авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Слободчикова Светлана Вадимовна

ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ И ЦИТОКИНОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ

ФАГОЦИТОЗА STAPHYLOCOCCUS AUREUS

14.03.09 клиническая иммунология, аллергология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Шмагель Константин Владимирович Пермь 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................... 1.1. ПРОБЛЕМА СТАФИЛОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ........................................................... КЛАССИФИКАЦИЯ И КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА 1.2.

CТАФИЛОКОКК....................................................................................................... КОЛОНИЗАЦИЯ ПОКРОВОВ МАКРООРГАНИЗМА ЗОЛОТИСТЫМ 1.3.

СТАФИЛОКОККОМ.................................................................................................. 1.4. ПРОНИКНОВЕНИЕ СТАФИЛОКОККА ЧЕРЕЗ БАРЬЕРЫ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК.............................................................................................................. 1.5. ЗАЩИТНАЯ РЕАКЦИЯ МАКРООРГАНИЗМА НА S. AUREUS........................................... 1.5.1. Развитие воспаления в ответ на проникновение S. aureus............................ 1.5.2. Значение нейтрофилов в защите от стафилококковой инфекции............... 1.5.3. Значение гуморального иммунитета в защите от стафилококковой инфекции.............................................................................................................. 1.5.3.1. Значение иммуноглобулинов в защите от стафилококковой инфекции.............................................................................................................. 1.5.3.2. Значение цитокинов в защите от стафилококковой инфекции................... ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................... 2.1. ПОДГОТОВКА ОБЪЕКТОВ ФАГОЦИТОЗА.................................................................... 2.1.1. Подготовка клеток стафилококков................................................................. 2.1.1.1. Окраска клеток S. aureus флюоресцеина изотиоцианатом.......................... 2.1.1.2. Опсонизация клеток S. aureus препаратами антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов...................................................

................... 2.1.2. Подготовка опсонизированного зимозана....................................................... 2.1.3. Получение модельных иммунных комплексов................................................... 2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККА..................................................................................................... 2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНИХ РАЗМЕРОВ ЧАСТИЦ ВЗВЕСИ СТАФИЛОКОККОВ.................. 2.4. ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.............................................................. 2.5. КУЛЬТУРЫ КРОВИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНАХ..................................................................................................... 2.6. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ............................ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЮМИНОЛЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ 2.7.

ЛЕЙКОЦИТОВ (ЛЗХЛ)........................................................................................... 2.8. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................... ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ НА ФАГОЦИТОЗ S. AUREUS............. 3.1. СВЯЗЫВАНИЕ АНТИТЕЛ РАЗЛИЧНЫМИ ШТАММАМИ СТАФИЛОКОККА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА A В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ БАКТЕРИИ....... ЗАВИСИМОСТЬ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГРАНУЛОЦИТОВ И 3.2.

МОНОЦИТОВ ОТ ОПСОНИЗИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ АНТИТЕЛ.................................... 3.2.1. Характер поглощения неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами.......................................................................... 3.2.2. Влияние нормального иммуноглобулина на фагоцитоз S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами........................................................................ 3.3. ВЛИЯНИЕ АСИ НА ПОГЛОЩЕНИЕ S. AUREUS ГРАНУЛОЦИТАМИ............................... 3.3.1. Исследование поглощения неопсонизированных стафилококков.................. 3.3.2. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Wood 46.............................................. 3.3.3. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Cowan I............................................... 3.3.4. Влияние штамма стафилококков на поглотительную активность гранулоцитов....................................................................................................... 3.3.5. Сравнительная характеристика опсонизирующих свойств антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов........................... СПЕКТРОТУРБИДИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СРЕДНИХ 3.4.

РАЗМЕРОВ ЧАСТИЦ СТАФИЛОКОККОВЫХ СУСПЕНЗИЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ........................................................................................... 3.5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АСИ НА ЛЗХЛ ЛЕЙКОЦИТОВ....................................... 3.6. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................................ ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА ФАГОЦИТОЗ S. AUREUS COWAN I..................................................................................................... 4.1. ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ СУТОЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, АКТИВИРОВАННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ СТИМУЛЯТОРАМИ........................................... 4.1.1. Секреция TNF- в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I................................................................. 4.1.2. Секреция IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I................................................................. 4.1.3. Секреция TNF-, IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных LPS, PHA и зимозаном............................................ ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, 4.2.

СТИМУЛИРОВАННЫХ COWAN I, НА ПОГЛОТИТЕЛЬНУЮ S. AUREUS АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ..................................................................................... 4.2.1. Влияние супернатантов на поглотительную активность гранулоцитов....................................................................................................... 4.2.2. Влияние супернатантов на поглотительную активность моноцитов........ 4.3. ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ КУЛЬТУР КРОВИ НА ЛЗХЛ ЛЕЙКОЦИТОВ..................... 4.3.1. Влияние супернатантов культур клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I, на уровень ЛХЗЛ лейкоцитов, поглотивших стафилококк................................................................................ 4.3.2. Отмена тренталом усиливающего влияния САК на ЛЗХЛ лейкоцитов, поглотивших S. aureus Cowan I......................................................................... 4.4. ЛЗХЛ ЛЕЙКОЦИТОВ В ОТВЕТ НА S. AUREUS И ДРУГИЕ ОБЪЕКТЫ ФАГОЦИТОЗА........ 4.5. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................................ ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................... ВЫВОДЫ.............................................................................................................. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА................................... ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. является основным S. aureus возбудителем нозокомиальных инфекций во всем мире [16;

61;

110;

136]. В настоящее время регистрируется рост числа стафилококковых заболеваний [22;

126].

Одной из причин распространённости стафилококковых инфекций является отсутствие надёжных средств специфической профилактики [158;

184] и лечения.

Вакцины, предотвращающие развитие стафилококковых инфекций, отсутствуют.

Антибиотики могут оказаться неэффективными в результате развития у бактерий антибиотикорезистентности [2;

69].

Другим объектом терапевтического воздействия при лечении инфекций является организм человека. Учитывая, что наличие антибиотикоустойчивости стафилококков является серьёзной проблемой, надежда на создание альтернативных средств лечения возлагается на препараты, действие которых направлено на макроорганизм.

Известно, что ключевым механизмом защиты макроорганизма от стафилококка является фагоцитоз [102;

114;

144]. На эффективность фагоцитоза оказывает влияние локальное микроокружение, важнейшими компонентами которого являются антитела и цитокины. Антитела обладают наиболее выраженной опсонизирующей активностью по сравнению с другими молекулами [115;

171;

189]. Дефицит антител приводит к развитию гноеродных инфекций, большей частью вызванных S. aureus [23]. Цитокины участвуют в регуляции количества лейкоцитов в очаге инфекции [92;

109] и осуществляют прайминг фагоцитов [47;

155].

Исходя из вышесказанного, основные усилия рзработчиков при создании иммунотропных средств лечения были сосредоточены на улучшении опсонизации бактерий с помощью введения или индукции in vivo образования антител. Тем не менее, четыре препарата с указанными свойствами не смогли успешно пройти клинические испытания [112;

141]. В России в качестве дополнительного средства лечения стафилококковых инфекций в клинической практике используется антистафилококковый иммуноглобулин, который, однако, не проходил испытаний согласно требованиям доказательной медицины [90].

Неудачные попытки создания иммунопрепаратов для лечения стафилококковых инфекций свидетельствуют о недостаточном понимании их патогенеза [10;

63]. Всё это обуславливает необходимость вновь обратиться к вопросам изучения механизмов фагоцитоза S. aureus и факторов, определяющих его эффективность.

Цель работы исследование влияния антител и цитокинов на эффективность фагоцитоза S. aureus.

Основные задачи исследования:

Оценить выраженность влияния опсонизации S. aureus антителами на 1.

реакцию интернализации и выработку активных форм кислорода лейкоцитами человека при поглощении стафилококков в системе in vitro.

Оценить опсонизирующую и агрегационную активность 2.

коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S.

aureus и сравнить указанные свойства специфического препарата со свойствами нормального иммуноглобулина человека.

Определить закономерности продукции основных провоспалительных 3.

и противовоспалительных цитокинов клетками крови при контакте со стафилококком, а также оценить выраженность влияния цитокинов на процессы интернализации и продукции активных форм кислорода лейкоцитами при фагоцитозе S. aureus в системе in vitro.

Научная новизна. Впервые показано, что антитела в несколько раз усиливают процесс поглощения стафилококков, однако это не приводит к адекватному повышению выработки активных форм кислорода фагоцитами.

Впервые обнаружено, что опсонизирующие свойства препарата коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S. aureus уступают таковым препарата нормального иммуноглобулина человека.

Впервые показана возможность применения спектротурбидиметрии для оценки агрегационных свойств антител. Агрегационная активность коммерческого антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к S.

aureus выражена в меньшей степени, чем соответствующая функция препарата нормального иммуноглобулина.

Впервые получены данные о зависимости интенсивности синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в суточных культурах цельной крови от широкого диапазона концентраций S. aureus. Результаты позволяют проследить синтез цитокинов от уровня базовой секреции до уровня её запредельного торможения.

Впервые показано, что цитокины, вырабатываемые при контакте клеток крови со стафилококком, преимущественно усиливают выработку активных форм кислорода фагоцитами, оказывая незначительное влияние на интенсивность поглощения бактерий.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане полученные результаты расширяют представления о механизмах фагоцитарных реакций по отношению к S. aureus. Показано, что основная проблема антистафилококковой защиты макроорганизма заключается в низком уровне кислородзависимой бактерицидности фагоцитов, поглотивших стафилококк. В практическом плане результаты работы позволяют по-новому взглянуть на эффективность повышения опсонизации S. aureus и применение цитокинов для усиления бактерицидного потенциала лейкоцитов при лечении стафилококковых инфекций.

Положения, выносимые на защиту:

Опсонизация стафилококков антителами в значительной степени 1.

усиливает интернализацию S. aureus лейкоцитами, оказывая при этом слабое стимулирующее влияние на выработку клетками активных форм кислорода.

Действие препарата коммерческого антистафилококкового 2.

иммуноглобулина на процесс поглощения S. aureus и агрегационная активность специфических антител уступают соответствующим свойствам нормального иммуноглобулина человека. Оба препарата в равной степени влияют на продукцию активных форм кислорода фагоцитами при поглощении S. aureus.

Цитокины, вырабатываемые клетками цельной крови при контакте со 3.

стафилококком, усиливают образование активных форм кислорода лейкоцитами, фагоцитирующими S. aureus;

влияние цитокинов на реакцию поглощения стафилококков выражено в меньшей степени.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены в виде докладов и обсуждены на II Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов с международным участием «Симбиоз Россия 2009» (25–29 мая 2009 г. – г. Пермь);

VII конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной, клинической иммунологии и аллергологии» (29 июня – 3 июля 2009 г. – г. Архангельск);

VIII конференции иммунологов Урала (28–30 июня 2010 г. – г. Сыктывкар);

IX конференции иммунологов Урала (21–24 июня 2011 г. – г. Челябинск);

X конференции иммунологов Урала (1–3 июля 2012 г. – г. Тюмень).

Основные результаты исследования представлены в 4 печатных работах, из них 3 статьи вышли в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных результатов исследований, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, из них 18 отечественных и 176 зарубежных, списка иллюстративных материалов, содержащего 13 рисунков и 12 таблиц.

Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны программой Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», № проекта:

09-П-4-1015.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Проблема стафилококковых инфекций S. aureus - главный возбудитель нозокомиальных инфекций во всем мире [16;

61;

110;

136;

186]. Стафилококковые инфекции являются проблемой хирургических стационаров, отделений интенсивной терапии, родильных домов Среди инфекций, осложняющих [3;

16;

18;

129;

145;

157;

174].

послеоперационный период, доля заболеваний, вызванных золотистым стафилококком, составляет около Другими часто 50-70% [129;

145].

встречающимися нозологическими формами являются ИВЛ-ассоциированная пневмония и инфекции, связанные с применением внутрисосудистых катетеров [61;

181]. Среди этиологических факторов инфекций кожи и мягких тканей золотистый стафилококк также стоит на первом месте (44,6% случаев), значительно опережая Pseudomonas aeruginosa (11,1%), -гемолитический стрептококк (4,1%) и коагулазо-негативные стафилококки (2,8%) [110]. В настоящее время в развитых странах отмечен рост числа стафилококковых заболеваний [22;

126]. В США общее количество стафилококковых инфекций, требующих госпитализации, ежегодно составляет более 35000000 случаев [126].

Одним из факторов преобладания S. aureus как причины нозокомиальных инфекций считают антибиотикорезистентность, которую стафилококки приобретают значительно легче, чем другие бактерии [2;

69]. В стационарах создаются благоприятные условия для возникновения и циркуляции антибиотико резистентных штаммов [16;

61]. Доля антибиотикоустойчивых бактерий среди S.

aureus варьирует в зависимости от географического региона: Швеция – 1-5%, Португалия – 25-50%, Румыния больше 50%1, Тайвань - 97% [181]. Наличие антибиотикоустойчивости у микроорганизмов приводит к увеличению сроков пребывания пациента в стационаре и увеличивает стоимость лечения [20]. При бактериемии, вызванной резистентными штаммами, уровень смертности более URL: http://ecdc.europa.eu/en/publications/publications/0706_sur_annual_epidemiological _report_2007.pdf высок, чем в том случае, когда этиологическим фактором бактериемии являются антибиотикочувствительные стафилококки [187].

Другой причиной большого количества внутрибольничных случаев стафилококковых инфекций является снижение общей реактивности организма пациентов, что делает их более восприимчивыми к оппортунистическим инфекциям [69]. Но в начале 1990-х годов эпидемическая ситуация изменилась:

было зарегистрировано появление метициллин-устойчивых штаммов стафилококка, способных вызывать инфекции у практически здоровых людей [43;

69]. Новые штаммы отличались гипервирулентным фенотипом и получили название CA-MRSA (community-associated methicillin resistant Staphylococcus метициллин-устойчивый вызывающий внебольничные aureus, S. aureus, инфекции) [43;

69]. В настоящее время в США регистрируют рост числа заболеваний, вызванных ставшего главной причиной CA-MRSA [88], инфекционных болезней среди населения [61;

69].

Таким образом, распространение стафилококковых инфекций в мире, проблема антибиотикоустойчивости и образование новых болезнетворных штаммов в полной мере оправдывают эпитеты, употребляемые по отношению к стафилококку: «чума ХХ века» и «стафилококковое бедствие» [16]. Однако проблему стафилококковых инфекций следует рассматривать не только в эпидемиологическом аспекте. Современные исследователи отмечают, что до настоящего времени не достигнуто полного понимания патогенеза заболеваний, вызванных S. aureus. С практической точки зрения огромное значение имеет отсутствие эффективных средств лечения и профилактики инфекции.

1.2. Классификация и краткая характеристика бактерий рода cтафилококк Стафилококки – грамположительные неподвижные аэробные или факультативно анаэробные кокки [1], по типу питания - хемоорганотрофы.

Диаметр бактерий от 0,5 до 1,5 мкм;

стафилококки формируют структуры в виде грозди, либо собраны в группы по 2-4 клетки. Согласно классификации, представленной в определителе Берджи [27], род Staphylococcus относиться к типу XIII Firmicutes, классу I Bacilli, порядку I Bacillales, семейству VIII Staphylococcaceae. В род Staphylococcus входит 37 видов и несколько подвидов бактерий [27]. Внутри рода виды разделены на три группы по наличию у микроорганизмов коагулазы и устойчивости к новобиоцину (антибактериальному препарату, блокирующему АТФ-азную реакцию ДНК-гиразы микроорганизма):

коагулазо-негативные, новобиоцин-чувствительные: S. epidermidis, S.

capitis, S. caprae, S. haemolyticus, S. hominis, S. saccharolyticus, S. warneri, S. simulans, S. carnosos коагулазо-негативные, новобиоцин-устойчивые: S. saprophyticus, S.

cohnii, S. xylosu, S. sciuri, S. lentus, S. vitulinus (син. pulvereri) коагулазо-позитивные, новобиоцин-чувствительные: S. intermedius, S.

delphini, S. aureus, S. aureus подвид anaerobius.

Бактерии рода стафилококк являются представителями нормальной микрофлоры кожи и слизистых человека, домашних и диких животных, некоторых видов птиц. Стафилококки могут быть резидентными или транзиторными по отношению к макроорганизму. Резидентные бактерии представляют собой самовосстанавливающуюся популяцию микробов, присущую какому-либо хозяину [96]. Транзиторные штаммы стафилококков, попадая в макроорганизм из окружающей среды, быстро элиминируются организмом хозяина. У человека S. aureus заселяет эпителий преддверия носовой полости.

Кроме этого, бактерия встречается на коже промежности и подмышечных впадин, слизистой глотки, ЖКТ и женских половых органов. По типу носительства стафилококка популяцию людей можно разделить на постоянных носителей (около 20%), периодических носителей (около 60%) и остальных, у которых никогда не обнаруживается стафилококк [61].

В то же время стафилококки - возбудители оппортунистических инфекций человека и животных. Коагулазо-позитивные бактерии (S. aureus, S. intermedius, S.

delphini, S. schleiferi подвид coagulans и коагулазо-вариабельный вид S. hyicus) рассматриваются как потенциальные патогены [27]. Для человека основным среди них является S. aureus [27;

74;

87;

173;

193]. Инфекции, вызванные S. aureus, имеют более тяжёлое течение и серьёзный прогноз, чем заболевания, вызванные коагулазо-негативными стафилококками [24;

98;

146].

1.3. Колонизация покровов макроорганизма золотистым стафилококком Колонизация поверхности эпителия - комплексный процесс. Он включает в себя адгезию бактерий, формирование устойчивости к антимикробным компонентам макроорганизма и способность стафилококка конкурировать с другими представителями микрофлоры [46].

Адгезия стафилококка к слущивающемуся эпителию является первым условием, обеспечивающим колонизацию. О молекулярных механизмах адгезии стафилококка известно не много. Большинство накопленных сведений касаются фиксации стафилококка на эпителии носовой полости [56;

46]. Прикрепление бактерий осуществляется посредством взаимодействия молекул клеточной стенки стафилококка с поверхностными структурами эпителиальной клетки.

Адгезивными свойствами обладают тейхоевые кислоты (структурный элемент клеточной стенки стафилококка) и различные белки: ClfB (Clumping factor B:

фактор агрегации В), IsdA (iron-regulated surface determinant protein A: железо регулируемый поверхностный детерминантный белок А), SasG (S. aureus surface protein: поверхностный белок G S. aureus), SdrC и SdrD (Serin-aspartic acid rich proteins С и D: содержащие в большом количестве серин и аспарагиновую кислоту белки C и D) [46;

76]. Тейхоевые кислоты, вероятно, являются лигандами скавенджерных рецепторов [185], а факторы ClfB и IsdA взаимодействуют с цитокератином эпителиальных клеток [46;

76]. Лиганды для SasG, SdrC и SdrD не известны [56]. Следует упомянуть о том, что стафилококк не использует все факторы адгезии одновременно. Так, тейхоевые кислоты важны в начальной стадии взаимодействия бактерии и хозяина, тогда как ClfB и IsdA необходимы на поздних этапах колонизации [46]. Таким образом, стафилококк обладает выраженными адгезионными способностями, которые обеспечиваются набором белков-адгезинов и тейхоевыми кислотами.

Следующей важной составляющей процесса колонизации является формирование устойчивости микроба к антибактериальным компонентам организма-хозяина. В эпителии кожи и слизистых присутствует ряд бактерицидных молекул: лизоцим, катионные белки и (бета-дефензины кателицидин LL-37) [125], лактоферрин [38] и другие. Однако к большинству из них стафилококки приобрели резистентность. Так, пептидогликан S. aureus (основной полимер клеточной стенки) имеет химически изменённую структуру и поэтому не подвергается расщеплению под действием лизоцима [27]. Благодаря модифицирующим эффектам белков MprF (multiple peptide resistance factor:

фактор, обеспечивающий устойчивость ко многим пептидам) и IsdА, анионные тейхоевые кислоты стафилококка имеют сниженный отрицательный заряд. В результате взаимодействие катионных белков организма-хозяина с поверхностью бактерии существенно ослабляется [46]. Кроме того дефензины и кателицидины могут быть разрушены секретируемыми ферментами золотистого стафилококка:

стафилокиназой и ауреолизином [46]. IsdA инактивирует бактерицидную активность лактоферрина, который считается основным антистафилококковым белком слизистой носа [38]. Антибактериальной активностью обладают также гидрофобные жирные кислоты кожного сала [194]. Гидрофильные свойства поверхности бактерии препятствуют взаимодействию жирных кислот с клеткой стафилококка. Гидрофильность поверхности клетки стафилококка обеспечивается благодаря аминокислотному составу белка IsdA, расположенного на клеточной стенке [39]. Приведенные данные показывают, что стафилококк обладает определенным арсеналом средств, способных нивелировать действие многих антибактериальных молекул кожи и слизистых оболочек.

Состав микробиоты экологических ниш, в которых может находиться стафилококк, довольно разнообразен. Например, у здоровых людей доминирующими видами комменсальной флоры носовой полости являются представители типа Actinobacteria (Propionibacterium spp. и Corynebacterium spp.).

На их долю приходится две трети всех бактерий. Четвертую часть микробиоты составляют бактерии типа Firmicutes (куда входит род Staphylococcus), причём на золотистый стафилококк приходится не более 5% от общего числа микробов.

Наконец, третье место принадлежит микроорганизмам типа Proteobacteria, доля которых равна 4% [59]. В это число входят также условно-патогенные микроорганизмы: Streptococcus pneumoniae (тип Firmicutes), Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis (тип Proteobacteria) [116]. Таким образом, микробиота носовой полости у здоровых людей содержит несколько видов бактерий, среди которых S. aureus - не самый многочисленный представитель.

Бактерии микрофлоры оказывают влияние на численность других микроорганизмов микробиоты. Например, чем больше коринебактерий или S.

epidermidis находиться в преддверии носовой полости, тем меньше вероятность обнаружения S. aureus в составе её микробиоты. В свою очередь, золотистый стафилококк может вытеснять S. epidermidis из состава микрофлоры носовой полости [59], однако он не влияет на количество коринебактерий [103].

Вероятность обнаружения золотистого стафилококка среди носителей Streptococcus pneumoniae снижена в два раза по сравнению с лицами, у которых S.

pneumoniae отсутствует. В свою очередь, среди носителей S. aureus колонизация S. pneumoniae наблюдается в два раза реже, чем среди неносителей [147].

Следовательно, Corynebacterium spp., S. epidermidis и S. pneumoniae проявляют антагонизм по отношению к золотистому стафилококку. S. aureus может вытеснять S. epidermidis [59] и S. pneumoniae [147] из состава микрофлоры, но он не проявляет такой активности по отношению к коринебактериям [103].

Подводя итог, можно сказать, что золотистый стафилококк обладает рядом факторов, которые позволяют ему фиксироваться на эпителиальных клетках макроорганизма, определяют его устойчивость к антибактериальным молекулам кожи и слизистых и обеспечивают его способность конкурировать с другими представителями микрофлоры. И, хотя S. aureus не является доминирующим видом и присутствует в определённых зонах кожного покрова и слизистых человека, эти факторы дают возможность стафилококку конкурировать с другими микроорганизмами, входящими в состав микробиоты.

1.4. Проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек Неповреждённая кожа, по-видимому, является непреодолимым препятствием для стафилококка. При носительстве S. aureus у человека отсутствуют клинические признаки воспаления. Начало инфекции, как правило, связано с нарушением целостности кожных или слизистых покровов. Это могут быть бытовые и спортивные травмы, инвазивные медицинские манипуляции (инъекции, хирургические вмешательства) и т.д.

Вместе с тем, существует ряд экспериментальных свидетельств, полученных при исследовании клеточных культур, показывающих, что S. aureus может проникать внутрь клеток эпителия [89;

93;

111;

160], фибробластов [58] и ряда клеточных линий [76]. Проникновение S. aureus в клетку происходит при участии фибронектина и фибронектин-связывающих белков (FnBPs: Fibronectin binding proteins). При этом фибронектин служит посредником между FnBPs стафилококка и интегрином 51 на поверхности клетки макроорганизма.

Взаимодействие данных молекул приводит к активной интернализации бактерий [76;

161].

В связи с тем, что верхний слой эпидермиса, состоящий из ороговевших неживых клеток, является непроницаемым для стафилококка, вероятный механизм проникновения микроорганизма через кожный покров представляется следующим образом. Нарушение целостности кожи обеспечивает S. aureus внедрение в нижележащие слои, где расположены живые клетки. Стафилококк получает возможность взаимодействовать с клетками кожи, используя их интегрины и собственные фибронектин-связывающие белки.

Реализация механизма внедрения зависит от доступности молекул, участвующих в поглощении бактерии [46]. Здоровая и патологически изменённая кожа отличаются содержанием 51 интегрина и фибронектина. Эпителий здоровой кожи не синтезирует 51. Клетки соединительнотканного слоя также отличаются слабой его экспрессией [134]. Кроме того, в соединительной ткани, расположенной на границе дермы и эпителия кожи, отмечено незначительное содержание фибронектина [41]. Однако, эта ситуация может меняться. Так, при псориазе эпидермальные клетки экспрессируют большое количество 51 [134], а содержание фибронектина увеличивается как в дерме, так и в эпидермисе [62].

По-видимому, поглощение S. aureus живыми клетками кожи более вероятно в ткани, уже изменённой каким-либо патологическим процессом, чем в здоровом кожном покрове.

Кроме того, экспериментальные данные, раскрывающие детали проникновения S. aureus через однослойный эпителий, свидетельствуют о существовании иного механизма заражения. На модели стафилококковой пневмонии у мышей показано, что важную роль в преодолении защитного барьера может играть альфа-токсин стафилококка. Токсин связывается с расположенной на поверхности эпителиальных клеток лёгких металлопротеазой ADAM10 и повышает её активность. Этот фермент, осуществляя протеолиз молекул Е-кадгерина, вызывает нарушение межклеточных контактов эпителиальных клеток [84].

Ослабление контактов клеток дыхательных путей может быть также результатом влияния белка А (основного белка клеточной стенки стафилококка) [166]. В экспериментах с монослоем эпителиальных клеток дыхательных путей показано, что протеин взаимодействует с клеточными рецепторами - TNFR1 и EGFR. Сигнал с этих рецепторов активирует RhoA/ROCK/MLC каскад, что приводит к сокращению цитоскелета. Дополнительный сигнал с EGFR вызывает в клетке активацию кальпаина (кальций-зависимой цистеиновой протеазы), который расщепляет белки межклеточной адгезии (окклюдин и Е-кадгерин).

Сокращение цитоскелета и разрушение межклеточных связей обеспечивает стафилококку проникновение сквозь монослой эпителиоцитов. Кроме того, в экспериментах in vivo показано, что блокирование активности кальпаина препятствует инвазии лёгочной паренхимы стафилококком [166]. Таким образом, стафилококковое инфицирование дыхательных путей может происходить при участии собственных факторов S. aureus (факторов патогенности), которые способны изменять проницаемость эпителия.

Вопрос о проникновении стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек остаётся пока малоизученным. Однако из имеющихся сведений можно заключить, что для преодоления эпителиальных барьеров стафилококку необходимы условия, отличные от тех, которые существуют при колонизации (повреждение кожных покровов или проникновение в зоны, обычно не колонизируемые, например, полость лёгких). Контакт с живыми клетками макроорганизма позволяет стафилококку эксплуатировать их жизненно важные процессы (интегрин-опосредованную активацию цитоскелета, функционирование клеточных ферментов, цитокиновую регуляцию активности клетки) для осуществления инвазии. В процессе заражения принимают участие несколько факторов патогенности стафилококка. Наконец, проникновение через эпителиальный барьер может происходить как путём внедрения внутрь клетки, так и путём разрушения межклеточных связей эпителия.

1.5. Защитная реакция макроорганизма на S. aureus 1.5.1. Развитие воспаления в ответ на проникновение S. aureus Проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых оболочек приводит к развитию острой воспалительной реакции. Одним из условий её индукции является обнаружение патогена. Данную функцию выполняют паттерн распознающие рецепторы, среди которых наиболее значимым для развития воспаления в ответ на внедрение стафилококка считается TLR2 [57]. Он взаимодействует с широким кругом молекулярных структур стафилококка тейхоевыми кислотами, пептидогликаном, липопротеинами и фенол растворимыми модулинами [57]. Возможно, что в обнаружении стафилококка также принимают участие цитоплазматические рецепторы Nod2 (лиганд мурамилдипептид) и TLR9 (лиганд бактериальная ДНК) [57;

113]. Эти структуры экспрессируются многими клетками макроорганизма: макрофагами, дендритными клетками, тучными клетками, и лимфоцитами, B T плазматическими и NK клетками, фибробластами, кератиноцитами и клетками Лангерганса и т.д. [113]. Следовательно, обнаружение золотистого стафилококка возможно сразу после проникновения бактерий через барьеры кожи и слизистых оболочек.

Рецепция молекулярных паттернов стафилококка инициирует в клетках макроорганизма синтез и секрецию провоспалительных цитокинов TNF-, IL-1, IL-6, IL-12, хемокинов CXCL1, CXCL2, CXCL5, CXCL8 (IL-8) и других молекул, необходимых для развития воспаления [57;

113;

137]. Эти медиаторы обладают чрезвычайно широким спектром активности. Например, провоспалительные цитокины повышают экспрессию молекул адгезии и индуцируют синтез хемокинов эндотелиальными клетками, вызывают активацию лейкоцитов. В свою очередь, хемокины обеспечивают привлечение лейкоцитов в очаг поражения [113]. Таким образом, проникновение стафилококка через барьеры кожи и слизистых инициирует ряд событий, необходимых для развития воспалительной реакции.

Значение своевременного развития воспалительной реакции в ответ на проникновение стафилококка можно продемонстрировать на примере первичных иммунодефицитов (ПИД), возникающих при генетических дефектах IRAK-4 или MyD88. IRAK-4 и MyD88 - необходимые компоненты передачи сигнала с TLR (кроме TLR3) и IL-1R. Клетки больных при активации агонистами этих рецепторов не продуцируют (или вырабатывают незначительные количества) TNF-, IL-1, IL-6, IL-12, IL-8 и других медиаторов. В результате значительно снижается выраженность воспалительной реакции, т.е. нарушается мобилизация защитных факторов макроорганизма против инфекции. Например, отсутствие продукции IL-6 в крови приводит к невозможности существенного повышения концентрации C-реактивного белка и температуры тела в начале заболевания [137]. Пациенты с дефектами IRAK-4 и MyD88 имеют предрасположенность к рецидивирующим пиогенным инфекциям, в то же время у больных отмечается сниженное образование гноя. Золотистый стафилококк занимает первое место (43-53% случаев) среди других микроорганизмов как причина поверхностных инфекций (фурункулёз, фолликулит, целлюлит, омфалит, эндофтальмит). При более тяжёлых осложнениях (менингит, сепсис, артрит, остеомиелит, абсцессы) стафилококк входит в число основных возбудителей инфекций и занимает третье место (14% случаев), уступая S. pneumoniae (54%) и P. aeruginosa (19%) [137].

Таким образом, своевременное развитие адекватной воспалительной реакции это необходимое условие защиты от пиогенных инфекций, вызванных, в том числе, S.

aureus.

1.5.2. Значение нейтрофилов в защите от стафилококковой инфекции Основную роль в защите макроорганизма от стафилококковой инфекции играют нейтрофильные лейкоциты, первыми пребывающие в очаг воспаления.

Главной их функцией является поглощение и уничтожение бактерий.

Фагоцитарная реакция протекает в несколько этапов: адгезия нейтрофилов к эндотелию, диапедез через стенку сосуда, хемотаксис в очаг инфекции, адгезия мишени, её интернализация и уничтожение [19]. Нарушение какого-либо этапа фагоцитоза либо недостаточность численности нейтрофилов в очаге воспаления приводят к повышенной восприимчивости макроорганизма к бактериальным, в том числе стафилококковым инфекциям. Об этом свидетельствуют клинические проявления ПИД, в основе патогенеза которых лежат различные нарушения фагоцитарной функции нейтрофилов [102;

114;

144].

Так, рецидивирующие стафилококковые инфекции характерны для первичных иммунодефицитов, при которых нарушены процессы адгезии и хемотаксиса лейкоцитов. Например, дефекты лейкоцитарных селектинов и интегринов имеют место при синдроме дефицита адгезии лейкоцитов (Leukocyte Adhesion Deficiency, LAD). Это проявляется значительным снижением миграции нейтрофилов через эндотелий сосудов очага воспаления [102]. При гипер-IgE синдроме (HIES, Hyper IgE Syndrome) из-за нарушения развития Th17 клеток возникает дефицит хемокинов, что приводит к нарушению хемотаксиса нейтрофилов [50;

127]. (Th17-лимфоциты продуцируют IL17A и IL17F, которые запускают в клетках-мишенях синтез хемокинов, необходимых для привлечения нейтрофилов: CXCL1, CXCL2, CXCL5 и CXCL8 [113].) Наиболее частой причиной инфекционных осложнений при LAD является S. aureus [102];

кожные абсцессы у 90% больных с гипер-IgE синдром вызваны золотистым стафилококком [130].

Нарушение этапа адгезии и поглощения мишени фагоцитоза имеет место при недостаточности опсонинов (антител, комплемента, белков острой фазы) [148]. Так, отсутствие иммуноглобулинов (Х-сцепленная агаммаглобулинемия, общий вариабельный иммунодефицит) приводит к развитию гноеродных инфекций, вызванных, в том числе S. aureus [8;

23;

153;

176]. Транзиторная гипогаммаглобулинемия младенцев может осложниться стафилококковым сепсисом [81]. Инфекционные осложнения при системной красной волчанке, заболевании, в основе патогенеза которого лежит недостаточность компонентов классического пути активации комплемента, чаще всего вызваны S. aureus [128].

Таким образом, недостаточность опсонинов выражается, в том числе, в повышенной чувствительности макроорганизма к стафилококковой инфекции.

Ключевая роль нейтрофилов в борьбе против S. aureus обусловлена фагоцитарной функцией этих клеток, которая заключается в поглощении и последующем уничтожении бактерий [19;

53]. Конечный результат достигается благодаря мощному по сравнению с другими фагоцитами бактерицидному потенциалу нейтрофилов. При поглощении патогена клетки вырабатывают активные формы кислорода непосредственно в полость фагосомы с помощью мембранного фермента Многочисленные гранулы NADPH-оксидазы.

нейтрофилов содержат антибактериальные белки (дефензины, катепсины, лизоцим и т.д.). При слиянии мембран фагосомы и гранул нейтрофилов эти соединения оказывают своё бактерицидное действие на патоген [53].

Известно несколько генетически обусловленных заболеваний, приводящих к снижению бактерицидного потенциала нейтрофилов. Так, при синдроме Чедиака-Хигаси в гранулах нейтрофилов отсутствуют эластаза и катепсин G и наблюдается замедленное слияние гранул с фагосомой [102]. Дефицит специфических гранул нейтрофилов приводит к снижению кислородзависимой [72] и кислороднезависимой бактерицидности (за счёт отсутствия дефензинов в первичных гранулах) [102]. Хроническая гранулематозная болезнь обусловлена дефектами генов, кодирующих компоненты NADPH-оксидазного комплекса.

Каждое из заболеваний имеет свои особенности клинической картины, однако, для всех характерно наличие осложнений в виде рецидивирующих бактериальных инфекций. Наиболее частым их возбудителем является S. aureus [102].

Значение нейтрофилов в борьбе против стафилококка становится также очевидно при недостаточности фагоцитов, которое развивается при нейтропениях различного генеза. Так, при одной из форм – тяжёлой врождённой нейтропении – очень часто наблюдаются рецидивирующие стафилококковые целлюлиты, периректальные абсцессы, стоматиты, менингиты [102]. Индуцированная нейтропения значительно утяжеляет течение экспериментальной стафилококковой инфекции у мышей. Кроме того, у таких животных наблюдается склонность к генерализации инфекции [114].

В заключение ещё раз отметим, что при таких врождённых патологиях нейтрофилов, как дефицит адгезии лейкоцитов, гипер-IgE синдром, синдром Чедиака-Хигаси, дефицит специфических гранул, хроническая гранулематозная болезнь, а также при недостаточности опсонинов и при нейтропениях наблюдается повышенная чувствительность макроорганизма к бактериальным, в том числе к стафилококковым инфекциям. Это доказывает ключевую роль нейтрофилов в борьбе против S. aureus.

1.5.3. Значение гуморального иммунитета в защите от стафилококковой инфекции 1.5.3.1. Значение иммуноглобулинов в защите от стафилококковой инфекции Ранее (раздел 1.5.2) мы упоминали о том, что дефициты иммуноглобулинов клинически выражаются в повышенной чувствительности макроорганизма к стафилококковой инфекции. В научной литературе также присутствуют описания экспериментов, раскрывающих основную роль антител в защите от бактерий опсонизацию объектов фагоцитоза. Так, при поглощении S. aureus, опсонизированного сывороткой пациентов с гипоглобулинемией, нейтрофилы вырабатывают меньше свободных радикалов, чем при опсонизации стафилококка сывороткой здоровых доноров [115;

189]. Интенсивность поглощения некоторых штаммов стафилококка (с низким содержанием белка А в клеточной стенке) в большой степени зависит от содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови [179]. Наконец, поглощение клеток стафилококка, фрагментов его клеточной стенки или очищенного пептидогликана (полимер клеточной стенки) нейтрофилами в отсутствии опсонинов ничтожно [54;

135;

179]. И, хотя в опсонизации стафилококка принимают участие не только антитела [78;

167;

179;

189], приведённые примеры показывают, что опсонизирующая функция антител является существенной для защиты макроорганизма от S. aureus.

Среди всех классов иммуноглобулинов основную долю сывороточных антистафилококковых антител составляют антитела класса G [45;

142]. Хотя IgA, взаимодействующие с поверхностными антигенами бактерии, также представлены в большом количестве [142]. Кроме того IgG являются основным видом антител, присутствующих в экссудате ран: количество IgG в десятки раз превышает содержание иммуноглобулинов других классов. В гнойных ранах (возбудителем инфекции в которых является S. aureus) концентрация IgG в 5 раз больше, чем в экссудате стерильных ран. Тогда как концентрации других иммуноглобулинов при наличии или отсутствии инфицирования раны остаются неизменными [17]. Численное превосходство антистафилококковых IgG в сыворотке крови и большое количество IgG в раневом содержимом подчёркивают роль антител этого класса в противостафилококковой защите организма.

Сыворотка здоровых людей содержит иммуноглобулины, распознающие как поверхностные структуры, так и секретируемые продукты S. aureus [26;

40;

45;

80;

142;

188;

191]. По данным Dryla A. et al. от 0,1% до 3% всех IgG, присутствующих в сыворотке крови, взаимодействуют с антигенами клетки стафилококка. Такие сыворотки считаются сыворотками с низким и высоким титром антистафилококковых антител соответственно [45]. Репертуар анти-S.

aureus IgG большей частью представлен иммуноглобулинами, распознающими липотейхоевые кислоты (60% - 85%) и пептидогликан (15% - 25%) [45].

IgG проявляют более выраженные опсонизирующие свойства, чем иммуноглобулины других классов и комплемент. При контакте с адсорбированным на поверхности IgG нейтрофилы генерируют больше перекиси водорода, чем при контакте с поверхностно-адсорбированными IgM. Фагоцитоз IgA-опсонизированных бактерий протекает менее интенсивно по сравнению с поглощением бактерий, опсонизированных IgG [67]. Опсонизация объектов фагоцитоза иммуноглобулинами класса G приводит к более интенсивному их поглощению нейтрофилами человека, чем опсонизация комплементом. При этом фагоциты вырабатывают больше активных соединений кислорода, если опсонином является IgG [67]. Таким образом, наиболее мощными (по сравнению с другими молекулами) опсоническими свойствами обладают антитела класса G, поскольку в их присутствии поглощение объектов фагоцитоза и выработка активных форм кислорода фагоцитами происходят интенсивнее.

IgG-опсонизированные частицы взаимодействуют с нейтрофилами при участии низкоаффинных FcRIIA и FcRIIIB и высокоаффинного рецептора FcRI [149;

152]. Интернализация IgG-опсонизированных частиц осуществляется при участии FcRIIA и FcRIIIB (экспрессируются на поверхности нейтрофилов постоянно). При этом поглощение с помощью FcRIIA происходит более эффективно [149]. FcRI на клетках отсутствует, а его появление (может быть индуцировано IFN-) на мембране нейтрофила не приводит к усилению интернализации опсонизированных частиц [149].

Следует также отметить, что IgG, связанные с антигеном, способны фиксировать компоненты классического пути активации комплемента. Поэтому IgG-опсонизированные частицы помимо контакта с Fc-рецепторами могут взаимодействовать с нейтрофилами через рецепторы к комплементу (complement receptor, CR), которые присутствуют на этих клетках: CR1, CR3 и CR4 [138]. Из числа рецепторов к комплементу наибольшее значение для фагоцитоза нейтрофилов имеет CR3. Посредством этой молекулы нейтрофилы осуществляют адгезию и поглощение до 70% опсонизированных комплементом частиц [138].

Таким образом, FcR и CR выполняют различные функции в процессе фагоцитоза. Среди этих рецептров можно выделить основные и вспомогательные.

Зная роль иммуноглобулинов в опсонизации бактерий, логично было бы предположить, что увеличение количества опсонизирующих антител в сыворотке крови должно усиливать противостафилококковую защиту макроорганизма.

Действительно, вацинация мышей коньюгированной вакциной, состоящей из стафилококкового капсульного полисахарида (capsular polysaccharide, CP) 5 типа и протеина А Pseudomonas aeruginosa, позволяла увеличить выживаемость лабораторных животных до 73% при введении им летальной дозы стафилококков.

В параллельном эксперименте тот же показатель у животных контрольной группы, «иммунизированных» фосфатно-солевым буферным раствором, составил 13%. Исследователи отмечают, что концентрация сывороточных анти-CP5 антител в группе выживших животных в 2,3 раза превышала концентрацию специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови у погибших животных [51].

В качестве другого примера удачной антистафилококковой иммунотерапии лабораторных животных можно привести увеличение концентрации сывороточных IgG, специфичных к липотейхоевым кислотам (LTA, lipoteichoic компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий), путём acid, вакцинации. Введение мышам конюгата, содержащего полиглицерофосфат (высококонсервативный компонент и основная антигенная детерминанта гуморального ответа на столбнячный токсоид, LTA), CpG олигодеоксинуклеотиды и алюминиевые квасцы приводило к росту титров анти LTA IgG. У мышей опытной группы происходило быстрое (по сравнению с животными контрольной группы) освобождение кровотока от стафилококков [36].

Ещё одним доказательством благоприятного влияния увеличения концентрации опсонизирующих антител на течение стафилококковой инфекции служат эксперименты с пассивной иммунизацией лабораторных животных. Так, перед инокуляцией бактерий животным вводили антистафилококковый иммуноглобулин, полученный из сыворотки доноров, иммунизированных коньюгатом капсульных полисахаридов 5 и 8 S. aureus с протеином А P.

Эффективность анти-СР-иммуноглобулина сравнивали с aeruginosa.

эффективностью нормального иммуноглобулина, полученного от неиммунизированных доноров. При интраперитонеальном введении мышам летальной дозы стафилококка инъекции человеческого анти-СР иммуноглобулина увеличивали выживаемость лабораторных животных в 25 раз по сравнению с животными контрольной группы. Введение антистафилококкового иммуноглобулина позволяло снизить бактериальную обсеменённость тканей почек и печени и уменьшить число бактерий в крови и перитонеальном смыве заражённых мышей по сравнению с животными контрольной группы при инокуляции им сублетальной дозы S. aureus [51]. В экспериментальной модели стафилококкового эндокардита у крыс также продемонстрирована эффективность кроличьего анти-СР5 иммуноглобулина. У заражённых крыс наблюдалось снижение количества случаев эндокардита, уменьшение числа вегетаций стафилококка на клапанах аорты, снижение бактериальной обсеменённости ткани почек и уровня бактериемии, вызванных СР5-продуцирующим стафилококком. Следует при этом отметить, что препарат анти-СР5 иммуноглобулина оказался неэффективен в отношении инфекции, вызванной нетипируемым штаммом стафилококка [100]. Следовательно, специфичность антител в препарате иммуноглобулинов определяла наличие у него защитных свойств.


То, что антитела, специфичные к поверхностным небелковым компонентам клетки бактерии усиливают фагоцитоз стафилококков, было продемонстрировано в тестах in vitro. Нейтрофилы человека активно уничтожали S. aureus Lowenstein (CP5-продуцирующий штамм), если в реакционной смеси присутствовали либо гипериммунный IgG человека, либо сыворотка кроликов, иммунизированных коньюгированной вакциной, содержащей и В параллельном CP5 CP8.

эксперименте наличие гипериммунного IgG, полученного при вакцинации доноров нерелевантным (т.е. отсутствующим у микроорганизма, к которому необходимо индуцировать иммунный ответ) полисахаридом, не повлияло на эффективность фагоцитоза [51]. Добавление сыворотки мышей, иммунизированных коньюгатом полиглицерофосфата, к фагоцитам усиливало уничтожение живых S. aureus [36]. Таким образом, активная и пассивная иммунизация лабораторных животных поверхностными небелковыми антигенами S. aureus усиливает противостафилококковую защиту макроорганизма за счёт повышения эффективности фагоцитоза.

Подобные результаты были получены при иммунизации животных белковыми антигенами S. aureus. Группой исследователей под руководством была предпринята попытка определить оптимальный Y. K. Stranger-Jones антигенный состав стафилококковой вакцины [168]. Для этого мышей подвергали иммунизации одним из девятнадцати заякоренных в клеточной стенке бактерии и наиболее консервативных белков стафилококка. Затем животных инфицировали ретроорбитальной инъекцией взвеси S. aureus. Иммунизация животных ClfA, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB и некоторыми другими белками снижала показатель бактериальной обсеменённости тканей почек инфицированных мышей на порядка по сравнению таковым у животных, которым «прививали» фосфатно солевой буферный раствор. При этом наиболее мощный защитный потенциал имели вакцины, содержащие IsdA, IsdB, SdrD и SdrE. Наконец, комбинированная вакцина уменьшала число бактерий в ткани почек ниже определяемого уровня, а также предотвращала развитие фатального исхода при интраперитонеальном введении мышам летальной дозы различных клинических изолятов S. aureus. В тестах in vitro было показано, что антитела, полученные при иммунизации кроликов перечисленными антигенами, повышали комплементзависимое уничтожение стафилококков фагоцитами в 319 раз [168].

Другие белки для создания поливалентной стафилококковой вакцины были предложены E. Glowalla и др. Исследователи провели поиск потенциальных вакцинных антигенов среди поверхностных белков, нековалентно связанных с клеточной стенкой стафилококков. Если белок специфически связывал антитела препарата нормального человеческого иммуноглобулина для внутривенного введения, то его включали в перечень «кандидатов». Затем из 40 обнаруженных белков случайным образом были отобраны три протеина: енолаза (Eno), оксоацилредуктаза (Oxo) и гипотетический белок hp2160. При внутривенном введении S. aureus иммунизация мышей Eno, Oxo и hp2160 снижала распространение стафилококков в организме животных в 10100 раз, а вакцинация hp2160 улучшала выживаемость мышей. Вновь в тестах in vitro было показано, что антитела, специфичные к Eno, Oxo и hp2160 улучшают опсонизацию и фагоцитоз S. aureus [65]. Таким образом, иммунизация животных поверхностными белковыми, также как и небелковыми, антигенами стафилококка оказалась клинически эффективной. Действие вакцин было обусловлено усилением опсонизирующих свойств сыворотки крови.

В перечень антигенов стафилококка, которые были протестированы в качестве антигенов для создания вакцин, вошли белки адгезии FnBP-A (Fibronectin binding protein А, фибронектин-связывающий белок А), FnBP-B (Fibronectin binding protein В, фибронектин-связывающий белок В) и Cna protein, коллаген-связывающий белок). В модели (collagen-binding стафилококкового перитонита у мышей изучали влияние пассивной иммунизации FnBP-A, FnBP-B и Cna на проявления стафилококковой инфекции. Препаратом сравнения вновь служил неиммунный IgG. Было показано, что элиминация бактерий из перитонеальной полости мышей опытной группы происходила эффективнее, чем у мышей контрольной группы [150].

Подводя итог, можно сказать, что увеличение концентрации антистафилококковых антител, специфичных к белковым и небелковым поверхностным антигенам S. aureus, в сыворотке крови лабораторных животных улучшает течение экспериментальных стафилококковых инфекций. Эти данные являются весьма многообещающими для создания лекарственных препаратов, механизм действия которых заключался бы в улучшении опсонизации стафилококка.

Не менее важной функцией антител представляется нейтрализация микробных токсинов. В первой половине ХХ века советскими исследователями в основу концепции противостафилококкового иммунитета был положен антитоксический иммунитет. Основная идея заключалась в следующем: при нейтрализации токсина «…важный фактор, препятствующий клеточной защите, устраняется и создаётся возможность для полного проявления её действия» [2, с.

216]. К такому заключению исследователи пришли после многочисленных экспериментов по иммунизации лаборатоных животных обезвреженным токсином стафилокка (анатоксином). Иммунизация анатоксином в отличие от корпускулярной стафилококковой вакцины индуцировала образование антитоксических антител. Увеличение титра антитоксина сопровождалось повышением показателей выживаемости животных и улучшением клинического течения экспериментальных стафилококовых инфекций. На основании этих фактов также был сделан вывод о главенствующей роли антитоксического иммунитета над клеточным иммунитетом в антистафилококковой защите макроорганизма [2]. Вместе с тем, однако, отмечалось, что «...при относительно обильном содержании антитоксина в жидкостях организма, но при пониженной клеточной защите организма выздоровление может не наступить, так как антитоксин, снимая токсикоз (что даёт возможность клеточной защите проявить полную силу), не может её заменить» [2, с. 216].

Результаты современных исследований согласуются с данными, полученными советскими исследователями. Так, вакцинация лабораторных животных различными инактивированными токсинами S. aureus индуцирует выработку антитоксических антител, что позволяет снизить остроту клинических проявлений экспериментальных стафилококковых инфекций. В модели стафилококковой пневмонии иммунизация мышей мутантной формой альфа токсина (гемолизин альфа, alpha-hemolysin, Hla) снижала смертность, уменьшала бактериальную обсеменённость и степень повреждения ткани лёгких у заражённых животных по сравнению с показателями в контрольной группе («вакцинация» фосфатно-солевым буферным раствором). Аналогчный клинический эффект удалось получить путём пассивной иммунизации мышей кроличьей анти-Hla сывороткой. (При введении мышам нормальной сыворотки кроликов клинического улучшения в течении стафилококковой пневмонии не наступало.) [183]. Благоприятное влияние нейтрализации альфа-токсина было показано в модели инфекционного дерматита у мышей. Инъекция моноклональных анти-Hla антител (в отличие от введения IgG другой специфичности) позволяла значительно сократить зону дерматонекроза при внутрикожной инокуляции взвеси стафилококков. Исследователи отмечают усиление эффективности моноклональных антител с ростом их аффинности к Hla [175].

Снижение смертности инфицированных животных, уменьшение степени бактериальной обсеменённости внутренних органов (селезёнки, печени, почек) в модели стафилококкового сепсиса у мышей достигается вакцинацией животных мутантным токсином синдрома токсического шока (toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1) [83;

118]. При этом эффекта удаётся достичь как при подкожном введении вакцины [83], так и при интраназальной иммунизации [118]. Инъекции мышам анти-TSST-1 антител, приготовленных из пулированной сыворотки иммунизированных кроликов, также предотвращают фатальный исход в модели стафилококкового сепсиса [83].

Показательными были эксперименты по вакцинации мышей стафилококковыми энтеротоксинами А (staphylococcal enterotoxin A, SEA) [123] и С (staphylococcal enterotoxin C, SEC) [82]. У вакцинированных мышей по сравнению с животными из контрольных групп улучшались показатели выживаемости, снижалась бактериальная обсеменённость внутренних органов [82], была отмечена меньшая потеря веса [123]. Пассивный перенос анти-SEA специфичных антител неиммунным животным предотвращал их гибель при внутривенной инокуляции взвеси стафилококков [123].

Таким образом, нейтрализация различных токсинов стафилококка путём активной и пассивной иммунизации является действенной мерой в защите лабораторных животных от стафилококковых заболеваний. Эти данные убеждают, что стимуляция антитоксического иммунитета (как и усиление опсонизации) может стать одним из подходов к лечению стафилококковых заболеваний.

Однако попытки создания иммунотропных лекарственных препаратов для лечения стафилококковых инфекций у человека до сих пор не увенчались успехом. Основные усилия исследователей были сосредоточены на создании препаратов, механизм действя которых базируется на использовании опсонизирующей или токсин-нейтрализующей функций антител. Так, комбинированная вакцина, состоящая из обезвреженных бактериальных клеток и инактивированного Hla, не предотвращала развития перитонитов, катетер ассоциированных инфекций и асимптоматического носительства у пациентов, подвергающихся постоянному перитонеальному диализу. Иммуноглобулины с повышенным количеством антител к ClfA и SdrG, CP5 и CP8, а также вакцина, содержащая CP5 и CP8, не прошли III фазы клинических испытаний [141]. Эти препараты не вызвали статистически значимого снижения частоты случаев стафилококковой бактериемии [112;

141]. В списке лицензированных вакцин США отсутствуют антистафилококковые препараты1. На территории Советского Союза [2;


6;

12;

15], а затем и России [4;

5] применялись и применяются стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин. Однако работ, подтверждающих клиническую эффективность данных препаратов с точки зрения доказательной медицины, не проводилось [90]. В обзоре советской литературы, написанном J. Kelly, основными недостатками многочисленных клинических исследований эффективности стафилококкового анатоксина, URL: http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm 3.htm антистафилококковой плазмы и иммуноглобулина названы плохой дизайн исследований, отсутствие рандомизации испытуемых и неверно подобранные группы сравнения [90]. В связи с этим роль антитоксического иммунитета в защите от стафилококковых инфекций, на наш взгляд, требует перепроверки на основе требований доказательной медицины.

Неудачи в создании антистафилококковых иммунопрепаратов на основе антител могут быть следствием нескольких феноменов. В первую очередь следует назвать структуры стафилококка, которые препятсвуют эффективной опсонизации бактерии: белок А (Protein A, Spa) и Sbi (staphylococcal binder of immunoglobulin, белок стафилококка, связывающий иммуноглобулин). Эти белки обладают способностью связывать IgG через Fc-фрагмент [35;

91;

164;

165], что не позволяет антителам взаимодействовать с соответствующими рецепторами фагоцитов. Кроме того, этот способ «адсорбции» иммуноглобулинов может экранировать другие антигены стафилококка от взаимодействия со специфическими антителами.

Нивелирование активности антибактериальных иммуноглобулинов стафилококком может происходить и другими способами. Так, антитела, специфичные к поверхностным гликопротеинам CP или PNAG (poly-N acetylglucosamine, поли-N-ацетилглюкозамин экзополисахарид биоплёнок стафилококка), усиливают фагоцитоз S. aureus. Однако, находясь в одной среде, они взаимно снижают опсонизирующую активность друг друга [140]. Это происходит в результате «склеивания» Fab-фрагментов анти-СР и анти-PNAG [162;

163]. Антитела к стафилококковому адгезину FnbpA (Fibronectin-Binding protein A, фибронектин-связывающий белок А) не ингибируют связывание S.

aureus с фибронектином. Дело в том, что макроорганизм синтезирует антитела, взаимодействущие не с нативным FnbpA, а с FnbpA, конформационно изменённым после соединения с молекулой-мишенью фибронектином [33].

Попытки нейтрализации токсина Пантона-Валентайна (Panton-Valentine leukocidin, PVL) вопреки общепринятой точке зрения на нейтрализацию бактериальных токсинов как на способ снижения вирулентности микробов могут оказать неблагоприятное влияние на течение стафилококковых инфекций [192].

По мнению P. Yoong сублитические концентрации токсина, которые не приводят к разрушению клеток макроорганизма, являются существенным активатором клеток врождённого иммунитета и необходимы для развития адекватной воспалительной реакции. Поэтому в модели стафилококковых кожных абсцессов у мышей для инокуляции бактерий P. Yoong были выбраны небольшие количества PVL-продуцирующих (PVL+) S. aureus 104105 бактерий/животное.

Вирулентность PVL+ S. aureus сравнивали с вирулентностью изогенных штаммов, не продуцирующих PVL (PVL). Через три дня после инокуляции PVL+ опытной группе животных и PVL-стафилококков контрольной группе подсчитывали число колоние-образующих единиц (КОЕ) в кожных абсцессах. Оказалось, что число бактерий в абсцессах опытной группы было в 1,54 раза меньше, чем КОЕ в абсцессах контрольной группы мышей. Это означает, что PVL+-стафилококки менее вирулентны, чем PVL. Кроме того, как и предполагалось исследователями, нейтрализация токсина негативно отразилась на инфекционном процессе.

PVLантисыворотки Введение кроличьей перед инокуляцией токсин продуцирующих стафилококков вызвало увеличение числа бактерий в очагах инфекции. В абсцессах мышей контрольной группы, получавших инъекции нормальной кроличьей сыворотки, число PVL+КОЕ было в несколько раз меньше.

На основании этих данных авторы делают следующий вывод: антитела, нейтрализующие PVL на ранних стадиях инфекционного процесса (когда число бактерий ещё невелико), мешают мобилизации иммунной системы и утяжеляют течение инфекционного процесса [192]. Приведённые примеры иллюстрируют, что гуморальный антистафилококковый иммунный ответ имеет более сложные механизмы, чем это представлялось до сих пор.

Особо следует отметить, что стафилококк является микроорганизмом с большим разнообразием патогенных и регуляторных факторов, каждый из которых обладает широчайшим спектром биологической активности в отношении организма хозяина. Многие факторы обладают синергизмом действия [77]. Среди них трудно выделить основной, ответственный за развитие заболевания. Этим стафилококковые инфекции отличаются, например, от дифтерии или столбняка, патогенез которых обусловлен действием одного токсина. Наличие нейтрализующих антител к дифтерийному или столбнячному токсинам является синонимом иммунитета при этих заболеваниях [28]. В случае со стафилококковыми инфекциями нейтрализация одного из токсинов стафилококка недостаточна для благоприятного разрешения патологического процесса. Это позволяет лишь снизить остроту его клинических проявлений, возможно, потому, что в «арсенале» бактерии присутствуют другие токсины.

На основании изложенных фактов можно дать общую характеристику современного состояния проблемы гуморального иммунитета в защите от стафилококковых инфекций. Усиление опсонизирующей или токсин нейтрализующей функций антител позволяет значительно снизить остроту проявлений экспериментальных стафилококковых инфекций у лабораторных животных. Однако экстраполяция выводов, полученных в этих экспериментах, на человека не столь удачна. Результаты исследований зарубежных фармацевтических компаний не позволяют утверждать, что вакцинация поверхностными антигенами стафилококка улучшает процесс выздоровления. В такой ситуации попытка усиления антитоксического иммунитета выглядит весьма привлекательной. Однако для подтверждения клинической эффективности этого подхода требуется проведение крупномасштабных исследований. Давая оценку значению гуморального иммунитета, следует учесть, что функции иммуноглобулинов не исчерпываются опсонизацией микроорганизмов и нейтрализацией бактериальных токсинов. Антитела также участвуют в поддержании гомеостаза макроорганизма [120;

124] - функции, которая может играть не последнюю роль в патогенезе стафилококковых инфекций. Поэтому на сегодняшний день вопрос о роли антител при стафилококковых заболеваниях остаётся открытым.

1.5.3.2. Значение цитокинов в защите от стафилококковой инфекции Стафилококковая инфекция, как и любой воспалительный процесс, требует участия цитокинов секретируемых клеточных белковых продуктов, выполняющих регуляторную функцию [19;

119], как, например, мобилизацию защитных факторов организма (см. раздел 1.5.1 и 1.5.2).

Последовательная и достаточная выработка цитокинов необходима для привлечения лейкоцитов в очаг инфекции. Так, TNF-, IL-1 и IL-8 имеют большое значение на ранних этапах развития воспалительной реакции. В моделях стафилококкового и LPS-индуцированного артрита у кроликов было показано, что нейтрализация этих цитокинов в первые 24 часа после заражения приводит к значительному снижению лейкоцитарной инфильтрации очага воспаления [92;

109]. Более позднее введение нейтрализующих агентов подобного эффекта не вызывает [92].

Помимо регуляции численности лейкоцитов, цитокины оказывают влияние на функциональное состояние фагоцитов: осуществляют прайминг нейтрофилов.

Под этим термином понимают ряд внутриклеточных процессов, результатом которых является повышение степени готвности фагоцита к уничтожению патогена. Прайминг нейтрофилов включает в себя понижение порога активации ферментов NADPH-оксидазы (за счёт частичного фосфорилирования), PLA (phospholipase A2, фосфолипаза А2), PLD (phospholipase D, фосфолипаза D), PI3K (phosphoinositide 3-kinase, фосфоинозитид-3-киназа), увеличение количества fMLF-рецепторов на поверхности мембраны клетки [47]. Во время фагоцитоза праймированные нейтрофилы вырабатывают большее количество свободных радикалов и, следовательно, проявляют большую бактерицидность, чем фагоциты, которые не подверглись праймингу.

Цитокины отличаются друг от друга по виду и силе оказываемого на нейтрофилы воздействия. Так, TNF- и GM-CSF являются более активными праймирующими медиаторами, чем IL-1, IL-8, IL-18 и IL-15 [47]. TNF увеличивет эксперсиию CR3 на поверхности нейтрофилов [55] и запускает фосфорилирование белков цитоскелета при связываении CR3 со своим лигандом [68]. IFN- не обладает праймирующим влиянием на нейтрофилы. Однако, действуя на фагоциты совместно с TNF-, этот цитокин повышает как респираторный взрыв, так и экспрессию рецептора к C3b [105]. TNF- и GM-CSF вызывают фосфорилирование р47phox (цитоплазматический компонент NADPH оксидазы) [44] и повышают число молекул цитохрома b558 (мембранный компонент NADPH-оксидазы) на мембране нейтрофилов [182]. Воздействие GM CSF на нейтрофилы повышает их фагоцитарное число и фагоцитарный индекс.

При этом эффект GM-CSF проявляется только в том случае, если стафилококки были опсонизированы. Интересно отметить, что уничтожение бактерий при этом не усиливается [54]. IL-1 является слабым индуктором фосфорилирования р47phox [44]. IL-18 усиливает дегрануляцию нейтрофилов, что приводит к увеличению числа мембранных молекул цитохрома b558. Кроме того, под влиянием IL-18 усиливается эндоцитоз рецепторов к fMLP (n-formyl-methionyl пептиды) и leucyl-phenylalanine, n-формил-метионил-лейцил-фелилаланин происходит реорагнизация цитоскелета [48]. Таким образом, молекулярные механизмы прайминга различных цитокинов отличаются друг от друга.

Однако, несмотря на универсальность цитокиновой регуляции воспалительного процесса, можно выделить некоторые её особенности, характерные для стафилококковой инфекции. Так, при поверхностном воспалении особое значение для притока нейтрофилов в очаг, по-видимому, приобретает IL-1. В экспериментах на культурах кератиноцитов человека было показано, что эти клетки способны к спонтанной и индуцированной стафилококком секреции IL-1 и IL-1. Причём выработка IL-1 количественно превосходит продукцию IL-1. Значение IL-1 определяется тем, что из двух вариантов IL-1 только IL-1 являестя мощным индуктором продукции нейтрофильных хемоаттрактантов CXCL8, CXCL1 и CXCL2 кератиноцитами человека [131]. Следует отметить, что IL-1 также в состоянии индуцировать синтез этих хемоаттрактантов [131]. Однако того количества IL-1, которое вырабатывается кератиноцитами in vitro, вероятно, недостаточно, чтобы стимулировать синтез CXCL8, CXCL1 и CXCL2 [131]. Таким образом, есть основания полагать, что кератиноциты эпидермиса при «встрече» со стафилококком способны опосредованно, путём секреции IL-1, мобилизировать нейтрофилы в очаг инфекции (см. раздел 1.5.2).

Значение для защиты макроорганизма при поверхностных IL- стафилококковых инфекциях подтверждается в экспериментах на лабораторных животных. Так, у мышей с дефицитом продукции IL-1 или IL-1 оценивали тяжесть течения стафилококковых инфекций кожи. Группой сравнения служили здоровые животные. При внутрикожном введении взвеси S. aureus уменьшение нейтрофильной инфильтрации и снижение клиренса бактерий наблюдались лишь в группе мышей с дефицитом IL-1. Если же стафилококки наносили на участки кожи с поверхностными повреждениями (обнажён слой живых клеток эпидермиса), то тяжёлое по сравнению с воспалением у контрольных животных течение раневой инфекции наблюдалось в обеих группах мышей. Следовательно, при поверхностных стафилококковых инфекциях кожи IL-1 выполняет защитную функцию наравне с IL-1. Тогда как при более глубоких повреждениях IL-1, по-видимому, утрачивает свою роль [97].

Подобно IL-1 привлечение нейтрофилов в очаг инфекции вызывает IL-17.

(Этот цитокин индуцирует синтез CXCL1, CXCL2, CXCL5 и CXCL8 [113] (см.

раздел 1.5.2)). Источником IL-17 являются Th17-, -T-, NK-клетки и, возможно, тучные клетки и нейтрофилы [97]. Значение IL-17 в защите от стафилококковых инфекций и роль Th17-лимфоцитов как его источника определяются ходом развития патологического процесса при нарушении генерации Th17 клеток (см.

раздел 1.5.2). Ещё один цитокин IFN-, продукт Th1-клеток, индуцирует приток нейтрофилов при повреждении кожных покровов у мышей и защищает животных при внутривенном введении S. aureus. Однако реализуется ли такой механизм у людей остаётся неизвестным [97]. Таким образом, можно утверждать, что IL-1 и IL-17 вносят важный вклад в противостафилококковую защиту макроорганизма.

Рассмотренные выше примеры недостаточного уровня секреции цитокинов в ответ на внедрение стафилококка свидетельствовали о важной роли этих медиаторов в устойчивости макроорганизма к инфекции. Противоположная ситуация гиперпродукция цитокинов также имеет неблагоприятные последствия. Так, избыток IL-1 и недостаточность IL-1RА в очаге воспаления при ревматоидном артрите [37;

156], хронической обструктивной болезни лёгких [99] и в экспериментальной модели церебрального паралича, вызванного бактериальной инфекцией и/или гипоксией/ишемией [64] ассоциируется с неблагоприятным течением заболевания и рассматривается как одна из причин нарушения функции поражённого органа. Поэтому можно ожидать, что соотношение концентраций IL-1RА/IL-1 в очаге стафилококковой инфекции будет отражать остроту воспаления или свидетельствовать об обострении хронического процесса.

На системном уровне гиперэргическая воспалительная реакция клинически проявляется как шок. Симптомы шока (лихорадка, гипотензия и мультиорганная недостаточность) развиваются при избыточной продукции медиаторов TNF, IL-1, IL-6, IFN- и некоторых других [79]. Следует отметить, что механизм патогенеза шокового состояния при стафилолкокковом сепсисе изучен недостаточно.

Однако, группой исследователей во главе с Holtfreter S. была предложена модель «двойного удара», описывающая причины развития этого состояния [79].

Согласно этой гипотезе «первым ударом» являются моноцитарные активаторы:

пептидогликан и липотейхевые кислоты. Затем наступает время «второго удара»

секретируемых, направленных на Т-клетки суперантигенов стафилококка [71;

79].

Синергичное действие бактериальных стимуляторов на моноциты и Т-клетки приводит к гиперпродукции провоспалительных цитокинов [79].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Подготовка объектов фагоцитоза 2.1.1. Подготовка клеток стафилококков Для исследования были взяты штаммы стафилококков, отличающиеся по экспрессии белка A, обладающего способностью неспецифически (через Fc фрагмент) связывать антитела: S. aureus Cowan I (белок A+) и S. aureus Wood (белок A–). Обезвреженные формалином стафилококки трехкратно отмывали (центрифугирование: 1500 g, 20 мин) 0,15M NaCl и хранили в виде суспензии в 20% растворе глицерина на физиологическом растворе при минус 20°С. Перед любой манипуляцией микроорганизмы вновь трёхкратно отмывали.

Концентрацию стафилококка определяли фотометрически при 600 нм относительно стандартов мутности.

2.1.1.1. Окраска клеток S. aureus флюоресцеина изотиоцианатом Окраску стафилококков осуществляли флюоресцеина изотиоцианатом (FITC;

Sigma, США) по общепринятой методике [13]. Для этого взвесь стафилококков вносили в раствор FITC (8 мкг/мл) на карбонатно-бикарбонатном буфере (0,1М;

рН = 9,5;

конечная концентрация стафилококков в растворе FITC 109 кл/мл) и инкубировали в течение 1 часа на магнитной мешалке. Затем стафилококки трёхкратно отмывали в физиологическом растворе, ресуспендировали в растворе Хенкса без фенолового красного (Sigma, США), определяли концентрацию клеток бактерий, разливали на аликвоты и оставляли на хранение при минус 20°С до использования. Повторного замораживания стафилококков не допускалось.

2.1.1.2. Опсонизация клеток S. aureus препаратами антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов Опсонизацию FITC-меченых и неокрашенных стафилококков проводили путем их инкубирования в растворах препаратов иммуноглобулинов («Пермское НПО «Биомед») в течение 40 мин при 37°C. Концентрация специфического иммуноглобулина составляла 25 мг/мл по белку, что соответствовало среднему уровню антител к альфа-токсину стафилококка (8,25 МЕ/мл) в сыворотке крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Для проведения контрольных экспериментов опсонизацию стафилококков выполняли в растворе нормального иммуноглобулина (25 мг/мл по белку). Конечное содержание S. aureus во время опсонизации составило 109 кл/мл. После инкубации с антителами бактерии трехкратно отмывали 0,15М NaCl, ресуспендировали в растворе Хенкса (без фенолового красного, Sigma, США), определяли концентрацию стафилококка как указано выше, разливали на аликвоты и хранили при минус 20°С до исследования. Повторного замораживания стафилококков не допускалось.

2.1.2. Подготовка опсонизированного зимозана К суспензии зимозана (Sigma, США) с концентрацией 1,5 мг/мл в изотоническом растворе хлорида натрия добавляли равный объем свежей пулированной сыворотки здоровых доноров и инкубировали 30 мин при 37°С, периодически встряхивая. После трехкратного отмывания центрифугированием (350 g;

15 мин) в физиологическом растворе частицы зимозана ресуспендировали до исходного объема, разливали на аликвоты и замораживали при минус 20 °С.

2.1.3. Получение модельных иммунных комплексов Для получения модельных нерастворимых иммунных комплексов использовали модифицированную методику Л. Б. Королевской [9]. Смешивали равные объемы столбнячного анатоксина («Пермское НПО «Биомед»), разведенного в 32 раза раствором Хенкса, и противостолбнячного иммуноглобулина («Пермское НПО «Биомед»), разведенного в два раза в той же среде. Концентрации реагентов соответствовали зоне эквивалентности антигена и антител [9]. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Преципитат двукратно отмывали (40000g, 15 мин, плюс 4°С) и ресуспендировали в растворе Хенкса. Содержание иммунных комплексов контролировали фотометрически при 280 нм и выражали в виде количества белка в 1 мл взвеси.

2.2. Исследование иммуноглобулинсвязывающей активности штаммов стафилококка Взвеси S. aureus Cowan I и S. aureus Wood 46 инкубировали в растворе нормального иммуноглобулина с постоянной, предварительно подобранной и удобной для спектрофотометрического контроля концентрацией (0,16 мг/мл).

Затем пробы центрифугировали (1500 g, 20 мин) и определяли оптическую плотность (ОП) супернатантов при 280 нм.

2.3. Определение средних размеров частиц взвеси стафилококков Метод спектротурбидиметрии основан на спектральной зависимости интенсивности луча света, прошедшего через дисперсную среду, от размера частиц суспензии [7]. Разведения компонентов готовили в физиологическом растворе. Взвесь S. aureus Cowan I или S. aureus Wood 46 в концентрации 2х109 кл/мл и раствор антистафилококкового или нормального иммуноглобулина 1 мг/мл смешивали в равных объемах и инкубировали в течение 40 мин при 37°C.

После инкубации пробы разводили физиологическим раствором в 2 раза и регистрировали оптическую плотность суспензий при 470 нм, 510 нм, 550 нм, 590 нм и 630 нм на спектрофотометре Shimadzu UV mini-1240. Из значений ОП суспензий вычитали ОП раствора соответствующего иммуноглобулина. Волновые экспоненты рассчитывали по уравнению, (1) где n волновой экспонент;

длина волны. Расчеты диаметра частиц суспензии на основе волновых экспонентов проводили по алгоритму, представленному в работе Л. Б.

Королевской [9].

2.4. Источник биологического материала В исследованиях использована периферическая венозная кровь 81 условно здорового добровольца (56 мужчин и 25 женщин), средний возраст 33 года (от 18 до 62 лет).



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.