авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |

«Современная генетика MODERN GENETICS Francisco J. Ayala John A. Kiger, Jr. University of California, Davis SECOND EDITION Ф. АЙАЛА, Дж.КАЙГЕР ...»

-- [ Страница 6 ] --

Когда фаг Р1 размножают на клетках thr+ leu + aziR, и затем полу ченным препаратом фага инфицируют реципиента thr- leu- aziS, то лишь 3% от рекомбинантов типа Thr + обладают также фенотипом Leu+, и ни один из них - фенотипом AzR. Однако, если отбирать ре комбинанты типа Leu +, то 50% из них составляют AzR. Следовательно, leu + более тесно сцеплен с aziR, чем с thr +, и гены, по-видимому, распо ложены в последовательности thr + leu + aziR. Частоты совместной транс дукции (котрансдукции) соответствующих маркеров можно использо вать для определения степени их сцепления. Тот факт, что лишь 3% трансдуцирующих фагов thr+ содержат также ген leu+, указывает на то, что эти гены столь удалены друг от друга, что редко оказываются вместе во фрагменте ДНК, попадающем в головку фага Р1. На физиче ской карте, полученной методом прерванной конъюгации, эти маркеры расположены на расстоянии около 1/50 от общей длины хромосомы бактерии, что составляет 6,4•104 н.п. Это находится в хорошем соответ ствии с данными, согласно которым молекула ДНК фага Р1 содержит чуть меньше 105 н.п.

Выращивая фаг Р1 на различных штаммах бактерий, а затем ис пользуя потомство фагов для трансдукции соответствующих маркеров в другие штаммы, легко производить трехфакторные реципрокные скре щивания. В таких экспериментах используется мутант фага P1, clear, не способный к лизогенизации бактерий. Подобные опыты по трансдук ции с использованием реципрокных трехфакторных скрещиваний позво ляют определить последовательность мутантных генов в хромосоме в тех случаях, когда, как в приводимом ниже примере, эксперименты по котрансдукции не позволяют этого сделать. Все маркеры trp трансдуци руются вместе более чем в 80% всех случаев. Представленные в табл. 8.4 данные содержат частоты совместной трансдукции cys + и четырех тесно сцепленных ауксотрофов Trp-. Частота совместной трансдукции (котрансдукции)-это частота, с которой клетки реципиен та, приобретшие прототрофность по цистеину (cys + ), приобретают 8. Бактериальный геном Рис. 8.17. Перенос ДНК из донорной бакте- штамма. После инфицирования фагом реци риальной клетки в реципиентную в результа- пиентной клетки среди рекомбинантов по те трансдукции фагом Р1. В популяции средством специальной селекции можно вы трансдуцирующих фагов Р1 можно обнару- делить носителей желаемого участка ДНК жить фаговые частицы, несущие любые донорной бактерии.

участки бактериальной ДНК донорного 252 Организация и передача генетического материала одновременно ауксотрофность по триптофану (Trp- ). Мерозиготы при этом сперва высевают на минимальную среду, содержащую триптофан.

Образовавшиеся колонии перепечатывают на минимальную среду с тем, чтобы выявить не прототрофные, т. е. обладающие фенотипом Тгр -. Частота котрансдукции позволяет установить порядок генов в хромосоме cys-trpE-trpC-(trpA,trpB), но не позволяет уверенно опреде лить взаимное расположение trpA и trpB, так как различие между и 47% (см. табл. 8.4) статистически недостоверно.

Трехфакторные скрещивания с участием cys, trpE, trpB, схематически изображенные на рис. 8.18, подтверждают, что гены расположены в по же и trp-маркеры. Кроссинговер, в Рис. 8.18. Генетическое картирование результате которого это могло посредством рекомбинационного ана произойти, обозначен цветной стрел лиза мерозигот, возникших в резуль кой. Взаимное расположение неселек тате трансдукции. Отбор маркера cys + тивных маркеров trp устанавливают, относительно которого известно, затем по частотам более редких ре что он тесно сцеплен с trp, комбинантных классов, позволяет выделить класс мерозигот, возникающих в результате в которые из донорной клетки попа четырехкратных обменов.

дает участок ДНК, содержащий так 8. Бактериальный геном Рис. 8.19. Пример ис пользования реци прокных скрещиваний для установления и подтверждения взаимного расположе ния маркеров в трех факторном скрещива нии при трансдукции.

Для определения по следовательности генов выявляют относи тельные частоты двух указанных рекомби нантных генотипов.

Участок, на котором произошел кроссинго вер, обозначен цветной стрелкой, а наиболее вероятное расположе ние второго кроссинго вера-черной стрелкой.

Менее вероятные лока лизации кроссинговера указаны пунктирными стрелками.

следовательности cys-trpE-trpB. Порядок генов можно установить, зная, что рекомбинантный генотип, появляющийся наиболее редко, возникает в результате четырехкратного кроссинговера. (Сравните частоты гено типов cys + trpEtrpB и cys + trpE + trpB.) Разделить рекомбинантные классы trpEtrpB +,trpE+ trpB и trpEtrpB, каждый из которых обладает фенотипом Trp-, можно, используя селективные среды, в которых от сутствует то или иное промежуточное соединение на метаболическом пути биосинтеза триптофана. Пути биосинтеза и прерывающие их аук сотрофные мутации подробно обсуждаются в главе 10, сейчас мы рас сматриваем эти мутации просто как генетические маркеры, позволяю щие различать некоторые генотипы.

Трехфакторные скрещивания в результате трансдукции фагом Р1 по зволяют установить на генетической карте взаимное расположение всех генов ауксотрофности по триптофану: Е, С, В и А. Результаты реци прокных трехфакторных скрещиваний представлены в табл. 8.5. В этих скрещиваниях вектор селектируемых маркеров задает участок, в кото ром произошел единичный перекрест. Положение участка, в котором произошел второй перекрест, выявляется при исследовании частот комбинаций неселектируемых маркеров. Условием выбора маркеров для проведения трехфакторного скрещивания служат данные о возмож ности их котрансдукции, полученные в предварительных экспериментах.

254 Организация и передача генетического материала На рис. 8.19 схематически изображены кроссинговеры, приводящие к возникновению рекомбинантов, полученных в экспериментах 1 и 2 из таблицы 8.5. Выбор одной из двух возможных последовательностей ге нов основывается на следующих рассуждениях: 1) чем ближе неселек тивный маркер к селективным, тем меньше частота неселективного кроссинговера между ними;

2) четырехкратный кроссинговер происхо дит реже, чем двойной. Таким образом, поскольку в первом из изобра женных на рис. 8.19 эксперименте генотип ЕС + А+ обнаруживается ча ще, чем Е + С + А +, то гены расположены в последовательности Е С-А. Правильность такой последовательности подтверждается ре ципрокным скрещиванием (эксперимент 2), в котором тоже наиболее ча сто встречается генотип ЕС + А +.

Картированные гены ауксотрофности по триптофану образуют опе рон (см. гл. 15), в котором последовательность расположения генов со ответствует последовательным биохимическим реакциям, приводящим к синтезу триптофана. Мы уже видели, что мутации, влияющие на ути лизацию лактозы, расположены в хромосоме очень близко друг от дру га (рис. 8.16). Такое «кучное» расположение генов, определяющих род ственные генетические функции — это один из наиболее важных фактов, обнаруженных при изучении генетической организации бактерий.

Вспомним, что кучное расположение генов, определяющих родственные функции, наблюдалось у бактериофагов и Т4 (гл. 7). Такая генетиче ская организация не случайна: она, по-видимому, отражает фундамен тальные основы регуляции генетических функций у прокариотических организмов.

8. Бактериальный геном Обзор результатов генетического анализа В главах 5-8 мы видели, как генетический анализ позволяет определить общую организацию генетического материала у эукариотических и про кариотических организмов, и их вирусов. Комплементационный тест по зволяет относить мутации к различным функциональным единицам.

С помощью рекомбинационного анализа удается устанавливать взаим ное расположение этих единиц и строить генетическую карту, предста вляющую собой модель хромосомной организации функциональных ге нетических единиц. Мы увидели, что генетические модели организации наследственного материала очень хорошо соответствуют реальной фи зической структуре ДНК. Кроме того, мы убедились в том, что генети ческий анализ может использоваться для изучения изменений тонкой структуры генов-изменений, затрагивающих отдельные пары нуклеоти дов.

В последней главе первой части мы рассмотрим, как генетики ис пользуют генетические элементы прокариот для исследования тонкой структуры генетической организации прокариот и эукариот. Эти новые методы заложили основы «рекомбинантной революции в исследовании ДНК» и привели к появлению генетической инженерии. Изучив физиче скую и генетическую организацию генома, во второй части нашей книги мы вернемся к рассмотрению механизмов функционирования генов и к изучению того, каким образом гены определяют фенотип организма.

Литература Bukhari A. I., Shapiro J. A., Adhya S. L., eds., 1977. Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold DNA Insertion Elements, Plasmids, and Spring Harbor, N.Y.

Episomes, Cold Spring Harbor Laboratory, Yanofsky C, Lennox E. (1959). Transduction and Cold Spring Harbor, N.Y. recombination study of linkage relationships Jacob F., Wollman E., 1961. Sexuality and the among the genes controlling tryptophan Genetics of Bacteria, Academic Press, New synthesis in Escherichia coli, Virology, 8, York. 425-447.

Miller J.H., ed., 1972. Experiments in Molecular Ключевые слова и понятия Анаболизм Мерозигота Ауксотроф Неселективный маркер Катаболизм Общая транедукция Инсерция (IS) Перепечатывание колоний Конъюгация Плазмида Конъюгационная трубка Прерванная конъюгация Конъюгационное картирование Репликон Котрансдукция Селективный маркер 256 Организация и передача генетического материала Эписома Специфическая трансдукция Hfr-штамм Трансдукция F-фактор Трансдукционное картирование F'-штамм Транспозон F+ -штамм Трансформация F- -штамм Фактор устойчивости к антибиотикам Задачи 8.1. Последовательность передачи генов 8.3. Для определения взаимного распо у различных Hfr-штаммов Е. coli различ- ложения нескольких ауксотрофных мута на;

для нескольких штаммов она предста- ций Е. coli проводили эксперимент по влена ниже. Постройте на основе этих прерываемому скрещиванию между про тотрофным штаммом HfrStrS и штаммом данных физическую карту бактериального F -, A-,В -,D -, Str R. В качестве селек генома.

тивных маркеров использовали устойчи вость к стрептомицину и прототрофность по D. Определите расположение генов А и В относительно D, считая, что D + пере дается при скрещивании последним.

8.2. Для определения взаимного распо ложения генов А, В, С и D на генетической карте использовали метод прерванной конъюгации. Hfr-штамм leu + А +,В +,С +, D + Str передающий ген 1еи+ в самом начале 8.4. Для определения взаимного распо скрещивания, скрещивали со штаммом F ложения нескольких ауксотрофных мута leu- A-,B-, C -,D-StrR. Определите взаимное ций Е. coli использовали данные по транс расположение генов А, В, С и D, дукции фагом Р1. Проанализируйте при используя гены StrR и leu + в качестве веденную таблицу и установите порядок селективных маркеров (рис. 8.20).

следующих генов: А, В, С, D и F.

8. Бактериальный геном 8.5. При скрещивании F - - нии данных по трансдукции считает тесно сцепленной с геном his. Он ставит конъю штамма с различными Hfr-штаммами гационное скрещивание штамма Hfr последовательность переноса генов АВ313 StrS,Ade- TlS (см. условие задачи различна. В таблице приводится порядок 8.5) с ауксотрофным штаммом F переноса различными Hfr-штаммами StrR,Ade+ TlR. После прерывания конъю нескольких генов, расположенных гации образцы суспензии он высевает на неподалеку от точки начала (0). На среду, содержащую глюкозу и стрептоми основании этих данных постройте цин. Рекомбинантов обнаруживается физическую карту бактериальной очень мало, и их недостаточно для того, хромосомы.

чтобы установить тесное сцепление. Со своими трудностями он обращается к пре подавателю. Тот советует ему исключить из среды стрептомицин и повторить экс перимент. Студент пользуется советом и получает надежные данные, показываю щие, что ген, положение которого он дол жен определить, попадает в F- -клетки за две минуты до гена his. Объясните, что было неправильно в первом эксперименте, и почему во втором случае эксперимент удался. Предложите другую схему экспе римента.

8.8. Изобразите схематически реком 8.6. Для того, чтобы определить поло- бинанты, которые могут быть выделены жение гена arg 7 + на карте хромосомы Е. из нового F'-штамма, в котором F'-эле coli, прототрофный штамм StrSHfr4 (см. мент содержит гены thr + leu -, а бакте условие предыдущей задачи) скрещивали риальная хромосома - гены thr - 1еи +.

со штаммом F-,Met- Mtl- StrR arg 7-. После Обозначьте положение полового фактора того как скрещивание прерывалось, в каждом рекомбинанте.

образцы культуры высевали на чашки, со- 8.9. Предложите два способа определе державшие глюкозу в качестве источника ния того, принадлежит ли отобранная по углерода, стрептомицин и аргинин (или сле скрещивания Hfr и F- -штаммов ре метионин). По приведенным в таблице комбинантная колония типу F' или F -.

данным определите расположение гена 8.10. Установлено, что определенный arg7 +. штамм Е. coli, требующий для роста ме тионин, содержит в гене met элемент IS1, инактивирующий этот ген и вызывающий потребность в метионине. Из этого штам ма выделено множество спонтанных му тантов с делециями, затрагивающими смежный по отношению к гену met оперон ilv. Носители этих делеций, кроме метио нина, нуждаются также в изолейцине и ва лине. Каждый из штаммов с одной из де леций используется в качестве донорного для трансдукции фагом Р1 маркеров ilv + в реципиентные штаммы ilv -. Исполь зуются реципиентные штаммы ilv A -, ilv В -, ilv C - и ilv D -. В приводимой та блице указано присутствие ( + ) или отсут 8.7. Студент-генетик получил задание ствие ( - ) рекомбинантов ilv + в каждом определить положение на карте ауксо трофной мутации, которую он на основа 258 Организация и передача генетического материала опыте. Определите расположение мута ций ilv- друг относительно друга и отно сительно гена met.

8.13. Когда в качестве реципиентных используются клетки аrаЗ, а донорными клетками для фага Р1.служат ara1, ara 8.11. Мутанты thr и leu у Е. coli-ауксо или клетки дикого типа, и отбираются трофы, требующие для роста треонин трансдуктанты Аrа +, то на селективной и лейцин, соответственно. Мутация ara среде наряду с крупными колониями по обусловливает неспособность клеток ис являются крошечные колонии, неразли пользовать арабинозу в качестве источни чимые невооруженным глазом. Сформу ка углерода. В приводимой таблице ука лируйте гипотезу об их происхождении.

заны частоты котрансдукции этих генов 8.14. Клетки некоторых штаммов фагом Р1. Какая селективная среда ис Salmonella paratyphi подвижны, поскольку пользовалась в каждом случае и какова обладают жгутиками;

клетки других последовательность генов?

штаммов лишены жгутиков и неспособны к самостоятельному движению. Фаг, осу ществляющий общую трансдукцию у Salmonella (P22), выращивают на под вижных клетках и инфицируют им непо движные клетки. Когда инфицированные клетки неподвижного штамма высевают на поверхность столбика из мягкого ага ра, то после инкубации можно увидеть тя нущиеся вглубь агара от поверхности це почки мелких колоний (рис. 8.21).

8.12. Мутации ara1 и ara2 очень тесно сцеплены с аrаЗ. Все они делают клетки Е.

coli неспособными к использованию ара бинозы в качестве единственного источни ка углерода. Для того, чтобы установить взаимное расположение этих мутаций, проводили реципрокные трансдук ционные скрещивания, результаты ко Рис. 8.21. Бакте торых представлены в таблице. Во всех риальные колонии случаях отбирали рекомбинанты Ara + Salmonella paratyphi в и среди них определяли долю носителей пробирке с мягким неселективных маркеров leu + и thr +. Ка- агаром. [Lederberg J.

ково взаимное расположение этих марке- (1956). Genetics, 41, ров? 845.] 8. Бактериальный геном Leu + StrR или Gal+ StrR и среди них опре В культурах, выделенных из этих колоний, деляют долю (ly- )Hfr. О наличии маркера все клетки оказываются неподвижными.

ly- судят по чувствительности к со Объясните.

8.15. При некоторых скрещиваниях ответствующему фагу, другими словами, с участием лизогенных штаммов профаги утрата профага рекомбинантом интерпре типа А, могут использоваться в качестве тируется как наличие неселективного мар бактериального генетического маркера. кера. На основании этих данных опреде В таблице представлены результаты скре- лите взаимное расположение профагов на щивания между нелизогенным [(1у)-] физической карте Е. coli и их положение относительно Thr + Leu+ и Gal +.

8.16. При скрещивании штамма Hfr, лизогенного по фагу, с нелизогенным F--штаммом может иметь место фено мен, называемый зиготической индукцией.

Что это такое можно понять, сравнивая рекомбинанты, получаемые в реципрок ных скрещиваниях между содержащими профаги штаммами HfrHStrS и F-,Thr Leu-ArBTlRLac-gal-StrB, результаты ко торых приведены в таблице. Основы ваясь на представленных в таблице штаммом HfrH,StrS и штаммами F- данных о частоте возникновения реком Thr- Leu- Gal- StrR, лизогенными по бинантов при зиготической индукции, по стройте гипотезу, объясняющую этот фе одному из нескольких различных профа гов, например, F-,Thr- Leu- Gal- StrR (). номен, и предложите постановку экспери Отбираются рекомбинанты Thr + мента для проверки вашей гипотезы.

Методы работы с ДНК Наследственная информация кодируется последовательностью нуклеоти дов в молекуле ДНК. Любая экспериментальная методика, предназначен ная для определения последовательности нуклеотидов, требует химически чистых препаратов ДНК. Слово «чистый» в данном случае означает не только отсутствие примесей других типов молекул, например РНК и бел ков, но и гомогенность нуклеотидных последовательностей. Все моле кулы ДНК в таком образце должны быть одинаковы как по размерам, так и в отношении последовательности нуклеотидов. По этой причине первы ми для изучения генетической организации на уровне нуклеотидов были выбраны вирусы прокариотических и эукариотических организмов. Ге номы вирусов относительно малы, и вирусные частицы можно довольно легко отделить от клеточного материала еще до химического выделения интактных молекул ДНК из вирусных частиц. Описанное в гл. 7 гетероду плексное картирование фага основано на умении генетиков выделять интактные молекулы ДНК из различных линий фага, геномы которых с генетической точки зрения уже изучены. То же самое относится и к ис следованиям, показавшим концевую избыточность нуклеотидных после довательностей фагов Т2 и Т4 и циклические перестановки в их геномах.

Напротив, огромная длина молекул ДНК бактериальных хромосом и хромосом эукариот делает эти молекулы очень уязвимыми в отношении разрывов при их выделении из клеток. Разрывы происходят случайно вдоль двойной спирали, и в результате возникает сложная смесь более мелких молекул ДНК, отличающихся друг от друга длиной и последова тельностью нуклеотидов. Извлечь из такой смеси химическими методами информацию об исходной конкретной последовательности нуклеотидов в интактной хромосоме невозможно.

9. Методы работы с ДНК В 1970 году Смит и Вилкокс получили чистый препарат нового типа нуклеазы из бактерии Haemophilus unfluenzae. Это событие оказалось ре шающим для дальнейших исследований. Выделенная ими нуклеаза рас щепляла молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Это откры тие, а также создание методов клонирования относительно небольших фрагментов двухцепочечной ДНК привело к «рекомбинантной револю ции» в исследованиях ДНК и послужило основой современных генетиче ских и биохимических исследований. Метод рекомбинантных ДНК решил проблему получения препаратов ДНК, содержащих молекулы одинаково го размера и с одинаковой последовательностью нуклеотидов.

Прежде чем перейти к подробному рассмотрению этого метода, мы сначала познакомимся с информацией, которую можно получить при слу чайном расщеплении ДНК и, соответственно, при исследовании неодно родной смеси нуклеотидных последовательностей. Хотя информация, по лученная такими методами, носит статистический характер, тем не менее до 1970 г. она играла важную роль в описании общих закономерностей организации последовательностей ДНК многих организмов. Эта инфор мация была получена из теоретических и экспериментальных исследова ний реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК.

Кинетика ренатурации ДНК Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбран ной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль. Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетероду плекса ДНК в главах 7 и 8.

В реакции ренатурации, как показано на рис. 9.1, можно выделить две отдельные стадии. Первая стадия - нуклеация — заключается в образова нии водородных связей между несколькими, принадлежащими двум раз Рис. 9.1. Последовательные этапы де- ная реакция, т.е. реакция второго натурации и ренатурации фрагментов порядка;

(2) застегивания, при кото ДНК. Ренатурация требует осуществ- рой водородные связи образуются ления двух отдельных реакций: (1) между всеми основаниями компле нуклеации -образования водородных ментарных нитей;

это мономолеку связей между двумя одноцепочечны- лярная реакция, т.е. реакция первого ми фрагментами;

это бимолекуляр- порядка.

262 Организация и передача генетического материала Рис. 9.2. Кинетика идеальной реак- чала реакции. По абсциссе отложена ции второго порядка при k 2 = 1. По величина c0t, где с0 -начальная кон ординате отложена доля одноцепо- центрация одноцепочечной ДНК в чечных фрагментов в реакционной молях нуклеотидов на литр.

смеси по прошествии t секунд от на ным цепям комплементарными основаниями;

остальные взаимно ком плементарные основания выстраиваются друг против друга. На данной стадии происходит образование связи между двумя разными одноцепо чечными молекулами. Это реакция второго порядка, ее скорость пропор циональна квадрату концентрации ДНК. Вторая стадия-реакция «засте гивания молнии», при которой устанавливаются водородные связи между выстроенными друг против друга комплементарными нуклеотидами. Эта стадия представляет собой мономолекулярную реакцию;

скорость обра зования водородных связей пропорциональна концентрации ДНК, т. е. ки нетически является реакцией первого порядка. Какая из этих двух стадий идет медленнее и, следовательно, определяет общую скорость ренатура ции ДНК, должен решать эксперимент. Показано, что лимитирующей является стадия образования первых связей между цепями.

Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в про цессе реакции ренатурации описывается гиперболической функцией (вы вод формулы приводится в дополнении 9.1). График зависимости концен трации от времени при k2 = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени (t1/2), необходимому для ренатурации половины ис ходного количества ДНК (с/с0 = 0,5), можно определять показатель реак ции ренатурации (с0t1/2). Эта величина прямо пропорциональна числу ну клеотидов в неповторяющейся последовательности ДНК. Эта закономер ность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряя значение c0t1/2 ! Более того, экспериментально определяя кривые ренату рации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации.

На рис. 9.4 сравниваются кинетика ренатурации ДНК прокариот и эу кариот. Обратите внимание на то, что кривая ренатурациии ДНК Е. coli ном значении с. время, необходимое для ре Рис. 9.3. Взаимозависимость между экспери натурации половины молекул, пропорцио ментально определенными значениями cotl/ нально N. [Britten R.J., KohneD.E. (1968).

и сложностью (N) использованных в экспе Science, 161, 529.] рименте фрагментов ДНК. При фиксирован Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации тики ДНК коровы по форме качественно от фрагментов ДНК Е. coli и фрагментов ДНК личается от изображенного на рис. 9.2. ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. coli теленка содержит последовательности рена очень близка к теоретической кривой, пред- турирующие как быстрее, так и медленнее ставленной на рис. 9.2, что указывает на то, последовательностей ДНК Е. coli. [Britten что ренатурация ДНК происходит при един- R.J., KohneD.E. (1968). Science, 161, 529,] ственном неизменном значении константы скорости реакции k2. Напротив, график кине 264 Организация и передача генетического материала Рис. 9.5. На рисунке в виде спектра изобра жена частота последо вательностей ДНК мы ши с различной по вторностью. Число ко пий каждого типа по следовательности оценивали по кинетике ренатурации ДНК мы ши.

почти тождественна теоретической кривой, представленной на рис. 9.2.

Так как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что скорость реакции второго порядка k2 неизменна, это означает, что ре натурация фрагментированной ДНК Е. coli характеризуется определен ным значением k2. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренату рации фрагментированной ДНК Е. coli, тогда как остальная ДНК (около 60%) ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можно заключить, что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последова тельности, каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, на пример, основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, ча стота представленности которых в геноме схематически изображена на рис. 9.5.

Организация и возможные функции многократно повторяющихся ну клеотидных последовательностей в геноме эукариот были в 60-х годах, после их открытия, предметом активного обсуждения. Около 10% генома мыши составляет совокупность тандемно расположенных последователь ностей примерно из 10 нуклеотидов, повторенных I06 раз (рис. 9.5). Эти последовательности ДНК локализованы преимущественно в окружаю щем центромеры гетерохроматине. Подавляющее большинство этих по следовательностей, по-видимому, играют какую-то роль в структурной организации хромосом, поскольку они не транскрибируются в последова тельности РНК. С другой стороны, большинство последовательностей с не столь высокой повторностью распределены по всему геному и тран скрибируются в РНК. Природа этих последовательностей активно изу чается методами рекомбинантных ДНК, о которых мы расскажем в этой главе.

9. Методы работы с ДНК Дополнение 9.1 Кинетика ренатурации ДНК Организация и передача генетического материала набору значений с0t1/2, получаемых при вать кривые ренатурации ДНК типа изо различных условиях эксперимента (при браженной на рис. 9.4, следует предполо разных температурах и ионных силах рас- жить, что в ДНК эукариотических клеток твора). В этом состоит один из наиболее присутствуют различные типы нуклео важных результатов исследования кинети- тидных последовательностей, различаю ки, а именно: используя один и тот же щихся сложностью и частотой повторов.

набор условий эксперимента, можно по Часть ДНК, ренатурирующая медленнее значению а рассчитать N для ДНК неиз- всего (т.е. характеризующаяся наиболее вестной природы. высокими значениями c0t1/2), отвечает На рис. 9.4 сравниваются кривые рена- уникальным последовательностям, пред турации бактериальной ДНК и ДНК эука- ставленным в геноме однократно. Фрак риотических организмов. По форме кри- ции, ренатурирующие более быстро, со вой видно, что ренатурация бактериаль- ответствуют семействам идентичных или ной ДНК происходит при неизменном очень близких последовательностей, ка значении константы скорости реакции ждая из которых характеризуется опреде второго порядка, т.е. в соответствии ленным значением константы скорости, с уравнением (2). Напротив, кривая рена- отражающим сложность (N) семейства.

турации ДНК эукариотического организ- Долю генома, занятую последовательно ма свидетельствует о том, что в процессе стями того или иного типа, можно оце ренатурации величина k2 должна изме- нить по ординате графика, представленно няться. Для того, чтобы интерпретиро- го на рис. 9.4.

Рестрикция ДНК и ферменты модификации Практически все виды бактерий синтезируют по одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндо нуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза ми), поскольку их основная функция состоит, по-видимому, в ограниче нии присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей си стемой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не мо дифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага ини циирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментирует ся, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствую щей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами.

Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису-клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицирован ную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бакте риальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изуче ние закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов.

9. Методы работы с ДНК Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последо вательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК не подалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определен ную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы ре стрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндону клеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, полу чать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последова тельностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов.

Рестриктазы второго типа узнают палиндромные последовательно сти-последовательности, обладающие центральной симметрией и считы вающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего типа, напротив, узнают асимметричные сайты. В табл. 9.1 пред ставлены сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрел 268 Организация и передача генетического материала 9. Методы работы с ДНК ками, точка разреза двойной спирали может совпадать с осью симметрии, а может быть сдвинута относительно нее. В последнем случае образуются комплементарные концы, и между соответствующими основаниями мо гут сперва устанавливаться водородные связи, а затем посредством ДНК лигазы происходить сшивка фрагментов с возникновением ковалентных связей между соседними нуклеотидами. Защита от повторного расщепле ния рестриктазой обеспечивается ферментами модификации, метилирую 270 Организация и передача генетического материала щими некоторые основания в сайте узнавания: соответствующие основа ния помечены звездочкой. Метилирование происходит после того, как соответствующий нуклеотид включается в ДНК в процессе репликации.

Эти ферменты могут действовать либо на неметилированные, либо на по луметилированные сайты;

при этом в процессе полуконсервативной ре пликации образуются полностью метилированные сайты.

Из различных видов и штаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выя влено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функ ция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клет ки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают про никновение чужеродной ДНК in vivo. Вероятно, эти ферменты осущест вляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независи мо от их функций in vivo служат мощным инструментом структурного анализа геномов.

Рестрикционный анализ молекул ДНК Огромные возможности рестриктаз можно проиллюстрировать на сле дующем примере. Рассмотрим двухцепочечную репликативную форму бактериофага фХ174. Он содержит два ковалентно связанных комплемен тарных кольца, из 5386 нуклеотидов каждое. Чистый препарат ДНК со стоит из гомогенных молекул фага. Теперь представим себе, что этот пре парат подвергается действию эндонуклеазы, однократно разрезающей двойную спираль кольца без какой-либо специфичности в отношении точ ки разреза. В результате мы получим препарат ДНК, содержащий ли нейные молекулы 5386 различных типов, т. е. препарат, совершенно беспо лезный с точки зрения анализа нуклеотидных последовательностей.

Напротив, если при этом используется рестриктаза Pst I, разрезающая па линдромную последовательность GTGCAG (выписана последователь ность нуклеотидов лишь в одной цепи двойной спирали), то получается гомогенный препарат линейных молекул ДНК длиной до 5386 нуклеоти дов каждая, упорядоченных в одной и той же последовательности. Геном фХ174 содержит лишь один сайт, узнаваемый рестриктазой Pst I.

В геноме фХ174 есть сайты, узнаваемые многими другими ферментами, перечисленными в табл. 9.1. Количество и локализация сайтов для каждой рестриктазы строго определены. Таким образом, воздействие каким-то ферментом приводит к образованию уже известного количества фрагментов ДНК фиксированного размера. Размер каждого типа фраг ментов можно узнать с помощью электрофореза в геле: мелкие фраг менты перемещаются в геле быстрее крупных. Так как фрагменты каждо го типа характеризуются одинаковым размером и одинаковой последова тельностью нуклеотидов, то нуклеотидную последовательность в каждом из них можно определять отдельно, на выделенном посредством электро фореза в геле препарате. Полную последовательность нуклеотидов в ге номе можно затем «собрать» из последовательностей отдельных фраг ментов, если знать последовательность самих фрагментов в геноме.

9. Методы работы с ДНК Геном фага фХ174 принадлежит к числу самых мелких и наиболее хорошо изученных (см. гл. 7), и именно для этого генома в 1978 году была полностью определена последовательность нуклеотидов с помощью опи санного выше подхода (см. гл. 12).

Фаг также представляет собой хороший пример того, как можно ис пользовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и раз меры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких раз личных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно опреде лить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайтов рестрикции генома фага. На рис. 9.7 схема тически изображена карта сайтов Eco RI и Hin dIII на фоне генетической и физической карт генома фага.

Последовательность образующихся при рестрикции фрагментов в ин тактной молекуле ДНК можно установить несколькими способами. Пре жде всего можно использовать неполное расщепление ДНК эндонуклеа зами и последующее разделение фрагментов электрофорезом. Затем 272 Организация и передача генетического материала выделенные из электрофоретического геля крупные фрагменты снова под вергают действию того же фермента и посредством электрофореза уста навливают идентичность образующихся мелких фрагментов. С другой стороны, фрагменты, возникшие в результате полного расщепления под действием одного фермента, можно извлечь из геля, обработать второй рестриктазой и определить затем с помощью электрофореза размеры образовавшихся мелких фрагментов. Так, например, из рис. 9.7 видно, что выделение фрагмента А под действием рестриктазы Hin dIII и последую щая обработка Eco RI приводят к образованию фрагментов А' и т, возни кающих и при одновременном воздействии обоими ферментами.

Сопоставление карты рестрикции с генетической картой можно осуще ствить, действуя рестриктазами на ДНК, выделенную из различных му тантов фага с известными делециями и перестройками в геноме. Срав нивая фрагменты ДНК фагов дикого типа и мутантных, можно определять участки генетической карты фага, в которой локализованы соответствующие фрагменты.

Построение рестрикционной карты генома дает возможность разрабо тать стратегию определения последовательности нуклеотидов в генах, представляющих особый интерес. В результате действия нескольких раз личных ферментов образуются сравнительно мелкие перекрывающиеся фрагменты, содержащие не более нескольких сотен нуклеотидов. Эти фрагменты могут быть выделены в чистом виде, и в них может быть уста новлена последовательность нуклеотидов. Затем, зная взаимно перекры вающиеся участки последовательностей, можно восстановить последова тельность нуклеотидов в крупных фрагментах и в геноме в целом.

9. Методы работы с ДНК Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование) Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции исполь зуются для фиксации специфических «точек отсчета». Последователь ность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляют ся из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описа ния последовательности нуклеотидов в первой цепи.

Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, на чинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным ну клеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны.

Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по раз мерам посредством электрофореза в геле. Фрагменты должны быть поме чены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8.

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу ра диоактивного мечения, и кроме того по способу выделения исходного на бора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент ме тят радиоактивным изотопом 32Р в 5'-конце с использованием [ — 32Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплемен тарные цепи разделяют и в них независимо определяют последователь ность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь;

звездочка обозна чает радиоактивную метку 32Р на 5'-конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной вели чины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5'-конце содержат радиоак тивную метку, а на другом конце-определенный нуклеотид (см. рис. 9.8).

(При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми 3'-кон цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных на бора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле «бок о бок». Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор по лос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера.

Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеоти дов, начиная с 5'-конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные ре зультаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду.

274 Организация и передача генетического материала Рис. 9.8. Основные принципы определения чайной длины оканчиваются определенным нуклеотидной последовательности нуклеи- нуклеотидом. Все четыре набора фракциони новых кислот. Меченные радиоактивным руют затем по размерам посредством элек изотопом (*) фрагменты одноцепочечной трофореза. Нуклеотидная последовательность ДНК подвергают химической обработке при этом может считываться непосредствен четырьмя различными методами, в результа- но с радиоавтографа электрофоретического те чего образуются четыре группы фрагмен- геля (последовательность стрелок от полосы тов, в каждой из этих групп фрагменты слу- к полосе на диаграмме).

9. Методы работы с ДНК Рис. 9.9. Радиоавто граф электрофоретиче ского геля, по которо му считывают нуклео тидную последователь ность методом Максима - Гилберта.

Изображена последова тельность нуклеотидов, заключенная между двумя генами -гло бина ДНК человека.

Фрагмент ДНК был помечен на З'-конце и обработан рестрикта зами, расщепляющими по G, С, G и А и С и Т (для определения нуклеотид-ной последовательности нет необходимости в том, чтобы расщепление цепи происходило по единственному основанию). Слева представлена последо вательность, которую можно считать, с геля.

Метод рекомбинантных ДНК Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фраг менты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные {или хи мерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие ре стриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фраг менты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см.

табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водо родных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на 276 Организация и передача генетического материала Рис. 9.10. Образование рекомбинантных моле кул ДНК. При дей ствии одной рестрик тазы на различные мо лекулы ДНК обра зуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными кон цами. Соединение та ких фрагментов в раз ных сочетаниях может приводить к образова нию рекомбинантных молекул ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование реком бинантных молекул за вершается установле нием ковалентных свя зей.

рис. 9.10. После образования водородных связей между комплемен тарными основаниями концы фрагментов соединяются ковалентными связями под действием лигазы.

Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструирова нии химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация такого репликона будет приводить к размноже нию также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молеку лу. Исходный репликон становится при этом вектором для другого фраг мента ДНК.

В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векто ров) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг и множе ство различных плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК мо жет проникнуть в клетку Е. coli после того, как клетка обработана ионами Са + +. Такая процедура позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно 9. Методы работы с ДНК жать ДНК этих клонов в больших количествах. Совокупность мето дов, объединяемых названиями «клонирование», или «генная инженерия», произвели революцию в генетике, биохимии и биотехнологии. В настоя щее время ДНК эукариотических организмов может изучаться на уровне последовательности нуклеотидов с той же детальностью, которая еще не давно была возможна лишь в отношении ДНК вирусов. Методы генной инженерии позволяют использовать Е. coli в качестве фабрик для про изводства продуктов функционирования генов человека, например, для производства инсулина и гормона роста. Вероятно, в недалеком будущем это даст возможность успешно и недорого лечить диабет, возникающий при недостатке инсулина в организме, и карликовость, являющуюся след ствием недостатка гормона роста. Методы рекомбинантных ДНК откры вают широкие перспективы в решении проблем медицины, сельского хо зяйства и химической технологии. Эти методы обещают возникновение новой индустрии, называемой биотехнологией, привлекающей в настоя щее время внимание средств массовой информации и финансирующих организаций.

Векторы для клонирования ДНК Методы клонирования чужеродной ДНК в клетках Е. coli удобно про иллюстрировать на примере плазмиды pBR322, специально сконструи рованной Франциско Болваром и Раймондом Родригесом для клониро вания маленьких фрагментов ДНК, состоящих всего из нескольких тысяч пар оснований или еще меньше. Эта плазмида невелика (4362 ну клеотидные лары), несет гены антибиотикоустойчивости amp и tet и в каждой бактериальной клетке может присутствовать во множестве ко пий. Последовательность нуклеотидов плазмиды известна. Ее физиче ская карта представлена на рис. 9.11. Обратите внимание на то, что имеется один сайт для рестриктазы Pst I в гене amp и по одному сайту для рестриктаз Ват HI и Sal I в гене tet. Наличие этих сайтов именно Рис. 9.11. Физическая карта клонирующей плазмиды pBR322. Эта плазмида сконструиро вана из трех частей.

Участок начала репли кации (ori)-из плаз миды рМВ1;

ген tet из плазмиды pSC101, а ген атр-из транспозона Tn3. Ука заны соответствующие уникальные сайты ре стрикции.

278 Организация и передача генетического материала в генах устойчивости к двум антибиотикам дает возможность отбирать плазмиды, несущие чужеродную ДНК (рис. 9.12).

Плазмиду рестрицируют Ват HI и образовавшиеся линейные моле кулы смешивают с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК плазмиды могут соединиться друг с другом: при этом восстановится исходная кольцевая плазмида с ин тактным геном tet. Возможно, однако (именно это и требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК;

при этом це лостность гена tet нарушится. Полученной in vitro смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е. coli, предварительно обработанные ио 9. Методы работы с ДНК Рис. 9.13. Синтетические фрагменты ДНК, содержащие сайты ре стрикции, можно ис пользовать в качестве связующих звеньев (линкеров) при создании рекомбинантных моле кул. А. Любой фраг мент ДНК без липких концов можно клони ровать при использова нии двухцепочечных линкеров. Б. Структура трех линкеров.

нами Са + + с тем, чтобы сделать эти клетки проницаемыми для ДНК.

Затем трансформированные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. На таком агаре размножаются лишь те клетки, которые обладают фенотипом AmpR и, следовательно, содержат восстановлен ную плазмиду или плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК. Колонии, выросшие на среде с ампициллином, перепечатывают на чашки с тетрациклином. Клетки с восстановленной кольцевой плаз мидой, содержащей неповрежденный ген tet, будут иметь фенотип TetR, тогда как клетки, в плазмиду которых встроен фрагмент чужеродной ДНК, окажутся чувствительными к тетрациклину (TetS). Клоны с фено типом TetSAmpR можно отобрать для дальнейшего исследования встроенных фрагментов ДНК.

Процедуру клонирования можно вести с помощью рестриктазы Sal I а не Bam HI, и точно так же отбирать колонии трансформантов с фено типом TetSAmpR;

при этом будут клонироваться фрагменты чужерод ной ДНК, специфичные именно для Sal I и отличные от фрагментов, клонируемых Ват HI. Можно также в качестве рестрицирующего фер мента при клонировании с помощью вектора pBR322 использовать Pst I;

при этом для дальнейших исследований природы встроенных фрагментов следует отбирать колонии с фенотипом TetRAmpS.

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеоти дов, получивших наименование «линкеры» (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безо тносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие «тупо конечные» (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соеди няться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9.13). Эти фрагменты могут «выстригать 280 Организация и передача генетического материала система содержит все структурные белки и Рис. 9.14. Использование харон-фага для ферменты, необходимые для того, чтобы клонирования крупных фрагментов ДНК инфицирующие частицы фага были носителя мыши. Эффективное клонирование оказы ми векторной ДНК, в том числе ферменты, вается возможным благодаря действующей разрезающие длинные контамерные моле in vitro системе упаковки, полученной из ин кулы ДНК.


фицированных фагом клеток Е. coli. Эта ся» из любых молекул ДНК физическими методами;

границы фрагмен тов при этом не зависят от распределения сайтов рестрикции.

Геном бактериофага, был превращен генными инженерами в на иболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чуже родной ДНК. В геноме фага есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22 000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами P и Q (СМ. рис. 7.7). Таким образом, около 9. Методы работы с ДНК 25 000 пар нуклеотидов ДНК фага можно заменить чужеродной ДНК, не затрагивая способности этого фага выступать в роли вектора. Нор мальный геном фага содержит 49000 нуклеотидных пар, однако го ловка фага может вместить от 38000 до 53 000 н. п., продолжая при этом функционировать нормально. Можно сконструировать множество различных линий фага, предназначенных для клонирования разно образных фрагментов чужеродной ДНК, подчиняющихся лишь сформу лированным выше ограничениям. Примерами таких векторов могут служить так называемые харон-фаги (по имени мифического перевоз чика в царство мертвых) и gt-фаги (осуществляющие общую трансдук цию). Они сконструированы таким образом, что гены, ответственные за жизненно важные функции, локализованы на левом и правом концах ге нома, а середина существенных генов не несет и кроме того ограничена двумя различными сайтами рестрикции. Эта центральная часть генома содержит гены, влияющие на морфологию колоний, так что по их форме можно сразу определить, чужеродная или собственная ДНК включена в головку. Использование харон-фагов при клонировании фрагментов чужеродной ДНК схематически изображено на рис. 9.14.

Библиотеки геномов Одна из основных целей клонирования различных фрагментов ДНК прокариотических и эукариотических организмов состоит в расчленении геномов на участки, достаточно малые для того, чтобы было возможно их детальное исследование. Интуитивно представляется очевидным, что, если накопить достаточно большое количество клонируемых фрагмен тов ДНК, эта коллекция будет включать по меньшей мере по одному экземпляру каждой последовательности генома. Такую коллекцию кло нируемых фрагментов называют библиотекой генома или банком генов.

Если клонируют фрагменты генома Drosophila melanogaster средней длины 15-20•103 н. п., то для того, чтобы в коллекции были предста влены все участки генома, достаточно около 40000 независимых клонов (общая длина генома составляет около 1,5• 108 н. п.). Для полной би блиотеки генома человека требуется около 800000 клонов (см. дополне ние 9.2). В библиотеке генов содержится вся наследственная информа ция организма. Однако определение того, какой именно из томов библиотеки (т. е. клонов) содержит необходимую в каждом конкретном случае информацию, представляет очень сложную для генетиков про блему. Если копия соответствующей генетической информации оказы вается доступной в форме структуры молекулы РНК или в форме по следовательности аминокислот, то это может быть использовано при отыскивании в библиотеке клона, содержащего требуемую информа цию.

Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов высевают на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было при близительно 10000 негативных колоний. Например, библиотека генома Drosophila melanogaster умещается всего на четырех таких чашках. Ка ждая негативная колония содержит химерные инфекционные фаги и большое количество химерных молекул фаговой ДНК, не уместив шихся в головки фагов. Эта свободная ДНК дает возможность опреде лить, какие именно из негативных колоний содержат интересующие нас 282 Организация и передача генетического материала с пленок смывали остаток не всту Рис. 9.15. Поиск в библиотеке генома пившего в гибридизацию зонда, и тутового шелкопряда генов оболочки подвергали радиоавтографии. Черные яйца. На рисунках (А) и (Б) пятнышки соответствуют не представлены две пленки, снятые с гативным колониям, в которые одной и той же чашки Петри, со включился радиоактивный зонд.

держащей 5000 негативных колоний.

Сравнение пятнышек на двух экзем Обе пленки выдерживали некоторое время с меченной Р32 кДНК, полу- плярах пленки позволяет отличить случайные «позитивы», проявившиеся ченной с помощью обратной тран лишь на одной из двух пленок, от скрипции из мРНК, выделенной из истинных, проявившихся на обеих.

развивающихся ооцитов. Затем фрагменты ДНК. К поверхности чашки Петри прикладывают специаль ную пленку, на которой отпечатываются все негативные колонии. Затем пленку снимают и помещают в раствор щелочи, денатурирующий ДНК.

Пленку высушивают и выдерживают в вакууме при температуре 80°С, что приводит к установлению ковалентных связей между отпечатанны ми одноцепочечными молекулами ДНК и пленкой.

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содер жащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеино вой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержа щие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наибо лее активно функционирует интересующий нас ген;

это может быть так же искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, ко торый кодируется разыскиваемым нами геном;

наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки.

Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, распо лагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибриди зировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фраг мент чужеродной ДНК.

Труднее выделить из библиотеки клоны, соответствующие генам с известным фенотипическим проявлением, но неизвестным непосред 9. Методы работы с ДНК ственно биохимическим продуктом функционирования. Метод, с по мощью которого эту задачу можно решить, был впервые предложен применительно к геному дрозофилы Бендером и Хогнессом и получил название «прогулки по хромосоме». Этот метод требует, чтобы, во первых, была заранее известна локализация интересующего нас гена на генетической карте политенной хромосомы (см. главу 5, например, рис. 5.19) и, во-вторых, чтобы для какого-нибудь гена той же хромо сомы существовал зонд.

Рассмотрим в качестве примера участок Х-хромосомы, изобра женный на рис. 5.19, и будем двигаться по хромосоме, как это изобра жено на рис. 9.16. Наша цель состоит в том, чтобы отыскать в библио теке клонируемые фрагменты ДНК, отвечающие гену dunce, локализо ванному в хромомере 3D4. Этот ген необходим для формирования нормальной памяти у мух;

при этом он также кодирует фермент сАМР специфическую фосфодиэстеразу. Прогулка по хромосоме начинается с рекомбинантного клона сDm1570, несущего ДНК из хромомера 3С11-12. Этот химерный фаг извлекается из библиотеки генов дрозо филы посредством гибридизации с информационной РНК, выделенной из слюнных желез личинок. Эта информационная РНК кодирует клей кий белок, обозначаемый символом Sgs-4. Генетическое картирование мутаций, затрагивающих Sgs-4, позволяет локализовать этот ген в по лосе 3011-12 политенной хромосомы (рис. 9.16). Клонированная ДНК Sgs-4 гибридизирует с ДНК из полосы 3С11-12 политенной хромосомы, расположенной непосредственно справа от левого края делеции Df(l)d m75e19. Это можно показать, используя разработанный Эдвином Сау зерном метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку, связывающую одноцепочечные молекулы ДНК (блотинг по Саузерну;

см. рис. 9.6). Затем на эту пленку наносят ра диоактивный зонд, что позволяет определить, какие из фрагментов ДНК в геле комплементарны последовательности нуклеотидов зонда.

Этот метод схематически изображен на рис. 9.17.

Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеции, если использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О на рушении нормальной нуклеотидной последовательности в делетирован ной хромосоме свидетельствует изменение распределения сайтов ре стрикции по сравнению с ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между двумя сайтами рестрикции нор мальной ДНК, то расстояние между оставшимся сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося, чем был первый. На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для определения нового распределения сайтов рестрикции.

На рис. 9.18, А представлены результаты опыта, в котором ДНК мух дикого типа (Oregon-R) и Df(l)dm75e19/Df(l)N64j15 подвергали действию HindIII, а затем сравнивали методом Саузерна, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы из клона cDm2151. Обратите внимание на то, что распределение сайтов рестрикции в обеих ДНК одинаково, так как ДНК дрозофилы из cDm2151 комплементарна последовательности и нормальной ДНК, и ДНК из хромосомы с де лецией Df(l)dm75e19. (Обратите также внимание на то, что, как это видно на рис. 9.16, в хромосоме с делецией Df(l)N64j15 отсутствует лена карта участка протяженностью Рис. 9.16. Карта рестрикции участка около 100 000 н. п. Серыми полосами Х-хромосомы Drosophila melanogaster, изображены концевые точки неко полученная при анализе перекрываю торых из хромосомных перестроек;


щихся фрагментов ДНК клониро ширина полос соответствует точно ванных в харон-фагах, и ото сти, с которой локализованы кон бранных методом «прогулки по хро цевые точки перестроек на рестрик мосоме» слева направо, как это опи ционной карте.

сано в тексте. На рисунке представ 9. Методы работы с ДНК Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК ковалентно связываются с пленкой, после обрабатывают рестриктазами и образовав- че-го пленку обрабатывают радиоактивным шиеся фрагменты подвергают электрофорезу зондом и подвергают радиоавтографии.

в агарозном геле. Размеры рестрикционных Сравнение радиоавтографа с фотографией фрагментов определяют по фотографиям ге- окрашенного после электрофореза геля по ля, окрашенного бромистым этидием. Затем зволяет определить рестрикты, комплемен фрагменты денатурируют и переносят на тарные радиоактивному зонду. [Rodriguez R.

пленку из нитроцеллюлозы с помощью L., Tail R. С, University of California, Davis.] фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК участок ДНК вокруг полосы 3С11-12, так что анализируется лишь ДНК из хромосомы Df(l)dm75e19.) Сравним теперь те же фрагменты, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы клона cDml570, который имеет общий участок с ДНК клона cDm2151 (рис. 9.16). Рас пределение сайтов рестрикции при этом (рис. 9.18, Б) получается совер шенно иным. Фрагменты, образующиеся при рестрикции нормальной ДНК, теперь отсутствуют, и имеется лишь один фрагмент другого раз мера в ДНК хромосомы Df(l)dm75e19. Внимательное рассмотрение 286 Организация и передача генетического материала гибридизации радиоактивной ДНК харон-фа Рис. 9.18. Локализация концов хромосомных гов cDm2151 и cDml570. В хромосоме перестроек на карте сайтов рестрикции Df(l)N64j15 полностью отсутствует ДНК из ДНК. ДНК мух с генотипом Df(l)dm75el9/Df(l)N64j15 сравнивают с ДНК мух участка, содержащего ген Sgs-4 и, следова тельно, все присутствующие в геноме фраг дикого типа линии Oregon-R. Сравнение менты ДНК принадлежат хромосоме проводят по методу Саузерна. Фрагменты Df(l)dm75el9.

рестрикции идентифицируют с помощью карты рестрикции, изображенной на риc. 9.18, В, показывает, что новый фрагмент, длиной примерно в 8,8 т.п.н., должен представлять собой ле вую часть фрагмента длиной 9,0 т.п.н., идентифицируемого зондом cDml570. Следовательно, крайняя точка делеции Df(l)dm75e19 должна располагаться внутри фрагмента cDm1570, причем неподалеку от правого конца участка длиной 9,0 т.п.н. фрагмента HmdIII. После того как установлено, что -вектор, несущий участок ДНК из хромо 9. Методы работы с ДНК Дополнение 9.2. Сколь велика библиотека генома?

Число независимо клонируемых случай но выбранных фрагментов ДНК, необхо димое для того, чтобы составить би блиотеку генома (иногда говорят «банк генов»), зависит от размера генома орга Это выражение1 позволяет определить низма и от величины клонируемых фраг ментов ДНК. вероятность того, что в коллекции из Пусть N-число независимых клонов, N клонов представлен ген величины X.

составляющих библиотеку;

Обычно в качестве минимально приемле Р - вероятность того, что данная ну- мого значения вероятности выбирается клеотидная последовательность предста- Р = 0,99 и разрабатывается состав реак влена в библиотеке;

ционной смеси, гарантирующей получе L-средняя величина клонируемых ние числа независимых рекомбинантных фрагментов ДНК;

векторов, превышающих данное N.

X - размер данной искомой нуклео тидной последовательности;

М-размер генома. Clarke L., Carbon J. (1976). Cell, 9, 91-99.

сомы дрозофилы, включает конец делеции Df(l)dm75e19, можно начать «прогулку по хромосоме».

Делая первый шаг по хромосоме, мы используем радиоактивно ме ченный рестрикционный фрагмент ДНК дрозофилы в cDml570 в каче стве зонда, позволяющего отобрать в библиотеке генов дрозофилы дру гие фаги, гибридизирующие с ним. При этом оказывается, что существует общий участок у векторов cDm1570 и cDm (рис. 9.16). Следующий шаг состоит в том, чтобы используя в качестве зонда радиоактивно меченный фрагмент рестрикции вектора сDm 2001, расположенный правее участка, общего с вектором cDml570, выбрать из библиотеки новые фаги, гибридизирующие с cDm2001. Таким спо собом из библиотеки последовательностей отбирается набор фрагмен тов с общими участками;

полученная таким образом коллекция реком бинантных фагов дает расшифровку последовательности вправо от гена Sgs-4 (рис. 9.16). Из карт сайтов рестрикции отдельно взятых клони руемых сегментов можно собрать карту участка хромосомы в целом.

Для того чтобы в процессе такой «прогулки по хромосоме» следить, в какой именно точке мы находимся, следует использовать клони руемые зонды для локализации на карте рестрикции концевых точек других хромосомных перестроек (рис. 9.18). В результате такой процесс прогулки по хромосоме может быть спроецирован на цитологическую карту, поскольку известны клоны, захватывающие концевые точки деле ций Df(l)N 64j15, Df(l)N 75h24 и Df(l)N 64i16.

288 Организация и передача генетического материала Обзор методов работы с ДНК «Прогулка по хромосоме»-это инструмент, позволяющий систематиче ски картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав шиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрик ционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоак тивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, раз работанные на прокариотических организмах, для исследования генети ческой организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательно стей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в наших знаниях об организации, функционировании и эволюции гено мов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах.

Не удивительно, что новые эффективные методы исследований на шли применение не только в фундаментальных исследованиях. Они оказывают глубокое влияние на медицину, ветеринарию, селекцию жи вотных, растений, на микробиологическую промышленность. Приведем всего лишь несколько примеров.

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в от дельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповид ноклеточной анемии происходит замена AT на ТА в шестой паре ну клеотидов гена, кодирующего -цепь гемоглобина человека;

замена происходит в сайте (CTNAG), чувствительном к рестриктазе DdeI (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием DdeI у здоро вого человека и больного серповидноклеточной анемией можно срав нить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в каче стве зонда радиоактивно меченную ДНК гена -глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу.

Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного ре цессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике.

Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовер шенствовать методы создания вакцин против различных вирусных забо леваний человека и животных. Такие новые способы, включая клониро вание и определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке вакцин против ящура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых болезней свиней и крупного рогато го скота. Современные вакцины, приготовленные традиционным спосо бом, используют «инактивированные» или ослабленные препараты, ко торые, однако, иногда содержат патогенные вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые штаммы виру сов при культивировании в лабораторных условиях не достигают кон 9. Методы работы с ДНК Рис. 9.19. Исследование мутации серповидно клеточной анемии на уровне ДНК. А. Нор мальная и мутантная последовательности аминокислот и со ответствующие им по следовательности ну клеотидов в ДНК. Б.

Карта сайтов рестрик ции клонируемого зон да для участка гена цепи гемоглобина че ловека. Широкой поло сой изображен тран скрибируемый участок ДНК, тонкой линией нетранскрибируемый участок на 5'-конце ге на. В нижней части ри сунка показана локали зация DdeI-сайтов на рестрикционной карте нормальной и мутант ной форм. В. Размеры Dde I-рестриктов ДНК из нормальных клеток () и клеток, гомози готных по мутации серповидноклеточной анемии (SS ), опреде ляли с помощью ра диоактивного зонда.

[Geever R.F. et al.

(1981). Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 8, 5081.] центраций, достаточно высоких для вакцинации. Разработка синтетиче ских вакцин позволяет решить многие из этих проблем. Основным антигеном вируса ящура является белок головки вируса VP1. Однако сам по себе этот белок, выделенный в очищенном состоянии из ви русных частиц, или полученный из клеток Е. coli, используемых при клонировании гена VP1. обладает слабым антигенным действием и не может использоваться в качестве вакцины. Определение нуклеотидной последовательности клонируемого гена позволяет, зная генетический код (см. главу 12), легко определить полную последовательность амино кислот в белке VP1. После того как полная последовательность амино кислот известна, нетрудно химически синтезировать более короткие по липептиды, обладающие сильными антигенными свойствами и индуци рующими синтез антител против целых вирусных частиц.

290 Организация и передача генетического материала Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. coli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разрабо таны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие век торы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2µ плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2µ и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрож жевых клетках, так и в Е. coli. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может слу жить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (ин терферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще).

Дрожжевые клетки наиболее подходят, по-видимому, для производ ства не содержащих вирусы вакцин против болезни человека, вызывае мой вирусом гепатита В. Этот вирус состоит из нуклеопротеинового ко ра, содержащего геном вируса и окруженного фосфолипидной мембра ной, поверхность которой составляют кодируемые геномом вируса белки. Антигенно активной составляющей является белок поверхности вируса, однако для сильной антигенной активности необходимо, чтобы этот белок входил в состав фосфолипидной мембраны. Мембранная си стема дрожжевых клеток аналогична системе других эукариотических организмов и отлична от мембранной системы Е. coli. Когда белок, ко дируемый клонируемым геном вируса гепатита В, накапливается в дрожжевых клетках, то образуются фосфолипидные частицы с белко вой поверхностью, которые способны индуцировать производство вак цинируемым организмом антител против вируса в целом. С другой сто роны, при накоплении этого белка в клетках Е. coli он не связывается с фосфолипидами и поэтому не вызывает сильной антигенной реакции.

Применение методов рекомбинантных ДНК к фундаментальным ге нетическим исследованиям мы рассмотрим в различных главах второй части.

Литература Abelson J. (1977). Recombinant DNA: examples of Chang S., Cohen S.N. (1977). In vivo site-specific present-day research, Science, 196, 159-160. genetic recombination promoted by the Eco RI Abelson J. (1980). A revolution in biology, Science, restriction endonuclease, Proc. Natl. Acad. Sci.

209, 1319-1321. USA, 74, 4811-4815.

Arber W. (1979). Promotion and limitation of Gilbert W. (1981). DNA sequencing and gene struc genetic exchange, Science, 205, 361-365. ture, Science, 214, 1305-1312.

Berg P. (1981). Dissections and reconstructions of Greever R.F. et al. (1981). Direct identification of genes and chromosomes, Science, 213, 296-303. sickle cell anemia by blot hybridization, Proc.

Bittle J.L. et al. (1982). Protection against foot- Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5081-5085.

and-mouth disease by immunization with Itakura K. et al. (1977). Expression in Escherichia a chemically synthesized peptide predicted from coli of a chemically synthesized gene for the the viral nucleotide sequence, Nature, 298, hormone somatostatin. Science, 198, 1056-1063.

30-33. Laird CD., McCarthy B.J. (1969). Molecular Britten R., Kohne D.E. (1968). Repeated sequences characterization of the Drosophila genome, in DNA, Science, 161, 529-540. Genetics, 63, 865-882.

9. Методы работы с ДНК Rodriguez R. L, Tail R. C, 1983. Recombinant Maniatis Т. et al. (1978). The isolation of structural DNA Techniques: An Introduction, genes from libraries of eucaryotic DNA, Cell, 15, Addison-Wesley, Reading, Mass. Sanger F.

687-701.

(1981). Determination of nucleotide Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J., 1982.

sequences in DNA, Science, 214, 1205-1210.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Smith H.O. (1979). Nucleotide sequence specificity Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring of restriction endonucleases, Science, 205, Harbor, N. Y. [Имеется перевод: Маниа 455-462. Valenzuela P. et al. (1982). Synthesis muc Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Молеку and assembly лярное клонирование, М., Мир.] of hepatitis В virus surface antigen particles in Nathans D. (1979). Restriction endonucleases, yeast, Nature, 298, 347-350. Wetmur J., simian virus 40, and the new genetics, Science, 206, 903-909. Davidson N. (1968). Kinetics of renaturation of DNA, J. Mol. Biol., 31, 349-370.

Roberts R.J. (1976).Restriction endonucleases, CRC Crit. Rev. Biochem., 4, 123-164.

Ключевые слова и понятия Библиотека генома Вектор для Палиндромная нуклеотидная последова клонирования ДНК Зонд тельность Карта сайтов рестрикции Прогулка по хромосоме Кинетика ренатурации ДНК Рекомбинантная ДНК Линкер Уравнение Cot Фермент Метод Саузерна модификации ДНК Фермент Определение нуклеотидной последова- рестрикции ДНК Электрофорез тельности в геле Задачи 9.1. Препарат линейной вирусной ДНК 9.2. Препарат кольцевой плазмидной обрабатывают указанными ниже фермен- ДНК подвергают действию указанных тами и их комбинацией. Получившийся ферментов, а затем анализируют фраг набор рестриктов подвергают электрофо- менты при электрофорезе в геле. Исполь резу. На основе представленных в таблице зуя представленную информацию, по результатов постройте карту рестрикции стройте карту рестрикции этой плазмид вирусной ДНК. ной ДНК.

9.3. Препарат линейной вирусной ДНК обрабатывают рестриктазой Sma I до пол ного расщепления. Электрофорез в геле выявляет присутствие фрагментов еле 292 Организация и передача генетического материала дующих размеров (т.п.н.): 10, 7, 6, 3 и 2.

Параллельно интактную вирусную ДНК 9.5. Фрагмент, полученный при расще расщепляют той же эндонуклеазой непол- плении рестриктазой Bgl II ДНК Cannabis ностью. Полученные при неполном рас- sativa клонируется в сайте Ват HI плаз щеплении пять фрагментов обозначены в миды pBR322. При попытке выделить порядке убывания размеров буквами от А этот важный участок из плазмидной ДНК до Е. Затем каждый из этих фрагментов оказывается, что ни Ват HI, ни BglII не обработан рестриктазой Sma I до полного вырезают ДНК С. sativa из плазмидной.

расщепления и подвергнут электрофорезу. Почему? Какой фермент рестрикции сле Полученные результаты представлены в дует использовать, чтобы выделить расти таблице. Постройте карту рестрикции Sma тельную ДНК из рекомбинантной плаз I вирусной ДНК. миды?

9.6. При конструировании векторов се рии харон оказывается, что все фаговые частицы несут встроенные участки ДНК.

Почему не обнаруживаются фаговые ча стицы, которые несут лишь левое и правое плечо молекулы ДНК вектора.

9.7. Линейный фрагмент ДНК Eco RI длиной 2,5 т.п.н. с единственным сайтом рестрикции HhaI клонируется в сайте EcoRI плазмиды длиной 5 т.п.н. Карты рестрикции этих двух молекул ДНК изо бражены на рис. 9.20. Участки линейной ДНК могут быть клонированы в двух ориентациях.

9.4. Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. н подвергают полной рестрикции эндонуклеазой Kut I. Электро форез в геле выявляет наличие фрагмен тов следующих размеров: 5,0;

4,0;

3,5;

3,0;

1,5 и 1,0. Неполная рестрикция интактной плазмидной ДНК той же эндонуклеазой с последующим разделением фрагментов посредством электрофореза в геле по казывает существование пяти фрагментов, обозначенных в порядке убывания разме ров буквами от А до Е. Результаты после дующей полной рестрикции этих фраг ментов представлены в таблице. Построй те рестрикционную карту кольцевой плаз мидной ДНК.

9.7. Каковы два способа ориентации?

9.8. Совместная обработка рестриктаза ми HindIII и HhaI дает фрагменты дли ной 1 и 6,5 т.п.н. Какова ориентация кло нируемого фрагмента?

9.9. 9.8. Фрагмент ДНК длиной в пар нуклеотидов был помечен с З'-конца и последовательность нуклеотидов определялась способом, схематически изображенным на рис. 9.8. Результаты предста 9. Методы работы с ДНК влены в таблице. Какова нуклеотидная щей картиной для ДНК фага дикого типа, последовательность фрагмента? представленной на рис. 9.7. Полный ответ требует решения задачи 9.9.

9.11. Используемые при клонировании фаги могут включать до 20 т. п. н. инте грированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага с плаз мидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы вы брали при создании библиотеки ДНК че ловека и почему? Геном человека содер жит около 3109 нуклеотидных пар.

9.12. На рис. 9.21 изображен график кинетики ренатурации фрагментирован ной ДНК троглодита. Что вы можете сказать о его геноме, основываясь на сле дующих данных: 1) геном Е. coli содержит 9.9. Расщепление ДНК фага рестри 3,2 106 пар нуклеотидов и имеет мол. мас ктазой HindIII дает семь фрагментов су 2,5109 Да;

2) график кинетики ренату (рис. 9-7). Продумайте постановку просто рации ДНК Е. coli, производившейся в тех го эксперимента с использованием поли же условиях, что и представленный на нуклеотидкинаэы, позволяющего опреде рис. 9.21, характеризуется значением лить, какие из двух фрагментов содержат c0t1/2 = 5;

3) содержание ДНК в сперме концевые точки ДНК.

троглодита составляет 37,5109 Да.

9.10. Дано два препарата интактной 9.13. Серьезные разногласия вызывает ДНК фага : один дикого типа и второй вопрос о том, являются ли хромосомы эу dgal. Фаг dgal комплементирует му кариот унинемными или полинемными, танты по гену К, но не комплементирует т. е. содержат ли они одну или несколько мутанты по гену J (см. рис. 7.7). Сравните идентичных ДНК. Как может способство картину распределения HindIII-рестрик вать решению этого вопроса исследова тов, которую вы ожидаете получить при ние кинетики ренатурации?

расщеплении ДНК dgal, с соответствую Рис. 9.21. Кинетика ренатурации фрагментированной ДНК троглодита из усло вия задачи 9.12.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.