авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 12 |

«Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Всероссийская общественная ...»

-- [ Страница 6 ] --

Отделяли культуральную жидкость и осаждали полисахарид (ПСкж) этиловым спиртом. Из отмытого с поверхности клеток 0.9 % раствором NaCl капсульного материала осаждали капсульный полисахарид (КПС) добавлением ацетона в трехкратном объеме. Осадки растворяли и отделяли соли и пигменты хроматографией на колонке с Sephadex G-50. После лиофилизации выход высокомолекулярных фракций ПСкж и КПС составил 0. и 1.48 % соответственно от массы сухих микробных клеток. Липополисахарид (ЛПС) экстрагировали из высушенных ацетоном бескапсульных клеток по методу Вестфаль. ЛПС был выделен как из водной (ЛПСв/ч), так и из фенольной (ЛПСф/ч) частей экстракта. Выход ЛПСв/ч и ЛПСф/ч от массы сухих микробных клеток составил 1.0 и 1.5 % соответственно. Во всех образцах было выявлено наличие углеводов от 10.7 и до 34.5 %, белка от 0. до 4.0 %, фосфора от 0.6 до 5.0 %, 2-кето-3 дезоксиоктоновой кислоты от 0.1 до 2.9 % и следовые количества нуклеиновых кислот в ЛПС. Методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) после метанолиза в составе исследуемых гликанов были идентифицированы насыщенные, гидрокси- и ненасыщенные жирные кислоты (ЖК) с длиной углеродной цепи от С12 до С18. Во всех образцах преобладающими были 3-гидроксидодекановая, тетрадекановая, гексадекановая кислоты, а также октадеценовая в ЛПСв/ч и ЛПСф/ч и 2-гидроксидодекановая и октадекановая в ПСкж. Моносахаридный состав исследовали методом ТСХ и ГЖХ в виде ацетатов полиолов. Все образцы содержали Man, Glc, Gal, GlcN и неидентифицированный аминосахар. Помимо этого была обнаружена Xyl в ЛПСв/ч и второй неидентифицированный аминосахар в ЛПСф/ч. Иммунохимические исследования проводили с использованием антител (Ат) на целые клетки H. seropedicae Z78 обработанные глутаровым альдегидом специфически взаимодействующих с углеводными компонентами гликополимеров бактериальной поверхности. Методом двойной радиальной иммунодиффузии была выявлена перекрестная реакция Ат с ЛПСв/ч, ЛПСф/ч, и КПС. Это указывает на наличие в КПС антигенных детерминант общих с ЛПС, и как следствие на присутствие в структурах их полисахаридных составляющих одинаковых фрагментов. Методом твердофазного иммуноферментного анализа было показано, что взаимодействие Ат с ЛПСв/ч и с КПС в два раза сильнее, чем с ЛПСф/ч. Ат с ПСкж не взаимодействовали. Таким образом, бактериальная культура H. seropedicae Z78, выращенная на синтетической среде с малатом и глюкозой до окончания экспоненциальной фазы роста, продуцирует в окружающую среду полисахариды отличные по иммунохимическим свойствам от гликополимеров внешней мембраны и капсулы, но имеющие некоторые сходства в химическом составе. Работа частично поддержана грантом НШ 3171.2008. СОДЕРЖАНИЕ ФОСФОРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У РАСТЕНИЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОГО ЗАСОЛЕНИЯ Якушева М.С.

Пермский государственный университет, Пермь, ya.mashuta.89@mail.ru Техногенное загрязнение окружающей среды является одной из важных экологических проблем. Вещества, загрязняющие окружающую среду, оказывают на растение не только отрицательное воздействие, но и снижают пределы толерантности, т.е. уменьшают их устойчивость к естественным факторам среды. На Верхнекамском ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ месторождении солей производится добыча минерального сырья. Галитовые отходы производства солей, образующие солеотвалы г.Соликамска, загрязняют все компоненты ландшафта. Одной из причин угнетения растений при действии засоления является нарушение минерального, в частности, фосфорного питания.

Фосфорный обмен – одно из важнейших звеньев метаболических процессов, связанных с ростом растений.

Адаптация живых организмов к внешним условиям является энергозависимым процессом. В этом плане фосфаты играют ключевую роль, поскольку они способны к образованию разнообразных типов химических связей с малым и большим энергетическим потенциалом. В процессе регуляции солевого обмена, растения осуществляют энергозависимые процессы перекачки ионов через мембраны клеток и транспорт ионов между органами. Для оценки энергообеспеченности исследуемых растений нами было определено содержание кислоторастворимой органической фракции фосфора. В эту фракцию входят АТФ, АДФ, фосфопировиноградная кислота, фосфорные эфиры сахаров и другие соединения, принимающие участие в энергетическом обмене и биосинтетических процессах. Целью нашей работы явилось изучение влияния техногенного засоления на содержание кислоторастворимой фракции фосфора у растений, произрастающих вблизи солеотвалов г.

Соликамска в зоне неустойчивого и устойчивого засоления. Исследования проводились на 5 видах растений:

полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.), клевер ползучий (Trifolium repens L.), мать-и-мачеха обыкновенная (Tussilago farfara L.), бодяк полевой (Cirsium arvense L.)и подорожник большой (Plantago major L.). На основе полученных результатов было установлено, что среди исследуемых видов самый высокий уровень кислоторастворимого органического фосфора характерен для полыни горькой. Это растение относится к группе соленепроницаемых гликофитов, которые приспосабливаются к произрастанию на засоленных почвах благодаря накоплению в тканях органических веществ – продуктов метаболизма;

клетки этих растений малопроницаемы для солей. Можно предположить, что наличие кислоторастворимого фосфора способствует повышению энергообеспеченности данного вида, что имеет важное адаптивное значение в условиях техногенного засоления.

Достаточно высокий уровень кислоторастворимой фракции фосфора отмечен у подорожника большого – эврибионтного вида, способного существовать и в условиях засоления. Повышенное содержание фосфора данной фракции свидетельствует о протекании у растений данного вида защитных реакций, которые требуют энергетических и метаболических затрат. Более низкий уровень фосфатов у других исследуемых видов, вероятно, связан с расходованием энергии макроэнергетических соединений на процессы восстановления звеньев метаболизма, нарушенных избытком засоляющих ионов.

Таким образом, особенности фосфорного обмена растений в условиях антропогенного засоления отражают стратегию биохимической адаптации растений, а выявленные различия можно объяснить как видовой специфичностью, так и развитием различных адаптивных перестроек в метаболизме. Последние, очевидно, связаны с экспрессией генов NaCl-индуцируемых белков и регуляцией активности продуктов этих генов.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА МУТАЦИИ В ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ CEL I ЭНДО НУКЛЕАЗНЫМ АНАЛИЗОМ, КАК ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАРКЕР ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ГРУЗА.

Абдуллаев С.А.

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, abdullaev.iteb@rambler.ru В последнее время растет значительный интерес к состоянию митохондриальной ДНК (мтДНК), как к более уязвимой мишени для генотоксических агентов и возможности ее использования как чувствительного маркера для прогнозирования и диагностики развития различных патологий. В докладе представлены совершенно но вые (полученные впервые) данные скрининга мутантных копий мтДНК в клетках тканей и в плазме (внекле точной циркулирующей мтДНК) мышей (BALB/c), подвергшихся воздействию ионизирующей радиацией (1- Гр Х-лучей). В анализах использовались образцы общей ДНК, выделенные из тканей (селезенка, головной мозг) и плазмы крови мышей в разное время после их облучения. Мутации мтДНК определяли по расщеплению CEL-I нуклеазой (фермент, специфически расщепляющий неспаренные основания) гетеродуплексов, получае мых путем гибридизации ПЦР-ампликонов участков мтДНК (ген ND3 и D-loop регион) облученных и кон трольных мышей. В качестве эталонного образца для расщепления CEL-I нуклеазой был использован гетероду плекс ПЦР-ампликонов участков дикого и мутантного гена р53 человека. Одновременно определяли изменение общего количества копий мтДНК (по гену ND4) относительно яДНК (ген GAPDH) методом ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что метод CEL-I нуклеазного расщепления гетеродуплексов ПЦР-ампликонов является высокочувствительной тест-системой, которая позволяет провести скрининг неизвестных мутаций, индуцируемых ионизирующей радиацией. Анализ результатов указывает наличие повышенного уровня мтДНК с мутациями в клетках тканей и в плазме крови облученных мышей в течение месячного пострадиационного периода. Повышение уровня мутантных копий зависит от дозы облучения мышей. Установлено, что в тканях мозга и селезенки наибольший уровень мутантных копий мтДНК наблюдается на 8 день после облучения, с последующим снижением к 28 дню пострадиационного периода. Отметим, что снижение количества мутант ных копий мтДНК в клетках пролиферирующей ткани селезенки, происходит более активно, чем в постмитоти ческой ткани мозга. Вместе с тем, изменения общего количества копий мтДНК в тканях мышей имеют одина ковый характер и остаются на одинаковом уровне в течение пострадиационного времени. Эти данные указывают, что в клетках тканей облученных животных происходит селективная элиминация поврежденных, мутантных копий мтДНК. Это предположение согласуется с данными, полученными при анализах внеклеточ ной мтДНК плазмы облученных мышей. Результаты показали, что в плазме этих животных регистрируется по вышенный уровень (в зависимости от дозы облучения) циркулирующих мутантных копий мтДНК. Причем, наибольший уровень повышения наблюдается (в отличие от таковой в тканях) на 14 день пострадиационного времени.

Таким образом, в клетках тканей и в плазме облученных животных обнаруживается высокий уровень мутант ных копий мтДНК. Наблюдается интенсивный выброс мутантных копий мтДНК в кровоток из клеток и мито хондрий (возможно в результате отсроченной гибели клеток и митофагии органелл). Внеклеточная мтДНК с мутациями в плазме крови облученных мышей, может служить чувствительным биомаркером радиационного поражения, и действия других генотоксических агентов на организм.

ПРОЛОНГИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ МЕТКИ С-14 КАК ПРОЯВЛЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА В ЛИНИЯХ ДИКОГО ТИПА DROSOPHILA MELANOGASTER Антосюк О.Н., Давиденко К.А., Марвин А.М.

Уральский государственный университет, Екатеринбург, antosuk-olga@mail.ru В связи с современной экологической обстановкой, остро встаёт вопрос о биологическом эффекте малых доз хронического облучения. Выбранная нами модель исследований позволяет оперативно проанализировать влия ние внутреннего источника облучения на все ткани организма, включая предшественники половых клеток.

Таким образом, нашей целью являлось: проследить пролонгирующий эффект малых доз хронического облучения в ряду поколений у Drosophila melanogaster.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Для осуществления исследований были выбраны две линии дикого типа: «Биос-3» и «Белгород», поскольку наши данные по изучению внешних источников облучения свидетельствуют об их различной радиочувстви тельности.

При изучении комплексного воздействия метки С-14 (доза 3 МБк) на нестабильность генома в ряду поколений рассматривались показатели жизнеспособности двух линий дикого типа Drosophila melanogaster. Особый инте рес представлял морфометрический анализ крыла дрозофилы, так как облучению подвергалось только роди тельское поколение в конце 2-го или начале 3-го личиночного возраста, т.е. в период формирования крыла.

В ходе экспериментального анализа показателей жизнеспособности в ряду поколений у обеих линий дрозофи лы было установлено, что:

при инкорпорировании лейцина, меченного по С-14, наблюдается устойчивое повышение средней ин дивидуальной плодовитости относительно контрольной группы;

значение частоты встречаемости поздних доминантных эмбриональных леталей максимально для ро дительского поколения, а далее характеризуется волнообразной динамикой в течение 5 последующих поколе ний;

значение частоты встречаемости постэмбриональных личиночных леталей достигает наибольшей ве личины в F1, а далее также характеризуется волнообразной динамикой в течение 5 поколений;

относительно частоты встречаемости куколочных леталей наблюдается значительное повышение дан ного показателя в родительском поколении.

Выводы:

Достоверных различий в радиочувствительности к внутреннему источнику облучения для исследуемых 1.

линий дрозофилы не было обнаружено, что, вероятно, свидетельствует о влиянии метки С-14 на работу репара тивных систем организма.

За счёт стрессовой стимуляции плодовитости дрозофилы меткой С-14, невозможно достоверно оценить 2.

частоту встречаемости ранних и поздних доминантных эмбриональных леталей, значения которых, возможно, столь же высоки, как при воздействии внешних источников облучения.

Наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в случае высокого тератогенного эффек 3.

та метки С-14 на эмбриональной стадии развития, выжившие особи оказываются более жизнеспособными на стадии личинки. Соответственно, в следующем поколении наблюдается обратная зависимость, так как отбор вторично происходит уже на стадии личинки у F1. Данная закономерность была прослежена нами до F5.

Исходя из полученных нами данных, в течение 5 поколений наблюдается нестабильность генома в двух линиях дикого типа Drosophila melanogaster, которая проявляется в волнообразной динамике ряда показателей жизне способности.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ПАСПОРТИЗАЦИИ СОРТОВ LUPINUS ANGUS TIFOLIUS Артюхова А.В., Гришин С.Ю., Заякин В.В., Нам И.Я.

Брянский государственный университет им. акад. И.Г. Петровского, Брянск, nasteva@list.ru В последние годы все большее значение для сельского хозяйства приобретает люпин. Эта культура, накапливая в почве до 200 кг азота на га, является прекрасным сидератом, а также содержит в семенах от 30 до 50% высо кокачественного белка, что обеспечивает его широкое использование в качестве корма.

Наша работа направлена на разработку и внедрение методов ДНК-маркирования для обнаружения молекуляр ных маркеров хозяйственно ценных признаков, что позволит существенно ускорить селекцию люпина узколи стного, а в дальнейшем и проводить исследования по картированию его генома. Для селекционеров интерес представляют гены устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям, алкалоидности, скороспелости, детер минантности, окраски вегетативных и генеративных органов и других морфо-физиологических признаков.

Первыми шагами в этой области являются обнаружение внутривидового полиморфизма и составление генети ческих паспортов различных сортов люпина узколистного.

Для выявления межсортовых различий межмикросаттелитных последовательностей использовали метод ISSR PCR. ДНК выделяли из пророщенных в течение 4-6 дней семян. 20 сортообразцов люпина узколистного отече ственной и польской селекции были проанализированы с 19 ISSR-праймерами. Использование двух из них по казывало на электрофореграмме высокомолекулярный шлейф, еще семь не показывали межсортовых различий, остальные десять давали от 1 до 10 полиморфных фрагментов. Всего выбранные праймеры позволили обнару жить 46 полиморфных фрагментов из 160 полос. Показатель внутривидового полиморфизма составил около 25%.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА При составлении формул сортов учитывались как мажорные, так и минорные фрагменты, так как они обладали высокой воспроизводимостью. Также большое внимание уделялось их интенсивности, т.к. она, как правило, не изменялась при анализе трех повторных выделений ДНК в одинаковых условиях ПЦР и нанесении на элекро форез одинакового объема амплификата. Такой подход к анализу результатов обеспечивает наиболее полный их учет.

Длины полиморфных фрагментов измеряли с помощью программы QuantityOne.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности применения метода ISSR-PCR для выявления внутривидового полиморфизма и паспортизации люпина узколистного. Составленные паспорта позволяют идентифицировать все 20 использованных в работе сортов люпина узколистного. Существуют молекулярные фрагменты, которые присутствуют во всех сортах отечественной селекции, но являются полиморфными для польских сортов. Начата работа по выявлению амплифициованных фрагментов, которые могут являться моле кулярными маркерами хозяйственно ценных признаков.

ЗАВИСИМОСТЬ ВСТРЕЧАЕМОСТИ МРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ ОТ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОПУХОЛИ ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ Белова Т.В., Плеханова Е.С., Новиков Д.В., Калугин А.В.

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород, belih59@list.ru Раково-тестикулярные гены в норме экспрессируются в клетках семенников и женских репродуктивных орга нах. Также их экспрессия часто индуцируется при опухолевой трансформации клеток. На данный момент из вестно 70 семейств раково-тестикулярных генов. Функции, которые выполняют белки кодируемые этими гена ми, до конца не ясны, однако было показано их участие в регуляции клеточного цикла, процессах апоптоза, а также в работе транскрипционных комплексов. Ограниченная экспрессия раково-тестикулярных генов позволя ет использовать их мРНК или сами белки в качестве биомаркеров опухолевого процесса. В ранее опубликован ных работах описывается встречаемость мРНК этих генов в крови онкологических больных, однако в этих ис следователи не сопоставляли полученные результаты со степенью дифференциации опухоли. Таким образом, задачей данного исследования стало сравнение встречаемости мРНК MAGE-A1-6, MAGE-C, XAGE, SSX, NY ESO-1, PAGE и GAGE генов в крови больных колоректальным раком с разной степенью дифференциации опу холи. В ходе работы было проанализировано с использованием гнездовой ОТ-ПЦР 49 образцов перифериче ской крови больных колоректальным раком. Результаты оценивались с помощью электрофореза в 2% агароз ном геле, содержащем бромид этидия.

Было продемонстрировано, что при злокачественной трансформации клеток и потере гистологических призна ков той ткани, из которой опухоль произошла, наблюдалось возрастание количества одновременно выявляемых форм мРНК раково-тестикулярных генов. При высокодифференцированной аденокарциноме, клетки которой почти неотличимы от аналогичных клеток здоровой ткани, процент встречаемости мРНК раково тестикулярных генов был минимален - 71%. В умеренно дифференцированной аденокарциноме мРНК этих ге нов выявлялась в 79% протестированных образцов. В низко дифференцированных опухолях, обладающих мак симальной пролиферативной активностью, процент выявления мРНК раково-тестикулярных генов составлял 100%.

С потерей признаков дифференциации изменяется и качественный состав выявляемых мРНК раково тестикулярных генов. Наиболее часто на высокой стадии дифференциации выявлялись мРНК MAGE-C и XAGE. В умеренно дифференцированой аденокарциноме наиболее часто выявлялась мРНК MAGE-A1-6. При низкой стадии дифференциации наиболее часто выявлялись мРНК MAGE-A1-6 и SSX. Таким образом, качест венный и количественный состав мРНК раково-тестикулярных генов выявленных в крови больных зависит от степени дифференциации колоректального рака.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

АНАЛИЗ ПОДВИЖНОСТИ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE В ПРИ СУТСТВИИ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ Варшаломидзе О.Э., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кацы Е.И.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, varshalomidze@yandex.ru МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Объектом наших исследований являются бактерии Azospirillum brasilense, вступающие во взаимовыгодные ас социативные взаимоотношения с растениями. Эти бактерии подвижны. Основная популяция клеток A. brasi lense дикого типа использует для перемещения по полужидким средам роение, определяемое флагеллами и межклеточными контактами (Swa+ фенотип). По нашим наблюдениям, довольно часто в популяции A. brasilense Sp245, появляются спонтанные производные, имеющие бльшую скорость роения (Swa++). Для более подроб ного анализа молекулярно-генетических причин изменения поведения бактерий были выделены пять независи мых производных штамма Sp245 (Sp245.P1–Sp245.P5) с ускоренным роением. Оказалось, что спонтанные пере стройки, приводящие к появлению Swa++ вариантов, не обладают строгой сайт–специфичностью и в ряде случаев сопровождаются утратой гена hdfR, локализованного нами в 85-МДа плазмиде (p85) Sp245. HdfR явля ется негативным регулятором транскрипции мастер–оперона flhDC, продукты которого необходимы для экс прессии остальных флагеллярных генов у E. coli и ряда других бактерий. Интересно, что перед выявленными в р85 генами медь-содержащей нитритредуктазы (nirK), гетеродимерной NO-редуктазы (norCB), регулятора транскрипции LysR-типа (hdfR) и каталитической субъединицы цитохромоксидазы (ccoN) есть потенциальные сайты связывания регулятора NarL, находящегося под контролем сенсора нитрата/нитрита NarX. Возможно, биосинтез не только двух ферментов денитрификации, но и кодируемых p85 белков HdfR и CcoN модулируется в ответ на NO3 и NO2. Было проведено сравнение скорости движения и особенностей социальной подвижно сти в присутствии нитратов или нитритов у A. brasilense Sp245 и его спонтанных суперроящихся вариантов, у двух из которых (Sp245.P1 и Sp245.P5) утрачен ген hdfR. В жидкой среде для нитратредукции (MPSS) с нитра том калия клетки вариантов Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, плава ли значительно быстрее, чем особи родительского штамма. При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P подвижность подавлялась, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась. При выра щивании бактерий в жидкой MPSS в условиях недостатка кислорода скорость движения клеток Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 снижалась, не зависела от источника азота и была близка к показателю, характерному для родительского штамма в сходных условиях, но в присутствии нитрата. При этом в случае Sp245 замена нитрата на нитрит в условиях недостатка кислорода приводила к подавлению подвижности клеток. Вероятно, в случае, когда создаются условия дефицита кислорода, усиливается отрицательное действие нитрита на подвижность бактерий в жидких средах. На полужидких средах (концентрация агара 0.4%) с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, и межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 за мена нитрата на нитрит не влияет на подвижность бактерий. Оказалось, что на полужидкой среде с нитритом калия все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к ускоренному, по сравнению с диким ти пом, роению, за исключением штамма Sp245.P5. Таким образом, были выявлены различия в поведении спон танных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый суперроящийся фенотип в средах с солями аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА +3247 A/G ГЕНА ЦИТОКИНА IL-6 СРЕ ДИ ТАТАР В ПОПУЛЯЦИИ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН Габбасов Р.Т., Ахатова Ф.С., Ризванова Ф.Ф., Ризванов А.А., Кравцова О.А.

Казанский государственный университет, Казань, iiiha89@mail.ru Мутации в различных участках генов, кодирующих цитокины (иммуномодулирующие белки, активирующие Т лимфоциты) могут приводить к изменению экспрессии данных белков, что повышает риск проявления той или иной патологии. Цитокин IL-6 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов. Гомозиготность по некоторым из девяти известных полиморфных аллелей гена IL-6 может приводить к патологии. Например, аллель А рассмат риваемого нами полиморфизма +3247 A/G в IL-6 связывают с лимфоцитозом. Создание методов диагностики предрасположенности к заболеваниям требует популяционного анализа частоты встречаемости исследуемого цитокина в конкретной популяции людей.

Цель работы - оценить распределение частот аллелей полиморфизма +3247 A/G IL-6 среди татар в популяции Республики Татарстан (РТ) по сравнению с общей популяцией РТ.

Материалы и методы: методом фенольной экстракции выделили ДНК из крови 118 добровольцев – татар, а также 124 добровольцев – без учета национальности. Определение генотипа проводили методом ПЦР со спе цифичными праймерами для аллелей +3247 A/G гена IL-6. Внутренним контролем служил ген hgh. Анализ про дуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Статистический же анализ - методом 2.

Результаты и обсуждение. Частоты распределения генотипов AA, AG и GG составили: у татар в популяции РТ 39,1 / 47,0 / 13,9%, в общей популяции РТ - 54,6/ 36,7 /8,7% соответственно (р 0,03). Таким образом разработка МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА тест систем на основе полиморфизма генов на территории РТ возможна только с учетом национального признака, что связано как с техническими, так и этическими сложностями. Полученные данные также могут применяться в этнографических исследованиях.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА СТАРТОВЫХ КОДОНОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕНА speA egfp.

Глазова О. В.1, 2, Чернышов С. В. Самарский государственный университет, г. Самара, Россия.

Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М. М.

Шемякина и Ю. А. Овчинникова, г. Пущино, Россия. svch2@rambler.ru Ген speA супрессирует патогенность батерий Erwinia carotovora. Структурная часть гена представляет собой протяженную открытую рамку считывания (ОРС), состоящую из 368 аминокислот. Особенностью данной ОРС является наличие в её пределах 6 кодонов АUG, потенциально претендующих на роль инициирующих. Перед тремя из них (start 2, start 4 и start 6) располагаются пурин-богатые участки, в различной степени обладающие гомологией с последовательностью Шайна-Дальгарно (SD1, SD2 и SD3, соответственно). Три других кодона лишены последовательностей SD. С целью проверки функциональной активности in vivo всех имеющихся SD создан ряд генетических конструкций, где использован ген зелёного флуоресцирующего белка, egfp, в качестве репортерного. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о различной функциональной ак тивности всех трех исследуемых структур. В одной из конструкций ген egfp соединен с 5-концевой частью гена speA, где он поставлен сразу после инициирующего кодона start 6 гена speA. В результате вестерн-блот анали за, проведенного с применением поликлональных антител к GFP, показано наличие ряда сигналов разной ин тенсивности, соответствующих белкам с различными молекулярными массами. Это свидетельствует об одно временном, но неравнозначном участии в инициации трансляции всех трех структур SD. Установлен также факт инициации трансляции со стартовой точки 1, не имеющей перед собой последовательности SD. Причем для этого необходимо, по всей вероятности, присутствие нуклеотидной последовательности, расположенной между стартовыми точками 1 и 2, поскольку постановка гена egfp непосредственно под стартовую точку 1 не приводила к его экспрессии. Для дополнительного подтверждения факта альтернативной инициации трансля ции гена speA на базе векторной плазмиды pET28b была создана конструкция, в которой полноразмерный ген speA соединён с репортёрным геном зелёного флуоресцирующего белка. Продукт этого рекомбинантного гена представляет собой химерный белок, состоящий из двух доменов. N-концевым доменом является белок SpeA, который на C-конце слит с белком GFP. Достоинство данной конструкции заключается в том, что, во-первых, в ней имеются все потенциальные стартовые кодоны и регуляторные элементы для инициации трансляции, а, во вторых, наличие домена флуоресцирущего белка позволяет осуществлять непосредственную детекцию инициа ции трансляции при биосинтезе химерного белкового продукта. Проведен сайт-направленный мутагенез ини циирующих кодонов start 2 и start 6 рекомбинантного гена speA-egfp, приводящий к превращению триплета АUG в триплет CUG и, соответственно, к замене метионина на лейцин. В результате получены три мутантные конструкции, в которых последовательно элиминированы инициирующие кодоны start 2, start 6 и оба кодона вместе. Клетки E. coli, трансформированные этими конструкциями, сохранили способность к флуоресценции подобно контрольным клеткам, содержащим исходную плазмиду, что свидетельствовало об инициации транс ляции с нескольких стартовых точек. Вестерн-блот анализ белков мутантных клонов, продемонстрировал изме нение спектра сигналов по сравнению с контролем. У мутантов наблюдалось исчезновение тех белков, в мРНК которых происходила элиминация инициирующего кодона.

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА И ЭКЗОН-ИНТРОННОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА ТУБУЛИНА-2 ПЕ ЧЁНОЧНЫХ СОСАЛЬЩИКОВ FASCIOLA HEPATICA И ДРУГИХ ТРЕМАТОД Гуляев А.С.1,2, Васильев В.А.1, Архипов И.А.2, Семенова С.К.1, Институт биологии гена РАН, Москва, andrewgull87@gmail.com;

Всероссийский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина, Москва МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Печёночные сосальщики являются возбудителями такого широко распространённого гельминтоза как фасцио лёз. Им могут быть поражены многие виды диких и домашних животных, а также человек. В ветеринарии для борьбы с фасциолёзом широко используются препараты семейства карбаматбензимидазолов, в частности аль бендазол, механизм действия которых основывается на нарушении полимеризации микротрубочек за счёт свя зывания антигельминтика с тубулином-. В результате действия этих препаратов в организме фасциолы проис ходит разрушение цитоскелета клеток, образующих тегумент, а также нарушается нормальный процесс деления клеток на стадии метафазы. Следует отметить, что -тубулин имеет ряд изотипов, например тубулин-1, тубу лин-2, тубулин-3 и т.д., кодируемых соответствующими ядерными генами (tubb1, tubb2 и т.д.). Известно, что в течение десятилетий применения альбендазола появились штаммы фасциол устойчивых к его воздействию.

Показано, что для нематод эта резистентность ассоциирована с изменениями в структуре генов тубулина. По этому целью нашей работы было определение экзон-интронной структуры гена tubb2 у трематод разных видов и поиск полиморфизма, связанного с устойчивостью к действию альбендазола. Для экспериментального изуче ния был выбран печёночный сосальщик F.hepatica (определение вида производилось на основании нуклеотид ных последовательностей ядерного локуса ITS2). Выделение тотальной ДНК из взрослых фасциол проводили по стандартной фенол-хлороформной методике с использованием протеиназы К. Затем проводили реакцию амплификации и разделяли её продукты в 1,5% агарозном геле. Подбор праймеров осуществлялся на основании известных в GeneBank последовательностей кДНК гена tubb2 F.hepatica из Великобритании. Для элюции и по следующего клонирования был выбран фрагмент длиной около 1300 п.н., что примерно равно длине гена tubb у трематод Schistosoma mansoni и Schistosoma japonicum. Секвенирование показало, что ген tubb2 у F.hepatica состоит из 3 экзонов и 2 интронов. Первый экзон имеет длину в 57 п.н., второй – 468 п.н., а третий – 807 п.н.;

длина первого и второго интронов составила 185 п.н. и 86 п.н. соответственно. Трематоды из родов Schistosoma и Fasciola не отличаются между собой по числу экзонов и интронов. Однако, второй интрон и третий экзон оказался у шистосом намного длиннее (315 п.н. и 912 п.н. соответственно), а первый интрон короче (87 п.н.).

Сравнение последовательностей экзонов F.hepatica показало, что доля вариабельных сайтов составляет 5.8%, а доля несинонимичных замен – 23.6%. Сравнение нуклеотидных последовательностей первых двух экзонов у F.hepatica, S.mansoni, S. japonicum и Clonorchis sinensis показало, что доля вариабельных сайтов у пары видов F.hepatica и S.mansoni составляет 23.4%, у F.hepatica и S.japonicum – 24.3%, у F.hepatica и C. sinensis – 24.3%, большая часть которых представлена несинонимичными заменами (от 71.1% до 75.0%).

Планируется дальнейшее изучение полиморфизма генов тубулина и их распределения в российских популяци ях печёночных сосальщиков.

МАТРИЧНАЯ РНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ В КРОВИ И ОПУХОЛЕВЫХ ОЧА ГАХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ Гуррам Н1, Новиков Д.В1, Березин К.В2, Белова Т.В1, Калугин А.В Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород mbre@mail.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород Рак почки является относительно редкой формой рака и занимает 10 место по уровню заболеваемости среди злокачественных новообразований. Тем не менее, разработка методов мониторинга и способов ранней диагно сти рака почки является актуальной задачей. Среди опухоле-ассоциированных антигенов выделяют группу ра ково-тестикулярные антигенов, которые обнаруживаются в опухолевых клетках различного происхождения в различных комбинациях и имеют прогностический потенциал. Транскрипция генов MAGE-A наблюдается в клетках первичных и метастатических опухолей различных гистологических типов. Активация транскрипции раково-тестикулярных генов происходит вследствие гипометилирования генома опухолевых клеток. Ограни ченная экспрессия генов позволяет использовать мРНК раково-тестикулярных антигеноов в качестве маркера присутствия раковых клеток в различных тканях человека. Показано, что обнаружение мРНК ряда раково тестикулярных антигенов в опухолевых клетках ассоциировано с неблагоприятным прогнозом течения заболе вания. Обнаружено, что мРНК, кодирующая раково-тестикулярные антигены, встречается не только в клетках опухолевых очагов, но и в периферической крови онкологических больных, что свидетельствует о циркуляции в кровотоке метастазирующих опухолевых клеток или наличии в крови продуктов деградации опухолевых кле тов. К раково-тестикулярным антигенам относятся ранеее обнаруженные антигены XAGE, GAGE и SSX. Зада чей настоящего исследования явилось исследование встречаемости матричной РНК раково-тестикулярных XAGE, GAGE и SSX антигенов в крови и опухолевых очагах больных раком почки.

В работы исследованы образцы периферической крови и клеток опухолевых очагов полученные от 54 больных раком почки, проходивших лечение в Приволжском медицинском центре (г. Нижний Новгород). Матричную РНК раково-тестикулярных антигенов определяли методом гнездовой ОТ-ПЦР с применением разработанных МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА авторами праймеров. Праймеры позволили проводить детекцию мРНК представителя семейства генов XAGE XAGE-1, одновременную детекцию мРНК девяти представителей семества генов GAGE – генов GAGE1 GAGE9 (GAGE1-9) и трех одновременную представителей семейства генов SSX - SSX-1, SSX-2, SSX-4 (SSX 1,2,4) Результаты реакции учитывали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

В образцах опухолевых очагов больных раком почки матричные РНК XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 антигенов выявлялись в 41, 52 и 76 % случаев, соответственно. В периферической крови больных раком почки матричные РНК XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 антигенов выявлялись в 43, 67 и 83 % случаев, соответственно. На первой стадии рака почки мРНК раково-тестикулярных антигенов XAGE-1, GAGE1-9 и SSX-1,2,4 выявлялась в пери ферической крови у 46, 61 и 92% больных, соответственно. Таким образом, при раке почки как в опухолевых клетках, так и периферической крови обнаруживается матричная РНК различных раково-тестикулярных анти генов. Высокая встречаемость мРНК тестированных антигенов на первой стадии заболевания свидетельствует о возможности использования тестов на их определение при разработке новых методов ранней диагностики рака почки.

Исследование поддержано ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 2013 годы, ГК №П802.

ГЕНОМНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ CNG-МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК Денисова О.В., Железная Л.А.

Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, daktilus7@rambler.ru Метилирование ДНК – один из механизмов эпигенетической наследственности эукариот. Большинство совре менных методов направлены на изучение CG-метилирования отдельных генов или непротяженных участков генома. Однако наравне с CG-метилированием у растений и млекопитающих наблюдается метилирование сим метричных (CNG) и несимметричных (CNN) последовательностей (N – любой нуклеозид).

Недавно было обнаружено, что CNG-метилирование ДНК преобладает в стволовых клетках (при этом около 15% всех метилированных цитозинов входят в состав последовательностей CWG (W – A или Т)) и мало пред ставлено в дифференцированных клетках. Предполагается, что такой тип метилирования играет ключевую роль в возникновении и поддержании плюрипотентного статуса стволовых клеток. Однако до последнего времени значение CNG-метилирования ДНК практически не исследовалось из-за отсутствия быстрых и недорогих мето дов анализа.

Нами предлагается простой и изящный метод анализа CNG-метилирования ДНК высших эукариот. Метод от личаются использованием малых количеств ДНК (10 нг – 1 мкг) и быстрым получением результата.

Предложенный подход основан на расщеплении ДНК двумя сайт-специфическими эндонуклеазами: EcoRII-C – чувствительна к метилированию сайта CCWGG и AjnI – метилнечувствительна. Все этапы метода отработаны в модельных экспериментах с использованием смесей метилированной и неметилированной ДНК фага лямбда и плазмидных ДНК. Скорость проведения анализа обеспечивается применением простой технологии с использо ванием магнитных шариков, позволяющей выделять метилированные фрагменты из полного генома. Получен ные фрагменты ДНК, содержащие метилированные сайты CCWGG, можно использовать в последующих опе рациях. А именно, статус метилирования определенной области можно легко оценить с помощью ПЦР в реальном времени или стандартной ПЦР, а статус метилирования большого числа генов или целого генома можно проанализировать с использованием методов профилирования ДНК, основанных на микрочипах или секвенировании.

В результате проделанной работы составлена библиотека тэгов в векторе pUC18 и впервые показана локализа ция метилированных сайтов CCWGG в геномной ДНК крысы Rattus norvegicus. Дальнейшие исследования на правлены на повышение разрешающей способности метода. Планируется использование IIS-эндонуклеазы MmeI, которая производит расщепление ДНК в стороне от сайта узнавания на расстоянии 18/20 нуклеотидов.

МЕХАНИЗМ ЗАПРЕТА УЗНАВАНИЯ UGA КАК СТОП-КОДОНА У ИНФУЗОРИИ EUPLOTES AEDI CULATUS Елисеев Б.Д.1, Крючкова П.Н.1,2, Алкалаева Е.З.1, Фролова Л.Ю. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, eliseev@vega.protres.ru;

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва.

Биосинтез белка осуществляется наиболее крупной и сложноустроенной клеточной молекулярной машиной – рибосомой – с участием белков, названных факторами трансляции. Заключительная стадия этого процесса на чинается после узнавания стоп-кодона - сигнала остановки белкового синтеза на мРНК. Далее происходит ос вобождение готового полипептида из рибосомы. В организмах с универсальным генетическим кодом 61 смы словой кодон используется для кодирования 20 природных аминокислот, а три кодона UAA, UAG и UGA являются стоп-кодонами. Ресничная инфузория Euplotes aediculatus обладает вариантным генетическим кодом и использует в качестве стоп-кодонов UAA и UAG, в то время как UGA кодирует цистеин.

Известно, что за декодирование стоп-кодонов у организмов с универсальным кодом отвечает N-домен фактора терминации eRF1, поэтому мы предположили, что у Euplotes для запрета узнавания UGA как стоп-кодона в аминокислотной последовательности N-домена eRF1 должны были произойти соответствующие изменения.

Был проведен анализ данных множественного выравнивания аминокислотных последовательностей eRF1 из организмов с универсальным и вариантными кодами, а также данных пространственной структуры, и выделены части N-домена eRF1 Euplotes, которые предположительно могут запрещать узнавание этим фактором кодона UGA. На основе eRF1 человека были получены химерные белки, содержащие такие участки последовательно сти Euplotes, и определена их специфичность в узнавании стоп-кодонов в реконструированной эукариотической системе трансляции in vitro. Химерный белок, который не узнавал UGA, содержал участок последовательности Euplotes в середине N-домена (70-80 а.о.). Эта последовательность в структуре домена включает часть спирали 3. Были также получены и исследованы мутантные белки по отдельным аминокислотным остаткам в этой области. Было выяснено, что аминокислотный остаток 70 вносит основной вклад в запрещение узнавания UGA как стоп-кодона белком eRF1 Euplotes. Аналогичный подход привел ранее к локализации аминокислот, запрещающих узнавание кодонов UAA и UAG как стоп-кодонов у инфузорий рода Stylonychia, в ином участке N-домена фактора терминации. Наши результаты позволяют высказать новые предположения относительно механизма узнавания стоп-кодонов при биосинтезе белка.

ЭКСПРЕССИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ АДРЕНАЛИНОВОМ МИОКАРДИТЕ Искусных И.Ю.

Воронежский государственный университет, Воронеж, iskusnykh777@mail.ru В основе адреналинового миокардита лежит усиление окислительных процессов при нарушении работы систе мы антиоксидантной защиты (САЗ), приводящее к развитию оксидативного стресса. При адреналиновом мио кардите образование активных форм кислорода некомпенсируется САЗ клеток, в которую входят ферментатив ные и неферментативные компоненты. Восстановленный глутатион является компонентом неферментативного звена САЗ, обеспечивая непосредственную детоксикацию АФК, свободных радикалов и гидропероксидов. Вос становление окисленного глутатиона происходит в ходе глутатионредуктазной реакции, функционирование которой осуществляется только при постоянном притоке в реакцию восстановительных эквивалентов в форме NADPH, образующихся, преимущественно, в ходе работы окислительной ветви пентозофосфатного пути, клю чевым ферментам которого является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ). В связи с этим, целью настоя щей работы явилось изучение количественной экспрессии гена Г6ФДГ в сердце самцов белых крыс (Rattus rat tus) с адреналиновым миокардитом с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для индуцирования миокардита крысам вводили подкожно 0,1% раствор адреналина в количестве мкл на 100 г веса организма. Эксперимент проводился в несколько этапов: экстракция тотальной РНК тризоло вым методом, удаление примесей геномной ДНК из выделенной тотальной РНК, обратная транскрипция и ПЦР-амплификация в режиме реального времени на приборе АНК-32. Для проведения ПЦР использовали на бор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR GreenI фирмы «Синтол» и праймеры, подобранные с помощью программы Genamics Expression. Полученные значения пороговых циклов реакций (Ct) были норма лизованы относительно Ct трех генов “домашнего хозяйства” и статистически обработаны с помощью про граммного обеспечения "Relative Expression Software Tool – 2008".

Проведенное исследование показало, что экспрессия гена Г6ФДГ с учетом эффективности амплификации уве личивается при адреналиновом миокардите в 5,9 раз. Имеющаяся в настоящее время научная информация сви детельствует о повышении активности Г6ФДГ в условиях токсического гепатита, сопровождающегося интен сификацией свободнорадикальных процессов. Считают, что увеличение активности данного фермента обеспечивает устойчивость клеток к окислительному стрессу. Ряд данных свидетельствует о возможности из менения активности Г6ФДГ за счет конформационных изменений молекулы фермента. Однако вопрос о регу ляции экспрессии Г6ФДГ оставался открытым. Наши данные указывают, что одним из механизмов повышения МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА активности Г6ФДГ при оксидативном стрессе, вызванном, в частности, развитием адреналинового миокардита, может быть гиперэкспрессия фермента. Таким образом, необходимость поставки восстановительных эквива лентов для усиленной работы глутатионовой САЗ в условиях оксидативного стресса приводит к увеличению экспрессии Г6ФДГ при развитии адреналинового миокардита.

ПРИСУТСТВИЕ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ В КРОВИ И КЛЕТКАХ ОПУХО ЛЕВЫХ ОЧАГОВ ПРИ МИОМЕ МАТКИ Калугин А.В.1, Белова Т.В.1, Плеханова Е.С.1, Новиков Д.В.1, Конторщикова Е.Ю. НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ, Н.Новгород, KAV290485@yandex.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород При неопластической трансформации возможна реактивация генов, кодирующих раково-тестикулярные анти гены, в норме характерные для герминальных клеток семенников и неподнадзорных иммунной системе орга нов. Одними из них являются NY-ESO-1, SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 антигены. Выявление мРНК, кодирующих раково-тестикулярные антигены, в периферической крови человека может указывать на наличие процесса клеточного перерождения. Целью данного исследования является сравнение спектров мРНК раково тестикулярных антигенов SSX-1,2,4, NY-ESO-1, XAGE-1, GAGE1-8, PAGE-1 в периферической крови и клет ках опухолевых очагов больных миомой матки.

Матричные РНК SSX-1,2,4, NY-ESO-1, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 выявляли в периферической крови и клетках опухолевых очагов 33 больных миомой матки с помощью обратной транскрипции-полимеразной цеп ной реакции (ОТ-ПЦР). Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Установлено, что суммарная частота обнаружения мРНК данных антигенов в клетках опухолевых очагов со ставила 36 %, а в периферической крови – 33 %. В образцах опухолевых очагов чаще обнаруживались мРНК XAGE-1 (27%) и SSX-1,2,4 (18%), реже – мРНК GAGE1-8 (6%), а мРНК NY-ESO-1 и PAGE-1 – отсутствовали.

При этом мРНК двух антигенов определялись в 12 % случаев, а одного антигена – в 27% случаев. Образцы опу холевых очагов, одновременно содержащие мРНК трёх и более антигенов, отсутствовали. В образцах перифе рической крови тех же больных встречаемость мРНК SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 была ниже, чем в клетках опухолевых очагов, и она составила 15%, 9% и 3%, соответственно. Необходимо отметить присутствие в пери ферической крови мРНК PAGE-1 (12%) и NY-ESO-1 (9%), которые не были выявлены в клетках опухолевых очагов. 15% образцов периферической крови содержали мРНК одного антигена, 9% образцов – мРНК двух ан тигенов и 3% образцов – мРНК трёх антигенов. Ни один из образцов периферической крови не содержал мРНК более чем трёх антигенов. Следует отметить, что при сравнении экспрессии мРНК NY-ESO-1, SSX-1,2,4, XAGE-1, GAGE1-8 и PAGE-1 в периферической крови и клетках опухолевого очага одного больного в десяти случаях заболевания миомой матки в крови были обнаружены мРНК данных антигенов, которые не детектиро вались в клетках солидной опухоли.

Подобные различия в обнаружении мРНК тестированных антигенов в периферической крови и клетках опухо левых очагов могут быть обусловлены их функциональными отличиями, особенностями иммунного ответа, а также разнообразными эпигенетическими изменениями, происходящими при туморогенезе. Таким образом, при миоме матки мРНК XAGE-1, SSX-1,2,4, NY-ESO-1, PAGE-1 и GAGE1-8 выявляются как в крови, так и в клетках солидных опухолей. Обнаружение в периферической крови больных миомой матки мРНК раково тестикулярных антигенов свидетельствует о циркуляции в ней или опухолевых клеток, или продуктов их де градации.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований.

СТРАТИФИКАЦИЯ ВОДНОЙ КОЛОНКИ ОЛИГОТРОФНОГО ОЗЕРА РАДОК, ВОСТОЧНАЯ АН ТАРКТИДА, ПО ДОМИНИРУЮЩИМ БАКТЕРИАЛЬНЫМ ФИЛОТИПАМ ПО ДАННЫМ ПЦР С ТРЕМЯ РАЗЛИЧНЫМИ ПРАЙМЕРНЫМИ КОМБИНАЦИЯМИ Карлов Д.С., Чувочина М.С., Алехина И.А., Булат С.А.

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина, makondo07@gmail.com МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Антарктические озёра – это уникальные экстремальные водные экосистемы c олиготрофными и низкотемпера турными условиями существования. Изучение их микробиоты представляет особый интерес в плане поиска внеземной жизни (экзобиологии). Целью исследования было оценить микробное содержание и разнообразие в водной колонке холодного (не выше 1оС) олиготрофного пресноводного глубоководного оз. Радок, Оазис Эй мери, Восточная Антарктида. Материал исследования включал 6 образцов, из которых 4 были взяты в самой глубокой точке озера (R1 – 1.3м;

R100 – 100м;

R200 – 200м;

R367 – 367м) и 2 образца - у береговой черты и в истоке реки Межозёрной (глубина 2м). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК использовали ге номную ДНК и праймеры на вариабельную область гена v3-v5 (для всех 6 образцов), а для двух образцов (R1 и R367) – дополнительно на вариабельную область v4-v8 и полноразмерный ген. Продукты реакций клонировали, клоны после риботипирования секвенировали и полученные последовательности анализировали филогенетиче ски.

В результате для области v3-v5 в целом для 6 образцов доминировали (состояли из трёх и более клонов) 5 фи лотипов Actinobacteria, 2 филотипа Cyanobacteria совместно с хлоропластами и пластидами и по одному фило типу – -, -, -Proteobacteria, Bacteriodetes и Candidate division OD1. Особо отметим обширный видовой ком плекс из актинобактерий, состоящий из трех подвидов, представители которых показали 96-97% сходства с видом Candidatus Planktophila limnetica и составили от 42 до 100% клонов во всех 6-х библиотеках.

Анализ бактериального разнообразия двух водных горизонтов (1м и 367м) по полноразмерному гену выявил 1 и 3 доминирующих филотипа, соответственно. Один филотип (хлоропластная ДНК водорослей) оказался общим и совпал с филотипом, выявленным для этих же образцов по области v3-v5, 2-ой филотип (367м, пластидная ДНК страменопилов) совпал с филотипом, выявленным по области v3-v5 лишь в образце с глубины 200м, а 3-й филотип (367м) из Bacteroidetes оказался уникальным. Вместе с тем, повсеместно доминирующий (по данным области v3-v5) видовой комплекс Candidatus Planktophila limnetica не был выявлен вовсе, что указывает на вы раженную праймер-специфичность, которую необходимо учитывать при молекулярном анализе микробного разнообразия методом ПЦР амплификации генов 16S рРНК и последующего секвенирования.

Эту закономерность подтвердил анализ тех же водных горизонтов (1м и 367м) с праймерами на вариабельную область гена 16S рРНК v4-v8. Так, было выявлено 6 и 7 доминирующих филотипа, соответственно, из которых между образцами совпал лишь один (Mycobacterium sp.), который также совпал для области v3-v5, но не был выявлен вовсе при анализе полноразмерного гена. Кроме того, по данной области (v4-v8) было выявлено 4 (1м) и 3 (367м) уникальных филотипа, не совпадающих ни между собой, ни с филотипами, выявленными по области v3-v5 и полноразмерному гену.


В целом бактериальное разнообразие в водной колонке озера Радок оказалось на удивление большим и жизнь в нем, несмотря на экстремальные условия, процветает.

Данное исследование поддержано грантами РФФИ 07-04-00646_а, 05-05-66806-НЦНИ_a (С.А. Булат).

ПОЛИМОРФИЗМ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ICAM-1 ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ Князев Д.И.1, Сахарнова Т.А.2, Новиков Д.В.1, Алясова А.В.2,Новиков В.В.1.

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, Н.Новгород Нижегородская государственная медицинская академия, Н.Новгород ICAM-1 (InterCellular Adhesion Molecule 1) – мембранный гликопротеин молекулярной массой 80-114 кДа, при надлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов. ICAM-1 вовлечён в клеточные адгезивные контакты, а так же в адгезивные контакты между клеткой и межклеточным матриксом. В соответствии с литературными дан ными, повышенная экспрессия ICAM-1 при раке может как подавлять развитие опухоли, так и способствовать агрессивному опухолевому росту и усилению метастатического потенциала. Помимо изменений экспрессии на поверхности малигнизированных клеток, наблюдаются изменения сывороточного уровня растворимого ICAM 1 (sICAM-1). Образование растворимой формы происходит либо за счёт схода с мембраны путём протеолити ческого расщепления, либо путём альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК). В последнем случае удаляется участок пре-мРНК, кодирующий часть трансмембранного домена, в результате чего также происхо дит сдвиг рамки считывания и терминация трансляции.

В настоящей работе проведено исследование образцов опухолевых очагов толстого кишечника на наличие мРНК, кодирующих мембранную и растворимую формы ICAM-1;

выполнена оценка содержания sICAM-1 в сыворотке крови больных колоректальным раком;

проведено генотипирование больных по однонуклеотидному полиморфизму (SNP, single nucleotide polymorphism) rs5498 – замене аденина на гуанин, приводящего к амино кислотной замене лизин-глутамин в составе трансмембранного домена ICAM-1.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА В исследование было включено 49 больных колоректальным раком в возрасте от 45 до 84 лет на разных стади ях патологии. Детекцию мРНК мембранной и растворимой форм ICAM-1 в образцах опухолей проводили ме тодом ОТ-ПЦР. Генотипирование по SNP rs5498 выполняли методами ПЦР и секвенирования. Определение уровня растворимого ICAM-1 в сыворотке крови выполняли двухсайтовым иммуноферментным методом с ис пользованием моноклональных антител ИКО-184, специфичных к ICAM-1, и поликлональных антител, специ фичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека.

Распределение генотипов по SNP rs5498 было следующим: AA-33%, AG-49%, GG-18%, частота аллеля A соста вила 57%, G – 43%. Полученные результаты соответствуют ранее обубликованным данным европейских иссле дователей, однако на данный момент не позволяют сделать вывод о статистически значимой связи между гено типом по SNP rs4598 и риском развития колоректального рака. Уровень растворимого ICAM-1 в сыворотке крови больных был вдвое выше, чем у доноров, независимо от присутствия мРНК ICAM-1 в клетках опухоле вых очагов. Матричная РНК мембранной формы ICAM-1 наблюдалась в 84% случаев, из них в 34% случаев обнаруживалась мРНК растворимой формы. Случаев экспрессии мРНК только растворимой формы в опухоле вых очагах не наблюдалось. У больных без метастазов мРНК растворимой формы выявлялась в 35% случаев, тогда как у больных с регионарными и отдалёнными метастазами – в 13% случаев. Таким образом, можно предположить, что наличие растворимой формы мРНК ICAM-1 ассоциировано с пониженным риском возник новения метастазов.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE ПО ОБ РАЗОВАНИЮ ЖГУТИКОВ, СОЦИАЛЬНОЙ ПОДВИЖНОСТИ И СТРУКТУРЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ Ковтунов Е.А.1,2, Петрова Л.П.1, Шелудько А.В.1, Кацы Е.И. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, kovtunovea@mail.ru В качестве основного объекта исследования нами выбраны почвенные бактерии Azospirillum brasilense, обла дающие гибким метаболизмом и способные вступать во взаимовыгодные ассоциативные взаимоотношения с широким кругом растений. На клетках A. brasilense могут образовываться разнообразные двигательные орга неллы, с помощью которых, а также полисахаридных компонентов клеточной поверхности и иных средств межклеточной коммуникации и микромодификации внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории и корни растений. Одним из способов колонизации поверхностей является роение бактерий, то есть зависящее от работы жгутиков, межклеточных контактов и продукции сурфактантов, роль которых могут выполнять ли пополисахариды (ЛПС) и экзополисахариды (ЭПС), согласованное перемещение по различным средам. При переходе от свободного плавания к роению увеличиваются продольные размеры бактерий и количество жгути ков. У A. brasilense, бактерий со смешанным жгутикованием, при роении, кроме полярного жгутика, образуют ся также многочисленные латеральные жгутики. Генетические механизмы, обеспечивающие переход бактерий от плавания к роению, до сих пор не расшифрованы. Ранее нами были получены неподвижные (с парализован ным полярным и латеральными жгутиками) омегоновые мутанты модельного штамма A.brasilense Sp245. Инте ресно, что локусы, существенные для образования и работы жгутиков азоспирилл, обнаружены в резидентных плазмидах (р120 и р85) штамма Sp245. Целью данной работы было обогащение библиотеки мутантов A. brasi lense Sp245 новыми инсерционными мутантами по образованию жгутиков, социальной подвижности, структуре R ЛПС и ЭПС. В качестве искусственного транспозона использовали Omegon-Km. Было отобрано 1714 Km кло нов. Для отбора мутантов с нарушениями подвижности использовали метод укола в полужидкий агар, с даль нейшей регистрацией образования "колец роения". Наличие кольца "роения'' и его диаметр отражают подвиж ность в полужидкой среде, где преимущественную роль играют латеральные жгутики. Способность мутантов продуцировать функционирующий полярный жгутик оценивали по подвижности клеток в жидкой питательной среде посредством световой микроскопии. Затем клетки неподвижных клонов проанализировали с использова нием просвечивающей электронной микроскопии. В результате были отобраны четыре полностью неподвиж ных мутанта. Штамм A. brasilense Sp245 на поверхности плотных питательных сред образует плотные, шерохо ватые, врастающие в агар, колонии (R-фенотип), активно сорбирующие краситель конго красный за счет R поверхностных полисахаридов. Количество Km клонов, не собирующих краситель, составляет примерно 30% от общего числа клонов;

40% клонов представлены неоднородной популяцией микроорганизмов: только часть их колоний активно сорбируют краситель. Были отобраны два мутанта, имеющие ослизненный S-фенотип, один из которых неподвижен. Обогащенная библиотека мутантов будет использована для клонирования и сек МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА венирования генетических локусов, мутагенез которых приводит к определенным изменениям в фенотипе бак терий;

для идентификации кодирующих последовательностей и характеристики предполагаемых продуктов их трансляции. Выполнение этой работы должно способствовать получению новых данных о регуляции социаль ной подвижности микроорганизмов.

ВЛИЯНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В РИБОСОМНЫХ БЕЛКАХ L5 И L25 НА СВОЙСТВА АП ПАРАТА ТРАНСЛЯЦИИ И РОСТ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI Коробейникова А.В., Корепанов А.П., Аникаев А.Ю., Максимова Е.М., Никонов С.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.

Институт белка РАН, Пущино, kav-20@rambler.ru 5S рРНК является неотъемлемым компонентом рибосом всех известных организмов. Как и в других бактериях, в Escherichia coli с этой рибосомной РНК образуют специфический комплекс три рибосомных белка, L5, L18 и L25. 5S рРНК-белковый комплекс расположен вблизи от функциональных центров 50S субчастицы, а рибосом ная субчастица, реконструированная in vitro в отсутствие 5S рРНК, функционально неактивна. Однако до сих пор нет прямых данных о том, какую роль играют 5S рРНК или связывающиеся с ней белки в работе аппарата трансляции. Недавно нами показано, что два 5S рРНК-связывающих белка, L5 и L18, строго необходимы для выживания бактериальной клетки. В то же время, клетки E. coli, лишенные белка L25, выживали, но росли зна чительно медленнее клеток дикого типа. Целью данной работы является выяснение необходимости некоторых межмолекулярных контактов белков L5 и L25 для функционирования рибосомы.

Белок L5 в рибосоме помимо специфического взаимодействия с 5S рРНК и 23S рРНК контактирует еще с не сколькими молекулами. В частотности, в кристаллической структуре функционального комплекса бактериаль ной рибосомы петля b2-b3 белка L5 образует контакт с тРНК в Р-участке. Для выяснения роли этого структурного элемента белка L5 в работе рибосомы E. coli, мы внесли несколько вариантов мутаций непосредственно в хромо сомный ген белка. Одиночные замены S73A и R80A в петле b2-b3 белка L5 не влияли на ростовые характеристики клеток E. coli. В то время как делеция всех аминокислотных остатков петли (S73-R80) приводила к замедлению роста клеток. Рибосомы, содержащие такой мутантный белок, не отличались от контрольных рибосом по ком пактности, белковому составу и точности трансляции природной матрицы in vivo. Однако эффективность синтеза полипептида (beta-галактозидазы) мутантными рибосомами была значительно сниженной.


По результатам биохимических и кристаллографических исследований белок L25 взаимодействует в рибосоме только с двумя молекулами, 5S рРНК и белком L16. Ранее нами было показано, что некоторые мутантные формы белка L25 (Y31A или H88F) неспособны связываться с изолированной 5S рРНК. Мы решили проверить, как такие мутации в белке L25 повлияют на рост клеток E. coli и встраивание белка в рибосому in vivo. Были получены штаммы E. coli, содержащие в хромосоме ген указанной мутантной формы белка L25. Оказалось, что клетки данных мутантных штаммов не отличаются по скорости роста от штамма дикого типа при различных условиях культивирования, а мутантный белок L25 встраивается в рибосому. Вероятно, что эти одиночные мутации в РНК-связывающем модуле белка L25 не полностью исключают его контакт с 5S рРНК в рибосоме. Поэтому, нами были получены и охарактеризованы штаммы E. coli, содержащие в хромосоме ген мутантной формы бел ка L25 с множественными заменами в РНК-связывающем модуле, для которых должна была полностью исклю чаться возможность их контакта с 5S рРНК.

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание роли двух 5S рРНК-связывающих белков в формировании и функционировании бактериальной рибосомы.

Работа поддержана: грантами РФФИ № 09-04-01747-а, № 08-04-00459-а, Программами Президента РФ по под держке Ведущих научных школ (НШ-751.2008.4) и «Молекулярная и клеточная биология» РАН. Работа М.Б. Гар бер поддерживается грантом Медицинского Института Говарда Хьюза (HHMI 55005609).

ВЛИЯНИЕ ИОННОЙ СИЛЫ РАСТВОРИТЕЛЯ НА СКОРОСТЬ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА РНК-БЕЛОК Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Сычева А.М, Тищенко С.В., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Учреждение Российской академии наук Институт Белка РАН, Пущино, zelle@rambler.ru МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Для функционирования многих биологических систем важна способность белков специфически узнавать опре деленные участки на поверхности РНК, однако правила, по которым происходит это узнавание, слабо изучены.

Объектом наших исследований является двухдоменный рибосомный белок L1. Этот белок образует L1-выступ рибосомы, участвующий в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Кроме того, он имеет специфи ческий участок связывания на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи».

Ранее в нашей лаборатории были определены пространственные структуры белка L1 из нескольких организмов в свободном состоянии и в комплексе со специфическими фрагментами мРНК и рРНК. Анализ структурных данных выявил на поверхности домена I белка L1 структурно инвариантную область, состоящую из консерва тивных аминокислотных остатков, формирующих со специфическим участком на РНК консервативные недос тупные для растворителя водородные связи. РНК-связывающие свойства белка исследовались методом поверх ностного плазмонного резонанса, который позволяет наблюдать за взаимодействием молекул в реальном времени.

В данной работе исследовалось влияние ионной силы раствора на кинетику образования и распада комплексов с РНК, образованных как белком L1 дикого типа, так и его мутантными формами. Ионная сила устанавливалась путем изменения концентрации NaCl в диапазоне 0.15М – 0.7 М. Измерения показали, что константа скорости ассоциации белка и РНК уменьшается в среднем на два порядка, тогда как константа скорости диссоциации увеличивалась не более чем в 5 раз. Характер зависимости кинетических констант от плотности противоионов на поверхности белка позволяет оценить влияние электростатических взаимодействий на сродство белка и РНК и кинетику образования и распада их комплексов.

Работа финансировалась Программой поддержки ведущих научных школ Программой МКБ РАН, Федеральным агентством по науки и (НШ-4435.2010.4), инновации (ГК № 02.740.11.0295), грантом РФФИ.

СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ МУШЕК DROSOPHILA MELANOGASTER МОДЕЛИРУЮЩИХ РАКОВЫЕ ПЕРЕРОЖДЕНИЯ ТКАНИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ ФАСЕТОЧНЫХ ГЛАЗАХ.

Крючков М. В., Аверков В. С., Плешкова Н. А.

Институт Белка РАН, Пущино, Michail_V._Kryuchkov@mail.ru Идентификации новых генов/белков, активность которых повышена или нарушена при различных патогенных состояниях - одно из востребованных направлений современной геномики и протеомики, и является фундамен тальной научной проблемой, решение которой имеет огромное значение для современной молекулярной биоло гии, медицины и фармакологии. Существует множество различных технологий идентификации потенциальных мишеней. Одной из таких технологий, до сих пор используемой лишь ограниченно, является технология экс прессии потенциального белка-мишени в глазу плодовой мушки D.melanogaster.

Впервые предполагается настолько масштабная транформация D.melanogaster препаратом кДНК библиотеки.

Благодаря высокоэффективным методам трансформации предполагается осуществить несколько сотен тысяч иньекций и тем самым получить коллекцию трансформантов, содержащую все кДНК человеческой ткани.

Примеры успешного выявления или характеризации человеческих белков-мишеней с использованием дрозофи лы немногочисленны. Одна из причин этого - имевшая место ранее низкая "пропускная способность" техноло гии создания трансгенных мух, тогда как современные методы трансгенеза позволяют достичь высочайшей эффективности трансформации дрозофил. Кроме того, не ясно a priori, какой человеческий белок следует экс прессировать в дрозофиле и каковы шансы получения фенотипа, оправдывающего затраченные усилия. Под ход, предлагаемый нами, решает эти проблемы и превращает их в сильные стороны. Вектор, в который клони руется кДНК-библиотека, модифицируется таким образом, чтобы уже в поколении F1 идентифицировать не только факт встраивания чужеродной ДНК в геном дрозофилы, но и фенотип глаза при экспрессии человече ского трансгена. Устанавливаются индивидуальные трансгенные линии, дающие рыхлость при экспрессии в глазах.

Идентификация новых генов, вызывающих нарушение развития глаза D.melanogaster с помощью ПЦР и секве нирования. Используя стандартные методы определения нуклеотидной последовательности ДНК, новизна под хода заключается в масштабном подходе селекции линий на основе нарушения фенотипа, которые подвергают ся анализу, что может позволить проанализировать все человеческие гены, экспрессия которых нарушает процесс органогенеза модельного организма D.melanogaster.

Большой научной ценностью будет обладать исчерпывающее знание от том, какие белки человека настолько консервативны и важны, что при экспрессии в организме, далеко расположенном от человека на эволюционной МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА лестнице, способны взаимодействовать с белками этого организма и нарушать нормальные процессы его орга ногенеза. Прикладная ценность такой коллекции видится в исчерпывающем списке всех возможных дрозо фильных моделей человеческих патологий.

На данный момент нами получено порядка 500 линий мушек, гиперэкспрессирующих человеческие гены. Из них 3 линиии охарактеризовано как рыхлоглазые, экспрессирующиеся в них белки идентифицированы. Ведётся работа по выяснению их функции в канцерогенезе.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОК ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМИ ФАКТОРАМИ Кудряшова Н.В.1, Салафутдинов И.И.1, Исламов Р.Р.2, Ризванов А.А.1, Казанский государственный университет, Казань, nkudryashova@gmail.com;

Казанский государственный медицинский университет, Казань На сегодняшний день большое значение придается разработке методов генно-клеточной терапии различных заболеваний человека, таких как нейродегенеративные и сердечнососудистые заболевания, с использованием стволовых клеток. Для повышения эффективности клеточной терапии активно исследуются возможности при менения генетически модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих терапевтические гены. В каче стве терапевтических генов нами были выбраны следующие нейротрофические факторы: VEGF и FGF2.

Целью работы является получение генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих терапевтические гены VEGF и FGF2.

Материалы и методы. Клонирование генов VEGF и FGF2 в экспрессионные плазмидные вектора. Амплифика ция генов VEGF и FGF2 с использованием специфичных праймеров методом ОТ-ПЦР, созданных на основе нуклеотидных последовательностей данного гена из системы GeneBank. Продукты ПЦР – амплификации были проанализированы в агарозном геле с последующим выделением из геля и очищением интересующих нас фрагментов. Реакция лигирования полученных фрагментов была проведена с использованием T4 ДНК-лигазы.

Для исключения наличия мутаций и подтверждения получения рекомбинантных плазмид было проведено пол ное секвенирование вставок. Определение первичной нуклеотидной последовательности выполнялось на авто матическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). После этого нами было проведено субклонирование генов в экспрессионные плазмидные вектора pcDNА 3.1+ и pBudCE4.1. В качестве транс плантируемых клеток были использованы клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека, харак теризующиеся низкой аллореактивностью. Эти клетки были выделены с помощью стандартной методики оса ждения клеток в плотности фиколла. Для трансфекции выделенных клеток плазмидой pBud-VEGF-FGF2 был выбран метод электропорации, обладающий высокой биологической безопасностью и эффективностью по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена. В работе использовался прибор Gene Pulser Xcell Total System с кюветами 0,4 см (BioRad). При повышении значений напряжения и емкости пульсового воздействия эффективность электропорации была выше, однако в то же время существенно снижалась жизне способность клеток (информация не показана). После трансфекции клетки инкубировались в CO2 –инкубаторе в течение 18 ч в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS и ампициллин/стрептомицин. В качестве контроля по служили нетрансфецированные клетки мононуклеарной фракции и клетки, трансфецированные контрольной плазмидой pEGFP-N2 (Clontech).

Результаты. 1) получение плазмидного вектора, экспрессирующего комбинацию генов сосудистого эндотели ального фактора роста VEGF и фактора роста фибробластов FGF2;

2) экспериментальным путем разработан протокол трансфекции стволовых клеток человека для научно-исследовательских работ и последующих кли нических испытаний;

3) путем трансфекции стволовых клеток получены генетически модифицированные клет ки, экспрессирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и фактор роста фибробластов FGF2.

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИТИН-СПЕЦИФИЧНОГО ДОМЕНА РАСТИТЕЛЬНЫХ ПЕРОКСИДАЗ Кузьмина О.И., Постригань Б.Н., Кулуев Б.Р., Гильмутдинов Р.А.

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа, olya.kuzmina.ibg@gmail.com МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА В настоящее время ответ на вопрос о роли генов устойчивости растений неблагоприятным условиям среды, в том числе биотической природы, является актуальным, так как это открывает перспективы использования био технологических подходов для повышения продуктивности растений. Дикие виды пшениц и эгилопсов с мно гообразием морфо-физиологических и биохимических признаков, характеризуются разнообразием и в генах, способствующих формированию у них и устойчивости ко многим биотическим и абиотическим факторам. Сре ди многообразия таких генов специфическое место занимают гены, кодирующие патоген-индуцируемые изопе роксидазы, среди которых ранее в нашей лаборатории выявлены хитин-специфичные изоформы. Целью этой работы явился анализ молекулярно-генетической организации полисахарид-специфичного сайта гена перокси даз растений.

Проведенная нами ПЦР с использованием праймеров к фрагменту гена, кодирующего полисахарид специфичномый домен, показал, что между видами пшеницы значительных отличий по размеру ампликона не существует. В то же время, секвенирование показало наличие в этом фрагменте определенных замен нуклеоти дов, специфичных к определенным видам пшеницы. Полученные данные можно рассмотреть с позиции эволюции пшеницы.

C использованием вектора pCambia 1305.1 с репортерным геном GUS, находящегося под контролем 35S промотора, для направленного клонирования фрагмента хитин-связывающего сайта гена анионной пероксидазы получена ген но-инженерная конструкция. Следует заметить, что амплифицированный фрагмент встроен вместо интрона, идуще го после промотора гена GUS. После таких модификаций данная конструкция была способна экспрессироваться в бактериальных клетках. Проведенный SDS-форез выявил белок размером ~ 110 кДа, который, по нашему пред положению, и является трансформированным химерным белком. Соответственно, интерес представлял факт определения его способности взаимодействовать с хитином. С использованием хитина в качестве сорбирующей матрицы экспериментально доказано, что химерный белок -глюкуронидазы, содержащий хитин-связывающий домен пероксидазы, обладает способностью взаимодействовать с хитином.

На основе вектора pCAMBIA 2301 с фрагментом гена анионной пероксидазы в антисенс-ориентации под управ лением промотора вируса мозаики георгина создана генно-инженерная конструкция. Полученные конструкции в сенс- и антисенс-ориентациях методом агробактериальной трансформации встроены в каллусы пшеницы и арабидопсиса. Это позволит выяснить роль пероксидазы в механизмах защитных реакций против патогенов.

Таким образом, в этой работе нам удалось доказать способность взаимодействовать с хитином фрагмента гена пероксидазы в химерной конструкции с геном -глюкуронидазы. Полученные данные доказывают, что у хитин специфичных пероксидаз растений на поверхности белка существуют непосредственные сайты, ответственные за их связывание с хитином патогенных грибов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №05-04-48310, 08-04-90259-Узб-а и Всероссийского моло дежного научного инновационного конкурса «УМНИК» (2009).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ НАСЕКОМЫХ ОТРЯДА ТАРАКАНОВЫХ (DICTYOPTERA, BLATTINA): РИБОСОМНАЯ ДНК И МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ Мавропуло В.А.1, Каграманова А.С. 1, Лукьянцев С.В.2, Анисюткин Л.Н.3, Муха Д.В. Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва, mavropu lov@gmail.com;

Томский государственный университет, Томск, Учреждение Российской академии наук Зоологический институт, Санкт-Петербург Кластер рибосомных генов (рДНК) является классическим примером мультигенного семейства. Повторяющие ся единицы формируют кластер, в которых гены 18S-, 5,8S- и 28S-подобных рРНК разделены рядом спейсер ных последовательностей: межгенными (IGS) и внутренними транскрибируемыми (ITS-1 и ITS-2) спейсерами.

Известно, что одной из важных составляющих генома эукариот являются мобильные генетические элементы (МГЭ). Доля генома, приходящаяся на мобильные элементы может составлять десятки процентов. У многих видов эукариот кластеры рибосомных генов служат, так называемой, «нишей» для определенных семейств мо бильных элементов, в частности, R1 и R2 ретропозонов, которые интегрируются в высококонсервативный рай он 28S гена.

В ходе работы был проведен сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов фрагментов 18S-5,8S 28S рДНК 38 видов трех семейств тараканов. Показано, что данный фрагмент является высокоинформативным для филогении данной группы насекомых. Построены филогенетические деревья на основе как относительно эволюционно консервативных частей генома (гены рибосомных РНК), так и относительно вариабельных – про межуточных последовательностей (спейсеров), разделяющих повторяющиеся последовательности структурных генов. Первый подход направлен на создание филогенетического древа, позволяющего определить степень эво МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА люционного родства между различными таксонами. Второй подход, предполагающий анализ близкородствен ных видов, направлен на выявление особенностей конкретных механизмов молекулярно-эволюционного про цесса изменчивости рДНК этой группы организмов.

Построение филогенетического древа отряда Таракановые позволяет выявить закономерности эволюционной изменчивости организмов и определить генетические дистанции между различными видами, то есть позволяет проследить этапы «вертикального переноса» генетического материала. Кроме того, построение филогенетиче ских деревьев необычайно важно для выявления актов «горизонтального переноса» различных участков гено ма, в частности мобильных элементов.

С использованием нескольких пар вырожденных праймеров нами были амплифицированы и затем клонирова ны протяженные фрагменты R2 мобильных элементов нескольких видов тараканов, принадлежащих различным подсемействам. Для R2 ретропозона рыжего таракана определена полная последовательность нуклеотидов.

Исследована доменная организация белковых последовательностей, соответствующих выявленным ORF кло нированных мобильных элементов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (09-04-01113-а и 08-04-01402-а) и Программы фундаментальных исследований РАН «Биологическое разнообразие» (подпрограмма «Генофонды и генетиче ское разнообразие»).

МЕХАНИЗМЫ СОХРАНЕНИЯ ПЛОДА – РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК Матвеичев А.В.1,2, Талаев В.Ю.1, Талаева М.В.1, Цатуров М.Э.1,2, Ломунова М.А.1, Заиченко И.Е.1, Бабайкина О.Н. Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н.Блохиной, Н. Новгород, alex_norton@mail.ru Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, Н. Новгород В ходе беременности в организме матери происходят уникальные иммунологические изменения, позволяющие успешно развиться плоду, несущему 50% генов отца, чуждых для матери. Очевидно, должны существовать специфические механизмы для поддержания толерантности матери к растущему плоду, и их изучение является принципиальной задачей, так как большое число патологий беременности (бесплодие, невынашивание, преэк ламсия) являются следствием иммунологического конфликта на границе разделов организмов матери и плода.

Данная работа посвящена исследованию роли наиболее активных антигенпрезентирующих клеток иммунной системы - дендритных клеток (ДК) в реализации механизмов, обеспечивающих толерантность иммунной сис темы матери и плода. В ходе работы была in vitro создана экспериментальная модель фето-плацентарного мик роокружения, включающая основные клеточные типы беременной матки: клетки цитотрофобласта, дендритные клетки, лимфоциты и, в ряде экспериментов, децидуальные фибробласты. ДК получали из моноцитов крови культивированием с интерлейкином-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором.

Часть ДК созревала в присутствии клеток цитотрофобласта (ТР). Культуры ДК, росшие с ТР (ДК-ТР), содержа ли большое количество вытянутых веретенообразных клеток, в отличие от ДК, росших без ТР. Культуры ДК ТР демонстрировали фенотипическую незрелость – снижение экспрессии молекул HLA-DR и процента клеток, несущих ее, повышение экспрессии моноцитарного маркера CD14. ДК, росшие без ТР, как и ДК-ТР, одинаково эффективно стимулировали пролиферацию аллогенных лимфоцитов. В то же время созревание ДК в присутст вии ТР подавляло их способность стимулировать продукцию интерферона- – ключевого цитокина, управляю щего наиболее опасными для плода клеточными формами иммунных реакций. Т-лимфоциты, стимулированные ДК-ТР, сохраняют экспрессию CD62L, что ограничивает маршрут их рециркуляции и возможность участия в конфликте матери и плода. Таким образом показано, что ДК участвуют в формировании цитокинового сдвига беременности и изменении миграции Т-клеток. Полученные данные открывают возможность поиска новых средств для лечения патологий беременности. Работа поддержана РФФИ, проекты 07-04-00244, 10-04-00304-а.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 12 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.