авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации ...»

-- [ Страница 2 ] --

2.4. Статистический анализ Статистический анализ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории биостатистики ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующий – к. т. н. С. М. Куликов). Оценка достоверности различий между группами осуществлялась с использованием методов описательной статистики, парного и непарного t-тестов, анализа кривых выживаемости. Корреляционный анализ проводили методом попарной корреляции Пирсона. Результаты оценивались статистически значимыми при р 0,05. Данные представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения, медианы с указанием минимального и максимального значений.

Результаты были обработаны с помощью статистического пакета SAS и R.

3. Результаты и обсуждение 3.1. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга Всем 43 пациентам, включенным в исследование, выполнено кариотипирование клеток костного мозга. При стандартном цитогенетическом исследовании нормальный кариотип определен у 23 (53,5%) из 43 больных, у одного из них выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9 – inv(9)(p13q21), у 16 (37,2%) больных выявлены аномалии кариотипа и у 4 (9,3%) больных исследование не выполнено вследствие отсутствия достаточного количества или удовлетворительного качества митозов. Среди выявленных аномалий преобладали изолированные хромосомные аберрации – у 9 (56,3%) из 16 больных: делеция 5q, моносомия 7, изохромосома 14 и инверсия хромосомы 3;

у 2 (12,5%) больных выявлено сочетание 2 аномалий: делеции 5q с моносомией 7 и трисомии Х с моносомией 7;

и у 5 (31,2%) больных определены комплексные нарушения кариотипа: 3 и более аномалии.

Следующим этапом применили метод FISH у пациентов с хромосомными аномалиями с целью их подтверждения. У пациентов с нормальным кариотипом или отсутствием митозов выполняли FISH-исследование с ДНК-зондами к хромосомам 5, 7 и 8 с целью возможного выявления «скрытых» аномалий в указанных хромосомах. Зонды к данным цитогенетическим маркерам выбраны с учетом наиболее распространенных и клинически значимых аномалий при МДС [10, 68, 72, 136, 146].

У 7 (16,3%) из 43 больных с помощью FISH-исследования выявлены скрытые хромосомные аномалии, которые не были определены при кариотипировании. У двух из них (пациенты 012 и 014) при стандартном исследовании не были получены митозы, и методом FISH выявлены: в первом случае – одновременно del(5q) и del(7q) в 84% клеток, во втором – трисомия 8 в 67% клеток. У 4 больных определен нормальный кариотип, однако с помощью FISH-исследования у двух из них (пациенты 003 и 040) выявлена del(5q) в 75% и 67% клеток, соответственно;

у одного больного (036) выявлена моносомия 7 в 45% клеток и у одной больной (033) – трисомия 8 в 19% клеток. Еще у больного (028), у которого в кариотипе определена изолированная del(5q), FISH анализ позволил выявить дополнительно трисомию 21 в 52% клеток. Таким образом, количество больных с аномалиями кариотипа увеличилось с 16 (37,2%) до 22 (51,2%). Число больных без хромосомных аномалий в клетках костного мозга составило 21 (48,8%). Распределение выявленных аномалий по прогнозу согласно шкале IPSS-R было следующим: аномалии очень хорошего прогноза не были выявлены ни в одном случае;

у 6 (27,3%) больных выявлены аномалии хорошего прогноза (нормальный кариотип, del(5q) изолированно и в сочетании со второй аномалией);

у 3 (13,6%) больных определены аномалии промежуточного прогноза (i(14) и +8);

у 9 (40,9%) больных – аномалии плохого прогноза (3 аномалии, -7/del(7q) изолированно и в сочетании со второй аномалией, inv(3)) и у 4 (18,2%) больных определены аномалии очень плохого прогноза (более 3 аномалий). Результаты цитогенетических исследований общей популяции клеток костного мозга представлены в таблице 20 (приложение 1).

Известно, что стандартное цитогенетическое исследование является классическим подходом для проведения хромосомного анализа с целью выявления аномалий кариотипа. Исследование входит в перечень необходимых процедур на этапе диагностики МДС [10, 68, 69, 72, 146]. Тем не менее в некоторых случаях получение митозов в культуре клеток костного мозга представляет трудность, клетки с нормальным кариотипом получают преимущество при культивировании перед клонально-измененными опухолевыми клетками, и их митотическая активность начинает преобладать, либо качество митозов в препаратах оказывается недостаточным для проведения анализа. Метод флюоресцентной in situ гибридизации обладает рядом преимуществ перед стандартным исследованием, так как при его выполнении достаточно наличия интерфазных ядер, а, следовательно, нет зависимости от успехов в культивировании клеток. Применение метода FISH дополнительно к стандартному цитогенетическому исследованию способствует определению скрытых хромосомных аномалий, не выявленных при кариотипировании, по разным данным, у 6-18% больных МДС [30, 89, 102, 133].

В нашей работе показано, что после выполнения FISH-исследования дополнительно к стандартному исследованию кариотипа в 16,3% случаев удалось выявить хромосомные аберрации, не определенные при кариотипировании. Количество больных с цитогенетическими аномалиями в клетках костного мозга после применения двух диагностических методов составило 22 (51,2%) из 43, что соответствует частоте встречаемости хромосомных аберраций у пациентов с МДС в дебюте заболевания [10, 68, 72, 146, 136]. Среди больных с изменениями кариотипа изолированная аномалия выявлена у 13 (59,1%) больных, сочетание 2 аномалий – у 4 (18,2%) больных и комплексные нарушения кариотипа – у 5 (22,7%) больных.

Таким образом, стандартное цитогенетическое исследование позволяет выявить хромосомные аномалии в клетках костного мозга у пациентов с МДС в дебюте заболевания и является основным методом их диагностики. В некоторых случаях целесообразно выполнение дополнительно к стандартному методу FISH исследования с целью определения скрытых поломок.

3.2. Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R 36 пациентов с МДС были стратифицированы на группы риска в зависимости от результатов цитогенетического исследования, количества бластных клеток в костном мозге, варианта заболевания, показателей гемограммы и наличия трансфузионной зависимости в соответствии с критериями прогностических шкал IPSS, WPSS и IPSS-R. Больным с вторичным МДС и больным, у которых при стандартном цитогенетическом исследовании не были получены митозы и методом FISH «скрытые» аномалии не выявлены, группа риска не определялась. Результаты представлены в таблице (приложение 1).

Из 11 больных с низким риском по шкале IPSS у 3 по шкале WPSS определен очень низкий риск, у 6 – низкий и у 2 – промежуточный;

по шкале IPSS-R распределение было следующим – у 10 больных подтвержден низкий риск и у 1 больного определен промежуточный риск.

10 больных согласно шкале IPSS отнесены к промежуточному-1 риску;

по шкале WPSS 1 больной отнесен к очень низкому риску, 2 больных – к низкому, – к промежуточному и 3 – к высокому риску;

по шкале IPSS-R у 3 больных определен низкий риск, у 5 больных – промежуточный и у 2 – высокий риск.

У 9 больных в соответствии с критериями шкалы IPSS определен промежуточный-2 риск;

согласно шкале WPSS у 1 из них определен промежуточный риск, у 7 – высокий риск и у 1 больного – очень высокий риск;

по шкале IPSS-R у 2 больных подтвержден промежуточный риск, 6 больных отнесены к категории высокого риска и 1 больной – к категории очень высокого риска.

Высокий риск по шкале IPSS установлен 4 больным;

в соответствии со шкалами WPSS и IPSS-R все больные были отнесены к категории очень высокого риска.

Основные изменения в прогнозе у больных в соответствии с разными шкалами были определены в категории промежуточного риска. Так, по шкале IPSS эта группа (промежуточный-1 и промежуточный-2 риск) составила 19 из больных, тогда как для WPSS – 7 и для IPSS-R – 8 больных. Распределение больных в группу более низкого или более высокого риска осуществлено в первом случае за счет наличия или отсутствия зависимости от гемотрансфузий, во втором – за счет прогностического значения аномалий кариотипа, градации цитопенического синдрома и количества бластных клеток в костном мозге.

У двух больных (015 и 016) были выявлены комплексные аномалии кариотипа – более 3 аномалий. Согласно шкале IPSS-R такие изменения кариотипа отнесены к очень плохому прогнозу, и, следовательно, у пациента группа риска была изменена с промежуточного-2 на очень высокий, а у пациента 016 – с промежуточного-2 на высокий. У пациентки 022 определена инверсия хромосомы 3, которая перемещена из категории промежуточного в категорию плохого прогноза. Тем не менее у больной подтвержден промежуточный риск и по новой шкале.

Всего у 25 из 34 больных группа риска по трем прогностическим шкалам различалась, у 9 из них прогноз совпадал. У двух больных категория риска была изменена согласно шкале IPSS-R на более высокий вследствие прогностического значения кариотипа.

В таблице 7 приведена сравнительная характеристика лабораторных показателей и частоты хромосомных аномалий у пациентов разных групп риска по шкале IPSS-R:

Таблица Показатели периферической крови и частота хромосомных аномалий у больных разного риска по шкале IPSS-R Число Число Л АЧН Гем Тр больных с Риск больных медиана медиана медиана медиана хромосомным (разброс) (разброс) (разброс) (разброс) и аномалиями (%) (%) Очень 0 (0,0%) низкий - - - - Низкий 13 (38,3%) 3,7 2 89 207* 3 (23,1%)* (2,3-7,6) (0,8-5,0) (68-138) (46-710) Промежу- 8 (23,5%) 3,1 1,7 75 130 4 (50,0%)* точный (2,2-5,8) (0,9-4,4) (61-120) (10-309) Высокий 8 (23,5%) 3,8 2,2 85 55 5 (62,5%)* (2,7-7,7) (0,1-4,8) (59-103) (34-134) Очень 5 (14,7%) 2,2 0,6* 87 39 5 (100%)* высокий (2,0-3,3) (0,2-1,7) (70-92) (6-79) *p0,05 *p0,05 *p0, Примечание: Л – лейкоциты;

АЧН – абсолютное число нейтрофилов;

Гем – гемоглобин;

Тр – тромбоциты;

Как видно из таблицы, количество больных преобладало в группе низкого риска – 13 (38,3%), ни один больной не был определен в группу очень низкого риска. Наблюдалось четкое увеличение частоты хромосомных аберраций с повышением группы риска: в группе низкого риска аномалии кариотипа определены всего у 23,1% больных, все они имели благоприятный прогноз (del(5q) изолированно или в сочетании со второй аномалией);

а в группе очень высокого риска хромосомные аномалии выявлены у 100% больных, среди аномалий в этой группе были -7/del(7q) и комплексные нарушения кариотипа.

Наличие хромосомных аномалий достоверно влияло на распределение больных по группам риска (p0,05). Также закономерно прослеживалось усугубление цитопенического синдрома у больных высокого и очень высокого риска в сравнении с группами более благоприятного прогноза. Выявлено достоверное отличие абсолютного числа нейтрофилов (АЧН) в группе очень высокого риска и количества тромбоцитов – в группе низкого риска (p0,05).

В таблице 8 представлено распределение больных по группам риска после проведения стандартного исследования кариотипа и после применения дополнительно к нему FISH-исследования:

Таблица Распределение больных на группы риска по шкале IPSS-R после проведения стандартного цитогенетического исследования и после применения FISH Количество больных Группа риска СЦИ, n=32 СЦИ+FISH, n= Очень низкий 0 (0,0%) 0 (0,0%) Низкий 13 (40,6%) 13 (38,3%) Промежуточный 7 (21,9%) 8 (23,5%) Высокий 8 (25,0%) 8 (23,5%) Очень высокий 4 (12,5%) 5 (14,7%) Группа риска не 3* 1** определена Примечание: * больные, у которых при СЦИ не получены митозы;

** больной, у которого после применения FISH цитогенетические маркеры не выявлены Как видно из таблицы, после проведения кариотипирования 3 больных не представлялось возможным стратифицировать на группы риска вследствие отсутствия данных цитогенетического исследования (не получены митозы), тогда как после выполнения дополнительно FISH-исследования у 2 из них были выявлены цитогенетические аномалии, позволившие определить одного больного в группу промежуточного риска и одного больного – в группу очень высокого риска.

Таким образом, все три прогностические шкалы риска функциональны и могут быть использованы в клинике для стратификации больных МДС на группы риска. Шкала IPSS-R позволяет более четко распределить больных МДС по группам риска в соответствии с прогностическим значением кариотипа и цитопеническим синдромом.

3.3. Результаты динамического наблюдения за больными МДС Время наблюдения за больными составило от 2,3 до 21 месяца (медиана 11,6 месяцев). Больным в зависимости от варианта заболевания применяли следующие виды терапевтического воздействия: сопроводительная терапия (заместительные гемотрансфузии, витаминотерапия), ростовые факторы (эритропоэтин), иммуномодулирующая терапия (леналидомид), химиотерапия (малые дозы цитозара, «7+3»), эпигенетическая терапия (азацитидин) и трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Данные представлены в таблице 9:

Таблица Лечение больных Вид лечения Количество больных Сопроводительная терапия (гемотрансфузии, витамины группы В) Ростовые факторы (ЭПО) Иммуномодулирующая терапия (леналидомид) Гипометилирующая терапия (азацитидин) Химиотерапия (малые дозы Ara-C, «7+3») Алло-ТГСК Отказ от лечения Учитывая разнородность проводимой терапии, нам не удалось получить сопоставимые группы для анализа долгосрочного прогноза. Общая выживаемость больных в группе в целом составила 82%, как представлено на рисунке 4:

. Cum. Survival... 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22. Time Рисунок 4. Общая выживаемость больных МДС, включенных в исследование За время наблюдения умерли 5 больных, все – от прогрессии в ОЛ.

Цитогенетические аномалии выявлены у 18 (50%) из 36 больных МДС.

Была проанализирована общая выживаемость в зависимости от выявления хромосомных нарушений в клетках костного мозга. Графики выживаемости представлены на рисунке 5:

. Cum. Survival есть аномалии.. нет аномалий. 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22. Time Рисунок 5. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от выявления аномалий кариотипа В нашем исследовании общая выживаемость среди больных с аномалиями и без аномалий кариотипа не отличалась, по-видимому, из-за небольшой длительности наблюдения, разнородности и малочисленности групп. Наличие хромосомных аномалий достоверно не увеличивало вероятность трансформации МДС в ОМЛ (p=0,68) Больные были распределены в группы прогноза по шкале IPSS-R. Для определения общей выживаемости в зависимости от группы риска больные высокого и очень высокого риска объединены;

таким образом были сформированы группа низкого (n=12), промежуточного (n=9) и высокого (n=12) риска. Графики выживаемости представлены на рисунке 6:

. Cum. Survival... 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22. Time низкий риск промежуточный риск высокий риск Рисунок 6. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от группы риска по шкале IPSS-R Как видно из рисунка, все больные из группы низкого риска были живы в течение периода наблюдения. В группе с промежуточным риском умерли двое и в группе с высоким риском – трое больных. Учитывая, что смерти зафиксированы в группах промежуточного и высокого риска, мы проанализировали выживаемость больных, объединив эти две группы в одну.

Графики представлены на рисунке 7:

. Cum. Survival низкий риск. высокий риск.. 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22. Time Рисунок 7. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от группы риска по шкале IPSS-R Как видно из графика, выживаемость больных в группе низкого риска составила 100%, а в группе промежуточного/высокого риска – 66% (p=0,07).

Несмотря на отсутствие достоверных различий, очевидно, что выживаемость лучше у больных из группы низкого риска.

Недостаточные сроки наблюдения за больными, разнородные и немногочисленные группы не позволяют сделать окончательные выводы. С этим связаны высокие показатели выживаемости и отсутствие влияния аномалий кариотипа на выживаемость. Смерти зафиксированы в группах промежуточного и высокого риска, тогда как в группе низкого риска все больные были живы.

3.4. Характеристика CD34+ клеток-предшественниц, полученных из костного мозга и периферической крови 3.4.1. Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови По данным литературы у здоровых лиц в костном мозге содержится примерно 1,5% и в периферической крови – до 0,5% CD34+ гемопоэтических клеток-предшественниц [47, 58, 157]. У пациентов с МДС количество CD34+ клеток увеличено как в костном мозге, так и в периферической крови вследствие задержки созревания миелоидных и лимфоидных предшественниц, а также увеличения количества бластных клеток [47, 58, 110, 116, 157].

С помощью проточной цитометрии было подсчитано процентное содержание CD34+ клеток в популяции CD45+ клеток лимфоцитарной, моноцитарной и гранулоцитарной клеточных линий у 12 пациентов: РАИБ – 8, РЦ (МДС с del(5q) и РЦМД) – 4. Результаты представлены в таблице 10:

Таблица Процент CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови у больных МДС, здоровых доноров и больных лимфопролиферативными заболеваниями Процент CD34+ Процент CD34+ Процент бластных клеток КМ клеток КМ клеток ПК РАИБ+РЦ (n=12) 8,4305,430 5,1083,855* 1,5101,400* (0,400-18,200) (0,700-13,400) (0,02-4,30) Доноры КМ 1,114±0, - 0,023±0, (n=5) (0,591-2,109) (0,009-0,033) Больные ЛПЗ - 0,918±0,863 0,007±0, (n=4) (0,260-2,10) (0,001-0,017) *p0,05 *p0, Примечание: КМ – костный мозг, ПК – периферическая кровь, РЦ – рефрактерная цитопения, РАИБ – рефрактерная анемия c избытком бластов;

ЛПЗ – лимфопролиферативные заболевания С учетом небольшой группы больных содержание CD34+ клеток анализировали без разделения по вариантам заболевания. Как видно из таблицы, CD34+ клеток-предшественниц в группе больных МДС среднее содержание составило 5,11% (0,70-13,40) в костном мозге и 1,51% (0,02-4,30) – в периферической крови. Содержание CD34+ клеток у больных МДС было значимо больше, чем в контрольных группах здоровых доноров костного мозга и больных лимфопролиферативными заболеваниями как в костном мозге, так и в периферической крови (p0,05).

Во всех исследованных клеточных образцах в группе больных МДС имела место гетерогенность популяции CD34+ клеток по экспрессии антигена CD34, а также наблюдалась более интенсивная гранулярность в проекции бокового светорассеяния. На рисунке 8 (а, б) приведен пример подсчета количества CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови у пациента 036 с диагнозом МДС: РАИБ-2:

а) б) Рисунок 8. Пример подсчета CD34+ клеток у больного 036 костном мозге и периферической крови Примечание: а) костный мозг;

б) периферическая кровь На правой нижней картинке рисунков а) и б) прямоугольником очерчена фракция CD34+ клеток. Отсутствие четких границ между популяциями CD34+ и CD34- клеток (расположена внизу слева, зеленого цвета) говорит о гетерогенности популяции CD34+ клеток в отношении экспрессии антигена CD34, а высокое их расположение в проекции бокового светорассеяния (SSC) говорит патологической гранулярности. Описанные параметры могут отражать CD34+ иммунофенотипические признаки диспластических изменений в кроветворных предшественницах при МДС.

Следующим этапом было проведено сравнение количества бластных клеток в костном мозге и содержания CD34+ клеток-предшественниц в костном мозге. Значимой зависимости между этими показателями получено не было, однако корреляция не нулевая (индекс Пирсона 0,31, p=0,32). Что означает наличие тенденции к зависимости количества CD34+ клеток от количества бластных клеток в костном мозге и возможность достижения статистически достоверных результатов на большей выборке больных. Результаты представлены на рисунке 9:

Индекс Пирсона=0,31, p=0, Рисунок 9. Процент CD34+ клеток костного мозга в зависимости от количества бластных клеток Таким образом, показано, что у больных МДС количество CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови значимо больше по сравнению со здоровыми лицами и больными ЛПЗ. CD34+ клетки при МДС гетерогенны в отношении экспрессии антигена CD34 и имеют повышенную гранулярность цитоплазмы.

3.4.2. Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках С помощью стандартного цитогенетического исследования и метода FISH у 22 из 43 пациентов в общей популяции клеток костного мозга были выявлены аномалии кариотипа. У 16 из них выполнено FISH-исследование фракции CD34+ кроветворных клеток-предшественниц с соответствующими ДНК-зондами.

Хромосомные аберрации были выявлены у всех исследованных больных в CD34+ клетках как костного мозга, так и периферической крови.

Средний процент ядер с положительными флюоресцентными сигналами в общей популяции клеток костного мозга был несколько меньше, чем в CD34+ клетках, значения составили: 58,8123,99% – в общей популяции клеток костного мозга, 69,3026,35% – в CD34+ клетках костного мозга и 65,4026,65% – в CD34+ клетках периферической крови. Значимого различия размеров патологических клонов в этих клеточных популяциях получено не было, p=0,09, 0,33 и 0,11, соответственно. На рисунке 10 представлено распределение процента аномальных ядер в этих клеточных популяциях:

75 label BM cells % 50 CD34+cells BM CD34+cells PB 25 BM cells CD34+cells BM CD34+cells PB Рисунок 10. Средние значения процента ядер с положительными флюоресцентными сигналами в общей популяции клеток костного мозга и в CD34+ клетках Примечание: BM cells – клетки костного мозга;

CD34+ BM cells – CD34+ клетки, костный мозг;

CD34+ PB cells – CD34+ клетки, периферическая кровь У 6 больных выявлены существенные различия содержания аномальных ядер в общей популяции клеток костного мозга и их содержания в фракции CD34+ клеток. У 3 из них размер патологического клона в клетках костного мозга был значительно меньше, чем в CD34+ клетках: трисомия 21 в 25% ядер у пациентки 041, del(5q) в 27% ядер у пациента 029 и моносомия 7 в 45% ядер у пациента 036, в то время как в CD34+ клетках эти аномалии выявлены в 80%, 75% и 84% ядер, соответственно. У 3 пациентов, наоборот, среди CD34+ клеток количество клонально-измененных было меньше, чем в общей популяции: у пациентки 006 моносомия 7 выявлена в 60% клеток костного мозга, а в CD34+ клетках - всего в 26%;

у пациентки 022 inv(3) в общей популяции клеток костного мозга определена в 45% клеток, а в CD34+ клетках – в 25% (в костном мозге) и в 28% (в периферической крови);

и у пациентки 033 в общей популяции клеток был определен 19%-ный клон с трисомией 8, а в фракции CD34+ клеток – всего 5%-ный.

Интересным было распределение клонально-измененных клеток в разных клеточных фракциях еще у двух больных. У пациентки 032 при исследовании общей популяции клеток костного мозга выявлено 2 патологических клона – моносомия 7 (в 23% ядер) и трисомия X (в 20% ядер), причем эти клоны при стандартном исследовании определялись в разных клетках. Исследование CD34+ клеток показало наличие среди них такого же процента клеток с моносомией (26%), но отсутствие клона с трисомией X. Было проведено стандартное цитогенетическое исследование культуры фитогемагглютинин(ФГА) стимулированных лимфоцитов периферической крови, в которых определен нормальный кариотип;

трисомия X не была выявлена в лимфоцитах и методом FISH. Таким образом, конституциональный характер трисомии Х у этой пациентки не подтвержден. У другого больного (028) с del(5q) и трисомией при исследовании общей популяции клеток костного мозга также создавалось впечатление о наличии одновременно 2 клонов клеток. Так, при стандартном исследования определен только клон с del(5q), а клетки с трисомией отсутствовали. Результаты FISH-исследования были следующими: клон с del(5q) определен в 80% клеток, а с трисомией 21 – в 52%. Таким образом, часть клонально-измененных клеток содержали только del(5q), а остальные клетки – и del(5q), и трисомию 21. В то же время процент клеток, содержащих обе аномалии, в фракции CD34+ клеток был одинаковый – 70% клеток с del(5q) и 70% клеток с трисомией 21.

Такие существенные различия процентного соотношения клонально измененных клеток среди общей клеточной популяции костного мозга и изолированной фракции CD34+ предшественниц у этих больных обусловлены, вероятно, эволюцией патологических клонов.

Было проанализировано наличие зависимости между процентным содержанием клеток с аберрантным кариотипом во фракции CD34+ клеток и в общей популяции клеток костного мозга. Выявлена прямая корреляционная зависимость данных показателей (p0,05). Графики представлены на рисунке (а, б, в):

а) % in CD34+cells BM 20 30 40 50 60 70 80 % in BM cells Индекс Пирсона=0,62;

p0, б) % in CD34+cells PB 20 30 40 50 60 70 80 % in BM cells Индекс Пирсона=0,60;

p0, в) % in CD34+cells PB 20 40 60 % in CD34+cells BM Индекс Пирсона=0,98;

p0, Рисунок 11. Зависимость процента клонально-измененных ядер в общей популяции клеток костного мозга и среди CD34+ клеток Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки костного мозга;

б) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки периферической крови;

в) CD34+ клетки костного мозга и периферической крови Далее FISH-исследование изолированной фракции CD34+ клеток было выполнено у больных без аномалий кариотипа (n=21/43). С целью возможного определения малых или «скрытых» клональных нарушений на уровне кроветворных клеток-предшественниц у 17 из 21 больных исследование было выполнено с применением ДНК зондов к хромосомам 5, 7 и 8. У всех этих больных определено отсутствие, по крайней мере искомых, цитогенетических аномалий во фракции клеток-предшественниц.

Таким образом, в CD34+ клетках-предшественницах определяются те же аномалиями кариотипа, что и в общей популяции клеток костного мозга.

Процент клонально-измененных ядер среди общей популяции клеток костного мозга и CD34+ клеток, полученных как из костного мозга, так и из периферической крови, одинаков. Выявлена прямая корреляционная зависимость между величиной клона в этих клеточных популяциях. У пациентов без аномалий кариотипа «скрытые» хромосомные аберрации в CD34+ клетках предшественницах не выявлены.

3.4.3. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического варианта заболевания Среди пациентов с аномалиями кариотипа (n=16) в клетках костного мозга был 1 больной РА, 2 больных МДС с del(5q), 5 больных РЦМД, 6 больных РАИБ и 2 больных ОМЛ. Проанализировано содержание клонально-измененных ядер среди CD34+ клеток у больных в зависимости от варианта заболевания. Больные без увеличения бластных клеток в костном мозге были объединены в одну группу (РЦ), а больные с увеличением количества бластных клеток – в другую (РАИБ и ОМЛ). Результаты представлены в таблице 11:

Таблица Процент клонально-измененных CD34+ клеток у пациентов с разными вариантами заболевания Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией Диагноз КМ ПК РЦ (РА, 5q- и РЦМД), n=8 70,624,6 68,423, РАИБ и ОМЛ, n=8 67,330,3 62,130, p=0,79 p=0, Примечание: КМ – костный мозг, ПК – периферическая кровь, РЦ – рефрактерная цитопения, РА – рефрактерная анемия, 5q- – МДС с del(5q), РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией, РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов, ОМЛ – острый миелоидный лейкоз (стадия трансформации) Как видно из таблицы, величина патологического клона в CD34+ клетках, как костного мозга, так и периферической крови, не отличалась у больных с разными вариантами заболевания (без бластоза, с бластозом и в стадии трансформации).

3.4.4. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от их прогностической значимости Среди исследованных больных у 7 определены благоприятные хромосомные аномалии (del(5q)), у 8 больных - хромосомные аномалии промежуточного прогноза (моносомия 20, трисомия 21, трисомия 8, дополнительная Y хромосома) и у 5 больных – неблагоприятные аномалии (inv(3), моносомия 7). Было проведено исследование содержания клонально измененных CD34+ клеток у больных в зависимости от варианта хромосомных аномалий. Результаты представлены в таблице 12:

Таблица Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от прогностической значимости хромосомных аномалий Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией Вариант хромосомной аномалии КМ ПК Благоприятный, n=7 82,610,1 79,88, Промежуточный, n=8 60,228,8 57,926, Неблагоприятный, n=5 64,635,5 59,738, p=0,07 p=0,32 p=0,82 p=0,06 p=0,38 p=0, Как видно из таблицы, среди CD34+ клеток процент клонально измененных ядер с благоприятными аномалиями был выше, чем с аномалиями, имеющими промежуточный (p=0,07 – в костном мозге и p=0,06 – в периферической крови) и неблагоприятный прогноз (p=0,32 – в костном мозге и p=0,38 – в периферической крови). Однако эти различия не были достоверны.

3.4.5. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клеточности костного мозга При анализе гистологических препаратов трепанобиоптатов подвздошной кости увеличение клеточности костного мозга по сравнению с возрастной нормой определено у 8 больных, снижение клеточности и преобладание жирового костного мозга – у 5 больных и нормальная клеточность – у больного. Было проведено сравнение величины патологического клона в CD34+ клетках в зависимости от клеточного состава костного мозга. Для проведения анализа больные со сниженной и нормальной клеточностью костного мозга объединены в одну группу. Результаты представлены в таблице 13:

Таблица Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от клеточности костного мозга Процент CD34+ клеток с хромосомной Клеточность КМ аномалией КМ ПК Снижена/нормальная, n=6 52,729,7 53,229, Увеличена, n=8 74,224,0 70,023, p=0,16 p=0, Как видно из таблицы, клональные нарушения в CD34+ клетках более выражены у больных с гиперклеточным костном мозгом по сравнению с гипо- и нормоклеточным (p=0,16 – в костном мозге и p=0,26 – в периферической крови).

Однако эти различия статистически не достоверны, по-видимому, вследствие малой группы больных в анализе.

3.4.6. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге Коллагеновый фиброз оценивался морфологически при микроскопии гистологических препаратов костного мозга. Трепанобиопсия костного мозга выполнена у 39 больных. Обращала на себя внимание частая встречаемость признаков фиброза – у 13 (33,3%) из 39 больных. Необходимо отметить, что в костном мозге больных с цитогенетическими аномалиями фиброз встречался в 1,7 раз чаще, чем у больных без аномалий кариотипа – у 42,1% (8 из 19 больных) и у 25% (5 из 20 больных), соответственно (p=0,43).

Было проведено сравнение содержания клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от наличия фиброза в костном мозге. Результаты представлены в таблице 14:

Таблица Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от наличия/отсутствия фиброза в костном мозге Процент CD34+ клеток с хромосомной Фиброз аномалией КМ ПК есть, n=6 74,322,9 67,020, нет, n=8 62,529,8 62,529, p=0,36 p=0, Размер патологического клона среди CD34+ клеток не зависел от наличия фиброза и был одинаков у больных с наличием и отсутствием признаков фиброза в костном мозге.

Таким образом, в исследовании было показано, что выраженность клональных изменений в CD34+ кроветворных клетках-предшественницах не зависела от таких прогностических факторов как диагноз, кариотип, клеточность костного мозга и фиброз.

3.5. Характеристика МСК костного мозга 3.5.1. Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц Культура МСК получена у 36 из 43 больных;

у 4 больных не получен рост клеточной культуры и у 3 больных исследование не проводили. Сравнительная характеристика МСК больных и здоровых доноров представлена в таблице 15:

Таблица Сравнительная характеристика МСК костного мозга больных МДС и здоровых доноров Параметр Кол-во посаженных Время получения Группа Конфлюэнтность, клеток х106 подслоя (2 пассаж), % (разброс) дни (разброс) Больные (n=24) 6,4 (5,0-8,0) 50-100 46,6 (27-89) - митозы получены (n=18) 45,1 (27-89) - митозы не получены 51,3 (39-77) (n=6) Доноры (n=7) 8,2 (7,8-8,5) 100 33,8 (12-54) Как видно из таблицы, плотность клеточного подслоя (конфлюэнтность) на площади дна пластикового матраса у больных в большинстве случаев не доходила до 100%. Среднее время формирования монослоя у больных превышало время в контрольной группе здоровых доноров, составив 46,614,5 и 33,815, дней, соответственно.

На рисунке представлено сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных МДС и здоровых доноров:

p=0, Рисунок 12. Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных и доноров Достоверное различие темпов роста культуры МСК у больных МДС и здоровых доноров не получено (p=0,14). Несмотря на статистически не значимые отличия показателей динамики роста МСК, нельзя утверждать, что кинетика роста МСК больных МДС и здоровых лиц одинакова, так как проанализировано небольшое количество случаев, а также не были учтены больные, у которых клеточный монослой не сформировался (n=4).

Как представлено также в таблице 15, вследствие снижения пролиферативной способности МСК больных МДС в некоторых случаях не были получены митотически делящиеся клетки. Было проведено сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК в случаях получения достаточного количества анализируемых митозов и в случаях их отсутствия.

Результаты представлены на рисунке 13:

p=0, Рисунок 13. Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в культурах, в которых были получены и в которых отсутствовали митозы Примечание: больные группа 1 – митозы получены;

больные группа 2 - митозы отсутствовали Время получения культуры МСК в группе 1 (n=18, митозы получены) и группе 2 (n=6, митозы не получены) не различалось и составило 45,115,3 и 51,313,6 дней, соответственно (p=0,33).

3.5.2. Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза В анализ включены больные, у которых формирование конфлюэнтного монослоя достигнуто на втором пассаже (n=24). Распределение клинических вариантов заболевания было следующим: 1 больной РА, 2 больных РАКС, больных МДС с del(5q), 11 больных РЦМД, 2 больных РАИБ-1, 2 больных РАИБ-2 и 4 больных ОМЛ. Для сравнительного анализа больные с отсутствием бластоза в костном мозге (РА, РАКС, МДС с del(5q) и РЦМД) были объединены в одну группу, а больные с избытком бластных клеток (РАИБ-1 и РАИБ-2) и в стадии трансформации – в другую. Сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК у пациентов с разными вариантами заболевания представлено в таблице 16:

Таблица Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в зависимости от варианта заболевания Диагноз Время получения МСК, дни РЦ (РА, 5q-, РАКС и РЦМД), n=16 44,915, РАИБ и ОМЛ, n=8 50,213, p=0, Вариант заболевания (без бластоза, с бластозом и ОМЛ) не влиял на время роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК на втором пассаже было одинаковым (p=0,39).

Распределение по группам риска согласно шкале было IPSS-R следующим: больных группы низкого риска, 6 больных группы промежуточного риска, 3 больных высокого и 1 больной – очень высокого риска.

Мы сравнили среднее время получения культуры МСК у больных их разных групп риска. Больные с высоким и очень высоким риском были объединены:

Таблица Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в зависимости от группы риска Диагноз Время получения МСК, дни Низкий, n=10 46,913, Промежуточный, n=6 40,812, Высокий/очень высокий, n=4 44,215, p=0, Как видно из таблицы, время роста МСК не зависело от группы риска.

Далее проведен анализ связи между кинетикой роста МСК и морфологическими особенностями костного мозга.

При анализе гистологических препаратов костного мозга клеточность была снижена у 6 больных, соответствовала возрастной норме у 4 больных и превышала ее у 13 больных. Одному больному гистологическое исследование костного мозга не проводили. Было проанализировано время получения культуры МСК в зависимости от клеточности костного мозга. Для получения сопоставимых по количеству больных групп больные с гипо- и нормоклеточным костным мозгом были объединены. Результаты представлены в таблице 18:

Таблица Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных в зависимости от клеточности костного мозга Клеточность КМ Время получения МСК, дни Снижена/нормальная, n=10 52,5±16, Увеличена, n=13 39,8±7, p0, Клеточность костного мозга достоверно влияла на активность роста МСК в культуре. Выявлено, что у больных с гиперклеточным костным мозгом время получения конфлюэнтного монослоя было значимо меньше, чем у больных со сниженной и нормальной клеточностью (p0,05).

Наличие признаков коллагенового фиброза в трепанобиоптатах костного мозга в этой группе наблюдалось у 5 (21,7%) из 23 больных. В таблице представлены показатели времени получения культуры МСК у больных с и без признаков фиброза в костном мозге:

Таблица Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных с наличием и отсутствием фиброза в костном мозге Фиброз КМ Время получения МСК, дни есть, n=5 45,614, нет, n=18 44,412, p=0, Наличие морфологических признаков фиброза не влияло на показатели роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК у больных с фиброзом и без фиброза в костном мозге было одинаковым (p=0,86).

Известно, что МСК больных МДС имеют функциональные отличия от МСК, полученных у здоровых лиц [7-9, 63, 100, 137, 158]. В нашем исследовании показано, что МСК костного мозга больных МДС проявляли сниженную пролиферативную способность в культуре по сравнению с МСК, полученными в контрольной группе: конфлюэнтность менее 100%, увеличение времени формирования монослоя или его отсутствие, однако значимые различия в культурах МСК больных и здоровых лиц не получены. Выявлена обратная зависимость времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК от клеточности костного мозга. Клинический вариант МДС и наличие фиброза в костном мозге не влияли на темп роста культуры клеток.

Таким образом, рост МСК костного мозга больных был снижен в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. На скорость формирования конфлюэнтного подслоя МСК влияла клеточность костного мозга и не влияли клинический вариант заболевания и наличие фиброза.

3.5.3. Стандартное цитогенетическое исследование МСК Кариотипирование МСК выполнено у 27 из 36 больных (МДС - 23 и ОМЛ - 4) и у 7 здоровых доноров костного мозга. При анализе цитогенетических препаратов МСК от 9 больных не были получены делящиеся клетки либо качество/количество имевшихся митозов не было достаточным для проведения исследования. Результаты цитогенетического исследования МСК приведены в таблице 20 (приложение 1).

Нормальный кариотип определен у всех больных ОМЛ и у 21 больного МДС, у одного из которых (пациент 002) в кариотипе МСК определена конституциональная инверсия хромосомы 9. У 2 (9%) из 23 пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа МСК. У одного из них с конституциональной инверсией хромосомы 9 (пациент 009) выявлена неклональная транслокация в одной метафазе: 46,ХY,t(2;

22)(p10;

q11),inv(9)(p13q21)[1]/46,ХY, inv(9)(p13q21)[19]. У второго пациента (пациент 016) в кариотипе МСК выявлена клональная перестройка в 7 метафазах из 20:

46,ХY,add(2q)[7]/46,ХY[13]. В костном мозге у этого больного определены комплексные нарушения кариотипа. Исследование кариотипа общей популяции клеток костного мозга и МСК у этого больного представлено на кариограмме (рисунок 14 а, б):

а) Кариотип: 45-46,XY,-5,+mar ?del(13q21),der(19),add(?q13or ?p13),-20,+2mar б) Кариотип: 46XY,add(2)(q36) Рисунок 14. Кариотип клеток костного мозга и мезенхимальных стромальных клеток пациента Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга;

б) мезенхимальные стромальные клетки У обоих пациентов с выявленной в клетках костного мозга и МСК инверсией хромосомы 9 ее конституциональный характер был подтвержден исследованием кариотипа культуры ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови.

В МСК, полученных от здоровых доноров костного мозга, хромосомные аномалии не выявлены.

Таким образом, клональные аномалии кариотипа МСК выявлены всего у одного больного: структурная перестройка с вовлечением хромосомы 2.

Хромосомные нарушения МСК у этого больного были отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток костного мозга.

3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH Исследование выполнено у 11 больных: 2 – МДС с del(5q), 3 – РЦМД, 2 – РАИБ-1, 2 – РАИБ-2 и 2 – ОМЛ. У всех этих больных в клетках костного мозга были выявлены хромосомные аномалии: у 5 больных – изолированные del(5q), моносомия 7 и inv(3), у 2 больных – сочетание 2 аномалий (моносомия 7 и трисомия X, del(5q) и del(7q)) и у 4 больных – комплексные нарушения кариотипа. Размер клонов, исследованных в клетках костного мозга с использованием соответствующих ДНК-зондов, составил 20-85%.

При стандартном цитогенетическом исследовании МСК у 9 из 11 больных определен нормальный кариотип (у 1 из них выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9), у 1 больного – клональные аномалии кариотипа и у больного исследование не выполнено вследствие отсутствия митозов. При FISH анализе МСК были применены ДНК-зонды к выявленным в кроветворных клетках цитогенетическим маркерам. Ни в одном случае в МСК не были определены искомые хромосомные аномалии. Исключение составила пациентка 032, у которой в МСК было обнаружено 4% клеток с трисомией X. Как было указано выше, у данной пациентки в общей популяции клеток костного мозга выявлено 2 клона клеток – с моносомией 7 (в 23% ядер) и с трисомией Х (в 20% ядер);

при исследовании CD34+ клеток-предшественниц клон с моносомией определен в 26% ядер, а клон с трисомией Х отсутствовал;

при исследовании ФГА-стимулированных лимфоцитов крови определен нормальный кариотип.

Таким образом, учитывая отсутствие хромосомной аномалии (трисомии Х) в лимфоцитах периферической крови, ее конституциональный характер не был подтвержден. Оставалось неясным отсутствие клона с трисомией Х на уровне ранних кроветворных предшественниц, а также его наличие в культуре МСК. По всей видимости, у пациентки с моносомией 7 появление второго патологического клона (трисомии Х) произошло на уровне более зрелых клеток, на поверхности которых утрачен антиген CD34. В этом случае отсутствие трисомии Х в CD34+ клетках объяснимо. Вопрос о том, чем может быть обусловлен факт наличия трисомии Х в клетках стромы, оставался открытым, так как в литературе нам не встретились описания совпадения клональных нарушений в кроветворных и стромальных клетках при МДС [90, 129, 142].

Представляется возможным, что небольшой процент позитивных ядер (4%) в данном случае был обусловлен наличием примеси кроветворных клеток (макрофагов) в культуре МСК.

В нашем исследовании показано, что в МСК костного мозга не определяются хромосомные поломки, характерные для МДС. Это не противоречит данным литературы Наряду с отсутствием [129, 90].

специфических для кроветворных клеток аномалий, МСК проявляют генетическую нестабильность, выявляя другие аберрации [33, 34, 54, 55, 36, 100, В нашей работе в МСК у 2 (9,5%) из исследованных больных МДС 143].

выявлены структурные аномалии кариотипа (неклональная и клональная). Мы не наблюдали аномалии кариотипа МСК у больных в стадии трансформации в ОМЛ. В большинстве исследований описано преобладание потери генетического материала МСК (гипоплоидия, делеции, дериваты хромосом), тогда как методом сравнительной геномной гибридизации выявлено преимущественно увеличение генетического материала на различных хромосомах В нашем [100].

исследовании потери генетического материала МСК не были выявлены: у первого пациента определена неклональная (в одной метафазе) транслокация t(2;

22), у второго – появление дополнительного участка на длинном плече хромосомы 2 (клональная аномалия).

В литературе есть свидетельства о появлении в культурах МСК у здоровых лиц хромосомных аберраций в процессе культивирования in vitro, которые проявляются как на ранних (1-5-й), так и на более поздних пассажах [1, 14].

Тогда как в работах других исследователей продемонстрирована генетическая стабильность МСК при довольно длительном культивировании [15, 28]. Нельзя полностью исключить, что выявленные нами аномалии кариотипа у 2 больных не являются результатом трансформации in vitro, так как мы не исследовали кариотип МСК у этих больных на других пассажах. У первого больного кариотип оценивался после трех пассажей, а у второго – после двух, таким образом, культуры клеток не подвергались длительному культивированию.

Несовпадение хромосомных аномалий в популяциях кроветворных и стромальных клеток свидетельствует о том, что МСК не являются частью опухолевого клона при МДС. Этот факт не вызывает сомнение, учитывая отсутствие общей клетки-предшественницы кроветворной и мезенхимальной клеточных линий. В то же время клетки стромы костного мозга проявляют функциональную неполноценность у больных МДС (снижение пролиферативной активности, нарушение пластичности, аномальная экспрессия поверхностных маркеров и др.). Следовательно, наличие хромосомных аберраций наряду с нарушением процессов клеточного деления и дифференцировки подтверждают функциональную патологию стромы при МДС, что может иметь важное значение в патогенезе заболевания.

Таким образом, после применения двух методов цитогенетического анализа – стандартного цитогенетического исследования и FISH – в МСК костного мозга выявлены структурные (клональные и неклональные) аномалии кариотипа у 9,5% больных МДС. Хромосомные аномалии, характерные для популяции кроветворных клеток костного мозга, выявлены не были. У всех больных в стадии трансформации в ОМЛ определен нормальный кариотип МСК.

3.5.5. Клиническое наблюдение пациента с клональными нарушениями кариотипа МСК Представлена история заболевания пациента 016 (м, 1944 г.р.).

Диагноз МДС: РЦМД установлен в феврале 2012 года, длительность цитопении к моменту обследования – 2 месяца.

Обоснование диагноза:

– наличие общей слабости, фебрильной лихорадки – цитопенический синдром с зависимостью от гемотрансфузий. В общем анализе крови – гемоглобин 59 г/л, эритроциты 1,39х1012/л, лейкоциты 5,81х109/л, нейтрофилы 61%, моноциты 14%, тромбоциты 55х109/л – миелограмма – гипоклеточный костный мозг, бластные клетки 1,4%, гранулоцитарный росток 45% с признакми дисгранулоцитопоэза (диссоциация созревания, гипогранулярность цитоплазмы, псевдопельгеризм), эритроцидный росток 50% с признаками дизэритропоэза (мегалобластоидность хроматина, атипия ядер), мегакариоциты в сниженном количестве – гистологическое исследование трепанобиоптата костного мозга – клеточность костного мозга увеличена, расширение эритроидного ростка, среди элементов гранулоцитопоэза – преобладание промежуточных форм, мегакариоциты в достаточном количестве. Признаки дисмиелопоэза в трех ростках кроветворения, фиброз в костном мозге не выявлен – общее содержание CD34+ клеток в костном мозге - 4,5% – цитогенетическое исследование костного мозга – комплексные хромосомные поломки: 45-46ХY,-?5,-13,der(19),add(?q13or?p13),-20,+marх2, +mar?del(13q21)[15]/45-46ХYidem,+dmin [2]/46ХY[3]. Методом FISH выявлены – del(5q) в 74% и моносомия 20 в 70% ядер, результаты исследования представлены на рисунке 15 (а, б, в, г):

а) б) в) г) Рисунок 15. FISH-исследование общей попудяции клеток костного мозга, изолированных CD34+ клеток костного мозга и периферической крови и мезенхимальных стромальных клеток у пациента 016. ДНК-зонд - LSI (5q33-q34) EGR-1 SpectrumOrange/D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга, del(5q) выявлена в 74% ядер;

б) мезенхимальные стромальные клетки, del(5q) не выявлена;

в) CD34+ клетки из костного мозга, del(5q) выявлена в 70% ядер;

г) CD34+ клетки из периферической крови, del(5q) выявлена в 70% ядер;

На основании полученных данных обследования пациенту установлен диагноз: миелодиспластический синдром: рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией. Риск IPSS – промежуточный-2 (1,5 балла). Риск WPSS – высокий (4 балла). Риск IPSS-R – высокий (6 балла).

В течение 4 месяцев после установления диагноза пациент получал сопроводительную терапию, заместительные гемотрансфузии. В июне 2012 года в миелограмме отмечено увеличение количества бластных клеток до 16,3%, в гемограмме – трехростковая цитопения, бластемия до 17%. Наблюдалось прогрессирование заболевания. В июне начата терапия азацитидином в дозе мг/м2 подкожно в течение 7 дней. Межкурсовые перерывы были увеличены в связи с развитием глубокой цитопении и инфекционных осложнений (грам положительный сепсис, двусторонняя пневмония). В связи с наличием осложнений доза азацитидина со второго курса редуцирована на 50%. С июня по сентябрь 2012 года проведено 3 курса гипометилирующей терапии.

После завершения 3 курса терапии азацитидином происходило постепенное нарастание лейкоцитоза до 70х109/л. В пунктате костного мозга (сентябрь 2012 года) – 60% бластных клеток. Констатирована трансформация МДС в ОМЛ. Посткурсовой период осложнился повторным развитием двусторонней пневмонии с острой дыхательной недостаточностью, в связи с прогрессирующим течением которой пациент наблюдался в отделении реанимации и интенсивной терапии. Несмотря на массивную противомикробную терапию, объем поражения легочной ткани увеличивался, усугублялась степень дыхательной недостаточности, присоединились признаки полиорганной недостаточности и ДВС-синдрома. 16 октября 2012 года наступила смерть больного.

Резюмируя представленный клинический случай, у пациента с РЦМД через 4 месяца после установления диагноза наблюдалась прогрессия заболевания и развитие РАИБ-2. В дальнейшем отмечалась резистентность к проводимой терапии гипометилирующими препаратами, на фоне которой констатирована трансформация в острый миелоидный лейкоз и смерть от некупируемых инфекционных осложнений через 8 месяцев.


Основываясь на категории риска, ожидаемая продолжительность жизни у этого больного составила по шкале IPSS 12,5 месяцев (1,2 лет), по шкале WPSS – 19 месяцев (1,6 лет), по шкале IPSS-R – 18 месяцев (1,5 лет). Среднее время трансформации в ОМЛ (IPSS-R) – 17 месяцев (1,4 лет).

У пациента при исследовании МСК костного мозга выявлены клональные нарушения кариотипа – 30%-ный клон add(2q) (рисунок 14).

Известно, что выявление клональных нарушений кариотипа МСК ассоциировано с неблагоприятным кариотипом в кроветворных клетках костного мозга, а также с худшей выживаемостью больных [33]. В нашем исследовании у пациента с клональной аномалией в МСК в клетках костного мозга были выявлены комплексные нарушения кариотипа, а продолжительность жизни оказалась почти вдвое меньше предполагаемой. Однако, учитывая единичность наблюдения, делать окончательные выводы не представляется возможным.

Таким образом, присутствие клональных нарушений кариотипа в строме у больного с множественными хромосомными аберрациями в кроветворных клетках костного мозга, возможно, явилось дополнительным фактором, определившим резистентность к терапии, быструю трансформацию в острый лейкоз и короткую продолжительность жизни больного.

Заключение В исследовании представлен комплексный цитогенетический анализ разных клеточных популяций у больных МДС на этапе установления диагноза.

Показано количество и спектр хромосомных аномалий, выявляемых в общей популяции клеток костного мозга. Среди включенных больных 22 (51,2%) имели клональные изменения кариотипа. Проанализирована эффективность стандартного цитогенетического исследования в выявлении хромосомных нарушений, а также значение флюоресцентной in situ гибридизации в определении скрытых аномалий, не зафиксированных при кариотипировании.

Так, по нашим данным, у значительной части больных (16,3%) были выявлены дополнительно хромосомные аномалии после применения двух цитогенетических методов, что увеличило процент больных с нарушениями кариотипа с 37,2% до 51,2%. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения FISH-исследования в дополнение к стандартному.

Особенно это важно в тех случаях, когда не удается проанализировать кариотип из-за отсутствия митозов, а также когда есть весомые подозрения на наличие клональных нарушений кариотипа (например, del(5q)), или определение хромосомных нарушений необходимо для верификации диагноза при проведении дифференциальной диагностики с пограничными состояниями (апластическая анемия, вторичные дисплазии кроветворения). В нашем исследовании у 4 из 7 больных, у которых были выявлены «скрытые»

хромосомные аберрации, при стандартном исследовании определен нормальный кариотип. Эти данные указывают на то, что при получении нормального кариотипа, больным также желательно выполнять FISH-анализ.

Больные, включенные в исследование, были стратифицированы на группы риска по основным прогностическим шкалам, используемым в практике врача гематолога – IPSS, WPSS и IPSS-R. Показана их функциональная значимость и проведено сравнение определения групп риска у больных согласно разным шкалам.

CD34+ В работе охарактеризованы гемопоэтические клетки предшественницы у больных МДС. Показано, что их содержание увеличено в костном мозге и периферической крови больных по сравнению с контрольной группой здоровых лиц и больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Цитогенетическое исследование незрелых кроветворных клеток выявило в них клональные нарушения кариотипа. Хромосомные аномалии на уровне CD34+ клеток соответствовали выявленным в общей популяции клеток костного мозга, величина патологических клонов была одинакова. Установлена прямая зависимость между содержанием клонально-измененных клеток среди изолированной фракции клеток-предшественниц и их содержанием в общей клеточной популяции костного мозга. Показано, что выраженность клональных изменений на уровне CD34+ кроветворных клеток-предшественниц не зависела от таких прогностических факторов, как диагноз, категория риска, кариотип, клеточность костного мозга и наличие фиброза. Мы наблюдали больший размер патологического клона в клетках с благоприятными хромосомными аномалиями и у больных с гиперклеточным костным мозгом (результаты статистически не значимы). Определено, что у больных МДС в циркулирующих CD34+ клетках также содержатся аномалии кариотипа, это имеет практическое значение и может быть применено для проведения цитогенетических исследований у больных. Использование клеток периферической крови поможет снизить кратность пункций костного мозга у больных в процессе наблюдения и лечения.

Проанализированы свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при МДС. Выявлено, что МСК больных отличны по пролиферативной активности от культуры клеток, полученных у здоровых доноров костного мозга, а также у разных больных – в зависимости от морфологических особенностей костного мозга. У большинства больных при цитогенетическом исследовании МСК содержали нормальный набор хромосом.

Однако у 2 (9,5%) больных МДС в МСК были выявлены: в одном случае неклональная, в другом – клональная структурные аномалии кариотипа, которые отличались от нарушений кариотипа кроветворных клеток костного мозга. У больных ОМЛ из предшествующего МДС хромосомные аномалии МСК не выявлены. Полученные данные позволяют сделать вывод, что МСК костного мозга не являются частью патологического клона при МДС, и вместе с тем проявляют функциональные нарушения, которые, несомненно, имеют значение в патогенезе заболевания.

Таким образом, результаты нашего исследования демонстрируют, что аномалии кариотипа у больных МДС содержатся как в кроветворных, так и в стромальных клетках-предшественницах, что указывает на патогенетическое участие в развитии заболевания не только кроветворных компонентов костного мозга, но и их микроокружения, и является очередным свидетельством высокого уровня поражения при этом заболевании. Представляют важность дальнейшие исследования в данной области.

Выводы 1. У больных миелодиспластическими синдромами в дебюте заболевания методом стандартного цитогенетического исследования хромосомные аномалии в костном мозге выявлены у 37,2% больных, нормальный кариотип получен у 53,5% и отсутствие митозов – у 9,3% больных.

2. Применение метода флюоресцентной in situ гибридизации в дополнение к стандартному цитогенетическому исследованию позволило выявить «скрытые»

аномалии кариотипа в 16,3% случаев, таким образом, процент больных с хромосомными аберрациями составил 51,2%.

3. Установлено, что в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественницах в костном мозге и периферической крови определены те же аномалии кариотипа, что и в клетках общей популяции костного мозга.

4. Выявлена прямая корреляционная зависимость между величиной клона в клетках общей популяции костного мозга и в CD34+ гемопоэтических клетках предшественницах костного мозга и периферической крови.

5. Получена зависимость времени формирования подслоя мезенхимальных стромальных клеток от клеточности костного мозга: культура росла быстрее у больных с гиперклеточным костным мозгом.

6. Определены структурные (клональные и неклональные) аномалии кариотипа мезенхимальных стромальных клеток у 9,5% больных миелодиспластическими синдромами, отличные от аномалий кариотипа клеток костного мозга.

Библиографический список 1. Бочков Н.П. Цитогенетика стволовых клеток человека. / Бочков Н.П., Никитина В.А. // Молекулярная медицина. – 2008. – N 3. – с. 40-47.

2. Гайдамака, Н.В. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в костном мозге у больных острыми лейкозами / Н.В. Гайдамака, Е.Н. Паровичникова., Л.Э. Завалишина, В.Г. Савченко, Г.А. Франк // Гематология и трансфузиология – 2009. – N 2. – p. 3-10.

3. Григорян, А.С. Спонтанная злокачественная трансформация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в культуре - происходит ли она в действительности?/ А.С. Григорян, П.В. Кругляков. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. – N 4. – c. 78-82.

4. Кохно, А.В. Терапия рефрактерных анемий и острых малопроцентных лейкозов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук: 14.00.29 / Кохно Алина Владимировна. – М. 2001. – 135 с.

5. Кохно, А.В. Эффективность терапии циклоспорином у больных миелодиспластическим синдромом / А.В. Кохно, Е.Н. Паровичникова, Е.А.

Михайлова, Е.Н. Устинова, И.Б. Капланская, В.Н. Двирнык, Ю.В. Ольшанская, Е.В. Домрачева, В.Г. Савченко // Терапевтический архив. – 2010. – N 8. – c. 48 53.

6. Кохно, А.В. Миелодиспластичкий синдром / А.В. Кохно, Е.Н.

Паровичникова, В.Г. Савченко // Клиническая геронтология. – 2009. – N 3. – с.

33-46.

7. Лубкова, О.Н. Экспрессия VCAM-1 на стромальных клетках из костного мозга больных миелодиспластическими синдромами / О.Н. Лубкова, Н.В.

Цветаева, К.С. Момотюк, В.М. Белкин, Т.Е. Манакова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – N 1. – c. 17-20.

8. Манакова, Т.Е. Функциональные нарушения кроветворного микроокружения при различных формах миелодиспластического синдрома / Т.Е.

Манакова, Л.П. Герасимова, Н.В. Цветаева, К.С. Момотюк // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2000. – N 9. – c. 255-258.

9. Манакова, Т.Е. Дефект адгезии и хоминга кроветворных предшественников из костного мозга больных миелодисплазиями к стромальным клеткам из культур нормального костного мозга / Т.Е. Манакова, Н.В. Цветаева, В.М. Белкин, К.С. Момотюк, Н.Д. Хорошко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.– 2005. – N 1. – c. 11-14.


10. Ольшанская, Ю.В. Хромосомные перестройки при миелодиспластическом синдроме / Ю.В. Ольшанская, Е.В. Домрачева, А.И.

Удовиченко // Терапевтический архив. – 2005. – N 7. – с. 27-33.

11. Савченко, В.Г. Эффективность лечения циклоспорином А больных миелодиспластическими синдромами в зависимости от формы заболевания / В.Г.

Савченко, Е.Н. Паровичникова, А.В. Кохно, Е.А.Михайлова, Ю.В.Ольшанская, И.Б.Капланская // Современная онкология. – 2001. – N 2. – с. 55-56.

12. Савченко, В.Г. Миелодиспластический синдром: некоторые вопросы патогенеза и лечения / В.Г. Савченко, Е.Н. Паровичникова, Е.А. Михайлова, Ю.В. Ольшанская, Е.Н. Устинова, Е.О. Грибанова, Г.А. Франк, Л.Ю. Тихонова, А.В. Кохно и др. // Терапевтический архив. – 1996. – N 7. – c. 31-37.

13. Свинарева, Д.А. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидном гормоном / Д.А. Свинарева, И.Н.

Нифонтова, И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – N 9. – с. 320-324.

14. Свинарева, Д.А. Основные свойства мезенхимных стромальных клеток из костного доноров: поверхностные маркеры / Д.А. Свинарева, И.Н. Шипунова, Ю.В. Ольшанская, К.С. Момотюк, Н.И. Дризе, В.Г. Савченко // Терапевтический архив. – 2010. – N 7 – c. 52-56.

15. Шалыгина Ю.А. Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека / Шалыгина Ю.А., Ефимова О.А., Кругляков П.В., Пендина А.А., Григорян А.С., Кузнецова Т.В., Полынцев Л.Г., Баранов В.С. // Клеточная трансплантология и тканевая медицина. – 2009. – N 2. – с. 63-69.

16. Чертков, И.Л. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение / И.Л. Чертков, O.A. Гуревич // Медицина. - 1984. – 238 с.

17. Чертков, И.Л. Схема кроветворения / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе, А.И.

Воробьев // Терапевтический архив. – 2006. – N 7. – c. 5-12.

18. Щеголеватая, О.О. Развитие острого миелоидного лейкоза из донорских клеток после аллогенной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток у больной острым монобластным лейкозом / О.О.

Щеголеватая, Е.Н. Паровичникова, И.А. Демидова, В.Г. Исаев, А.Н. Соколов, Е.И. Желнова, И.В. Алексеева, В.А. Жеребцова, Т.В. Гапонова, Е.В. Домрачева и др. // Терапевтический архив. – 2011. – N 3. – c. 57-62.

19. Alvi, S. Successful establishment of long-term bone marrow cultures in patients with myelodysplastic syndromes / S. Alvi, A. Shaher, V. Shetty, B.

Henderson, B. Dangerfield, F. Zorat, L. Joshi, S. Anthwal, L. Lisak, L. Little et al. // Leuk Res. – 2001. – N 25. – p. 941-954.

20. Andrews. R.G. Monoclonal antibody 12.8 recognizes a 115-Kd molecule present on both unipotent and multipotent hematopoietic colony-forming cells and their precursors / R.G. Andrews, J.W. Singer, I.D. Bernstein // Blood. – 1986. – N 67.

– p. 842-845.

21. Arinkin, M.I. Dieintravitale Untersuchungsmethodik des Knochenmarks / M.I. Arinkin // Folia Haematol (Leipzig). – 1929. – N 38. – p. 233-240.

22. Ayraud, N. Cytogenetic study of 88 cases refractory anemia / N. Ayraud, M.

Donzeau, S. Raynaud, J.C. Lambert // Cancer Genet Cytogenet. – 1983. – N 8. – p.

243-248.

23. Baumann, M.A. Concurrent myelodysplasia and lymphoproliferation: a disorder of the true pluripotential stem cell? / MA. Baumann, J.A. Libnoch, R.M.

Hansen, M.G. Heckman, G.A. Hanson // Q J Med. – 1985. – N 55. – p. 199-211.

24. Bejar, R. Clinical effect of point mutations in myelodysplastic syndromes / R. Bejar, K. Stevenson, O. Abdel-Wahab, N. Galili, B. Nilsson, G. Garcia-Manero, H.

Kantarjian, A. Raza, R.L. Levine, D. Neuberg, B.L. Ebert // N Engl J Med. – 2011. – N 364. – p. 2496-2506.

25. Bennett, J.M. Proposals for the classification of the acute leukaemias.

French-American-British (FAB) co-operative group / J.M. Bennett, D. Catovsky, M.T.

Daniel et al. // Br J Haematol. – 1976. – N 33. – p. 451-458.

26. Bennett, J.M. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes / J.M. Bennett, D. Catovsky, M.T. Daniel, G. Flandrin, D.A. Galton, H.R.

Gralnick, C. Sultan // Br J Haematol. – 1982. – N 51. – p. 189-199.

27. Berenson, R.J. Antigen CD34+ marrow cells engraft lethally irradiated baboons / R.J. Berenson, R.G. Andrews, W.I. Bensinger, D.F. Kalamasz, G. Knitter, C.D. Buckner, I.D. Bernstein // J Clin Invest. – 1988. – N 81. – p. 951-955.

28. Bernardo, M.E. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms / M.E. Bernardo, N. Zaffaroni, F. Novara, A.M. Cometa, M.A. Avanzini, A. Moretta, D. Montagna, R. Maccario, R. Villa, M.G. Daidone, O.

Zuffardi, F. Locatelli // Cancer Res. – 2007. – N 67. – p. 9142-9149.

29. Berneman, Z.N. A myelodysplastic syndrome preceding acute lymphoblastic leukaemia / Z.N. Berneman, D. Van Bockstaele, P. de Meyer, M. van der Planken, F.

Vertessen, R. de Bock, M.E. Peetermans // Br J Haematol. – 1985. – N 60. – p. 353 354.

30. Beyer, V. Systematic screening at diagnosis of -5/del(5)(q31), -7, or chromosome 8 aneuploidy by interphase fluorescence in situ hybridization in acute myelocytic leukemia and high-risk myelodysplastic syndrome patients:

concordances and discrepancies with conventional cytogenetics / V. Beyer, C.

Castagn, D. Mhlematter, V. Parlier, J. Gmr, U. Hess, T. Kovacsovics, S. Meyer Monard, A. Tichelli et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 2004. – N 152. – p. 29-41.

31. Bhatia, R. Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: Role of malignant stromal macrophages/ R. Bhatia, P.B, McGlave, G.W. Dewald, B.R. Blazar, C.M. Verfaillie // Blood. – 1995. – N 85. – p. 3636-3645.

32. Bjorkman, S.E. Chronic refractory anemia with sideroblastic bone marrow: a study of four cases / S.E. Bjorkman // Blood. – 1956. – N 11. – p. 250-259.

33. Blau, O. Mesenchymal stromal cells of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia patients have distinct genetic abnormalities compared with leukemic blasts / O. Blau, C.D. Baldus, W.K. Hofmann, G. Thiel, F. Nolte, T. Burmeister, S.

Turkmen, O. Benlasfer, E. Schumann et al. // Blood. – 2011. – N 118. – p. 5583-5592.

34. Blau, O. Chromosomal aberrations in bone marrow mesenchymalstroma cells from patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloblasticleukemia / O. Blau, W.R. Hofmann, C.D. Baldus, G. Thiel, V. Serbent, E. Schumann, E. Thiel, I.W. Blau // Exp Hematol. – 2007. – N 35. – p. 221-229.

35. Block, M. Preleukemic acute human leukemia / M. Block, O. Leon, O.

Jacobson, W.F. Bethard // JAMA. – 1953. – N 152. – p. 1018-1028.

36. Borgstrom, G.H. Clinical implications of monosomy 7 in acute nonlymphocytic leukemia / G.H. Borgstrom, L. Teerenhovi, P. Vuopio, A. de la Shapelle, H. Van Den Berghe, L. Brandt, H.M. Golomb, A. Louwagie, F. Mitelman et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 1980. – N 2. – p. 115-126.

37. Braulke, F. FISH analysis of circulating CD34+ cells as a new tool for genetic monitoring in MDS: verification of the method and application to 27 MDS patients / F. Braulke, J. Schanz, K. Jung, K. Shirneshan, K. Schulte, C. Schuetze, R.

Steffens, L. Trumper, D. Haase // Leuk Res. – 2010. – N 34. – p. 1296-1301.

38. Caspersson, T. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents / T. Caspersson, L. Zech, C. Johansson, E.J. Modest // Chromosoma. – 1970. – N 30. – p. 215-227.

39. Chagraoui, H. Pathogenesis of myelofibrosis with myeloid metaplasia:

Insight from mouse models / H. Chagraoui, F. Wendling, W. Vainchenker // Best Pract Res Clin Haematol. – 2006. – N 19. – p. 399-412.

40. Chamberlain, G. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing / G.

Chamberlain, J. Fox, B. Ashton, J. Middleton // Stem cells. – 2007. – N 25. – p. 2739 2749.

41. Christiansen, D.H. Mutations of AML1 are common in therapy-related myelodysplasia following therapy with alkylating agents and are significantly associated with deletion or loss of chromosome arm 7q and with subsequent leukemic transformation / D.H. Christiansen, M.K. Andersen, J. Pedersen-Bjergaard // Blood. – 2004. – N 104. – p. 1474-1481.

42. Christiansen, D.H. Methylation of p15INK4B is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy related myelodysplasia and acute myeloid leukemia / D.H. Christiansen, M.K.

Andersen, J. Pedersen-Bjergaard // Leukemia. – 2003. – N 17. – p. 1813-1819.

43. Chute, J.P. Soluble factors elaborated by human brain endothelial cells induce the concomitant expansion of purified human BM CD34 +CD38- cells and SCID-repopulating cells / J.P. Chute, G.G. Muramoto, J. Fung, C. Oxford // Blood. – 2005. – N 105. – p. 576-583.

44. Dameshek, W. Sideroblastic anaemia: is this a malignancy? / W. Dameshek // Br J Haematol. – 1965. – N 11. – p. 52-58.

45. Deans, R.J. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses / R.J. Deans, A.B. Moseley // Exp Hematol. – 2000. – N 28. – p. 875-884.

46. De Grouchy, J. Analysis chromosomiques dans l'anemie sideroblastique idiopathique acquise / J. de Grouchy, C. de Nava, R. Zittoun, J. Bousser // Nouv Rev Fr Hematol. – 1966. – N 6. – p. 367-389.

47. De Smet, D. Diagnostic Potential of CD34+ Cell Antigen Expression in Myelodysplastic Syndromes / D. de Smet, F. Trullemans, K. Jochmans, W. Renmans, L. Smet, O. Heylen, A.M. Bael, R. Schots, B. Leus, M. de Waele // Am J Clin Pathol.

– 2012. – N 138. – p. 732-743.

48. Dewald, G.W. Clinical characteristics and prognosis of 50 patients with a myeloproliferative syndrome and deletion of part of the long arm of chromosome 5 / G.W. Dewald, M.P. Davis, R.V. Pierre, J.R. O'Fallon, H.C. Hoagland // Blood. – 1985.

– N 66. – p. 189-197.

49. Doan, P.L. The vascular niche: home for normal and malignant hematopoietic stem cells / P.L. Doan, J.P. Chute // Leukemia. – 2012. – N 26. – p. 54 62.

50. Ernst, T. Inactivating mutations of the histone methyltransferase gene EZH in myeloid disorders / T. Ernst, A.J. Chase, J. Score, C.E. Hidalgo-Curtis, C. Bryaent, A.V. Jones, K. Waghorn, K. Zoi, F.M. Ross et al. // Nat Genet. – 2010. – N 42. – p.

722-726.

51. Faed, M. Ring F chromosome mosaicism (46,XY,20r/46,XY) in an epileptic child without apparent hematological disease / M. Faed, H.G. Morton, J. Robertson // J Med Genetics. – 1972. – N 9. – p. 470-472.

52. Fialkow, P.J. Chronic myelocytic leukemia: origin of some lymphocytes from leukemic stem cells / P.J. Fialkow, A.M. Denman, R.J. Jacobson, M.N.

Lowenthal // J Clin Invest. – 1978. – N 62. – p. 815-823.

53. Fialkow, P.J. Chronic myelocytic leukemia: clonal origin in a stem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage / P.J.

Fialkow, R.J. Jacobson, T. Papayannopoulou // Am J Med. – 1977. – N 63. – p. 125 130.

54. Flores-Figueroa, E. Mesenchymal stem cells in myelodysplastic syndromes:

phenotypic and cytogenetic characterization / E. Flores-Figueroa, R.M Arana-Trejo, G.

Gutierrez-Espindola, A. Perez-Cabrera, H. Mayani // Leuk Res. – 2005. – N 29. – p.

215-224.

55. Flores-Figueroa, E. Functional analysis of myelodysplastic syndromes derived mesenchymal stem cells / E. Flores-Figueroa, J.J. Montesinos, P. Flores Guzman, G. Gutierrez-Espindola, RM. Arana-Trejo, S. Castillo-Medina, A. Perez Cabrera, E. Hernandez-Estevez, L. Arriaqa, H. Mayani // Leuk Res. – 2008. – N 32. – p. 1407-1416.

56. Flores-Figueroa, E. Distinctive contact between CD34+ hematopoietic progenitors and CXC12+ CD271+ mesenchymal stromal cells in benign and myelodysplastic bone marrow / E. Flores-Figueroa, S. Varma, K. Montgomery, P.L.

Greenberg, D. Gratzinger // Lab investig. – 2012. – N 92. – p. 1330-1341.

57. Ford, C.E. The chromosomes of man / C.E. Ford, J.L. Hamerton // Nature. – 1956. – N 10. – p. 1020-1023.

58. Fuchigami, K. Absolute number of circulating CD34+ cells is abnormally low in refractory anemias and extremely high in RAEB and RAEB-t;

novel pathologic features of myelodysplastic syndromes identified by highly sensitive flow cytometry / K. Fuchigami, H. Mori, T. Matsuo, M. Iwanaga, K. Nagai, K. Kuriyama, M.

Tomonaga // Leuk Res. – 2000. – N 24. – p. 163-174.

59. Gangenahalli, G.U. Hematopoietic stem cell antigen CD34: role in adhesion or homing / G.U. Gangenahalli, VK. Singh, Y.K. Verma, P. Gupta, R.K. Sharma, R.

Chandra, P.M. Luthra // Stem Cell Dev. – 2006. – N 15. – p. 305-313.

60. Genest, P. Partial deletion of a group-F (19-20) chromosome in a physically handicapped psychiatric male patient / P. Genest, M. Bouchard, J. Poty // J Med Genetics. – 1971. – N 8. – p. 374-377.

61. Geneva, A. Daland. Differentiation of pernicious anemia and certain other macrocytic anemias by the distribution of red blood cell diameters / Geneva A.

Daland, Clark W. Heath, George R. Minot // Blood. – 1946. – N 1. – p. 67-75.

62. Gerritsen, W.R. Clonal analysis of myedysplastic syndrome: monosomy 7 is expressed in the myeloid lineage,but not in the lymphoid lineage as detected by fluorescent in situ hybridization / W.R. Gerritsen, J. Donohue, J. Bauman, S.C.

Jhanwar, N.A. Kernan, H. Castro-Malaspina, R.J. O,Reilly, J.H. Bourhis // Blood. – 1992. – N 80. – p. 217-224.

63. Geyh, S. Analysis of mesenchymal stromal cells and their interactions with CD34 stem and progenitor cells in patients with myelodysplastic syndromes / S. Geyh, P.R. Cadeddu, J. Frbel, I. Bruns, F. Zohren, A.N. Hnerlitrkoglu, G. Kobbe, N.

Germing, R. Haas, T. Schroeder // Blood, ASH Annual Meeting Abstracts. – 2011. – N 118. – abstr. 2393.

64. Gilbert, H.S. A reappraisal of the myeloproliferative disease concept / H.S. Gilbert // Mt Sinai J Med. – 1970. – N 37. – p. 426-435.

65. Glenn, L.D. Failure of karyotypic instability to predict clinical progression in patients with dysmyelopoietic syndromes / L.D. Glenn, W.G. Sanger, A. Kessinger, W.P. Vaughan // Hematol Pathol. – 1988. – N 2. – p. 239-248.

66. Goodman, R.M. Unusual chromosomal findings in a case of myelofibrosis / R.M. Goodman, B.A. Bouroncle, F. Miller, C. North // J Hered. – 1968. – N 59. – p.

348-350.

67. Greaves, M.F. 'Target' cells, differentiation and clonal evolution in chronic granulocytic leukaemia: a 'model' for understanding the biology of malignancy. / M.F.

Greaves // In: New York: Praeger Publishers. – 1982. – p. 15-47.

68. Greenberg, P.L. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg, C. Cox, M.M. LeBeau, P. Fenaux, P.

Moreal, G. Sanz, M. Sanz, T. Vallespi, T. Hamblin et al. // Blood. – 1997. – N 89. – p.

2079-2088.

69. Greenberg, P.L. Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R) for myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg, H. Tuechler, J. Schanz, G. Sanz, G.

Garcia-Manero, F. Sole, J.M. Bennett, D. Bowen, P. Fenaux et al. // Blood. – 2012. – N 120. – p. 2454-2465.

70. Grneberg, H. The anemia of flexed-tailed mice (Mus musculus L.) / H.

Grneberg // Journal of Genetics. – 1942. – N 44. – p. 246-272.

71. Guba, S.C. Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammatory stimulation: Demonstration by serum-free bioassay, enzyme-linked immunoabsorbant assay and reverse transcriptase polymerase chain reaction / S.C. Guba, C.I. Sartor, L.R. Gottschalk, J. Ye-Hu, T. Milligan, S.C. Emerson // Blood. – 1992. – N 80. – p.

1190-1198.

72. Haase, D. Cytogenetic features in myelodysplastic syndrome. / D. Haase // Ann Hematol. – 2008. – N 87. – p. 515-526.

73. Haase, D. Evidence for malignant transformation in acute myeloid leukemia at the level of early hematopoietic stem cells by cytogenetic analysis of CD34 + subpopulations / D. Haase, M. Feuring-Bruske, S. Konemann, C. Fonatsch, C. Troff, W. Verbeek, A. Pekrun, W. Hiddemann, B. Wormann // Blood. – 1995. –N 86. – p.

2906-2912.

74. Haase, D. Cytogenetic analysis of CD34+ subpopulations in AML and MDS characterized by the expression of CD38 and CD117 / D. Haase, M. Feuring-Buske, C.

Schafer, Schoch C, C. Troff, B. Gahn, W. Hiddemann, B. Wrmann // Leukemia. – 1997. – N 1. – p. 674-679.

75. Haase, D. Involvement of CD34+ Stem Cells in Malignant Transformation in AML and MDS — Genetic Analysis of Sorted Subpopulations by Classical and Molecular Cytogenetics / D. Haase, M. Feuring-Buske, C. Schoch, C. Schafer, F.

Griesinder, C. Troff, B. Gahn, W. Hiddemann, B. Wormann // Hematol blood transfusion. – 1998. – N 39. – p. 19-28.

76. Hamilton-Paterson, J.L. Pre Leukaemic Anaemia / J.L. Hamilton-Paterson // Acta Haematol. - 1949. – N 52. – p. 309-316.

77. Healy, L. The stem cell antigen CD34 functions as a regulator of hemopoietic cell adhesion / L. Healy, K. Gale, F. Grosveld, M. Greaves, T. Enver // Proc Natl Acad USA. – 1995. – N 92. – p. 12240-12244.

78. Heuser, M. Loss of MLL5 results in pleiotropic hematopoietic defects, reduced neutrophil immune function, and extreme sensitivity to DNA demethylation / M. Heuser, D.B. Yap, M. Leung, T.R. de Algara, A. Tafech, S. McKinney, J. Dixon, R. Thresher, B. Colledge et al. // Blood. – 2009. – N 113. – p. 1432-1443.

79. Hofman, W.K. Myelodysplastic syndromes / W.K. Hofman, M. Lubbert, D.

Phillip, H. Koeffer // The Hematology Journal. – 2004. – N 5. – p. 1-8.

80. ISCN (2005): An international system for human cytogenetic nomenclature / L.G. Shaffer, N. Tommerup // S. Karger, Basel. – 2005. – 130 p.

81. Iwata, M. Reduced expression of inducible gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 in monocytes from patients with myelodysplastic syndrome:

correlation of inducible levels with the percentage of cytogenetically marked cells and with marrow cellularity / M. Iwata, M. Pillai, A. Ramakrishnan, R.C. Hackman, H.J.

Deeg, G. Opdenakker, B. Torok-Storb // Blood. – 2007. – N 109. – p. 85-92.

82. Jacobs, A. Myelodysplastic syndromes: pathogenesis, functional abnormalities, and clinical implications. / A. Jacobs // J Clin Pathol. – 1985. – N 38. – p. 1201-1217.

83. Jacobs, R.H. Prognostic implications of morphology and karyotype in primary myelodysplastic syndromes / R.H. Jacobs, M.A. Cornbleet, J.W. Vardiman, R.A. Larson, M.M. le Beau, J.D. Rowley // Blood. – 1986. – N 67. – p. 1765-1772.

84. Jaffe, E.S. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues / E.S. Jaffe, N.L. Harris, H. Stein, J.W. Vardiman // 3rd edn. Lyon. IARC Press. – 2001. – 352 p.

85. Jaju, R.J. Combined immunophenotyping and FISH identifies the involvement of B-cells in 5q-syndrome / R.J. Jaju, M. Jones, J. Boultwood, S. Kelly, D.Y. Mason, J.S. Wainscoat, L. Kearney // Genes Chromosomes. – 2000. – N 29. – p.

276-280.

86. Janssen, J.W. Clonal analysis of myelodysplastic syndromes: Evidence of multipotent stem cell origin / J.W. Janssen, M. Buschle, M. Layton, H.G. Drexler, J.

Lyons, H. van den Berghe, H. Heimpel, B. Kubanek, E. Kleihauer, G.J. Mufti et al. // Blood. – 1989. – N 73. – p. 248-254.

87. Kere, J. Monosomy 7 in Granulocytes and Monocytes in Myelodysplastic Syndrome. / J. Kere, T. Ruutu, A. de la Chapelle // N Engl J Med. – 1987. – N 316. – p. 499-503.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.