авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт теоретической и экспериментальной биофизики Институт биофизики клетки Академия государственного управления при Президенте ...»

-- [ Страница 4 ] --

Ионы железа могут существенно ускорить этот процесс. Одним из наиболее хорошо известных примеров формирования радикалов с участим железа является реакция Фентона, названная в честь Генри Фентона (H. Fenton), впервые обнаружившего необычные особенности взаимодействия перекиси водорода с ионами железа в 1894 г. Более детальное описание этого процесса и предположение о формировании свободных радикалов было сделано полвека спустя [711]. Лишь в 50–60 гг.

XX века было обнаружено изменение степени окисления железа и некоторых других металлов переменной валентности в реакциях с учас тием перекиси водорода. Кроме того, было исследовано биологическое значение процессов, названных химией Фентона [712]. В литературе часто используются также название «реакция Фентона» [713;

714]. В этих процессах происходит окисление и восстановление железа в присутствии перекиси водорода:

(1) Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO• + OH, (2) Fe3+ + O2• Fe2+ + O2, cуммарный процесс: H2O2 + O2• HO• + O2.

Реакция (1) впервые была описана в работе Хабера и Вейса [711], где получила название «реакция Фентона». Образующийся в результате расщепления перекиси водорода гидроксил-радикал (HO•) участвует во многих процессах окисления органических веществ, включая белки, нуклеиновые кислоты, но главным образом липиды. В результате этих реакций образуются новые активные радикалы и перекиси, что может стать причиной лавинообразного развития процессов по механизму цепной реакции. Это связано с высокой активностью гидроксил-радикала в сравнении с другими прооксидантами (табл. 4).

Таблица 4. Активные формы кислорода и родственные соединения.

Относитель Формула Содинения Название ная активность O2• Супероксид-анион-радикал HO2• Пероксил-радикал HO• Гидроксил-радикал Радикалы RO• Алкоксил-радикал RO2• Алкилпероксил-радикал Пероксид водорода H2O2 Синглетный кислород O2 Нерадикалы Гипохлорит-анион ClO Пероксинитритная кислота ONOOH Примечание. Взято из [715], с изменениями.

Несмотря на значительные различия в активности прооксидантов, представленных в таблице, все они могут оказывать существенное влияние на метаболизм клетки, вызывать окислительный стресс и даже гибель клетки, если механизмы защиты работают недостаточно эффективно.

Необходимо учитывать условность представленных в табл. 4 данных, поскольку для оценки истинной активности этих веществ в клетке необходимо учитывать также время их «жизни» и концентрацию в цитоплазме. Кроме того, активность прооксидантов может значительно изменяться в средах различной полярности. Так, активность O2• в водном окружении низка, но существенно повышается в неполярных средах, таких как гидрофобная область липидного бислоя.

В живой клетке различные процессы участвуют в формировании гидроксил-радикала, являющегося самым активным окислителем. Кроме процессов окисления железа в присутствии перекиси водорода, он образуется также в аналогичном процессе окисления меди. Кроме того, он образуется при разложении пероксинитритной кислоты [716]. В клетке присутствует также значительное количество перекиси водорода, которая образуется в процессе дыхания митохондрий [717]. При этом, металлы железо и медь находятся в цитоплазме преимущественно в восстановленном состоянии благодаря присутствию восстановителей, таких как NADH, NADPH и др. Процесс продуцирования гидроксил-радикала в клетке происходит в цепи циклических реакций (рис. 41).

Рис. 41. Циклический процесс окисления и восстановления ионов железа внутриклеточными восстановителями (NADH) и окислителями (Н2O2) в реакции Фентона приводит к образованию радикалов гидроксила, что может вызывать окислительное повреждение мембранных липидов, белков и нуклеиновых кислот [718].

2.2.3. Индуцированное окисление липидов Известны три механизма индуцированного окисления липидов:

автоокисление радикалами, фотоокисление и ферментативное окисление.

В живой клетке радикальные процессы и реакции участвуют в таких важных процессах, как транспорт электронов в дыхательных цепях ферментов, метаболизм липидов, включая синтез эйкозаноидов, к числу которых принадлежат такие важные вещества, как лейкотриены, простагландины, тромбоксаны и катехоламины. Эти вещества регулируют пролиферацию и дифференциацию клеток, эндоцитоз и секрецию веществ, апоптоз и гибель клеток. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) зависит от соотношения активности прооксидантов и анти оксидантов в клетке. Парадоксально, но именно восстановители – легкоокисляющиеся вещества, могут служить наиболее активными прооксидантами, способными индуцировать появление свободных радикалов. К их числу следует отнести НАДФН2 и НАДН2, полиненасы щенные жирные кислоты, продукты метаболизма простагландинов и катехоламинов. Прооксидантами могут быть также витамины, например А и D, если они находятся в избытке.

Существенную роль в процессах окисления мембранных липидов играет супероксид-анион-радикал (O2•), поскольку его химическая активность существенно возрастает в неполярном окружении фосфо липидного бислоя. Супероксид-анион-радикал способен атаковать эфирную связь, в результате чего происходит отщепление жирной кислоты [719;

720].

Еще большей активностью обладает пероксид-радикал (НО2•), который к тому же не несет заряда и поэтому лучше растворяется в гидрофобной области липидного бислоя, чем супероксид-анион-радикал.

Одним из наиболее ярких примеров разрушительного действия процессов окисления липидов является так называемый «дыхательный взрыв» – резкое повышение потребления кислорода нейтрофилами и макрофагами в процессе иммунного ответа. При этом кислород участвует в продуцировании супероксид-анион-радикала. В результате дальнейших реакций в цитоплазме накапливаются такие активные окислители, как гипохлорит и пероксинитрит, которые являются мощными цито токсическими агентами и участвуют в иммунной реакции против бактериальных, грибковых и гельминтозных инфекций, а также в развитии аутоиммунных заболеваний [721-723]. Примечательно, что при окислении углеводородных цепей ненасыщенных липидов, жирные кислоты также могут удалятся в результате атаки эфирных связей фосфолипазой А2 [724 726]. В результате происходит существенное нарушение барьерных свойств мембран, что может приводить к гибели клеток.

Повреждающее действие процессов перекисного окисления на кле точные мембраны связано с потерей в составе мембран полиненасыщенных липидов и накоплении в бислое продуктов окисления, включая свободные жирные кислоты, их окисленные продукты, а также их олигомеры, образующиеся в результате поперечных сшивок. Кроме того, накопление низкомолекулярных токсических продуктов окисления, включая альдегиды и диальдегиды, например, малоноваый диальдегид, способны образовывать поперечные сшивки в цепях белков и нуклеиновых кислот [727].

Различают три этапа перекисного окисления липидов (ПОЛ) с участием радикалов: инициация, распространение, завершение. Рас смотрим их подробнее.

2.2.3.1. Стадия инициации ПОЛ Если в среде нет перекиси водорода, процесс инициации ПОЛ начинается с отсоединения атома водорода от метиленовой группы (-СН2-) в углеводородной цепи. Этот процесс может протекать в полине насыщенных жирных кислотах под действием радикала гидроксила (ОН •), тогда как супероксид-анион-радикал O2• недостаточно активен для этого.

Реакция протекает по формуле: СН2 + ОН• СН• + Н2О.

Рис. 42. Процесс ПОЛ в полиненасыщенных углеводородах, например, в жирных кислотах фосфолипидов биологических мембран.

В отсутствие кислорода происходит:

(а) – атака углеводородной цепи свободными радикалами, (б) – реорганизация молекулы углеводорода, (в) – образование алкильного радикала и конъюгация двойных связей с образованием диеновых конъюгатов.

В присутствии синглетного кислорода происходит:

(г) – окисление алкильного радикала до алкилпероксильного радикала.

Процесс ПОЛ может наблюдаться даже в анаэробной среде, если присутствуют достаточно активные радикалы (рис. 42). Присутствие двой ной связи в цепи ослабляет связь С–Н углеродного атома, соседнего с двойной связью, облегчая тем самым атаку радикалов и отсоединение водорода. В процессе реакции происходит изменение положения двойных связей, в результате чего соседние двойные связи сближаются и образуют диеновый конъюгат. Конечным продуктом этой стадии окисления является алкильный радикал. В присутствии синглетного кислорода происходит дальнейшее окисление углеводородной цепи, в результате которого образуется пероксильный радикал [728-730].

2.2.3.2. Стадия распространение ПОЛ Алкилпероксильные радикалы также могут активно взаимо действовать с соседней углеводородной цепью, особенно полиненасы щенных липидов, и захватывать атом водорода.

В результате реакции образуется неактивный алкилгидропероксид и алкильный радикал, способный снова взаимодействовать с кислородом и образовывать алкилпероксильный радикал. Таким образом, реакция повторяется многократно, а концентрация перекисей растет.

2.2.3.3. Стадия терминации ПОЛ Терминация (обрыв цепи окислительных реакций) может насту пить, если образование алкильного радикала не происходит. Такие реакции могут инициироваться, например, в присутствии -токоферола, который в мембранах является главным агентом, прерывающим цепи окисления. Так, алкильный радикал R• может взаимодействовать с перокидным радикалом ROO• и образовывать стабильный мостик между двумя углеводородными цепями ROOR, или молекулы пероксида, взаимодействуя с флавоноидами, могут образовывать неактивную форму гидроксилированого производного ROH, как это будет показано далее.

2.2.4. Другие продукты окисления 2.2.4.1. Образование эпоксидов Другим важным классом соединений, образующихся в процессе ПОЛ, являются эпоксиды. Эпоксиды формируются при атаке двойной связи алкилпероксильным радикалом:

.

Эпоксиды обнаруживают в биологических тканях, претерпевших окислительный стресс, например в результате повреждения при ожоге или при ишемии. Эпоксиды жирных кислот обладают высокой биологической активностью. Например, эпоксиды линолевой кислоты токсичны и получили название лейкотоксины (рис. 43).

Рис. 43. Биологически-активные эпоксиды, образующиеся в процессе перекисного окисления липидов.

Лейкотоксины:

(а) – 12,13-эпокси-9-октадеканоевая кислота, (б) – 9,10-эпокси-12-октадеканоевая кислота, (в) – продукт окисления арахидоновой кислоты: 5,6-эпокси-8,11,14-эйкоза триеновая кислота (ЭЭТ).

Продукт окисления арахидоновой кислоты – эпоксиэйкозо триеновая кислота (ЭЭТ) обладает антивоспалительным действием и может регулировать активность тирозинкиназы. Она участвует в кальциевой сигнализации и способна регулировать скорость кровяного потока, агрегацию кровяных пластинок, миграцию клеток, апоптоз, фибринолиз, секрецию стероидных гормонов. ЭЭТ продуцируется многими тканями, включая печень, почки, поджелудочную железу, яичники, клетки эндотелия и мозга [731-735].

2.2.4.2. Окисление холестерина В зависимости от условий окисления и химической природы окислителя могут появляться различные формы окисленного холестерина (рис. 44). Окислении эфиров холестерина зависит от присутствия различных видов окисленных жирных кислот. Подробное описание процессов окисления стероидов, химического строения, а также биологической актив ности окисленных продуктов холестерина можно найти в обзоре Шроеп фера [736]. Анализ продуктов окисления фитостеролов можно найти в обзоре Ховенкампа [737].

Рис. 44. Примеры продуктов окисления холестерина:

(а) – холестерин, неокисленный, (б) – 7-ОН или 7-ОН холестерин, (в) – 7-кето холестерин, (г) 5,6- или 5,6-эпоксихолестерин.

Многие наиболее важные оксистеролы продуцируются в клетке с участием белков комплекса цитохрома Р450. Для человека наиболее важными являются 27-, 24-, 7- и 4-ОН-гидрохолестерины. Аналогичные продукты могут также образовываться при термической обработке пищи в процессе приготовления, в результате так называемого автоокисления холестерина. Наиболее важными продуктами автоокисления являются 7-кето- и 7-ОН-холестерины. Продукты окисления холестерина могут обладать цитотоксическим действием, влиять на экспрессию генов, а также на процессы клеточной сигнализации [738].

2.2.4.3. Конечные продукты окисления липидов В процессе ПОЛ происходит фрагментация полиненасыщенных углеводородных цепей, в результате чего могут образовываться малые химически активные молекулы, которые называют конечными продуктами окисления (advanced lipoxidation end products) (рис. 45). К ним можно отнести альдегиды – акролеин, кротоновый альдегид, гексанал, малоновый диальдегид и глиоксаль, а также 4-гидрокси-2-ноненал (hydroxynonenal HNE) и др. вещества [739].

Рис. 45. Конечные продукты окисления полиненасыщенных липидов: малоновый диаль дегид (а);

глиоксаль (б);

4-гидроксиноненал или 4-гидрокси-2-ноненал (в).

Наиболее известным и давно исследуемым является малоновый диальдегид (МДА), образующийся во многих процессах перекисного окисления природных липидов (рис. 46). Измерение содержания МДА часто используется для оценки интенсивности окислительных процессов в тканях.

Однако точный механизм формирования МДА не установлен. Возможно, что предшественниками МДА являются моноциклические пероксиды, образующиеся при окислении жирных кислот (рис.

46 ) Источником МДА могут служить также предшественники простагландинов. Так, тромбоксан синтаза может образовывать МДА наряду с тромбоксаном А2 при действии на эндопероксид простагландина в процессе активации кровяных пластинок человека [740]. МДА является очень важным продуктом ПОЛ, поскольку он весьма реакционноспособен и может взаимодействовать с белками и полинуклеотидами, образуя поперечные сшивки между цепями. Альдегиды способны взаимодействовать с различными молекулами, включая белки, аминокислоты, и аминофосфолипиды, в результате чего наблюдаются значительные изменения из свойств, приводящие к гибели клеток и повреждению тканей. Продукты химического взаимодействия этих агентов с молекулярными компонентами клетки называются аддуктами (рис. 47).

Рис. 46. Предполагаемый процесс формирования МДА [741]. Алкилпреоксильный радикал (а) взаимодействует с соседней двойной связью, находящейся на той же самой цепи, в результате чего образуется моноциклический пероксид, происходит реорганизация двойных связей, и следующий по положению атом углерода приобретает неспаренный электрон (б). В процессе дальнейшего окисления образовавшегося алкилпероксильного радикала формируется алкилгидропероксил, происходит расщепление углеводородной цепи (в) и образо вание МДА (г).

Рис. 47. Повреждения аминофосфолипидов, белков и ДНК альдегидными продуктами перекисного окисления липидов. В качестве примера показаны молекулярные аддукты (конечные продукты перекисного окисления), образующиеся при взаимодействии с диальдегидом глиоксалем. Образующиеся концевые карбоксильные группы способны вступать в дальнейшие взаимодействия, образуя поперечные сшивки между молекулами [739].

2.2.5.Флавоноиды как антиоксиданты Антиоксидантные свойства флавоноидов широко известны. Многие гипотезы о влиянии флавоноидов на здоровье человека, включая положительное действие на сердечно-сосудистую систему, анти канцерогенное действие и т.д., также основаны на их антиоксидантных свойствах [742]. Флавоноиды, наряду с другими антиоксидантами, поступа ющими в организм с пищей, например витамины Е и С, являются важными компонентами антиоксидантной системы клетки [669;

743]. В соответствии с общепринятой точкой зрения, антиоксидантные свойства флавоноидов основаны на их способности служить ловушками для свободных радикалов, а также хелатировать ионы металлов, участвующих в перекисном окис лении [744;

745].

Полифенольные соединения (Фен) способны взаимодействовать с гидроксильным (L–О•)- и пероксильным (L-OO•)-радикалами липидов (алькоксилами) благодаря их способности отдавать электрон (или атом водорода). В результате образуются радикалы фенолов – феноксилы, которые не участвуют в распространении окислительного процесса. Это связано с уникальной структурой их молекулы, в которой происходит ста билизация электронного облака [746;

747]:

(1) L–OO• + Фен–ОН L-OOH + Фен–О•, (2) L–O• + Фен–ОН L-OH + Фен–О•.

Кроме того, возможно восстановление окисленных полифенолов, которое может происходить разными путями. Например, с участием аскорбиновой кислоты (Аск). В результате, образуется радикал монодигидроаскорбата (МДА•), который превращается в аскорбиновую кислоту и дегидроаскорбиновую кислоту (ДГА) [748;

749]:

(1) 2Фен-О• + Аск 2Фен-ОН + 2МДА•, (2) МДА• + МДА• Аск + ДГА.

В молекулах флавоноидов имеется три области, в наибольшей степени ответственные за радикал-связывающие свойства (рис. 48): (1) – группа из двух соседних гидроксилов на В-кольце, названая катехольной группой;

(2) – 2,3-двойная связь, конъюгированная с 4-оксо группой, которая предположительно способна инициировать делокализацию электронов В-кольца;

(3) – гидроксильные группы в положениях 3 и 5, которые осуществляют захват радикалов.

Рис. 48. Молекула кверцетина. Указаны группы, в наибольшей степени ответст венные за связывание свободных ра дикалов [669].

Предполагается, что гидроксилы катехольной группы кольца В, или гидроксильная группа в положении С–3 являются первичной мишенью для различных оксидантов. При окислении этих групп сначала образуются короткоживущие семихиноновые анион-радикалы, а затем ортохи ноны [750;

751]. Предполагается, что указанные гидроксильные группы могут вовлекаться в единый процесс внутримолекулярных превра щений (рис. 49).

Рис. 49. Возможная последовательность молекулярных превращений кверцетина, иниции руемых атакой радикалов на катехольную группу кольца В.

В соответствии с представленной таблицей (табл. 5), довольно большой активностью обладают кверцетин и мирицетин, поскольку они содержат практически все элементы, ответственные за способность связывать радикалы. В целом флаван-3-олы еще более активны, особенно эпигаллокатехин-галлат (EGCG). Необходимо отметить, что флаван-3-олы, т.е. флавоноиды, имеющие гидроксильную группу в положении 3, что важно для поддержания антирадикальной активности, приобретают допол нительную активность, если они имеют также катехольную группу.

Напротив, флавоноиды, имеющие катехольную группу и двойную связь в положении 2,3, но не имеющие гидроксильной группы в положении 3, проявляют пониженную активность. Это свидетельствует о необходимости сочетания всех факторов для проявления высокой активности.

Таблица 5. Соотношение структуры и активности флавоноидов в присутствии радикала дифенлпикрилгидразина [669].

Флав:радикал, Флавоноиды 3’ 4’ 5’ 3 5 моль/моль Флавоны Апигенин ОН ОН ОН - - - Лютеолин ОН ОН ОН ОН 3,9±0, - Флавонолы Фисетин ОН ОН ОН ОН 6,1±0, - Кемпферол ОН ОН ОН ОН 1,9±0, - Кверцетин ОН ОН ОН ОН ОН 6,6±0, Мирцетин ОН ОН ОН ОН ОН ОН 7, Флаван-3-олы ОН ОН ОН ОН ОН 4,9±0, (_)-EC ОН ОН ОН ОН ОН ОН 6,8±0, (_)-EGC ОН ОН ОН ОН 6,4±0, (_)-ECG O-галлат ОН ОН ОН ОН 9,3±1, ОН _ ( )-EGCG O-галлат Примечание. EC – эпикатехин, EGC – эпигаллокатехин, ECG – эпикатехин-галлат, EGCG – эпигаллокатехин-галлат.

Немаловажным фактором для проявления антиоксидантной активности в отношении углеводородных цепей липидного бислоя является гидрофобность антиоксидантов. Так, было показано, что EGCG высоко гидрофобен и растворяется в бислое. Этот агент более гидрофобен, чем витамин Е, что объясняет его большую активность в защите липидного бислоя. Представленная выше упрощенная картина антиоксидантных свойств флавоноидов не может быть полной без более широкого анализа способности этих веществ захватывать свободные радикалы. Для сравнения способности флавоноидов служить ловушками для свободных радикалов можно использовать скорости реакций между флавоноидами и различными радикалами с использованием импульсного радиолиза [743]. Было обнаружено, что радикал-связывающие свойства флавоноидов сильно варьируют в отношении различных агентов. Так, катехин-галлаты проявляют высокую активность только в отношении супероксид-радикала кислорода (O2•), но не к остальным, подчас намного более активным радикалам. Напротив, малоактивные в отношении супероксид-радикала лютеолин и кемпферол проявляют наибольшую активность в отношении радикалов ОН•, N3•, t-BuO•. Еще более скромными выглядят способности кверцетина в защите процессов автоокисления во фракции мембран, полученных из мозга крысы, в сравнении с флавоноидами нарингенином и гесперетином [752].

Теоретические исследования показывают, что антиоксидантная активность катехинов связана со способностью гидроксилов катехольной группы образовывать водородные связи с двумя кислородами пероксидного радикала липидов, в результате чего происходит захват пероксидного радикала и образование компактного реакционного комплекса [753].

В настоящее время не существует общей теории, позволяющей связать структуру флавоноидов с их антиоксидантной активностью, однако можно предположить, что существует специализация флавоноидов в защите организма от различных повреждающих агентов. Неверно утверждать, что какие-то флавоноиды более эффективны, чем другие, не учитывая конкретных условий эксперимента и особенностей окислителя. Большое разнообразие флавоноидов в природе позволяет этим веществам осуществлять всестороннюю защиту организмов от множества различных угроз внешней среды.

2.2.6. Продукты окисления в клеточной сигнализации В клетке существуют нормальные физиологические процессы продуцирования супероксид-радикала кислорода О2• с участием NADPH оксидаз, присутствующих во всех типах клеток [754-756]. Кроме того, О2• генерируется митохондриями, которые имеют ряд различных сайтов продуцирования супероксида [757;

758]. Это убихинон-связывающие сайты комплекса I (сайт IQ) и комплекса III (сайт IIIQo), глицерол-3-фосфат дегидрогеназа, комплекс флавина I (сайт IF), электрон-переносящий флавопротеин Q-оксидоредуктаза (ETFQOR) -окисления жирных кислот, цитохром с оксидоредуктаза, комплекс цитохрома bc1, и наконец, пируват и 2-оксиглутарат-дегидрогеназы. Возможность повреждения матрикса или ДНК митохондрий зависит от локализации этих сайтов. Все сайты имеют локализацию в матриксе, но сайты IIIQo и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа находятся также в межмембранном пространстве, что способствует выходу супероксида в цитоплазму. Относительный вклад этих сайтов в продуци рование супероксида в значительной мере зависит от типа клеток и может изменяться в различных физиологических состояниях [757]. Мито хондриальная супероксиддисмутаза способна нейтрализовать образую щийся супероксид-радикал – главный компонент митохондриальных реактивных форм кислорода (ROS), которые регулируют процессы клеточного выживания или смерти, регулируют ретроградный путь клеточной сигнализации из цитоплазмы к ядру и участвуют в развитии многих физиологических процессов (рис. 50).

Этот механизм распространения сигналов между митохондриями, другими органеллами и клеточным окружением является мишенью многих лекарственных веществ [759]. Попадая в клеточное окружение, супероксид может проникать в цитоплазму соседних клеток через анионный канал и участвовать в процессах сигнализации [760]. Однако при проникновении в цитоплазму он может быстро удаляться супероксиддисмутазой, которая присутствует в высокой концентрации и обладает поразительно высокой активностью. При этом образуется перекись водорода и вода. Поэтому вопрос о действительном участии супероксид-радикала в межклеточной коммуникации остается открытым [761].

В отличие от супероксид-радикала, участие перекиси в качестве вторичного мессенджера хорошо известно. При этом супероксид-радикал является ее непосредственным и основным предшественником благодаря активности супероксиддисмутазы в митохондриях. Дополнительным источником перекиси водорода могут служить две NADPH-оксидазы семейства Nox/Duox, катализирующие двухэлектронное окисление кислорода в митохондриях фагоцитов, обеспечивая бактерицидное действие этих клеток. Перекись водорода может также использоваться для сигнализации клеточного роста в процессах ангиогенеза, в развитии иммунных процессов, в клеточном ответе на гипоксию и окислительную модификацию белков внеклеточного матрикса [762]. Благодаря этому NADPH-оксидазы семейства Nox/Duox служат мишенью для терапев тического воздействия при лечении рака, воспалительных процессов, нейродегенеративных заболеваний, регуляторов роста кардиомиоцитов, клеток легочного эпителия и др. [763–767].

Еще одним важным регулятором, влияющим на сигнальные пути посттрансляционной модификации, является продукт окисления полиненасыщенных жирных кислот 4-гидроксиноненал (4-hydroxynonenal, 4-HNE). Этот агент обнаруживают во всех типах ткани животных при активации процессов окислительного стресса. Предполагается, что 4-HNE может играть ключевую роль в передаче сигналов клеточного деления и клеточной адгезии.

Рис. 50. Локализация в клетке центров продукции и распространения супероксид-радикала и перекиси водорода. Супероксид продуцируется снаружи клетки с помощью NADPH оксидазы, располагающейся на поверхности мембраны (1), далее дисмутирует с участием внеклеточных супероксиддисмутаз и образует Н2О2 (2), который может проникать в цитоплазму через аквапорин (3). Супероксид может проникать в клетку через анионный канал (4), где дисмутирует в Н2О2 и О2 с участием Cu- и Zn-зависимых супероксиддисмутаз Cu/ZnSOD (5). В цитоплазме пероксидоксины Prdx (6) и глутатионпероксидазы Gpx (7) быстро удаляют Н2О2. Реакции сопряжены с процессом окисления глутатиона (GSH) и тиоредоксина Trx(SH)2, в результате чего образуются дисульфиды глутатиона GSSG и тиоредоксина TrxS2.

Каталаза, присутствующая в пероксисомах, также удаляет избыток Н2О2 (8). Супероксид продуцируется митохондриями путем окисления убисемихинона (9) благодаря реакции, инициируемой с участием Mn-зависимой супероксиддисмутазы MnSOD (10), в результате чего образуется Н2О2. Если на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрии генерируется О2•, то он будет дисмутировать при участии Cu/Zn SOD (11), что приводит к образованию Н2О2 и О2. NADPH-оксидаза, присутствующая на внешней мембране ядра или на мембранах эндоплазматического ретикулума, продуцирует О2• (12). Подробнее об этом можно прочитать в обзоре [761].

Присутствие в тканях 4-HNE может служить причиной воспали тельных, нейродегенеративных, респираторных и раковых заболева ний [768-770]. В клетке уровень 4-HNE регулируется активностью глутатион-S-трансфераз (GST), которые конъюгируют глютатион-содер жащие пептиды с 4-HNE, в результате чего образуются водорастворимые молекулы GS-HN, которые не способны инициировать развитие окислительного стресса.

Недавно было обнаружено, что некоторые флавоноиды также оказывают защитное действие на клетки при повышенных концентрациях 4-HNE. Так, кемпферол способен защищать клетки РС-12 от апоптоза, вызванного действием 4-HNE [138]. Кемпферол взаимодействует непосред ственно с цитоплазматической субъединицей NADPH-оксидазы (субъеди ница p-47phox), благодаря чему наблюдается ингибирование повышенной активности NADPH-оксидазы, вызванной действием 4-HNE. Благодаря этому происходит терминация сигнального пути от NADPH-оксидазы к протеинкиназе c-Jun-N и далее к белкам апоптоза Bcl-2 и каспазе-3 (сиг нальный путь NOX-JNK). Предполагается, что кемпферол может служить эффективным профилактическим средством против нейродегенерации, связанной с действием NADPH-оксидазы.

Ранее, этими же исследователями было показано, что аналогичным действием могут обладать флавоноиды красного вина [771] и проциа нидины какао [772]. Примечательно, что наибольшей активностью обладал не самый известный агент красного вина ресвератрол, а флавоноиды квер цетин и мирицетин, также присутствующие в вине [771]. Авторы объяснили способность этих флавоноидов препятствовать апоптозу клеток тем, что наблюдалась защита поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы от ингибирующего действия 4-HNE. Что касается процианидинов какао, то их мишенью служи ли белки апоптоза Bcl-2 и Bcl-X, активность которых снижалась. При этом повышалась активность каспазы-3, наблюдалась активация с-Jun N-кон цевой протеинкиназы (JNK), а также митоген-активируемой протеин киназы 4 (MKK4).

Многочисленные исследования показывают, что изофлавоны сои снижают риск развития рака молочной железы также благодаря защите от действия 4-HNE. В частности, было обнаружено, что генистеин способен влиять на экспрессию глютатион-S-трансферазы в клетках эпителия молоч ной железы человека, нарушенную токсическим действием продуктов перекисного окисления и, в частности, 4-HNE. При этом снижается возможность повреждения клеточной ДНК, наблюдающаяся в присутствии 4-HNE, что предотвращает возможность неопластического роста этих тканей и развития опухоли [773].

2.3. Флавоноиды как хелаторы металлов Флавоноиды хорошо связывают ионы металлов и образуют с ними комплексы. Поскольку многие металлы, прежде всего металлы переменной валентности, например ионы железа и меди, являются инициаторами перекисного окисления и способствуют образованию свободных радикалов, связывание ионов этих металлов является важным вкладом флавоноидов в защиту организма от окислительного стресса [718;

774;

775]. Таким обра зом, антиоксидантное действие флавоноидов определяется не только их способностью удалять свободные радикалы из среды путем непосред ственного взаимодействия с ними, но также способностью связывать (хела тировать) и удалять из среды ионы металлов, инициирующих появление свободных радикалов.

По мнению многих исследователей, хелатирование металлов является наиболее эффективным путем подавления процессов перекисного окисления флавоноидами [776-778]. Более того, при образовании комплексов с металлами переменной валентности, например Fe(II), Fe(III), Cu(I), Cu(II) и др., способность флавоноидов нейтрализовать свободные радикалы возрастает. Этот эффект достигается благодаря тому, что ком плексы флавоноидов с металлами обладают супероксиддисмутазной активностью [743;

774;

775]. Указанные реакции комплекса флавоноида с металлом и супероксид-анион-радикалом можно записать следующим образом:

(1) Me(n+1)+– Флав + O2• Men+ Флав + O2, (2) Men+– Флав + O2• + 2H+ Me(n+1)+– Флав + H2O2, где Ме – металлы переменной валентности: Fe (n = 2);

Cu (n = 1) и др.

Эти процессы были обнаружены не только in vitro, но также в экспериментах на животных. Так, комплексы Cu-рутин эффективно защи щали от окисления легочную ткань животных, вдыхавших асбестовую пыль [779]. Исследовались также антиоксидантные свойства флавоноидов с другими металлами, например комплексов морина с Pd(II) и Pt(II). Было показано, что при образовании комплексов способность морина связывать супероксид-радикал и препятствовать окислению липидов возрастает.

При этом, комплекс с Pt(II) обладал большей активностью, чем комплекс с Pd(II) [780]. Комплексы морина с ионами La(III), Gd(III), Lu(III) прояв ляют антибактериальную активность в отношении Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, сравнимую с действием пени циллина [781]. Комплексы кверцетина с трехвалентными редкоземельными металлами (La, Nb, Eu, Gd, Tb, Dy, Tm, Y) обладают токсичностью в отношении клеток опухолей. Показана также их способность связываться с молекулой ДНК, что вероятно вносит определенный вклад в антиопухо левую активность этих комплексов [782-784]. Высокая антиоксидантная активность и способность связываться с ДНК была обнаружена также у комплексов нарингенин-2-гидроксибензоил гидрозона с трехвалентными редкоземельными металлами Y и Eu [785] или комплексов гесперетин-4 бензоил гидразона с трехвалентными лантаноидами, особенно с Nd [786].

Высокую активность на животных, на клетках из различных органов или на субклеточных фракциях обнаруживали металлокомплексы рутина, кверцетина, катехина и других флавоноидов [718;

776-778;

787], что свиде тельствует не только о большой общебиологической значимости этих комплексов, но также открывает перспективы их использования в меди цине [788].

2.3.1. Взаимодействие флавоноидов с металлами Потенциально молекулы флавоноидов могут иметь несколько сайтов связывания металлов, положение которых определяется наличием пар расположенных рядом гидроксильных или карбонильных групп. Так, в связывании могут принимать участие пара 3’- и 4’-гидроксильных групп кольца В. Указанную пару гидроксилов часто называют катехольной группой, хотя эта группа присутствует не только в катехинах, но и в неко торых других флавоноидах, например, в кверцетине, таксифолине и др.

Кроме того, в связывании металлов могут принимать участие 3-гидро ксильная и 4-карбонильная группы кольца С или 5-гидроксильная и 4-кар бонильная группы, принадлежащие кольцам А и С соответственно.

Катехольная группа рассматривается некоторыми исследователями как наиболее вероятный центр связывания металлов. Связывание металлов в этом положении может облегчаться в щелочных средах (рН 10) вследствие депротонирования гидроксилов. Этот сайт связывания был исследован на примере комплекса кверцетина с ионами Cu(II) [789]. При создании комплекса соотношение кверцетин : медь (II) составляло 2:1 (рис. 51).

Рис. 51. Комплекс кверцетина с двухвалентной медью. Соотношение кверцетин : медь = 2 : 1.

Атом меди взаимодействует с гидроксилами катехольных групп, благодаря чему связывает две молекулы кверцетина [789]. В предложенной схеме молекулы кверцетина располагаются в ортогональных плоскостях.

Не все флавоноиды имеют катехольную группу. Более того, количество гидроксильных групп в молекулах некоторых флавоноидов весьма ограничено, что облегчает анализ структуры комплексов. Например, в комплексе гликозида нарингенина с медью имеется лишь одно место связывания катиона металла в положении 5-гидроксильная и 4-карбо нильная группы (рис. 52). Было обнаружено, что образование комплекса с медью повышает антиоксидантные свойства нарингенина. Кроме того, повышается токсичность этого вещества в отношении клеток злокачест венных опухолей, усиливается антивоспалительное действие [790].

Однако в некоторых случаях положение атома металла, а также стехиометрию комплексов трудно определить и этот вопрос до сих пор является предметом дискуссий. При взаимодействии кверцетина с ионами железа различной валентности предполагается возможность образования комплексов с различной стехиометрией связывания. Расчеты показы вают [791], что из трех возможных сайтов связывания (рис. 53, а–в) наи Рис. 52. Комплекс нарингенина с двухва лентной медью. Соотношение нарин генин : Cu(II) = 1:1. Нарингенин растворен в этиловом спирте, поэтому в состав комплек са входят две молекулы этанола. Структура металлокомплекса определена с помощью спектроскопии в инфракрасной, ультра фиолетовой и видимой областях, а также на основании данных ЯМР [790].

большая энергия связывания ионов железа в молекуле кверцетина наблюдается в комплексе с 3-й гидроксильной и 4-й карбонильной группами (рис. 53 а). За ними следуют 4-я карбонильная и 5-я гидрок сильная группы (рис. 53 б), а также 3’-я и 4’-я гидроксильные группы (рис.53 в).

Рис. 53. Предполагаемая структура комплексов кверцетина с атомами железа с различной стехиометрией связывания:

(а–в) – стехиометрия кверцетин/же лезо 1:1;

(г) – 2:1;

(д) – 3:2;

(е) – 3:1.

Взято из работ [791;

793].

Стехиометрия связывания зависит от валентности железа и может составлять величины 1:1, 1:2, 2:3 и 1:3 для Fe(II) и Fe(III) (рис. 53). Таким образом, теоретически возможно образование комплексов железа с одной, двумя и тремя молекулами кверцетина. Как упоминалось в предыдущих главах, благодаря реакции Фентона, переход между формами железа Fe(II) и Fe(III) значительно облегчается в присутствии перекиси водорода [713;

714], которая образуется в клетке в процессе различных окислительно восстановительных реакций, протекающих в митохондриях и частично в эндоплазматическом ретикулуме [714]. Поэтому в клетке потенциально могут присутствовать ионы железа с различной степенью окисленности.

В то же время, необходимо учитывать, что благодаря наличию восстано вительных агентов, таких как НАДН-редуктаза, аскорбиновая и лимонная кислоты, а также тиоредоксин, катионы железа in vivo присутствуют большей частью в восстановленной форме (Fe2+), тогда как окисленная форма железа (Fe3+) практически не встречается [792].

2.3.2. Липофильность металлокомплексов Образование комплексов флавоноидов с катионами железа может оказывать существенное влияние на их липофильность и взаимодействие с фосфолипидным бислоем. Так, расчеты коэффициента распределения молекул в системе октанол/вода (C log P) показывают, что комплекс кверцетин–железо (1:1) менее гидрофобен, чем молекула свободного кверцетина, однако липофильность существенно возрастает в комплексах кверцетин–железо 2:1, 3:2, 3:1 (табл. 6).

Таблица 6. Расчетные величины коэффициента распределения кверцетина и его комплексов с железом в системе октанол/вода (C log P).

Вещество С log P Кверцетин 1, Кверцетин/железо (1:1) 0, Кверцетин/железо (2:1) 3, Кверцетин/железо (3:2) 5, Кверцетин/железо (3:1) 6, Примечание. Данные получены с использованием программы Chem3DUltra 9.0 (программный пакет Chemical Office, Cambridge Soft). Величина C log P 1 свидетельствует о повышенной липофильности вещества.

Расчеты показывают, что образование комплекса кверцетина с железом не препятствует взаимодействию этого флавоноида с фосфолипидным бислоем. В соответствии с расчетами, данное взаимо действие может усиливаться в металлокомплексах с соотношением кверцетин–железо 2:1, 3:2 или 3:1, тогда как липофильность металлокомплекса 1:1 ниже липофильности свободного кверцетина.

Экспериментальные измерения также показывают рост липофильности флавоноидов в присутствии железа, что выражается в росте величины коэффициента распределения этих веществ в системе октанол / вода (рис. 54). Однако получаемые величины log P существенно меньше расчетных величин C log P, полученных для комплексов кверцетин/железо 1:1.

Рис. 54. Зависимость коэффициента распределения (log P) в системе октанол / вода от соотношения железо(II)/фла воноид для кверцетина (а) и таксифолина (б).

2.3.3. Стехиометрия металлокомплексов Экспериментальные исследования взаимодействия различных комплексов флавоноидов с металлами показывают, что их стехиометрия сильно зависит от концентрации протонов. При слабокислых или нейтральных рН координационное число может быть выше, чем в щелочных средах. Для образования комплексов оптимальным явля ется рН 6 (табл. 7).

Таблица 7. Стехиометрия комплексов флавоноидов с металлами.

Флавоноид Ион металла Флав/металл рН Cu(II) 1:2 6, Zn(II) 1:1 6, Pb(II) 1:2 4, Ni(II) 1:2 6, Co(II) 1:1 5, Рутин CoO42- 1:1 6, WO42- 1:2 7, Eu(III) 1:2 5, UO2(II) 1:1 6, Pd(II) 1:2 8, TiO(C2O4)22- 1:2 6, Ni(II) 1:1 5, Co(II) 1:1 5, Кверцетин Pd(II) 1:1 6, TiO(C2O4)22- 1:2 6, Cu(II) 1:2 5, Zn(II) 1:2 5, WO42- 1:2 5, Морин Pd(II) 1:1 5, TiO(C2O4)22- 1:2 4, Ba(II) 1:1 4, Cu(II) 1:2 5, UO2(II) 1:2 3, Гесперетин Al(III) 1:1 3, Zr(IV) 1:1 3, Примечание. Частично заимствовано из [774].

При высоких концентрациях протонов (рН 3) гидроксильные группы не диссоциируют, что препятствует формированию комплексов с металлами [774]. Образование комплексов кверцетина с железом можно анализировать по спектрам поглощения кверцетина в видимой и ультра фиолетовой областях. Известно, что кверцетин имеет два максимума поглощения: при 373 нм (полоса 1) и при 255 нм (полоса 2). Полоса относится к электронным переходам В-кольца, тогда как полоса 2 связана с переходами А-кольца кверцетина [794]. При титровании кверцетина возрастающими концентрациями железа максимум при 373 нм снижается, но при этом появляется и растет максимум при 425 нм, что связано с появлением металлокомплекса (рис. 55).

Рис. 55. Определение стехиометрии Б A Абсорбция, 425 нм кверцетин:Fe(II) методом титрования.

0, 372 нм А – набор спектров кверцетина в концен 0,4 0, трации 20 мкМ (1) и комплексов 425 нм кверцетина с железом в концентрациях Абсорбция 0, 2 мкМ, 4 мкМ, 6 мкМ, 8 мкМ, 10 мкМ 0 20 40 60 0, (номера 2–6 соответственно).

[Fe] M 398 нм Б – зависимость величины абсорбции при 425 нм от концентрации железа. Излом 0,0 кривой приходится на 10 мкМ железа, что соответствует стехиометрии квер 200 300 400 500 цетин/железо 2:1.

нм Полученный набор кривых имеет одну изоcбестическую точку при 398 нм, что свидетельствует о наличии единого равновесного и обра тимого процесса формирования обоих хромофоров [795]. Зависимость величины абсорбции при 425 нм от концентрации железа может быть аппроксимирована к прямой, имеющей излом при концентрации железа 10 мкМ. Учитывая, что в эксперименте концентрация кверцетина была 20 мкМ, мы получаем стехиометрию кверцетин : Fe = 2:1. Спектры комплексов кверцетина с железом (II), полученные при смешивании компонентов в различных молярных отношениях, не имеют изосбестической точки, что характерно для указанного способа смешивания компонентов (рис. 56). Полученная зависимость величины поглощения от молярных отношений компонентов имеет максимум при отношении 3:2.

Коэффициент распределения полифенолов в системе вода–октанол (log P), определяющий их липофильность и способность погружаться в гидрофобную область фосфолипидного бислоя биологических мембран, коррелирует с их антиоксидантной активностью и способностью прерывать процессы окисления липидов как в полярной, так и в гидрофобной областях мембраны, в зависимости от степени погружения этих молекул в би слой [796].

Способность флавоноидов погружаться в гидрофобную область мембраны снижается для молекул с большим числом гидроксильных групп [797]. На способность флавоноидов погружаться в бислой может влиять концентрация солей и присутствие отрицательно заряженных липидов в мембране [798]. На примере катехинов было показано, что даже различные стериоизомеры этих молекул способны по разному влиять на физические свойства бислоя [799].

Рис. 56. Определение стехиометрии квер Б Абсорбция при 425 нм A 0, цетин / Fe(II) методом молярных соотноше ний. А – спектры поглощения кверце 0, тина (1) и комплексов кверцетина 0, 0,4 Абсорбция с железом, полученных путем смешивания 0, кверцетина и железа в молярных соотноше 8/2 6/4 4/6 2/ ниях 8:2, 6:4, 4:6, 2:8;

1:9 (номера 2–6 соот Кверцетин / Fe 0, ветственно). Б – зависимость абсорбции 2 при 425 нм от соотношения кверце тин/железо. Максимум кривой приходится 0, на соотношение кверцетин/железо 6:4.

200 300 400 500 нм 2.4. Действие флавоноидов на биологические мембраны Цитоплазма любой клетки отделяется от окружающей среды клеточной мембраной, которую называют плазматической. Кроме того, у эукариотических клеток мембраны отделяют различные внутриклеточные компартменты, благодаря чему внутри клетки различают такие органеллы, как ядро, митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, вакуоли, хлоропласты, лизосомы.

Функции мембран разнообразны, но главная функция – барьерная.

Мембраны разделяют две водные среды, например, клеточное окружение и цитоплазму, цитоплазму и кариоплазму (содержимое ядра), цитоплазму и внутренний просвет вакуоли и т.д. Для поддержания жизнедеятельности клетки важно то, что мембраны являются барьерами, обладающими избирательной (селективной) проницаемостью для различных веществ.

Практически все жизненно важные вещества могут проникать через мембраны, но пути и механизмы их проникновения, а также направление их движения различны, и эти различия являются основой клеточного метаболизма. Барьерные свойства мембран позволяют клетке защищаться от проникновения патогенных агентов и направленно транспортировать компоненты метаболических процессов [800-803].

Являясь полупроницаемым барьером для веществ, мембраны также обладают способностью к рецепции и избирательному проведению сигналов с поверхности клетки в цитоплазму, что определяет сигнальную функцию мембран [804;

805]. Однако многие процессы жизнедеятельности непосредственно связаны с самой мембраной и протекают на ее поверх ности или в глубине гидрофобной области. Мембрана высоко структури рована, и различные ее участки отличаются не только функционально, но также и по химическому составу. Две противоположные поверхности мембраны тоже существенно различаются, как функционально, так и по химическому составу, что придает векторную направленность процессам переноса веществ через мембраны [806;

807].

Имея высокую структурированность, мембраны также являются динамичными жидкокристаллическими образованиями. В основе их организации лежит бислойная структура, образованная фосфолипидами.

Известно, что фосфолипиды, как природного происхождения, так и их синтетические аналоги, способны спонтанно образовывать бислойные структуры при гидратации. Наиболее известным фосфолипидом, спонтанно образующим бислойные структуры, обычно в форме липосом, является фосфатидилхолин. Общая фракция фосфолипидов, полученных из некоторых природных источников, например липиды из яичного желтка (яичный лецитин), липиды сои (соевый лецитин), липиды клеток мозга различных животных, тоже могут образовывать липосомы.

Кроме фосфолипидов, структурное разнообразие и функциональная специализация клеточных мембран в значительной степени определяется присутствием в них белков, а также других молекул, прежде всего холестерина. Представление о том, что мембранные белки, прикрепленные к поверхности или интегрированные в бислой фосфолипидов, могут диффундировать в плоскости бислоя как в жидкости, а в некоторых случаях могут собираться вместе виде «островов» в жидком «озере» липидов, нашло отражение в так называемой «жидкостно-мозаичной» модели мембраны, предложенной Сингером и Николсоном в 1972 г. [808]. Эта модель не потеряла актуальности и в наше время, несмотря на внесенные изме нения и дополнения.

В основе структуры биологических мембран лежит бислой, образованный липидами. Именно липиды являются основным строи тельным элементом, определяющим многие физические свойства мембран и создающим специфические условия для функционирования мембранных белков. Термин «липиды» происходит от греческого «липос» – жир. Они представляют собой большую группу природных органических веществ, которые выделяют из тканей различных организмов с помощью органических растворителей (хлороформ, спирты, ацетон). В соответствии с современной классификацией, липиды разделяют на восемь больших классов: глицеролипиды, глицерофосфолипиды, жирные кислоты, сфинголипиды, стероидные липиды, пренольные липиды, гликолипиды и поликетиды [809]. Большая часть липидов, входящих в состав мембран клеток, принадлежит к классу глицерофосфолипидов, которые часто называют просто фосфолипидами.

Молекулы липидов имеют полярную, способную взаимо действовать с водой (гидрофильную) часть и неполярную, не растворимую Рис. 57. Липиды, наиболее часто встречающиеся в мембранах эукариот.

PC – фосфатидилхолин, LPC – лизофосфатидилхолин, PA – фосфатидная кислота, LPA – лизофосфатидная кислота, PE – фосфатидилэтаноламин, PG – фосфатидилглицерин, PS – фосфатидилсерин, CL – кардиолипин, Chol – холестерин, FA – жирная кислота, PI – фосфатидилинозитол, PIP3 – фосфатидилинозитол-трифосфат, DAG – диацилглицерин, Sph – сфингозин, Sph1P – сфингозин-1-фосфат, SphM – сфингомиелин, Cer – церамид, GlcCer – глюкозилцерамид. Остаток глицерина (глицериновый остов) выделен жирным.

в воде (гидрофобную) часть, представленную углеводородными цепочками, которые часто являются остатками жирных кислот (рис. 57). В полярной части молекулы могут иметь одну или несколько фосфатных групп, несущих отрицательный заряд. Большинство липидов в полярной части молекулы имеют также дополнительные гидрофильные группы, несущие заряды, что определяет суммарный заряд молекулы, который обычно бывает отрицательным или нейтральным, хотя в природе встречаются также положительно заряженные липиды.

Многие из представленных липидов являются глицеролипидами.

Часто они имеют также фосфатную группу и поэтому их относят к глицеро фосфолипидам. В молекуле фосфатидилхолина (PC), как в большинстве глицерофосфолипидов, имеется глицериновый остов, к которому в поло жениях 1 и 2 присоединены сложноэфирной связью остатки жирных кислот.

Следует заметить, что жирная кислота в положении 2 часто имеет одну или несколько двойных связей в цис-конформации. В молекулах сфинголипидов (SphM, GlcCer, PI, PIP3) в положении 2 углеводородная цепь прикрепляется посредством амидной связи. Полярная часть молекулы PC имеет две заряженные группы: фосфатную с зарядом (–) и холиновую группу с зарядом (+). Таким образом, суммарный заряд фосфатидилхолина равен нулю. Полярная группа молекулы является цвиттер-ионом и проявляет свойства диполя. Такую же полярную группу имеет LPC, который отличается от РС отсутствием остатка жирной кислоты в положении 2.

Свойствами цвиттер-иона обладает также молекула SphM, полярная область которой не отличается от РС. Кроме того, имеется ряд нейтральных молекул, не имеющих заряда. К ним относятся Chol, DAG, Cer, GlcCer.

Отрицательный заряд, присутствующий на фосфатной группе, часто не компенсируется наличием положительного заряда, вследствие чего общий заряд молекул отрицательный. К таким молекулам относятся PA, LPA, PG, PI, Sph1P. Два отрицательных и один положительный заряд присутствует в молекуле фосфатидилсерина (PS), тогда как кардиолипин (CL) имеет две фосфатных группы, и соответственно – два отрицательных заряда. Среди представленных липидов наибольшее число отрицательных зарядов (около пяти) несет молекула PIP3.

Таблица 8. Липидный состав различных органов крысы.

Ткань Липид Сердце Печень Эритроциты Chol – эфиры - 2 TAG 4 7 DAG 1 - Chol 4 5 CL 12 5 PE 33 20 PI 4 4 PS - - PC 39 55 SphM 2 2 LPC - - Примечание. Заимствовано из [810].

Меньшая вариабельность характерна как для липидов, присутст вующих в больших количествах (PC, PE), так и для некоторых минорных липидов, например PI. Известно, что эритроциты содержат только плазматическую мембрану и поэтому представленные выше данные по эритроцитам интересно сравнить с данными о составе плазматичских мембран других клеток (рис. 58).


Анализ липидного состава мембран, полученных из различных источников, обнаруживает существенные вариации (табл. 8). Значительная вариабельность в содержании CL связана с различиями количества митохондрий в клетках разнообразных тканей. Наблюдается также большая вариабельность в содержании Chol и SphM.

Эритроциты 60 Кровяные пластинки Фосфолипиды, % Фосфолипиды, % Фосфолипиды, % Лимфоциты Тучные клетки 40 20 0 PC PE PS PI SM PC PE PS PI 0 PC PE PS PI SM SM Цитоплазматический лепесток Экстраклеточный лепесток Плазмамембрана Рис. 58. Фосфолипидный состав и асимметрия распределения фосфолипидов в плазматической мембране клеток из различных тканей человека. Заимствовано с изменениями из [811].

В представленных данных на примере клеток из различных тканей человека видно, что большинстве случаев в составе плазматической мембраны доминирует фосфатидилхолин, хотя, как видно из предыдущей таблицы (табл. 9), это не является универсальным правилом для всех млекопитающих. При этом PC и SphM доминируют во внешнем монослое плазматических мембран всех клеток, тогда как во внутреннем монослое наблюдается значительное преобладание PE, PS и PI.

Таблица 9. Состав фосфолипидов в мембранах гепатоцитов крысы, полученных из разных субклеточных структур [814-816].

Мембраны (моль % фосфора) Липид Все ткани Ядро Митохондрии Микросомы Плазмамембраны – – CL 5 15 PE 25 26 34 22 PI 7 4 7 8 PS 3 6 1 4 PC 51 57 41 59 SphM 4 6 2 4 – LPC 1 1 2 Различия состава липидов во внешнем и внутреннем монослоях клеточной мембраны связаны с их биогенезом. Кроме того, различия поддерживаются с помощью ферментов флиппаз, участвующих в АТФ зависимом процессе транслокации липидов между монослоями. Флиппазы располагаются не только в плазматической мембране, но и в мембранах аппарата Гольджи, где обеспечивают асимметричное расположение липидов и белков в бислоях, которые в форме везикул доставляются к плазматической мембране [812;

813].

Асимметричное расположение PS в плазматической мембране клеток играет важную роль во многих биологических процессах. Например, при апоптозе асимметричное расположение PS нарушается и этот липид мигрирует из внутреннего монослоя во внешний. Это является сигналом «съешь меня» для активации фагоцитов, которые удаляют отмирающие клетки [817]. Таким образом, асимметричное расположение PS в плазма тических мембранах клеток участвует в регуляции иммунного ответа в отношении мертвых или умирающих клеток, включая клетки раковых опухолей.

Липидный состав клеточных органелл также различается. Главной причиной этих различий являются особенности синтеза липидов и их трафика в клетке. Большая часть липидов, включая главные структурные фосфолипиды, церамиды и холестерин, синтезируется в эндоплазма тическом ретикулуме [818]. Синтезированные липиды транспортируются в другие части клетки. Так, например, хотя холестерин синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), здесь его содержание невелико, поскольку он доставляется к плазматической мембране. Зато ЭР богат такими нетипичными для плазматической мембраны липидами, как DAG, который служит предшественником в синтезе многих липидов. Здесь же присутствует долихол – липид полиизопреновой природы, участвующий в гликозилировании белков и липидов.

Аппарат Гольджи также участвует в синтезе липидов. Он специали зируется в синтезе сфинголипидов и производит SM, глюкозилцерамид (GlcCer), лактозилцерамид (LacCer), которые в дальнейшем направляются к плазматической мембране [819].

Поток мембранного материала, а с ним и липидов, движется не только из цитоплазмы на поверхность клетки, но также и в обратном направлении. Плазматическая мембрана доставляет липиды в цитоплазму в процессе эндоцитоза. Ранние эндосомы мало отличаются от плазмати ческой мембраны, но в дальнейшем они, по мере созревания, теряют холестерин и PS, но обогащаются бис-(моноацилглицеро)фосфатом (BMP), который участвует в процессах слияния эндосом и в гидролизе сфинго липидов [820]. В процессе созревания эндосом большую роль играют также фосфоинозитол-фосфаты, с одной или несколькими фосфатными группами, прикрепленными в различных положениях к инозитиду, которые играют важную роль в регуляции процессов эндосомального трафика везикул [821].

Липидный состав митохондрий, особенно внутренней мембраны, образующей кристы, резко отличается от состава остальных частей клетки, но близок к таковому у бактерий [818]. Прежде всего необходимо упомя нуть о присутствии в составе внутренней мембраны митохондрий CL, кото рый характерен также для мембран бактериальных клеток. С метаболизмом CL связано также присутствие в мембране митохондрий PA и PG.

В мембране практически отсутствуют SphM и PS, но в них высоко содер жание PE. Содержание холестерина во внутренней мембране митохондрий обычно мало, хотя исключение составляют клетки, участвующие в синтезе стероидов, у которых холестерин присутствует и в митохондриальных мембранах [822].

2.4.1. Взаимодействие флавоноидов с фосфолипидным бислоем Для флавоноидов, так же как и для многих других биологически активных веществ, гидрофобность и, соответственно, способность взаимо действовать с биологическими мембранами является одним из необходимых условий проявления фармакологической активности [823]. Однако моле кулы флавоноидов, которые являются полифенолами, располагают значи тельным числом гидроксильных групп, определяющих полярность молекулы и ответственных за проявление слабых кислотных свойств.

Обратная корреляция между числом гидроксильных групп и гидро фобностью флавоноидов была показана экспериментально [824]. Кроме того, в исследованиях методом дифференциальной сканирующей микро калориметрии (ДСК) были обнаружены существенные различия в способности флавоноидов влиять на процессы плавления липи дов (рис. 59).

Так, действие гликозидов флавоноидов, например рутина, на про цессы плавления липидов практически не наблюдалось. Это связано с тем, что гликозиды лучше растворимы в воде, чем соответствующие агликоны, и поэтому способны взаимодействовать только с поверхностью липидного бислоя, тогда как их влияние на плавление гидрофобной области незначи тельно [825;

826]. Такое же незначительное влияние на плавление липидов оказывают катехин и мирицетин – флавоноиды, известные как сравнительно гидрофильные соединения, слабо взаимодействующие с фосфолипидным бислоем [827].

Влияние таксифолина и кверцетина на плавление липидов было существенно бльшим. Увеличивалась ширина перехода, в то время как максимум перехода снижался на несколько градусов. Исследования, прове денные с использованием флуоресцентных красителей, показывают, что влияние кверцетина на плавление липида можно охарактеризовать как уве личение вязкости мембраны [825;

829]. Предполагается, что кверцетин локализуется на границе между полярной и неполярной областями бислоя.

Действие кверцетина на жидкостные свойства мембраны сопоставимы с действием холестерина [829], и предполагается возможность проник новения молекул кверцетина в гидрофобную область бислоя и взаимо действие с углеводородными цепями липида [824].

Рис. 59. А – Данные ДСК мультиламеллярных липосом из DMPC, содержащих флавоноиды (флавоноид : липид = 1:1 моль/моль): (а) – контроль DMPC, (б) – липосомы с рутином, (в) – c катехином, (г) – мирицетином, (д) – таксифолином, (е) – кверцетином, (ж) – флоретином.

Б – формулы перечисленных флавоноидов. Взято из работы [828].

В соответствии с приведенными термограммами (рис. 59) можно заключить, что действие таксифолина на плавление липидов было меньшим по сравнению с кверцетином. Объяснение обнаруженных различий можно найти при сравнении формы молекул. Предполагается, что плоская молекула кверцетина должна преодолевать меньшие стерические препятствия при проникновении между плотно упакованными углеводородными цепями липида по сравнению с изогнутой молекулой таксифолина.

2.4.2. Локализация флавоноидов в бислое Сведения о локализации флавоноидов в бислое весьма противо речивы. По мнению некоторых исследователей, они способны проникать глубоко в бислой, однако наличие большого числа гидроксильных групп позволяет молекулам полифенолов образовывать водородные связи с липидами, что способствует их взаимодействию с более полярными областями [830]. В действительности, многое зависит от рН среды, что определяет величину зарядов флавоноидов и липида. Чем ниже величина рН, тем меньше степень депротонирования флавоноидов и тем глубже они способны проникать в бислой [831].

Катехины, имеющие группы галлата (ECG, EGCG), адсорбируются бислоем в большей степени, чем катехины, не имеющие галлатов (EC, EGC). Различные методы исследования взаимодействия катехинов с липо сомами показывают следующий ряд изменения сродства этих веществ к бислою липидов: ECG EGCG EC EGC [798;

799;

832;

833]. Указанный ряд коррелирует с липофильностью этих веществ, величина которой определяется как коэффициент распределения (log P) в системе окта нол : вода [799].

Многие исследования взаимодействия флавоноидов с мембранами проведены с использованием катехинов. После адсорбции бислоем все катехины проникают в область, находящуюся глубже фосфатных групп, и распределяются в плоскости бислоя благодаря латеральной диффузии.

Молекулярное моделирование показывает [834], что в результате проник новения в мембрану происходит возрастание площади бислоя на 0,374 нм на каждую молекулу EGCG. При этом с каждой молекулой EGCG взаимо действует в среднем 10,8 молекул липида. Липиды, примыкающие к моле куле EGCG, плотно упакованы и занимают площадь 0,51 нм2, что на 0,14 нм2 меньше, чем для остальных молекул. Все молекулы катехинов склонны к неравномерному распределению в плоскости бислоя и образо ванию агрегатов. Агрегация катехинов наблюдается как в молекулярных моделях липидного бислоя [39], так и в экспериментах с искусственными мембранами [798]. Появление агрегатов флавоноидов в бислое может при водить к возникновению дефектов бислойной структуры, нарушению це лостности гидрофобного барьера и росту проницаемости мембран [835].


Находясь в бислое, гидроксильные группы катехинов образуют водородные связи с атомами кислорода в молекулах липида. Чем больше гидроксильных групп, тем прочнее взаимодействие. При этом проница емость мембран для флуоресцентных красителей, например кальцеина, может возрастать [836]. Образование водородных связей между катехоль ными гидроксильными группами флавоноидов и атомами кислорода пероксидов липидов определяет антиоксидантные свойства катехинов [753].

В целом, предполагается, что образование указанных водородных связей может играть значительную роль в антиканцерогенном и антибакте риальном действии катехинов [837-839].

Исследования ЯМР, проведенные с использованием наноразмер ных, изотропно вращающихся фрагментов плоского бислоя фосфолипидов, называемых бицеллами, позволяют проследить процесс взаимодействия катехинов с бислоем. Было показано, что катехины взаимодействуют с бислоем фосфатидилхолина (рис. 60), при этом галлоильная группа ECG или EGCG располагаются в непосредственной близости от группы триметиламмония, принадлежащей молекуле фосфатидилхолина [840;

842].

Поскольку эта группа обладает положительным зарядом, ЯМР позволяет наблюдать ее взаимодействие с -электронами галлоильной группы.

Указанное взаимодействие между катехинами и катионным зарядом молекулы фосфатидилхолина (взаимодействие катион–) имеет большое значение в стабилизации молекулы полифенола в интерфазной области Рис. 60. Расположение различных флавоноидов в фосфолипидном бислое. Для простоты показан монослой DOPC. Положение фосфатных и карбонильных групп показано горизонтальными пунктирными линиями. Показано также предпочтительное расположение в монослое эпикатехин-галлата (ECg) из работы [840], даидзеина (Dai) и генистеина (Gen) из работы [841], а также кверцетина (Que) и протонированной формы сульфата кверце тина (QueS) из работы [664]. Данные получены на основе рентгеновского рассеяния, ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования.

фосфолипидного бислоя. Ранее аналогичные катион– взаимодействия между атомами азота фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина с остатками триптофана мембранных белков исследовались также на приме ре молекул грамицидина [843;

844].

ЯМР-исследования показали также, что молекулы катехинов способны вращаться в бислое вокруг оси, наклоненной к плоскости бислоя под углом приблизительно 55° [840], при этом расстояние от ближайшей фосфатной группы липида до карбонильного углерода катехина составляет 5,3±0,1 (рис. 60). Флавоноиды кверцетин, генистеин и даидзеин также располагаются ближе к полярным группам, чем к гидрофобному центру бислоя [664;

841]. При этом, в соответствии с данными недавно проведен ных исследований, предполагается, что длинная ось молекулы ориен тирована предпочтительно параллельно плоскости бислоя, а плоскость колец перпендикулярна плоскости бислоя. Действие флавоноидов на бислой иногда сравнивают с холестерином, но при этом известно, что длинная ось молекулы холестерина располагается преимущественно перпендикулярно плоскости бислоя.

Присутствие флавоноидов изменяет механические свойства би слоя [841]. Так, при максимальной концентрации генистеина 20 % и даи дзеина 14 %, являющейся пределом растворимости этих веществ в липиде, величина модуля сжимаемости бислоя POPC снижается на 40 %. При этом площадь бислоя возрастает на 8 % и 12 % соответственно. Возрастает спо собность бислоя к деформации.

Изменения физических параметров бислоя могут быть существенны в объяснении способности генистеина и даидзеина увеличивать продол жительность открытого состояния трансмембранных белковых каналов благодаря снижению энергетического барьера, необходимого для увеличения размеров молекулы при открывании канала [845]. Недавно проведенные исследования влияния флавоноидов на вязкостные свойства мембран клеток нескольких типов лейкоцитов, измеряемые с использо ванием мембранотропных флуоресцентных красителей, показали способ ность кверцетина и EGCG увеличивать анизотропию бислоя и рост транс мембранного потенциала, что предположительно, может быть существенно в проявлении антиоксидантных и регуляторных свойств этих флаво ноидов [846].

Известно, что в организме человека и животных флавоноиды могут подвергаться существенным химическим модификациям. В частности, как это более подробно обсуждается в разделе книги, посвященном метабо лическим превращениям флавоноидов, молекулы могут метилироваться, сульфатироваться и гликозилироваться. Метилирование одной из гидрок сильных групп кверцетина мало влияет на взаимодействие этого флаво ноида с фосфолипидным бислоем. Значительно бльшие изменения наблюдаются при сульфатировании и гликозилировании молекул [664]. Так, в нейтральной среде сульфатированная форма кверцетина менее липо фильна, чем кверцетин, и располагается ближе к водной поверхности.

Однако в кислых средах наблюдается протонирование сульфогруппы, что способствует проникновению молекулы в бислой. Молекула может также развернуться длинной осью поперек бислоя, если она сульфати рована в 3’ или 4’ положении (рис. 60). Присоединение глюкуроновой кис лоты значительно сдвигает молекулу к периферии бислоя таким образом, что глюкуроновый остаток располагается в водной фазе. Эти изменения могут снижать антиоксидантные свойства флавоноидов в отношении радикалов, располагающихся в глубине бислоя [664].

2.4.3. Проникновение флавоноидов через фосфолипидный бислой Взаимодействие флавоноидов с биологическими мембранами явля ется важным процессом, определяющим их действие на живую клетку [796].

Флавоноиды способны воздействовать на физические свойства фосфо липидного бислоя, изменять термодинамические параметры плавления липидов, а также влиять на процессы перекисного окисления липидов [847].

Большое значение имеет также способность флавоноидов проникать через мембраны клеток [848] и специфически связываться с рецепторами в цито плазме. Исследование взаимодействия флавоноидов с мембранами актуально также в связи с возможностью использования липосом в меди цине для хранения и доставки этих веществ.

Возникает вопрос, способны ли флавоноиды проникать через фосфолипидный бислой, или для их проникновения через мембраны требуются специализированные транспортеры белкового происхождения, которые, как известно, во многих случаях необходимы для проникновения различных веществ в цитоплазму? Для ответа на этот вопрос можно исследовать проникновение флавоноидов через множество бислоев мультиламеллярных липосом, образованных фосфатидилхолином. Можно предположить, что действие флавоноидов на плавление фосфолипидных мембран будет существенно различаться, если флавоноид был добавлен в раствор липидов в хлороформе, т.е. до формирования липосом (добавка изнутри), в сравнении с экспериментом, в котором флавоноид был добавлен к суспензии предварительно сформированных мультиламеллярных липосом (добавка извне). В последнем случае флавоноид будет беспрепятственно взаимодействовать только с наружной мембраной, тогда как для взаимо действия с остальной (бльшей) частью липида флавоноид должен проникнуть через гидрофобный барьер многочисленных бислоев. Однако было обнаружено, что флавоноид, добавленный к липосомам извне, оказывал примерно такое же действие на плавление липида (рис. 61), как и в случае, когда он был добавлен в хлороформ перед приготовлением липосом, то есть введен в них изнутри.

Приведенные выше данные микрокалориметрических измерений свидетельствуют о том, что таксифолин, добавленный в водный раствор, Рис. 61. Термограмма ДСК, показывающая влияние флавоноида таксифолина (дигидро кверцетина) на плавление липосом из DMPC. А – таксифолин добавлен в раствор липида в хлороформе перед приготовлением липосом («изнутри»). Б – таксифолин добавлен к водной суспензии готовых липосом («извне»). Цифрами указано количество добавленного флавоноида в моль %. Взято из работы [678].

Рис. 62. Электронные микрофотографии DMPC липосом, полученные методом замора живания–скалывания. Все препараты выдерживали при 37°С в течении 1 ч, после чего охлаждали до 18°С перед криофиксацией. (а) – Поперечный скол мультиламеллярных липосом.

(б) – Тот же препарат, показаны гидрофобные поверхности скола, содержащие риппл-фазу.

Стрелками указана ступенька, отделяющая скол самого внешнего бислоя от поверхности скола следующего бислоя, находящегося ближе к центру. (в) – К суспензии липосом добавлен таксифолин 23 моль %. (г) и (д) – Участки поверхности сколов из (б) и (с) соответственно (выделено рамками), представленные с бльшим увеличением. Взято из работы [678].

окружающий мультиламеллярные липосомы, способен оказывать влияние на процесс плавления всего липида, независимо от того, входит ли этот липид в состав внешней мембраны липосомы или находится внутри липосомы. Для объяснения наблюдаемого феномена мы можем предложить две гипотезы: 1). Таксифолин разрушает мультиламеллярные липосомы, в результате чего доступность липидов действию таксифолина существенно возрастает. 2). Липосомы сохраняют целостность, но при этом таксифолин способен проникать через бислойные структуры фосфолипидов, благодаря чему он может оказывать влияние на плавление многочисленных мембран, находящихся внутри мультиламеллярных липосом.

Электронная микроскопия замораживания–скалывания (рис. 62) показывает, что в условиях нашего эксперимента в суспензии присутство вали гигантские мультиламеллярные липосомы, как в исходном препарате, так и в присутствии таксифолина. Это свидетельствует о том, что такси фолин в исследуемых концентрациях, добавленный к предварительно сформированным липосомам, не оказывает разрушающего действия на фосфолипидный бислой. В то же время нами было обнаружено, что морфология поверхности скола мембран существенно изменялась.

Известно, что метод замораживания–скалывания позволяет изучать гидрофобную область фосфолипидного бислоя, поскольку плоскость скола проходит в центре гидрофобной области мембраны между двумя монослоями липидов. При криофиксации от 18–20°С гидрофобная поверхность скола мембран DMPC содержит характерные периодические структуры риппл-фазы. Структуру риппл-фазы можно было наблюдать как на поверхности сколов периферического бислоя, так и на гидрофобной поверхности скола всех бислоев, находящихся внутри везикул (рис. 62).

В присутствии таксифолина, добавленного снаружи к предвари тельно сформированным липосомам, периодические структуры риппл-фазы не наблюдались, а гидрофобные поверхности скола мембран выглядели гладкими. Такие изменения в равной степени были характерны как для бислоев, находящихся на поверхности, так и для бислоев, находящихся в центральной части мультиламеллярных липосом. Известно, что возник новение риппл-фазы непосредственно связано с физическим состоянием липидов при определенных температурах. Так, в DMPC-липосомах риппл фаза возникает в интервале температур между предпереходом (13–16°С) и главным фазовым переходом (23–25°С) этого липида [849;

850].

Различные агенты, влияющие на процесс плавления липида, такие как холестерин или токоферол, могут модифицировать структуру риппл фазы, изменять температурные границы ее существования. Представленные данные микроскопии, демонстрирующие исчезновение риппл-структур во всех слоях мультиламеллярных липосом, свидетельствуют о том, что таксифолин действительно может проникать через многочисленные бислойные структуры фосфолипида и влиять на фазовое состояние и мор фологию мембран. При этом, данные микроскопии свидетельствуют о сохранении мультиламеллярной структуры липосом при всех концен трациях таксифолина, используемых в эксперименте. Проникновение таксифолина через мембраны может объясняться хорошей растворимостью этого вещества в органических растворителях и, следовательно, способ ностью проникать вглубь гидрофобной области бислоя. Об этом свидетель ствует также изменение процессов плавления липидов, регистрируемое ДСК, а также изменения морфологии гидрофобной поверхности скола липосом, наблюдаемые под электронным микроскопом.

2.4.4. Влияние на фазовое поведение липидов Несмотря на то, что флавоноиды обладают значительным числом гидроксильных групп, их растворимость в воде весьма ограничена.

Напротив, как упоминалось выше, имеются многочисленные свидетельства их способности взаимодействовать с биологическими мембранами и прони кать в фосфолипидный бислой. С помощью дифференциальной скани рующей микрокалориметрии было показано, что флавоноиды способны также существенно влиять на процесс плавления фосфолипидного бислоя и, предположительно, способны влиять на фазовое поведение и структурную организацию биологических мембран [828]. Недавно нами было обнару жено, что комплексы кверцетина с железом (II) оказывают наибольшее влияние на фазовый переход бислой–гексагональная НII-фаза, характерный для фосфатидилэтаноламина. При этом наблюдается повышение темпе ратуры перехода на несколько градусов. Кроме того, комплексы, также как и свободные флавоноиды, снижают температуру плавления и увеличивают ширину перехода фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (рис. 63).

Примечательно, что готовый комплекс кверцетина с железом (II) оказывал слабое влияние на фазовые переходы липидов, что свиде тельствует о слабом взаимодействии с фосфолипидным бислоем. Напротив, если вначале к липосомам был добавлен кверцетин, а затем через некоторое время добавлено железо (II), то образующийся комплекс оказывал большее действие, чем кверцетин, что особенно хорошо видно на примере влияния этого комплекса на фазовый переход POPE из бислойной структуры в гексагональную HII-фазу, наблюдаемый исходно при 69°С (рис. 64, б–г).

Рис. 63. Действие кверцетина и его комплексов с Fe(II) на фазовые переходы фосфолипидов:

димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) – А, и пальмитоил-олеоил фосфатидилэтаноламина (POPE) – Б. Исходные липиды (а) плавятся при 24–25°С. Кроме того, при ~ 69°C POPE имеет переход из бислойной структуры в гексагональную НII-фазу. Показаны изменения кривых плавления липидов при действии кверцетина (б), железа (в), последовательной добавки сначала кверцетина, а затем (через 30 мин) железа (г), или готового комплекса кверцетина с желе зом (д). В экспериментах соотношение липид/кверцетин/Fe = 100:10:1. Среда: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4. Взято из работы [851].

При этом наблюдалось повышение температуры перехода на несколько градусов. Увеличивалась ширина перехода и снижалась его высота.

Неспособность готовых комплексов кверцетин–железо взаимодействовать с фосфолипидным бислоем связана с формированием нерастворимых в воде частиц. Фотонно-корреляционная спектроскопия показывает, что при смешивании кверцетина с железом (II) в среде присутствуют частицы двух размеров: малые частицы в области 10–15 нм, и более крупные частицы в области 1–5 мкм (рис. 64).

Рис. 64. Анализ размеров частиц комплексов кверцетин / Fe (II) = 10:1 с помощью фотонно корреляционной спектроскопии.

2.4.5. Агрегация и слияние мембран Было обнаружено также явление, связанное с действием комплек сов флавоноидов и железа на кальций-зависимые процессы агрегации и слияния мембран. Известно, что в присутствии катионов кальция наблюдается агрегация липосом [852;

853]. В присутствии флавоноидов агрегация липосом наблюдается также под действием катионов двухва лентного железа. Последовательные добавки железа и кальция показывают, что эффекты агрегации суммируются, как это можно наблюдать по свето рассеянию суспензии липосом (рис. 65).

Светорассеяние, условные единицы Рис. 65. Влияние кверцетина (Кв), двухвалент ного железа (Fe) и катионов кальция (Са) на светорассеяние суспензии липосом из фосфа Кв Fe Ca тидилхолина. Светорассеяние измеряли под уг лом 90° на спектрофлуориметре. Концентрация фосфатидилхолина 2·10-4 М, кверцетина и желе за 1·10-5 М, кальция 1·10-4 М. Исходный диаметр липосом составлял 100 нм.

Fe Кв Ca Взято из работы [854].

0 200 400 600 Время, сек Анализ показывает (рис. 66), что при добавлении к липосомам флавоноидов с железом (II) наблюдается лишь незначительное увеличение размеров частиц, исходный диаметр которых составлял 100 нм, тогда как при добавлении флавоноидов, железа и кальция появляется новая фракция значительно более крупных частиц. Электронная микроскопия замораживания–скалывания обнаруживает, что после добавления флавоноидов, железа и кальция между липосомами возникают контакты, а также появляются гигантские липосомы, что свидетельствует о процессах слияния мембран (рис. 67).

Рис. 66. Анализ размеров липосом с помощью фотонно-корреляционной спектроскопии.

К суспензии липосом, диаметром 100 нм, были добавлены флавоноиды: кверцетин (Кв), таксифолин (Такс), катехин (Кат), а также катионы железа (Fe) и кальция (Са).

Концентрация фосфатидилхолина 2·10-4 М, флавоноидов и железа 1·10-5 М, каль ция 1·10 4М.

Взято из работы [854].

Рис. 67. Электронная микроскопия замора живания–скалывания липосом из фосфатидил холина (диаметр 100 нм) перед (А) и после (В,С) добавления кверцетина, двухвалентного железа и кальция. Контакты межу липосомами указаны стрелками.

Взято из работы [854].

Способности липосом из фосфатидилхолина образовывать агрегаты, обмениваться липидом и сливаться интенсивно исследуются в течение многих лет, поскольку эти явления имеют непосредственное отношение к процессам доставки лекарственных препаратов и генети ческого материала с помощью липосом [855;

856]. Было обнаружено, что после агрегации липосом под действием различных агентов может активи роваться процесс их слияния, что зависит от размера липосом и физи ческого состояния липидов. Однако липосомы из фосфатидилхолина диа метром 100 нм, используемые в данном эксперименте, обычно не обладают способностью спонтанно сливаться, тогда как липосомы меньшего диаметра могут агрегировать и сливаться при температуре выше точки плавления липида, хотя этот процесс занимает многие часы и сутки [857].

Комплексы флавоноидов с железом обладают большей липофиль ностью, чем молекулы свободных флавоноидов. Это связано с тем, что полярность гидроксильных групп в молекулах флавоноидов снижается, но при этом наиболее полярной частью молекулы становится атом же леза [854]. В соответствии с предложенной нами схемой, комплекс флаво ноида с железом 2:1 может образовывать мостик между соседними мембра нами липосом. При этом молекулы флавоноидов погружаются в гидрофоб ную область липидов, а полярная часть комплекса, содержащая атом железа, образует мостик (скрепку) между соседними мембранами. Катионы кальция также могут образовывать мостики между мембранами, но посредством взаимодействия с фосфатными группами. Поскольку эти механизмы взаимодействия между мембранами различны и независимы, их действие суммируется. Необходимо отметить, что для достижения сходной величины агрегации в указанных экспериментах концентрация кальция была в десять раз выше, чем железа и флавоноидов.

Рис. 68. Модель «металлической скрепки», образуемой комплексом флавоноидов кверце тина (А), морина (Б) и железа (Fe), расположенных между поверхностями двух соседних мембран. Для простоты показано только два соседних монослоя липидов. Показаны также кальциевые мостики между фосфатными группами липидов. Взято из работы [854].



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.