авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ...»

-- [ Страница 2 ] --

2.5. Культуры крови и определение концентрации цитокинов в супернатанах 10 мкл гепаринизированной (25 ЕД/мл) венозной крови условно здоровых добровольцев вносили в 190 мкл культуральной среды 199 (ООО «БиолоТ», Россия) с феноловым красным, содержащей 80 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L глютамина (Sigma, США), 10 мМ HEPES (Sigma, США) и 10 % ЭТС (ООО «БиолоТ», Россия), а также взвесь S. aureus Cowan I. Реакцию клеток на стафилококк сравнивали с их реакцией на другие агенты: неопсонизированный зимозан, липополисахарид (LPS;

Sigma) и фитогемагглютинин (PHA;

Serva).

Конечные концентрации стимуляторов в реакционной смеси составили:

стафилококки 1041010 кл/мл, неопсонизированный зимозан 0,1100 мкг/мл, LPS 0,1100 нг/мл, PHA 230 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение 24 ч при 37°С После суточного культивирования супернатанты [170].

центрифугировали (1500 g, 20 мин), и в надосадке определяли содержание цитокинов TNF-, IL-1, IL-1RА, IL-2, IL-4, IL-17, IFN- с помощью коммерческих реагентов (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции производителя. В некоторые культуры крови перед инкубацией со стафилококком добавляли трентал до конечной концентрации 500 мкмоль/л для ингибирования синтеза цитокинов [49;

107;

122].

2.6. Исследование поглотительной активности лейкоцитов Поскольку известно, что поглотительная активность лейкоцитов напрямую зависит от соотношения фагоцит/объект фагоцитоза [101], при исследовании фагоцитарных реакций использовались две концентрации стафилококков – 106 кл/мл и 108 кл/мл. Компоненты реакций готовили на растворе Хенкса без фенолового красного.

Лейкоциты из гепаринизированной (25 ЕД/мл) венозной крови выделяли путем обогащения в растворе декстрана сульфата 500 T (Loba Feinchemic) [101].

Концентрацию клеток доводили раствором Хенкса до 2х10 5 кл/мл по полиморфноядерным лейкоцитам. К 250 мкл суспензии лейкоцитов добавляли 250 мкл суспензии FITC-меченого стафилококка в концентрации 2х106 или 2х108 кл/мл и инкубировали 30 мин при 37°C. Последующие этапы проводили при 4°C. Пробы центрифугировали (1500 g, 5 мин), удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 1 мл лизирующего раствора (0,15М NH4Cl, 0,01М NaHCO3, 0,0001М ЭДТА, pH = 7,2). После выдерживания проб в темноте (5 мин) и повторного центрифугирования получали осадок, который ресуспендировали в 400 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с 0,0005М ЭДТА и хранили в темноте на льду до исследования.

В ряде экспериментов определяли влияние культуральной среды клеток цельной крови на реакцию интернализации стафилококков фагоцитами. Для этого цельные пулированные супернатанты вносили в реакционную смесь с таким расчетом, чтобы их количество составляло 10%, 25% и 70% от общего объема смеси.

Оценку поглощения FITC-меченых стафилококков [13] проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США;

Рисунок 1). По полученным результатам рассчитывали следующие показатели:

фагоцитарное число (ФЧ) – отношение средней интенсивности 1) флюоресценции одного поглотившего стафилококки фагоцита к средней интенсивности флюоресценции FITC-меченой бактериальной клетки;

фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, поглотивших объекты 2) фагоцитоза (ОФ);

интегральный показатель поглощения (ИПП): число ОФ, 3) поглощённых 100 фагоцитами (ИПП = ФЧ х ФИ).

Рисунок 1. Применение метода проточной цитометрии для анализа поглощения лейкоцитами периферической крови FITC-меченого S. aureus.

А гейтирование гранулоцитов и моноцитов по параметрам светорассеяния;

Б и В идентификация гранулоцитов (Б) и моноцитов (В), поглотивших FITC-меченые стафилококки (регион, обозначенный горизонтальной чертой с надписью «фагоцитоз»). По оси абсцисс: А интенсивность прямого светорассеяния;

Б и В интенсивность зелёной флюоресценции (FITC). По оси ординат: А интенсивность бокового светорассеяния;

Б и В число событий 2.7. Исследование люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов (ЛЗХЛ) Лейкоциты получали методом естественного оседания форменных элементов крови. Число сегментоядерных лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева. Их концентрацию доводили раствором Хенкса до 10 6 кл/мл. 10 мкл суспензии лейкоцитов вносили в лунки микропланшета, содержащие 10 мкл 100 мкМ раствора люминола и 10 мкл суспензии S. aureus Cowan I или Wood 46 в 107 концентрации или кл/мл (концентрация лейкоцитов и клеток стафилококков при проведении ЛЗХЛ соответствовала таковой при иссдедовании поглотительной активности фагоцитов). В ряде экспериментов вместо стафилококков в качестве стимуляторов использовали опоснизированный зимозан (см. раздел 2.1.2) и нерастворимые иммунные комплексы (см. раздел 2.1.3). Для определения влияния культуральной среды клеток цельной крови на ЛЗХЛ пулированные супернатанты вносили в реакционную смесь в том же количестве, что и при оценке влияния культуральной среды на поглотительную активность фагоцитов (см. раздел 2.5). Затем общий объём исследуемой пробы доводили раствором Хенкса до 100 мкл. Измерение люминесценции проводили при 37°С в течение 1 часа в динамическом режиме на микропланшетном люминометре «Luminoskan Ascent» («Thermo Electron Corporation», Финляндия). Интервал между замерами составлял 3 мин. Полученные результаты обрабатывали с помощью прилагающегося к прибору программного обеспечения «Ascent Software». Вычисляли площадь под кривой люминесценции. Результаты выражали в виде интегральных значений относительных световых единиц люминесценции В некоторых (relative luminescence light units, RLU).

экспериментах для определения влияния культуральной среды клеток цельной крови на реакции фагоцитоза вновь использовали цельные пулированные супернатанты (см. раздел 2.5).

2.8. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного и непарного t-критерия Стьюдента [11]. Сравнение показателей ИПП, RLU и концентраций цитокинов в культуральной среде проводили на основе логарифмированных величин (распределение величин в выборках не соответствовало нормальному). Результаты выражали в виде средних геометрических. Для определения влияния факторов применяли дисперсионный анализ;

силу влияния (2) факторов оценивали по Плохинскому [14].

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ НА ФАГОЦИТОЗ S. AUREUS Источником антител для исследования их влияния на фагоцитоз S. aureus послужили коммерческие препараты антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов. В качестве объектов фагоцитоза были использованы два штамма S. aureus, различающиеся по способности неспецифически связывать антитела за счёт экспрессии белка А на поверхности бактериальной клетки (см.

раздел 1.5.3.1 и 2.1.1). Предварительно была проведена проверка уровня неспецифического связывания антител стафилокками выбранных штаммов.

3.1. Связывание антител различными штаммами стафилококка в зависимости от содержания белка A в клеточной стенке бактерии Инкубация S. aureus Wood 46 (белок А) в растворе нормального иммуноглобулина (НИ) не оказывала существенного влияния на показатели ОП супернатантов (Рисунок 2): при всех использованных концентрациях бактерий содержание белка в растворе статистически достоверно не изменялось (PF0,05).

Иная картина наблюдалась при инкубации S. aureus Cowan I (белок А+).

Увеличение содержания микроорганизмов в суспензии приводило к снижению ОП Рисунок 2. Содержание белка в 0, супернатанте после инкубации стафилококков в растворе нормального иммуноглобулина. По оси абсцисс: концентрация 0, стафилококков, кл/мл;

по оси ординат: оптическая плотность супернатанта при 280 нм. Условные обозначения: – S. aureus Wood 46, 0, – S. aureus Cowan I. Представлены M±m 0, 0 10^8 10^9 10^ Все результаты, представленные в диссертации, получены автором лично.

надосадочного раствора (PF0,05).

Известно, что оптическая плотность белкового раствора прямо коррелирует с концентрацией в нём протеина. Если принять оптическую плотность исходного раствора нормального иммуноглобулина за 100%, то после добавления S. aureus Cowan I в количестве 1010 кл/мл общее содержание белка в растворе снижалось на 17%, (2) где х ОП надосадочного раствора нормального иммуноглобулина после добавления 1010 кл/мл S. aureus Cowan I;

у исходная ОП раствора нормального иммуноглобулина. Напротив, при внесении того же количества S. aureus Wood 46 заметного снижения ОП не происходило. Согласно данным Dryla A. et al., сыворотка крови человека может содержать не больше 3% IgG, взаимодействующих с антигенами стафилококков [45]. Поскольку доля и репертуар антистафилококковых IgG в препарате нормального иммуноглобулина соответствуют их содержанию в плазме крови здоровых людей, ОП раствора нормального иммуноглобулина при добавлении сколь угодно больших количеств бактериальных клеток не должна падать ниже, чем на 3%, если в системе имеет место только специфическое связывание антигенов и антител. Исходя из этого становится очевидно, что в системе НИS. aureus Cowan I происходит неспецифическое связывание антител бактериальными клетками, а в системе с Wood 46 нет.

3.2. Зависимость поглотительной активности гранулоцитов и моноцитов от опсонизирующей функции антител 3.2.1. Характер поглощения неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами При исследовании поглощения стафилококка без предварительной опсонизации антителами были получены следующие результаты. В условиях, когда к суспензии клеток добавлялось небольшое количество микробов (106 кл/мл), в поглощении участвовало всего 8,4±1,1% присутствовавших во взвеси гранулоцитов (Рисунок 3, А). Увеличение числа стафилококков до 108 кл/мл в 8,7 раз повышало долю клеток, вовлеченных в фагоцитоз (ФИ *** *** ** Рисунок 3. Поглощение неопсонизированного S. aureus Cowan I гранулоцитами (белые столбцы) и моноцитами (серые столбцы). А – ФИ, Б – ФЧ. По оси абсцисс – концентрация стафилококка в реакционной смеси, кл/мл;

по оси ординат графика А – показатель ФИ, по оси ординат графика Б – показатель ФЧ. Представлены M±m.

** P0,01;

*** – P0, 73,4±2,7%;

P0,001). Одновременно с ростом количества участвовавших в фагоцитозе клеток происходило увеличение удельной поглотительной активности гранулоцитов: их ФЧ возрастало с 0,8±0,02 до 2,4±0,2 (рост показателя в 3 раза;

P0,001;

Рисунок 3, Б).

Моноциты, присутствовавшие в лейкоцитарной взвеси, более эффективно поглощали неопсонизированный стафилококк по сравнению с гранулоцитами. В интернализации исходно небольшого числа бактерий (106 кл/мл) число участвовавших моноцитов превысило процент фагоцитировавших гранулоцитов и составило 24,3±3,6% (P0,01;

Рисунок 3, А). При высокой концентрации микроорганизмов (108 кл/мл) ФИ моноцитов оказался равен 95,0±0,7% (рост показателя в 3,9 раза;

P0,001). В этих условиях способность моноцитов к поглощению стафилококков вновь превзошла фагоцитарную активность гранулоцитов (P0,001;

Рисунок 3, А). При повышении концентрации бактерий наблюдалось увеличение ФЧ моноцитов с 0,8±0,04 до 7,7±0,7 соответственно (рост показателя в 9,6 раза;

P0,001;

Рисунок 3, Б). При 108 кл/мл стафилококков моноциты вновь демонстрировали более высокую удельную поглотительную активность по сравнению с гранулоцитами (P0,001;

Рисунок 3, Б).

Таким образом, повышение интенсивности фагоцитоза при увеличении концентрации неопсонизированных стафилококков происходило как за счёт роста числа поглощающих клеток, так и за счёт усиления интенсивности захвата объектов фагоцитоза. Показатели интернализации неопсонизированного стафилококка моноцитами почти всегда были достоверно выше соответствующих показателей, полученных для гранулоцитов.

3.2.2. Влияние нормального иммуноглобулина на фагоцитоз S. aureus Cowan I гранулоцитами и моноцитами Опсонизация S. aureus Cowan I нормальным иммуноглобулином усиливала как гранулоцитарный, так и моноцитарный фагоцитоз. При концентрации опсонизированных микроорганизмов 106 кл/мл доля поглощающих гранулоцитов составила 24,0±2,7%, что в 3 раза превышало значение соответствующего показателя, полученного при фагоцитозе неопсонизированного стафилококка (P0,001;

Рисунок 4, А). При этом значение ФЧ гранулоцитов существенно не менялось (1,5±0,1;

увеличение в 1,9 раза;

P0,001;

Рисунок 4, В). Показатели поглощения моноцитов при малой концентрации бактерий под влиянием опсонизации также достоверно увеличивались: ФИ до 41,7±3,6% (в 1,7 раза;

P0,01;

Рисунок 4, А), а ФЧ до 2,1±0,2 (в 2,6 раза;

P0,001;

Рисунок 4, В).

Влияние опсонизации при высокой концентрации стафилококков отражалось, главным образом, на функциях гранулоцитов. Их ФИ возрастал в 1, раз (до 91,7±1,5%;

P0,001;

Рисунок 4, Б), а ФЧ – в 4,6 раза (до 11,1±1,2;

P0,001;

*** ** *** *** *** *** *** Рисунок 4. Влияние опсонизации S. aureus Cowan I нормальным иммуноглобулином на показатели поглощения гранулоцитов и моноцитов. Белые столбцы неопсонизированный стафилококк, серые столбцы опсонизированный стафилококк. Концентрации бактерий в реакционной смеси: А и В 106 кл/мл, Б и Г – 108 кл/мл. По оси ординат графиков А и Б – показатель ФИ, по оси ординат графиков В и Г – показатель ФЧ. Представлены M±m. ** P0,01;

*** P0, Рисунок 4, Г). Усиление поглотительной активности моноцитов происходило только за счет повышения удельной интернализации: ФЧ моноцитов увеличился до 21,6±1,8 (в 2,8 раза;

P0,001;

Рисунок 4, Г). Доля моноцитов, участвовавших в поглощении больших количеств опсонизированных и неопсонизированных бактерий, не изменялась (95,0±0,7% и 96,1±1,0% соответственно;

P0,05;

Рисунок 4, Б).

При анализе вышеприведённых результатов обнаруживается и другая закономерность: показатели поглощения моноцитов достоверно превышают ФИ и ФЧ гранулоцитов во всех случаях. Следовательно, поглотительная активность моноцитов превосходит фагоцитарную активность гранулоцитов по отношению как к неопсонизированному, так и к опсонизированному стафилококку. Однако более наглядно поглотительную активность фагоцитов можно проиллюстрировать с помощью интегрального показателя поглощения (ИПП).

В присутствии малого числа бактерий соответствующие ИПП гранулоцитов и моноцитов составили: при поглощении неопсонизированного стафилококка 6, (ln=1,8±0,1) и 18,3 (ln=2,9±0,2;

P0,001), опсонизированного 33,4 (ln=3,5±0,1) и 81,3 (ln=4,4±1,2;

P0,001). С увеличением концентрации бактерий моноциты также проявляли большую поглотительную активность: в отсутствие иммуноглобулинов ИПП гранулоцитов 166,2 (ln=5,1±0,1), моноцитов 705, (ln=6,6±0,1;

P0,001);

после опсонизации нормальным иммуноглобулином ИПП гранулоцитов 1114,0 (ln=7,0±0,1), моноцитов 2017,6 (ln=7,6±0,1;

P0,001).

Кроме того, значения ИПП фагоцитов при поглощении опсонизированного стафилококка достоверно выше, чем при поглощении неопсонизированного.

Таким образом, анализ ИПП фагоцитов подтверждает вывод о положительном влиянии опсонизации на захват бактерий и большей поглотительной активности моноцитов.

Применение дисперсионного анализа для статистической обработки результатов в виде ИПП позволяет обнаружить ещё одну закономерность. Сила влияния (2) фактора опсонизации на поглотительную функцию гранулоцитов оказалась равна 27,1% (PF0,001;

Таблица 1). Тогда как для моноцитов её значение составило 17,8% (PF0,001;

Таблица 2). Следовательно, фагоцитоз гранулоцитов в большей степени зависит от опсонизациии бактерий антителами.

Подводя итог, можно сказать, что опсонизация положительно влияет на поглотительную активность фагоцитов. При этом моноциты в целом интенсивнее поглощают стафилококк, чем гранулоциты. (Повышенную активность моноцитов по отношению к неопсонизированному стафилококку можно объяснить наличием Таблица 1 Результаты дисперсионного анализа влияния опсонизации S. aureus Cowan I нормальным иммуноглобулином и концентрации бактерий на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Опсонизация антителами 27,1 (26,0-28,3) 100,1 0, Концентрация S. aureus 41,1 (40,3-42,6) 153,0 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 23,9 (22,7-25,0) 88,2 0, Влияние всех учтенных факторов 92,4 (90,1-94,8) 113,7 0, Таблица 2 Результаты дисперсионного анализа влияния опсонизации S. aureus Cowan I нормальным иммуноглобулином и концентрации бактерий на ИПП моноцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Опсонизация антителами 17,8 (16,6-19,0) 63,3 0, Концентрация S. aureus 59,3 (58,1-60,5) 210,5 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 15,0 (13,8-16,2) 53,2 0, Влияние всех учтенных факторов 92,1 (89,7-94,6) 109,0 0, на их мембранах большего по сравнению с гранулоцитами числа паттерн распознающих рецептров [75].) Эффективность фагоцитоза гранулоцитов в большей мере зависит от опсонизации S. aureus антителами, чем соответствующая функция моноцитов.

Исследование поглощения гранулоцитами и моноцитами стафилококков другого штамма Wood 46 (как неопсонизированного, так и опсонизированного) не выявило различий между свойствами двух типов фагоцитов (данные не приводятся).

Тот факт, что поглотительная активность гранулоцитов в большей степени зависит от опсонизирующих антител, а также то, что нейтрофилы, составляющие основную часть фракции гранулоцитов, являются ключевым звеном защиты макроорганизма от стафилококковой инфекции (см. раздел 1.5.2), стали основанием для выбора гранулоцитов в качестве объекта для тестирования опсонизирующей функции антистафилококкового иммуноглобулина (АСИ). Для простоты расчётов дальнейшую оценку реакции интернализации гранулоцитов проводили с использованием ИПП.

3.3. Влияние АСИ на поглощение S. aureus гранулоцитами 3.3.1. Исследование поглощения неопсонизированных стафилококков Интенсивность поглощения неопсонизированных стафилококков гранулоцитами периферической крови зависела от штамма и количества микроорганизмов, внесенных в систему. При большой концентрации бактерий (108 кл/мл) значение ИПП гранулоцитов в присутствии бактерий штамма Wood составило 41,2 (ln=3,718±0,199;

Рисунок 5), а при внесении Cowan I – 166, (ln=5,113±0,123;

P0,001). Различия в интенсивности поглощения S. aureus Wood 46 и Cowan I при невысоком их содержании в реакционной смеси (106 кл/мл) отсутствовали: ИПП фагоцитов 4,5 (ln=1,505±0,202) и 6, (ln=1,846±0,121) соответственно (P0,05). Таким образом, при избыточном количестве в реакционной смеси неопсонизированных бактерий (1000 на полиморфноядерный лейкоцит) процесс интернализации гранулоцитами S. aureus Cowan I осуществлялся в 4 раза активнее по сравнению с поглощением S. aureus Wood 46.

Рисунок Поглощение 5.

неопсонизированного S. aureus Wood 46 (белые столбцы) и *** S. aureus Cowan I (серые столбцы) гранулоцитами периферической крови. По оси абсцисс:

концентрации микроорганизмов в реакционной смеси, кл/мл;

по оси ординат: интегральный показатель поглощения гранулоцитов.

Представлены средние геометрические и их ошибки.

*** P0, 3.3.2. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Wood После опсонизации S. aureus Wood 46 специфическим иммуноглобулином были получены следующие показатели интернализации микробов фагоцитами.

При низкой концентрации (106 кл/мл) бактерий ИПП гранулоцитов составил 214, (ln=5,367±0,118), а в условиях высокого их содержания (10 8 кл/мл) 2149, (ln=7,673±0,087). Сравнение этих данных с аналогичными результатами, полученными без опсонизации, показало увеличение поглотительной активности гранулоцитов под влиянием АСИ соответственно в 47,8 и 52,2 раза. Различия в обоих случаях были высоко достоверны (P0,001).

Вместе с тем, в контрольном исследовании, в котором для опсонизации бактерий использовали НИ, процесс интернализации стафилококков гранулоцитами протекал более активно. В смеси, содержащей 106 микробов в мл, показатель ИПП составил 350,3 (ln=5,859±0,317), а при 100-кратно большей концентрации стафилококков – 2883,8 (ln=7,967±0,054). В первом случае под влиянием опсонинов поглощение стафилококков увеличилось в 78,0 раз (P0,001), во втором – в 70,0 раз (P0,001). Из полученных результатов следует, что в отношении стафилококка, не содержащего белок A на своей поверхности, антистафилококковый иммуноглобулин обладает менее выраженными опсонизирующими свойствами, чем препарат нормального иммуноглобулина (PАСИ-НИ0,05 при концентрации ОФ 108 кл/мл;

Рисунок 6, А).

Этот вывод подтверждается результатами дисперсионного анализа, выполненного на основе ИПП фагоцитов (Таблица 3 и Таблица 4): рост интенсивности поглощения стафилококков под влиянием нормального иммуноглобулина на 50% обусловлен опсонизацией. В том случае, когда опсонизирующим агентом являлся антистафилококковый иммуноглобулин, влияние фактора снижалось до 39%. Следует также отметить существенное и статистически достоверное влияние сочетанного действия факторов опсонизации и концентрации стафилококков. Это означает, что два фактора, каждый из которых в отдельности усиливают поглотительную активность гранулоцитов, потенцируют действие друг друга.

* * ** Рисунок 6. Интенсивность поглощения гранулоцитами S. aureus Wood 46 (А) и S. aureus Cowan I (Б), опсонизированных антистафилококковым (белые столбцы) и нормальным (серые столбцы) иммуноглобулинами. По оси абсцисс: концентрация стафилококков в реакционной смеси, кл/мл;

по оси ординат: ИПП гранулоцитов.

Представлены средние геометрические и их ошибки. * P0,05;

** P0, Таблица 3 Результаты дисперсионного анализа влияния опсонизации S. aureus Wood 46 антистафилококковым иммуноглобулином и концентрации бактерий на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Опсонизация антителами 39,2 (38,4-40,1) 186,9 0, Концентрация S. aureus 28,6 (27,7-29,5) 136,1 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 26,3 (25,4-27,2) 125,2 0, Влияние всех учтенных факторов 94,1 (92,3-95,9) 149,4 0, Таблица 4 Результаты дисперсионного анализа влияния опсонизации S. aureus Wood 46 нормальным иммуноглобулином и концентрации бактерий на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Опсонизация антителами 50,1 (49,2-51,0) 231,6 0, Концентрация S. aureus 22,8 (21,8-23,7) 105,5 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 21,1 (20,2-22,0) 97,4 0, Влияние всех учтенных факторов 93,9 (92,1-95,8) 144,7 0, 3.3.3. Влияние АСИ на поглощение S. aureus Cowan I Опсонизация специфическим иммуноглобулином усиливала поглощение стафилококка штамма Cowan I. В присутствии небольшого числа бактерий ( кл/мл) ИПП гранулоцитов составил 19,9 (ln=2,992±0,107) и в 3,2 раза превышал (P0,001) уровень поглощения неопсонизированных объектов. При высоком содержании микробов (108 кл/мл) ИПП гранулоцитов оказался равен 621, (ln=6,433±0,170). Показатель вырос в 3,7 раза относительно соответствующего ИПП, полученного без опсонизации стафилококка (P0,01).

В контрольном исследовании опсонизация S. aureus Cowan I НИ способствовала ещё более интенсивному поглощению бактерий. При малой концентрации микробов значение ИПП гранулоцитов достигло 33, (ln=3,508±0,132), что в 5,3 раза больше показателя (P0,001) при поглощении стафилококков в отсутствие опсонинов. В условиях избытка бактерий величина ИПП составила 1114,0 (ln=7,016±0,082). Интенсивность поглощения возросла в 6,7 раза (P0,001) по сравнению с активностью захвата неопсонизировнаных стафилококков.

Таким образом, опсонизирующие свойства антистафилококкового иммуноглобулина по отношению к другому штамму S. aureus (содержащему белок A на своей поверхности) вновь уступают свойствам препарата сравнения.

Показатели контрольного исследования с НИ достоверно превышали соответствующие значения, полученные при опсонизации Cowan I АСИ (PАСИ и PАСИ-НИ0,05 при малой и большой концентрации бактерий НИ0, соответственно;

Рисунок 6, Б). Сила влияния (2) фактора опсонизации в контрольном исследовании составила 27% (Таблица 1), тогда как в эксперименте с антистафилококковым иммуноглобулином она оказалась равна 15,7% (Таблица 5).

Объединяя эти данные с результатами, предствленными в разделе 3.3.2, можно утверждать, что независимо от присутствия белка А на поверхности стафилококка опсонизирующие свойства специфического иммуноглобулина выражены слабее, чем опсонизирующие свойства нормального иммуноглобулина.

Таблица 5 Результаты дисперсионного анализа влияния опсонизации S. aureus Cowan I антистафилококковым иммуноглобулином и концентрации бактерий на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Опсонизация антителами 15,7 (11,8-19,7) 17,0 0, Концентрация S. aureus 48,1 (44,1-52,1) 51,8 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 13,9 (9,9-17,9) 14,9 0, Влияние всех учтенных факторов 77,7 (69,3-86,1) 27,9 0, 3.3.4. Влияние штамма стафилококков на поглотительную активность гранулоцитов На основании данных в разделах 3.3.1-3.3.3 можно дать оценку влияния штамма стафилококков на интенсивность их поглощения гранулоцитами. Как было показано ранее (см. раздел 3.3.1), фагоциты менее активно захватывали неопсонизированный S. aureus Wood 46 по сравнению с бактериями штамма Cowan I. При опсонизации бактерий антителами ситуация менялась. При невысоком содержании микробов Wood 46 и Cowan I, опсонизированных специфическим иммуноглобулином, соответствующие значения ИПП гранулоцитов составили 214,3 (ln=5,367±0,118) и 19,9 (ln=2,992±0,107;

различие в 10 раз;

P0,001). При 100-кратно большей концентрации бактерий соответствующие значения ИПП были 2149,0 (ln=7,673±0,087) и 621, (ln=6,433±0,170;

различие в 3,5 раза;

P0,001). То есть показатели фагоцитоза опсонизированных бактерий штамма Wood 46 превосходили ИПП фагоцитов при поглощении S. aureus Cowan I.

Схожие результаты были получены при опсонизации Wood 46 и Cowan I нормальным иммуноглобулином. Соответствующие пары значений ИПП составили: при концентрации микробов 106 кл/мл – 350,3 (ln=5,859±0,317) и 33, (ln=3,508±0,132;

различие в 10,5 раз;

кл/мл – P0,001), 2883, (ln=7,967±0,054) и 1114,0 (ln=7,016±0,082;

различие в 2,6 раза;

P0,001). Вновь поглощение опсонизированного S. aureus Wood 46 превосходило интенсивность фагоцитоза бактерий штамма Cowan I. Таким образом, опсонизированный антителами белок является более A-негативный S. aureus Wood «привлекательным» объектом фагоцитоза, чем опсонизировнный теми же антителами белок A-позитивный S. aureus Cowan I. Учитывая, что поглощение S.

aureus Wood 46 в отсутствие антител происходит достаточно слабо, опсонизация иммуноглобулинами имеет большее значение для фагоцитоза S. aureus Wood 46.

3.3.5. Сравнительная характеристика опсонизирующих свойств антистафилококкового и нормального иммуноглобулинов В предыдущих разделах были представлены доказательства того, что фактор опсонизации оказывает значительное влияние на интенсивность поглощения стафилококков. Чтобы оценить влияние специфичности препратов на эффективность поглощения, статистический анализ полученных значений ИПП нужно провести без учёта данных по интернализации неопосонизированных бактерий. Результаты дисперсионного анализа, представленные в Таблицах 6 и 7, показывают, что интенсивность интернализации стафилококков обоих штаммов зависит от специфичности иммуноглобулинов не более чем на 4%. Для биологических объектов такую величину вряд ли можно считать существенной, несмотря на высокую достоверность статистической оценки (PF0,01 в обоих случаях). Это означает, что различия в содержании опсонизирующих антител в двух препаратах невелики. И основным фактором, который обуславливает интенсивность поглощения опсонизированных стафилококков, становится концентрация объектов фагоцитоза.

Таблица 6 Результаты дисперсионного анализа влияния типа опсонинизирующих иммуноглобулинов и концентрации S. aureus Wood 46 на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Тип иммуноглобулина 4,0 (2,4-5,6) 10,6 0, Концентрация S. aureus 85,2 (83,7-86,8) 225,7 0, Влияние всех учтённых факторов 89,4 (86,1-92,7) 78,9 0, Таблица 7 Результаты дисперсионного анализа влияния типа опсонинизирующих иммуноглобулинов и концентрации S. aureus Cowan I на ИПП гранулоцитов Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Тип иммуноглобулина 4,2 (2,3-6,2) 9,2 0, Концентрация S. aureus 83,0 (81,1-85,0) 180,7 0, Взаимодействие факторов концентрации и опсонизации 3,5 (1,5-5,5) 7,7 0, Влияние всех учтённых факторов 90,8 (86,5-95,1) 65,9 0, 3.4. Спектротурбидиметрическое определение изменения средних размеров частиц стафилококковых суспензий под влиянием иммуноглобулинов В предыдущих разделах было показано, что различия опсонизирующих свойств иммуноглобулинов, а также штамм стафилококка отражаются на интенсивности поглощения микробов. Поскольку известно, что размер частицы оказывает влияние на активность её захвата фагоцитом [34;

85], следующим шагом в тестировании свойств антистафилококкового иммуноглобулина было определение средних размеров частиц суспензий клеток S. aureus при их опсонизации антителами.

По данным спектротурбидиметрических измерений средний диаметр клеток неопсонизированных S. aureus Wood 46 и Cowan I составлял 694,1±5,8 и 608,5±4, нм соответственно. Полученные значения согласуются с установленными размерами бактерий рода стафилококк (см. раздел 1.2).

Добавление раствора АСИ к взвеси S. aureus Wood 46 (Рисунок 7) приводило к увеличению среднего диаметра стафилококков с 694,1±5,8 до 925,1±8,3 нм (различие составило 231 нм;

P0,001). В параллельном исследовании с раствором НИ средний размер частиц во взвеси оказался равен 946,6±6,2 нм (на 252,5 нм больше по сравнению с размером неопсонизированных бактерий;

P0,001). Различие средних диаметров S. aureus Wood 46, обработанных АСИ и НИ, составило 21,5 нм (P0,02). То есть под влиянием препарата сравнения увеличение среднего диаметра стафилококков происходило более интенсивно, чем в присутствии антистафилококкового иммуноглобулина.

При инкубации штамма Cowan I в растворе НИ средний размер частиц взвеси увеличился с 608,5±4,3 до 698,5±1,9 нм (на 90 нм;

P0,001). Но эта Рисунок 7.

-0, Спектротурбидиметрические показатели суспензий неопсонизированного и опсонизированного АСИ и НИ S. aureus Wood 46. По оси абсцисс: lg длины -0, волны;

по оси ординат: lg оптической плотности. Условные обозначения:

+ неопсонизированный стафилококк, – взвесь бактерий, инкубированных в -0, растворе АСИ, – то же, но в растворе НИ. Прямые, соединяющие точки, линии тренда. Угол наклона линии тренда к оси абсцисс обратно пропорционален среднему размеру -0, 2,65 2,70 2,75 2, частиц суспензии величина была существенно меньше средних размеров частиц опсонизированного штамма Wood 46 (P0,001).

Таким образом, препараты иммуноглобулинов увеличивают средний размер частиц стафилококковой суспензии. Укрупнение частиц суспензий выражено ярче в присутствии нормального иммуноглобулина. Препараты оказывают меньшее влияние на увеличение размеров частиц S. aureus Cowan I, чем на клетки штамма Wood 46.

3.5. Исследование влияния АСИ на ЛЗХЛ лейкоцитов Внесение в реакционную смесь бактерий в концентрации 10 6 кл/мл (как неопсонизированных, так и опсонизированных) индуцировало очень слабый по сравнению с нестимулированными лейкоцитами ответ. Достоверных различий между группами не выявлено (данные не приводятся).

Уровень хемилюминесценции лейкоцитов, стимулированных неопсонизированными стафилококками штамма Wood 46 в концентрации 108 кл/мл, составил 117,1 (ln=4,763±0,215) RLU (Рисунок 8). Опоснизация бактерий антителами усиливала реакцию фагоцитов. Уровень ЛЗХЛ достигал 176,3 (ln=5,172±0,292) и 176,7 (ln=5,175±0,306) RLU при опсонизации S. aureus Wood 46 АСИ и НИ соответственно (P0,01). Однако специфичность Рисунок Люминолзависимая 8.

## хемилюминесценция лейкоцитов, стимулированных 10 кл/мл S. aureus ## Wood 46 и S. aureus Cowan I. По оси ## ординат: интегральные значения # относительных световых единиц (relative luminescence light units (RLU)). Чёрные столбцы – неопсонизированный стафилококк, белые столбцы – опсонизация бактерий АСИ, серые столбцы – опсонизация бактерий НИ.

Представлены средние геометрические и их ошибки. # P0,02;

## P0, иммуноглобулинов не отразилась на интенсивности люминесценции (PАСИ НИ0,05).

Подобные результаты были получены при исследовании влияния препаратов антител на ЛЗХЛ при поглощении S. aureus Cowan I. В присутствии бактерий в концентрации 108 кл/мл уровень ЛЗХЛ составил 79,3 (ln=4,373±0,369) RLU.

Опсонизация микробов АСИ и НИ способствовала повышению образвания активных форм кислорода (АФК) фагоцитами: показатели ЛЗХЛ выросли до 133, (ln=4,892±0,250;

P0,02) и 139,4 (ln=4,938±0,249;

P0,01) RLU соответственно.

Вновь специфичность препаратов не оказала влияния на величину ответа лейкоцитов (PАСИ-НИ0,05).

Определённое влияние на интенсивность люминесценйии оказывал штамм микроорганизма. Неопсонизированные стафилококки индуцировали одинаковый ответ лейкоцитов в ЛЗХЛ (PWood-Cowan0,05). Однако после опсонизации бактерий АСИ или НИ S. aureus Wood 46 стимулировал более интенсивное образование АФК, чем S. aureus Cowan I (PWood-Cowan0,01 для бактерий, опсонизированных АСИ и PWood-Cowan0,03 для стафилококков, опсонизированных НИ).

Таким образом, специфический иммуноглобулин, как и контрольный препарат, позволяли усиливать выработку свободных радикалов фагоцитами в 1,51,7 раза. Однако как антистафилококковый иммуноглобулин, так и препарат сравнения оказывали одинаковое влияние на ЛЗХЛ. Опсонизированный S. aureus являлся более сильным активатором люминесценции, чем Wood опсонизированный S. aureus Cowan I.

Выводы, полученные на основании проведённого исследования:

Определено, что опсонизация S. aureus антителами многократно 1.

усиливает захват стафилококков фагоцитами, при этом образование клетками активных форм кислорода увеличивается в меньшей степени.

Установлено, что опсонизирующая активность антистафилококкового 2.

иммуноглобулина по отношению к S. aureus уступает таковой препарата сравнения нормального иммуноглобулина человека;

это выражается в менее интенсивном поглощении стафилококков и в меньшей степени агрегации S. aureus в присутствии антистафилококкового иммуноглобулина. Однако оба препарата в равной мере усиливают продукцию активных форм кислорода фагоцитами при поглощении S. aureus.

3.6. Обсуждение Таким образом, в данной главе представлены результаты исследования опсонизирующих свойств антистафилококковго иммуноглобулина, предназначенного для лечения инфекций стафилококковой этиологии. Препаратом сравнения послужил иммуноглобулин человеческий нормальный. Оценка опсонизирующих свойств препаратов основывалась главным образом на показателях активности фагоцитарных реакций гранулоцитов периферической крови человека в системе in vitro. Установлено, что антистафилококковый иммуноглобулин помимо заявленных производителем антитоксических свойств обладает по отношению к стафилококку опсонизирующей активностью. Её выраженность сопоставима с таковой препарата сравнения. Так, оба препарата в несколько раз усиливают поглощение стафилококков гранулоцитами вне зависимости от способности бактерий неспецифчески связывать антитела. Однако по ряду показателей опсонизирующая активность антистафилококкового иммуноглобулина несколько уступает соответствующей функции нормального иммуноглобулина. В присутствии контрольного препарата реакция поглощения стафилококков выражена сильнее.

Измерение среднего размера частиц суспензии методом спектротурбидиметрии также позволило обнаружить различия в опсонизирующей активности двух препаратов. Спектротурбидиметрические параметры опсонизированных и неопсонизированных бактерий дают представление о среднем размере частиц суспензии [7]. Рост последнего при опсонизации может быть обусловлен, на наш взгляд, двумя процессами: образованием оболочки опсонинов вокруг бактерий и агрегацией микробов за счет перекрестного «сшивания» специфическими антителами. Если в качестве ведущего фактора рассматривать первый вариант, то, исходя из среднего размера молекулы IgG ( нм) [133], толщина гипотетического слоя иммуноглобулинов должна превышать величину молекулы IgG более чем в 10 раз, что маловероятно. По-видимому, ключевую роль в изменении среднего размера микробных частиц играет образование агрегатов бактерий под влиянием антител. Исходя из того, что средний диаметр частиц S. aureus Wood 46 в присутствии нормального иммуноглобулина оказался достоверно больше, чем в присутствии антистафилококкового, можно предположить, что контрольный препарат содержит большее по сравнению со специфическим количество антистафилококковых антител.

Образование агрегатов бактерий может оказать влияние на интенсивность поглощения, поскольку известно, что скорость реакций фагоцитоза зависит от размера поглощаемых частиц [34;

85]. Например, по данным Champion J.A. et al.

наиболее интенсивное нарастание скорости фагоцитоза происходит при увеличении диаметра частиц от 0,93 до 2-3 мкм. Возможно, поэтому данные спектротурбидиметрии соответствовали показателям поглощения опсонизированных объектов гранулоцитами: чем больше был средний размер частиц в суспензии, тем активнее их захватывали фагоциты. Средний диаметр частиц S. aureus Wood 46 в присутствии НИ оказался больше, чем в растворе АСИ.

Их интернализация также протекала более активно. Средний размер частиц суспензии S. aureus Cowan I в НИ был меньше, чем средний размер частиц взвесей S. aureus Wood 46 в любом из иммуноглобулинов. И уровень поглощения фагоцитами опсонизированных стафилококков Cowan I был существенно ниже по сравнению с соответствующими показателями, установленными для штамма Wood 46. Следовательно, большая степень агрегации бактерий под влиянием нормального иммуноглобулина отражается на интенсивности поглощения опсонизированных стафилококков.

При фагоцитозе стафилококков происходит запуск кислородзависимых механизмов бактерицидности в лейкоцитах. Продукция свободных радикалов усиливается после предварительной опсонизации микроорганизмов антистафилококковым иммуноглобулином. Однако при достаточно сильном влиянии на поглощение, опсонизация антителами не имеет столь выраженного воздействия на ЛЗХЛ. Кроме того, эффект опсонизации препаратами иммуноглобулинов проявляется только при контакте фагоцитов с большим количеством микроорганизмов. Несмотря на установленные ранее отличия в опсонизирующей активности, антистафилококковый и нормальный иммуноглобулины внесли равный вклад в усиление ЛЗХЛ.

Следует особо отметить, что регистрация люминесценции лейкоцитов осуществлялась в присутствии аутосыворотки доноров. В предварительных экспериментах, когда сыворотка удалялась путём отмывания лейковзвеси, опсонизированный и неопсонизированный стафилококки индуцировали одинаковый уровень ответа лейкоцитов в ЛЗХЛ (данные не приводятся).

Известно, что комплемент сыворотки является существенным для развития максимального бактерицидного ответа нейтрофилов при поглощении стафилококков [25;

151]. Таким образом, в наших экспериментах присутствие аутосыворотки как источника комплемента позволило обнаружить положительное влияние преопсонизации стафилококков антителами на выработку активных форм кислорода лейкоцитами. В целом полученные результаты показывают, что опсонизирующая функция антител главным образом усиливает захват бактерий и слабо влияет на генерацию свободных радикалов фагоцитами.

На реализацию свойств иммуноглобулинов оказал влияние штамм микроорганизмов. Опсонизированный S. aureus Wood 46 оказался более сильным активатором ЛЗХЛ. С одной стороны это может быть связано с большим размером опсонизированных бактерий, а, следовательно, и количеством доступных для фагоцитарных Fc-рецепторов соответствующих фрагментов иммуноглобулинов. С другой стороны, на уровень ЛЗХЛ влияет характер взаимодействия антител с бактериальной клеткой. Показано, что уровень ЛЗХЛ коррелирует с количеством IgG, специфически связанного с поверхностными структурами микроорганизма [190]. При этом молекулы иммуноглобулина, взаимодействующие с белком A (присутствует на поверхности S. aureus Cowan I) через Fc-фрагмент, на хемилюминесцентный ответ лейкоцитов не влияют [190]. Следовательно, неспецифически связывая антистафилококковые антитела, белок А может вносить свой вклад в снижение уровня ЛЗХЛ фагоцитов, препятствуя развитию полноценной фагоцитарной реакции. Причинами низкого уровня регистрируемой хемилюминесценции фагоцитов также может быть наличие у золотистого стафилококка факторов, которые разрушают активные формы кислорода:

стафилоксантин, супероксиддисмутаза и редуктаза [43;

66;

104;

178].

Необходимо учесть, что результаты проведенных исследований ЛЗХЛ в основном отражают продукцию АФК нейтрофилами. Это связано со специфичностью взаимодействия люминола с АФК. Из всего спектра кислородзависимых соединений, продуцируемых лейкоцитами, люминол окисляется преимущественно гипохлорит-анионом – продуктом миелопероксидазы [42;

Основным источником фермента являются 154].

азурофильные гранулы нейтрофилов [29]. Содержание миелопероксидазы в моноцитах намного меньше, чем в нейтрофилах [172], и доля моноцитов в лейковзвеси также мала. Кроме того, моноциты вырабатывают меньше АФК, чем нейтрофилы [121].

Объяснение существования различий в опсонизирующих свойствах двух иммуноглобулинов можно найти в способе производства этих препаратов. НИ получают из образцов сыворотки крови не менее тысячи здоровых доноров (из инструкции к препарату). Учитывая, что около 20% людей не являются носителями стафилококка [94] и отличаются продукцией к нему защитных антител [45], большое число образцов сывороток, используемых для производства препарата, обеспечивает наличие опсонизирующих антител к «ключевым» для защиты антигенам. В то же время, решающим фактором для отбора сывороток при производстве антистафилококкового иммуноглобулина является титр антистафилолизина. Доноров подвергают иммунизации стафилококковым анатоксином. Это, в свою очередь, может снижать количество антител других специфичностей [143;

159].

Однако, как показывают результаты сравнительного анализа влияния препаратов на поглотительную реакцию фагоцитов, различия опсонизирующих свойств иммуноглобулинов довольно незначительны. На количество свободных радикалов кислорода при поглощении стафилококков лейкоцитами специфичость иммуноглобулинов не оказывает никакого влияния. Поэтому, с нашей точки зрения, маловероятно, что выявленные различия опсонизирующей активности иммуноглобулинов в системе in vitro будут иметь значение in vivo.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА ФАГОЦИТОЗ S. AUREUS COWAN I В материалах данной главы представлены результаты, позволяющие проследить синтез цитокинов в суточных культурах крови в присутствии стафилококков: TNF-, IL-1 и IL-1RА как основных представителей про- и противовоспалительных медиаторов, а также IFN-, IL-2, IL-17 и IL-4 как цитокинов, характерных для различных видов Т-хелперного ответа. Также проведена оценка степени влияния цитокинов на фагоцитарные реакции гранулоцитов: процесс интернализации объектов фагоцитоза (S. aureus Cowan I) и связанную с ним ЛЗХЛ. Изложение результатов заключает сравнительный анализ реакции лейкоцитов на различные объекты фагоцитоза в ЛЗХЛ.

4.1. Цитокиновый профиль суточных культур клеток цельной крови, активированных различными стимуляторами 4.1.1. Секреция TNF- в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I Базовый уровень секреции TNF- составил 1,2 (ln=0,154±0,688) пг/мл, а статистически достоверный рост содержания TNF- в культуральной среде наблюдался уже при концентрации клеток стафилококка 104 кл/мл и оказался равен 13,7 (ln=2,615±0,075) пг/мл (P0,05;

Рисунок 9). Увеличение содержания бактерий в среде сопровождалось непрерывным ростом количества TNF-.

Концентрация последнего достигла максимума при 108 кл/мл стафилококка и составила 1505,7 (ln=7,317±0,382) пг/мл. Дальнейшее увеличение содержания бактерий вызвало падение количества цитокина в 1,72,7 раза (P0,03) по сравнению с пиковой концентрацией.

4.1.2. Секреция IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I Зависимость выработки IL-1 от количества стафилококка имела схожий с Рисунок 9. Содержание TNF- (), IL-1 () и IL-1RА () в супернатантах суточных культур * клеток крови, активированных S. aureus Cowan I. По оси абсцисс:

концентрация бактерий в реакционной смеси, кл/мл;

0 – пробы без активатора. По оси ординат:

* концентрация цитокинов в * супернатанте, пг/мл. Представлены средние геометрические и их ошибки. * P0,05 по сравнению с неактивированными образцами продукцией TNF- характер (Рисунок 9). Базовый уровень цитокина в культуральной среде оказался ниже уровня чувствительности тест-системы.

Достоверный рост концентрации IL-1 по сравнению с контрольными пробами зарегистрирован при содержании стафилококка 105 кл/мл. Соответствующее значение концентрации IL-1 составило 13,0 (ln=2,561±0,295) пг/мл (P0,02).

Максимальный уровень секреции IL-1 так же, как и TNF-, наблюдался при 108 кл/мл бактерий и оказался равен 2200,7 (ln=7,697±0,210) пг/мл. При дальнейшем увеличении количества стимулятора следовало снижение выработки IL-1 (P0,02).

Совершенно иная картина наблюдалась при регистрации продукции рецепторного антагониста IL-1 клетками крови в ответ на S. aureus Cowan I (Рисунок 9). Прежде всего, обращал на себя внимание высокий уровень его базовой секреции 31,1 (ln=3,438±0,177) пг/мл. Кроме того, уже при 104 кл/мл стафилококков концентрация IL-1RА достигла наивысшего значения 751, (ln=6,621±0,233) пг/мл (P0,02) и оставалась на этом уровне даже при увеличении количества бактерий в 1000 раз (до 107 кл/мл). Затем происходило постепенное угнетение выработки цитокина до значений, приближающихся к концентрации IL 1RА в контрольных пробах.

Таким образом, полученные результаты показали, что продукция TNF- и IL-1 динамично нарастала при увеличении числа стафилококков в реакционной смеси;

после достижения пиковой концентрации медиаторов наступала фаза торможения секреции. Следует отметить, что обнаружение TNF- в концентрациях, отличных от его количества в контрольных пробах, в культуральной среде было возможно при меньших концентрациях стимулятора, чем обнаружение IL-1. В отличие от продукции IL-1 и TNF- секреция IL-1RА носила иной характер. Обращали на себя внимание высокий уровень базовой секреции и подъём выработки до максимального уровня при небольших концентрациях стафилококков. В отличие от выработки провоспалительных медиаторов для продукции IL-1RА была характерна широкая зона плато и более глубокое угнетение секреции цитокина (до уровня базовой секреции) в присутствии большого числа бактерий. Из этого следует, что начало, пик и спад выработки медиатора противовоспалительной направленности IL-1RА происходило при меньшем количестве стимулятора, чем это требуется для TNF и IL-1. Примечательно, что в супернатантах культур крови уровень рецепторного антагониста всегда превышал содержание IL-1, но лишь до того момента, когда стафилококков достигла концентрация кл/мл. При этом количестве стимулятора незначительное снижение концентрации IL-1RА (в 1,5 раза по сравнению с предыдущим значением;

P0,02) сопровождалось резким увеличением содержания IL-1 (в 6,2 раза;

P0,01): наблюдался «концентрационный перекрест».

4.1.3. Секреция TNF-, IL-1 и IL-1RА в суточных культурах клеток цельной крови, стимулированных LPS, PHA и зимозаном Концентрационная зависимость синтеза TNF-, IL-1 и IL-1RА в культурах крови при воздействии LPS, PHA и зимозана имела схожий характер. TNF появлялся в культуральной среде при меньших концентрациях стимуляторов и вырабатывался в большем количестве, чем IL-1. Секреция IL-1RА предшествовала появлению IL-1 в культуральной среде и всегда превышала её.

«Концентрационный перекрест» и запредельное торможение секреции цитокинов не наблюдались (Рисунок 10).

Анализ выработки цитокинов под влиянием оптимальных концентраций каждого из активаторов показал следующее. Стафилококк значительно эффективнее по сравнению с другими стимуляторами индуцировал выработку IL 1. Соответствующие концентрации цитокина в культурах с оптимальным количеством S. aureus Cowan I, LPS, PHA и зимозана составили: 2200, (ln=7,697±0,210), 351,8 (ln=5,863±0,309;

P0,05), 573,1 (ln=6,351±0,078;

P0,01) и 131,7 (ln=4,881±0,264;

P0,01) пг/мл. Интенсивность продукции TNF- под влиянием бактерий (1505,7 (ln=7,317±0,382) пг/мл) статистически достоверно отличалась от уровня его синтеза в культурах с зимозаном (242,3 (ln=5,490±313) * * ** * ** ** * * * Рисунок 10. Содержание TNF- (), IL-1 () и IL-1RА () в супернатантах суточных культур * крови, активированных LPS, PHA и зимозаном. По оси абсцисс:

концентрация стимуляторов в ** * реакционной смеси: LPS – нг/мл, PHA * – мкг/мл и зимозан – мкг/мл;

0 неактивированные образцы. По оси ординат: концентрация цитокинов в супернатанте, пг/мл. Представлены средние геометрические и их ошибки.

* P0,05;

** P0,01 по сравнению с неактивированными образцами пг/мл) (P0,05). Таким образом, из всех использованных стимуляторов, стафилококк оказался самым мощным активатором выработки TNF- и IL-1 в культурах цельной крови.

Концентрации IFN-, IL-2, IL-17 и IL-4 в суточных культурах крови в присутствии стафилококка, LPS или зимозана не отличались от базового уровня при всех использованных концентрациях этих стимуляторов (Таблицы 8, 9 и 11).

Выработка этих цитокинов происходила лишь в присутствии PHA (Таблица 10).

Таким образом, выработка TNF-, IL-1 и IL-1RА в суточных культурах под влиянием стафилококков, LPS, PHA и зимозана имеет схожий характер: секреция рецепторного антагониста доминирует над выработкой IL-1, TNF обнаруживается в культуральной среде при меньших концентрациях стимуляторов. Из всех использованных индукторов синтеза цитокинов стафилококк является наиболее сильным стимулятором выработки TNF- и IL-1.


Выработки IFN-, IL-2, IL-17 и IL-4 под действием стафилококка (как и в присутствии LPS и зимозана) в течение первых суток культивирования цельной крови не происходит.

Таблица 8 Продукция цитокинов в суточных культурах цельной крови, стимулированых S. aureus Cowan I В пг/мл Концентрация S. aureus Cowan I в культурах крови, кл/мл Цитокин 104 105 106 107 108 109 5,0 4,7 4,3 4,9 5,4 6,8 4,8 5, IL- (ln=1,614 (ln=1,547 (ln=1,453 (ln=1,581 (ln=1,693 (ln=1,920 (ln=1,572 (ln=1, ±0,163) ±0,373) ±0,739) ±0,284) ±0,372) ±0,394) ±0,332) ±0,207) 1,7 1,2 3,2 3,3 3,1 7,2 6,5 4, IFN (ln=0,557 (ln=0,212 (ln=1,178 (ln=1,196 (ln=1,139 (ln=1,978 (ln=1,878 (ln=1, ±0,787) ±1,127) ±0,777) ±0,598) ±0,640) ±0,510) ±0,560) ±0,752) 1,0 0,9 0,9 0,9 0,8 1,0 1,1 0, IL- (ln=0,023 (ln=-0,156 (ln=-0,059 (ln=-0,144 (ln=-0,265 (ln=0,037 (ln=0,131 (ln=-0, ±0,509) ±0,361) ±0,236) ±0,309) ±0,173) ±0,083) ±0,155) ±0,224) IL- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0, Таблица 9 Продукция цитокинов в суточных культурах цельной крови, стимулированых липополисахаридом В пг/мл Концентрация LPS, нг/мл Цитокин 0 1 10 5,0 2,2 2, IL- (ln=1,614±0,163) (ln=0,777±0,522) (ln=0,930±0,676) 1,7 2,6 1,6 3, IFN (ln=0,557±0,787) (ln=0,940±0,940) (ln=0,470±1,366) (ln=1,110±1,110) 1,0 0,8 0,4 0, IL- (ln=0,023±0,509) (ln=-0,227±0,301) (ln=-1,013±0,812) (ln=-0,064±0,301) IL-17 0,0 0,0 0,0 0, Таблица 10 Продукция цитокинов в суточных культурах цельной крови, стимулированых фитогемагглютинином В пг/мл Концентрация PHA, мкг/мл Цитокин 0 3 15 5,0 122, IL- (ln=1,614±0,163) (ln=4,811±0,257) 1,7 101,8 600,6 788, IFN (ln=0,557±0,787) (ln=4,623±0,306) (ln=6,398±0,127) (ln=6,670±0,082) 1,0 1,1 5,7 6, IL- (ln=0,023±0,509) (ln=0,115±0,020) (ln=1,743±0,074) (ln=1,881±0,149) 5,8 59,0 75, IL-17 0, (ln=1,765±0,945) (ln=4,078±0,848) (ln=4,330±0,753) Таблица 11 Продукция цитокинов в суточных культурах цельной крови, стимулированых неопсонизированным зимозаном В пг/мл Концентрация неопсонизированного зимозана, мкг/мл Цитокин 0 1 10 5,0 6,0 4, IL- (ln=1,614±0,163) (ln=1,789±0,565) (ln=1,459±0,500) 1,7 1,3 3, IFN- 0, (ln=0,557±0,787) (ln=0,269±1,179) (ln=1,105±0,611) 1,0 0,9 0,3 0, IL- (ln=0,023±0,509) (ln=-0,093±0,213) (ln=-1,134±1,040) (ln=-0,166±0,102) IL-17 0,0 0,0 0,0 0, 4.2. Влияние супернатантов культур клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I, на поглотительную активность фагоцитов 4.2.1. Влияние супернатантов на поглотительную активность гранулоцитов Результаты экспериментов, проведённых при концентрации S. aureus Cowan I 106 кл/мл в реакционной смеси, не обнаружили существенного влияния СНК и САК на поглощение бактерий гранулоцитами (данные не приводятся).

В присутствии 108 кл/мл S. aureus Cowan I ИПП гранулоцитов составил 67, (ln=4,206±0,116) (Рисунок 11, А). Внесение супернатантов неактивированных культур крови (СНК) увеличивало поглощение неопсонизированного стафилококка гранулоцитами в 26,2 раза. Эффект имел концентрационную зависимость. При соответствующем количестве СНК (10%, 25% и 70% от объема реакционной смеси) ИПП гранулоцитов оказались равны 135,2 (ln=4,907±0,164;

P0,01), 268,3 (ln=5,592±0,164;

P0,001) и 413,3 (ln=6,024±0,094;

P0,001).

Внесение супернатантов активированных стафилококком культур клеток крови (САК) еще более увеличивало ИПП гранулоцитов по сравнению с добавлением СНК. В этом случае показатели поглощения составили: при 25% САК 391, (ln=5,971±0,132;

PСНК-САК0,01), при 70% САК 570,5 (ln=6,347±0,107;

PСНК САК0,01).

Таким образом, САК вызывало в 1,41,5 раза большее усиление поглощения стафилококков гранулоцитами, чем СНК. Следовательно, цитокины, которые имелись в супернатанте активированных культур крови, усиливали поглотительную активность гранулоцитов в отношении стафилококка. Это подтверждается и результатами дисперсионного анализа, выполненного на основе ИПП (Таблица 12). Интернализация S. aureus в данных экспериментальных условиях зависит от наличия цитокинов на 7,6%.

** ** Рисунок 11. Влияние супернатантов суточных культур крови, инкубированных с 108 кл/мл S. aureus Cowan I () или без стимулятора (), на уровень ИПП гранулоцитов (А) и моноцитов (Б) периферической крови в присутствии 108 кл/мл S. aureus Cowan I. По оси абсцисс: концентрация супернатантов, % от объема реакционной смеси;

по оси ординат:

интегральный показатель поглощения (ИПП). Представлены средние геометрические и их ошибки. ** P0, Таблица 12 Результаты дисперсионного анализа влияния СНК и САК на ИПП гранулоцитов в присутствии 108 кл/мл S. aureus Cowan I Сила влияния (2), % Критерий Фактор PF (max и min значение) Фишера Цитокины 7,6 (4,0-11,3) 8,4 0, Другие компоненты супернатантов 46,8 (41,0-52,6) 25,7 0, Влияние всех учтенных факторов 56,3 (45,4-67,2) 12,4 0, 4.2.2. Влияние супернатантов на поглотительную активность моноцитов Внесение СНК и САК при концентрации стафилококков 10 6 кл/мл не отразилось на ИПП моноцитов (данные не приводятся).

ИПП моноцитов в присутствии 108 кл/мл неопсонизированного S. aureus Cowan I составил 221,1 (ln=5,399±0,116) (Рисунок 11, Б). Внесение СНК усиливало поглощение стафилококков моноцитами в 1,51,7 раза. ИПП моноцитов при 25% СНК составил 332,1 (ln=5,806±0,120;

P0,02), при 70% СНК 381,9 (ln=5,945±0,058;

P0,01). Внесение супернатантов активированных культур вызывало те же изменения ИПП моноцитов, что и добавление СНК (во всех случаях PСНК-САК0,05). Таким образом, присутствие цитокинов в супернатантах не отразилось на поглощении бактерий моноцитами.

4.3. Влияние супернатантов культур крови на ЛЗХЛ лейкоцитов 4.3.1. Влияние супернатантов культур клеток цельной крови, стимулированных S. aureus Cowan I, на уровень ЛХЗЛ лейкоцитов, поглотивших стафилококк В присутствии 108 кл/мл неопсонизированного S. aureus Cowan I уровень люминесценции лейкоцитов составил 67,3 (ln=4,209±0,188) RLU. Внесение в реакционную смесь возрастающих концентраций СНК не повлияло на продукцию АФК стимулированными лейкоцитами (Рисунок 12, А;

P0,05 во всех случаях).

Ситуация существенно изменилась при добавлении таких же количеств САК. Уже в присутствии 10% супернатанта уровень ЛЗХЛ вырос в 1,7 раза и составил 111, (ln=4,712±0,177) RLU (P0,001). При больших концентрациях САК величина ответа, однако, оставалась на том же уровне. Тем не менее, очевидно, что САК в отличие от СНК усиливали реакцию лейкоцитов, поглотивших S. aureus Cowan I.

Положительное влияние САК на уровень ЛЗХЛ вызывало следующий вопрос: не обусловлено ли усиление ЛЗХЛ самостоятельным активирующим действием САК на лейкоциты. Для ответа на этот вопрос было проведено измерение ЛЗХЛ соответствующих контрольных проб без добавления стафилококков. Так исходный уровень ЛЗХЛ лейкоцитов составил 3, (ln=1,131±0,180) RLU. Добавление СНК и САК во взвесь лейкоцитов не отразилось на реакции последних. Следовательно, все компоненты, присутствующие в супернатантах, в том числе цитокины, не вызывают активации лейкоцитов самостоятельно.

*** *** *** *** Рисунок 12. Влияние супернатантов суточных культур крови на уровень ЛЗХЛ лейкоцитов в присутствии 108 кл/мл S. aureus Cowan I. По оси ординат графиков А и Б: интегральные значения относительных световых единиц (relative luminescence light units (RLU)). Представлены средние геометрические и их ошибки. А влияние супернатантов культур крови, инкубированных с 108 кл/мл S. aureus Cowan I () или без стимулятора (), на уровень ЛЗХЛ лейкоцитов. По оси абсцисс: концентрация супернатантов, % от объёма реакционной смеси. Б влияние 10%-ных супернатантов культур крови на уровень ЛЗХЛ. СНК супернатант неактивированных культур крови;

СНК+Т супернатант неактивированных культур крови, инкубированных с 500 мкмоль/л трентала (Т);

САК супернатант культур крови, активированных 108 кл/мл S. aureus Cowan I;

САК+Т супернатант культур крови, активированных 108 кл/мл S. aureus Cowan I в присутствии 500 мкмоль/л трентала. *** P 0, 4.3.2. Отмена тренталом усиливающего влияния САК на ЛЗХЛ лейкоцитов, поглотивших S. aureus Cowan I Следующим этапом работы стало доказательство того, что положительное влияние САК на ЛЗХЛ лейкоцитов обусловлено действием цитокинов. Для этого получение супернатантов было проведено в условиях, препятствующих синтезу цитокинов. В качестве вещества, которое ингибирует их выработку, был использован трентал [49]. Инкубирование культур крови в присутствии мкмоль/л трентала привело к отмене усиливающего влияния супернатантов на ЛЗХЛ (Рисунок 12, Б): её интенсивность упала с 77,8 (ln=4,354±0,251) RLU в присутствии САК до 49,3 (ln=3,899±0,248) RLU (P0,001) при внесении САК с тренталом. Последнее значение статистически не отличалось от люминесценции проб с СНК.

Тот факт, что ЛЗХЛ в контрольных пробах с 10% СНК с тренталом и без него имели одинаковую интенсивность люминесценции, свидетельствует об отсутствии у данного препарата в данной концентрации гасящего или ингибирующего влияния на ЛЗХЛ. Следовательно, повышение уровня ЛЗХЛ в пробах с 10% САК обусловлено наличием в нём цитокинов, а не является артефактом. Согласно результатам однофакторного дисперсионного анализа присутствие цитокинов в 10% САК определяет интенсивность ЛЗХЛ на 17,9% (1,9%-34,0%;

PF 0,05).

В то же время в контрольных пробах с более высоким содержанием супернатантов наличие трентала в некоторой степени угнетало ЛЗХЛ лейкоцитов.


В пробах с 25% СНК без трентала уровень люминесценции составил 50, (ln=3,918±0,329) RLU. Внесение СНК с ингибитором не позволило лейкоцитам достичь того же значения ЛЗХЛ. Величина люминесценции оказалась равна 39, При концентрации супернатантов (ln=3,678±0,281) RLU (P0,01). 70% соответствующие значения ЛЗХЛ составили 48,6 (ln=3,883±0,218) и 29, (ln=3,397±0,171) RLU (P0,01). То есть присутствие трентала в супернатантах неактивированных культур крови негативно сказывалось на уровне ЛЗХЛ в контрольных пробах. Это может означать, что в СНК присутствует некоторое количество цитокинов, достаточное для того, чтобы отразиться на уровне люминесценции. Либо трентал в больших концентрациях всё же обладает ингибирующим или гасящим влиянием на ЛЗХЛ.

4.4. ЛЗХЛ лейкоцитов в ответ на S. aureus и другие объекты фагоцитоза В предыдущих разделах было показано, что опсонизация антителами и присутствие цитокинов при фагоцитозе S. aureus положительно влияют на ЛЗХЛ фагоцитов. Однако узнать насколько эффективно влияние указанных факторов можно, сравнив реакцию лейкоцитов, поглотивших стафилококк, с ответом лейкоцитов, фагоцитировавших другие объекты. Поэтому на заключительном этапе работы было проведено измерение люминесценции лейкоцитов при фагоцитозе иммунных комплексов и опсонизированного зимозана и сопоставление этих значений с показателями ЛЗХЛ в экспериментах со стафилококком.

Так, при добавлении к взвеси лейкоцитов 100 мкг/мл нерастворимых иммунных комплексов, 15 или 150 мкг/мл опсонизированного зимозана интенсивность люминесценции фагоцитов достигала 604,7 (ln=6,405±0,091), 688, (ln=6,535±0,243) и 1007,7 (ln=6,915±0,069) RLU соответственно (Рисунок 13).

Полученные значения в 915 раз превышали уровень ЛЗХЛ лейкоцитов, стимулированных 108 кл/мл S. aureus Cowan I 67,3 (ln=4,209±0,188) RLU Рисунок 13. Влияние различных объектов фагоцитоза на ЛЗХЛ лейкоцитов. По оси ординат: интегральные значения относительных световых единиц (relative luminescence light units (RLU)). Представлены средние геометрические и их ошибки. Условные обозначения: SA неопсонизированный S. aureus Cowan I, 108 кл/мл;

SA+At опсонизированный АСИ S. aureus Cowan I, 108 кл/мл;

25% САК то же, что и SA, но в присутствии 25%-ного супернатанта суточных культур крови, активированных 108 кл/мл S. aureus Cowan I;

НИК – нерастворимые иммунные комплексы, 100 мкг/мл;

Z15 опсонизированный зимозан, 15 мкг/мл;

Z150 опсонизированный зимозан, 150 мкг/мл (P0,001 во всех случаях). Тогда как при добавлении того же количества S. aureus Cowan I, опсонизированных антистафилококковым иммуноглобулином, уровень ЛЗХЛ оказался равен 133,2 (ln=4,892±0,250) RLU (P0,05). Не многим менее был показатель люминесценции лейкоцитов, стимулированных 108 кл/мл S. aureus Cowan I в присутствии 25% САК, 124,8 (ln=4,827±0,172) RLU (P0,01).

Опсонизация антителами и воздействие цитокинов обеспечили прирост показателя ЛЗХЛ в 2 раза. Таким образом, полученные данные иллюстрируют, что хотя опсонизация антителами и воздействие цитокинов повышают уровень ЛЗХЛ лейкоцитов при фагоцитозе S. aureus, ответ лейкоцитов в ЛЗХЛ всё же остаётся на достаточно низком уровне.

Выводы, полученные на основании проведённого исследования:

Показано, что стафилококк при контакте с клетками крови 1.

стимулирует образование как противовоспалительных, так и провоспалительных цитокинов;

для активации синтеза противовоспалительного цитокина (рецепторного антагониста интерлейкина 1 бета) требуется меньше бактерий, чем это необходимо для продукции провоспалительных медиаторов (опухоль некротизирующего фактора альфа и интерлейкина 1 бета).

Установлено, что при взаимодействии S. aureus с лейкоцитами крови 2.

человека цитокины преимущественно усиливают образование свободных радикалов фагоцитами, не оказывая существенного влияния на поглощение бактерий. Однако по сравнению с зимозаном и иммунными комплексами S. aureus является слабым активатором продукции активных форм кислорода фагоцитами.

4.5. Обсуждение Изучение секреции TNF-, IL-1 и обнаружило IL-1RА in vitro определённые закономерности этого процесса. Во-первых, нам удалось зафиксировать нарастание, максимальную интенсивность и, наконец, спад продукции медиаторов при увеличении концентрации стафилококков. Изменение интенсивности секреции цитокинов от базового уровня до уровня запредельного торможения в зависимости от концентрации активатора свидетельствует о том, что выработка TNF-, IL-1 или IL-1RА происходит как стандартная реакция биологической системы на раздражитель.

Во-вторых, повышение интенсивности секреции TNF-, IL-1 и IL-1RА происходило в определённом порядке. Какой бы из четырёх стимуляторов мы ни вносили в культуры крови, в первую очередь клетки реагировали секрецией IL 1RА. Его концентрация всегда доминировала над количеством остальных цитокинов. (Исключением является «концентрационный перекрест» IL-1RА/IL- феномен, который требует отдельного обсуждения.) Вслед за IL-1RА нарастала продукция TNF-. Наконец, при дальнейшем увеличении концентрации активаторов в культуральной среде обнаруживался IL-1. Тот факт, что индукция секреции цитокинов происходила в определённом порядке вне зависимости от природы стимулятора, говорит об универсальности рекции синтеза основных цитокинов на антигенное раздражение. (Хотя, вполне вероятно, что на антиген другой природы, например, вирус, модель ответа клеток цельной крови может быть иной.) Кроме того, порядок появления цитокинов в культуральной среде, с нашей точки зрения, отражает минимальную величину антигенного раздражения, необходимого для начала секреции данного цитокина. Судя по всему, из трёх определяемых цитокинов IL-1 имеет наибольший, а IL-1RА наименьший порог активации секреции;

TNF- с этой точки зрения занимает промежуточное положение.

Следует отметить, что порядок нарастания секреции определённых цитокинов в супернатантах культур крови совпадает с временем появления этих медиаторов в очаге бактериального воспаления. Так, на моделях стафилококкового и LPS-индуцированного артрита у кроликов было показано, что уровень TNF- в очаге воспаления достигает пиковых значений через два часа после введения антигена [92;

109]. Затем следует выраженный подъём концентраций IL-1 (через 24 часа после инокуляции стафилококка [92] либо через 6 часов после введения LPS [109]). То есть, по мере развития воспалительной реакции происходит смена цитокинового микроокружения:

«ранние» цитокины (TNF-) уступают место более «поздним» (IL-1). Кроме того, интенсивность секреции первых влияет на выработку вторых, что можно наблюдать и in vivo: введение моноклональных антител, блокирующих TNF-, пациентам с ревматоидным артритом вызывает снижение концентрации IL-1 в их крови [106]. Поэтому характер синтеза цитокинов в модели in vitro отчасти можно считать прототипом цитокинового микроокружения in vivo, по крайней мере, на ранних этапах развития очага воспаления.

В-третьих, сравнительный анализ характера секреции IL-1 и его рецепторного антагониста позволяет сделать выводы о механизме «совместной работы» этих цитокинов. Так, продукция IL-1RА в культурах крови начиналась в присутствии минимальных концентраций стимуляторов и практически сразу устанавливалась на максимальном уровне. В отличие от продукции TNF- и IL 1, для секреции IL-1RА была характерна широкая зона плато: при непрервном росте концентрации активаторов (до определённого момента) количество цитокина в среде сохранялось на постоянном, максимальном уровне. Это особенно отчётливо прослеживается на графиках, иллюстрирующих продукцию цитокинов в присутствии стафилококков, LPS и PHA. Зарегистрировать появление IL-1 в культуральной среде можно было только в условиях, когда концентрация IL-1RА приближалась или уже достигла максимального уровня.

Однако в отличие от секреции IL-1RА, после достижения пиковой концентрации в выработке IL-1 наблюдался немедленный спад без зоны плато. (Следует отметить, что полученные нами результаты согласуются с данными J. T. M.

Frieling: график секреции IL-1 и IL-1RА клетками цельной крови под влиянием LPS, представленный в работе этой научной группы [60], практически идентичен нашим результатам.) То есть нарастание продукции IL-1 происходит при максимальной концентрации его антагониста. Подобный характер секреции IL- и IL-1RА наводит на мысль, что реализация биологических эффектов IL- осуществляется «под контролем» ингибитора.

Известно, что блокирование биологических эффектов IL-1 in vivo происходит, если концентрация IL-1RА превосходит концентрацию IL-1 в 10100 раз [21;

52]. Исходя из этого, механизм «совместной работы» агониста и антагониста представляется следующим. При малом количестве антигена, когда соотношение цитокинов больше или равно указанному в литературе значению, IL-1 не может оказать своего влияния на клетки в месте выработки. Если в очаге воспаления уровень антигенного раздражения повышается (например, при увеличении числа бактерий в ране), баланс цитокинов изменяется.

Концентрационное соотношение IL-1RА/IL-1 падает ниже 10 за счёт усиления секреции IL-1 при постоянном уровне IL-1RА. В этом случае IL-1 получает возможность реализовать своё биологическое действие. Однако влияние IL- «смягчено» присутствием IL-1RА. Следует также принять во внимание вероятное наличие в культуральной среде других негативных регуляторов биологических эффектов IL-1, присутствие которых не анализировалось в нашей работе (мембранный рецептор IL-1 второго типа IL-1RII (interleukin-1 receptor type II) и растворимые рецепторы sIL-1RII (soluble interleukin-1 receptor type II) и sIL-1RАcP (soluble interleukin-1 receptor accessory protein)). Скорее всего, суммарное действие этих факторов, несмотря на резкий скачок секреции IL-1 в ответ на увеличение антигенного раздражения, ещё более сглаживает влияние IL-1. Можно также предположить, что в результате совместного влияния негативных регуляторов биологические эффекты IL-1 проявляются лишь при значительном антигенном раздражении, которое индуцирует выработку достаточного уровня IL-1.

С этой точки зрения интересно взглянуть на соотношение цитокинов в очаге гнойного воспаления. Так, по данным работы научной группы под руководством К. В. Шмагеля концентрация рецепторного антагониста IL-1 в гнойных ранах в момент вскрытия гнойника составляет 41 нг на 1 мл раневого экссудата. Тогда как концентрация IL-1 в той же среде равна 11,3 нг/мл, что в 3,6 раза ниже, чем количество IL-1RА [17]. То есть даже на пике развития гнойного процесса соотношение агониста и антагониста не падает до единицы или менее. Исходя из этого, можно предположить, что «концентрационный перекрест», наблюдаемый нами в культурах цельной крови, in vivo является довольно редкой ситуацией.

Далее, в той же работе приводится динамика снижения концентраций IL- и IL-1RА в течение нескольких дней после санации раны. Так, в течение трёх дней после вскрытия гнойника на фоне общего снижения концентрации указанных цитокинов соотношение IL-1RА/IL-1 увеличилось с 3,6 в первый день до 12,5 на третий. Следовательно, спад продукции цитокинов при заживлении раны, а, следовательно, и снижении уровня антигенного раздражения, происходит неравномерно. Очень «чутко» на снижение количества антигена реагирует продукция IL-1. Уменьшение секреции IL-1RА проходит в более низком темпе.

То есть «затухание» синтеза IL-1 и IL-1RА происходит в проядке, обратном их появлению в очаге воспаления. Поэтому можно предположить, что на третий день после санации гнойной раны IL-1 уже не оказывает биологического воздействия на клетки в очаге воспаления, поскольку соотношение IL-1RА/IL- приблизилось к своему критическому значению.

Следующий заслуживающий внимания феномен возникновение «концентрационного перекреста» в культурах крови со IL-1RА/IL- стафилококком. Хотя в пробах с другими стимуляторами мы не наблюдали изменение соотношения IL-1RА/IL-1, маловероятно, что это явление может быть вызвано исключительно под действием стафилококков. Так, в работе J. T. M. Frieling показано, что в культурах цельной крови «концентрационный перекрест» IL-1RА/IL-1 возможен в присутствии LPS [60]. В другом исследовании спонтанная продукция и IL-1 с трёхкратным IL-1RА преобладанием секреции антагониста наблюдалась в десятидневных культурах ткани синовиальной оболочки суставов больных ревматоидным артритом [37].

Поэтому изменение баланса IL-1RА/IL-1 скорее следует рассматривать как реакцию клеток крови на избыточное количество антигенного раздражения.

Однако, допустима ли такая ситуация в организме? В рассмотренном выше примере цитокинововго микроокружения гнойных очагов «концентрационного перекреста» IL-1RА/IL-1 не происходит.

Наконец, последнее, о чём следует сказать в рамках вопроса о балансе IL 1RА/IL-1, это то, что характер секреции этих цитокинов может отражать основные принципы развития воспалительной реакции и функционирования механизмов, её сдерживающих. В культурах крови со стафилококком мы протестировали секрецию цитокинов с использованием довольно широкого диапазона концентраций стимулятора. Обращает на себя внимание, что снижение продукции происходит в присутствии меньших концентраций IL-1RА стафилококков и секреция IL-1RА достигает более глубокого торможения, чем выработка IL-1 (а также и TNF-;

Рисунок 9). В целом же график секреции IL 1RА оказывается смещённым влево по оси абсцисс относительно графика продукции IL-1 (Рисунок 9). Это означает, что для возникновения реакции клеток, которая выражается в виде секреции IL-1RА, необходима меньшая сила раздражения. Такой характер продукции противо- и провоспалительного цитокинов наводит на мысль о том, что для активации и истощения противовоспалительных механизмов необходим меньший уровень воздействия, чем это требуется для индкуции воспаления. Другое предположение, которое следует из наблюдения за секрецией IL-1 и IL-1RА, заключается в том, что при избыточном количестве антигенов в фазу запредельного торможения в первую очередь перейдут именно сдерживающие воспаление механизмы.

По крайней мере, к первому из предположений можно найти факты, которые косвенно его подтверждают. Так, в 100% образцов диализной жидкости, взятой у пациентов, находящихся на постоянном перитонеальном диализе и которым поставлен диагноз бактериальный перитонит, был обнаружен высокий уровень IL-1RА. Тогда как повышенные концентрации IL-1 присутствовали в 75% диализатов. Причём количество рецепторного антагониста значительно превышало концентрации IL-1. В своротке крови пациентов также были зарегистрированы повышенные концентрации этих цитокинов. Однако IL-1RА положительными оказались 92% проб, а высокий уровень IL-1 обнаружен лишь в 8% образцов [30]. В другом примере в системе in vitro количество LPS, необходимое для индукции секреции рецепторного антагониста моноцитами, было в тысячу раз меньше, чем это требовалось для запуска секреции IL-1 [108].

Эти примеры демонстрируют, что и на уровне организма и на клеточном уровне при наличии антигенного воздействия в первую очередь активируется противовоспалительная система (здесь в виде продукции IL-1RА), а вслед за этим нарастает воспалительная реакция (о которой мы судим по продукции IL-1).

Нельзя обойти вниманием и наблюдаемый нами высокий уровень базовой секреции IL-1RА в культурах крови. Этот феномен вызван уменьшением содержания альфа-1-антитрипсина (сериновая протеаза, в большом количестве находится в сыворотке, обладает противовоспалительными свойствами) в цельной крови в результате её разведения культуральной средой [139]. То есть, по сути является артефактом. Тем не менее, он не противоречит нашим предположениям о первичной активации противовоспалительной системы. Этот феномен свидетельствует о том, что секреция IL-1RА может быть вызвана и в отсутствие антигена. Достаточно лишь изменения окружающей клетку среды, что повлечёт за собой превентивную активацию противовоспалительных механизмов.

В нашей работе нам не удалось зафиксировать выработку IFN-, IL-17А, IL 2 и IL-4 в культурах крови с S. aureus. Хотя по данным литературы стафилококкки могут быть индукторами указанных цитокинов in vitro. Так, обезвреженные клетки золотистого и эпидермального стафилококков вызывают выработку значительного количества IFN- лейкоцитами в культурах цельной крови [169] и в культурах мононуклеарных клеток человека [32]. В присутствии S.aureus, инактивированного ультрафилолетовым излучением, мононуклеарные клетки крови секретируют IL-17 [86]. В той же модельной системе компоненты клеточной стенки стафилококка белок А, тейхоевые кислоты и мурамилдипептид индуцируют секрецию IL-4;

из них белок А является наиболее мощным стимулятором [177]. Наконец, клетки золотистого и эпидермального стафилококков запускают продукцию в культурах IL- мононуклеаров человека, причём в присутствии золотистого стафилококка этот процесс идёт активнее [117].

Тот факт, что нам не удалось обнаружить IFN-, IL-17А, IL-2 и IL-4 в супернатантах, мог быть связан с недостаточным временем инкубации культур крови (в течение одних суток). В указанных выше работах определение выработки IFN- и IL-17 осуществлялось на вторые или третьи сутки после начала эксперимента [32;

86;

169]. Кроме того, причиной таких результатов могла послужить достаточно высокая степень разведения цельной крови культуральной средой (в двадцать раз). Возможно, что при большей концентрации лейкоцитов нам удалось бы зарегистрировать начало выработки IFN-, IL-17А, IL-2 и IL-4 в первые 24 часа после стимуляции лейкоцитов.

Заключая раздел, посвящённый характеристике выработки цитокинов в культурах крови, можно сказать следующее. Реакция синтеза цитокинов в ответ на стафилококк протекает как стандартная реакция биологической системы на антигенное раздражение. Секреция цитокинов в очаге воспаления подчиняется закономерностям, которые находят своё отражение в системе in vitro. В частности, нам удалось обнаружить корреляцию между концентрационной зависимостью появления цитокинов в культуральной среде и последовательностью синтеза цитокинов в очаге стафилококковой инфекции.

Количество бактерий является фактором, определяющим баланс IL-1RА/IL-1. Об этом свидетельствует возникновение «концентрационного перекреста» IL 1RА/IL-1 при увеличении количества в культурах крови.

S. aureus Экстраполяция закономерностей концентрационной зависимости выработки IL 1RА/IL-1 на системный уровень позволяет высказать предположения о принципах функционирования про- и противовоспалительных механизмов на уровне организма в целом.

Следующий этап нашей работы заключался в оценке влияния цитокинов на эффективность фагоцитоза S. aureus. Источником цитокинов служил супернатант культур клеток цельной крови, стимулированных такой дозой стафилококка, при которой наблюдался максимальный уровень выработки медиаторов (108 кл/мл).

Добавление супернатантов культур клеток в реакционную смесь, содержащую лейкоциты крови и неопсонизированные стафилококки, оказало значительное влияние на поглощение бактерий гранулоцитами: интенсивность реакции интернализации возросла в несколько раз. Однако различие в поглощении стафилококков в пробах, в которых тестируемые супернатанты отличались только наличием или отсутствием цитокинов, составляло лишь 1, раза. Из этого следует, что главной причиной значительного усиления поглощения бактерий являлось наличие в культуральной среде опсонинов плазмы крови: антител, комплемента, фибронектина и т.д. Цитокины супернатанта активированных клеток крови, действуя на фоне опсонинов плазмы, обеспечивали небольшой прирост поглотительной способности гранулоцитов. (На поглотительную способность моноцитов наличие супернатантов не оказало никакого влияния.) Очевидно, что усиление фагоцитоза гранулоцитов, пусть и незначительное, обусловлено эффектом прайминга лейкоцитов цитокинами (см.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.