авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Биология: традиции и инновации в ХХI веке Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия-2008» с международным участием ...»

-- [ Страница 2 ] --

1. УНТ + пероксидаза (контроль) 2. УНТ + EDC + sulfo-NHS + пероксидаза 3. УНТ + EDC + sulfo-NHS + гидрохинон + пероксидаза 4. УНТ + Tween-20 + EDC + sulfo-NHS + гидрохинон + пероксидаза По окончании реакции трижды центрифугировали систему для осаждения УНТ, удаляя надосадочную жидкость и добавляя воду. Измеряли пероксидазную активность осадка и супернатанта. После второго центрифугирования УНТ активность фермента в супернатанте не обнаруживалась, свидетельствуя о том, что центрифугирование эффективно удаляет непрореагировавший фермент. Значения оптического поглощения осадка УНТ, пропорционального пероксидазной активности, после проведения реакции, показаны на рис.1.

Рис.1. Пероксидазная активность продуктов реакций 1-4 (объяснение в тексте).

Во всех полученных осадках наблюдалась пероксидазная активность, что свидетельствует о связывании пероксидазы с углеродными нанотрубками.

Наличие ферментативной активности в реакции 1, проводимой без активирующих реагентов, свидетельствует о наличии неспецифического связывания УНТ с ферментом. В реакции 2 ковалентно связывали пероксидазу, содержащую аминогруппы, с активированными нанотрубками.

Активность продукта соответствующей реакции меньше, чем в контроле, что указывает на частичную инактивацию пероксидазы при ковалентной сшивке.

Для защиты активного центра пероксидазы добавляли субстрат гидрохинон (реакция 3). В результате, осадок УНТ проявлял максимальную пероксидазную активность, указывая на то, что гидрохинон предотвращает инактивацию фермента.

В реакции 4 наряду с гидрохиноном в раствор добавляли детергент Tween-20 для защиты поверхности нанотрубок от неспецифического взаимодействия с молекулами фермента. В этом случае активность осадка УНТ была меньше, чем в реакции 3 без детергента. По-видимому, это связано с тем, что Tween-20 блокирует не только области неспецифического связывания на поверхности УНТ, но также карбоксильные группы, по которым происходит ковалентное связывание фермента.

Разработанный способ может быть использован для получения ковалентно связанных конъюгатов УНТ с ферментами и другими биомолекулами, содержащими первичные аминогруппы. Области возможного применения подобных конъюгатов включают: различные биотехнологические процессы, создание биосенсоров и новых терапевтических препаратов.

Литература 1. Challa S.S.R. Kumar (ed.). Biofunctionalization of nanomaterials. Wiley-VCH, 2005. - 386 pp.

2. Абдуллин Т.И.. Никитина И.И., Ишмухаметова Д.Г., Будников Г.К., Коновалова О.А., Салахов М.Х. // Журн. Аналит. Химии. 2007. Т.62.

№6. С.667.

3. Т.И. Абдуллин, И.И. Никитина, О.В. Бондарь, Д.Г. Ишмухаметова, О.А. Коновалова, М.Х. Салахов. Конструирование и тестирование электродов на основе многостенных углеродных нанотрубок // Рос.

нанотехнологии. 2007. Т.2. № 7–8. С.156–160.

4. Yoon-Mee L., O-Yul K., Yeo-Joon Y., Keungarp R. // Biotech. Lett. V. 28. P. 39–43.

5. Naoki Nakajima, Yoshito Ikada. // Bioconjugate Chem. 1995. V.6.

P.123-130.

УДК (547.466.2+546.234-325+546.236-325):544.183. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ РАССМОТРЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩЕЕ СОЕДИНЕНИЕ СЕЛЕНА – ЦИСТЕИН Н.А. Бычков1, А.Н. Панкратов1, О.М. Цивилева Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Соединения селена играют важную роль в биохимических превращениях с участием белков в живых организмах. Селен замещает атом серы в аминокислотных остатках цистеина и метионина. Цель настоящей работы квантовохимическое исследование комплексообразования при взаимодействии L-цистеина с селенистой и селеновой кислотами. Расчеты проводили методом DFT по программам пакета PC GAMESS на уровне теории B3LYP/6-31G(d,p).

Выяснилось, что в каждой из систем цистеин - H2SeO3 и цистеин - H2SeO образуется по 4 комплекса, строение которых аналогично для обеих селенсодержащих кислот (рис. 1 и 2).

Рис 1. Наиболее устойчивый комплекс (II) цистеина с: H2SeO Рис 2. Наиболее устойчивый комплекс (V) цистеина с: H2SeO Судя по межатомным расстояниям и принимая во внимание граничные значения расстояний между ван-дер-ваальсовыми и специфическими взаимодействиями (2.15 и 2.62 для взаимодействий O…H и S…H соответственно), названные комплексы можно отнести к разряду водородносвязанных.

В изученных нами комплексах можно судить о прочности водородной связи по степени уменьшения расстояния O…H по сравнению с пороговой величиной, и можно отметить наиболее сильные водородные связи.

Таким образом, в системах цистеин - H2SeO3 и цистеин - H2SeO4 при сближении молекул реактантов наблюдаются их взаимная ориентация и образование межмолекулярных водородных связей, играющих значительную роль в стабилизации комплексов.

Поскольку реакции образования комплексов с участием водородных связей должны являться обратимыми и не должны иметь высокого барьера, можно полагать, что комплексообразование будет протекать с термодинамическим контролем. В связи с этим нами проанализирована сравнительная термодинамическая устойчивость комплексов комплексов I-IV и V-VIII (табл. 1 и 2).

Таблица Суммы электронных и термических энтальпий (H) и свободных энергий (G)комплексов L-цистеина с кислотами селена (в атомных единицах, Хартри на частицу)* Комплекс Комплекс H G H G –3348.04551 –3348.10253 –3423.19938 –3423. I V –3348.04833 –3348.10719 –3423.19568 –3423. II VI –3348.03439 –3348.09420 –3423.18594 –3423. III VII –3348.02873 –3348.08657 –3423.18480 –3423. IV VIII * Включают энергии нулевых колебаний Таблица Разностные энергетические характеристики (ккал/моль) Разность Разность H G H G энергий энергий I-II 1.770 2.919 V-VI –2.326 –1. I-III –6.973 –5.233 V-VII –8.435 -8. I-IV –10.53 –10.02 V-VIII –9.154 –10. II-III –8.743 –8.152 VI-VII –6.109 –6. II-IV –12.30 –12.94 VI-VIII –6.828 –9. III-IV –3.556 –4.783 VII-VIII –0.719 –2. Как видно, в системе цистеин - H2SeO3 преимущественно образуются комплексы I и II, а в системе цистеин - H2SeO4 - соединения V и VI, причем в первом случае энергетически несколько более выгоден комплекс с тремя водородными связями II, а во втором - комплекс V с практически планарным расположением карбоксильной группы и фрагмента O16O18H20.

В табл. 3 приведены энтальпии и свободные энергии образования комплексов I-VIII.

Таблица Энтальпии (Hf) и свободные энергии (Gf) образования комплексов L-цистеина с селенистой кислотой Hf, Gf, Hf, Gf, Комплекс Комплекс ккал/моль ккал/моль ккал/моль ккал/моль –18.57 –5.641 –20.37 –7. I V –20.34 –8.559 –18.05 –6. II VI –11.60 –0.408 –11.94 0. III VII –8.040 4.376 –11.22 3. IV VIII Полученные результаты свидетельствуют о том, что в случае обеих селенсодержащих кислот преимущественно возникают комплексы по карбоксильной группе цистеина, при этом энтальпии образования составляют от -19 до -21 ккал/моль, а свободные энергии от -6 до -9 ккал/моль.

Теоретическое рассмотрение влияния селенсодержащих соединений на формирование дополнительных дисульфидных связей в молекуле белка и на изменение вследствие этого биологической активности белковой молекулы одна из современных проблем химии белка. Поскольку, как уже указывалось, селенистая и селеновая кислоты образуют наиболее устойчивые комплексы по карбоксильной группе цистеина, то при комплексообразовании не блокируется тиольная группа аминокислоты, служащая реакционным центром биохимически важных процессов - окислительной димеризации с формированием дисульфидных мостиков [1-4], замещения атома серы на селен [5] и др. Указанные процессы важны для проявления биологической активности определенных классов белков. Так, к числу общих свойств углеводсвязывающих белков - лектинов относится стабилизация сайтов связывания углеводов дисульфидными мостиками [6-9]. При этом дополнительное образование S-S связей в молекулах лектинов благоприятствует способности последних к взаимодействию с гликоконъюгатами и проявлению лектиновой активности. Растительные белки, характеризующиеся ярко выраженной способностью связывания с (1,3)--D-глюканами (так называемые thaumatin-like proteins) и имеющие относительно большое число дисульфидных мостиков в молекуле, восстанавливают свою полисахарид-связывающую способность, утраченную в результате ограниченной денатурации, под действием цистеина (включенного в состав буфера в виде 1 мМ раствора) [10].

Влияние цистеиновых фрагментов белковой молекулы на биологическую активность и, в частности, на белок-углеводные взаимодействия, предполагающее возможность обратимого окисления-восстановления цистеина в биологических условиях, требует благоприятствующих условий химического окружения и состояния тиольной группы. Вероятно, первоначальный акт взаимодействия в системе гидроксилсодержащее соединение селена - -аминокислота, включающий взаимную ориентацию молекул реактантов и образование межмолекулярных водородных связей, служит предпосылкой того, что тиольная группа оказывается способной принимать участие в последующих стадиях (включающих более глубокие химические превращения) биологически значимых реакций.

Литература 1. Jacob C., Holme A.L., Fry F.H. The Sulfinic Acid Switch in Proteins // Org. Biomol. Chem. - 2004. - V. 2, № 14. - P. 1953-1956.

2. Giles N.M., Watts A.B., Giles G.I., Fry F.H., Littlechild J.A., Jacob C.

Metal and Redox Modulation of Cysteine Protein Function // Chem.

Biol. - 2003. - V. 10, № 8. - P. 677-693.

3. Jones D.P., Go Y.M., Anderson C.L., Ziegler T.R., Kinkade J.M. Jr., Kirlin W.G.. Cysteine/Cystine Couple Is a Newly Recognized Node in the Circuitry for Biologic Redox Signaling and Control // FASEB J. 2004. - V. 18, № 11. - P. 1246-1248.

4. Jacob C., Maret W., Vallee B.L. Selenium Redox Biochemistry of Zinc Sulfur Coordination Sites in Proteins and Enzymes // Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. - 1999. - V. 96, № 5. - P. 1910-1914.

5. Moroder L. Isosteric Replacement of Sulfur with Other Chalcogens in Peptides and Proteins // J. Pept. Sci. - 2005. - V. 11, № 4. - P. 187-214.

6. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Молекулярная биология - 1994. - Т. 28, вып. 2. - С. 245-273.

7. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. - Львов: Вища школа. Изд-во при Львов. ун-те, 1981. - 156 с.

8. Elagavish S., Shaanan B. Lectin-Carbohydrate Interactions: Different Folds, Common Recognition Principles // Trends Biochem. Sci. - 1997. V. 22. - P. 462-467.

9. Лахтин В.М. Биотехнология лектинов // Биотехнология. - 1989. Т. 5, № 6. - С. 676-691.

10. Trudel J, Grenier J, Asselin A. Detection of Enzymes Active on Various Beta-1,3-glucans After Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis // Electrophoresis – 1998. - V. 19, № 10. - P. 1788-1792.

УДК 581. СОРТОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ Р.Н. Валиуллина, В.В. Рябовол, Л.П. Хохлова Казанский государственный университет, Казань Установлено, что обработка корней проростков яровой пшеницы бензиловым спиртом (0,2%) и диметилсульфоксидом (5%) приводит к повышению проницаемости мембран у разных по теплоустойчивости сортов как при нормальной температуре, так и после действия на растения повышенной температуры. У устойчивых растений происходила более ускоренная репарация и адаптация мембран после действия теплового шока.

УДК 573. ВЛИЯНИЕ МУТАНТНЫХ НУКЛЕАЗ SERRATIA MARCESCENS НА КОПИЙНОСТЬ ПЛАЗМИДЫ PHISNUCSMA Р.М.Гудино, О.А. Гимадутдинов, Р.Г. Хамидуллина Казанский государственный университет Была определена активность мутантных нуклеаз Serratia marcescens при базальном уровне экспрессии их генов, находящихся в плазмиде pHisNucSma.

Показано, что чем выше уровень активности мутантных эндонуклеаз S.

marcescens, тем выше устойчивость рекомбинантных штаммов к ампициллину. Выявлена корреляция между уровнем устойчивости к ампициллину, активностью -лактамазы и количеством плазмидных копий pHisNucSma в рекомбинантных штаммов E. coli LK 111.

УДК 581. ВЛИЯНИЕ ВНЕЗАПНО ИЗМЕНИВШЕЙСЯ МАССЫ ПРОДУКТОВ ФОТОСИНТЕЗА НА ЭКСПОРТ АССИМИЛЯТОВ ИЗ ЛИСТА И ИХ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ОРГАНАМ РАСТЕНИЯ ПШЕНИЦЫ Э.В. Исаева, С.Н. Баташева Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань Экспорт продуктов фотосинтеза из листа – один из основных процессов, определяющих продуктивность растения. Внезапное и временное изменение массы образующихся в листе продуктов фотосинтеза влияет на их дальнейшую постфотосинтетичекую судьбу. В растениях пшеницы появление временного избытка или дефицита ассимилятов в листе приводит к противоположному действию на их поступление в главный акцептор – колос.

Экспорт вновь синтезированных ассимилятов из листа определяется предсуществующими условиями. Таким образом, в растении система дальнего транспорта ассимилятов значительно инертней, чем сам фотосинтез.

УДК 661.721.422:602. МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ МЕТАНА Д.А. Казаков, В.В. Вольхин, А.И. Нечаев, Д.В. Торхов Пермский государственный технический университет В настоящей работе предложена математическая модель биодеградации метана, учитывающая диффузионные и кинетические стадии процесса.

Показано, что модель воспроизводит тенденции, наблюдаемые в эксперименте и, таким образом, может быть использована для анализа поведения рассматриваемой биокаталитической системы при проведении научных исследований и технологических расчётов.

УДК 579.8.088. STENOTROPHOMONAS CHELATIPHAGA - НОВЫЙ ФАКУЛЬТАТИВНЫЙ ДЕСТРУКТОР ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРААЦЕТАТА Е.Н. Капаруллина Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Введение Среди 250 известных комплексообразующих соединений ЭДТА имеет наиболее широкое применение. В мире ежегодно производится более 1105 т ЭДТА. Благодаря способности образовывать стабильные водорастворимые комплексы с двух- и трехвалентными металлами, ЭДТА используется при отмывке паровых котлов, систем отопления жилищно-коммунального хозяйства, теплообменников, бойлеров, при дезактивации ядерных реакторов, в фотографической, текстильной и бумажной промышленностях, в гальванических процессах, в качестве добавки в стиральных порошках, моющих средствах, удобрениях и косметике. Однако столь широкое использование комплексонов приводит к нарушению равновесия экосистем [1-2]. Поскольку наиболее перспективным способом деградации ЭДТА является микробиологический, поиск и изучение свойств новых деструкторов этого поллютанта весьма актуальны.

Постановка задачи Цель данной работы - таксономическая и физиолого-биохимическая характеристика штамма LPM-5 - нового факультативного деструктора ЭДТА.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Идентифицировать штамм LPM-5 методами полифазной таксономии.

2. Провести энзимологический анализ путей метаболизма ЭДТА у данного штамма.

Результаты Изолят представлен грамотрицательными, аэробными аспорогенными подвижными палочками (0.5-0.7 0.8-1.3 мкм). На агаризованной минеральной среде с ЭДТА образует точечные бесцветные колонии, тогда как на богатых средах формирует колонии желтоватого цвета 2 - 5 мм в диаметре.

Оптимум температуры для роста 28-37 С, оптимум рН 5.5- 8.5. При культивировании не выделяет пигменты в среду. Использует ЭДТА в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, а также растет на фруктозе, глюкозе, галактозе, маннозе, ксилозе, мальтозе и арабинозе, но не на метаноле, этаноле или аминокислотах -серине, глицине, триптофане, аргинине, валине. Оксидазо- и каталазоположительный, гидролизует крахмал, разжижает желатину, образует индол. Не гидролизует Tween 80, не восстанавливает нитраты до нитритов, не выделяет H2S, не обладает уреазой и гемолитической активностью. Растет на среде с ЭДТА в присутствии до 2, % NaCl. Устойчив к оксацилину (10 мкг), ампициллину (10 мкг), новобиоцину (5 мкг), стрептомицину (10 мкг), неомицину (30 мкг) и налидиксовой кислоте (30 мкг), но чувствителен к гентамицину (10 мкг) и линкомицину (2 мкг).

Для установления таксономического положения штамма LPM- использовали методы полифазной таксономии. Доминирующими фосфолипидами у штамма LPM-5 являются фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин и кардиолипин, при росте на триптон-соевом агаре в жирнокислотном соcтаве доминируют изо-пентадекановая (Сi15 12,02%), антеизо-пентадекановая (Са15 13,05%), тетрадекановая (С14:0 10,09%), 7 гексадеценовая (С16:1w7 21,04%) кислоты. Основной убихинон Q-8. Штамм LPM-5 принадлежит к Gammaproteobacteria и, по данным секвенирования гена 16S рРНК, наиболее близок представителям рода Stenotrophomonas: S.

maltophilia LMG 958T = VKM B-591T (98.6%), S. acidaminiphila AMX 19T (97.0%), S. nitritireducens DSM 12575T (97.2%), S. rhizophila e-p10T (98.3%) (Рис.1). Содержание ГЦ в ДНК составляет 68.3 мол.%. Типовая культура S.

maltophilia ВКМ B-591T (=LMG 958T) не способна использовать ЭДТА в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. В отличие от представителей рода имеющих различную Stenotrophomonas, осмотолерантность (3-5% NaCl), новый деструктор штамм LPM- ингибируется концентрациями NaCl выше 2.5 %. Кроме того, новый изолят не способен расти при 4C. Использует ксилозу в качестве источника углерода и энергии;

не способен восстанавливать нитрат до нитрита;

не обладает антифунгальной активностью и липазой. ДНК-ДНК гибридизация методом ДНК реассоциации выявила 51% гомологии с типовой культурой S.

maltophilia LMG 958T = VKM B-591T. Основываясь на данных полифазной таксономии, штамм LPM-5 отнесен к новому виду Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5Т (ВКМ В-2486) депонирована в базе данных под номером Gene Bank EU 573216.

0. Stenotrophomonas humi R-32729T Pseudomonas pictorum ATCC 23328T (AB021392) Stenotrophomonas nitritireducens L2T (AJ 012229) 95 Stenotrophomonas terrae R-32768T (AM403589) 74 Stenotrophomonas acidaminiphila AMX19T (AF273080) Stenotrophomonas koreensis TR6-01T (AB166885) 77 Stenotrophomonas maltophilia IAM 12423T (AB294553) Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5 (EU 573216) Stenotrophomonas rhizophila e-p10T (AJ293463) Stenotrophomonas dokdonensis DS-16T (DQ178977) Pseudoxanthomonas broegbernensis B1616/1(AJ012231) Luteimonas mephitis B1953/27.1T Escherichia coli 0157:Н7 (АУ513502) Рисунок 1 Филогенетическое положение Stenotrophomonas chelatiphaga LPM-5Т, основанное на сравнении нуклеотидной последовательности 16S рДНК среди представителей родов Stenotrophomonas, Luteimonas и Pseudoxanthomonas.

Показаны bootstrap значения выше 45%. Дерево построено относительно последовательности 16S рДНК Escherichia coli 0157:Н7 (АУ513502).

Полярографические и спектрофотометрические исследования показали, что первая реакция разложения ЭДТА у штамма LPM-5 зависит от O2, НАДН и стимулируется ФАД, в отличие от монооксигеназ Chelativorans multitrophicus DSM 9103 и Chelativorans oligotrophicus LPM-4, у которых фермент стимулировался ФМН. Показано, что первичными продуктами деградации ЭДТА являются глиоксилат и ионы аммония. Концентрация глиоксилата в культуральной жидкости при росте штамма LPM-5 на среде с ЭДТА составляла 0.013 мкМ, тогда как концентрация ионов аммония достигала 80 мг/л. Первый продукт оксигенирования ЭДТА – глиоксилат, вовлекается в метаболизм через глиоксилатный и глицератный пути, поскольку штамм LPM-5 обладает активностями малатсинтазы и глицераткиназы. Отсутствие активности альдолазы эритро- гидроксиаспартата исключает участие 3-гидроксиаспартатного пути в первичной ассимиляции глиоксилата. Наличие активности дегидрогеназы кетоглутарата свидетельствует о функционировании замкнутого цикла Кребса. NH4+ - второй продукт разложения ЭДТА ассимилируется посредством восстановительного аминирования пирувата. Дальнейшее перераспределение аммонийного азота происходит в реакциях трансаминирования: серин-глиоксилат, аспартат-глиоксилат, аспартат гидроксипируват. Обнаружена высокая активность фруктозо-1,6 бисфосфатальдолазы и очень низкая КДФГ - альдолазы. Следовательно, ассимиляция глюкозы исследуемым штаммом происходит в основном через путь Эмбдена-Мейергофа. Выявлены также активности гексокиназы, фосфорилирующей глюкозу, а также НАДФ+-зависимых форм дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата, ферментов пентозофосфатного пути.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 06-04-49580-a и Минобрнауки РФ РНП 2.1.1.2671. Автор благодарен к.б.н. Чистяковой Т.И., к.б.н. Лысенко А.М., д.б.н. Осипову Г.А за помощь в работе.

Выводы Новый факультативный деструктор ЭДТА (штамм LPM-5) классифицирован как Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov. методами полифазной таксономии.

Установлено, что первый этап деградации ЭДТА у S. chelatiphaga LPM- катализирует ФАД-стимулируемая монооксигеназа, зависящая от НАДН2 и О2.

Одними из первых продуктов оксигенирования ЭДТА являются аммоний и глиоксилат, который далее вовлекается в метаболизм малатсинтазой и, возможно, через тартроновый полуальдегид в глицератный путь. Аммоний ассимилируется восстановительным аминированием пирувата с последующим трансаминированием.

Имеет замкнутый цикл Кребса, сахара метаболизирует в гликолитическом и пентозофосфатном путях.

Литература 1. Weilenmann H-U., Engeli B., Bucheli-Witschel M., Egli T. Isolation and growth characteristics of an EDTA-degrading member of the -subclass of Proteobacteria. Biodegradation.- 2004.-V.15, - P. 289–301.

2. Сатрутдинов А.Д., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Капаруллина Е.Н., Ерошин В.К. Штамм бактерий, характеризующийся потребностью в ЭДТА.

Прикл. биохимия и микробиология- 2005. –Т. 41.- С. 535-540.

УДК 581.121:621. ДЕЙСТВИЕ АНИОНОФОРА НА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОК КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ Ю. Н.Валитова, Ю. М. Каргаполова, С. Ю. Краснобаева, Л. И. Муртазина, И. С. Рыжкина, Е. А. Катаев, Ф. В. Минибаева Введение В настоящее время в фокусе внимания исследователей находится проблема функционирования и принципов организации надмолекулярных комплексов. Трансмембранный перенос ионов, молекулярная рецепция, действие гормонов – все эти процессы включают в себя молекулярное распознавание структуры соединений. Благодаря современным достижениям органической и координационной химии появилась возможность создания искусственных молекул с заданными свойствами, способных к самоорганизации и целенаправленному связыванию. К таким молекулам относятся анионофоры. Эти мембранотропные физиологически активные вещества наряду с антибиотиками могут использоваться для решения экспериментальных задач современной биологии. В настоящее время синтезирован ряд макроциклических комплексообразователей, способных селективно связывать анионы тетраэдрического строения, такие как фосфат и сульфат. Можно полагать, что искусственное связывание фосфатных анионов в клетке неизбежно приведет к сдвигам в энергетическом метаболизме.

Целью данной работы было выявление изменений в энергетическом метаболизме, а именно, дыхательной активности клеток корней пшеницы при действии синтетического анионофора, а также его влияния на качественный и количественный состав фосфор-содержащих нуклеотидов в клетках корней пшеницы.

Объектом исследования служили отсеченные корни 4-х дневных проростков яровой пшеницы. В ходе данной работы изучалось изменение таких параметров как дыхание, проницаемость мембраны, нуклеотидный состав клеток корней. Определение интенсивности дыхания проводили манометрическим методом Варбурга. О проницаемости мембраны корня судили по изменению содержания ионов калия в среде инкубации.

Определение нуклеотидного состава клеток корней пшеницы осуществляли с помощью метода обращенно-фазовой жидкостной хроматографии.

N N H H N N O O NH HN N N NH HN O O N N H H N N Рис.1. Структурная формула макроциклического анионофора V Результаты исследований Отличительной особенностью использованного в работе анионофора является наличие NH-групп, способных к образованию водородных связей и к электростатическому взаимодействию с анионами. В структуре существует определенное чередование азотсодержащих амидных и иминных групп, а также гетероциклов (Рис.1). Это обуславливает высокое сродство молекул данных анионофоров к тетраэдрическим анионам, таким как гидросульфат и дигидрофосфат [1].

Ранее показано, что используемый анионофор в водных растворах образует ассоциаты [2]. В связи с этим, нами изучено влияние анионофора на энергетический метаболизм клеток корней пшеницы в широком интервале концентраций, в котором происходит образование ассоциатов. Обнаружено, что при воздействии вещества V2 в концентрации 10-5 М наблюдалось сильное подавление дыхания. При действии анионофора в концентрации 10 М происходило значительное усиление дыхания через 3, 4, 5 ч инкубации. В концентрации 10-7 М анионофор индуцировал уменьшение интенсивности дыхания через первые 2 ч (рис 2). Интересным представляется факт физиологического эффекта сверхмалых доз (10-13 М) анионофора на корни пшеницы. В этой концентрации наблюдалась небольшая стимуляция интенсивности дыхания (рис. 2).

Таким образом, нами выявлено, что при изменении концентрации анионофора меняется направленность его физиологического эффекта на растительные ткани. В современной биологии физиологические эффекты сверхмалых доз веществ вызывают повышенный интерес. Так, по мнению Е.Б. Бурлаковой [3], действие веществ в сверхмалых концентрациях обусловлено связыванием с мишенями в биологических мембранах и проявлением их сигнальных функций.

Потребление О2, мкл О2 ч-1.г-1 сыр.в.

Рис.2. Изменение потребления кислорода при действии анионофора V2 в различных концентрациях: а – 10-6 М;

б – 10-7 М;

в – 10-5 М;

г – 10-13 М;

контроль – 1% водный раствор ДМФА Важным параметром, характеризующим энергетический статус клеток, наряду с интенсивностью дыхания, является качественный и количественный состав нуклеотидов. Данные таблицы 1 свидетельствуют о падении уровня фосфор-содержащих нуклеотидов при действии анионофора, в то время как количество НАДН не изменялось.

Таблица Изменение нуклеотидного состава клеток корней проростков пшеницы под действием анионофора, нмоль/г. сыр. в.

НАДН+ Вариант АТФ АМФ НАДФ СаСl2 496,20±39,40 845,20±212,10 105,00±15,20 43,11±2, СаСl2 + 44,10±4,48 21,30±3,85 21,50±4,97 46,81±3, анионофорV Возможно, обнаруженные изменения обусловлены особым свойством анионофора связываться с остатками фосфорной кислоты и соединениями, их содержащими. В свою очередь, уменьшение количества доступных молекул субстратов для синтеза АТФ приводит к снижению уровня энергизованности митохондрий при воздействии анионофора.

Полученные результаты дают основание предположить, что синтетические макроциклические анионофоры являются перспективным инструментом в исследованиях энергетического метаболизма растительных клеток.

Литература 1. Катаев Е.А. Новая стратегия и новые методы создания искусственных макроциклических анионных рецепторов : Автореф. Дис.... канд.

химич. наук. Москва, 2006. – 117 с.

2. Муртазина Л.И., Рыжкина И.С., Катаев Е.А., Валитова Ю.Н., Коновалов А.И. Ассоциация мембранотропных макроциклических соединений и их взаимодействие с ПАВ // XIXСимпозиум химическая физика»,22 сетября-3 октября «Современная 2007.Пансионат МГУ «Буревестник», Туапсе. Тезисы докладов. С.378.

3. Бурлакова Е.Б., Конрадов А. А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты // Известия Академии Наук СССР, Серия биологическая. - 1990. - №2. - С.184-193.

УДК 581.19;

58. ПРОДУКЦИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА Картунова Ю. Е., Бояршинов А. В., Асафова Е. В.

Казанский государственный университет Исследовали сортоспецифические изменения содержания пероксида водорода (Н2О2) и малонового диальдегида (МДА) в листьях проростков яровой пшеницы при обезвоживании (3ч), а также влияние донора NO нитропруссида натрия (SNP, 0,5мМ, 1ч) на развитие окислительного стресса.

Установлено повышение уровня Н2О2 (на35-45%) и МДА (на 20-25%) в листьях при действии обезвоживания. Выявлена сортоспецифичность в накоплении пероксида водорода, проявляющаяся в более ранней стрессовой реакции у проростков более устойчивого сорта Омская 33. В условиях обезвоживания нитропруссид натрия не вызывал увеличение количества Н2О2 в листьях (с. Омская 33, с. Дебют), что указывает на защитные свойства донора NO, выступающего в качестве антиоксиданта.

Яровая пшеница (Triticum aestivum L.) – пероксид водорода (Н2О2) – малоновый диальдегид(МДА) - донор NO – обезвоживание – регидратация УДК 581: ГЕНОТИПИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫЕ ОТВЕТЫ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА ДЕЙСТВИЕ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР Л.В.Козлова, Р.Н. Валиуллина, В.В. Рябовол, А.О. Гасанова Казанский государственный университет Введение В условиях Республики Татарстан атмосферная засуха в сочетании с высокой температурой оказывает значительное влияние на растения яровой пшеницы. Именно поэтому исследование влияния температуры представляет первостепенный интерес для различных разделов теоретической биологии и непосредственно связано с решением ряда важных вопросов сельского хозяйства. В ответ на действие абиотических стрессов в первую очередь изменяется проницаемость плазматических мембран, водный статус растений и энергетический обмен клеток [1, c. 187]. В связи с этим актуальным является выяснение различий в изменениях указанных процессов при гипертермии у разных по теплоустойчивости сортов яровой мягкой пшеницы.

Объекты и методы исследований Объекты исследований - листья проростков шести сортов яровой мягкой пшеницы, отличающихся по теплоустойчивости. Растения выращивали в камере искусственного климата «Биотрон-3» при освещении 25000 Люкс и 12-часовом фотопериоде в течение 9 суток в вегетационных сосудах. Часть растений (опыт) адаптировали к постепенно возрастающей температуре в течение 3 часов (370С - 420С), а затем подвергали действию теплового шока ( ч, 420С). Проницаемость мембран контролировали по выходу электролитов (ВЭ) из тканей кондуктометрическим методом, водоудерживающую способность (ВС) листьев оценивали рефрактометрически по содержанию оставшейся в образцах воды после инкубации их в 20% растворе ПЭГ-6000, интенсивность дыхания определяли методом Варбурга по поглощению листьями кислорода при постоянной температуре (250С).

Результаты и обсуждение Одним из основных физиолого-биохимических показателей, определяющих стрессустойчивость растений, является проницаемость клеточных мембран. Ранее по порогу повреждения клеточных мембран исследуемые сорта были разделены на три группы: Омская 33 и Амир – высокотеплоустойчивые, Тризо и Дебют – среднетеплоустойчивые, Тимер и Закамская – низкотеплоустойчивые. Проницаемость мембран – хорошо известный показатель температурной устойчивости. В наших опытах в контроле экзосмос электролитов из тканей растений возрастал в ряду Омская 33АмирТризоДебютТимерЗакамская (рис.1), что соответствует представленной дифференцировке сортов.

В результате воздействия повышенных температур у всех сортов увеличилась вымываемость электролитов из тканей по сравнению с контролем. Причиной этого может быть модификация мембранных липидов в результате усиления их перекисного окисления и/или ферментативного расщепления под действием повышенной температуры [2]. При этом меньше всего проницаемость мембран возрастала у сортов Закамская и Тимер (на 8, и 13,8% от контроля, соответственно), больше - у Омской 33 и Амира (на 36, и 33,9% от контроля). У сортов Тризо и Дебют изменения проницаемости мембран были средними (19,7 и 21,5% от контроля).

Выход электролитов, % от полного выхода Омская 33 Амир Тризо Дебют Тимер Закамская Рис. 1. Экзосмос электролитов из тканей разных сортов яровой пшеницы (светлые столбики - контроль (25 0С);

серые - опыт (3 ч, 37- 420С и 2 ч, 420С)).

Можно заключить, что на действие повышенных температур мембраны устойчивых сортов реагируют более значительным увеличением проницаемости, чем неустойчивых. Эта точка зрения подтверждается данными Г.В. Удовенко [3], согласно которым в случае, если воздействие неблагоприятного фактора носило кратковременный характер, у более устойчивого генотипа метаболические отклонения выражаются сильнее, чем у неустойчивого.

Изменения энергетического обмена, так же как и проницаемости мембран, относятся к первичным ответам клетки на стрессовые условия[3], поэтому представлялось целесообразным изучение интенсивности дыхания исследуемых генотипов. Наиболее интенсивное дыхание в контроле было отмечено у сортов Закамская и Тимер, наименьшей интенсивностью дыхания характеризовались растения сортов Амир и Тризо (рис. 2). Следует сказать, что Амир и Тризо являются низкорослыми сортами и формируют значительно меньшую биомассу растения, что может быть связано с меньшими энергетическими затратами на синтетические процессы, отражением чего явится и более низкий уровень интенсивности дыхания.

В условиях повышенного температурного режима у четырех сортов (Закамская, Тризо, Дебют и Тимер) наблюдали депрессию дыхания по сравнению с контролем, причем у Тризо и Дебюта она была относительно невелика – снижение составило 11,4 и 23,8%, соответственно, а у Закамской и Тимера - около 55%, что свидетельствует о существенном угнетении дыхательной функции. У сортов Омская 33 и Амир, напротив, в опыте было отмечено увеличение интенсивности дыхания более чем на 65%, что является доказательством интенсификации энергетического обмена клеток. Можно предположить, что изменения подобного характера являются следствием того, что теплоустойчивые сорта Амир и Омская 33 в нормальных условиях не реализуют в полной мере потенциальные энергетические возможности, которые при стрессе исчерпываются полнее.

Интенсивность дыхания, мкл О2/г сыр. веса/ч Омская 33 Амир Тризо Дебют Тимер Закамская Рис.2. Интенсивность дыхания листьев разных сортов яровой пшеницы Обозначения как на рис.1.

Вероятно, при неблагоприятных условиях происходит переход устойчивых сортов к новому более адаптированному состоянию.

Корреляционный анализ выявил взаимосвязь интенсивности дыхания с проницаемостью мембран (r = + 0,84) у изучаемых сортов. Это позволяет использовать оба этих показателя в качестве диагностического признака устойчивости.

Оводненность тканей растений всех сортов составляла приблизительно 89% от сырого веса, сортовые различия были недостоверны. В контроле сильнее всего водоотнимающий фактор подействовал на листья растений сортов Закамская и Дебют. Содержание оставшейся воды составило у них 49,77% и 59,92% от сырого веса, соответственно, в то время как ткани Омской 33 сохранили 77,53% (рис. 3). Вероятно, это объясняется разной степенью проницаемости мембран клеток каждого из сортов. Это подтверждается высоким коэффициентом корреляции между ВС и ВЭ (r = + 0,95).

Содержание оставшейся воды, % от сырого веса Омская 33 Амир Тризо Дебют Тимер Закамская Рис.3. Водоудерживающая способность листьев разных сортов яровой пшеницы Обозначения как на рис.1.

Общей реакцией на действие высокой температуры было увеличение ВС.

При этом общее содержание воды в тканях и сортовые различия этого показателя остались на прежнем уровне. Исключение составил сорт Тимер, растения которого ответили на засуху резким снижением общего содержания воды. Максимальной ВС в опыте характеризовались сорта Омская 33(83,8%) и Амир(86,21%). У остальных сортов содержание оставшейся воды находилось в пределах от 66,33% (Дебют) до 75,34% (Закамская) от сырого веса.

Причиной увеличения водоудерживающей способности может быть накопление клетками осмолитов, например, пролина. В опыте отсутствовала корреляция между ВС и выходом электролитов. Это свидетельствует о превалирующем вкладе других механизмов на фоне не столь выраженной роли проницаемости мембран в водоудерживающую способность листьев при действии повышенных температур.

Таким образом, установлено, что устойчивые генотипы при действии повышенных температур увеличивают интенсивность дыхания, тогда как неустойчивые, напротив, снижают. Это указывает на более полную реализацию энергетического потенциала у теплоустойчивых сортов яровой пшеницы. На кратковременное воздействие гипертермии мембраны более устойчивых сортов отвечают большим увеличением проницаемости, чем неустойчивых. Отмечено, что в оптимальных температурных условиях водоудерживающая способность листьев растений в основном зависит от проницаемости мембран, тогда как при действии адаптивных и стрессовых температур данный показатель в большей степени обуславливается действием других механизмов. Выявлена прямая зависимость между реакцией проницаемости мембран и интенсивности дыхания на действие повышенных температур и теплоустойчивостью исследуемых генотипов яровой пшеницы.

Литература 1. Косулина Л.Г., Луценко Э.К. и др. Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. – Ростов-на-Дону: Издательство Ростовского университета, 2007. – 236 с.

2. Лукаткин А.С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений // Физиология растений. – 2003. – Т. 50. – С. 271-274.

3. Удовенко Г.В. Устойчивость растений к абиотическим стрессам. // Физиологические основы селекции растений. – Санкт-Петербург:Изд во ВИР, 1995. – Т. II. – С. 293-346.

УДК 581. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ЛЕКТИНОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ЗАКАЛИВАНИИ.

Московкина М.А.

Казанский государственный университет В клетках корней проростков озимых пшениц (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808 и Галина исследовано изменение полипептидного состава и функциональной активности лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного воздействия. Обнаружено несколько фаз изменения активности лектинов в ходе адаптации растений к холоду, что свидетельствует об их участии в формированиине специфического адаптационного синдрома клеточной системы. При сравнении кривых, отражающих изменения активности лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного закаливания, в растениях сорта Мироновская 808 все этапы неспецифического адаптационного синдрома проходят быстрее, чем у сорта Галина. Обнаружены значительные изменения полипептидного состава лектинов в первые часы действия гипотермии.

УДК 581. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ, ГЕНЕТИЧЕСКУЮ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТАТУС КЛЕТОК КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ Л.Р. Нигматуллина, Г.В. Камалова, Н.И. Румянцева Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань Введение С увеличением времени культивирования в каллусных культурах могут происходить биохимические, генетические, физиологические, морфологические и цитологические изменения. Следствием такой нестабильности может стать полная потеря регенерационной способности каллусных культур. Поскольку природа вариабельности in vitro мало изучена, управление ею усложняется и сдерживает масштабное использование биотехнологий. Одной из причин, приводящих к потере регенерационной способности, может быть развитие окислительного стресса, вызываемое условиями культивирования [1, 2]. Предполагают, что механизм возникновения изменчивости in vitro сходен со спонтанными мутациями и вызывается активными формами кислорода [3, 4].

В каллусных культурах гречихи посевной регенерационная способность быстро снижается (через 6-12 месяцев культивирования), что коррелирует с изменением морфологических, цитогенетических и биохимических характеристик каллуса [5]. Представляет интерес исследовать изменения редокс-статуса клеток каллусов гречихи посевной при длительном культивировании. Цель данной работы - исследовать изменение регенерационной способности, хромосомной вариабельности и окислительного статуса в клетках длительно культивируемых каллусов гречихи посевной Fagopyrum esculentum Moench.

Методы В работе использовали морфогенные и неморфогенные каллусы гречихи посевной Fagopyrum esculentum Moenh. Каллусы были получены из незрелых зародышей осенью 2005 года;

морфология и получение таких культур описаны нами ранее [5, 6]. Культуры поддерживали в термостате при температуре 26+ 20С, в темноте, на каллусогенной среде RХ, (рН 5.5 – 5.6).

Для определения регенерационной способности каллусные культуры помещали на регенерационные среду RXR и Ms б/г [5] и культивировали на свету (5000 лк) в условиях 16/8 часового фотопериода и температуры 25 0C.

Оценивали способность к образованию соматических зародышей, почек и корней. Для приготовления цитогенетических препаратов каллус фиксировали в фиксаторе Кларка. Окрашивание хромосом проводили 2% ным пропионовым орсеином (“Serva”, Германия). Препараты анализировали с помощью микроскопа Jenamed “Сarl Zeiss” (Германия). Содержание Н2О2 в клетках определяли спектрофотометрически, согласно [7]. Активность растворимой пероксидазы определяли по методу Бояркина [8]. Активность каталазы определяли согласно [9], активность супероксиддисмутазы (СОД) – согласно [10].

Результаты и обсуждение Первично морфолого-цитогенетический анализ, а также оценку регенерационной способности полученных в 2005 г каллусных культур проводили через 4 мес культивирования (2006 г). Линии 1-10, 2-5 и 3-12 были охарактеризованы как морфогенные (табл.1). Через 1 год культивирования линии 2-5 и 1-10 снизили морфогенную способность (табл.1). В этих культурах образование соматических зародышей происходило с небольшой частотой, и их развитие ограничивалось ранними стадиями. Наоборот, линия 1-18, ранее охарактеризованная как неморфогенная, на среде Ms б/г проявляла способность к интенсивному образованию корней. Линия 3- сохранила способность к образованию почек на прежнем уровне.

Таблица 1. Изменение морфогенной способности, доли диплоидных клеток и содержания Н2О2 в длительно культивируемых каллусах гречихи посевной Морфогенная Доля диплоидных Содержание Н2О2, способность клеток,% мкМ/г сух веса Линия 2006 2007 2006 2007 2006 +++ + 7,15±0, 1-10 83±3,07 40±4 0,071±0, 2-5 +++ + 80±2,83 45±4,6 0,97±0,07 5,8±0, 3-12 ++ ++ 19±2,23 79±5,1 21,44±0,73 3,55±0, к - 2,75±0, 1-18 10±1,69 94.9±1,1 16,59±1, +,++,+++ - интенсивность морфогенной способности (образование соматических зародышей или почек) - - отсутствие морфогенной способности к – каллусы формировали только корни Из полученных результатов следует, что снижение регенерационного потенциала коррелирует со снижением доли диплоидных клеток (линии 2-5 и 1-10), тогда как проявление способности к морфогенезу сопровождается увеличением доли диплоидных клеток (линия 1-18). Интересно отметить, что через 4 мес культивирования (в 2006 г.) в линии 3-12 морфогенная активность наблюдалась при низком числе диплоидных клеток, а через 1,5 года культивирования (в 2007 г.) произошло значительное увеличение доли клеток с диплоидным набором хромосом, что, вероятно, обусловлено стабилизацией штамма, при этом морфогенная способность культуры осталась высокой.

Вероятно, первые исследования (в 2006 году) были проведены, когда в каллусе начался селективный отбор в пользу популяции клеток с диплоидным набором хромосом.

По мнению ряда авторов, генетическая нестабильность, наблюдаемая в культурах клеток растений, может быть связана с высоким уровнем окислительного стресса, создаваемого условиями культивирования in vitro [1, 2]. Одним из маркеров окислительного стресса является повышение содержания Н2О2 в клетках. При анализе внутриклеточного содержания Н2О в четырех различных линиях каллуса F.esculentum было установлено, что уровень внутриклеточной Н2О2 обнаруживает обратную зависимость от величины морфогенной способности культур. Например, в линиях 1-10 и 2- частота образования соматических зародышей уменьшилась, при этом содержание Н2О2 в клетках увеличилось. Интересно, что в линии 1- активация ризогенеза также коррелировала с уменьшением уровня внутриклеточной Н2О2. Кроме того, увеличение содержания внутриклеточной Н2О2 коррелировало с увеличением доли полиплоидных клеток в линиях 1- и 2-5, а в линиях 1-18 и 3-12, в которых наблюдали уменьшение доли полиплоидных и увеличение доли диплоидных клеток, отмечали снижение среднего содержания Н2О2 по сравнению с ранее полученными результатами.

Таким образом, нами было установлено, что в культурах гречихи посевной, снижение регенерационной способности коррелирует с увеличением доли полиплоидных клеток и повышением внутриклеточного содержания Н2О2, тогда как усиление морфогенной способности сопровождается увеличением доли диплоидных клеток и снижением содержания Н2О2 в клетках.

При исследовании активности антиоксидантных ферментов было установлено, что активность растворимой пероксидазы в линиях 2-5, 1-18 и 3 12 со временем культивирования снижается, а в клетках линии 1- наблюдается увеличение активности растворимой пероксидазы по сравнению с данными 2006 года (табл.2).

Было отмечено, что активность СОД во всех исследованных линиях превышала активность других ферментов (табл.2). За 1,5 года культивирования активность СОД в линии 1-18 снизилась (табл. 2), что коррелирует со снижением содержания внутриклеточной Н2О2 (табл. 1). Для линии 2-5 и 3-12 за этот период было отмечено увеличение активности СОД практически в 2 раза.

Таблица 2. Изменение активности антиоксидантных ферментов в длительно культивируемых каллусах гречихи посевной, отн.ед/г сух веса Растворимая СОД Каталаза пероксидаза Линия 2006 2007 2006 2007 2006 1-10 – 57,3±4,7 41,2±1,5 57,42±4,8 – 1,091±0, 2-5 46±9,2 95,95±3,1 32,6±5 16,76±1,9 – 0,43±0, 1-18 104,3±6,3 76,9±1,3 20,9±2,2 0,31±0,04 – 0,31±0, 3-12 42,5±2,2 76,47±1,9 10,7±0,46 0,259±0,03 – 0,26±0, - нет данных Активность каталазы у всех исследуемых линий находилась в диапазоне от 0,2 до 1,1 отн.ед./г сухого веса. При этом относительно высокой активностью обладала линия 1-10 (табл.2). Тем не менее, нам не удалось выявить корреляцию между изменением морфогенной способности в длительно культивируемых каллусах и активностью антиоксидантных ферментов в них. Возможно, высокая тканевая гетерогенность исследуемых культур обеспечивает вариабельность способов антиоксидантной защиты, в том числе и неферментативной, поэтому более точную информацию можно получить при сравнении морфогенных каллусов и полученных из них полностью неморфогенных культур, представленных, главным образом, паренхимными клетками.

Литература 1. Benson, E.E. Special symposium: in vitro plant recalcitrance. Do free radicals have a role in plant tissue culture recalcitrance?// In Vitro Cell. Dev.

Biol.—Plant – 2000. – V. 36. – P. 163–170.

2. Cassells A.C., Curry R. F. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers//Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2001. – V. - 64. – P.145-157.

3. Anonymous S. Habituation, hyperhydricity and plant cancer // Agricell Rep.

– 1995. – V. 25. – P. 29.

4. Micke A., Donini B. Induced mutation. In: Hayward M.D. (ed.) Plant Breeding Principles and Prospects. - 1993. – P. 52-62.

5. Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.В., Сальников В.В., Гумерова Е.А., Лозовая В.В. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи//Физиология растений - 1989. - Т.36, №1. С.187-194.

6. Румянцева Н.И., Сальников В.В., Федосеева Н.В., Лозовая В.В.

Особенности морфогенеза в длительно культивируемых каллусах гречихи //Физиология растений -1992. -Т.39, №1. - С.143-151.

7. Bellincampi D., Dipierro N., Salvi G. Extracellular H2O2 induced by oligogalacturonides is not involved in the inhibition of the auxin-regulated rolB gene expression in tobacco leaf explants //Plant Physiol. - 2000. - V.122, №4. P.1379-1385.

8. Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Регуляция начальных этапов эмбриогенеза у высших растений//Физиология растений. – 1994.-Т.41, № 4. С. 467 - 477.

9. Aebi Н. Catalase in vitro//Methods in Enzymology. – 1984. - V. 105. – P.

121 – 126.

10. Giannopolitis C.N., Ries S.K. Superoxide dismutase. Occurence in Higher Plants//Plant Physiol. - 1977. - V. 59. - P. 309-314.

УДК 579.8. ИЗМЕНЕНИЕ ВИРУЛЕНТНЫХ СВОЙСТВ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6) ПРИ АДАПТАЦИИ К СТРЕССОРАМ А.А. Музыкантов1, А.Д. Пельникевич Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань Казанский государственный университет, Казань Введение Mycoplasma gallisepticum – широко распространенный возбудитель респираторных микоплазмозов сельскохозяйственных птиц, передающийся как горизонтальным, так и вертикальным путями. Инфицирование птиц этой микоплазмой может вызывать патологию и гибель куриных эмбрионов, а также контаминацию создаваемых на их основе вирусных вакцин [1, с. 445 454]. Контроль и подавление инфекций, вызванных M. gallisepticum, представляет серьезную проблему, решение которой связывают с успехами изучения молекулярной и клеточной биологии микоплазм, определяющей адаптацию этих микроорганизмов к биотическим и абиотическим стрессорам и патогенность. В наших исследованиях [2, с. 87-88] было впервые показано, что адаптация M. gallisepticum S6 связана с изменениями морфологии, ультраструктуры и экспрессии генома клеток микоплазмы. В оптимальных условиях роста M. gallisepticum S6 образует клетки грушевидной формы с полярными и цитоскелетоподобными структурами (неадаптированные формы – НАФ), тогда как в неблагоприятных условиях микоплазма образует мелкие коковидные клетки, лишенные полярных и цитоскелетоподобных структур (адаптированные формы – АФ). В литературе есть данные, что изменения морфофизиологии и ультраструктуры, возникающие у аспорогенных бактерий в неблагоприятных условиях роста, могут сопровождаться также изменениями вирулентности этих микроорганизмов [3]. В этой связи целью нашей работы был сравнительный анализ способности к индукции повреждений генома клеток M. gallisepticum S6, образующихся в оптимальных и неблагоприятных условиях роста.


Материалы и методы В работе был использован штамм Mycoplasma gallisepticum S6, полученный из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Н.Ф.Гамалеи, а также тестерный штамм Escherichia coli PQ37, (экспрессия гена -галактозидазы PQ37 находится под контролем промотора SOS оперона), полученный из коллекции Института общей генетики им.

Н.И.Вавилова РАН. Адаптированные и неадаптированные формы клеток M.

gallisepticum S6 получали согласно [4]. Выполнение экспериментов для выяснения токсических и генотоксических эффектов клеток M. gallisepticum S6 и их культуральной жидкости осуществляли по Килардье [5] согласно методическим указаниям [6]. Токсическое влияние образцов НАФ, АФ и их культуральной жидкости измеряли по уровню экспрессии конститутивной щелочной фосфатазы, уровень индукции SOS-ответа – по активности индуцибельной -галактозидазы с учетом токсичности образца [6].

Показателем включения SOS-ответа является дозозависимое возрастание расчетной величины фактора индукции (IF, отношение уровня активности галактозидазы и щелочной фосфатазы в опытном варианте к контрольному, не содержащему исследуемых образцов). О наличие генотоксических эффектов свидетельствует значение IF 2 [7]. В качестве положительного контроля использовали стандартный супермутаген – этилметансульфонат ( мкг/мл). Для обработки данных были использованы стандартные компьютерные программы статистической обработки из пакета Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение Результаты сравнительных исследований токсических и генотоксических свойств НАФ и АФ M. gallisepticum S6 представлены в таблице 1.

Достоверные изменения активности щелочной фосфатазы тестерных клеток E.coli PQ37 при воздействии НАФ M. gallisepticum S6 и их культуральной жидкости по сравнению с контролем не установлены. Это позволяет заключить, что токсические метаболиты в клетках НАФ микоплазм не накапливаются. Активность же -галактозидазы у клеток E. coli PQ37 при действии НАФ и их культуральной жидкости значительно превышает контрольные показатели, что свидетельствует о включении экспрессии генов SOS-оперона тестерных бактерий (табл. 1).

Табл. 1. Индукция SOS-ответа тестерного штамма E. coli PQ37 при действии клеток M.gallisepticum S6 (НАФ и АФ) и их культуральной жидкости Активность Активность IF, Вариант щелочной галактозидазы, ед.

фосфатазы, ед. ед.

Среда для НАФ* 0,36±0,02 0,003±0,0005 Н Клетки 19, 0,35±0,03 0,06±0, А M.gallisepticum S6 Ф Культуральная 0,43±0,05 0,03±0,001 7, жидкость Среда для АФ 0,34±0,04 0,13±0,01 Клетки А 0,38±0,05 0,13±0,02 0, M.gallisepticum S Ф Культуральная 0,44±0,05 0,12±0,02 0, жидкость * В качестве контроля использовали среду для роста микоплазмы Показатели факторов индукции (IF) SOS-ответа клеток E. coli PQ37 для этих образцов составляют соответственно 19,54 и 7,8, что существенно превышает IF стандартного супермутагена (3,07). В отличие от НАФ M.

gallisepticum S6 АФ микоплазмы, так же как и их культуральная жидкость, не оказывали влияния на активность ферментов щелочной фосфатазы и галактозидазы тестерного штамма. Соответственно, расчетные величины IF (0,9 и 0,71) находятся за пределами значений, определяющих индукцию SOS ответа (табл.1). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии токсических эффектов исследуемых образцов по отношению к тестерным бактериям. Вместе с тем, значительное превышение контрольных значений галактозидазной активности у клеток E. coli PQ37 при воздействии НАФ и их культуральной жидкости, но не АФ и их культуральной жидкости, подтверждает наличие мутагенного потенциала у образцов НАФ и отсутствие такового у АФ клеток микоплазмы.

Проявление генотоксических эффектов как у НАФ, так и у культуральной жидкости этих клеток в отношении E. coli PQ37 позволяет предположить секрецию генотоксических метаболитов из клеток микоплазмы в окружающую среду и/или изменения компонентов культуральной среды под действием секретируемых метаболитов НАФ M. gallisepticum S6.

Выраженный генотоксический эффект НАФ (IF = 19,54) по сравнению с их культуральной жидкостью (IF = 7,8) может быть свидетельством того, что генотоксические метаболиты НАФ очень тесно взаимодействуют с поверхностными структурами микоплазмы, переходя в культуральную жидкость постепенно. Природа этих метаболитов представляет особенный интерес с точки зрения патогенного потенциала этой широко распространенной микоплазмы в отношении инфицированных клеток хозяина и микроорганизмов в микробиоценозах [8, с. 145-236].

Отсутствие SOS-ответа у клеток тестерного штамма E. coli PQ37 при воздействии АФ и их культуральной жидкости свидетельствует об отсутствии генотоксичности у исследуемых образцов АФ. Полученные данные позволяют заключить, что у M. gallisepticum S6, как и у ряда других аспорогенных бактерий, при адаптации к неблагоприятным условиям роста происходит аттенуация вирулентности, связанной с генотоксичностью клеток микоплазмы. Молекулярные основы этого феномена ещё предстоит выяснить.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01047а) Литература 1. McGarrity G.J. Kotani H., Butler H. Mycoplasmas and tissue culture cells // Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / Maniloff J. McElhaney R.N., Finch L., Baseman J.B. (eds). Washington. - 1992. - P. 445–456.

2. Чернов В.М., Чернова О.А., Давыдова М.Н. и др. Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций / Сборн. тез. итоговой конференции в рамках приоритетного направления "Живые системы" – Москва, 6-7 декабря 2007. – С. 87-88.

3. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. - 1998. - Т. 67. - № 6. - С. 725–735.

4. Чернов В.М., Мухаметшина Н.Е., Гоголев Ю.В., Нестерова Т.Н., Чернова О.А. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста:

нанотрансформация и фитопатогенность Acholeplasma laidlawii PG8 // ДАН. - 2007. - Т. 413. - № 2. - С. 271–275.

5. Quillardet P., Huisman O., Ari R.D., Hofnung M. SOS-chromotest, a direct assay of a SOS-function in Escherichia coli K12 to measure genotoxity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - V. 79. - P. 5971-5975.

6. Ильинская О.Н., Маргулис А.Б. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности // Методическое руководство. Казань:

изд-во КГУ. - 2005. - 31с.

7. Mersch-Sundermann V., Kern S., Wintermann F. Genotoxicity of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons and related structures on Escherichia coli PQ37 (SOS-chromotest) // Environ. and Molec. Mutagen. - 1991. - V.18. - P.

41–50.

8. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вонский М.С. // Микоплазмы. С-Пб.: Наука. – 2002. – 319с.

УДК 544.653.2:577.323. ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ НА ЭЛЕКТРОДЕ, МОДИФИЦИРОВАННОМ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ Никитина И.И., Бондарь О.В., Булатов Э.Р., Туаева Н.О., Абдуллин Т.И.

Казанский государственный университет, Казань Исследовано электрохимическое поведение альбумина, иммуноглобулина G и ДНК на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками. Установлено, что углеродные нанотрубки существенно облегчают электроокисление биомолекул, наблюдаемое при +0.8 В для белков и +1.1 В для ДНК. Выяснена возможность совместного детектирования белков и ДНК на модифицированном электроде;

получены калибровочные графики. Результаты представляют интерес в области создания электрохимических биосенсоров на основе наноматериалов и биомакромолекул.

УДК 577.151. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ МУТАНТНЫХ ФОРМ 9-ЛИПОКСИГЕНАЗЫ КУКУРУЗЫ Осипова Е. В., Чечеткин И. Р., Ярин А. Ю., Мухитова Ф. К., Гоголев Ю. В., Гречкин А.Н.

Казанский институт биохимии и биофизики, Казань, Россия Введение Согласно существующим в литературе представлениям, специфичность действия липоксигеназ определяется ориентацией субстрата в активном центре и наличием или отсутствием стерического препятствия, расположенного рядом с местом диоксигенирования. Ранее уже были проведены эксперименты, поддерживающие эту теорию на n-2 и n+ липоксигеназах животных и n+2 липоксигеназе растений, но n-2 растительная липоксигеназа не исследовалась.

В работе Коффа и Браша в качестве такого стерического препятствия выделен метильный радикал аминокислотного остатка аланина на поверхности субстрат-связывающего кармана фермента, при замене которого на глицин происходит изменение региоспецифичности и стереоспецифичности липоксигеназной реакции [3].

Эксперименты, поддерживающие эту теорию были проведены на n-2 и n+2 липоксигеназах животных и n+2 липоксигеназе растений, но n- растительная липоксигеназа не исследовалась.

Целью нашей работы было выявление эффекта замены Коффа Браша на специфичность реакции растительной n-2 липоксигеназы.

Нами были использованы методы: сайт-направленный мутагенеза на основе полимеразной цепной реакции, экспрессии рекомбинантного фермента дикого и мутантных типов, определение кинетики ферментов, высокоэффективная жидкостная хроматография на нормальной и хиральной фазе продуктов реакции фермента дикого и мутантных типов, газовая масс спектрометрия.

Так нами была исследована специфичность 9-липоксигеназы кукурузы, клонированной и любезно предоставленной Ненси Келлер, а также полученных нами мутантных форм.

Результаты и обсуждения Рассмотрим действие мутации Коффа и Браша на n-2 липоксигеназу млекопитающих, Так как липоксигеназы млекопитающих используют в качестве субстрата арахидоновую кислоту, то стереоспецифическое удаление атома водорода происходит, в случае 8S-липоксигеназы мыши, от 10 атома углеродной цепочки арахидоновой кислоты, при этом в определяющей специфичность позиции находится аланин, и в качестве продукта реакции образуется 8S-гидроперекись. При замене аланина в этой позиции на глицин, то есть, удалении стерического препятствия, специфичность липоксигеназы должна измениться на 12R, то есть, согласно теории Коффа и Браша изменяется и стереоспецифичность и региоспецифичность фермента. При этом субстрат входит в активный центр своим карбоксильным концом.


Отметим, что на практике происходит преобразование 8S-липоксигеназы в обладающую двойной специфичностью.

Согласно вышеизложенной теории дикий тип липоксигеназы кукурузы, имеющий такую аминокислотную последовательность активного центра, что определяющий специфичность аланин находится в 562 позиции, должен иметь в качестве преобладающего продукта реакции 9S-гидроперерекись.

При замене аланина в этой позиции на глицин должно произойти изменение региоспецифичности и стереоспецифичности реакции с образованием 13R гидроперекиси. При этом замена аланина в 560 позиции на глицин может оказать подобный эффект лишь в случае, если и этот аминокислотный остаток является критичным для специфичности реакции.

Согласно результатам нашей работы можно сказать, что исходный рекомбинантный фермент действительно производит 98% 9-гидроперерекиси, при этом наблюдается минорный продукт реакции 13-гидроперекиси, как и мутанта, имеющего замену аланина на глицин в 560 позиции. При замене аланина на глицин в 562 позиции наблюдается 68,5% 9-гидроперерекиси и Во всех случаях реакция проходит высоко 31,5% 13-гидроперекиси.

специфично, так как отсутствуют продукты автоокисления субстрата.

Были определены также стерические конфигурации продуктов реакции.

Оказалось, что исходный фермент, как и мутантный фермент с заменой Ala560Gly производит 9S-гидроперекись в количестве 97,5% от всех продуктов реакции, а в качестве минорных продуктов выступают 9R, 13S и 13R гидроперекиси, общее количество которых не превышает 2,5%.

Мутантный фермент с заменой Ala562Gly образует 9S-гидроперекись в количестве 66%, и 13R-гидроперекись в количестве 30% от общих продуктов, а также минорные продукты 9R и 13R гидроперекиси в количестве не превышающим 3,4% от всех продуктов.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что 560 позиция, в которой также находится аланин, не является определяющей для специфичности фермента, так как специфичность реакции мутантного фермента соответствует специфичности фермента дикого типа.

В момент катализа, согласно теории индуцированного соответсвия, имеется четкое соответствие между радикалами аминокислотных остатков фермента, негемовым железом и субстратом, при этом субстрат принимает «навязываемую» ферментом конформацию. Введение или удаление стерического препятствие приводит к тому, что в момент катализа субстрат внутри субстрат-связывающего кармана фермента имеют иную конформацию, чем в исходном ферменте, конформация фермента изменяется соответсвующим образом, поэтому и диоксигенирование происходит. При этом двойная специфичность реакции некоторых растительных липоксигеназ объясняется тем, что в момент катализа субстрат внутри субстрат связывающего кармана может принять несколько конформации, и в зависимости от конформации субстрата будет образован продукт реакции.

Согласно созданной пространственной модели трехмерной структуры липоксигеназы кукурузы, постоенной на основе гомологии первичнй последовательности аминокислот с последовательностью липоксигеназы сои, боковая цепь аминокислотного остатка Ala560 находится во внутренней части активного центра. Боковая цепь аминокислотного остатка Ala562, напротив, находится на поверхности активного центра, причем в непосредственной близости от атома железа и, по-видимому, принимает участие в формировании региоспецифичности фермента.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что при замене Ala560Gly в мутантном ферменте не изменяет регио- и стереоспецифичность реакции, так как, эта замена не является определяющей для специфичности реакции.

При замене в липоксигеназе кукурузы Ala562Gly изменяется региоспецифичность реакции, так как удаляется стерическое препятствие в виде метильного радикала аминокислотного остатка, определяющее специфичность реакции.

Полученные данные свидетельствуют о частичном смещении региоспецифичности фермента, тогда как стереоспецифичность не изменяется. Ранее Коффа и Браш предположили, что метильный радикал аланина может быть стерическим препятствием, затрудняющим доступ кислорода к определённой позиции. С нашей точки зрения, более убедительным может быть другое объяснение: замена аланина на глицин или наоборот может вызывать изменение позиции субстрата по отношению к железу и, тем самым – к изменению региоспецифичности фермента.

Список литературы 1. Gillmor S.A., Villasenor A., Fletterick R., Sigal E., Browner M. F. The structure of mammalian 15-lipoxygenase reveals similarity to the lipases and the determinants of substrate specifity // Nature Structure of Biology.- 1998. – V.4, pp. 1003-1009.

2. Garner H. W. Soybean lipoxygenase-1 enzymatically forms both 9(S) and 13(S)-hydroperoxides from linoleic acid by pH-dependent mechanism // Biochimic Biopphysic Acta. – 1989. – V. 1001, pp. 274 281.

3. Coffa G., Brash A. R. A single active site residue directs oxygenation stereospecificity in lipoxygenases: Stereocontrol is linked to the position of oxygenation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2004. – V. 101, pp. 15579–15584.

УДК 579.8.086. ЦИТОЛОГИЯ ПАРАЗИТИЗМА БАКТЕРИИ KAISTIA SP. ШТАММА NF1 НА НЕКОТОРЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЛЕЬНЫХ БАКТЕРИЯХ В.Н. Поливцева1, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино Пущинский Государственный Университет С помощью трансмиссионной электронной и флуоресцентной микроскопии изучен характер взаимодействия свободноживущей ультрамикробактерии (УМБ) - штамма NF1, относящейся к роду Kaistia, с представителями семи видов грамположительных и грамотрицательных гетеротрофных бактерий. Обнаружено, что штамм NF1 проявляет паразитическую активность по отношению к грамположительной бактерии Bacillus subtilis и грамотрицательной – Acidovorax delafieldii. Клетки УМБ прочно прикрепляются к оболочкам клеток-жертв и вызывают их лизис, проявляя таким образом признаки типичного эктопаразитизма.

Бактериальный паразит из рода Kaistia – штамма NF1 обладает особыми адгезивными клеточными структурами: ловчими полисахаридными сетями, липкими гранулами на нитях, а также прикрепительными конусовидными протрузиями на клетках;

представлен новый механизм адгезии клеток паразитов к клеткам жертв.

УДК 581. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ РЕАКЦИИ ХИЛЛА И НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО РАВНОВЕСИЯ В ХЛОРОПЛАСТАХ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.) ПРИ ОБЛУЧЕНИИ И ГИПЕРТЕРМИИ Е.С. Потехина, С.В. Зинина, Е.А. Васильева, Ю.В. Синицына, Е.О. Половинкина, ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород E–mail: kfr@bio.unn.ru Физиологический ответ живых систем на слабые воздействия характеризуются общностью свойств, что свидетельствует о едином механизме их инициации, реализующемся через клеточные мембраны.

Показано, что ионизирующее излучение в малых дозах 0,1 и 1 Гр и последующая гипертермия вызывают взаимосвязанные изменения начальных фотосинтетических реакций, процессов липопероксидации, а также изменения в антиоксидантной системе, включая супероксиддисмутазу и аскорбат. Облучение в дозе 0,1 Гр вызывало гиперчувствительный ответ на воздействие повышенной температуры, а большая доза (1 Гр) формировала адаптивный ответ хлоропластов.

УДК 630:576. ПРЕПАРАТ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ СЫРЬЯ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ Рафаилова Э.А., Тухбатова Р.И., Тазетдинова Д.И., А.Ф. Кабрера, Алимова Ф.К.

Казанский Государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина Найденный нами штамм обладает высокой активностью синтеза ксиланаз, сохраняет высокую стабильность в кишечном тракте животных, снижает вязкость раствора некрахмалистых полисахаридов в пищеварительном тракте животных и птиц. Благодаря этому улучшается перевариваемость корма - на 40% по сравнению со стандартным ферментным препаратом.

УДК 579. СКРИНИНГ РАСТЕНИЙ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ С ПОМОЩЬЮ МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова, Г.И. Высочина*, О.Н. Октябрьский Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь * Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск Введение Активные формы кислорода (АФК) оказывают токсическое и мутагенное действие на все виды клеток вследствие окислительного повреждения мембранных липидов, белков и ДНК. Бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, регулируемыми на генетическом уровне. У бактерий Escherichia coli ключевым регулятором адаптивных ответов на пероксидный стресс являются транскрипционный фактор OxyR (и регуляторный ген oxyR), который индуцирует согласованную экспрессию групп генов в ответ на действие перекиси водорода (H2O2) [1].

В последние годы большое внимание уделяется изучению антиоксидантной активности (АОА) экстрактов лекарственных растений, которые находят широкое применение в официальной и народной медицине, пищевой промышленности и косметике. Во многих случаях обнаружена высокая антиоксидантная активность экстрактов и предполагается, что эта активность может вносить существенный вклад в их лечебный эффект.

Важный вклад в поддержание здоровья человека вносит совокупная деятельность кишечных бактерий, которые принимают непосредственное участие в усвоении макроорганизмом полифенолов растений, оказывающих антиоксидантные эффекты [2-5]. В связи с этим, одним из направлений современных исследований является изучение влияния биологически активных веществ растений на бактерии, входящие в состав нормальной микрофлоры человека.

Скрининг растений, обладающих высокой антиоксидантной способностью, проводят с использованием методов in vitro, используя модели с генерацией определенного вида радикалов, а также in vivo на клеточных культурах разных организмов [6]. Наибольшую ценность представляют исследования, сочетающие оба подхода.

Целью настоящей работы явилось изучение антиоксидантной активности экстрактов растений, произрастающих на территории Западной Сибири с помощью бактериальных тест-систем.

Методы и материалы Водно-спиртовые экстракты растений были предоставлены сотрудниками лаборатории фитохимии Центрального сибирского ботанического сада СО РАН.

АОА экстрактов in vivo оценивалась как защитный эффект на скорость роста клеток Escherichia coli MN111 при воздействии 2 мМ H2O2 в течение мин после предобработки экстрактами (50 µl на 5 мл среды).

Действие экстрактов на экспрессию антиоксидантного гена katG исследовали с помощью штамма E. сoli MN111, несущего генное слияние katG::lacZ. Ген katG кодирует каталазу HPI, отвечающую за деструкцию перекиси водорода.

Образцы культур, обработанных экстрактами и отобранные до и после окислительного стресса, центрифугировали, ресуспендировали в свежей среде и использовали для измерения активности -галактозидазы по методу Миллера [7].

Способность экстрактов растений связывать свободные радикалы в системе in vitro с DPPH (2,2–дифенил-1-пикрилгидразилом) оценивали согласно [8].

Результаты исследования и обсуждение В Таблице приведены значения АОА экстрактов in vivo.

Установлено, что обработка клеток экстрактами серпухи венценосной, шлемника копьелистного, полыни австрийской, девясила иволистного приводила к повышению уровня экспрессии katG более чем в полтора раза по сравнению с контролем.

Воздействие на клетки 2 мМ H2O2 в течение 30 мин в присутствии экстрактов пустырника пятилопастного, латука татарского, повышало экспрессию гена katG более чем в три раза по сравнению с контролем.

Незначительное влияние на экспрессию katG в этих же условиях оказывали экстракты мелилотоидеса, полыни метельчатой и подорожника наибольшего.

Высокую радикалсвязывающую активность in vitro проявили экстракты хамериона узколистного, девясила иволистного, полыни понтийской, лабазника обыкновенного, латука татарского, которые оказались способными связать до 83% всех радикалов в модельной системе.

Известно, что определенная часть полифенолов, входящих в состав растительной пищи, может проходить в неизменном виде через весь желудочно-кишечный тракт и контактировать с микрофлорой кишечника.

Показано, что ряд кишечных бактерий принимают участие в метаболизме полифенолов [5].

Таблица. Антиоксидантная активность экстрактов in vivo.

Растение Антиоксидантная Растение Антиоксидантная активность активность экстрактов in экстрактов in vivo vivo Полынь Алтей 2,29 1, австрийская лекарственный Полынь Хамерион 3,18 3, понтийская узколистный Полынь Подорожник 3,53 3, метельчатая наибольший Девясил Кермек 2,82 3, иволистный Гмелина Латук Грушанка 3,29 3, татарский круглолистная Серпуха Живокость 3,35 2, венценосная высокая Пижма Василисник 3,11 2, обыкновенная простой Конопля Репейничек 1,82 3, посевная волосистый Бассия Лабазник 2,0 3, очитковидная степной Солодка Лабазник 2,82 3, уральская обыкновенный Мелилотоидес Мытник 1,12 3, плоскоплодный болотный Пустырник Коровяк 3,38 3, сизый черный Шлемник Горичник 3,72 3, копьелистный Морисона С другой стороны, представлены доказательства, что в кишечнике человека могут постоянно генерироваться АФК [9]. Некоторые из них, например, H2O2 могут свободно проникать через мембраны бактерий.

Возможно, что в определенных условиях некоторые экстракты, действуя как слабые прооксиданты, индуцируют антиоксидантные ферменты кишечных бактерий. Такие активированные бактерии могут вносить определенный вклад в антиоксидантную защиту макроорганизма. Полученные данные свидетельствуют о том, что бактерии могут применяться в качестве тест систем для первичного скрининга экстрактов растений на про- и антиоксидантную активность.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Урал № 07-04-960030 и гранта Президиума УрО РАН по программе интеграционных исследований с СО РАН.

Литература 1. Pomposiello P.J., Demple B. Global adjustment of microbial physiology during free radical stress // Adv. Microb. Physiol. – 2002. – V. 46. – P.

319-341.

2. Shahidi F., Janitha P.K., Wanasundara P.D. Phenolic antioxidants // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. – 1992. – V. 32. – P. 67-103.

3. Hanasaki Y., Ogaw, S., Fukui S. The correlation between active oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids // Free Radic. Biol.

Med. – 1994. – V. 16. – P. 845-850.

4. Melidou M., Riganakos K., Galaris D. Protection against nuclear DNA damage offered by flavonoids in cells exposed to hydrogen peroxide:

The role of iron chelation // Free Radic. Biol. Med. – 2005. – V. 39. – P.

1591-1600.

5. Halliwell B., Rafter J., Jenner A. Health promotion by flavonoids, tocopherols, tocotrienols, and other phenols: direct or indirect effects?

Antioxidant or not? // Am. J. Clin. Nutr. – 2005. – V.81. – P. 268S-276S.

6. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Методы исследования антиоксидантов // Химия растительного сырья – 2004. - №3. – С. 63 75.

7. Miller J.H. Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, New York;

1972.

8. Shyur L.-F.;

Tsung J.-H.;

Chen J.-H.;

Chiu C.-Y.;

Lo C.-P. Antioxidant properties of extracts from medicinal plants popularly used in Taiwan // Int. J. Appl. Sci. Eng. – 2005. – Vol. 3. P. 195-202.

9. Scott R.I., Yarlett N., Hillman K., Williams T.N., Williams A.G., Lloyd D.

The presence of oxygen in rumen liquor and its effects on methanogenesis // J. Appl. Bacteriol. – 1983 – V. 55. – P. 143-149.

УДК 579. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ И АКТИВНОСТЬ АЦИДОФИЛЬНЫХ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Севрякова О.А., Мусыргалина Л. Р., Семенова И.Н.

Сибайский филиал Академии Наук Республики Башкортостан, 453833 Республика Башкортостан, г. Сибай, ул. К. Цеткин, д. Введение За последние десятилетия промышленное применение железоокисляющих микроорганизмов с целью извлечения ценных компонентов из руд достигло широких масштабов в разных странах. [1, с.

592]. Значимость биометаллургии возрастает в связи с переходом на разработку низкосортных руд, минеральных концентратов, хвостов отработанных месторождений и с появлением на мировом уровне тенденции к проведению более рациональной и экологически безопасной добычи полезных ископаемых.

Процесс бактериального выщелачивания основывается на избирательном извлечении металлов из руд посредством их растворения микроорганизмами в водной среде. Выщелачивание биологическим путем происходит разными способами, но суть его сводится к поддержанию железа в окисленном состоянии (Fe3+- главный окислитель) и низких значений рН, при которых металлы активно переходят в растворимую форму [2, с. 5].

Микроорганизмы, осуществляющие биовыщелачивание металлов из сульфидных руд, представлены хемолитотрофными видами бактерий, архей.

Особенность метаболизма данных микроорганизмов заключается в окислении неорганических соединений, которые служат донорами электронов, существовании в условиях с низкими значениями рН, температурой от 5 до 80°С и высоким содержанием тяжелых металлов. Выделение микроорганизмов для биовыщелачивания металлов осуществляют из кислых природных металлосодержащих местообитаний, разрабатывающихся месторождений и реакторных установок для выщелачивания руд. Основные хемолитотрофы, используемые в технологии, представлены родами Acidithiobacillus, Leptospirillum, Sulfobaccillus [1, c. 591]. Это мезофильные микроорганизмы, для которых температурный оптимум, как правило, находится в пределах 30°С.

В последнее время микробиологические исследования направлены на изучение особенностей биологии и экологии микробных сообществ, представленных умеренными термофилами (Sulfobaccillus и thermosulfidooxidans, Acidithiobacillus caldus, Ferroplasma sp) экстремофильными термоацидофилами (Sulfolobus sp., Metallosphaera sp. и др.). Способность выживать в экстремальных условиях делает эти группы физиологически уникальными.

Целью нашего исследования является изучение влияния ионов тяжелых металлов на рост ассоциации железоокисляющих микроорганизмов и их железоокисляющую активность.

Знание о предельных концентрациях металлов, при которых возможен рост, необходимы в связи с использованием данных ассоциаций микроорганизмов в биотехнологиях очистки.

Методы В качестве источника для выделения литотрофных микроорганизмов использовали подотвальные воды месторождения Куль-Юрт-Тау, которое находится в 5 км к северу от г. Баймак Республики Башкортостан. В настоящее время это месторождение является отработанным и не эксплуатируется. На месте этого месторождения имеется карьер, заполненный водой, а с внешней стороны карьера имеются небольшие водоемы, заполненные водой, вытекающей с отвалов и имеющие рН от 1,5 до 4,8, ржаво-бурый цвет.

Культивировали на стандартной среде Сильвермана и Люндгрена.

Инкубацию проводили при температуре +25С, при периодическом перемешивании. Устойчивость к ионам металлов изучали, используя растворы CoCl2 x 6H2O, NiCl2 различных концентраций: 0,01;

0,02;

0,03;

0,05;

0,1 г/л, и контроль без внесения ионов тяжелых металлов. Микроскопическое изучение и количественный учет бактерий проводили по методу Виноградского [3, с. 201].

окисного железа (Fe3+) проводили Определение количества дифференциальным спектрофотометрическим методом, основанным на взаимодействии Fe3+ с сульфосалициловой кислотой, при котором в зависимости от рН раствора образуется ряд комплексных соединений. В частности, при рН 1,8 – 2,5 образуется моносульфосалицилат железа красно фиолетового цвета, имеющий спектр поглощения с максимум при 510 нм [3, с. 201].



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.