авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |

«Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Всероссийская общественная ...»

-- [ Страница 7 ] --

БОКОВОЙ L12-ВЫСТУП АРХЕЙНОЙ РИБОСОМЫ: КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА N-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА БЕЛКА L10 СО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК Митрошин И.В.1, Кравченко О.В.1, Пиндл В.2, Никонов С.В.1, Гарбер М.Б. Институт белка РАН, Пущино, ivan-mitroshin@rambler.ru;

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Биоцентр, Медицинский университет, Иннсбрук.

Белки L10 и L12 вместе с доменом II 23S рРНК формируют необходимый морфологический элемент большой рибосомной субчастицы всех изученных организмов, называемый выступом (L7/L12-выступ в бактериях, L12 выступ в археях, P1/P2-выступ в эукариотах). L12-выступ вовлечен в образование так называемого "ГТФазу связывающего сайта" и играет важную роль при взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в кон троле точности трансляции.

Наша работа посвящена структурным исследованиям компонентов рибосомного L12-выступа из архей рода Methanococcus. Из-за высокой подвижности данного выступа его кристаллическая структура до сих пор полно стью не определена в составе рибосомы. Поэтому определение структур отдельных компонентов данного вы ступа является актуальной задачей. Знание пространственной структуры комплекса рибосомного белка L10 со специфическим фрагментом 23S рРНК позволит уточнить структуру архейной рибосомы и детально оценить взаимодействие между белком L10 и 23S рРНК.

В препаративных количествах наработан и выделен рекомбинантный N-концевой фрагмент рибосомного белка L10 из Methanococcus jannaschii с чистотой пригодной для кристаллизации. Специфический 95 нуклеотидный фрагмент 23S рРНК из M. jannaschii синтезирован методом транскрипции in vitro. N-концевой фрагмент рибо сомного белка L10 формирует комплекс со специфическим фрагментом 23S рРНК в молярном соотношении 1:1. Оказалось, что в процессе кристаллизации от 95 нт фрагмента 23S рРНК отщепляется несколько нуклеоти дов. Именно из такого препарата данного РНК-белкового комплекса были получены первые кристаллы. Было принято решение создать генетическую конструкцию укороченного специфического фрагмента 23S рРНК.

Фрагмент гена 23S рРНК был наработан с помощью ПЦР и вставлен в вектор pUC18. Отсутствие мутаций в нуклеотидной последовательности фрагмента гена 23S рРНК в созданной плазмиде было проверено секвениро ванием.

Работа финансировалась Программой МКБ РАН и Федеральным агентством по науке и инновации (ГК № 02.740.11.0295).

ВЛИЯНИЕ ИНДУКЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В КЛЕТКАХ К562 НА ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАСОМ.

Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А.

Учреждение российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, t.n.moiseeva@gmail.com Протеасома представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, который отвечает за расщепление большинства внутриклеточных белков по средствам убиквитин-зависимого протеолиза. Кроме того, известно, что протеасомы обладают неканоническими активностями – эндорибонуклеазной и АТФ-зависимой геликаз ной, а также участвуют в регуляции транскрипции. Совмещение таких важных функций делает протеасому не заменимым участником различных этапов регуляции экспрессии генов при любом изменении физиологическо го состояния клетки.

Доксорубицин является сертифицированным противораковым препаратом, поэтому исследование его воздейст вия на клетки и, в частности, на активности и посттрансляционные модификации протеасом, имеет важнейшее прикладное значение.

Для изучения влияния индукции повреждения ДНК в клетках К562 на посттрансляционные модификации, субъединицы протеасом, выделенных из цитоплазмы и ядер контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562, были разделены с помощью двумерного электрофореза. Пятна, соответствующие по расположе нию на геле альфа-субъединицам протеасомы, были вырезаны из геля и исследованы с помощью масс спектрометрии на наличие посттрансляционных модификаций. Удалось выявить несколько сайтов фосфорили рования и убиквитилирования субъединиц 5, 6 и 7, при этом количество модификаций изменялось после воздействия на клетки доксорубицина.

Исследование эндорибонуклеазных активностей тех же субъединиц показало существенные изменения в пред почтительных условиях проведения реакции эндонуклеолиза при индукции повреждений ДНК.

Для оценки влияния доксорубицина на протеолитические активности протеасом были проведены эксперименты с флуорогенными пептидными субстратами для проверки трипсин-подобной, химотрипсин-подобной и каспаз подобной активностей протеасом. Все эти активности оказались существенно выше для протеасом, выделенных из клеток, обработанных доксорубицином.

Полученные результаты говорят о возможной регуляции каталитических активностей протеасомы – эндорибо нуклеазной и пептидазных – с помощью таких посттрансляционных модификаций – фосфорилирования и убик витилирования.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234) и Программы Пре зидиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ БЕЛКА HFQ ИЗ PSEUDOMONAS AERU GINOSA Москалева О.В.1,2, Мельник Б.С.2, Столбоушкина Е.А.2, Никонов С.В.2, Никулин А.Д. Пущинский филиал Московского государственного университета, Пущино, ovmoskaleva@rambler.ru;

Институт белка РАН, Пущино Hfq – небольшие (от 8 до 11 кДа) термостабильные бактериальные белки, являющиеся регуляторами экспрес сии многих генов. Мутация hfq- в клетках Escherichia coli приводит к изменению экспрессии генов более чем белков, как правило, за счет стимулирования связывания малых регуляторных РНК с комплементарными уча стками мРНК, что позволяет инициировать или ингибировать их трансляцию.

Характерной чертой бактериальных Sm-подобных белков Hfq является так называемый Sm-фолд, состоящий из консервативных Sm1 и Sm2 мотивов. В клетке такие белки существуют в виде гексамеров и образуют торои дальные структуры. За взаимодействие с молекулами РНК, как правило, отвечают атомы -тяжей Sm1-мотива, а за формирование четвертичной структуры - атомы азота и кислорода главной цепи 4 и 5 тяжей Sm2-мотива соседних мономеров, которые образуют консервативные водородные связи и формируют сквозной -лист, про ходящий через весь гексамер. Стабилизация четвертичной структуры обеспечивается взаимодействием боко вых цепей консервативных боковых остатков, которые прикрывают межсубъединичную область от растворите ля.

Нами было высказано предположение, что замена ряда консервативных аминокислотных остатков, отвечающих за формирование четвертичной структуры, могут привести к утрате важных консервативных водородных свя зей. Это, в свою очередь, может привести к изменению четвертичной структуры белка, либо уменьшению ста бильности белка Hfq.

Были получены мутантные формы белка с заменой выбранных консервативных аминокислотных остатков, часть из них закристаллизованы. Полученные белки обладали пониженной стабильностью по сравнению с бел ком дикого типа. С кристаллов белков сняты наборы рентгеноструктурных данных высокого разрешения. Оп ределение структур мутантных форм белков позволит нам оценить влияние мутаций на характер образования водородных связей и формирование четвертичной структуры белка Hfq.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МКБ РАН и Федеральным агентством по науке и инновации (ГК №02.740.11.0295).

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ЭКТОИНА У АЭРОБНЫХ МЕТИЛОТРОФ НЫХ БАКТЕРИЙ Мустахимов И.И.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино, mii80@rambler.ru Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности ДНК выше ectABC-ask оперона, кодирующего ферменты биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофных бактерий Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methy lophaga alcalica и Methylophaga thalassica, выявили ОРС (гены ectR), продукты которых проявляли сходство с известными транскрипционными регуляторами Mar-семейства. У Mm. alcaliphilum 20Z и M. thalassica ectABC ask оперон транскрибируются с двух промоторов (ectAр1 и ectAр2), проявляющих гомологию с 70-зависимым промотором Escherichia coli. Показано, что количество мРНК, транскрибируемой с промотора ectAр1, макси мально в клетках, подвергнутых осмотическому шоку, и минимально у выросших при низкой концентрации соли клеток, тогда как транскрипция с промотора ectAр2 поддерживалась в этих условиях на постоянном уров не. Таким образом, из двух промоторов ectABC-ask оперона только промотор ectAр1 является осморегулируе мым.

Для выяснения роли обнаруженного нами белка EctR в регуляции ect-оперона был получен штамм Mm. alcali philum 20Z с делецией гена ectR. Уровень экспрессии генов биосинтеза эктоина определяли в клетках исходно го и мутантного штаммов с использованием репортерного гена gfp, клонированного в векторе pTSGex под кон тролем промотора ect-генов (ectAp). Измерение флуоресценции показало более высокую активность ectAp промотора в штамме с нокаутом гена ectR при росте на средах с различной соленостью, по сравнению со штам МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА мом дикого типа. Следовательно, у данного метанотрофа белок EctR является репрессором транскрипции ect оперона.

Показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z транскрипция гена ectR осуществляется с единственного промотора ectRp, проявляющего сходство с 70-зависимым промотором E. coli. Следует отметить, что у Mm. alcaliphilum 20Z промотор ectRp находится между промоторами ectAр1 и ectAр2, свидетельствуя о том, что транскрипция с про мотора ectRp может контролироваться собственным продуктом - белком EctR. Напротив, у M. thalassica транс крипция гена ectR осуществляется с трех промоторов, причем предполагаемые -10 и -35 последовательности только промотора ectRp1 гомологичны соответствующим последовательностям 70-зависимого промотора E.

coli. При этом промоторы ectRp1, ectRp2 и ectRp3 гена ectR не перекрываются с промоторной областью ect оперона, в промоторных областях гена ectR не найден сайт связывания для белка EctR. Вероятно, транскрипция гена ectR у M. thalassica осуществляется конститутивно, но на низком уровне.

Картированием сайта узнавания белка с помощью ДНКазы I установлено, что EctR Mm. alcaliphilum 20Z защи щает протяженный асимметричный участок ДНК, содержащий -10 последовательность ectAр1 промотора. Гель фильтрацией показано, что данный белок как в свободном (м. м. 44-45 кДа), так и в связанном с ДНК состоянии (м. м. 50-55 кДа) является димером. Поиск в базе данных GenBank ОРС, гомологичных генам ectR, выявил их присутствие в нескольких геномах галофильных бактерий. Последовательности, аналогичные сайту связывания белка EctR выявлены в участках ДНК, фланкирующих гены синтеза эктоина у M. thalassica, M. alcalica, Reine kea sp. и Oceanobacter sp. Полученные данные позволяют предположить у ряда галофильных бактерий наличие регуляторной системы экспрессии генов синтеза эктоина с участием транскрипционного репрессора EctR.

Работа поддержана грантами РФФИ (10-04-01224-а;

09-04-92520-ИК_а), Министерства образования и науки РФ (РНП 2.1.1/605), ГК (02.740.11.1296) и CRDF (Rub1-2946-PU-09).

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭВОЛЮЦИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОСНОВНОГО АНТИГЕННОГО БЕЛКА БАКТЕРИОФАГА Т4.

Нигматуллина Л.Ф.1, Зимин А.А. Башкирский Государственный Университет, Уфа, liraenigma@rambler.ru;

Учреждение Академии Наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина, Пущино Бактериофаг Т4 и родственные ему Myoviridae несут на поверхности своего капсида декорирующие белки. Ис следуемый белок hoc является одним из них, и его влияние на жизнеспособность фага ничтожно. Тем не менее, именно этот белковый компонент фаговой частицы вызывает наибольший иммунный ответ в организме живот ного. Учитывая тот факт, что бактериофаги обнаруживаются в крови животного организма, то можно предпо ложить, что отбор вариантов поверхностных белков капсида мог происходить в этой экологической нише. Бе лок hoc состоит из четырех сходных между собой доменов. Исследование аминокислотной последовательности каждого из этих доменов белка hoc бактериофага Т4 проводилось с помощью программы PSI-BLAST. Для изу чения аминокислотной последовательности исследуемого белка, мы провели пять последовательных повторов (итераций). В каждом выданном программой результате обнаруживались домены белков капсида родственных бактериофагов, степень сходства с которыми была высока, а также домены других белков фагов, бактерий и животных. Все эти последовательности мы вводили в следующий этап повтора, в котором появлялись новые сходные с доменами Gp hoc участки различных белков. Проведенное нами сравнительное исследование этого белка с его гомологами родственных бактериофагов показало, что он обладает большой эволюционной пла стичностью. В основном его изменения связаны с изменением числа повторяющихся аминокислотных последо вательностей. Выводы. 1).В сравнении отдельных доменов было найдено сходство с соответствующими доме нами белков hoc родственных бактериофагов и в меньшей степени сходство с их другими доменами.

2).Несмотря на то, что четыре домена исследуемого белка сходны между собой, их последовательности показа ли сходство с различными белковыми последовательностями. 3).Исследование первого домена показало, что его аминокислотная последовательность имеет также слабое сходство с белками отростков бактериофага VP5, относящегося к Рodoviridae, а также BP-4795 семейства Siphoviridae. В ходе изучения особенностей второго домена было обнаружено его некоторое сходство с капсидным белком фага VP2 (Рodoviridae) и белком Wac бактериофага RB43. Последний входит в состав воротничка фага. Мы предполагаем, что данные последова тельности белков могут быть экспонированы на поверхности частиц. Второй домен hoc обнаруживает инте ресное сходство с компонентом отростка различных бактериофагов (Felix 01 семейства Myoviridae, инфици рующий Salmonella, лямбдоподобный фаг Enterobacteria phage HK97, относящийся к Siphoviridae, а также с основным белком хвоста профагов бактерий Shigella boydii, Escherichia coli O157). В этом сравнении также по казано сходство белка hoc Т4 и капсидного белка фага Т5. Второй домен обнаруживает большое сходство с двумя участками по 94 аминокислоты в белковой последовательности Gp hoc бактериофага RB30. Этот факт МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА дает основание полагать, что эволюционно белок фага RB30 стал пятидоменным в результате дупликации уча стка гена hoc фага Т4. Исследование третьего домена показало наибольшее сходство белков hoc у семи родст венных бактериофагов: RB32, RB14, RB51, RB30, RB69,JS10, JS98. Домены этих фагов различаются между собой многочисленными заменами в области последних 20 аминокислот. Также в списке подобных белков об наруживается отмеченный ранее белок компонента хвоста бактериофага VP5. Показано слабое сходство с Gp hoc фага Phi1. Сравнение четвертого домена hoc фага Т4 показало, что, по-видимому, именно эта часть белка постоянна во всех белках hoc родственных бактериофагов. Данная последовательность совпадает на 97% у бактериофагов Т4-типа. Четвертый домен имеет большое сходство с белком hoc фага RB43, который не обна руживал сходство с первыми тремя доменами данного белка. Вероятно, прикрепление к капсиду происходит именно за счет четвертого домена и его присутствие для формирования структуры белка обязательно. 4) Мы предполагаем, что природные hoc- - мутанты и фаги, сходные по гену hoc с RB43, могут быть более эффектив ными в фаготерапии заболеваний, вызванных патогенными бактериями, в связи со слабым антительным отве том на них иммунной системой человека или животного.

ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЙ ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2:

СТРУКТУРА ВТОРОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ ГТФ Никонов О.С., Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Институт белка РАН, Пущино, alik@vega.protres.ru Гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) играет центральную роль в связывании метианили рованной инициаторной тРНК (Met-tRNAi) на рибосоме в эукариотах и археях. В комплексе с ГТФ он связыва ется с такой тРНК и доставляет ее в Р-сайт малой рибосомной субчастицы.

Так же как и его эукариотический гомолог, архейный фактор инициации трансляции состоит из трех субъеди ниц:,, и. Анализ кристаллической структуры, полученной нами ранее сокристаллизацией субъединицы aIF2 со смесью ГДФ и нерасщепляемого аналога ГТФ позволил выявить второй сайт связывания нуклеотида на молекуле aIF2. В то время, как канонический сайт связывания, располагающийся на G-домене, был занят мо лекулой ГДФ, второй сайт, расположенный на поверхности домена 2, был занят молекулой GDPNP. Однако, связывание нерасщепляемого аналога ГТФ в этом месте могло быть обусловлено как кристаллическими усло виями, так и особенностями данного нерасщепляемого аналога, содержащего NH группу перед -фосфатом, которая образовывала водородную связь с кислородом главной цепи Asp222. Т.о. функциональная значимость обнаруженного второго места связывания нуклеотида на субъединице aIF2 оставалась под вопросом. Нашими австрийскими коллегами, in vitro и in vivo было показано, что субъединица aIF2 из Sulfolobus solfataricus имеет дополнительную функцию. Она связывается с 5’-концом мРНК при наличии на нем трифосфата и защищает ее от деградации. Мы предположили что обнаруженный нами второй сайт связывания нуклеотида может так же принимать участие и в связывании мРНК. Нами были получены кристаллы и определена структура комплекса aIF2 из S. Solfataricus с другим нерасщепляемым аналогом ГТФ, а именно GDPCP, не содержащим NH группу в положении перед гамма фосфатом, и, следовательно, не способным образовать водородную связь в этом по ложении. Сравнение положений обоих нерасщепляемых аналогов ГТФ по отношению к субъединице показа ло, что второй сайт связывания нуклеотида действительно существует на поверхности aIF2 и что он способен связывать различные аналоги ГТФ сходным образом. Как и в структуре, полученной сокристаллизацией aIF со смесью GDPNP/GDP, в структуре комплекса aIF2-GDPCP была обнаружена молекула нерасщепляемого аналога ГТФ в щели, сформированной -листом домена II (7, 8, 12, 13) и мобильным участком switch 1 G домена (остатки 41-44). Участок структуры, формирующий второй сайт связывания нуклеотида на поверхности субъединицы, образован консервативными и высоко консервативными остатками, как в археях, так и в эука риотах, часть которых образует сеть водородных связей с нерасщепляемым аналогом ГТФ.

Работа поддержана РФФИ, Программой поддержки ведущих научных школ и Программой МКБ РАН.

ДЕЛЕЦИЯ АЛАНИНА В МЕЖДОМЕННОЙ ПЕРЕТЯЖКЕ ПРИВОДИТ К РАСХОЖДЕНИЮ ДОМЕ НОВ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L Никонова Е.Ю. 1, Костарева О.С. 1, Тищенко С.В. 1, Габдулхаков А.Г. 1, Сычева А. М. 2, Невская Н.А. 1, Нико нов С.В., 1Гарбер, М.Б. 1.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, 142290, Московская область, г. Пущино, ул.

Институтская,4, katya_nik@vega.protres.ru Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт Биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10.

Рибосомный белок L1 – один из самых крупных рибосомных белков, он образует L1-выступ рибосомы, участ вующий в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Кроме того, он имеет специфический участок связывания на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи».

В нашей лаборатории давно ведётся работа по исследованию структуры и РНК-связывающих свойств белка L1.

Ранее нами были определены структуры рибосомного белка L1 из различных организмов как в свободном, так и в связанном с РНК состояниях. Нами было обнаружено, что взаимное расположение доменов в бактериаль ном белке L1 из Thermus thermophilus (TthL1) меняется при связывании с РНК;

белок переходит из закрытой конформации в открытую. В гомологичных белках L1 из термофильных архей закрытая конформация не на блюдалась. Анализ аминокислотных последовательностей и структур бактериального и архейных белков по зволил предположить, что закрытая конформация TthL1 в свободном состоянии вызвана присутствием в его междоменной перетяжке дополнительного остатка Ala158, который отсутствует в архейных белках L1.

Нами была получена мутантная форма белка L1 из бактерии T. thermophilus с делецией аланина в данном поло жении. Белок был закристаллизован, пространственная структура определена методом молекулярного замеще ния с разрешением 1.95. Анализ полученных данных показал, что делеция аланина в междоменной перетяжке белка привела к расхождению доменов белка, а также к повороту второго домена относительно первого. Белок TthL1из закрытой конформации перешел в открытую, характерную для него в составе комплекса с РНК.

Несмотря на такие серьёзные конформационные подвижки, РНК-связывающие свойства белка изменились не значительно. На приборе ProteOn XPR36 были измерены константы скоростей ассоциации и диссоциации, ха рактеризующие взаимодействия рибосомного белка L1 дикого типа и его мутантной формы со специфическими фрагментами рРНК и мРНК. Показано, что раскрытие доменов бактериального рибосомного белка L1 практи чески не изменило скорости формирования и распада его комплексов с РНК. Таким образом, перевод свободно го белка TthL1 в открытую конформацию не влияет на кинетику формирования РНК-белковых комплексов.

Работа была поддержана Программой поддержки ведущих научных школ (НШ-4435.2010.4), Программой МКБ РАН, Федеральным агентством по науки и инновации (ГК № 02.740.11.0295), грантом РФФИ (10-04-00618-а).

МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОЙ ДЕТЕКЦИИ ДВУХ ФОРМ мРНК АЛЬФА-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИНТЕР ЛЕЙКИНА-2 В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ Новикова С.В.

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, г. Н.Новгород, mar_mot@list.ru Задачи исследования. Важную роль в механизмах активации и супрессии клеточного иммунного ответа играет альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2RA, CD25 антиген) – поверхностный белок клеток иммунной сис темы. Экспрессия CD25 антигена показана на злокачественно трансформированных клетках. Обнаружено, что IL-2RA участвует в механизмах пролиферации неопластических клеток, а высокий уровень экспрессии CD антигена на их поверхности коррелирует с плохим прогнозом для пациента. Показано, что в клетках наряду с мРНК, кодирующей полноразмерную форму CD25 антигена, может присутствовать альтернативная форма мРНК CD25 антигена с делецией 4-го экзона, ответственного за связывание IL-2 (CD25Exo4Del). Целью работы явилась разработка и апробация метода одновременной детекции полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD25 антигена в клетках опухолевых очагов.

Материалы и методы. Исследовали 51 образец клеток опухолевых очагов больных колоректальным раком. Вы деление мРНК из образцов проводили методом фенол-хлороформенной экстракции. Нуклеотидную последова тельность кДНК определяли дидезоксинуклеотидным методом с помощью автоматического генетического ана лизатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer.

Результаты и выводы. Для разработки метода детекции мРНК CD25 антигена в клетках опухолевых очагов с использованием гнездового варианта ОТ-ПЦР сконструировали две пары праймеров, специфичных к последо вательностям, соответствующим местам соединения экзонов мРНК. Для эффективной амплификации фраг ментов кДНК гена IL-2RA эмпирически подобрали оптимальные значения параметров реакции: температуру и время отжига праймеров, концентрацию ионов Mg2+ в буфере для полимеразы. При установленном сочетании условий проведения ОТ-ПЦР на матрице мРНК, выделенной из клеток опухолевых очагов, обнаруживаются два вида кДНК гена IL-2RA: кДНК, кодирующая полноразмерный CD25 антиген и кДНК, кодирующая его аль тернативную форму CD25Exo4Del. Тестирование образцов опухолевых очагов на присутствие мРНК CD25 ан МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА тигена с использованием разработанного метода показало, что совместное присутствие полноразмерной и аль тернативной форм мРНК СD25 антигена в клетках опухолевых очагов больных колоректальным раком регист рируется в 92% случаев (47 из 51). В двух исследованных образцах была выявлена только полноразмерная форма мРНК CD25 антигена. В двух образцах не обнаружена ни одна форма мРНК CD25 антигена.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА NICOTIANA ПО СПОСОБНОСТЯМ К РЕГЕНЕРА ЦИИ И ТРАНСФОРМАЦИИ.

Павлова О.А., Матвеева Т.В., Лутова Л.А.

Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, olgunja_@mail.ru;

Явление горизонтального переноса генов широко известно у прокариот, как способ передачи генетической ин формации. Долгое время подвергалось сомнению участие генетического материала эукариот в горизонтальной передаче. На сегодняшний день известно, что представители рода Agrobacterium способны переносить и встраивать фрагмент своей плазмиды в ядерный геном растения. Это свойство агробактерий активно использу ется в генной инженерии для получения трансгенных организмов. Однако, около 30 лет назад было обнаруже но, что некоторые нетрансформированные растения могут содержать в ядерном геноме последовательности, гомологичные участку агробактериальной плазмиды (Т-ДНК). Например, у ряда представителей рода Nicotiana были обнаружены последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes. Данные мотивы закре пились в растительном геноме в процессе эволюции, поскольку, вероятно, могли иметь некое важное значение для растения. В связи с этим представляется важной характеристика видов несущих вставку Т-ДНК, и видов, не имеющих подобных последовательностей по способности к регенерации и трансформации, поскольку, способ ность к трансформации и регенерационный потенциал растения, вероятно, могли повлиять на возможность за крепления последовательностей, гомологичных агробактериальной Т-ДНК, в геноме растения в процессе эво люции. Кроме того, вероятно, может существовать связь между присутствием Т-ДНК-подобных мотивов у растения и его способностью к трансформации и регенерации.

Нами была охарактеризованы Т-ДНК-содержащие виды: N.tabacum, N.gossei, N.suaveolens, и виды, не несущие Т-ДНК: N.rustica, N.langsdogffii. Способность растений к регенерации проверена на средах Мурасиге-Скуга с добавлением синтетических фитогормонов (нафтилуксусной кислоты и бензоаминопурина). Оценена способ ность к трансформации 6 штаммами агробактерий дикого типа Agrobacterium rhizogenes (15834, 8196, A4) и A.

tumefaciens (T37, C58, A6).

Для всех видов показана высокая регенерационная способность с преимущественным проявлением определен ных морфогенетических реакций. Необходимо отметить, что у ряда Т-ДНК содержащих видов проявление морфогенетических реакций было сходным.

Оценена способность к агротрансформации. Часть видов продемонстрировали высокую способность к транс формации, часть представителей – низкую. Как и в случае регенерационной способности, виды характеризова лись проявлением разных морфогенетических реакций.

На основе полученных данных, можно заключить, все изученные виды обладают высокой эффективностью ре генерации и разной способностью к трансформации.

Можно предположить, что высокая регенерационная способность на фоне способности к трансформации по зволила растению сформировать регенеранты из трансгенной ткани. Таким образом, Т-ДНК-подобные после довательности смогли закрепиться и сохраниться в геноме растений после акта трансформации в эволюции.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-01005-а.

ЭФФЕКТ -ОБЛУЧЕНИЯ КЛУБНЕЛУКОВИЦ И КЛУБНЕПОЧЕК ГЛАДИОЛУСА ГИБРИДНОГО Плюснина М.А.

Пермский государственный университет, Пермь, plyusnina-marina@yandex.ru Под чувствительностью, или резистентностью, понимают реакцию организма на воздействие мутагенами, вы ражающуюся в изменении обмена веществ, ферментативных процессов, митотической активности, клеточного деления. Небольшие дозы мутагенов как правило стимулируют перечисленные процессы, большие – угнетают и могут привести к летальному исходу. Существует четкая зависимость выхода мутаций и доз воздействия.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА Следовательно, от правильно подобранной дозы мутагенного воздействия во многом зависит успех мутагенной селекции.

Целью нашей работы было выявление эффективных доз -облучения клубнелуковиц и клубнепочек гладиолуса гибридного для использования в мутагенной селекции.

Для выявления критических доз ионизирующей радиации в лаборатории радиобиологии ЕНИ ПГУ на установке источника Cs137 интенсивностью 70 Р/мин проводилось -облучение клубнелуковиц 3-х разборов гладиолуса гибридного: размером более 4 см (240 шт., 1 разбор), 2-4 см (487 шт., 2 разбор), до 2 см (292 шт., разбор) и клубнепочек (760 шт.). Использованные дозы облучения: 8, 12, 16, 18 и 20 кР. После высадки в грунт учитывали всхожесть облученного материала, его выживаемость, аномалии развития и морфологии (морфозы) в течение 3 вегетативных поколений (Мв1, Мв2, Мв3).

Независимо от диаметра клубнелуковиц их всхожесть уменьшается (от 77,6% до 27,6%) по мере возрастания дозы -радиации (от 8 до 20 кР), т.е. всхожесть облученного материала и доза -радиации связаны обратно про порциональной зависимостью. Кроме того, влияние дозы -радиации на всхожесть клубнелуковиц уменьшается с увеличением размера последних. Наиболее устойчивыми к воздействию -радиацией являются клубнелукови цы диаметром более 4 см, а наименее устойчивыми клубнелуковицы диаметром до 2 см и клубнепочки.

Начиная с года облучения (Мв1) в течение 3 лет вегетации наблюдается тенденция снижения выживаемости растений. По литературным источникам гладиолусы являются устойчивой к -облучению культурой. На второй год вегетации после -облучения (Мв2) выживает от 100% (8 кР) до 21% (16-18 кР) клубнелуковиц 1 разбора, от 68 (8 кР) до 8% (18 кР) клубнелуковиц 2 разбора, от 60 (8 кР) до 13% (20 кР) клубнелуковиц 3 разбора. Некото рые клубнелуковицы (в основном 2 разбора, облученные 8-16 кР) доживают до третьего года и дают вегетатив ное потомство (Мв3). Клубнепочки менее устойчивы к действию -радиации, до второго года доживает от 9% (12 кР) до 0,9% (18 кР) от общего количества облученных клубнепочек. В третий год после облучения растения в этом случае не развиваются.

Первым свидетельством успешности мутагенного воздействия является проявление различных морфозов. Так, у одного из растений, выращенных из облученных клубнелуковиц (смесь1 разбора, 16 кР), в соцветии было об наружено развитие двух цветков разной окраски. У растений наблюдались фасциация стебля (смесь1 разбора, кР) и наличие в пределах соцветия различных по окраске пятен на долях околоцветника (смесь1 разбора, 8 кР;

смесь 2 разбора, 16 кР). Дальнейшие наблюдения позволят выяснить, являются ли данные морфологические аномалии наследственным изменением.

Таким образом, эффективными дозами облучения клубнелуковиц можно считать дозы от 8 до 16 кР, а клубне почек – дозы меньше 8 кР и от 8 до 12 кР.

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СЛАДКОГО БЕЛКА ТАУМАТИНА II ИЗ THAUMATOCOCCUS DANIELLII В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА Пушин А.С.,1,2 Долгов С.В.1, Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино, aspushin@rambler.ru;

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Москва Сверх сладкий белок тауматин II впервые выделен из плодов западноафриканского растения Thaumatococcus daniellii Benth. Сравнение аминокислотной последовательности тауматина, определенной по кДНК, с амино кислотной последовательностью, определенной секвенированием белка, показало, что тауматин синтезируется в виде предшественника (препротауматина), который содержит N-концевой гидрофобный сигнальный пептид, состоящий из 22 а.к. остатков и С-концевой пептид, состоящий из 6 а.к. остатков. Целью наших исследований было изучить влияние удаления N- и С-сигнальных последовательностей препротауматина на характер экс прессии тауматина в трансгенных растениях табака. Для этого были синтезированы несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующие разные формы тауматина: форму с удаленным С-концевым сигнальным пептидом;

форму с удаленными N- и С-сигнальными пептидами;

форму с удаленным N-концевым сигнальным пептидом. В качестве контроля использовали ген, кодирующий препротауматин - форму, содержащую оба сиг нальных пептида. Все нуклеотидные последовательности клонировали в бинарный вектор рВI121 вместо гена uidA, под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена нопалинсинтазы.

Полученные векторы переносили в супервирулентный обезоруженный агробактериальный штамм СВЕ21, ко торый использовали для трансформации растений табака сорта Petite Havana SR. Отобранные трансгенные ли нии табака использовали для анализа. Анализ экспрессии гена тауматина при помощи иммуноблотинга с при менением поликлональных антител, специфичных к тауматину, показал следующие результаты. При наличии N- и С-сигнальных последовательностей тауматин накапливался внутриклеточно (предположительно в вакуо МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА лях) и соответствовал по подвижности зрелому белку, что свидетельствует о прохождении процессинга. Удале ние С-концевого гексапептида, привело к секреции тауматина в межклеточное пространство, при этом процессинг проходил корректно. Иммуноферментный анализ показал, что удаление обоих сигнальных пептидов или только N-концевого снизило уровень накопления тауматина в трансгенных растениях табака.

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ФОРМ МРНК FAS АНТИГЕНА В ОПУХОЛЕ ВЫХ КЛЕТКАХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА Сахарнов Н.А.1, Новиков Д.В1, Алясова А.В. 2, Новикова С.В.1, Уткин О.В.1, Новиков В.В. Нижегородский государственный университет, Н. Новгород, colian-molian@mail.ru Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород Особенности злокачественного опухолевого роста зависят от способности клеток экранировать цитотоксиче ское действие иммунной системы организма. Важным индуктором активации клеточной гибели является Fas антиген. Система Fas/Fas-лиганд имеет множественные пути регуляции, в том числе с участием растворимых форм Fas-антигена. Растворимые формы образуются преимущественно в результате альтернативного сплай синга мРНК первичного транскрипта. В настоящее время обнаружено около 15 различных вариантов мРНК Fas антигена, встречающихся в клетках в разных сочетаниях. Целью настоящей работы явилась характеристика частоты встречаемости альтернативных форм мРНК Fas антигена в клетках опухолевого очага на разных стади ях рака толстого кишечника.

Материалом для исследования явились 49 образцов клеток опухолевых очагов, полученных из Нижегородского областного онкологического диспансера при резекции опухолей у больных раком толстого кишечника. Из них 35 образцов на 1-2 стадии заболевания и 14 образцов на 3-4 стадии заболевания. мРНК Fas-антигена детектиро вали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов пре-мРНК Fas.

В клетках опухолевых очагов больных раком толстого кишечника обнаружено 7 альтернативных форм мРНК Fas антигена. Матричная РНК мембранной формы Fas антигена детектировалась в 100% случаев. Матричная РНК доминирующей растворимой формы Fas антигена с делецией 6 экзона обнаруживалась во всех образцах на 1-2 стадии (35 образцов) и в 86% случаев (12 из 14) на 3-4 стадии заболевания, матричные РНК пяти минорных форм с делециями 3, 4, 5 и 6 экзонов в различных комбинациях встречались с частотой от 22,9% до 91,4% на 1- стадии и от 14,3% до 85,7% на 3-4 стадии.

В образцах на 1-2 стадии заболевания мРНК Fas с делецией 5 экзона выявлялась в 31,4% образцов (11 из 35), мРНК Fas с делецией 4 экзона выявлялась в 22,9% случаев (8 из 35) мРНК Fas с делециями 3 и 4 экзонов выяв лялись в 91,4% случаев (32 из 35), мРНК Fas с делециями 4 и 6 экзонов выявлялась в 48,6% случаев (17 из 35), а мРНК Fas с делециями 3,4 и 6 экзонов выявлялась в 85,7% случаев (30 из 35).

В образцах на 3-4 стадии заболевания мРНК Fas с делецией 5 экзона выявлялась в 14,3% случаев (2 из 14), мРНК Fas с делецией 4 экзона выявлялась в 35,7% случаев (5 из 14), мРНК Fas с делециями 3 и 4 экзонов вы являлась в 85,7% случаев (12 из 14), мРНК Fas с делециями 4 и 6 экзонов выявлялась в 57,1% случаев (8 из 14), а мРНК Fas с делециями 3,4 и 6 экзонов в 78,6% случаев (11 из 14).

Различия в частотах встречаемости альтернативных форм мРНК между группами не были статистически зна чимыми. Всего было выявлено 12 различных спектров мРНК на 1-2 стадии и 8 спектров на 3-4 стадии заболе вания, отличающихся как по числу, так и составу форм мРНК Fas антигена. Общей особенностью исследован ных образцов явилась высокая гетерогенность спектров форм мРНК Fas- антигена.

СОХРАНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ POPULUS TREMULA L. ПОСРЕДСТВОМ МО ЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Светлакова Т.Н.

Пермский государственный университет, Пермь, atea2@yandex.ru В основе сохранения биологического разнообразия лежит необходимость сохранения генетической компонен ты. Среди современных молекулярно-генетических методов широко распространены и перспективны ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)- и IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism)-методы. Основой ISSR МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА метода является ПЦР с одним или несколькими праймерами длиной в 15–24 нуклеотида. Такие праймеры ам плифицируют фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микроса теллитными повторами. IRAP – это анализ полиморфных участков ДНК, амплифицированных между рет ротранспозонами. Молекулярно-генетический анализ на основе маркирования этими двумя методами позволяет оценить уровень генетической изменчивости популяции, выявить идентификационные родовые, видовые и по пуляционные фрагменты, установить генетические расстояния между популяциями. Посредством такого анали за можно определить степень самобытности изучаемых популяций в плане генетического разнообразия, что позволяет судить о их ценности для сохранения биологического разнообразия. В этом направлении уже разра ботано несколько подходов, одним из которых является молекулярно-генетическая идентификация популяций растений. В рамках этого подхода разработаны и апробированы методики молекулярно-генетической иденти фикации редких и ресурсных видов растений. Среди древесных видов растений для нужд лесопромышленных комплекса наиболее перспективен Populus tremula L. - тополь дрожащий (осина). Данный вид является одним из самых быстрорастущих и скороспелых, ценных ресурсных видов. В Пермском крае лесами с преобладани ем P. tremula покрыты 583.1 тыс. га. На территории Пермского края имеются девять ценных генетических ре зерватов, содержащих осину. Нами к сегодняшнему дню собран и проанализирован материал особей несколь ких популяций, находящихся в городской черте. Для выделения ДНК использовали методику A.M Torres и др.

Для полимеразной цепной реакции использовалась реакционная смесь объемом 25 мкл следующего содержа ния: 2 единицы Taq-полимеразы («Силекс М»), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР (Силекс М), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл ДНК (концентрация 100 µg/ml). Амплификацию ДНК проводили по программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.;

первые пять циклов 94°С, 20 сек.;

t° отжига, 10 сек.;

72°С, 10 сек.;

в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.;

t° отжига, 5 сек.;

72°С, 5 сек. Продукты ам плификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder) (“ООО-СибЭнзим-М”), определе ние длин фрагментов проводилось с использованием программы «Quantity One» в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). При изученнии популяций выявлено 166 молекулярных маркеров, из которых выявлено ISSR- и 95 – IRAP методами. Общий уровень полиморфизма характеризуется как высокий. Изучен ный материал систематизирован, написаны протоколы молекулярно-генетического анализа, по которым далее будут проводиться исследования популяций на территории резерватов. В результате сравнительного анализа идентификационных фрагментов особей популяций, находящихся в разных физико-географических условиях и с разной антропогенной нагрузкой будет составлена наиболее полная картина, характеризующая генетическое разнообразие вида, его динамику и особенности, что позволит разработать мероприятия по его сохранению.

ГЕТЕРОТРИМЕРНЫЙ ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2: СУЩЕСТВОВАНИЕ ДОПОЛНИ ТЕЛЬНОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ ГТФ Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б.

Институт белка РАН, Пущино, esmail@rambler.ru Нами ведутся структурные исследования гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 (aIF2) и его функциональных комплексов из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2). aIF2 гомологичен эукариотическому фактору eIF2 и выполняет ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка: в ГТФ связанной форме он доставляет инициаторную тРНК (Met-тРНКi) в P-участок малой рибосомной субчастицы, где происходит образование кодон-антикодонового дуплекса, после чего связанный с фактором ГТФ расщепля ется до ГДФ и фактор покидает рибосому. Недавние исследования наших австрийских коллег показали, что субъединица архейного aIF2 имеет неканоническую функцию: защищает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, от 53 направленной деградации.

-Субъединица фактора e/aIF2 является рибосомозависимой ГТФазой и по своей структуре относится к семей ству белков eEF1А (EF-Tu). e/aIF2 состоит из трех доменов: в первом домене расположен нуклеотид связывающий сайт, с которым связываются как ГТФ, так и ГДФ. Проведенная нами экспериментальная работа по исследованию структуры изолированной -субъединицы SsoIF2 в нескольких состояниях (в свободной фор ме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ), привела нас к обнаружению дополнительного ранее неизвестного ГТФ-связывающего сайта на поверхности -субъединицы (между первым и вторым доме нами), с которым ГДФ не взаимодействует.

В свете имеющихся в литературе данных о том, что в археях -субъединица aIF2 связывает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, мы предположили, что обнаруженный нами дополнительный участок связыва ния ГТФ на SsoIF2 есть то самое место, с которым взаимодействует 5'-конец мРНК. Чтобы проверить это МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА предположение, была проведена серия экспериментов по взаимодействию aIF2 с мРНК в присутствии различ ных нуклеотидов. Было показано, что добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к -субъединице ин гибирует ее связывание с мРНК, тогда как ни ГДФ, ни другие нуклеозид-трифосфаты подобного действия не оказывают. Это значит, что ГТФ и мРНК реагируют с идентичным местом на -субъединице, с которым ГДФ не взаимодействует.

В настоящее время наши исследования направлены на выявление причин конкуренции между ГТФ и мРНК за связывание с -субъединицей aIF2 и локализацию участка связывания мРНК на белке. Для этого мы проводим направленный мутагенез предполагаемого участка связывания мРНК, и пытаемся получить пригодные к струк турным исследованиям кристаллы комплекса aIF2 с мРНК.

Работа поддержана Российской Академией Наук, РФФИ и Программой МКБ РАН.

ВЫЯВЛЕНИЕ ВИДОВ - ИНДИКАТОРОВ САПРОБНОСТИ ПРЕСНОВОДНЫХ ОЗЁР КАЗАНСКОГО РЕГИОНА НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Тазетдинов А.Р. Фролова Л.Л., Казанский государственный университет, Казань, nice1992@mail.ru В настоящее время существуют разные системы оценки экологического состояния водоемов с биологической точки зрения, среди которых наиболее часто используется система, предложенная Сладечеком (1973). Она соз дана для планктонных организмов, обитающих в водоемах Западной Европы, и включает в себя классификацию по индикаторным видам планктонных организмов. И хотя набор видов - индикаторов с индивидуальными ин дексами сапробности зависит от географического расположения водного объекта, тем не менее, исследователи других регионов также используют эту классификацию, так как определение вида в качестве индикаторного весьма трудоемкий процесс. Таким образом, определение видов- индикаторов фитопланктонных организмов для конкретного региона является актуальной задачей в настоящее время.

Целью нашей работы является выявление видов - индикаторов сапробности пресноводных озёр Казанского ре гиона на основе консервативного гена 18S рРНК.

В работе использованы фрагменты нуклеотидных последовательностей 18S рРНК 92-х индикаторных видов фитопланктона из классификации Сладечека и 53-х фитопланктонных организмов из озер Казанского региона.

Последовательности получены из международной базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей про ведено программой CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Построение филогенетиче ского дерева по гену 18S рРНК фитопланктонных организмов выполнено с помощью программы Phylip (http://evolution.gs.washington.edu/phylip).

Анализ филогенетического дерева по гену 18S рРНК для 145-и видов фитопланктонных организмов показал наличие 27 кластеров с высоким уровнем достоверности. Из них, 9 кластеров содержат только индикаторные виды фитопланктона из классификации Сладечека, 3 кластера – только виды фитопланктона из Казанских озер и 15 кластеров содержат и виды фитопланктона из классификации Сладечека и виды фитопланктона из Казан ских озер.

По результатам анализа 15 кластеров филогенетического дерева по гену 18S рРНК для всех видов фитопланк тона, можно предположить, что виды планктонных организмов из Казанских озер, сгруппированных с индика торными видами из классификации Сладечека, могут быть использованы в качестве индикаторных видов для нашего региона на основе молекулярно-генетического анализа. Например, виды Closterium gracile Breb. и Clos terium acerosum из Казанских озер сгруппировались с индикаторными видами Closterium venus и Closterium ehrenbergii из одного семейства Siphonocladiales (b-сапробность) и могут быть использованы как индикаторы той же сапробности водоема. По результатам предварительного анализа из 53-х видов фитопланктонных орга низмов Казанских озер 18 могут использоваться в качестве индикаторов сапробности водоемов в Казанском регионе.

Полученные результаты носят предварительный характер и требуют дальнейшей проверки на Казанских водо емах.

Авторы выражают благодарность с.н.с., к.б.н. Палагушкиной О.В. за информацию по видовому составу фито планктонных организмов Казанских озер.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОХРОМОКСИДАЗНОГО КОМПЛЕКСА В ИЗУЧЕНИИ ФИЛОГЕНИИ И «БАРКОДИНГА» РЫБ СЕМЕЙСТВА КАРПОВЫХ (CYPRINIDAE).

Торгунакова О.А.,2, Луданный Р.И., Егорова Т.А.2, Семенова С.К.

Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, solnce_04.87@mail.ru;

Московский Педагогический Государственный Университет, Москва Молекулярные маркеры могут служить эффективным инструментом при решении фундаментальных проблем, связанных с выяснением эволюционных механизмов возникновения геномной вариабельности. В этом отноше нии геном карповых рыб, как одной из наиболее молодых, относительно недавно возникших групп костистых рыб, представляет несомненный интерес. Однако до настоящего времени ведутся дискуссии относительно цен тров происхождения, путей расселения и доместикации дикого предка современного карпа, а также относи тельно микро- и макроэволюционных процессов, приводящих к возникновению геномного и таксономического разнообразия у представителей всего семейства. В связи с этим, основная цель данного исследования состоит в изучении молекулярной филогении представителей двух подсемейств карповых рыб Cyprininae и Leuciscinae.

Мы впервые реконструировали молекулярно-филогенетические связи между представителями 14 видов из под семейств Cyprininae и Leuciscinae, обитающих в реках Волжского бассейна. С помощью дендрограмм, постро енных на основании полиморфизма каждого из трех генов цитохромоксидазного комплекса - cox1, cox2, cox3, а так же их суммарной последовательности, обнаружено, что выделение изученных видов в отдельные кластеры соответствует принятому в настоящее время разделению на два подсемейства. Для всей изученной группы карповых рыб показано, что уровень изменчивости, по всем трем локусам у представителей подсемейства Ель цовых (Leuciscinae) значительно выше (10.7%), по сравнению с Сазанообразными (Cyprininae) (7.5%), что ско рее всего, связано с межвидовой гибридизацией ельцовых.

На основании полиморфизма трех генов показано, что наибольшим полиморфизмом, то есть долей вариабель ных сайтов и нуклеотидным разнообразием характеризуется ген сох1 (P=12.26, = 0.123) в отличие от гена сох2 (Р=11.45, =0.115) и гена сох3 (P=11.85, =0.119). Поэтому именно последовательность гена сох1 может оказаться весьма эффективной для идентификации и дифференциации видов карповых рыб. Эти результаты могут использоваться в международной программе «Barcoding of life», основная цель которой состоит в широ комасштабном секвенировании последовательности гена cox1 у организмов различного таксономического ранга.

СТРУКТУРА ГЕНОВ НОВЫХ АНИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ПШЕНИЦЫ TRITICUM KIHARAE Уткина Л.Л.1, Андреев Я.А.2, Егоров Ц.А.2, Одинцова Т.И.,1, Пухальский В.А. Институт общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН, Москва, lyuba_utk@mail.ru;

Институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва В ходе эволюции у растений выработалась сложная защитная система, которая позволяет им узнавать патогены и активировать защитные реакции, направленные на предотвращение распространения инфекции. Важную роль в этой системе играют антимикробные пептиды (АМП). В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении ряда АМП, но структура генов, кодирующих эти соединения, в большинстве случаев остается неиз вестной.

Ранее из семян пшеницы T. kiharae были выделены и охарактеризованы два новых пептида Tk-AMP-X1 и Tk AMP-X2, которые обладают не описанным ранее цистеиновым мотивом и проявляют высокую ингибирующую активность в отношении ряда фитопатогенных грибов.


Цель работы заключалась в исследовании структуры генов, кодирующих антимикробные пептиды пшеницы Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-X2. Для этого из зерен T. kiharae на стадии молочной спелости была выделена тотальная РНК, после чего на матрице мРНК была синтезирована первая цепь кДНК. Затем сочетанием методов 3’- и 5’ RACE была получена полноразмерная кДНК целевых генов.

Было показано, что существуют два класса генов, кодирующих цистеин-содержащие пептиды пшеницы, при этом в каждом классе выявлен полиморфизм, обусловленный делециями/вставками и нуклеотидными замена ми. Все гены гомологичны между собой и имеют общую схему структурной организации: 5'-нетранслируемую область;

область, кодирующую сигнальный пептид;

область, кодирующую цистеин-содержащие пептиды ( пептидов в случае первого класса генов, и 7 – в случае второго), и 3'-нетранслируемую область. При амплифи кации на матрице ДНК полученные фрагменты не отличались по длине от фрагментов, полученных с кДНК, что свидетельствует об отсутствии интронов в этой части генов.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА На основе последовательностей кДНК были выведены последовательности предшественников обоих пептидов.

Всего было обнаружено 6 последовательностей предшественников, состоящих из сигнального пептида, облас ти, кодирующей 5 или 7 цистеин-содержащих пептидов, разделенных сайтами специфического протеолиза, и С концевого домена. В последовательностях предшественников были обнаружены пептиды Tk-AMP-X1 и Tk AMP-X2, несколько пептидов, выделенных ранее из экстракта семян T. kiharae, а также ряд ранее неизвестных пептидов.

Таким образом, гены новых АМП пшеницы имеют сложную модульную структуру, обеспечивающую образо вание сразу нескольких пептидов. Биологический смысл этого явления заключается в том, что активация экс прессии генов сопровождается образованием целого набора АМП, которые, по всей видимости, различаются по спектру антимикробного действия.

СУБЪЕДИНИЦА АЛЬФА7 ПРОТЕАСОМЫ ЧЕЛОВЕКА КАК ВОЗМОЖНЫЙ УЧАСТНИК РЕГУЛЯ ЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Федорова О.А., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, fedorovaolgand@mail.ru Основной функцией протеасом является деградация белков по убиквитин-зависимому механизму. 26S протеасома состоит из 20S корового комплекса и двух ассоциированных с ним регуляторных 19S-комплексов.

20S-коровый комплекс образован четырьмя кольцами, каждое из включает в себя семь субъединиц: внешние кольца образованы субъединицами -типа, а внутренние – субъединицами -типа. Три субъединицы -типа об ладают каспазо-, трипсино- и химотрипсиноподобной активностью. Субъединицы -типа обеспечивают регу ляцию доступа субстрата и присоединение регуляторных комплексов.

Протеасомы составляют около 1% всего клеточного белка и определяют время жизни множества ферментов в клетке, поэтому протеасомы играют ключевую роль в основных клеточных процессах. В 1990x годах было по казано наличие у 20S корового комплекса эндорибонуклеазной активности. В дальнейшем было обнаружено, что субъединицы 5 и 1 обладают РНКазной активностью. В исследованиях последних лет продемонстриро вано участие некоторых субъединиц 19S комплекса в регуляции транскрипции.

Целью данной работы является определение наличия РНКазной активности у субъединицы 7, экспрессиро ванной в E.coli, и определение спектра белков, способных связываться с этой субъединицей.

Последовательность кДНК субъединицы 7 человека была клонирована в экспрессионный вектор для E.сoli pGEX, и на его основе был получен химерный белок 7, слитый с GST. Были подобраны оптимальные условия синтеза белка 7-GST. В качестве субстрата эндонуклеазной активности была использована меченная [32P] мРНК гена человека p53. Продукты нуклеолиза анализировали с помощью денатурирующего электрофореза высокого разрешения.

Эксперименты показали, что химерный белок 7-GST обладает способностью к эндорибонуклеолизу. Выясне но, что активность зависит от наличия в реакционной среде ионов Ca2+ и Mg2+. Важно отметить, что белок был экспрессирован в E.coli, т.е. не нес посттрансляционных модификаций, и при этом проявил РНКазную актив ность.

Для определения спектра белков, способных связываться с субъединицей 7 из культуры К562 был получен клеточный экстракт, который разделяли на ядерные и цитоплазматические фракции, а затем инкубировали с белком 7. Связавшиеся с 7 белки разделяли с помощью двумерного электрофореза. Для идентификации бел ков использовался метод масс-спектрометрии.

В результате проведенной работы был получен спектр белков, способных связываться с субъединицей альфа 7.

Все белки можно разделить на несколько групп, отвечающих за такие важные процессы в жизнедеятельности клетки как транскрипция (фактор ассоциированный с РНК полимеразой II, фактор инициации транскрипции II и др.), трансляция (фактор элонгации 1, лизил-тРНК-синтетаза и др.), сплайсинг (фактор сплайсинга 3A, гетеро генный ядерный рибонуклеопротеин и др.) и репарация (АТФ-зависимая РНК-геликаза и др.). На основе полу ченных результатов и учитывая РНКазную активность 20S корового комплекса, можно рассматривать протеа сому как важный элемент системы регуляции экспрессии генов на различных этапах.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (проект №08-04-00834 и 10-04-01234 ) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА ДНК-ШТРИХКОДИРОВАНИЕ ЗООПЛАНКТОННЫХ ОРГАНИЗМОВ ПРЕСНОВОДНЫХ ОЗЕР г.КАЗАНИ Хусаинов А.М., Фролова Л.Л.

Казанский государственный университет, Казань, shade0602@yandex.ru ДНК штрих-кодирование – современный таксономический метод, в котором используются короткие генетиче ские маркеры в ДНК организмов, чтобы определить их принадлежность к конкретному виду. У эукариот за штрих код принимают короткий митохондриальный ген mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene.

В настоящее время в базе данных GenBank на сайте NCBI представлено всего лишь 12 тыс. фрагментов mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes по сравнению с общим количеством представленных нуклеотидных последовательностей. В то же время в базе данных по СО1 отсутствует информация по зоо планктонным организмам Казанского региона.

Целью нашей работы является идентификация зоопланктонных организмов пресноводных водоемов г.Казани (Россия) по гену mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes В работе использованы зоопланктонные организмы из пресноводных озер Кабан, которые выловлены и опреде лены в соответствии с существующими методиками. Для выделения гена mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) genes использованы универсальные праймеры для эукариот: LCO1490: 5' ggtcaacaaatcataaagatattgg-3', HC02198: 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'. Условия проведения эксперимента описа ны в статье Folmer et al.

Была поставлена серия экспериментов, в результате которой получены 5 последовательностей: для организма Brachionus calyciflorus получена последовательность длиной 661 bp, Keratella cochlearis - 705 bp, Scapholebecis mucronata - 658 bp, Chydorus sphaeriaus - 658 bp, Mesocyclops leacrarta - 658 bp. Эти последовательности про анализированы методами биоинформатики и подготовлены к вводу в базу данных на сайте NCBI с использова нием программы Barcode Submission Tool.

Полученные положительные результаты позволяют нам продолжить работы по секвенированию гена CO1 зоо планктонных организмов в масштабах Казанских озер и стать активными участниками международного проек та Barcode of Life projects.

РАЗРАБОТКА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ Чеботарева Е.Н., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И.

Филиал Учреждения РАН Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино, elena-cheb@yandex.ru Во многих лабораториях мира созданы и исследуются трансгенные растения - продуценты вакцин против раз личных возбудителей болезней человека, в том числе и против гепатита В, однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы. Нами получены трансгенные растения кар тофеля содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS. Начато проведение доклинических испытаний иммуногенности клубней картофеля на лабораторных мышах. В экспериментах использовали три группы по 10 аутбредных мы шей NMRI весом 23-25 г. Животные первой и второй групп питались трансгенными клубнями картофеля (по г, что составило 20 мкг HBsAg) на 1, 7 и 14-е сутки эксперимента, причем мышам первой группы давали в каче стве адъюванта по 20 мкг гликопина (ГМДП). Перед экспериментом мышей выдерживали 12 ч без кормления.

Контрольная группа получала только стандартный корм без картофеля. Для оценки иммунитета против гепати та В у мышей каждой группы собирали препараты крови из хвостовой вены на 6, 12, 22, 36, 50, 78, 86, 100, 114, 120-е сутки эксперимента. Показано, что уровень антител к HBsAg в сыворотке крови мышей первой и второй групп начинал увеличиваться на 36-50-е сутки после первого кормления. У семи мышей группы, получавшей трансгенный картофель вместе с адъювантом ГМДП, содержание антител к HBsAg составило 4-84 мМе/мл. У четырех мышей, получавших картофель без адъюванта, уровень антител на 50-е сутки с начала эксперимента был выше – до 9-169 мМе/мл. В крови мышей третьей, контрольной группы антител к HBsAg не обнаружено. С целью исследования усиления иммунного ответа против HBsAg, синтезируемого трансгенными растениями, на 71-е сутки эксперимента животным первой и второй групп внутрибрюшинно вводили коммерческую рекомби нантную дрожжевую вакцину против гепатита В (0.5 мкг/мышь). Содержание антител стало повышаться у мы шей обеих групп уже через неделю и достигло максимума у разных мышей через 15-43 суток после инъекции.


МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА В сыворотке крови мышей обеих групп количество антител к HBsAg повысилось до 112-350 мМе/мл. Досто верных различий в уровне антител между группами мышей, получавших трансгенный картофель с адъювантом (ГМДП) и без адъюванта, не обнаружено. Однако в первой группе большее количество мышей дало иммунный ответ (7 из 10) по сравнению со второй группой (4 из 10). На 120-е сутки после начала эксперимента уровень антител к HBsAg в обеих группах мышей оставался протективным (более 10 мМе/мл). Подбор оптимальной концентрации ГМДП для усиления иммунного ответа может явиться целью дальнейших исследований. Для повышения биологической безопасности вакцины получены безмаркерные растения табака и томата, содержа щие ген поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg под контролем промотора CaMV 35SS. Эти расте ния не содержат маркерных и селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Трансгенные растения синтезировали HBs-антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка, что достаточно для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Работа выполнена при финансовой под держке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 08-08-00328 и является победителем Программы Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере "Участник мо лодежного научно-инновационного конкурса (У.М.Н.И.К)"-2009.

РОЛЬ ГЕНА HSM3 ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В МУТАГЕНЕЗЕ, И УЧАСТИЕ ЕГО ПРОДУКТА В ПРОЦЕССАХ МОДИФИКАЦИИ И РЕМОДУЛЯЦИИ ХРОМАТИНА Черненков А.Ю.

Петербургский Институт Ядерной Физики им.Б.П.Константинова РАН Санкт-Петербург, Гатчина, an-cher@mail.ru Нами выделена линия мутантов по гену HSM3, несущих точечную мутацию и полную делецию. Ген HSM3 кар тирован нами на правом плече II хромосомы на расстоянии 25сМ от гена HIS7, и контролирует минорный путь системы коррекции ошибочно спаренных оснований (КОСО), имеет 80% гомологию с геном MSH2 основной системы КОСО. Все мутанты по гену HSM3 дефектны по коррекции искусственных гетеродуплексов ДНК. Му тации также приводят к увеличению частот спонтанного мутагенеза канаванин-устойчивости, а также повы шают чувствительность к широкому спектру мутагенов (УФ, -лучи, цисплатина и др.). Нами выявлено, что мутантные штаммы могут быть использованы как тестеры: при обработке мутагенами замечено, что изменяют ся частоты митотического кроссинговера и сегрегации. Дополнительно, нами впервые на клетках дрожжей по казан мутагенный и рекомбиногенный эффект цисплатины.

Проведено исследование более 80 взаимодействий гена HSM3 с генами различных репарационных групп. Ус тановлено, что ген HSM3 также принимает участие в рекомбинационной репарации: работает на RAD59 независимом пути, взаимодействуя с генами XRS2, RAD52, RAD51 и RAD54. Анализ двойных мутантов hsm3rad54 показал их сверхвысокую чувствительность к летальному действию мутагенов, а анализ двойных мутантов hsm3rad52 выявил их склонность к накоплению летальных повреждений и падение частот спонтанно го репаративного мутагенеза при неизменных во времени частотах спонтанного репликативного мутагенеза.

Также было установлено, что основным геном в группе рекомбинационной репарации является ген XRS2, а не RAD52, как считалось ранее.

Опыты по сверхэкспрессии белка Hsm3 на среде с раффинозой и галактозой и обработка мутантов hsm3 цис платиной на фоне мутации rad2 позволили предположить мультидоменную структуру продукта гена HSM3. Это нашло подтверждение в последних полученных данных, связанных с процессами модификации и ремодуляции хроматина. Исследование взаимодействия белков Hsm3 и Hat1 (ген HAT1 кодирует гистон-ацетилтрансферазу 1) показало, что продукт гена HSM3 принимает участие в процессах модификайии и ремодуляции хроматина в качестве вспомогательного опознающего белка, что имеет отражение, как в процессах транскрипции, так и в процессах репарации ДНК: привнесение отрицательных зарядов с помощью Hat1 приводит к «расталкиванию»

гистонов и ДНК становится открытой. Белок Hsm3 в данном случае обеспечивает дополнительное связывание (аналогично белкам SSB или PCNA) и привлечение других участников репарационного или транскрипционного процесса. Нами установлено что С-конец гена HSM3 отвечает за спонтанный мутагенез, N-конец отвечает, предположительно, за связь с ДНК и процесс поиска и опознавания повреждения, а центральная область коди рует домены, отвечающие за взаимодействие с различными белками как в репарационных и репликативных комплексах, так и на уровне хроматиновых (нуклеосомных) структур.

Для гена HSM6 (и, соответственно, белка Hsm6) были проведены сходные эксперименты. Нами показано, что он работает в комплексе с Hsm3, как каталитическая субъединица, при этом является аллелем гена PSY4, коди рующем субъединицу ядерной фосфатазы 4, и участвует в процессах модификации и ремодуляции хроматина, но в отличие от Hsm3 не в системе КОСО, а в системы нуклеотид-эксцизионной репарации у дрожжей.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВАКУОЛЯРНЫХ АНТИПОРТЕРОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ Черных Ю.С., Мирошниченко Д.Н., Тимербаев В.Р., Долгов С.В.

Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН;

Пущино, juliachernykh@mail.ru Засоление является одним из основных абиотических стрессов при возделывании культурных растений. Более 800 млн. гектар в мире подвержены засолению, что составляет примерно 6% от площади всех земель. Высокий уровень ионов натрия (Na+) пагубно действует на функции растительных клеток (на калиевое питание, актив ность клеточных ферментов, фотосинтез и другие аспекты метаболизма). Сейчас большое внимание уделяется выявлению генов, отвечающих за устойчивость растительных клеток к солевому стрессу. В качестве примера можно указать гены SOS систем, наиболее важными из которых считаются гены Na+/H+ вакуолярных антипор теров. Впервые вакуолярный Na+/H+ антипортер был выделен из Saccharomyces cerevisiae. Позднее ген Na+/H+ вакуолярного антипортера AtNHX1 обнаружен у растений Arabidopsis. Сверхэкспрессия AtNHX1 в трансгенных растениях Arabidopsis привела к повышению устойчивости к высоким концентрациям соли. Ва куолярные Na+/H+ антипортеры выводят избытки ионов Na+ из цитоплазмы клеток в вакуоли, таким образом, поддерживая постоянный ионный состав в цитоплазме и гомеостаз растительной клетки.

Пшеница (Triticum aestium L.) – основная и самая важная продовольственная культура в большинстве стран мира. Для увеличения устойчивости растений к высоким концентрациям Na+ в почве, нами изучена экспрессия генов вакуолярных антипортеров в трансгенных растениях пшеницы. Трансгенные растения получали путем баллистической трансформации пшеницы сорта «Андрос» несколькими векторными конструкциями. В первом случае проводилась ко-трансформация двумя векторами: вектор psGFPBAR содержал репортерный ген gfp и ген ацетилфосфотрансферазы bar, придающий устойчивость клеткам растений к гербицидам на основе фосфи нотрицина;

вектор pUCAgNHX#4 содержал ген вакуолярного антипортера agnhx галофита Atriplex gmelini, под контролем конститутивного промотера Ubi кукурузы. Во втором случае, проводилась трансформация вектор ной конструкцией psUHV, содержащей ген вакуолярного антипортера ячменя hvnhx, находящийся под действи ем промотера Ubi кукурузы, а так же репортерный ген gfp и ген ацетилфосфотрансферазы bar.

В результате генетической трансформации векторами pUCAgNHX#4 и psGFPBAR нами было получено 66 пер вичных линий. В результате трансформации вектором psUHV было получено 13 первичных линий. Вставку гена антипортера проверяли методом ПЦР-анализа, который показал наличие фрагмента гена agnhx в 46-ти ли ниях и фрагмента гена hvnhx во всех изначально полученных 13-ти линиях.

Далее проводили отбор гомозиготных потомков первичных трансгенных растений пшеницы со вставкой генов антипортеров, с целью дальнейшего исследования экспрессии этих генов и осуществления тепличных испыта ний на солеустойчивость. Анализ экспрессии генов проводили методом ОТ-ПЦР, который подтвердил наличие фрагментов мРНК гена антипортера agnhx в 26 линиях, и фрагментов мРНК гена антипортера hvnhx в 8 линиях, в то время как в отрицательном контроле экспрессия обнаружена не была.

Дальнейшие исследования направлены на анализ устойчивости гомозиготных трансгенных семей пшеницы в условиях зимних теплиц для выявления перспективных форм устойчивых к солевому стрессу.

ОСОБЕННОСТИ ЗАВЯЗЫВАНИЯ СЕМЯН САДОВЫХ ЛИЛИЙ ПРИ РАЗНЫХ ВАРИАНТАХ ОПЫЛЕНИЯ Чертков Н.О.

Пермский государственный университет, Пермь, chert-nikita@yandex.ru Гибридизация – наиболее эффективный и широко применяемый способ создания популяций исходного селек ционного материала. Начальным этапом селекции лилий является изучение биологии цветения, особенностей семенного размножения и экологии опыления.

Целью работы являлось изучение особенностей семенного размножения при различных вариантах опыления садовых лилий в условиях Предуралья для оптимизации селекционного процесса.

Для определения типа опыления лилий из разных сортовых групп было поставлено 6 вариантов опыта:

1) изоляция соцветий без дальнейшего вмешательства в процесс опыления;

2) изоляция соцветий с последую щим искусственным самоопылением;

3) изоляция соцветий с кастрированными цветками с последующим ис кусственным перекрестным опылением;

4) изоляция соцветий с кастрированными цветками без дальнейшего МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА вмешательства;

5) кастрация без изоляции и вмешательства, для установления необходимости изоляции при перекрестном опылении;

6) свободное опыление.

В опытах было привлечено 32 сорта лилий (956 цветков), относящихся к трем сортогруппам: Азиатские гибри ды (АГ), LA-гибриды (LA) и Мартагон гибриды (МГ). Отбор родительских пар проводили визуально по ком плексу декоративных и хозяйственно важных признаков.

При изоляции цветков с дальнейшим искусственным самоопылением семена завязались только у АГ (11,3%), что свидетельствует о возможности у них самоопыления, а также о присутствии системы самонесовместимости у остальных сортогрупп. Отсутствие положительных результатов при изоляции соцветий без дальнейшего вмешательства в процесс опыления свидетельствует об отсутствии особого механизма реализации автогамии.

При скрещивании лилий в пределах одной садовой группы и имеющих сходное происхождение, способны завя зывать семена только АГ (2,4% случаев, доля выполненных семян 2,0%). Также семена завязывались, если в качестве материнских использовали АГ (13,8% случаев, доля выполненных семян 11,3%). Также результатив ным оказалось скрещивание АГ ‘Латгалия’ х L. henryi Baker (в 84,6% случаев, доля выполненных семян 3,4%).

Сорт ‘Латгалия’ является гибридом, для получения которого в качестве одной из родительских форм использо валась L. henryi. При скрещивании МГ ‘Лилит’ и L. tsingtauense Gilg. семена завязались в 35,3% случаев (доля выполненных семян 0,3%). L. tsingtauense относится к секции Martagon. Виды из этой же секции использова лись для выведения сорта ‘Лилит’. Таким образом, завязываемость семян зависит от степени родства скрещи ваемых лилий. При использовании LA в качестве материнских и отцовских форм семена не завязываются, что вероятно, связано со сложным гибридным происхождением данной сортогруппы и высокой степенью стериль ности пыльцы (70,4%).

При свободном опылении семена завязались только у АГ (7,8% цветков) и у LA (4,2% цветков). Самая высокая семенная продуктивность при свободном цветении и при скрещиваниях в сравнении с другими сортогруппами наблюдается у АГ, что свидетельствует о высокой репродуктивной способности и перспективности их исполь зования в селекционных целях при гибридизации.

В опытах с изоляцией соцветий с кастрированными цветками без дальнейшего вмешательства семена не завя зываются. Апомиктичное завязывание семян у изученных лилий, скорее всего не возможно. Кроме того, выяс нено, что изоляция кастрированных цветков при постановке скрещиваний не обязательна.

ДИМЕБОН НЕ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ Шелковникова Т.А.,1 Устюгов А.А.,1 Миллершип С.,2 Бухман В.Л.,2 Нинкина Н.Н.,1 Бачурин С.О. Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка, sta.ipac@gmail.com;

Кардиффский университет, Кардифф Неселективный антигистаминный препарат димебон применялся в России в течение длительного времени, пока не были предложены более эффективные антигистаминные средства. Позже на основании известных свойств препарата было сделано предположение, что димебон может останавливать или замедлять прогрессию нейро логических заболеваний, характеризующихся постепенным снижением когнитивной функции. Эта гипотеза была подтверждена в ряде исследований на клеточных культурах и на животных – моделях нейродегенератив ных заболеваний, а также в некоторых клинических испытаниях (пациенты с болезнью Альцгеймера, хореей Гентингтона). Был сделан вывод, что димебон может рассматриваться в качестве кандидата на роль болезнь модифицирующего препарата для лечения протеинопатий (заболеваний, в патогенезе которых принимает уча стие агрегация и отложение определенных белков), сопровождаемых нейродегенерацией. Одна из наиболее распространенных протеинопатий, характеризуемых агрегацией белка альфа-синуклеина, – болезнь Паркинсо на (БП). Однако на настоящий момент данных по эффектам димебона при этом заболевании нет.

В задачи исследования входило изучение способности димебона ослаблять вызванные агрегацией альфа синуклеина патологические процессы, имеющие место на ранних стадиях БП. Была использована модель ран ней стадии БП – трансгенные мыши со сверхэкспрессией укороченной (содержащей аминокислотные остатки 1-120) формы человеческого альфа-синуклеина под контролем промотора гена тирозингидроксилазы крысы.

Ранее в экспериментах in vitro было показано, что укороченная форма альфа-синуклеина по сравнению с бел ком нормальной длины характеризуется способностью к более быстрой агрегации. Кроме того, известно, что развитию двигательной патологии и значительным изменениям в нейронах области черной субстанции у паци ентов с БП предшествует развитие патологических изменений в обонятельной луковице (ранняя стадия заболе вания).

Было сформировано две группы животных – контрольная (n=9) и экспериментальная (n=10), последняя получа ла димебон с питьевой водой (10 мг/мл) с возраста 3 мес до 14 мес.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА В ряде поведенческих тестов, позволяющих оценить двигательную активность, баланс и координацию живот ных (домашняя клетка, камера активности, ротарод, горизонтальная перекладина, перевернутая сетка), стати стически значимых различий между контрольной и экспериментальной группами обнаружено не было. Гисто логические (определение числа дофаминергических нейронов в черной субстанции и вентральной области покрышки), молекулярно-биологические (определение уровня экспрессии альфа-синуклеина в обонятельной луковице при помощи RT-ПЦР и вестерн-блоттинга) и биохимические (определение уровня дофамина и его метаболитов в полосатом теле при помощи ВЭЖХ) исследования головного мозга животных обеих групп также не выявили статистически значимых различий.

Нами был сделан вывод, что димебон не оказывает влияния на фенотип животных, у которых была смоделиро вана ранняя стадия БП.

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНГАЛЯЦИОННОГО КОМПЛЕКСА «ПРОПОЛИС – МАТОЧНОЕ МОЛОЧКО» НА КРИСТАЛЛОГЕНЕЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС ПРИ ОТЕКЕ ЛЕГКИХ Анашкина А.А., Копылова С.В., Мартусевич А.К.

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, Н.Новгород, aaanashkina@yandex.ru Известно, происходит частичное разрушение альвеол и прилегающих капилляров, в результате чего образуется множество эндогенных токсинов, попадающих в кровь и создающих интоксикацию, что является важным ком понентов патогенеза ОЛ. В связи с этим, актуальным является поиск адекватных средств и методов детоксика ции. Естественной технологией детоксикации является применение продуктов пчеловодства, в том числе пропо лиса и маточного молочка, однако особенности этого эффекта при изучаемом патологическом состоянии изучены недостаточно. Любое изменение физико-химического состояния внутренней среды организма, в том числе плазмы и сыворотки крови, находит свое отражение в особенностях структуризации биосреды при дегид ратации. Это обусловливает выбор в качестве метода исследования биокристаллоскопии. Поэтому целью работы служило исследование влияния ингаляционного комплекса «прополис – маточное молочко» (патент РФ №21740002 от 15.09.2000) на собственный и инициированный кристаллогенез сыворотки крови крыс при моде лировании ОЛ.

Для оценки физико-химических свойств сыворотки крови мы использовали методы оценки кристаллогенных (классическая кристаллоскопия) и инициирующих (сравнительная тезиграфия) свойств сыворотки крови крыс, не подвергавшихся воздействиям (интактных), с модельным ОЛ без лечения (контрольных), а также полу чавших лечение ОЛ ингаляционным комплексом «прополис – маточное молочко» (опытных). ОЛ воспроизводи ли путем внутрибрюшинного введения адреналина в дозе 0,5 мг/к Описание результатов выполняли с использо ванием специальной системы критериев. В качестве базисного вещества при выполнении тезиграфического исследования применяли 0,9% раствор хлорида натрия. Фиксацию изображений фаций производили с помощью морфометрического комплекса Leica.

На основании анализа кристаллограмм сыворотки крови крыс контрольной группы установлено, что при моде лировании ОЛ наблюдается умеренное усиление структуризации образцов, отмечаемое вследствие незначитель ного нарастания их индекса структурности и кристаллизуемости. Наличие у животных контрольной группы вы сокого уровня степени деструкции фации связано с моделированием у них ОЛ. Выраженное снижение четкости краевой зоны образцов указывает на уменьшение уровня протеинемии, связанное с деградацией белковых моле кул эндогенными токсинами. В опытной группе наблюдается значимое нарастаниие структуризации образцов, что проявляется в увеличении их индекса структурности и кристаллизуемости, а так же снижение степени дест рукции, по сравнению с контролем. Тезиграфический индекс у животных контрольной группы существенно ни же, чем в интактной. Аналогичная, но менее значимая тенденция была зарегистрирована в отношении кристал личности. Это свидетельствует об изменении химического состояния исследуемого биоматериала из-за гипоксии и появления эндогенных токсинов. У опытной группы уровень тезиграфического индекса и степени деструкции приближаются к уровню фаций крыс интактной группы.

В целом, моделирование ОЛ у крыс приводит к существенным преобразованиям физико-химических свойств сыворотки крови, частично купируемым путем применения ингаляционного комплекса «прополис – маточное молочко», что при отеке легких (ОЛ) возникает гипоксия.



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.