авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ

СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ЛАКТИОНОВ ПЕТР ПАВЛОВИЧ

РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ COOKIE MONSTER

И CANNONBALL В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В

СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ

DROSOPHILA MELANOGASTER

Молекулярная генетика – 03.01.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

к.б.н.

Белякин Степан Николаевич Новосибирск – 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................... Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................. 1.1 Гонады в эмбриональном развитии........................................................................ 1.2 Морфологическое строение семенников у D. melanogaster.............................. 1.3 Генетический контроль сперматогенеза.............................................................. 1.4 Геномная организация семенник-специфичных генов и предполагаемые механизмы их координированной регуляции........................................................... 1.5 Гены задержки мейоза........................................................................................... 1.6 Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов............................................................................ 1.7 Методы определения сайтов посадки ДНК-связывающих белков................... Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................. 3.1 Генетическая система для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути.......................................................... 3.2 Генетическая система для проведения DamID в клетках зародышевого пути D.melanogaster............................................................................................................... 3.3 Связывание Comr с генами в семенниках у D. melanogaster............................. 3.4 Влияние белка Comr на экспрессию генов.......................................................... 3.5 Идентификация вторичных Comr-зависимых регуляторов транскрипции.

..... 3.6 Связывание Comr не всегда приводит к изменению экспрессии генов........... 3.7 Тканеспецифичная принадлежность Comr-связанных и Comr-не связанных генов.............................................................................................................................. 3.8 Гены-мишени Comr обогащены маркерами неактивного хроматина в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути........................... 3.9 Транскрипционный фактор Comr связывается с протяженными участками хромосом у D. melanogaster........................................................................................ 3.10 Активация генов в семенниках D. melanogaster транскрипционными факторами tMAC и tTAF комплексов........................................................................ Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................. ВЫВОДЫ........................................................................................................................ ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Одним из главных направлений функциональной геномики является изучение регуляторных систем, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития организма. Сперматогенез у Drosophila melanogaster является удобной моделью для изучения регуляции экспрессии генов в процессе клеточной дифференцировки. В семеннике дрозофилы можно легко различить все стадии развития клеток зародышевого пути – образование клеток из стволовых предшественников, пролиферацию и терминальную дифференцировку Терминальная (Fuller, 1993).

дифференцировка клеток мужского зародышевого пути у D. melanogaster сопровождается перестройкой хроматина, за которой следует активация генов, необходимых для сперматогенеза (Chen et al., 2005;

Chen et al., 2011).

Активация генов дифференцировки контролируется несколькими специализированными транскрипционными факторами, которые кодируются так называемыми генами задержки мейоза и которые можно разделить на два класса - aly и can (White-Cooper, 2010). Белковые продукты генов aly-класса образуют комплекс tMAC (testis-specific meiotic arrest complex), а гены can класса являются семенник-специфичными паралогами (tTAF, testis-specific TBP-associated factors) генов TAF у D. melanogaster (White-Cooper, 2010).

Мутации генов задержки мейоза приводят к инактивации множества генов в семенниках, неспособности клеток зародышевого пути вступить в мейоз и остановке гаметогенеза на стадии сперматоцитов (Lin et al., 1996;

White Cooper, 2010). Было показано, что на фоне мутаций по генам задержки мейоза промоторные области генов дифференцировки остаются связанными белком-репрессором что по всей вероятности вызывает Polycomb, подавление экспрессии. В работе Chen et al. [2011] была сформулирована гипотеза, согласно которой активация генов в семенниках зависит от синхронизированного действия белков tMAC и tTAF. Это предположение основано на наблюдении о том, что в отсутствии компонентов tMAC нарушается связывание tTAF с ДНК. Однако существующие данные описывают конечный эффект мутаций, что не дает представления о механизме действия и конкретной роли этих транскрипционных факторов в регуляции активности генов. В первую очередь остаются невыясненными гены-мишени белков, кодируемых генами задержки мейоза. Более того, до сих пор не определено, являются ли эти белки прямыми активаторами или подавляют активность генов-репрессоров в клетках зародышевого пути.

Также остается открытым вопрос о том, каким образом эти транскрипционные факторы участвуют в эпигенетической регуляции активности генов. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию принципов работы регуляторных систем, управляющих генетическими программами дифференцировки клеток зародышевого пути D. melanogaster.

В представленной работе для исследования роли транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, на первом этапе были установлены гены-мишени транскрипционного фактора Cookie monster (Comr), кодируемого геном, относящимся к aly классу. Картирование Comr проводили методом тканеспецифичного DamID c последующим анализом методом микрочипов в масштабе генома. Анализ данных о локализации сайтов связывания Comr и экспрессии генов в семенниках мутантов по генам cookie monster (aly класс) и cannonball (can класс) позволил установить роль транскрипционных факторов Comr и Cannonball (Can) в регуляции экспрессии генов при дифференцировке клеток мужского зародышевого пути и сформулировать гипотезу относительно механизмов активации генов, необходимых для дифференцировки мужских гамет у D. melanogaster.

Цели и задачи исследования Целью данной работы являлось изучение роли транскрипционных факторов Cookie Monster (Comr) и Cannonball (Can) в регуляции активности генов в процессе сперматогенеза у D. melanogaster. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать генетическую систему для картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.

2. Определить профиль связывания транскрипционного фактора Comr с ДНК герминальных клеток самцов D. melanogaster.

3. Определить эффект связывания Comr на экспрессию генов в сперматоцитах D. melanogaster.

4. Определить регуляторный эффект белка Can на гены, связанные с белком Comr Научная новизна Разработан подход, позволяющий картировать сайты связывания хроматиновых белков с ДНК в отдельных клеточных популяциях в организме D. melanogaster методом DamID. Этим методом впервые были локализованы участки связывания транскрипционного фактора Comr в геноме и выявлены его гены-мишени в герминальных клетках самца D.

melanogaster. Показано, что белок Comr является прямым активатором части своих генов-мишеней в сперматоцитах. Выявлен возможный вторичный регуляторный фактор, экспрессия которого контролируется Comr.

Предложена модель, описывающая этапы активации семенник-специфичных генов в сперматоцитах D. melanogaster и роль белков tMAC и tTAF в этом процессе.

Научно-практическая ценность Полученные в результате исследования вносят вклад в современные представления о регуляторных системах, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития клеток. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизме действия белков комплексов tMAC и tTAF, что значительно расширяет представления о механизмах регуляции генов в семенниках D. melanogaster в процессе клеточной дифференцировки. Разработанная генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID может быть использована для исследования транскрипционных факторов и иных ассоциированных с ДНК белков в клетках зародышевого пути у D. melanogaster. Полученная система универсальна и может быть легко адаптирована для исследования тканеспецифичных транскрипционных факторов в других органах D.

melanogaster.

Публикации 1. Лактионов П.П., Андреева Е.Н., Шлома В.В., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Генетическая система для мечения соматических и герминальных клеточных линий в гонадах Drosophila melanogaster // Цитология. 2013. Т. 55. С. 185-189.

2. Максимов Д.А., Лактионов П.П., Белякин С.Н. Доменная регуляция экспрессии генов в районах интеркалярного гетерохроматина Drosophila melanogaster // Цитология. 2013. Т. 55. С. 190-193.

3. Лактионов П.П., H. White-Cooper, Максимов Д.А., Белякин С.Н.

Транскрипционный фактор Comr играет роль прямого активатора в генетической программе сперматогенеза у D. melanogaster// Молекулярная биология. Принята к публикации.

Апробация работы Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в виде стендовых сообщений: на международной конференции по системной биологии дрозофилы (Пултуск, Польша, 2012), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, на международной конференции «Высокопроизводительное 2012), секвенирование в геномике» (Новосибирск, Россия, 2013).;

а также в устных докладах: на международной конференции по молекулярным механизмам регуляции сперматогенеза «ETW-16» (Эльба, Италия, 2010), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, 2012).

В материалах этих конференций опубликованы следующие тезисы:

1. Laktionov P.P., Belyakin S.N., Maksimov D.A., Shloma V.V., Zhimulev I.F. Identification of transcriptional regulators for testis specific gene clusters in Drosophila melanogaster// 16th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrynology of the Testis, 2010, Elba, Italy. P. 76.

2. Лактионов П.П., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Роль транскрипционного фактора Cookie monster в регуляции генной экспрессии в процессе сперматогенеза Drosophila melanogaster// Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 126.

3. Белякин С.Н., Максимов Д.А., Лактионов П.П., Коряков Д.Е.

Регуляция репрессированных районов генома в развитии дрозофилы// Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 44.

4. Laktionov P.P., Maksimov D.A., White-Cooper H., Belyakin S.N. Male meiosis arrest factor Cookie monster binds the extensive chromosome regions and counteracts the repression of testis-specific genes// ESF EMBO Symposium on Systems Biology of Drosophila Development, Pultusk (Poland), May 22-25, 2012.

5. Лактионов П.П., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Метод тканеспецифичного DamID для полногеномного картирования сайтов связывания транскрипционных факторов в клетках мужского зародышевого пути D.melanogaster// Международная конференция «Высокопроизводительное секвенирование в геномике», 2013, Новосибирск, Россия. С17.

Вклад автора Основные результаты получены автором самостоятельно.

Работа по математической обработке данных выполнена совместно с Белякиным С.Н. и Максимовым Д.А. Данные по представленности транскриптов генов в семенниках предоставлены Dr. H. White-Cooper (Университет Кардиффа, Великобритания).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Гаметогенез дрозофилы включает в себя все основные этапы дифференцировки клеток из стволовых клеток-предшественников:

асимметричное деление стволовых клеток, пролиферацию (стадия митотических делений) и терминальную дифференцировку.

Семенники дрозофилы представляют собой удобную модель для изучения механизмов регуляции этих процессов благодаря ряду особенностей. Во-первых, в семенниках D. melanogaster можно легко отличить все стадии развития клеток зародышевого пути, структурные особенности каждой стадии подробно изучены. Во-вторых, какие-либо нарушения в регуляции сперматогенеза, как правило, приводят к отклонениям в морфологии семенников и стерильности, что облегчает поиск ключевых регуляторов этих процессов. В-третьих, многие аспекты развития клеток зародышевого пути достаточно подробно охарактеризованы и могут являться отправной точкой для дальнейших исследований. Кроме того, описано несколько генов, мутации по которым приводят к остановке сперматогенеза на определенных стадиях развития клеток зародышевого пути, что облегчает изучение отдельных субпопуляций клеток зародышевого пути.

Ниже будут описаны основные этапы сперматогенеза и особенности генетической регуляции ключевых стадий развития клеток зародышевого пути.

1.1 Гонады в эмбриональном развитии Клетки зародышевого пути у D. melanogaster происходят от полярных клеток, образующихся на заднем полюсе зародыша на ранних этапах эмбриогенеза. На стадии синцитиальной бластодермы полярные клетки первыми обосабливаются от общей цитоплазмы. В процессе целлюляризации они захватывают полярную плазму эмбриона, в которой содержатся полярные гранулы - электронно-плотные структуры, образованные белками и молекулами мРНК (Mahowald, 2001). Гены, кодирующие компоненты полярной плазмы, могут быть разделены на три группы, в зависимости от процессов, которые они регулируют (Ephrussi, Lehmann, 1992). Первая группа генов участвует в формировании передне-заднего градиента мРНК в ооците (gurken, orb, spindle genes и пр.). Гены второй группы требуются для организации полярной плазмы (oskar, vasa, valois, tudor). Третья группа включает в себя гены nanos и pumilio, белковые продукты которых необходимы для образования абдоминальных сегментов (Mahowald, 2001).

Содержимое полярной плазмы нарабатывается питающими клетками и транспортируются в яйцо в течение оогенеза. Определяющим компонентом полярной плазмы является белок Oskar, в зависимости от его концентрации меняется количество полярных клеток, кроме того он отвечает за локализацию в полярной плазме таких белков, как Vasa, Tudor и Valois (Ephrussi, Lehmann, 1992;

Thomson, Lasko, 2004). Последние регулируют локализацию и трансляцию мРНК nanos, pgc и gcl, которые необходимы для образования полярных клеток и подавления в них транскрипции генов (Lesch, Page, 2012).

От соматических клеток эмбриона клетки-предшественники зародышевого пути отличаются более ранним обособлением, сниженной частотой митотических делений, помимо этого у них не наблюдается транскрипции генов вплоть до стадии гаструляции (Van Doren et al., 1998).

Полярные клетки остаются недифференцированными и невосприимчивыми к клеточным сигналам, запускающим дифференцировку соматических клеток.

Это состояние полярных клеток достигается путем инактивации РНК полимеразы II и, по всей вероятности, подавлением экспрессии генов на уровне хроматина (Lesch, Page, 2012). В основе механизма инактивации РНК полимеразы II лежит действие белка Pgc, который кодируется геном с материнским эффектом pgc (Nakamura et al., 1996). Белок Pgc конкурирует с РНК-полимеразой II за связывание c комплексом PTEFb и не позволяет ему фосфорилировать Ser2 и Ser5 в составе полимеразы (Hanyu-Nakamura et al., 2008). Это ингибирует образование преинициаторного комплекса и элонгацию транскрипции (Lesch, Page, 2012). В эмбрионах, полученных от самок, несущих мутацию по гену pgc, зиготическая транскрипция в полярных клетках не подавляется, что приводит к их деградации и последующему полному отсутствию клеток зародышевого пути (Deshpande et al., 2004;

Martinho et al., 2004). В пользу существования механизма инактивации транскрипции на уровне хроматина свидетельствует тот факт, что у эмбрионов, дефицитных по мРНК nanos и белку Su(var)3-3, в полярных клетках наблюдается повышенное содержание H3K4мет2 модифицированных гистонов и не подавляется транскрипция генов развития (Schaner et al., 2003;

Rudolph et al., 2007). В эмбрионах, полученных от мутантных по гену nanos самок, в полярных клетках наблюдается транскрипция ряда соматических генов, таких как Sex-lethal и генов сегментации (fushi tarazu, even skipped) (Dansereau, Lasko, 2008). Такие клетки не мигрируют к месту образования эмбриональных гонад, претерпевают митотические деления и в конечном итоге элиминируются апоптозом (Dansereau, Lasko, 2008). Поскольку Nanos является ингибитором трансляции, то по всей вероятности, он влияет на транскрипцию генов опосредованно.

В результате гаструляции полярные клетки перемещаются внутрь эмбриона и начинают миграцию к первичным соматическим клеткам гонад.

Предшественники соматических клеток гонад имеют мезодермальное происхождение и располагаются билатерально в районе 10-12 парасегментов (Warrior, 1994). Процесс миграции клеток-предшественников зародышевого пути управляется белками Wunen, Wunen2, Hedgehog и Hmgcr (Dansereau, Lasko, 2008). В результате миграции в районе десятого парасегмента с обеих сторон скапливаются клетки-предшественники зародышевого пути и первичные соматические клетки гонад, которые в конечном итоге формируют компактные эмбриональные гонады (Boyle, DiNardo, 1995;

Dansereau, Lasko, 2008).

1.2 Морфологическое строение семенников у D. melanogaster Семенники взрослых особей D. melanogaster имеют характерную спиралевидную форму с утолщением на апикальном конце. Оболочка семенников дрозофилы образована мышечными и пигментными клетками (Fuller, 1993). В апикальной области расположены стволовые клетки зародышевого пути и, по мере продвижения к основанию семенника, можно различить все дальнейшие стадии развития клеток зародышевого пути – сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и зрелые сперматозоиды. Ниже будут рассмотрены морфологические особенности всех стадий развития клеток зародышевого пути у самцов дрозофилы.

1.2.1 Стволовые клетки и пролиферативный центр На замкнутом апикальном конце семенника располагается пролиферативный центр (также называемый нишей) который состоит из трех типов клеток (Hardy et al., 1979). Сердцевина пролиферативного центра образована двадцатью плотно прилегающими друг к другу соматическими клетками, которые формируют конусообразную структуру, называемую хабом (Fuller, 1993). Вокруг хаба расположены от 5 до 9 стволовых клеток (Рис. 1), которые дают начало линии зародышевого пути (Hardy et al., 1979).

Каждая стволовая клетка заключена в оболочку, образованную двумя соматическими стволовыми клетками гонад (также называются клетками предшественниками цисты) (Fuller, 1993). Стволовые клетки зародышевого пути и соматические стволовые клетки гонад поддерживают плотный контакт с клетками хаба (Hempel et al., 2008) (Рис. 1).

В результате асимметричного митотического деления стволовых клеток зародышевого пути образуется две клетки, одна из которых по прежнему контактирует с клетками хаба и остается стволовой, в то время как вторая клетка, так называемый гониобласт, вытесняется из ниши и приступает к пролиферации (Hardy et al., 1979;

Gonczy, DiNardo, 1996) (Рис.

1). Одновременно делятся соматические стволовые клетки гонад, что приводит к их самообновлению и образованию цистных клеток.

Образованные цистные клетки окружают гониобласт. В дальнейшем цистные клетки не делятся, а лишь увеличиваются в размерах;

они окружают развивающиеся половые клетки на всех стадиях развития – от начальных стадий и вплоть до стадии индивидуализации сперматид. Деление соматических стволовых клеток гонад зависит от клеточных сигналов, поступающих от стволовых клеток зародышевого пути: в отсутствие стволовых клеток зародышевого пути наблюдается нерегулируемая пролиферация цистных клеток (Gonczy, DiNardo, 1996). Кроме того показано, что соматические стволовые клетки гонад способны образовывать клетки хаба (Voog et al., 2008). Циста, состоящая из клеток зародышевого пути, окруженных двумя цистными клетками, представляет собой функциональную единицу сперматогенеза у дрозофилы (Fuller, 1998).

1.2.2 Сперматогонии: стадия митотических делений Гониобласт претерпевает четыре раунда митотических делений, что приводит к формированию цисты, состоящей из 16 сперматогониев, окруженных двумя цистными клетками. В каждом раунде деления не проходит полный цитокинез, поэтому клетки остаются соединенными между собой межклеточными мостиками, так называемыми кольцевыми каналами (de Cuevas et al., 1997). Они формируются за счет стабилизации сократительного кольца, что препятствует разделению клеток зародышевого пути (Hime et al., 1996). Кольцевые каналы сохраняются на всех стадиях развития вплоть до индивидуализации, предполагается, что они требуются для синхронного прохождения программы сперматогенеза (Hime et al., 1996).

Каналы пронизывает разветвленная цитоплазматическая мембранная структура – фусома, которая формирует сеть, проникающую во все клетки синцития (Lin et al., 1994;

Hime et al., 1996). В мужских клетках зародышевого пути фусома отвечает за нормальное протекание митотических делений и регулирует наследование центросом в ходе мейоза (Wilson, 2005;

Lighthouse et al., 2008). Мутации по структурным белкам, образующим фусому, приводят к нарушениям распределения центросом в ходе мейоза и стерильности самцов (Wilson, 2005).

1.2.3 Сперматоциты: стадия мейотических делений Сразу после четвертого митотического деления начинается предмейотическая S-фаза, и клетки зародышевого пути переходят на стадию первичных сперматоцитов (Fuller, 1993). На этой стадии клетки переходят от фазы пролиферации к фазе роста, активной транскрипции генов и дифференцировки. Сперматоциты, в отличие от более ранних стадий развития клеток зародышевого пути, уже не способны вернуться в состояние стволовых клеток (Brawley, Matunis, 2004), поэтому считается, что с началом стадии сперматоцитов запускается терминальная дифференцировка клеток зародышевого пути.

В ходе предмейотической G2 фазы, занимающей около 90 часов, первичные сперматоциты увеличиваются в размере приблизительно в 25 раз (Lindsley, Tokuyasu, 1980), и активируются все гены, которые потребуются в ходе дальнейших стадий сперматогенеза. После G2 фазы мейоза I транскрипция большинства генов прекращается (Fuller, 1993). Пост мейотическая транскрипция была обнаружена лишь для 24 генов (Barreau et al., 2008a;

Barreau et al., 2008b). В то же время, в семенниках дрозофилы функционирует механизм отложенной трансляции, когда наработанные на стадии сперматоцитов транскрипты сохраняются и могут быть транслированы на последующих стадиях (Fuller, 1993).

Экспрессия многих генов запускается впервые на стадии сперматоцитов (Jiang, White-Cooper, 2003;

Chen et al., 2005). Примерно 10% генов дрозофилы экспрессируется исключительно в семенниках (White Cooper, 2010).

Процесс роста первичных сперматоцитов сопровождается морфологическими изменениями. Ранние первичные сперматоциты проходят несколько этапов развития, в ходе которых увеличивается количество митохондрий и разрастается эндоплазматический ретикулум (Fuller, 1993).

Зрелые первичные сперматоциты являются наиболее крупными клетками зародышевого пути. Они содержат крупное ядрышко, развитый эндоплазматический ретикулум и две пары центриолей. Первичные сперматоциты претерпевают первое мейотическое деление, в результате которого образуются вторичные сперматоциты. После короткой интерфазы вторичные сперматоциты вступают во второе мейотическое деление.

Мейотические деления сперматоцитов приводят к образованию цисты, содержащей 64 круглых гаплоидных сперматиды.

1.2.4 Дифференцировка сперматид и сперматозоидов На завершающей стадии сперматогенеза круглые сперматиды претерпевают сильные морфологические изменения: начинает расти аксонема, формируется специальная митохондриальная структура, ассоциированная с ней, конденсируется ДНК, ядро изменяет форму.

В ходе мейотических делений сперматоцитов митохондрии равномерно распределяются между дочерними клетками. После завершающей телофазы митохондрии ранних сперматид сливаются в две митохондриальные производные, которые оборачиваются вокруг друг друга, формируя электронно-плотную, сферическую структуру, которая называется небенкерн (Tokuyasu, 1975). В поперечном сечении митохондриальные мембраны расположены концентрически, что делает небенкерн похожим на срез луковицы, поэтому этот этап развития сперматид носит название «стадии луковицы». Слияние митохондрий зависит от функции гена fuzzy onions (fzo), который кодирует трансмембранную ГТФазу. Белок Fzo детектируется на поверхности митохондрий непосредственно перед их слиянием и не проявляется впоследствии (Hales, Fuller, 1997). Таким образом, на «стадии луковицы» каждая из 64 ранних сперматид цисты содержит фазово-плотный небенкерн и фазово-прозрачное ядро. Если в предшествующих мейотических делениях процессы кариокинеза и неполного цитокинеза протекали нормально, то все 64 сперматиды будут обладать ядрами и митохондриальными производными одинакового размера (Gonzalez et al., 1989). Этот признак позволяет легко детектировать нарушения мейоза.

На стадии элонгации у каждой сперматиды из базального тельца начинает развиваться аксонема. Аксонема состоит из микротрубочек, организованных по схеме 9+2, и покрыта двойной мембраной (Lindsley, Небенкерн распадается на две митохондриальные Tokuyasu, 1980).

производные, которые вытягиваются вдоль аксонемы и достигают в длину 1,8 мм - полной длины жгутика сперматозоида (Lindsley, Tokuyasu, 1980). В дальнейшем развитии сохраняется только одна митохондрия, а минорная митохондриальная производная деградирует (Tokuyasu et al., 1972a).

Кольцевые каналы и фусома локализуются на противоположном ядрам конце сперматид (Hime et al., 1996). Происходит замена гистонов на протамины и удаляется часть ядерной оболочки и кариоплазмы (Fuller, 1993;

Braun, 2001).

Хроматин конденсируется, а ядро уменьшается приблизительно в 200 раз и принимает форму иголки (Fuller, 1993).

На стадии индивидуализации вокруг ядер сперматид формируются актиновые конусы, которые начинают движение к концам сперматид (Fabrizio et al., 1998). Элементы цитоскелета взаимодействуют с актиновыми конусами и мембраной, образуя комплекс индивидуализации (Fabrizio et al., 1998). Актиновые конусы приводятся в движение за счет полимеризации актина (Noguchi, Miller, 2003), они выдавливают цитоплазму и мембранные органеллы, одновременно с этим формируются индивидуальные клеточные стенки сперматид (Fuller, 1993). Удаленные клеточные компоненты скапливаются в расширении цисты, которое смещается к хвостам сперматид по мере продвижения актиновых конусов. Когда расширение достигает конца цисты, образуется так называемый «мусорный мешок», и его отделение завершает процесс индивидуализации (Tokuyasu et al., 1972a). В конечном итоге, образуется пучок из 64 зрелых сперматозоидов, которые по-прежнему заключены в оболочку из двух клеток цисты. После завершения индивидуализации пучки сперматозоидов достигают основания семенника (Tokuyasu et al., 1972b), клетки цисты разрушаются, и сперматозоиды высвобождаются в просвет семенника (Fuller, 1993).

1.3 Генетический контроль сперматогенеза В ходе сперматогенеза недифференцированная клетка-предшественник претерпевает множественные морфологические изменения и превращается в специализированную подвижную половую клетку. В первую очередь, корректное протекание сперматогенеза требует координированной регуляции ключевых переходных этапов. Всего в процессе сперматогенеза можно выделить три таких этапа, в ходе которых принимаются решения о переходе к дальнейшим стадиям развития (Рис. 2). Первый – асимметричное деление стволовой клетки зародышевого пути и поддержание стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Второй – переход от стадии митотических делений к мейозу в конце стадии сперматогониев. И последний этап – стадия сперматоцитов, на которой начинается транскрипция генов, необходимых для прохождения мейоза и всех последующих стадий дифференцировки клеток зародышевого пути.

Нарушения регуляции этих этапов приводят к остановке сперматогенеза и полному отсутствию гамет. Ниже будут рассмотрены генетические механизмы, управляющие этими принципиальными этапами сперматогенеза.

1.3.1 Асимметричное деление стволовых клеток и механизмы поддержания постоянного клеточного состава ниши Длительное сохранение репродуктивной способности зависит от поддержания постоянного числа способных к делению стволовых клеток зародышевого пути и стволовых соматических клеток гонад. Постоянство клеточного состава стволовой ниши поддерживается за счет строго определенного механизма деления и регуляторных сигналов, поступающих к стволовым клеткам. Локальные клеточные сигналы продуцируются клетками ниши и позволяют поддерживать пул стволовых клеток.

Стволовые клетки мужского зародышевого пути делятся асимметрично, то есть с образованием двух отличных друг от друга клеток (Hardy et al., 1979). При делении дочерняя клетка, сохраняющая контакт с хабом, продолжает получать от него сигналы и сохраняет свойства стволовой клетки, вторая же клетка отдаляется от хаба, перестает получать сигналы и приступает к дифференцировке.

В основе механизма асимметричного деления лежит особенное поведение центросом, которое определяют направление веретена деления (de Cuevas, Matunis, 2011). Клетки хаба и стволовые клетки ниши связываются друг с другом за счет адгезионных контактов, образованных белками APC2, E-кадгерином и -катенином (Yamashita et al., 2003). В G1-фазе деления стволовых клеток зародышевого пути центросома при помощи микротрубочек связывается с областью адгезионного контакта стволовой клетки с хабом. После репликации и разделения центросом в G2-фазе, материнская центросома сохраняет контакт с хабом, а дочерняя перемещается на противоположный полюс клетки. В результате, образующееся веретено деления расположено перпендикулярно к плоскости контакта стволовой клетки зародышевого пути с хабом, и после деления одна из дочерних клеток отдаляется от хаба (Yamashita et al., 2007).

Интересно отметить, что в стволовых соматических клетках гонад в ходе митоза веретено деления исходно располагается случайным образом, но в ходе анафазы один полюс также перемещается к месту контакта клетки с хабом (Cheng et al., 2011).

Регуляторные сигнальные каскады, участвующие в поддержании пула стволовых клеток Первым сигнальным каскадом, для которого была обнаружена роль в поддержании пула стволовых клеток мужского зародышевого пути и в регуляции их самообновления, был JAK-STAT (Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription) сигнальный путь (Kiger et al., 2001;

Tulina, Matunis, 2001). В семенниках дрозофилы этот сигнальный каскад запускается секреторным лигандом Upd, который нарабатывается клетками хаба. Upd прочно связан с внеклеточным матриксом, что ограничивает его диффузию (Harrison et al., 1998). Ограничение распространения Upd позволяет поддерживать в недифференцированном состоянии только клетки, контактирующие с хабом (Yamashita, Fuller, 2005). Связывание Upd с цитокиновым рецептором стволовых клеток Dome приводит к активации JAK-киназы (Hop) и последующему фосфорилированию транскрипционного фактора STAT92E, который, в свою очередь, транслоцируется в ядро герминальных стволовых клеток и активирует свои гены-мишени (Arbouzova, Zeidler, 2006). JAK-STAT сигнальный каскад регулирует поддержание как пула стволовых клеток зародышевого пути, так и стволовых соматических клеток гонад – при мутации гена, кодирующего STAT, все стволовые клетки ниши деградируют. Однако, эктопическая экспрессия STAT в клетках зародышевого пути, расположенных вне стволовой ниши, не приводит к их самообновлению (Leatherman, Dinardo, 2008). Напротив, эктопическая активации STAT в соматических стволовых клетках приводила к значительному увеличению их количества, и появлению самообновляющихся стволовых клеток зародышевого пути. На основании этих фактов предполагается, что STAT-активированные соматические стволовые клетки гонад продуцирют клеточные сигналы, контролирующие самообновление стволовых клеток зародышевого пути. В качестве медиаторов таких сигналов могут выступать белки, кодируемые генами мишенями STAT в соматических стволовых клетках, как например Zfh1 или Chinmo (Leatherman, Dinardo, 2008;

Flaherty et al., 2010) (Рис. 3). Эти белки необходимы для самообновления соматических стволовых клеток гонад и стволовых клеток зародышевого пути, однако, по всей вероятности, самообновление последних регулируется ими не напрямую (de Cuevas, Таким образом, не участвует в регуляции Matunis, 2011). STAT самообновления стволовых клеток зародышевого пути, однако необходим для поддержания соматических стволовых клеток и взаимодействия стволовых клеток зародышевого пути с клетками хаба (Рис. 3) (de Cuevas, Matunis, 2011).

Сигнальный путь BMP (Bone morphogenic protein) участвует в регуляции самообновления стволовых клеток зародышевого пути в семенниках дрозофилы. В стволовых клетках зародышевого пути дрозофилы, BMP сигнальный каскад запускается внеклеточными лигандами Glass bottom boat (Gbb) и Decapentaplegic (Dpp), которые экспрессируются клетками хаба и соматическими стволовыми клетками (Рис. 3). Для поддержания стволовых клеток зародышевого пути в недифференцированном состоянии требуется действие обоих лигандов (Kawase et al., 2004). Связывание лигандов с клеточным рецептором стволовых клеток зародышевого пути приводит к активации транскрипционного фактора Mad (Mothers against dpp), который транспортируется в ядро и регулирует экспрессию генов-мишеней (Raftery, Активация каскада приводит к Sutherland, 1999). BMP-сигнального подавлению активности гена bag of marbles (bam). В норме белок Bam экспрессируется, начиная со стадии сперматогониев (Kawase et al., 2004). В семенниках самцов, мутантных по генам, кодирующим лиганды BMP каскада, bam активируется в стволовых клетках зародышевого пути, в результате чего они преждевременно дифференцируются и впоследствии полностью деградируют (Kawase et al., 2004;

Schulz et al., 2004).

Предполагается, что в соматических стволовых клетках гонад лиганды BMP каскада могут быть генами-мишенями JAK-STAT сигнального пути (de Cuevas, Matunis, 2011). Это может объяснять способность соматических стволовых клеток гонад запускать самообновление стволовых клеток зародышевого пути в ответ на активацию JAK-STAT сигнального пути.

Однако не все клеточные сигналы посылаются от соматических клеток ниши к клеткам зародышевого пути. В качестве обратного примера можно привести сигнальный путь EGFR (Epidermal growth factor receptor), который регулирует образование оболочки гониобласта цистными клетками (Schulz et al., 2002). Гониобласты экспрессируют лиганд Spitz, который активирует EGFR сигнальный путь в клетках цисты (Schulz et al., 2002;

Sarkar et al., 2007). Для образования секретируемой формы Spitz требуется активность протеазы, кодируемой геном stet (Schulz et al., 2002;

Sarkar et al., 2007). Spitz активирует EGFR-рецептор цистных клеток, что инициирует перестройку цитоскелета и формирование из этих клеток оболочки гониобласта (Sarkar et al., 2007). Вместе с тем, цистные клетки также оказывают влияние на развитие клеток зародышевого пути. В ответ на EGFR-активацию в цистных клетках запускается MAPK сигнальный каскад (Mitogen Activated Protein Kinase), который стимулирует дифференцировку заключенного в цисту гониобласта (Kiger et al., 2000). Предполагают два возможных механизма такого влияния: цистные клетки могут изолировать гониобласт от сигналов самообновления, секретируемых клетками хаба и соматическими стволовыми клеток гонад, с другой стороны, активация EGFR в цистных клетках может приводить к образованию секретируемых факторов, влияющих на дифференцировку клеток зародышевого пути (Davies, Fuller, 2008).

Регуляция стволовых клеток посредством микроРНК Некодирующие микроРНК препятствуют трансляции, связываясь со специфичными мРНК, что приводит к деградации либо инактивации последних. У дрозофилы за образование микроРНК отвечают РНКаза Dicer- и белок Loquacious, связывающийся с двуцепочеченой РНК (Lee et al., 2004;

Forstemann et al., 2005;

Saito et al., 2005). В яичниках дрозофилы микроРНК участвуют в регуляции деления и самообновления стволовых клеток зародышевого пути и соматических стволовых клеток гонад (Hatfield et al., 2005;

Jin, Xie, 2007;

Yu et al., 2009). В семенниках дрозофилы обнаружена специфическая микроРНК которая, возможно, участвует в miR-7, самообновлении стволовых клеток зародышевого пути. miR-7 связывается с 3’-нетранслируемой областью (НТО) транскрипта bam и подавляет его трансляцию (Pek et al., 2009). Экспрессия miR-7 ингибируется белком Maelstrom (Mael), который требуется для дифференцировки стволовых клеток зародышевого пути. У самцов, мутантных по гену mael, стволовые клетки зародышевого пути сохраняют свои свойства, однако сперматогонии не способны наработать Bam, развиваются с нарушениями и часто перерождаются обратно в стволовые клетки (Pek et al., 2009). По всей вероятности, микроРНК участвуют в поддержании стволовых клеток путем подавления факторов дифференцировки.

Эпигенетические механизмы поддержания клеток зародышевого пути в недифференцированном состоянии Эпигенетическая регуляция осуществляется за счет изменения структуры хроматина и не затрагивает при этом последовательность нуклеотидов в ДНК. В поддержании пула стволовых клеток зародышевого пути помимо сигнальных каскадов и микроРНК задействованы также и механизмы эпигенетической регуляции (de Cuevas, Matunis, 2011). Известны два механизма регуляции структуры хроматина, которые влияют на доступность ДНК для факторов, активирующих экспрессию генов. Во первых, регуляция структуры хроматина может осуществляться специальными ферментами, которые присоединяют ковалентные метки к гистонам, что приводит к изменению связывания модифицированных гистонов с ДНК, либо к формированию такими гистонами комплексов с дополнительными белками. Второй механизм регуляции структуры хроматина реализуется ферментами (АТФ-зависимые факторы перестройки хроматина), которые обладают АТФазной активностью и способны влиять на характер связывания ДНК с гистонами, увеличивая либо уменьшая степень компактизации хроматина (Becker, Horz, 2002). У дрозофилы известно по крайней мере девять АТФ-зависимых факторов перестройки хроматина, которые изменяют структуру хроматина и могут активировать либо подавлять транскрипцию генов (Bouazoune, Brehm, 2006). Один из таких факторов, комплекс NURF (Nucleosome remodeling factor), необходим для сохранения стволовых клеток в семенниках дрозофилы (Cherry, Matunis, В стволовых клетках зародышевого пути 2010). NURF-комплекс способствует экспрессии и подавляет экспрессию и, STAT Bam, следовательно, сохраняет потентность стволовых клеток и не позволяет им преждевременно дифференцироваться. NURF-комплекс также участвует в поддержании недифференцированного состояния соматических стволовых клеток гонад. На потомков стволовых клеток NURF-комплекс, по всей вероятности, влияния не оказывает, так как отсутствие функционального NURF не вызывает нарушений в развитии этих клеток. По-видимому, регуляция структуры хроматина в стволовых клетках, вступивших в дифференцировку, осуществляется при помощи других механизмов и регуляторных комплексов.

Иные механизмы поддержания стабильного клеточного состава стволовой ниши Если бы не существовало механизма восполнения стволовых клеток, то количество таких клеток уменьшалось бы в течение жизни организма, однако на деле оно остается практически неизменным (Wallenfang et al., 2006).

Существует два возможных механизма восполнения пула стволовых клеток зародышевого пути – симметричное деление стволовых клеток и дедифференцировка клеток зародышевого пути в стволовые клетки. По всей вероятности, оба этих механизма встречаются в семенниках дрозофилы (de Cuevas, Matunis, 2011). Однако не все стадии клеток зародышевого пути способны снова стать стволовыми: начиная со стадии сперматоцитов, клетки уже не способны к дедифференцировке в стволовые клетки (Brawley, Matunis, 2004). Неспособность сперматоцитов превратиться в стволовые клетки связывают с серьезными изменениями в структуре хроматина (de Cuevas, Matunis, 2011).

1.3.2 Регуляция перехода от стадии митотических делений к мейозу В результате асимметричного деления стволовых клеток хаба образуется гониобласт, заключенный в оболочку из двух цистных клеток.

Гониобласт проходит четыре раунда митотических делений и в результате образуется циста, содержащая 16 соединенных между собой сперматогониев (Fuller, 1993). От стадии митотических делений клетки зародышевого пути переходят к стадии мейотических делений и терминальной дифференцировки. Как было упомянуто ранее, митотические деления происходят на стадии сперматогониев, а мейоз и начало терминальной дифференцировки – на стадии сперматоцитов (Fuller, 1993). Для перехода на стадию сперматоцитов сперматогонии должны прекратить пролиферацию, и в них должны активироваться гены, ответственные за реализацию генетической программы сперматоцитов. На данный момент считается, что основным регулятором этого этапа является белок Bam, кодируемый геном bag-of-marbles (bam) (Gonczy et al., 1997). У самцов дрозофилы, несущих мутацию по гену bam, пролиферация не ограничивается четырьмя раундами митоза, и в результате семенники оказываются заполнены цистами, содержащими более чем 16 сперматогониев, а остальные стадии сперматогенеза отсутствуют (Gonczy et al., 1997). Такие цисты не способны перейти на стадию сперматоцитов и в конечном итоге деградируют (Gonczy et al., 1997). Белок Bam впервые обнаруживается на стадии четырех сперматогониев, достигает наибольшей концентрации на стадии восьми сперматогониев и исчезает на стадии сперматоцитов, сразу после предмейотической S-фазы. Снижение дозы гена bam приводит к замедлению накопления белка Bam и задержке дифференцировки, в то время как преждевременная экспрессия bam приводит к ранней дифференцировке (Insco et al., 2009).

Белки Bam и Bgcn (Benign gonial cell neoplasm) действуют совместно и подавляют трансляцию. Это подтверждается способностью Bam связываться 3’-НТО транскриптов и непосредственно с фактором инициации трансляции eIF4A (Shen et al., 2009;

Insco et al., 2012). В яичниках дрозофилы Bam подавляет образование белка Nanos, который, в свою очередь (совместно c Pumillio), является основным ингибитором трансляции в женских стволовых клетках зародышевого пути. Подавление активности репрессоров приводит к запуску дифференцировки женских стволовых клеток зародышевого пути (Li et al., 2009). У самцов дрозофилы Bam действует на более поздней стадии развития клеток зародышевого пути, и то, каким образом он регулирует переход от пролиферации к дифференцировке остается невыясненным.

У самцов дрозофилы в подавлении активности bam в стволовых клетках зародышевого пути задействованы уже упомянутые BMP сигнальный путь, регуляция посредством микроРНК, а также белок Held-out wings (HOW) (Monk et al., 2011). Экспрессия HOW обнаруживается вплоть до стадии четырех гониобластов, когда его уровень резко снижается, что совпадает с началом экспрессии Bam (Monk et al., 2011). HOW также регулирует уровень CycB и участвует в регуляции митоза в стволовых клетках зародышевого пути (Monk et al., 2011). В сперматогониях концентрация Bam в клетках регулируется белком Mei-P26 (Insco et al., 2012). В отсутствие этого белка Bam не накапливается в сперматогониях, что приводит к нарушению дальнейшего сперматогенеза (Insco et al., 2012).

Интересно отметить, что на стадии третьего и четвертого митоза сперматогониев Bam напрямую связывается с 3’-НТО транскрипта mei-P26 и подавляет его трансляцию (Insco et al., 2012). Предполагается, что Mei-P может быть задействован в регуляторном каскаде, опосредованном микроРНК, и, в конечном счете, является ингибитором трансляции белков репрессоров гена bam. Роль такого репрессора в частности приписывается упомянутому выше HOW (Insco et al., 2012). На начальной стадии развития сперматоцитов белок Bam уже не обнаруживается, хотя мРНК bam сохраняется. На этой стадии активность Bam контролируется на пост транскрипционном уровне и осуществляется посредством действия микроРНК miR-275 и miR-306, которые способны связываться с 3’-НТО мРНК bam (Eun et al., 2013).

Несмотря на значительное количество данных о механизмах регуляции Bam, его функциональное значение в клетках мужского зародышевого пути остается невыясненным. Предполагается, что действие Bam в конечном итоге обеспечивает активацию факторов, ремоделирующих структуру хроматина и запускающих генетическую программу терминальной дифференцировки (de Cuevas, Matunis, 2011).

1.3.3 Регуляция терминальной дифференцировки клеток мужского зародышевого пути После окончания митотических делений мужские половые клетки вступают в стадию сперматоцитов, которая длится около 3,5 суток. После синхронного завершения предмейотической первичные S-фазы сперматоциты вступают в протяженную G2-фазу, в ходе которой происходит активная транскрипция генов. Длительное время считалось, что сперматоциты – последняя стадия развития половых клеток, на которой происходит транскрипция. Однако недавно была обнаружена постмейотическая активность 24 генов, активирующихся на стадии сперматид (Barreau et al., 2008a). В ходе G2-фазы первого мейоза нарабатываются практически все транскрипты, необходимые для прохождения всех последующих стадий сперматогенеза. Многие транскрипты транслируются по мере надобности, и такая отложенная трансляция может происходить спустя несколько дней после транскрипции генов (White-Cooper, 2010). Таким образом, на стадии сперматоцитов запускается генетическая программа терминальной дифференцировки клеток мужского зародышевого пути.

Начало терминальной дифференцировки клеток мужского зародышевого пути у Drosophila melanogaster сопровождается перестройкой хроматина и активацией специфичных генов. В регуляции этих процессов участвуют специализированные транскрипционные факторы, которые кодируются так называемыми генами задержки мейоза. Такое название обусловлено тем фактом, что в семенниках мутантных по этим генам самцов нарушается транскрипция, не происходит мейоз, а развитие клеток зародышевого пути останавливается на стадии сперматоцитов (Lin et al., 1996;

White-Cooper et al., 1998). Экспрессия генов задержки мейоза запускается с началом стадии сперматоцитов. На данный момент известно таких транскрипционных факторов и по функциональным признакам их делят на два класса: aly (aly, comr, tomb, topi и achi/vis) и can (can, mia, sa, rye, nht, mip40). Ниже будут более подробно рассмотрены механизмы регуляции активности генов в ходе дифференцировки клеток мужского зародышевого пути у дрозофилы.

Геномная организация семенник-специфичных генов и 1. предполагаемые механизмы их координированной регуляции В семенниках дрозофилы экспрессируется около половины всех белок кодирующих генов дрозофилы. Многие из этих генов обладают повышенной активностью в семенниках или экспрессируются исключительно в семенниках (т.е. являются семенник-специфичными) (Parisi et al., 2004;

Chintapalli et al., 2007). Кроме того, около половины из всех генов, кодирующих белки сперматозоидов, также обладают повышенной активностью в семенниках или являются семенник-специфичными (Dorus et al., 2006). Согласно современным данным среди всех аннотированных генов дрозофилы содержится около 1500 семенник-специфичных генов (Boutanaev et al., 2002;

Shevelyov et al., 2009;

Belyakin et al., 2010). Ранее было показано, что в соматических клетках семенник-специфичные гены зачастую расположены в районах транскрипционно неактивного гетерохроматина и формируют кластеры (Boutanaev et al., 2002;

Belyakin et al., 2005). Под кластерами подразумевается группа генов, которые расположены в геноме в непосредственной близости и имеют сходный профиль экспрессии. На сегодняшний день такая форма организации генов обнаружена у многих организмов (Cohen et al., 2000;

Caron et al., 2001). До сих пор остается невыясненным, какой регуляторный механизм обеспечивает синхронную экспрессию кластеризованных генов.

Около трети из общего числа семенник-специфичных генов входят в состав кластеров, содержащих от двух до шести генов (Boutanaev et al., 2002). Зачастую кластеры генов образуются в результате дупликации и такие гены могут иметь общие регуляторные элементы, что может объяснять их совместную регуляцию. Однако семенник-специфичные гены, образующие кластеры, преимущественно негомологичны, что подразумевает иной принцип их ко-регуляции (Boutanaev et al., 2002). Кроме того, в работе Meadows et al. [2010] было продемонстрировано, что в кластерах семенник специфичных генов не содержится единого регуляторного элемента, так как при разрушении кластера хромосомной перестройкой, экспрессия входивших в его состав генов не меняется. Одним из возможных механизмов координированной регуляции генных кластеров является формирование специализированных хроматиновых доменов. Хроматиновые домены должны содержать все необходимые регуляторные элементы для автономного управления транскрипцией входящих в их состав генов (Goldman, 1988). Домены могут находиться в активном («открытая»


конформация хроматина) или в репрессированном состоянии, при котором они формируют компактные хроматиновые структуры (Kalmykova et al., 2005). В пользу предположения о регуляции кластеров на уровне хроматина говорит тот факт, что в поддержании неактивного состояния семенник специфичных генов в соматических клетках участвует компонент ядерной мембраны – В-ламин (Shevelyov et al., 2009). Белок ламин не имеет собственного ДНК-связующего домена, поэтому логично предположить, что он связывается со специфическими хроматиновыми структурами. Вместе с тем, регуляция на уровне хроматина сама по себе не может в полной мере управлять экспрессией генов, и для обеспечения корректной тканеспецифичной экспрессии требуется комбинированное взаимодействие хроматина и специфических транскрипционных факторов.

1.5 Гены задержки мейоза Гены задержки мейоза кодируют семенник-специфичные транскрипционные факторы (White-Cooper, Davidson, 2011). В семенниках самцов, несущих мутации по этим генам, не активируются гены, необходимые для прохождения мейоза (cyclinA, twine, boule) и нарушается транскрипция генов дифференцировки (fzo, mst87F, dj и пр.) (White-Cooper, Кроме того, существуют свидетельства участия этих 2010).

транскрипционных факторов в процессе перестройки хроматина в сперматоцитах (Chen et al., 2005;

Chen et al., 2011). Как уже было упомянуто, на данный момент обнаружено 11 генов задержки мейоза, которые разделяют на два класса: aly (aly, comr, tomb, topi и achi/vis) и can (can, mia, sa, rye, nht, mip40). (Lin et al., 1996;

White-Cooper et al., 1998;

Jiang, White-Cooper, 2003;

Perezgasga et al., 2004;

White-Cooper, 2010). В основе деления на классы лежит две причины. Во-первых, мутации по генам aly-класса вызывали нарушения транскрипции как генов-регуляторов клеточного цикла (cyclinA, twine, boule), так и генов дифференцировки (fzo, mst87F, dj и пр.), в то время как мутации по генам can-класса приводили к инактивации только последних. Во-вторых, белки, кодируемые генами aly и can классов, входят в состав двух различных комплексов (White-Cooper, 2010). Важно отметить, что несмотря на предполагаемое влияние только на гены дифференцировки, у самцов, мутантных по генам can-класса, также как и в случае с aly, не происходит мейоз, и сперматогенез останавливается на стадии сперматоцитов, а все дальнейшие стадии сперматогенеза отсутствуют.

1.5.1 Гены aly-класса В состав aly-класса входят гены aly, comr, tomb, topi и achi/vis (White Cooper et al., 2000). Белок Aly содержит DIRP-домен (domain in Rb-related pathway), а все остальные белки, кодируемые генами aly-класса, содержат ДНК-связующие домены (Ayyar et al., 2003;

Jiang, White-Cooper, 2003;

Perezgasga et al., 2004;

Beall et al., 2007;

Jiang et al., 2007).

Белки, кодируемые генами aly-класса, образуют комплекс tMAC (testis Meiotic Arrest Complex). Помимо белков, кодируемых генами задержки мейоза, Aly, Comr, Topi, Tomb, в состав tMAC комплекса также входят белки Wuc, Mip40 и Caf1/p55 (Beall et al., 2007). Два последних белка также являются компонентами комплекса Myb-MuvB (MMB/dREAM), а Aly и Tomb являются паралогами субъединиц этого комплекса (Korenjak et al., 2004;

Lewis et al., 2004). В состав ММВ-комплекса входят белки Myb, Mip40, Mip120, Mip130, Caf1/p55, Rbf1, Rbf2, E2F2, Dp, Lin-52, Rpd3 и L(3)mbt (Korenjak et al., 2004) (Lewis et al., 2004;

Sim et al., 2012). Было обнаружено, что в соматических клетках MMB-комплекс связывается с большим количеством генов (Georlette et al., 2007). В состав комплекса входят как белки-репрессоры (Rbf1, Rbf2, E2F2, Dp, Mip40, Mip120, Mip130), так и активаторы (Myb) транскрипции (Korenjak et al., 2004;

Lewis et al., 2004;

Georlette et al., 2007;

Lee et al.;

Lee et al., 2012;

Sim et al., 2012). Хотя и известно, что в некоторых случаях MMB-комплекс может вызывать активацию генов, основная его роль заключается в подавлении транскрипции генов (Beall et al., 2007;

Sim et al., 2012). Было показано, что MMB-комплекс вовлечен в регуляцию многих процессов, таких как регуляция клеточного цикла, репарация, инактивация транскрипции генов, задействованных в клеточной дифференцировке (Manak et al., 2002;

Georlette et al., 2007;

Manak et al., 2007;

Lee et al., 2012). Несмотря на столь обширный спектр действия этого комплекса, остается неисследованным вопрос, каким образом происходит активация репрессированных им генов.

Гены mip40 (can-класс) и wuc также являются генами задержки мейоза (Beall et al., 2007;

Doggett et al., 2011). По характеру влияния на экспрессию, mip40 был отнесен к can-классу, однако кодируемый им белок входит в состав tMAC (Beall et al., 2007). Ген wuc является гомологом lin-52 (кодирует компонент MMB, Lin-52) и по данным о влиянии на экспрессию не принадлежит ни к одному из двух классов генов задержки мейоза. Кроме того, предполагается, что белок Wuc может подавлять транскрипцию генов, и с учетом того, что он действует в составе tMAC, это может быть дополнительным свидетельством функционального сходства tMAС и MMB комплексов (Doggett et al., 2011). Предполагается, что tMAC может являться семенник-специфичной версией MMB (Beall et al., 2007). На данный момент нет опубликованных данных относительно того, каким образом белки, кодируемые генами aly-класса (tMAC-комплекс) влияют на генную экспрессию в сперматоцитах. Вероятно, белки, кодируемые генами aly класса, могут оказаться активаторами транскрипции, так как они ассоциированы с эухроматином (White-Cooper et al., 2000;

Jiang, White Cooper, 2003;

Wang, Mann, 2003;

Jiang et al., 2007). Однако в некоторых работах не исключалась и возможность активации генов-мишеней tMAC посредством ингибирования генных репрессоров (White-Cooper, Davidson, 2011). Прямых указаний в пользу первого или второго предположения пока нет.

1.5.2 can-класс К can-классу принадлежат гены can, mia, sa, rye, nht. В отсутствие белков can-класса нарушается транскрипция генов, необходимых для осуществления программы развития половых клеток от стадии сперматоцитов до стадии сперматозоидов (спермиогенез). Гены can, mia, sa, rye, nht являются семенник-специфичными гомологами генов TAF4, TAF5, TAF6, TAF8 и TAF12, соответственно (Hiller et al., 2001;

Hiller et al., 2004).

Белки TAF4, TAF5, TAF6, TAF8 и TAF12 входят в состав базального фактора транскрипции TFIID и экспрессируются практически во всех тканях D.

melanogaster. Вполне возможно, что семенник-специфичные TAF (tTAF), кодируемые генами can-класса, также формируют сходный комплекс.

Предполагается, что в состав такого комплекса входят белки tTAF и изоформа TAF1, TAF1-2 (Metcalf, Wassarman, 2007). Однако, по всей вероятности, функции семенник-специфичного TFIID-комплекса могут несколько отличаются от функций повсеместно представленного TFIID, поскольку было обнаружено, что белки локализуются tTAF преимущественно в ядрышке и лишь небольшая часть ассоциирована с эухроматином (Chen et al., 2005). Кроме того белки tTAF могут участвовать в процессе перестройки хроматина (Chen et al., 2005;

Chen et al., 2011).

1.5.3 Взаимодействие белков, кодируемых генами aly и can-классов, и их влияние на структуру хроматина Ранее было показано, что на стадии сперматогониев гены, отвечающие за процесс дифференцировки клеток зародышевого пути, располагаются в областях неактивного хроматина, обогащенного гистоновыми метками H3K27мет3 (Gan et al., 2010). Такой тип гистоновой модификации связан с действием белков группы Polycomb, осуществляющих репрессию активности генов (Schwartz, Pirrotta, 2008). Подавление активности генов осуществляется двумя комплексами PRC1 и PRC2, образованными белками Polycomb (Schwartz, Pirrotta, 2007). Белок E(z), входящий в состав PRC2 способен проводить триметилирование гистона H3 по остатку лизина 27 (H3K27мет3).

Белок Polycomb, входящий в состав PRC1 комплекса, и содержит хромодомен, способный распознавать H3K27мет3 гистоновую метку. При помощи Polycomb комплекс PRC1 связывается с модифицированными гистонами, изменяет структуру хроматина и, предположительно, делает невозможным связывание активирующих транскрипционных факторов (Schwartz, Pirrotta, 2007).

На примере трех известных генов-мишеней (fzo, Mst87F, dj) белка Sa, кодируемого геном can-класса, было показано, что белки, кодируемые генами can-класса (tTAF-белки), конкурируют с белками комплекса PRC1 за связывание с промоторными областями генов-мишеней (Chen et al., 2005).

Было высказано предположение, что tTAF могут противодействовать белкам комплекса PRC1 посредством привлечения активирующего комплекса антагониста Trithorax, однако экспериментального подтверждения этого предположения пока нет (Chen et al., 2005). Еще одна интересная особенность tTAF заключается в том, что в первичных сперматоцитах они локализуются в ядрышке вместе с белком Polycomb (Chen et al., 2005). Более того, мутации по генам can-класса приводят к нарушению его локализации (Chen et al., 2005). Эта особенность трактовалась исследователями как свидетельство того, что tTAF-белки транспортируют Polycomb в ядрышко.

Механизм этого процесса, как, впрочем, и его биологический смысл, пока не выяснены.

Позже было продемонстрировано, что в отсутствие белков, кодируемых генами aly-класса, tTAF-белки не способны связывать гены мишени (Chen et al., 2011). Кроме того, на фоне мутаций генов aly-класса не были способны противодействовать tTAF-белки Polycomb опосредованной репрессии, в отсутствие же tTAF-белков, Polycomb удалялся с промоторных областей генов-мишеней, однако эффективность этого процесса была значительно ниже, чем при действии обоих комплексов (Chen et al., 2011). Эти данные указывают на то, что удаление инактивирующих меток требует активности обоих классов генов ареста мейоза. Кроме того, для активации генов дифференцировки недостаточно только преодолеть действие Polycomb, так как инактивация E(z), ключевого компонента PRC2, в не обеспечивала нормальной экспрессии генов nht-мутантах дифференцировки (Chen et al., 2011).


Генетические методы мечения отдельных клеточных 1. популяций и исследования в них функций генов Значительный прогресс в области изучения биологии развития дрозофилы во многом связан с разработкой методик, позволяющих проводить генетические манипуляции в отдельной клеточной популяции организма, не затрагивая при этом остальные клетки. Такие методики позволяют проводить генетическое мечение отдельных клеточных популяций или прослеживать клеточные поколения, берущие начало от одной клетки-предшественника. Генетические системы для прослеживания клеточных поколений также используются для активации трансгенов или создания мутаций по генам исключительно в заданной популяции клеток. В общем смысле, действие упомянутых генетических систем направлено на создание мозаичного организма, в котором присутствуют клетки различного генотипа.

Действие этих систем основано на способности специальных ферментов-рекомбиназ осуществлять обмен гомологичными участками хромосом по определенным сайтам узнавания. В экспериментах чаще всего используется либо FLP-рекомбиназа, которая распознает специфические участки ДНК, называемые FRT-сайтами, либо Cre-рекомбиназа, способная осуществлять рекомбинацию по особым loxP-сайтам (Golic, Lindquist, 1989;

Siegal, Hartl, 1996;

Martin et al., 2002). Компоненты FLP/FRT-системы рекомбинации исходно были обнаружены у дрожжей S. cerevisiae, а Cre/loxP системы - у бактериофага P1 (Abremski, Hoess, 1984;

Golic, Lindquist, 1989).

Для проведения рекомбинации на первом этапе сайты узнавания фермента внедряют в один и тот же геномный локус гомологичных хромосом и индуцируют экспрессию трансгена, кодирующего рекомбиназу. В ходе метафазы митоза гомологичные хромосомы сближаются, и под действием рекомбиназы происходит обмен фрагментами по сайтам узнавания (Liu, Hou, 2008). При помощи систем рекомбинации также можно осуществлять различные хромосомные перестройки, в частности, удалять участки хромосом - для этого два сайта узнавания рекомбиназы располагают на одной хромосоме, и под действием фермента происходит удаление участка, ограниченного ими (Struhl, Basler, 1993).

Существует несколько методов прослеживания клеточных поколений и генетического мечения отдельных популяций. В одном из них (Positively Marked Mosaic Lineage (PMML)), при помощи стандартных генетических методов в один и тот же участок гомологичных хромосом вводят две генетические конструкции (Kirilly et al., 2005;

Liu, Hou, 2008). Первая содержит промотор, способный активировать экспрессию генов во всех тканях исследуемого организма, за которым следует FRT-сайт. Во второй конструкции вслед за FRT-сайтом располагается последовательность, кодирующая белок-активатор транскрипции GAL4. Обнаруженный у дрожжей белок способен связываться со специфическими GAL последовательностями, называемыми UAS (upstream activatory sequence) и запускать транскрипцию генов, расположенных вслед ними (Brand, Perrimon, Система широко используется для эктопической 1993). GAL4/UAS экспрессии трансгенов в экспериментах на дрозофиле (Brand, Perrimon, 1993;

Liu, Hou, 2008). Помимо двух описанных, в геном дрозофилы также вводят индуцируемую конструкцию, кодирующую FLP-рекомбиназу, а также конструкцию, содержащую последовательности UAS и ген репортерного белка, например, EGFP. При индукции FLP-рекомбиназы в митотически делящихся клетках организма происходит рекомбинация между гомологичными хромосомами, в результате чего GAL4 оказывается под контролем активного промотора и запускается его экспрессия. GAL связывается с UAS-последовательностями и активирует репортерный белок, таким образом клетки, претерпевающие митоз и их потомки, окажутся меченными С использованием этого метода можно также EGFP.

инактивировать гены при помощи РНК-интерференции. Для этого под контроль UAS помещают конструкцию, кодирующую дцРНК, которая вызовет деградацию транскриптов интересующего гена. Недостатком этого метода является тот факт, что при делении клеток, лишь одна из дочерних клеток будет меченной и вся клеточная популяция будет мозаичной.

Генетическая система MARCM (mosaic analysis with a repressive cell marker) позволяет получать клетки, гомозиготные по определенной генной мутации, в составе гетерозиготного по этой мутации организма (Lee, Luo, 1999). При этом мутантные клетки также экспрессируют репортерный белок, что позволяет легко отличать их от клеток, гетерозиготных по мутации.

Такая система позволяет исследовать функции генов, мутации по которым рецессивны и летальны в гомозиготе. MARCM-система включает в себя несколько компонентов, среди которых FLP-рекомбиназа, UAS активируемый репортерный белок и последовательности, кодирующие белки GAL4 и GAL80, под контролем конститутивных промоторов. Белок GAL способен связываться с белком-активатором GAL4 и инактивировать его.

Для реализации метода в хромосому, несущую рецессивную мутацию, внедряют FRT-сайт, и в такую же область гомологичной хромосомы дикого типа внедряют конструкцию, в которой вслед за FRT-сайтом располагается последовательность, кодирующая GAL80, под контролем конститутивного промотора. Другие хромосомы трансформируют конструкциями, кодирующими GAL4 под контролем конститутивного промотора и UAS активируемый репортерный белок, и индуцируемой конструкцией, кодирующей В результате все перечисленные FLP-рекомбиназу.

конструкции содержатся в геноме каждой клетки организма. В ходе митоза, под действием FLP происходит рекомбинация между FRT-сайтами, и с вероятностью 25% образуется дочерняя клетка, гомозиготная по рецессивной мутации. Кроме того, в этих клетках будет отсутствовать GAL80, что позволит GAL4 активировать репортерный белок. В результате такие клетки будут обладать мутантным фенотипом и генетической меткой, позволяющей без труда идентифицировать их. Одним из минусов MARCM системы является относительная стабильность белка GAL80, который неизбежно наследуется дочерними клетками, и поэтому требуется достаточно много времени для «проявления» меченых клеток (Liu, Hou, 2008). Кроме того, если речь идет об исследовании стволовых клеток, лишь часть пула клеток потомков будет нести мутацию.

Наиболее простым в исполнении является метод прослеживания клеточных поколений, в котором транскрипция гена, кодирующего репортерный белок, блокируется во всех клетках организма при помощи специальной стоп-кассеты, а ген рекомбиназы активируется специфичным промотором, работающим только в интересующей популяции клеток (Struhl, Basler, 1993;

Davis et al., 2008). Ген репортерного белка находится под контролем промотора, способного обеспечить экспрессию во всех типах клеток, но его экспрессия не запускается, так как между ними расположена стоп-кассета. Стоп-кассета представляет собой терминатор транскрипции, фланкированный сайтами узнавания рекомбиназы. Под контролем специфичного промотора фермент-рекомбиназа нарабатывается только в клетках исследуемой популяции. В результате в этих клетках происходит удаление стоп-кассеты, и запускается экспрессия репортерного гена. В зависимости от выбора тканеспецифичного промотора можно запускать экспрессию репортерного белка в тех или иных клеточных линиях, причем меченными будут как клетки-предшественники, так и полностью вся клеточная линия, берущая начало от них. Основной методологической сложностью данного метода является подбор специфичного промотора.

Таким же образом можно запускать эктопическую экспрессию любого трансгена в отдельной клеточной популяции организма.

1.7 Методы определения сайтов посадки ДНК-связывающих белков На данный момент наиболее широко используемыми методами исследования сайтов связывания ДНК-связывающих белков являются метод иммунопреципитации хроматина и DamID. Иммунопреципитация хроматина включает в себя выделение хроматина, обработку специальным агентом, позволяющим образовывать ковалентные сшивки между белками хроматина и ДНК. После образования кросс-сшивок, полученные образцы обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе для получения коротких фрагментов ДНК. После этого, с применением специфических антител к исследуемому белку, выделяют его комплексы с ДНК, разрушают кросс сшивки и анализируют полученные фрагменты ДНК методом микрочипов, либо массового параллельного секвенирования (Lee et al., 2006b;

Hoffman, Jones, 2009). К недостаткам данного метода можно отнести достаточно сложную процедуру и потребность в специфических антителах к исследуемому белку.

Метод DamID позволяет картировать сайты связывания хроматиновых белков и представляет собой альтернативу методу in vivo иммунопреципитации хроматина. В сравнении с методом иммунопреципитации хроматина идентификация сайтов связывания при помощи метода DamID не требует фиксации материала и использования антител, что значительно упрощает процедуру. Метод DamID основан на способности ДНК-аденин метилтрансферазы (Dam) E.coli метилировать аденин в составе последовательности GATC (Marinus, Morris, 1973;

Brooks et al., 1983). Такой тип метилирования специфичен для бактериальных клеток и не встречается у эукариот. В геноме дрозофилы GATC последовательности встречаются в среднем каждые 200-300 п.н., что позволяет определять сайты связывания с достаточно высоким разрешением (van Steensel, Henikoff, 2000).

Показано, что умеренная экспрессия трансгенной Dam не вызывает токсических эффектов в организме дрозофилы, а Dam-метилирование не приводит к дефектам развития (Wines et al., 1996). Для картирования ДНК связывающих белков культуру клеток или модельный объект трансформируют генетической конструкцией, кодирующей химерный полипептид, состоящий из исследуемого белка и Dam. Исследуемый белок связывается с ДНК, а метилтрансфераза оставляет метильные метки в окрестностях сайта связывания. На следующем этапе выделяют модифицированную геномную ДНК и гидролизуют ее по метилированным GAmTC последовательностям специфичной эндонуклеазой рестрикции Затем к концам гидролизованных фрагментов лигируют (DpnI).

двуцепочечные адаптеры и обрабатывают полученные фрагменты ДНК специфичной к неметилированным GATC сайтам эндонуклеазой рестрикции (DpnII). После обработки DpnII адаптеры фланкируют только те фрагменты, которые ограничены GAmTC и не содержат внутри неметилированных GATC. На следующем шаге фрагменты ДНК амплифицируют при помощи полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарным адаптерам (Greil et al., 2006). Заключительным этапом является гибридизация образцов ДНК на микрочип или, с небольшими вариациями в процедуре пробоподготовки, анализ образцов при помощи методов массового параллельного секвенирования Для (DamID-Seq).

коррекции фонового метилирования, через все стадии эксперимента проводится контрольный образец, содержащий только Dam. Несмотря на менее высокое разрешение по сравнению с иммунопреципитацией хроматина, метод DamID позволяет получать схожие профили связывания исследуемых белков (Holland et al., 2005).

DamID применяется для картирования сайтов связывания белков как в культурах клеток насекомых и млекопитающих, так и при анализе профиля связывания белков в живых модельных организмах (S. Pombe, Arabidopsis thaliana, D. melanogaster) (de Wit et al., 2005;

Germann, Gaudin, 2011;

Woolcock et al., 2011). Однако в работах на живых организмах исследовались белки, экспрессирующиеся во всех тканях организмов. До настоящего времени использование метода DamID для определения профиля связывания исследуемого белка в определенных клеточных линиях или тканях организма было сопряжено с рядом сложностей. Это обусловлено тем, что для корректной работы DamID требуется крайне низкий уровень экспрессии химерного белка – в противном случае резко возрастает фоновое метилирование и снижается специфичность метода. Эмпирически было показано, что поддержание низкой, но достаточной для проведения экспериментов, активности химерного белка обеспечивается базальной активностью промотора белка теплового шока hsp70 при 250С (van Steensel et al., 2001). Однако базальная активность промотора hsp70 проявляется во всех клетках организма, в результате чего химерный белок экспрессируется даже в тех клетках, в которых in vivo исследуемый ген неактивен, что дает смешанную картину связывания. Поэтому эксперименты DamID в отдельных субпопуляциях клеток требуют выделения интересующих клеток из органа или всего организма, что далеко не всегда возможно.

Заключение Для успешного прохождения сперматогенеза у D. melanogaster на стадии сперматоцитов должна произойти глобальная перестройка хроматина и последующая активация семенник-специфичных генов. По современным данным совместное действие генов задержки мейоза играет в этих процессах ключевую роль, однако лежащий в основе механизм остается невыясненным.

Представленная работа направлена на прояснение роли белков Cookie monster и Cannonball в генетической программе, контролирующей массовую активацию генов в сперматоцитах D. melanogaster.

Рисунок 1. Строение пролиферативного центра семенника у D. melanogaster.

ЗСК – стволовые клетки зародышевого пути, ССК – соматические стволовые клетки гонад, Гб – гониобласт, Ц – цистные клетки. Рисунок из Davies, Fuller, [2008].

Рисунок 2. Принципиальные этапы сперматогенеза у D. melanogaster.

Рисунок из Davies, Fuller, [2008].

Рисунок 3. Регуляторные сигнальные каскады, участвующие в поддержании гомеостаза ниши стволовых клеток у D. melanogaster.

Рисунок из de Cuevas, Matunis, [2011].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Ведение линий мух Линии мух вели при температуре 250С на стандартном корме, состоящем из агара, дрожжей, кукурзной крупы, изюма, патоки и воды.

В работе использовались следующие линии мух:

Oregon R (Источник: фонд лаборатории) y1w67 (Источник: фонд лаборатории) cn comrz2-1340 bw/CyO (Предоставлены Dr. H. White-Cooper, Университет Кардиффа, Великобритания) can3 red e/TM6C (Предоставлены Dr. H. White-Cooper, Университет Кардиффа, Великобритания) y-w-;

P{y[+t7.7]=CaryP}attP40;

M{vas-int.B}ZH-102D (Источник:

Bloomington Stock Center) y1w67c23;

P{y[+t7.7]=CaryP}attP18;

M{vas-int.B}ZH-102D (Источник:

Bloomington Stock Center) Генетические конструкции Все генетические конструкции были сконструированы на основе вектора pUAST (Brand, Perrimon, 1993). Последовательность attB для phiC31 опосредованной рекомбинации (Groth et al., 2004) была встроена в состав вектора pUAST по уникальному сайту рестрикции NsiI. Полученный вектор pUAST-attB использовался в качестве основы для всех использованных конструкций.

nanos-cre:

Участки геномной ДНК, которые граничат с кодирующей областью гена nanos с 5’ и 3’ концов и обеспечивают корректную экспрессию nanos в клетках зародышевого пути (Gavis et al., 1996;

Forrest et al., 2004), были наработаны при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Phusion polymerase, NEB, США), использованные праймеры:

5’F - atctgcagCGCACAAGGGCAGCTATTCT, 5’R - aagcggccgcGGCGAAAATCCGGGTCGAAA, 3’F - aagcggccgcAGTGCTGTGCCCCAAACTAC, 3’R - attctagaCTGGCCCTTTTCGAGAAAC.

В качестве матрицы использовали образцы геномной ДНК, выделенной из мух линии Oregon R по описанной ниже методике. Создание конструкции проводилось в несколько этапов. Сначала при помощи гидролиза эндонуклеазами рестрикции PstI и NotI (Fermentas, США) из вектора pUAST attB были удалены последовательности UAS и промотор гена hsp70. ПЦР фрагмент геномной ДНК, ограничивающий кодирующую часть гена nanos с 5’-конца, был обработан рестриктазами PstI и NotI (Fermentas, США) и клонирован в полученный вектор. На следующем этапе в полученную конструкцию по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции NotI и XbaI (Fermentas, США) был клонирован ПЦР-фрагмент, ограничивающий кодирующую область гена nanos с 3’-конца. На заключительном этапе между регуляторными областями гена nanos по сайту рестрикции NotI в состав конструкции была введена кодирующая область гена рекомбиназы cre.

Последовательность, кодирующая Cre-рекомбиназу, была наработана при помощи ПЦР с вектора P[Crew] (Siegal, Hartl, 1996) и предварительно клонирована в вектор pGEM-TEasy (Promega, США). Полная последовательность полученной конструкции nanos-cre доступна в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ под номером KC845567.

) Конструкция UbiprostopmCD8-GFP:

Эта конструкция была создана ранее Белякиным С. Н.

Сконструирована также на основе вектора pUAST-attB, из которого удалены последовательности UAS и промотор гена hsp70. Содержит в составе промотор гена Ubi-p63E (Evans et al., 2009) и последовательность, кодирующую репортерный химерный белок mCD8-GFP (Lee, Luo, 1999, 2001). Между промотором и последовательностью mCD8-GFP встроена стоп кассета, состоящая из последовательности терминатора транскрипции гена hsp70Ab (Struhl, Basler, 1993), фланкированной сайтами loxP (Struhl, Basler, 1993). Полная последовательность полученной конструкции доступна в GenBank под номером KC Конструкции для DamID:

Чтобы получить генетические конструкции для проведения DamID, в вектор pUAST-attB по сайтам рестрикции EcoRI, NotI была клонирована последовательность, кодирующая химерный белок Dam с Myc-эпитопом (dam-myc (van Steensel, Henikoff, 2000)). На следующем шаге между промотором и последовательностью dam-myc по сайту EcoRI была встроена стоп-кассета, состоящая из последовательности терминатора транскрипции гена hsp70Ab (Struhl, Basler, 1993), фланкированной сайтами loxP (Struhl, Basler, 1993). Полная последовательность конструкции hsp70stopdam доступна в Gene Bank под номером JN993988.

Путем встраивания по сайту рестрикции кодирующей NotI последовательности гена comr в конструкцию hsp70stopdam в одну рамку считывания с dam-myc была получена конструкция hsp70stopdam-comr.

Кодирующая последовательность гена comr была наработана при помощи ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК (Phusion полимераза, NEB, США), использованные праймеры:

F – ctgcggccgcTCATGTCGGGGAACCAAGACAC, R – gaggtaccTCAACGAGGATTTCGCTTGG.

В качестве матрицы использовалась образцы геномной ДНК, выделенной из мух линии Oregon R по описанной ниже методике. Полная последовательность доступна в Gene Bank под номером KC845569.

Последовательности всех полученных конструкций были верифицированы секвенированием.

Выделение ДНК в ходе этапов молекулярного клонирования Выделение плазмидной ДНК, очистка ДНК из реакционных смесей, элюции ДНК из агарозного геля проводили при помощи специализированных наборов (БиоСилика, Россия) согласно протоколу производителя.

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции Для проведения специфического гидролиза ДНК применяли эндонуклеазы рестрикции производства «Fermentas» (США). В работе использовали ферменты для ускоренного проведения реакций (формат Fast Digest).

Лигирование фрагментов ДНК Лигирование фрагментов ДНК проводили с использованием набора для проведения быстрого лигирования (Quick ligation kit, NEB, США) согласно методике производителя.

Дефосфорилирование Дефосфорилирование проводили с использованием фермента Antarctic phosphatase в соответствии с инструкцией производителя (NEB, США).



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.