авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |

«Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Всероссийская общественная ...»

-- [ Страница 4 ] --

СКРИНИНГ ФЕНИЛАЦЕТОНИТРИЛ-УТИЛИЗИРУЮЩИХ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ Долгих Н.П. 1,2, Максимов А.Ю. 1, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия, Пермский государственный университет nadido@yandex.ru Некоторые алифатические и ароматические нитрилы и амиды являются нормальными метаболитами бактерий и растений, а трансформирующие их бактерии распространены в различных типах почв. Структурно функциональное разнообразие, распространение и роль ферментов, участвующих в этих процессах, еще недостаточно изучены и представляют интерес для фундаментальной микробиологии. В то же время микроорганизмы, способные к биотрансформации некоторых ароматических соединений, могут быть использованы для биокаталитического синтеза ценных фармацевтических препаратов, а также представляют интерес для экологической биотехнологии.

Большой интерес представляет биодеградация фенилацетонитрила и производных арилпропионовой кислоты предшественников соединений, являющихся основой нестероидных противовоспалительных средств (ибупрофен, кетопрофен и др.).

Цель работы – выделение и идентификация почвенных бактерий, трансформирующих фенилацетонитрил.

В ходе работы было проанализировано 6 различных типов почв умеренной и степной зоны России. Выделение культур проводилось методом прямого высева на селективные среды и накопительной культуры. Для выделения и выращивания бактерий была использована синтетическая среда N (солевая основа). Агаризованную среду получали добавлением бакто-агара (Sigma) до конечной концентрации 1,5 %. В качестве субстратов использовали ацетонитрил (10мМ), ацетамид (10мМ) и фенилацетонитрил (10мМ).

Учитывали общее количество гетеротрофных бактерий и количество микроорганизмов, трансформирующих нитрилы и амиды в 1 г. почвы (в пересчете на сухой вес). Наибольшее число гетеротрофов было обнаружено в почве С-2 (солончак) – 6,471010 КОЕ на 1 г сухой почвы (табл. 2). Установлено, что ацетамид-утилизирующие бактерии также наиболее распространены в солончаке – 3,11107 КОЕ/г сухой почвы. Ацетонитрил активно использовали бактерии дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (П27) – 3,08107 КОЕ/г сухой почвы. Фенилацетонитрил утилизировали 4,96% бактерий от общего числа гетеротрофов в почве П26.

В результате проведенного отбора всего было выделено 230 штаммов, утилизирующих алифатические и ароматические азотсодержащие соединения, из них 91 штамм выделен на ацетонитриле, 96 – на ацетамиде и – на фенилацетонитриле. Однако активность на акрилонитриле более 1,5 мкмоль/мг/мин проявляли 21, 11 и штаммов соответственно, из них 16 культур обладали активностью 2 и более мкмоль/мг/мин. Максимальную активность, 20 мкмоль/мг/мин, проявлял штамм №105.

По совокупности морфологических признаков, результатов теста с КОН, метода окраски по Граму, стандартных хемотаксономических и биохимических признаков, а также ПЦР-анализа установлено, что ацетонитрил утилизирующие штаммы микроорганизмов на 76% представлены грамположительными бактериями, главным образом, актинобактериями рода Rhodococcus, ацетамид-утилизирующие – на 64% грамотрицательными аэробными бактериями. Более 56% фенилацетонитрил-утилизирующих культур составляли представители рода Rhodococcus, преимущественно R. erythropolis.

Таким образом, из почвенных образцов выделены культуры бактерий, трансформирующие фенилацетонитрил, обладающие нитрилгидратазной активностью более 2 мкмоль/мг мин.

Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы»

(ГК№ 02.740.11.0078) и ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 годы)».

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ МЕДИ КАК СТРЕCСОВОГО ФАКТОРА ДЛЯ РЕДИСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO И IN VIVO Егорова И. В.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева, Саранск, i.v.egorova@yandex.ru Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами возрастает с каждым годом, и решение этой экологической проблемы становится не просто актуальным, но жизненно необходимым. Поступление тяжёлых металлов (ТМ) в окружающую среду оказывает негативное воздействие на почвы и растения и представляет угрозу для здоровья человека. В сельском хозяйстве это отражается на качестве продукции и в снижении её выхода и накопление ТМ нередко достигает опасного для людей и животных уровня. Поступившие в организм ТМ выводятся очень медленно, и небольшое их поступление может вызвать кумулятивный эффект. Одним из наиболее токсичных для растений тяжелым металлом является медь. Высокие концентрации меди приводят к торможению фотосинтеза, синтеза пигментов, повреждению мембран, нарушению обмена веществ, и в конечном итоге – гибели растений. Культура in vitro дает возможность изучения влияния стрессовых факторов на растение на клеточном уровне. Однако работ по действию ТМ на культуры растительных клеток очень немного, в отличие от опытов по влиянию ТМ на растения in vivo. В связи с этим необходимо детальное изучение устойчивости растений in vivo и культур клеток in vitro к ТМ с последующей разработкой способов повышения металлоустойчивости. Исследования проводились на 7-дневных проростках и 5-недельной каллусной культуре гипокотильного происхождения. Для работы использовалась соль CuSO45H2O в конценрациях 10 мкМ, 0,1 мМ, 1 мМ. При анализе действия различных концентраций Cu2+ на активность каталазы в листьях редиса и каллусах выявлено, что все исследованные дозы металла достоверно повышали активность фермента. Активность СОД также достигала наибольшего значения в варианте с добавлением в среду 10 мкМ CuSO4. У растений редиса с повышением дозы меди в среде активность СОД снижалась. В то же время в каллусах редиса активность СОД резко и почти линейно снижалась при увеличении концентрации CuSO4. Это может указывать на быстрое развитие окислительного стресса в клетках каллусной ткани, особо выраженного при высоких концентрациях ТМ. При изучении АПО в растениях редиса выявлена зависимость активности фермента от концентрации металла – она резко возрастала при концентрации 10 мкМ и затем снижалась с увеличением концентрации CuSO4. Активность АПО в каллусе редиса возрастала по сравнению с контролем при всех изученных концентрациях ионов Cu2+. При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Cu2+ в среде можно судить, что уровень АФК возрастал относительно контроля во всех вариантах опыта. Очевидно, что все концентрации тяжелого металла (меди) индуцировали возникновение окислительного стресса у растений редиса. Скорость генерации О2 в каллусе редиса возрастала относительно контроля при двух концентрациях меди и была наибольшей при концентрации 10 мкМ. При изучении интенсивности ПОЛ выяснено, что ионы Cu2+ не оказали значительного отрицательного влияния на культуру клеток. Это позволяет сделать выводы о том, что ионы Cu2+ оказывают более сильное влияние на проростки, чем на каллусные культуры. Возможно, это связано с отсутствием дальнего транспорта ионов меди, как это происходит в целом растении;

отсутствием надклеточного уровня регуляции, на который влияют ионы Cu2+;

отсутствием тканей, избирательно поглощающих тяжелые металлы;

а также может быть связано с результатом адаптации на клеточном уровне к избыточным дозам тяжелых металлов в среде, что возможно использовать при скрининге форм растений на устойчивость к ТМ.

БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ АРИЛАЛКИЛСУЛЬФОКСИДОВ Елькин А.А.1, Кылосова Т.И.2, Гришко В.В.3, Ившина И.Б.1, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия, an220@mail.ru Пермский государственный университет, Пермь, Институт технической химии УрО РАН, Пермь, Россия.

Оптически активные органические сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. Интерес к ним обусловлен высокой реакционной способностью и возможностью последующего удаления RS(O)-содержащих медиаторов в реакциях циклоприсоединения, альдольной конденсации, присоединения по Михаэлю и др. Ранее нами было показано, что в ростовых условиях актинобактерии рода Rhodococcus катализируют энантиоселективное окисление модельного фенилметилового сульфида (тиоанизола) в соответствующий сульфоксид с высокой оптической чистотой. При этом из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН был отобран штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66, характеризующийся оптимальными выходом и оптической чистотой целевого сульфоксида (продолжительность биотрансформации 5 сут при условии добавления 0,5 г/л тиоанизола через 2-е сут после начала инкубации).

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Цель настоящего исследования – разработка эффективного биокатализатора процесса окислительной биоконверсии прохиральных органических сульфидов на основе иммобилизованных клеток алканотрофных родококков.

Изучено влияние на окислительную активность родококков: концентрации сульфида и времени его внесения в среду, источника углерода и энергии, кислотности среды, температуры, режима аэрации и продолжительности процесса биотрансформации. Установлено, что в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана при pH = 8,0 и 28oC биоконверсия 0,5 г/л тиоанизола в соответствующий (S)-сульфоксид протекает с химическим выходом 92% и оптической чистотой 82,4% за 4 сут при условии добавления тиоанизола через 2-е сут после начала инкубации.

В связи с тем, что использование более высоких концентраций тиоанизола приводит к подавлению сульфидокисляющей активности родококков, для оптимизации процесса биоконверсии тианизола использовали клетки родококков, иммобилизованные в криогель на основе поливинилового спирта. Данный прием позволил сократить продолжительность процесса окисления и при условии одновременного введения биокатализатора и тиоанизола достичь полной биоконверсии сульфида (0,5 г/л) в сульфоксид в течение 24 ч или в условиях повышения концентрации тиоанизола до 1,5 г/л получить целевой сульфоксид за 3-е сут.

Эффективность биокатализатора подтверждена в реакциях биотрансформации гомологов тиоанизола – фенилэтил-, пара-толилметил- и бензилметилсульфидов. Согласно данным хромато-масс-спектрометрии, иммобилизованные клетки R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 катализируют направленное окисление исследуемых арилалкилсульфидов в целевые сульфоксиды с оптической чистотой: фенилэтилсульфоксид – 64,7%, пара толилметилсульоксид – 74,3%, бензилметилсульфоксид – 83,1%) Работа поддержана грантом программы фундаментальных исследований президиума РАН «Биологическое разнообразие» и грантом РФФИ № 10-04-96032.

.

ВЛИЯНИЕ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ -ГЛЮКОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА Ершова А.Н., Баркалова О.Н.

Воронежский государственный педагогический университет, Воронеж, oks-bar@mail.ru Для бактериальных и грибных -глюкозидаз (ЕС 3.2.1.21) было показано, что кроме гидролитического расщепления -гликозидной связи в алкил- или арилгликозидах, они участвуют и в реакции трансгликозилирования в присутствии различных спиртов. Реакции трансгликозилирования заканчивается синтезом новых сахаридов и арилгликозидов. Спирты, как более хорошие нуклеофилы, чем вода, участвуют в реакциях трансгликозилирования, что приводит к увеличению темпа расщепления гликозида и образованию новых гликозидных связей. Для растительных -глюкозидаз такие исследования мало проводились. Ранее нами были исследованы субстратная специфичность цитоплазматической -глюкозидазы растений гороха, определено влияние разных двух- и трехвалентных металлов, а также ингибиторов (р-CMB, ДЭПК, азид натрия, фторид натрия) на активность фермента для выявление каталитически активных групп. Изучали влияние спиртов на активность цитоплазматической формы фермента в реакционной системе рНФГ – спирт, используя бутанол, этанол, пропанол. Объектом исследования служили листья 10-дневных проростков гороха (“Рамонский 77”), выращенных методом гидропоники на свету. С использованием методов дифференциального центрифугирования, высаливания сульфатом аммония, очистки на G-25 и G-100 получили высокоочищенную форму фермента с удельной активностью 422,9 ФЕ /мг белка. Реакционная среда содержала фосфатно цитратный буфер (0,2 М) рН 5,2, -глюкозидаза и субстрат (р-НФГ), при этом в среду инкубации фермента вносили и исследуемые спирты в концентрациях 0,5-2,5 М. Скорость возможного трансгликозилирования оценивали, сравнивая скорость работы -глюкозидазы в среде без спиртов и в их присутствии. Активность глюкозидазы определяли по количеству отщепившегося р-нитрофенила при =440 нм. За единицу активности фермента принимали то его количество, которое катализировало расщепление 1 мкмоль субстрата в мин. при 37°С. Белок определяли по методу Lowry. Обнаружили, что увеличение активности фермента вызывало присутствие спирта пропанола в инкубационной среде (на 40%), в концентрации 0,5 М. Этанол в той же концентрации увеличивал активность на 30 %, но с увеличением концентрации спирта активность фермента несколько падала. Бутанол в концентрации 0,5-2,5 М не вызывал изменения активности цитоплазматической глюкозидазы растений гороха. Проведенные опыты впервые показали возможность протекания реакции трансгликозилирования под действием -глюкозидазы растений гороха, что приводит к накоплению соответствующих глюкозидов. Это вероятно может играть важную роль в процессах адаптации растений, связанных с детоксикацией накапливающихся в клетках спиртов в качестве конечных продуктов соответствующих метаболических путей.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ ШТАММОВ ЭНДОСИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ WOLBACHIA НА УРОВЕНЬ АПОПТОЗА В ГЕРМАРИИ ЯИЧНИКОВ DROSOPHILA MELANOGASTER Жукова М.В., Захаров И.К., Киселева Е.В.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, zhukovaMV@gmail.com Эндосимбиотические бактерии Wolbachia широко распространены среди беспозвоночных и вызывают у них изменения репродуктивных функций, такие как цитоплазматическая несовместимость, феминизация, партеногенез и андроцид. Передача бактерий Wolbachia у насекомых происходит через цитоплазму яйцеклеток самок, поэтому изучение степени влияния эндосимбионтов на процесс оогенеза хозяина относится к актуальным вопросам биологических исследований. Известно, что в яичнике плодовых мушек Drosophila melanogaster имеются две контрольные точки (check point), в которых может происходить апоптоз. Одна находится в гермарии (район 2), а вторая приходится на 7-8 стадию оогенеза.

Целью настоящей работы было выяснить возможность влияния бактерий Wolbachia на эффективность прохождения клетками контрольной точки в гермарии (район 2) яичников D. melanogaster. Для исследования этого вопроса были выбраны бактерии Wolbachia двух разных штаммов: wMel и wMelPop. Бактерии первого штамма не влияют на продолжительность жизни хозяина, и присутствуют в репродуктивных органах и мальпигиевых сосудах. Бактерии штамма wMelPop снижают продолжительность жизни насекомых, и обнаруживаются не только в тканях репродуктивных органов, но и в мышцах, сетчатке глаза и клетках мозга.

Для оценки количества гермариев, в которых присутствуют цисты с клетками, подвергшимися апоптозу, яичники окрашивали акридиновым оранжевым. Дополнительно проводили исследования с использованием электронного микроскопа. Установлено, что количество гермариев с гибнущими клетками не изменяется в яичниках мух, инфицированных Wolbachia штамм wMel, по сравнению с яичниками неинфицированных мух. В то же время, в яичниках мух, инфицированных Wolbachia штамм wMelPop, количество гермариев, в которых присутствуют цисты с гибнущими клетками, значительно увеличено (81,05±1,13%) по сравнению с неинфицированными мухами (38,24±1,4%). Электронно-микроскопическое исследование показало, что в большинстве гермариев у инфицированных бактериями штамма wMelPop мух присутствуют клетки на разных стадиях гибели. В апоптозных тельцах, образующихся при фрагментации клеток, обнаруживалось большое количество бактерий. Таким образом, присутствие Wolbachia штамма wMel не изменяет количество гермариев с гибнущими клетками, тогда как присутствие бактерий штамма wMelPop увеличивает этот показатель в два раза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследованные штаммы Wolbachia оказывают различное влияние на морфофункциональное состояние клеток гермария, необходимое для успешного прохождения первой контрольной точки.

Работа поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» №23.30 и грантом РФФИ № 09-04-00872-а.

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НЕФТИ НА АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ.

Зорина Е.М., Попцова С.С.

Удмуртский государственный университет, Ижевск, magradze@udm.net Актуальность: загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами до сих пор остается актуальной проблемой. Попадая в почву углеводороды нефти оказывают существенное негативное влияние на биологические свойства почвы и условия обитания живых организмов. Одним из основных компонентов почвенного биогеоценоза являются микроскопические грибы. Они чувствительны к изменению свойств почвы и могут служить индикаторами ее состояния. Микромицеты находятся в тесной взаимосвязи и взаимодействии с другими организмами.

Цель работы: изучение антагонизма микромицетов, выращенных на различной концентрации нефти, к микроорганизмам.

Материалы и методы: работа велась с тремя видами грибов. Для их культивирования использовали среду Чапека, где вместо сахарозы, выступающей в качестве источника углерода, брали различные концентрации нефти (5%,8%,10%). Для контрольного варианта использовали стандартную среду Чапека.

Культивировали грибы на субстрате с нефтью при температуре 24±2С. Через 5 и 10 дней ставили антагонизм с микроорганизмами методом агаровых блоков. По истечении суток определяли наличие зоны стерильности.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Результаты: через 5 и 10 дней роста при 5% и 8% нефти зона стерильности существенно не отличается у всех трех видов, а при 10% она отсутствует. В контрольном же варианте зона стерильности после 10 дней роста увеличивается в 1,5-2 раза.

Вывод: в ходе эксперимента выявлено - чем выше концентрация нефти, тем меньше проявляются антагонистические свойства микромицетов.

СОЗДАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ШТАММОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО БЕЛКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБНО-РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.

Канова Е. В.1, 2, Чернышов С. В. Самарский государственный университет, Самара;

Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.

А. Овчинникова, Пущино, svch2@rambler.ru Проблема взаимодействия микроорганизмов и растений становится весьма актуальной в последнее время и привлекает пристальное внимание исследователей в различных областях биологической науки. Возможность контроля этого процесса представляется весьма интересной с научной точки зрения задачей и открывает перспективы в практическом плане, позволяя добиваться повышения продуктивности сельскохозяйственных растений, а также эффективности в борьбе с различными их заболеваниями. Поставленная задача предполагает наиболее углубленное изучение различных этапов микробно-растительных взаимодействий. В этом смысле особую важность для изучения особенностей распространения и локализации микроорганизмов в организме хозяина, непосредственного мониторинга динамики численности микробной популяции приобретает возможность визуализации бактерий различных таксономических групп при помощи флуоресцирующих белков.

Эффективная экспрессия генов флуоресцирующих белков в различных микроорганизмах возможна при использовании промоторов, узнаваемых РНК-полимеразами данных бактерий и векторных плазмид, поддерживаемых их системой репликации. В настоящей работе в качестве объекта исследований были выбраны широко распространенные и наиболее изученные фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora ssp. carotovora и Agrobacterium tumefaciens. Первый фитопатоген вызывает у растений мягкие гнили, второй – образование корончатых галлов. В качестве репортёрного гена использовался ген зелёного флуоресцирующего белка, egfp.

Создан ряд плазмид, в которых ген egfp был поставлен под различные промоторы: промотор PCH, выделенный из геномной ДНК Erwinia herbicola, промотор PGM гена фосфоглюкомутазы агробактерий и промотор фага T7.

Фаговый промотор был использован в качестве отрицательного контроля, поскольку он не функционирует в отсутствии РНК-полимеразы этого же фага. Плазмиды, предназначенные для введения в клетки эрвиний и кишечной палочки, были сконструированы на основе вектора pET28b, а для трансформации агробактерий была использована плазмида pSS, применяемая в качестве вектора для переноса генетического материала из агробактериальной клетки в геном растений. Созданными генетическими конструкциями трансформировали клетки A. tumefaciens, E. carotovora и E. coli. Характерной чертой полученных трансформантов являлась различная функциональная активность использованных промоторов в клетках бактерий различных видов, что свидетельствует о видоспецифичности бактериальных промоторов. Так, флуоресценция агробактерий наблюдалась лишь при использовании промотора PGM. Промотор PCH проявлял активность как в клетках эрвиний, так и в клетках кишечной палочки, поскольку эти бактерии относятся к одному семейству микроорганизмов. Таким образом, были получены штаммы фитопатогенов, экспрессирующие репортерный ген зелёного флуоресцирующего белка. Эти штаммы могут быть использованы для дальнейших исследований с целью отработки методики мониторинга микробно-растительных взаимодействий и изучения особенностей функционирования патогенных микроорганизмов в условиях in planta. Планируется также создание штаммов симбиотических бактерий, экспрессирующих флуоресцентные белки, для исследования характера взаимодействий микроорганизмов в рамках более широкой многокомпонентной системы.

РАЗНООБРАЗИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ПОДСЕМЕЙСТВА БРУСНИЧНЫЕ (Vaccinioideae) Кечасов Д. Н., Павлова Е. Е.

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, Dikech@mail.ru ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Растения подсемейства брусничные (Vaccinioideae) являются довольно распространенной группой растений.

Считается, что ягоды брусничных полезны для здоровья в силу содержания в них большого количества антиоксидантов, в том числе фенольной природы. Фенольные соединения (ФС) растений имеют разнообразное строение, поэтому был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с помощью которого возможна быстрая, высокоточная идентификация веществ различной природы.

Целью данной работы являлось определение содержания отдельных представителей ФС методом ВЭЖХ в листьях и ягодах растений подсемейства брусничные (Vaccinioideae). Объектами исследования служили листья и ягоды растений голубики щитковой (Vaccinium corymbosum), Г. узколистной (V. angustifolium), Г. черноплодной (V. artrococcum), черники кавказской (V. arctostaphylos), клюквы болотной (Oxycoccus palustris.), К.

крупноплодной (Oxycoccus macrocarpus – сортов Ранний Черный, Стивенс и Ховес), культивируемые в Ботаническом саду ННГУ и Г. лесной (V. uliginosum), Ч. обыкновенной (V. myrtillus), брусники (V. vtis-idaa), произрастающих в лесных массивах Нижегородской области. Анализ содержания фенольных соединений проводили методом градиентной обращено-фазовой ВЭЖХ. Система растворителей состояла из: фазы А (ацетонитрил-вода-уксусная кислота 50-50-2,5), фазы В (вода-уксусная кислота 100-2,5). Детектирование проводили спектрофотометрическим детектором одновременно при длинах волн 254 и 340 нм. В качестве метчиков использовались галловая, хлорогеновая, кофейная, ванилиновая, р-кумаровая, о-кумаровая, эллаговая, феруловая кислоты, эскулин, кумарин, рутин, морин, кверцитин. Кроме того, проводился количественный анализ содержания ФС с помощью реактива Фолина-Дениса.

Согласно полученным результатам брусничные содержат довольно большое количество ФС, а именно листья растений содержат растворимых ФС от 29,5 до 157,3 мг/г сырого веса, а ягоды от 5,3 до 18,8 мг/г сыр. в.

Наибольшее количество ОРФС в листьях определили у Г. узколистной и Ч. обыкновенной, а наименьшее количество – у Г. черноплодной и К. болотной. В ягодах же наибольшее количество ФС оказалось у Ч.

обыкновенной и брусники, а наименьшее – у Г. черноплодной.

Наибольшее число исследуемых ФС содержат листья К. крупноплодной (особенно растения сорта Ховес – 12 из 14 определяемых ФС, отсутствуют галловая кислота и эскулин) и брусники (11 из 14 ФС, отсутствуют галловая кислота, кумарин, кверцитин). В Ч. обыкновенной обнаружена большая часть определяемых ФС, причем она отличается от других анализируемых растений своеобразным набором фенолов, в частности, наличием большей части флаваноидов. Если же судить по площади пиков на хроматограммах, то прослеживается следующая закономерность: для всех видов черник и голубик характерно преобладание хлорогеновой кислоты, а для брусники и клюкв свойственно наличие феруловой и о-кумаровой кислот. Среди видов голубик наиболее «богатым» растением оказалась Г. узколистная (9 из 14 ФС, в том числе морин и кумарин, не встречающиеся у других голубик). Особенно «бедной» оказалась Г. черноплодная (5 из 14 ФС).

В целом можно заключить, что наиболее часто встречающимся соединением в растениях подсемейства Брусничные являются: хлорогеновая, кофейная и элаговая кислоты (обнаружены в большинстве растений, кроме к. крупноплодной с. Стивенс). Наиболее редко встречающиеся (а также дающие небольшие пики на хроматограммах): галловая кислота, кумарин;

флаваноиды: морин, рутин, кверцитин. Последние соединения обнаружены только у клюквы, брусники, черники, г. узколистной.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ДОНОРА NO И ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ НА ТРАНСПОРТНУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОТОННЫХ ПОМП ТОНОПЛАСТА В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ ГИПЕРОСМОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ.

Колесникова Е.В., Озолина Н.В., Нурминский В.Н., Нестеркина И.С., Дударева Л.В., Саляев Р.К.

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, ozol@sifibr.irk.ru Одной из важнейших проблем современной биологии является расшифровка механизмов ответа организмов на изменение условий их существования. Все адаптивные события при стрессе запускаются с помощью определенных сигнальных молекул, вызывающих существенные изменения в физиологических процессах, протекающих в клетке. Зависимость функционирования основных компонентов мембранных транспортных систем от влияния сигнальных молекул практически не исследовалась. Поэтому проводилось изучение изменения транспортной активности протонных помп тонопласта под влиянием экзогенного донора оксида азота и изменения концентрации ионов кальция по отдельности и совместно на разных фазах онтогенеза и при гиперосмотическом стрессе. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оксид азота и ионы кальция могут оказывать влияние на активность транспортных процессов на тонопласте, причем значительно активнее в период роста и накопления метаболитов. При гиперосмотическом стрессе Н+-пирофосфатаза играет более важную роль по сравнению с Н+-АТФазой, поскольку ее активность увеличивалась в 2.3 раза, тогда как активность Н+-АТФазы почти не менялась. Н+-пирофосфатаза более интенсивно реагировала на присутствие экзогенного оксида азота и изменения концентрации ионов кальция. Влияние оксида азота на протонные помпы ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ тонопласта менялось при изменении концентрации ионов кальция, который, вероятно, является медиатором действия NO.

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРООБРАЗОВАНИЯ АЛЬБУМИНОВЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН ЛЬНА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ВОДА-ВОЗДУХ Козловская Ю.В., Лапина Г.П.

Тверской государственный университет, Тверь, yliyak_81@mail.ru В связи с недостаточной изученностью структуры и свойств тонких поверхностных слоев белков цель данной работы – изучение комплекса физико-химических характеристик альбуминов семян льна. Объектами работы были выбраны семена травянистого однолетнего растения льна долгунца сорта “Томский-10”. В процессе выделения и очистки белков альбуминов из гомогената семян льна нами сочетались методы гомогенизации, экстракции и фракционирования. Количественное содержание альбуминов определяли двумя независимыми методами: биуретовой реакции и УФ-спектроскопии. Для установления и подтверждения гомогенности, а также определения молекулярной массы альбуминов семян льна использовали современный физико-химический метод разделения биоорганических молекул – метод зонального электрофореза в ПААГе. Для этого проведено электрофоретическое разделение белков-маркеров: сывороточного альбумина человека (Mr 45000), алкогольдегидрогеназы (Mr 122000) и пероксидазы хрена (Mr 20000). Определили и рассчитали с использованием калибровочной кривой молекулярную массу альбуминов семян льна, составляющую 82000±5700. Метода максимального давления пузырька изучали поверхностную активность альбуминов семян льна. Получили зависимость поверхностного натяжения от концентрации при варьировании ионной силы водного раствора белка. При увеличении концентрации NaCl молекулы альбумина «разбухают», снижается доля электростатических взаимодействий, стабилизирующих нативную белковую макромолекулу. Это ведет к уменьшению адсорбционной способности альбуминовых белков льна, что и наблюдали в эксперименте, а именно, смещение изотерм поверхностного натяжения вверх. Установили, что при увеличении ионной силы от до 0,3 М изотермы поверхностного натяжения веерообразно поднимаются вверх, а изотермы адсорбции, соответственно, снижаются. Можно предположить, что это результат образования белковых ассоциатов. В литературе есть данные о способности альбуминовых молекул к ассоциации в этих условиях. Подтверждено образование ассоциатов альбуминовых белков льна методом электронной микроскопии. Далее, были рассчитаны адсорбционные характеристики: максимальная адсорбция (Гmax), площадь, приходящаяся на молекулу (Sмол) и толщина адсорбционного слоя (h), – которые позволили построить молекулярные модели структуры адсорбционного слоя из альбуминовых белков и подтвердить ее с использованием метода электронной микроскопии.

«СИМБИОТИЧЕСКИЕ» ИСКУССТВЕННЫЕ БИОПЛЕНКИ Коннова С. А., Замалеева А.И., Фахруллин Р.Ф Казанский государственный университет, Казань, Svetaka14@gmail.com Нами созданы искусственные свободно плавающие биопленки различной морфологии, состоящие из клеток Trichoderma asperellum, Saccharomyces cerevisiae, Chlorella sp. Также в создании таких «биопленок» были использованы различные полиэлектролиты: – полиаллиламин гидрохлорид, полистиренсульфонат, карбоксиметил целлюлоза, дезоксирибонуклеиновая кислота.

Целью данной работы является создание искусственных биопленок, одной из особенностью которых является свободное нахождение в растворе, т.е. они не прикреплены к поверхности.

Задачи, поставленные в работе:

Создание искусственной биопленки.

1.

Проверка жизнеспособности клеток в составе «биопленки».

2.

Характеристика полученных пленок методами оптической, электронной, конфокальной микроскопии.

3.

Основным методом создания является метод послойного нанесения, предложенный Decher еще в 90-х годах XX века. Метод послойного нанесения был открыт как инструмент для сборки полифункциональных материалов, используя покрытые полиэлектролитом искусственные поверхности. Полиэлектролитные слои строятся осаждением положительно отрицательно заряженных полиэлектролитов на заряженных поверхностях. Толщина ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ покрытия может быть контролирована на уровне нанометра, а также свойства поверхностей. Метод позволяет использовать и клетки, и коллоидные частицы.

Методика создания «биопленок» была следующей. Предварительно на поверхность стеклянной подложки были осаждены частицы карбоната кальция. Далее на поверхность модифицированной подложки были последовательно нанесены пленки полиэлектролитов, с включенным между ними слоем клеток. На заключительном этапе карбонат кальция растворили с помощью этилендиаминтетрауксусной кислотой. Таким образом, получили структурированную биопленку, состоящую из многослойных полимерных пленок и живых клеток.

Мы полагаем, что в будущем «биопленки» получат широкое распространение в создании биосенсоров на основе клеток;

в промышленности - создание антикоррозийных покрытий;

тканевой инженерии – искусственные ткани, импланты, пассивирование поверхности для подавления негативной реакции иммунной системы против трансплантанта;

оптике;

электронике.

Кроме того, внесение каких-либо частиц, например магнитных наночастиц, может способствовать их управлению путем воздействия внешнего магнитного поля. Например, нами созданы «биопленки», содержащие никелевые наночастицы, и воздействуя магнитным полем на них нам удалось осуществить перемещение «биопленок».

Таким образом, созданы планарные искусственные многоклеточные системы (биопленки), их морфология была охарактеризована методами оптической, электронной и конфокальной микроскопии и доказано, что клетки в составе полученных систем сохраняют свою жизнеспособность и способны к делению.

ВЛИЯНИЕ ЗАСОЛЕНИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ГЛУТАТИОНА У РАСТЕНИЙ ФАСОЛИ Корепанова В.А.

Пермский государственный университет, Пермь, Korepanova07@mail.ru Физиология солеустойчивости, хотя и имеет давнюю историю, тем не менее, является активно разрабатываемым разделом в учении о толерантности растений к неблагоприятным факторам. При неблагоприятных условиях растения вынуждены вырабатывать способы противостояния, затрагивающие разные уровни жизнедеятельности.

Это позволяет им использовать весь имеющийся потенциал адаптационных возможностей, включая количественные и качественные характеристики отдельных звеньев метаболизма. Так, например, устойчивость к засолению определяется характером окислительно-восстановительных реакций, протекающих, в частности, с участием аскорбиновой кислоты и глутатиона, которые могут служить диагностическим показателем жизнестойкости растений в стрессовых ситуациях. В связи с этим целью нашей работы было выяснить содержание этих соединений у молодых растений фасоли в условиях засоления. Семена фасоли для проращивания рассаживались по вариантам: контроль;

0,2% раствор хлористого натрия;

0,38% раствор сернокислого натрия. Осмотическое давление растворов 0,14мПа. Анализы проводились в три срока.

Аскорбиновая кислота и глутатион являются важными компонентами антиоксидантной защиты. Они являются сильными восстановителями и могут восстанавливать -S-S- связи белков, а также функционируют как промежуточные переносчики водорода при окислении органических соединений. Как показали наши исследования, содержание обоих компонентов у растений опытных вариантов особенно в присутствии сернокислого натрия существенно увеличилось по сравнению с контролем. Величина данных показателей зависит как от скорости синтеза, так и от интенсивности расходования изучаемых соединений. Если учесть, что в условиях засоления темпы роста растений снижаются, то, очевидно, уменьшается и потребность в данных метаболитах. Кроме того, как показывают исследования, проведённые на кафедре ранее, у растений в присутствии избытка засоляющих ионов происходит снижение активности аскорбиноксидазы – фермента, разрушающего аскорбиновую кислоту. Одинаковая тенденция аскорбиновой кислоты и глутатиона в их изменении под влиянием засоления свидетельствует об их слаженной работе в стрессовых ситуациях.

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК РОДОКОККОВ Криворучко А.В.1, Елькин А.А.1, Гришко В.В.2, Куюкина М.С.1, Ившина И.Б. Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь, nast@iegm.ru ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Институт технической химии Уральского отделения Российской академии наук, Пермь Цель настоящих исследований – разработка многоцелевых устойчивых биокаталитических систем для биотрансформации гидрофобных соединений. В качестве биокатализаторов окислительной трансформации органических соединений использованы актинобактерии рода Rhodococcus, характеризующиеся высокой активностью оксигеназного ферментного комплекса. С целью стабилизации функциональной активности родококков использован прием иммобилизации. При этом адаптированы два метода иммобилизации бактериальных клеток - метод адсорбционной иммобилизации на твердых носителях и метод включения живых клеток в матрицу криогелей на основе поливинилового спирта. В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе опилок древесных пород, куриных перьев и отходов кожевенного производства.

Для повышения сродства поверхности носителей к клеткам родококков использован прием гидрофобизации носителей с помощью Rhodococcus-биосурфактанта. Впервые с использованием сугубо физических методов профилометрии высокого разрешения с помощью интерференционного микроскопа New View 5000, Zygo, США и инфракрасной термографии с помощью камеры CEDIP Silver 450M, CEDIP Infrared Systems, Франция исследованы кинетика и термодинамика процесса адсорбции клеток родококков на поверхности твердых носителей. Определены условия монослойного распределения родококков (1,4107 клеток/см2) на поверхности носителя, обеспечивающего максимальную скорость разложения гидрофобных субстратов. В качестве гелевого носителя испытан макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта, позволяющий осуществлять иммобилизацию клеток родококков при физиологических рН и без применения токсичных химических веществ.

В результате проведенных исследований разработаны эффективные биокаталитические системы с параметрами, отвечающими основным требованиям биотехнологии (оптимальная адсорбционная емкость, высокая каталитическая активность, способность сохранять функциональную активность в экстремальных условиях, стабильность при хранении, экологическая безопасность). С использованием полученных систем осуществлены биотехнологические процессы, как то: окисление сырой нефти (31 мг·л-1·ч-1), индивидуальных углеводородов (104 мг н-гексадекана·л-1·ч-1, 0,92 мг фенантрена· л-1·ч-1, в частности), производных фенола (116 мг парацетамола·л-1·ч-1, в частности), гетероциклических ароматических соединений (11 мг дротаверина гидрохлорида·л-1·ч-1, в частности), карбоновых кислот (130 мг бензоата натрия·л-1·ч-1, в частности), органических сульфидов (21 мг тиоанизола·л-1·ч-1, 19 мг пара-толилметилсульфида·л-1·ч-1, в частности).

Разработанные биокаталитические системы перспективны для использования в биотехнологиях по очистке нефтезагрязненных почв, а также по утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств и получения оптически чистых сульфоксидов – интермедиатов в тонком органическом синтезе.

Работа выполнена при поддержке грантами Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы».

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ И ОКСАЛАТОКСИДАЗЫ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ЛЕКТИНАМИ АЗОСПИРИЛЛ Ларионова В.А., Наконечная О.И., Аленькина С.А., Никитина В.Е.

Учреждение российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, alenkina@ibppm.sgu.ru Многие биотические и абиотические воздействия могут вызывать резкое увеличение образования растительными клетками перекиси водорода и других активных форм кислорода. Синтез перекиси водорода – один из наиболее быстрых ответов растительной клетки на индуцирующие воздействия. Считается, что основным источником перекиси водорода в клетках растений является дисмутация молекулы кислорода, катализируемая супероксиддисмутазой. Однако в последнее время большой интерес вызывают альтернативные пути образования перекиси водорода c помощью пероксидазы и оксалатоксидазы.

Для корней проростков пшеницы одним из биогенных факторов являются находящиеся в прикорневой зоне азотфиксирующие ассоциативные бактерии рода Azospirillum, стимулирующие рост и развитие растений. Было показано, что инициация взаимодействия бактерий с корнями происходит по принципу лиганд-рецепторного взаимодействия. Установлено, что со стороны азоспирилл в этом процессе, в числе других факторов, участвуют лектины, находящиеся на поверхности клетки.

Ранее с поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3 были выделены лектины, являющиеся гликопротеинами с молекулярной массой 36 кDa, проявляющие специфичность к L-фукозе и имеющие структурные и антигенные различия. Было показано, что лектины азоспирилл способны не только осуществлять наряду с другими факторами адгезию бактерий к растительной клетки, но также стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ клетке митотическую и ферментмодифицирующую активности. Все эти факты позволили предположить, что лектины азоспирилл могут играть роль вещества-сигнала для растительной клетки.

Было показано, что лектины обоих штаммов во всех изучаемых концентрациях (оценивали три концентрации – 10, 20 и 40 мкг/мл) вызывали увеличение активности пероксидазы, но только в том случае, когда время выдерживания корней с лектинами составляло 20 мин (изучались временные интервалы 10 и 20 мин). Самой эффективной концентрацией для обоих лектинов явилась концентрация 40 мкг/мл. Лектин родительского штамма вызывал увеличение пероксидазной активности в большей степени, чем лектин мутантного штамма.

Также было показано, что 10-минутная обработка корней проростков растений препаратами лектинов вызывала активацию оксалатоксидазы. Лектины родительского и мутантного штамма проявляли различия. Если лектин родительского штамма при указанной экспозиции вызывал эффект при концентрации 10 мкг/мл, лектин же мутантного штамма - при 20 мкг/мл. Так, активность для родительского и мутантного штаммов составила через мин после инициации реакции 11,2 ± 1,3 и 7,2 ± 0,5 ед. на 1 г сырой массы, соответственно, в контрольных проростках, т.е. не инкубированных с лектинами она была 6,0 ± 0,2 ед.

Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл – бактерий, улучшающих рост и развитие растений, способны увеличивать активность ферментов, которые участвуют в образовании перекиси водорода – одной из разновидностей активных форм кислорода, и таким образом влиять на адаптационные возможности растения, не вызывая его повреждения или гибели, как это происходит под влиянием индукторов при патогенезе.

ВЛИЯНИЕ ПРЕДОБРАБОТКИ МЕТИЛЖАСМОНАТОМ НА ЛИГНИФИКАЦИЮ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК И ВЫХОД ЭЛЕКТРОЛИТОВ ИЗ ТКАНЕЙ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАСОЛЕНИИ Ласточкина О.В.1, Ишдавлетова Р.С.2, Фатхутдинова Р.А.1, Сахабутдинова А.Р. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа oksanaibg@gmail.com;

ФГОУ ВПО Башкирский государственный университет, Уфа Жасмоновая кислота (ЖК) и ее производное метилжасмонат (МЖ) являются эндогенными регуляторами роста и развития растений, участвующие в контроле различных физиологических процессов. Особый интерес к жасмонатам вызван обнаружением их важной роли в формировании устойчивости растений к стрессовым факторам как биотической, так и абиотической природы. Однако механизмы их защитного действия на растения пшеницы к неблагоприятным воздействиям окружающей среды пока еще недостаточно ясны. Известно, что засоление среды вызывает резкое усиление генерации активных форм кислорода, что может приводить к серьезным деструктивным последствиям, которые проявляются в нарушении целостности мембранных структур клеток и их проницаемости. Об изменении проницаемости клеточных мембран могут свидетельствовать данные анализа экзоосмоса электролитов. Также важный вклад в защите растений от поступления и распространения токсических ионов, включая и ионы Na, вносит лигнификация клеточных стенок, способствующая укреплению их барьерных свойств.

Так, цель работы состояла в анализе влияния предобработки 0.1 мкМ МЖ на лигнификацию клеточных стенок проростков пшеницы и экзосмос электролитов в норме и при натрий–хлоридном засолении.

Было показано, что в корнях контрольных растений флороглюциновая реакция на лигнин проявлялась, начиная с 5-суточного возраста. Обработка проростков 0.1 мкМ МЖ способствовала ускорению отложения лигнина в клеточных стенках – окрашивание на лигнин проявлялось уже в корнях 4-суточных растений. Инкубирование 4 суточных обработанных и необработанных МЖ проростков в течение 24 часов на среде, содержащей 2% раствор хлорида натрия, приводило к накоплению лигнина в клеточных стенках центрального цилиндра корней, при этом предобработка МЖ существенно интенсифицировала этот процесс. Также обнаружили, что воздействие 2%-ного NaCl оказывает сильный повреждающий эффект на клетки, о чем судили по резкому увеличению выхода электролитов из тканей в сравнении с контролем. Тогда как предобработка МЖ в течение 24 ч оказывала явный защитный эффект на растения пшеницы при засолении, который проявлялся в существенном уменьшении стресс-индуцированного выхода электролитов. К тому же необходимо отметить, что сама по себе предобработка МЖ в течение суток не вызывала увеличения выхода электролитов, что указывает на то, что воздействие этим регулятором роста является вполне благоприятным для растений пшеницы.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу способности 0.1 мкМ МЖ в ходе предобработки ускорять лигнификацию клеточных стенок и снижать уровень повреждающего действия дефицита влаги на целостность мембран клеток, что вносит свой вклад в МЖ - индуцируемую устойчивость растений пшеницы к засолению.

Работа поддержана грантом Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-915.2008.4.) ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИОНОВ CU НА РАСТЕНИЯ ОГУРЦА IN VITRO И КУЛЬТУРУ КЛЕТОК IN VIVO Латюк И. Д Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева, Саранск, irina-latyuk@yandex.ru На современном этапе одним из наиболее серьезных стрессоров антропогенной природы, действующих на растения, являются тяжелые металлы (ТМ). Их возрастающая эмиссия в окружающую среду приводит к накоплению в почве, откуда они легко поступают в растения и далее транспортируются по пищевым цепям. В последние годы предположено участие активированных форм кислорода в стрессовых реакциях растений и их клеток при действии ТМ. В связи с этим необходимо детальное сравнительное изучение механизмов влияния ТМ на растения in vivo и культуру клеток in vitro.Биология клеток растений in vitro является важнейшим разделом клеточной биологии и физиологии растений. Культура клеток высших растений представляет собой хорошую модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Исследования проводились на 7-дневных проростках огурца сорта Единство и 5-недельной каллусной культуре, полученной на разных эксплантах. Каллусы пересаживали на среду МС с добавлением различных концентраций (от 10-5 до 10-3 М/л) CuSO45H2O. Растения выращивали в растильнях с таким же вариантом концентраций CuSO45H2O, как и для каллуса. В листьях растений и каллусной ткани определяли интенсивность перекисного окисления липидов и скорость генерации супероксидного анион-радикала (О2 ), а также активность супероксиддисмутазы (СОД), аскорбат-пероксидазы (АПО) и каталазы. При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Cu2+ в среде показано, что уровень образования этой АФК возрастал относительно контроля во всех вариантах опыта. Очевидно, что все концентрации меди индуцируют в клетках растений огурца возникновение окислительного стресса;

при этом высокая доза ионов меди (1 мМ) приводит к более сильному стрессу. В каллусной культуре обнаружено падение скорости генерации О2 относительно контроля. При изучении интенсивности ПОЛ в растениях огурца было установлено, что этот показатель при всех дозах ионов меди в среде возрастал относительно контроля почти линейно. При этом с увеличением дозы Cu2+ в среде интенсивность ПОЛ повышалась, достигая максимума при концентрации 0,1 мМ.

Интенсивность ПОЛ в каллусной культуре также понижалась относительно контроля во всех вариантах опыта относительно контроля. Активность каталазы в растениях увеличивалась линейно относительно концентрации Cu, в то время как в каллусе значения активности были ниже контроля при 100мкМ и 10мкМ, максимум, превышающий контроль был на концентрации 1мМ. Активность СОД в растениях достигала максимума при 100мкМ и 10мкМ. В каллусной культуре все показатели были ниже контроля. Активность АПО в растениях была практически одинакова во всех вариантах опыта. Однако в каллусе данные показатели оказались ниже контроля.

Исходя из этого, можно сказать, что каллусная культура более устойчива к тяжелым металлам по сравнению с проростками. Это может быть связано с отсутствием дальнего транспорта ионов меди, как это происходит в целом растении;

отсутствием надклеточного уровня регуляции, на который не влияют ионы Cu2+;

отсутствием тканей, избирательно поглощающих тяжелые металлы;

а также может быть результатом адаптации на клеточном уровне к избыточным дозам тяжелых металлов в среде.

ВЛИЯНИЕ ТРИПТОФАНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СИНТЕЗА АУКСИНОВ У ГРИБОВ-БИОДЕСТРУКТОРОВ TRICHODERMA VIRIDE И FUSARIUM MONILIFORME Мелешина А.В., Стручкова И.В.

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, almele@ya.ru Способность синтезировать ауксины достаточно хорошо исследована в основном для видов и штаммов грибов, тесно взаимодействующих с растениями в качестве фитопатогенов или микоризообразователей, тогда как в отношении технофильных микромицетов имеются лишь единичные работы. В то же время исследование возможностей синтеза ауксинов грибами – биодеструкторами промышленных материалов представляет значительный интерес, так как фитогормоны способны повышать биосинтез некоторых ферментов, участвующих в биодеградации, а также изменять ростовые характеристики мицелия, важные для процессов деструкции.


Целью нашей работы являлось исследование влияния триптофана на интенсивность синтеза ауксинов у штаммов Trichoderma viride BKM F –1117 и Fusarium moniliforme ВКМ F – 136, применяемые для стандартных испытаний грибостойкости промышленных материалов. Грибы выращивали 2 недели в темноте на трех типах жидкой полной среды Чапека, различающихся концентрацией триптофана: 0 мМ, 0,5 мМ, 1,2 мМ. Культуральную жидкость отфильтровывали от мицелия. Определяли сырой вес мицелия. Из культуральной жидкости, рН ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ которой доводили до 3,0, двумя объемами этилацетата экстрагировали индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) и родственные ей соединения, химическую природу которых идентифицировали с помощью тонкослойной хроматографии. Суммарную этилацетатную фракцию замораживали (-200C, 12ч), отфильтровывали на холоде от кристаллов льда и выпаривали в роторном испарителе. Сухой остаток, растворенный в этаноле, использовали для количественного определения ИУК путем измерения на спектрофотометре при =535нм оптической плотности окрашенного в красноватый цвет продукта реакции ИУК с реактивом Сальковского. Концентрацию ИУК в среде роста выражали в мкМ, количество ИУК на единицу биомассы – в мкг на г сырой массы мицелия.

Ауксиновую активность выделенных соединений подтверждали с помощью биотеста на колеоптелях пшеницы.

Установлено, что оба штамма, выбранных для исследования, способны накапливать соединения, дающие с реактивом Сальковского красную окраску, что указывает на наличие ИУК в культуральной жидкости обоих грибов. В присутствии как меньшей, так и большей концентрации триптофана в среде роста интенсивность накопления ИУК у F. moniliforme возросла в 2,4 раза, однако у T. viride не претерпела достоверного увеличения.

В то же время было установлено, что указанные концентрации триптофана по-разному сказались на накоплении биомассы мицелия грибов. В частности, мицелиальная масса F. moniliforme на всех средах превышала массу мицелия T. viride не менее чем в 2,7 раза. Наиболее предпочтительной для продуцирования ИУК в расчете на единицу массы любого из двух грибов оказалась концентрация триптофана, равная 0,5 мМ, причем единица биомассы T. viride обладала большей ауксинпродуцирующей способностью, чем F. moniliforme при любой концентрации триптофана.

Таким образом, биодеструкторы T. viride и F. moniliformе способны синтезировать ауксины, при этом возрастание концентрации триптофана в среде роста значительно сильнее увеличивает накопление ИУК у F.

moniliformе. Тем самым ауксины способны оказывать модифицирующее действие на процессы биодеструкции материалов, особенно - имеющих в своем составе триптофан.

ЖИВЫЕ КЛЕТКИ В НЕОРГАНИЧЕСКИХ ОБОЛОЧКАХ: БИОИМИТИРУЮЩАЯ ИНКАПСУЛЯЦИЯ Минуллина Р.Т., Фахруллин Р.Ф.

Казанский государственный университет, Казань, biosensor@bk.ru Создание новых биосовместимых материалов является на сегодняшний день важной задачей для исследователей.

Одним из бурно развивающихся направлений является биомиметика. Биомиметика - это использование биологических объектов в качестве матриц и прототипов для создания различных материалов и искусственных биологических систем. С появлением этого направления внимание ученых обратилось на самый распространенный на планете минерал биологического происхождения – карбонат кальция.

Исследования процессов формирования биогенного карбоната кальция позволяют создавать новые биосовместимые материалы, совмещающие в себе свойства органических и неорганических веществ, а также приблизиться к открытию эволюционных механизмов формирования биогенных минералов.

В связи с этим целью данной работы явилось создание биоимитирующих оболочек карбоната кальция вокруг живых клеток микроорганизмов и водорослей.

В данной работе мы показали возможность создания искусственных микрокапсул из карбоната кальция для еденичных клеток микроорганизмов и водорослей. В качестве модельных объектов мы использовали клетки пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), конидии микроскопического гриба Trichoderma asperellum и одноклеточной зеленой водоросли Dunadiella martima.

С помощью метода флуоресцентной микроскопии было обнаружено, что инкапсулированные клетки остаются жизнеспособными в течение нескольких месяцев хранения. Для оценки жизнеспособности мы использовали окраску флуоресцеин диацетатом (ФДА-тест). Известно, что ФДА деацетилируется неспецифическими эстеразами внутри клеток, в результате чего образуется флуоресцирующий продукт. Также мы проверили жизнеспособность клеток, после удаления неорганических капсул, обработкой ЭДТА. ФДА тест показал, что инкапсуляция не нарушает клеточную стенку и ферментативную активность клеток.

Таким образом, была разработана методика инкапсуляции индивидуальных клеток микроорганизмов и водорослей в капсулы из карбоната кальция. Комбинация свойств живых клеток и неорганического карбоната кальция открывает широкие возможности в разработке новых материалов.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ Наконечная О.И., Аленькина С.А., Никитина В.Е.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Учреждение российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, alenkina@ibppm.sgu.ru Исследователями молекулярных механизмов функционирования микробно-растительных ассоциаций ведется активный поиск рецепторных структур микро- и макропартнеров и изучение ответных реакций, возникающих при установлении ассоциативных взаимодействий. В ассоциации «пшеница-Azospirillum» большой интерес представляют бактериальные лектины в связи с их известными информационными функциями в различных биологических системах.

Ранее с поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3 были выделены лектины, являющиеся гликопротеинами с молекулярной массой 36 кDa, проявляющие специфичность к L-фукозе и имеющие структурные и антигенные различия. Было показано, что лектины азоспирилл наряду с другими поверхностными структурами способны не только участвовать в адгезии бактерий на корнях растений, но и влиять на метаболизм растительной клетки - стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую активности.

Оставался открытым вопрос, изменение метаболизма растительной клетки под действием лектинов азоспирилл происходит с участием NO-синтазной сигнальной системы или без нее. Ключевой молекулой NO-синтазной сигнальной системы является оксид азота (NO).

Показано, что лектины двух штаммов азоспирилл — A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A.

brasilense Sp7.2.3 в концентрации 40 мкг/мл вызывают два пика индукции синтеза оксида азота в корнях проростков пшеницы, происходящей через 3 и 26 ч совместной инкубации. Различия между лектинами родительского и мутантного штаммов наблюдались лишь в случае 26 - часовой инкубации и лектин родительского штамма в большей степени активировал продукцию оксида азота в корнях. Добавление в среду инкубации корней с лектинами кальция в виде СаСl2(0,1мМ) приводило к снижению индуктивной активности обоих лектинов после 26 ч инкубации.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны активировать продукцию оксида азота, и тем самым выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.

ЛИПИДЫ ТОНОПЛАСТА КОРНЕПЛОДОВ КРАСНОЙ СТОЛОВОЙ СВЁКЛЫ ПРИ ГИПО- И ГИПЕРОСМОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ Нестёркина И.С., Озолина Н.В., Дударева Л.В., Саляев Р.К.

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, ozol@sifibr.irk.ru Проводилось изучение динамики липидной составляющей тонопласта при гиперосмотическом и гипоосмотическом стрессах. Изучались липиды выделенные из тонопласта и липиды выделенные из микродоменов (рафтов ) тонопласта. Результаты экспериментов по изучению жирнокислотного состава липидов тонопласта позволяют сделать вывод о том, что текучесть вакуолярных мембран, при гиперосмотическом стрессе, снижается по сравнению с нормой на 1,7%, а при гипоосмотическом стрессе увеличивается на 0,26%.

Липидный состав вакуолярных мембран при этом, по данным ТСХ, практически не изменялся. Изучение липидной составляющей рафтов тонопласта методами тонкослойной хроматографии показало преобладание гликолипидов и стеринов, что характерно для рафтов плазматической мембраны растений и рафтов, выделенных из мембран животных клеток. Идентификация полученных спектров продолжается. Будут приведены предварительные данные по изучению жирнокислотного состава липидной составляющей рафтов, выделенных из мембран корнеплодов, подвергнутых гипо- и гиперосмотическому стрессу, а также исследования, проведённые на корнеплодах, находящихся на разных фазах онтогенеза. Кроме того, будут доложены результаты изучения липидов микродоменов тонопласта методом ИК-спектроскопии.

СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ГОЛУБИКИ И ЧЕРНИКИ ПРИ ЦВЕТЕНИИ И ПЛОДОНОШЕНИИ Павлова Е. Е., Харьковская Е. Е.

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, pavlovaee@gmail.com ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Голубика и черника относятся к роду Vaccinium. Род Vaccinium является источником витаминов и фенольных соединений (ФС), которые широко используются в качестве лекарственных средств и биологически активных добавок. В различные периоды вегетации в растениях изменяется уровень ФС и витаминов, поэтому выявление их содержания в зависимости от периода вегетации важно для определения времени сбора растительного материала.


Целью работы являлось сравнение количества фенольных соединений и аскорбиновой кислоты (АсК) у различных видов голубики и черники в периоды цветения и плодоношения. Объектами исследования служили листья растений голубики щитковой, узколистной и черноплодной, а так же черники кавказкой, культивируемые в Ботаническом саду ННГУ, и Г. обыкновенной и черники произрастающих в лесных массивах Нижегородской области. Определение суммы общих растворимых фенольных соединений (ОРФС), флавонолов (Фл), проводили в 80% этаноловой вытяжке из листьев.

Наибольшее количество ОРФС и Фл в листьях в период цветения определили у черники обыкновенной (122 и мг/г сыр. в. соответственно). А наименьшее количество ОРФС и Фл – в Г. черноплодной (39 и 28 мг/г сыр. в.).

При этом Фл составляют 47-76% ОРФС при цветении растений. В период плодоношения максимальное содержание ОРФС оказалось у черники обыкновенной (135 мг/г сыр. в.), а также у Г. узколистной (132 мг/г сыр.

в.). Наибольшее количество Фл оказалось у Г. обыкновенной (104 мг/г сыр. в.), черники обыкновенной (103 мг/г сыр. в.) и Г. узколистной (99 мг/г сыр. в.). Наименьший же уровень ОРФС и Фл в период плодоношения оказался характерен для листьев Г. черноплодной (45 и 36 мг/г сыр. в. соответственно) и черники кавказской (37 и 36 мг/г сыр. в.).

Таким образом, в результате наших исследований выявлено, что большинство видов характеризуется возрастанием количества ОРФС (на 11-120%) и Фл (на 12-230%) в листьях в период плодоношения. Самое резкое увеличение уровня ФС обнаружено у Г. обыкновенной (количество ОРФС и Фл увеличилось более чем в 2 раза). Однако, по нашим данным, у черники кавказской количество ФС значительно снизилось. В основном за счет резкого снижения нефлаваноидной части ОРФС.

В оба вегетационных периода максимальное содержание АсК в листьях определили у Г. узколистной (2,1 мг/г сыр. в. Цв, 3,4 мг/г сыр. в. Пл) и щитковой (1,6 мг/г сыр. в. Цв, 3,6 мг/г сыр. в. Пл). Наименьшее же количество АсК содержалось в листьях Г. черноплодной(0,4 мг/г сыр. в. Цв, 0,7 мг/г сыр. в. Пл) и черники кавказской (0, мг/г сыр. в. Цв, 0,5 мг/г сыр. в. Пл).

Уровень АсК так же, как и уровень ФС, возрастает в период плодоношения. Однако количество АсК увеличивается более значительно, чем количество ФС, а именно на 60-132%, по сравнению с количеством АсК в период цветения, у всех исследуемых видов растений. Наибольший прирост обнаружен у черники кавказской (на 132%) и Г. щитковой (на 128%).

Таким образом, содержание фенольных соединений и аскорбиновой кислоты в листьях исследуемых растений значительно возрастает во время плодоношения (особенно уровень АсК). Это необходимо растению для защиты от вредителей в этот важный период вегетации, а также для накопления фенольных соединений и витаминов в ягодах. Растениями наиболее богатыми фенолами и аскорбатом являются голубика узколистная и черника обыкновенная. А наименее богата этими соединениями голубика черноплодная. Кроме того, было показано, что флаванолы составляют большую часть растворимых фенольных соединений.

ШТАММЫ RHODOCOCCUS, ОБЛАДАЮЩИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Павлова Ю.А. 1,2, Максимов А.Ю. 1, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь;

Пермский государственный университет, lсhm@iеgm.ru Исследования в области биокатализа и биотрансформации являются одним из важнейших направлений современной биотехнологии. Амидазы – ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Известно, что у бактерий амидазная активность часто сопряжена с метаболизмом нитрилов. У прокариот известны два пути метаболизма этих соединений:

двустадийный гидролиз, с помощью ферментов нитрилгидратаз и амидаз и одностадийный гидролиз, осуществляемый нитрилазой.

Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, могут быть использованы как биокатализаторы синтеза аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот.

Цель настоящей работы – изучение бактерий, метаболизирующих амиды карбоновых кислот, выявление и секвенирование генов амидазы.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ В результате селекции из образцов почв нами выделено более 400 культур грамположительных бактерий, активно метаболизирующих амиды и нитрилы, из них 38, обладающих амидазной активностью более мкмоль/мг/мин, значительно превышавшей нитрилгидратазную в широком интервале температур. Методами полифазной таксономии, а также путем анализа генов 16S рРНК изоляты идентифицированы как R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, Arthrobacter sp.

Показано, что большинство амидаз Rhodococcus высокоактивны при повышенной температуре (50°С), что важно для использования активной биомассы. Проведена трансформация нитрилов и амидов, включая алифатические, разветвленные, непредельные, гидроксилированные и ароматические амидов выделенными штаммами.

Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид (наиболее простые по структуре и легко-метаболизируемые субстраты). Однако некоторые штаммы, селекционированные на изобутиронитриле и изобутирамиде предпочитали именно эти субстраты с пространственно затрудненным доступом к амидной группе. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.

Методом ПЦР получены фрагменты ДНК штаммов Rhodococcus, родственные генам амидаз трех типов:

R.erythropolis (AY026386, Genbank), R. erythropolis (M88614, Genbank), Rhodococcus sp. N-771, R. rhodochrous J1.

Нуклеотидные последовательности определены с помощью ДНК-секвенирующей системы MegaBase1000.

Проведено сравнение нуклеотидных последовательностей и филогенетичский анализ.

Показано, что геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно две группы последовательностей, родственные ранее известным генам амидаз R. erythropolis, GenBank E12517, R. rhodochrous J1, S38270 (I группа), и R. erythropolis, GenBank, M88614 (II группа).

Гены других амидаз встречались со значительно меньшей частотой. Установлено, что изолированные и секвенированные фрагменты гомологичны соответствующим последовательностям генов амидазы R. erythropolis (M88614, Genbank) на 93-99,2%, Rhodococcus sp. N-771 - на 83-98,7%, R. rhodochrous J1- на 95-99%. Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам - и - субъединиц Fe-содержащей нитрилгидратаз, ранее известной у штаммов R. rhodochrous N-774, Rhodococcus sp. R312.

Филогенетический анализ секвенированных последовательностей показал, что большинство изучаемых последовательностей независимо выделенных штаммов из почв, взятых в географически различных точках, более близки между собой, чем к последовательности, депонированные в GenBank E12517, M88614. Вид получаемого филогенетического древа позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к гипотетической предковой форме алифатической амидазы.

Работа поддержана программами: Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 годы)».

ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИЗ РАЙОНА РАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ Пастухова Е.С.,1 Шестакова Е.А.,2 Ястребова О.В. Пермский государственный университет, Пермь;

Camomille-08@mail.ru;

Институт Экологии и Генетики Микроорганизмов УрО РАН, Пермь В последние годы в результате промышленной деятельности человека увеличивается поступление в окружающую среду (моно)полиароматических углеводородов, которые обладают устойчивостью, токсичностью и представляют опасность для биосферы. Наиболее перспективным методом разложения данных соединений является микробная деструкция. В ряде случаев эффективность данного метода ограничивается экстремальными условиями среды, такими как высокое засоление, высокие или низкие значения pH среды.

Целью работы являлось выделение и исследование бактерий-деструкторов (моно)полиароматических углеводородов, устойчивых к экстремальным факторам среды.

Методом накопительных культур из образцов почвы, грунта и техногенно-минеральных образований района солеразработок (г. Соликамск, г. Березники, Пермский край) выделен 21 штамм бактерий-деструкторов ароматических углеводородов, отличающихся грампринадлежностью, морфологией колоний и клеток.

Установлено, что 13 выделенных штаммов способны к росту в минеральной среде Раймонда (Розанова, Назина, 1981) с нафталином, 6 штаммов - с орто-фталатом, 2 штамма – с бензоатом в качестве единственного источника углерода и энергии. Среди штаммов, растущих на орто-фталате, штамм КТ112 обладает наиболее широкой субстратной специфичностью и способен к росту на ароматических субстратах (нафталине, орто-фталате, бифениле) и продуктах их разложения. Грамотрицательные штаммы К513 и К511 способны к эффективному росту на бензоате (1 г/л) в среде, содержащей до 6% хлорида натрия. При содержании 3% NaCl данные штаммы растут на высоких концентрациях бензоата (5 г/л).

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ Большинство выделенных штаммов бактерий являются галоалкалотолерантными организмами, способными к росту в полноценной среде Раймонда при рН 8.0 и 7% NaCl.

Сравнительная генетическая характеристика грамположительных штаммов-деструкторов орто-фталата с использованием метода REP-ПЦР показала принадлежность данных культур к трем геномогруппам, а грамотрицательных штаммов-деструкторов бензоата - к одной геномогруппе.

Предварительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК показал, что штаммы-деструкторы бензоата К511 и К513 филогенетически близки к бактериям рода Pseudomonas (99%), штамм-деструктор бензоата К51 – к бактериям рода Bacillus (99,5%), штамм-деструктор бензоата К52 – к бактериям рода Virgibacillus (99,5%). Штамм-деструктор нафталина и орто-фталата КТ112 имеет наибольшее сходство с бактериями рода Rhodococcus (уровень сходства 98% с R. wratislavensis FPA1T).

Работа выполнена при поддержке Программой Президиума РАН ”Молекулярная и клеточная биология” (ГР в ЦИТиС №01200963682) и ФЦП ”Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” (ГК №02.74011.0078).

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ИНВЕРТАЗЫ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО КРОСС-АДАПТАЦИИ Патраков П.А., Крючкова Е.С., Власова А.А.

Пермский государственный университет, Пермь, Chudinova.Lar@psu.ru Эксперименты по перекрестной адаптации являются убедительным доказательством функционирования общих механизмов устойчивости растений к действию различных стрессоров. В настоящее время основное внимание уделяется изучению биохимических и молекулярно-генетических аспектов устойчивости растений к неблагоприятным факторам, в частности, к одновременному действию высокой температуры и засоления.

Ключевым механизмом адаптации к стрессорам разной природы является синтез низкомолекулярных защитных соединений (НМП). К таким соединениям относятся моносахариды, аминокислоты, бетаины, полиамины. Они выполняют осмопротекторные и протекторные функции. Концентрация этих соединений будет зависеть от активности как индуцибельных, так и конститутивных ферментов их метаболизма. В этом аспекте данный вопрос исследован недостаточно. Целью нашей работы было изучение активности инвертазы (–D фруктофуранозид-фруктогидролаза), регулирующей концентрацию моносахаридов, в условиях перекрестной адаптации проростков пшеницы к высокой температуре и засолению, а также влияние на этот процесс таких регуляторных соединений как кальций и путресцин. Исследования проводили на проростках пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Иргина. Растения выращивались в водной культуре при комнатной температуре в условиях естественного освещения. По достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергали раздельному и совместному действию повреждающей температурой 45оС и засоления 0,5 %-ным NaCL. В соответствующих вариантах перед указанными воздействиями проводилась предварительная обработка проростков закаливающей температурой 37оС. Во второй и третьей серии опытные варианты выращивали в присутствии 0,015%-ного раствора Ca(NO3)2 и 5мМ путресцина соответственно. В листьях проростков определяли активность инвертазы по методу А.И. Ермакова и др. (1987). Полученные результаты показали значительное снижение активности инвертазы во всех опытных вариантах по сравнению с контролем. Особенно сильно активность фермента падала при совместном действии повреждающей температуры и засоления.

Введение ионов кальция и путресцина в питательную среду приводило к возрастанию активности инвертазы как в контрольных, так и в опытных растениях.. Причем опытные варианты сохраняли повышенный уровень активности этого фермента при всех стрессовых воздействиях. Можно предположить, что повышение в цитоплазме концентрации рядя вторичных мессенджеров (кальция и др.) изменяет экспрессию определенных генов, контролирующих накопление НМП и обеспечивает активацию кальций зависимых путей трансдукции сигнала в геном. Известно также, что полиамины принимают участие в индукции синтеза ферментов, причастных к образованию НМП. Повышение активность инвертазы может происходить и без участия белоксинтезирующей системы за счет разрушения под воздействием стрессоров комплекса “фермент – белок ингибитор”. Увеличение активности гидролитических ферментов, таких как инвертаза, приводит к возрастанию количества моносахаридов. В литературе указывается на способность сахаров повышать стабильность биологических мембран, оказывать антиденатурационное действие на белки, проявлять антиоксидантные эффекты. Таким образом, можно сделать заключение, что установленное повышение активности инвертазы в экспериментах по перекрестной адаптации является неспецифической ответной реакцией растений на неблагоприятные воздействия различной природы.

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА ЭКТОПАРАЗИТИЗМА НОВЫХ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ РОДА CHRYSEOBACTERIUM НА БАКТЕРИЯХ РОДА BACILLUS Поливцева В.Н.

Пущинский государственный университет, Пущино, eritro@rambler.ru Нами были выделены из ила озера Байкал и многолетнего нефтешлама Нижнекамского нефтекомбината изоляты грамотрицательной бактерии – штаммы NF4 и NF5, представленные ультрамелкими коккоидными клетками и короткими палочками с размерами от 0.2 до 0.4 мкм в поперечнике и от 0.2 до 0.5 мкм в длину;

среди них значительную часть (30- 60%) занимают наноформы - предельно мелкие клетки с диаметром 180- 300 нм и объемом 0.004-0.02 мкм3. На основании этих данных изолированные бактерии можно отнести к наиболее мелким ультрамикробактериям.

Клетки двух изученных изолятов - грамотрицательные, обладают хорошо выраженной наружной мембраной в клеточной стенке, неподвижные, не обладают жгутиками и скользящей подвижностью, размножаются делением с помощью перетяжки, почкованием и множественной септацией удлинённых клеток. Множественность путей репродукции обусловливает большой полиморфизм клеток.

Выделенные штаммы являются хемоорганотрофами, аэробами, психротолерантами, оксидазо- и каталазоположительными бактериями. Характерным признаком изолятов является отсутствие у него экзоклеточных деполимераз, таких как протеазы, липазы, пектиназы и целлюлазы.

По сходству в последовательности нуклеотидов в гене 16S рДНК и составу клеточных жирных кислот изоляты наиболее близки к некоторым видам рода Chryseobacterium (C. antarcticum, C. jeonii и C. marinum). Однако имеющиеся различия в нуклеотидных последовательностях гена 16S рДНК, а также в фенотипических признаках, таких как образование ультрамелких клеток, отсутствие ряда экзогидролаз, выраженный олиготрофизм и способность к эпибиозу на бактериальных клетках позволяют предполагать, что охарактеризованные изоляты являются, новым видом рода Chryseobacterium.

Особым свойством выделенных изолятов является их способность к эпибиозу – существованию в плотно прикрепленном состоянии на хозяйских клетках Bacillus subtilis. Этот процесс осуществляется поэтапно, конечной стадией является образование плотного контакта между взаимодействующими клетками.

Предполагается, что адгезия к хозяйским клеткам у штаммов NF4 и NF5(представителей филума Bacteroidetes) осуществляется тем же уникальным механизмом, который описан нами ранее у представителей альфапротеобактерий (Kaistia sp., штаммы NF1 и NF3). Ранее нами было описано наличие у данных штаммов рода Kaistia особых ловчих полисахаридных цепей, снабженных липкими узелками-гранулами, э функционируют в качестве улавливающих и стягивающих клетки канатов.

Работа выполнена при поддержке гранта Аналитической ведомственной целевой программы «Развития научного потенциала высшей школы» № 2.1.1/ ГЕНЕТИЧЕСКОЕ БИОРАЗНООБРАЗИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ВСТУПАЮЩИХ В СИМБИОЗ С ЧИНОЙ ГМЕЛИНА (LATHYRUS GMELINI FRITSCHI) Птицын К.Г., Баймиев А.Х.

Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа, Konstantin157@yandex.ru Биологическая фиксация азота бобовыми растениями в симбиозе с клубеньковыми бактериями является важнейшим биологическим процессом, играющим большую роль в круговороте азота в природе и обогащающим почву связанным азотом. В настоящее время микросимбионты дикорастущих бобовых растений умеренного климата изучены мало. Одним из таких растений является чина Гмелина (Lathyrus gmelinii Fritsch), встречающаяся на территории Республики Башкортостан (РБ), которая была взята нами для исследования ее микросимбионтов.

Уникальность чины Гмелина заключается в том, что она является травянистым многолетним реликтовым растением ледникового периода с коротким корневищем, произрастающим на кислых почвах с богатым содержанием микроэлементов, особенно азота.

Для исследования симбионтов чины Гмелина произрастающей в Белорецком районе РБ были собраны клубеньки с корней данного растения. Клубеньки собирали в полиэтиленовые пакеты. Внутрь пакета предварительно помещали влажную вату для предотвращения высыхания собранных клубеньков. После этого, в лаборатории производилась их отмывка и стерилизация. Рассев клубеньковых бактерий производили следующим образом: верхушку клубеньков надрезали стерильной иглой от одноразовых шприцов. Затем другой ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ стерильной иглой забирали материал, делая соскоб со среза, и высевали на твердую питательную среду.

Бактерии выращивали в термостате при 28°С.

Для определения степени филогенетического родства был проведен ПДРФ (полиморфизм длин рестриктазных фрагментов) анализ гена 16S рРНК. Выбор именно этого гена обусловлен, прежде всего, доступностью огромных массивов данных о структуре генов 16S рРНК у самых разнообразных микроорганизмов. Таким образом, было выявлено, что полученные бактерии по схожести гена 16S РНК образуют две однородные группы.

Для детального и более точного анализа фрагменты генов 16S рРНК размером 1300 п.н. представителей обоих групп были секвенированы. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов с помощью программы «Megablast», доступной на вебсайте NSBI (www.ncbi.nlm.nih.gov.), показал, что секвенированные фрагменты по последовательности гена 16S рРНК у обоих представителей близки, тем не менее, к бактериям рода Phyllobacterium.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.