbott) и накрывали покровным стеклом.

Анализ сигналов проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Zeiss-Axioscope (Germany) с использованием тройного фильтра Orange / Green / Dapi. Для каждого зонда анализировали по 200 интерфазных ядер с четкими сигналами.

Границы нормальных значений процента позитивных ядер для каждого зонда были определены по формуле + 3, где – среднее по совокупности, равное (n1+n2+n3+n4+n5)/5, – стандартное отклонение, равное [(n1-)2+(n2 )2+(n3-)2+(n4-)2+(n5-)2]/(5-1). Анализировали 1000 ядер мононуклеарных клеток периферической крови от 5 здоровых доноров, n1, n2, n3... и т.д. – количество ядер, содержащих аномалию, у первого, второго, третьего… и т.д.

доноров.

Границы нормы для используемых зондов:

– LSI (5q31-q34). G – зеленый, центромера, R – красный, регион 5q31.

Норма 2G2R, 1G1R – до 2,2% (если превышает – моносомия 5), 2G1R – до 5,7% (если превышает – делеция 5q31);

– LSI (7q31). G – зеленый, центромера, R – красный, регион 7q31. Норма 2G2R, 1G1R – до 2,2% (если превышает – моносомия 7), 2G1R – до 5,7% (если превышает – делеция 7q31);

– CEP 8. R – красный, центромера. Норма 2R, 1R – до 9% (если превышает – моносомия), 3R – до 0,8% (если превышает – трисомия 8);

– LSI AML1 / ETO. G – зеленый, ген AML (21q12-q21), R – красный, ген ETO (8q22), Y – сливной сигнал. Норма 2G2R, 1G1R2Y – 0% (если превышает – t(8;

21)), 3G2R – до 0,8% (если превышает – трисомия 21);

– CEP X / Y. G – зеленый сигнал, регион Yq12 хромосомы Y, R – красный сигнал, центромерный регион хромосомы X. Норма (мужчины) – 1G1R;

1R – до 0,5% (если превышает – потеря хромосомы Y), 2G1R – до 0,5% (если превышает - добавочная хромосома Y). Норма (женщины) – 2R;

1R – до 0,5% (если превышает – моносомия Х), 3R – до 0,5% (если превышает – трисомия X);

– LSI (20q12). R – красный сигнал, регион 20q12. Норма – 2R;

1R – до 5,7% (если превышает – делеция 20q12);

– EVI t(3;

3),inv(3)(q21;

q26). F – сливной сигнал (регион 3q26). Норма – 2F;

1F1G1R – до 2% (если превышает – inv(3)).



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.