авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ...»

-- [ Страница 2 ] --

Определение концентрации ДНК Концентрацию ДНК определяли по А260 с использованием спектрофотометра Nanodrop2000 (Thermo Scientific, США). Чистоту препарата ДНК оценивали по соотношениям A260/A280 и A260/A230.

Электрофорез в агарозном геле Разделение фрагментов ДНК проводили в 1,0% агарозном геле, приготовленном на основе TAE-буфера (40 мМ Tris-HCl pH 8.0, 20 мМ NaAc, 2 мМ EDTA) с добавлением бромистого этидия. Перед нанесением на гель образцы ДНК смешивали с буфером нанесения, содержащим лидирующие красители (50% глицерин, 0.05% бромфеноловый синий, 0.05% ксиленцианол). Электрофорез проводился при постоянном напряжении В/см. Результаты документировались с использованием прибора Ingenius (Syngene, США).

Полимеразная цепная реакция ПЦР проводили с использованием Taq-полимеразы (предоставлена Барановым К. О., лаборатория иммуногенетики ИМКБ СО РАН) или Phusion полимеразы (NEB, США) при условиях:

1 цикл: 4 мин – денатурация ДНК (96С) 25-35 циклов: 30 сек - денатурация (95С) 30 сек – отжиг праймеров (50-65 С) 1-3 мин – синтез ДНК (72С) 1 цикл 3 мин – окончательное достраивание цепей ДНК (72С) Для проведения амплификации ДНК Taq-полимеразой в реакционную смесь добавляли 1/10 объема 10х буфера С1 (650 mM Трис-HCl pH 8,9, mM (NH4)2SO4, 15 mM MgCl, 0,5% Твин 20) и 0,1 мМ эквимолярной смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) (Медиген, Россия), по 10 пмоль двух праймеров, 0,05-1 мкг ДНК-матрицы, 0,2-5 единиц активности фермента.

Для наработки белок-кодирующих последовательностей использовалась Phusion-полимераза (NEB, США). ПЦР проводилась в соответствии с рекомендациями производителя.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК Для проведения одной секвенирующей реакции готовили общую смесь объемом 15 мкл, содержащую:

ДНК 1-3 мкл (0,3-0,5 мкг) 1 мкл Big Dye Terminators v3. 3 мкл 5х Big Dye buffer Праймер (10mmol) 2 мкл H2O до 15 мкл Реакцию проводили по стандартной программе:

(96оС - 3 мин) – 1 цикл (96оС – 20 сек;

температура отжига праймеров – 15 сек;

60оС – 4 мин) – циклов (96оС – 3 мин) – 1 цикл Очистку реакционных смесей от невключившихся флуоресцентно меченных проводили гель-фильтрацией в соответствии с BigDye-ddNTP рекомендациями сотрудников ЦКП СО РАН «Геномика». Сорбент Sephadex G-50 (Sigma, США) смешивали с бидистиллированной водой в соотношении 1:20 и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. 400 мкл полученной суспензии переносили в спин-колонку, удаляли воду центрифугированием в течение 1 минуты при 1000xg. Промывали сорбент путем добавления в спин колонку 200 мкл бидистиллированной воды и последующего центрифугирования в течение 1 минуты при 1000xg. Переносили спин колонки в чистые пробирки, наносили реакционную смесь на сорбент и центрифугировали 2 минуты при 1000xg. После очистки образцы высушивали с использованием вакуумной центрифуги Concentrator plus (Eppendorf, Германия) и передавали для определения нуклеотидной последовательности в Центр коллективного пользования СО РАН "Геномика". Для анализа использовались капиллярные секвенаторы ABI XL Genetic Analyser и ABI 3730 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).

Получение электрокомпетентных клеток В 500 мл среды LB (на 1 литр среды: 10г NaCl (Медиген, Россия), 5г – дрожжевой экстракт (Amresco, США), 10г – триптон (Amresco, США)) вносили 1 мл ночной культуры клеток E.coli штамма XL-MRF' (Stratagene, США), инкубировали при 230С и интенсивном перемешивании. После достижения оптической плотности 0,5 культуру бактерий охлаждали на льду в течение 30 минут. Собирали клетки центрифугированием 15 минут при 40С.

1500g при Промывали осадок в 500 мл автоклавированной дистиллированной воды и центрифугировали при 1500g 15 минут. Повторяли процедуру дважды. Промывали клетки 20 мл 10% глицерина и собирали осадок при 1500g 15 минут. Ресуспендировали клетки в 2 мл охлажденного раствора 10% глицерина. Расфасовывали по 50 мкл полученной суспензии в микроцентрифужные пробирки. Пробирки замораживали в низкотемпературном холодильнике и хранили при -700С.

Трансформация бактериальных клеток электропорацией В пробирку, содержащую суспензию электрокомпетентных клеток, добавляли 1-10 мкл раствора ДНК, перемешивали на льду. Переносили полученную суспензию в охлажденную кювету (1 mm), помещали в электропоратор Eppendorf Multiporator, режим электропорации 5 мс, 1700 В.

По завершении процесса электропорации немедленно вносили в кювету 1 мл нагретой до 370С среды LB, ресуспендировали. Отбирали раствор из кюветы и переносили в микроцентрифужную пробирку. Собирали клетки центрифугированием и ресуспендировали осадок в 100 мкл стерильной среды LB. Полученную суспензию растирали шпателем Дригальского по чашке Петри с агаризованной средой LB (на 1 литр среды: 10г NaCl (Медиген, Россия), 5г – дрожжевой экстракт (Amresco, США), 10г – триптон (Amresco, США), 5г – агар (Amresco, США)), содержащей селективный антибиотик.

Выделение геномной ДНК из семенников и целых мух Для выделения ДНК необходимое количество семенников или мух гомогенизировали в 700 мкл лизирующего раствора (0,1 M NaCl, 0,2 M сахароза, 0,1 M Tris HCl (pH = 9,1), 0,05 M EDTA (pH = 8,0), 0,5% SDS). К полученному гомогенату 10 мкл диспазы (100 мг/мл, Roche, США) и инкубировали в течение ночи при 560С. Для экстракции ДНК добавляли равный объем ФХИ (смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в пропорции 25:24:1, AppliChem, Германия), тщательно перемешивали и центрифугировали 15 минут при 13000xg. Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли 10 мкл РНКазыА (10 мг/мл). Инкубировали 30 минут при 370С. Проводили повторную экстракцию ФХИ. Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали 20 минут при 13000xg. К полученной водной фазе раствора добавляли полтора объема изопропанола и центрифугировали 20 минут при 13000xg. Полученный осадок ДНК промывали раствором 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в необходимом объеме воды.

Выделение апирогенной плазмидной ДНК для проведения трансформации мух В 100 мл среды LB вносили 200 мкл ночной культуры бактерий, содержащих необходимую генетическую конструкцию, и инкубировали с перемешиванием 14-16 часов при 370С. Полученную биомассу собирали центрифугированием 15 мин при 6000xg при 40С. Дальнейшее выделение проводили при помощи набора Plasmid midi kit (Qiagen, США) согласно протоколу производителя.

Трансформация генома дрозофилы Введение генетических конструкций проводили при помощи системы phiC31-опосредованной трансформации дрозофилы (Bischof et al., 2007). Для трансформации использовали линии, содержащие сайт интеграции attP во второй хромосоме (attP40, линия y-w-;

P{y[+t7.7]=CaryP}attP40;

M{vas y1w67c23;

и в Х-хромосоме (attP18, линия int.B}ZH-102D) P{y[+t7.7]=CaryP}attP18;

M{vas-int.B}ZH-102D) (Markstein et al., 2008).

Помимо сайта интеграции эти линии мух также содержат источник phiC31 интегразы в составе четвертой хромосомы (Bischof et al., 2007).

Трансформацию проводили по описанной ранее методике, с некоторыми изменениями (Spradling, Rubin, 1982). Все процедуры проводились при температуре 230С. Эмбрионы линий, содержащих сайты attP40 или attP18, собирали на стадии 0-40 мин после откладывания и дехорионизировали вручную. Эмбрионы фиксировали на предметном стекле с использованием двусторонней липкой ленты и сушили в течение 3-10 минут в зависимости от влажности воздуха. Затем эмбрионы покрывали слоем минерального масла Halocarbon 200 (Halocarbon, США). Раствор ДНК (концентрация – 0, мкг/мкл) вводили в область формирования полярной плазмы при помощи микроинъекции. В среднем проводили микроинъекцию около 400 эмбрионов на одну генетическую конструкцию. После инъекции предметное стекло с эмбрионами помещали во влажную камеру. Личинок первого возраста собирали через сутки и переносили на стандартный корм. Средняя выживаемость личинок составляла 20%. Вылетевших мух (G0) индивидуально скрещивали с мухами линии y1w67. Потомков от скрещивания (F1) анализировали на предмет экспрессии репортерного гена miniwhite, содержащегося в составе генетических конструкций. Для получения гомозиготных трансгенных линий отбирали потомков, несущих встройку гена miniwhite, и скрещивали с мухами такого же генотипа. В следующем поколении отбирали мух, несущих двойную дозу гена miniwhite.

Конструкции nanos-cre и UbiprostopmCD8-GFP внедряли в сайт attP40, а конструкции hsp70stopdam и hsp70stopdam-comr в attP18. Для каждой конструкции было получено 5-10 независимых трансформантов и 5- независимых гомозиготных трансгенных линий. Все полученные линии были верифицированы при помощи ПЦР со специфичными праймерами.

Генетические скрещивания Для проверки специфичной экспрессии Cre-рекомбиназы в клетках зародышевого пути было поставлено скрещивание самок линии y1w67/y1w67;

UbiprostopmCD8-GFP/UbiprostopmCD8-GFP;

+/+ с самцами линии y1w67/Y;

nanos-cre/ nanos-cre;

+/+.

Для проведения DamID были поставлены скрещивания самок линии y1w67,hsp70stopdam/y1w67,hsp70stopdam;

+/+;

+/+ с самцами линии y1w67/Y;

nanos-cre;

+ и скрещивания самок линии y1w67, hsp70stopdam comr;

+;

+ с самцами линии y1w67/Y;

nanos-cre/ nanos-cre;

+/+. Среди потомков от скрещивания отбирали самцов для последующей диссекции семенников. Из семенников выделяли геномную ДНК, которую использовали для проведения DamID.

Методы микроскопического анализа Диссекцию семенников проводили в холодном PBS (137 мM NaCl, мM KCl, 8 мM 2 мM KH2PO4, NaH2PO4). Семенники переносили на предметное стекло в каплю PBS и аккуратно накрывали покровным стеклом.

Препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе Olympus BX-51.

Диссекцию яичников проводили в холодном PBS. Яичники инкубировали в растворе DAPI в PBS (1 мкг/мл) в течение 10 мин. Яичники переносили на предметное стекло, покрытое Poly-L-Lysine (Sigma, США) и анализировали препараты на конфокальном микроскопе Carl Zeiss LSM 710.

Проведение DamID По 200 пар семенников самцов генотипов y1,w67,hsp70stopdam comr/Y;

nanos-cre/+;

+/+ (генотип №1), y1,w67,hsp70stopdam/Y;

nanos-cre/+;

+/+ (генотип №2) и y1,w67,hsp70stopdam/Y;

+/+;

+/+ (генотип №3) были собраны в охлажденном буфере PBS. Сбор семенников осуществляли на третий день после вылета. Для проведения DamID использовали препараты ДНК, выделенные из семенников самцов перечисленных выше генотипов.

Опытный образец ДНК выделен из семенников самцов генотипа №1, в герминальных клетках которых экспрессировался химерный белок Dam Comr и метилирование ДНК происходило вблизи сайтов связывания исследуемого белка Comr. Образец №2 был выделен из семенников самцов генотипа №2, в которых экспрессировалась только Dam-метилаза и метилирование ДНК происходило неспецифично, данный образец использовался для контроля фонового метилирования. В организме самцов генотипа №3 не происходит наработка Dam-метилазы, поскольку сохранена стоп-кассета, разделяющая промотор и ген метилазы. Образец ДНК, выделенный из семенников таких самцов, использовался в качестве отрицательного контроля. Процедура подготовки образцов для DamID проводили по протоколу, описанному ранее (Greil et al., 2006). Геномная ДНК, выделенная из семенников, была гидролизована ферментом DpnI (NEB, США), который специфично расщепляет ДНК по метилированным сайтам GAmTC. На следующем этапе препараты гидролизованной ДНК были очищены при помощи спин-колонок (БиоСилика, Россия) и к концам фрагментов ДНК были лигированы двуцепочечные адапторы (Greil et al., 2006). Для повышения специфичности метода после лигирования образцы были обработаны эндонуклеазой рестрикции DpnII (NEB, США), которая специфически гидролизует неметилированные сайты GATC, в результате чего адапторы остаются лишь у тех фрагментов, которые содержали на обоих концах метилированные сайты GAmTC (Greil et al., 2006). Аликвоты полученных препаратов ДНК использовались в качестве матрицы для ПЦР с адаптор-специфичными праймерами. Амплификация наблюдалась только в образцах ДНК, выделенных из самцов, содержащих в геноме dam содержащие конструкции и конструкцию nanos-cre, и отсутствовала в контрольных образцах из семенников самцов генотипа №3 с невырезанной стоп-кассетой. Полученные образцы Dam-Comr и Dam были гибридизованы с микрочипами D. melanogaster Gene Expression 4x72K Arrays (Nimblegen, Roche) на базе университета г. Торонто (Canadian Drosophila Microarray Centre, http://www.flyarrays.com/). Эксперимент был повторен дважды на независимых биологических образцах.

Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения ArrayStar (http://www.dnastar.com). Была проведена коррекция фона, после чего данные были подвергнуты RMA-нормализации. Для всех точек был посчитан логарифм отношения интенсивностей сигнала в опытном и контрольном образце (Log2(Dam-Comr/Dam)). Результаты были отфильтрованы на воспроизводимость по описанному ранее методу (Yang et al., 2002). Отфильтрованные данные двух независимых воспроизведений эксперимента были усреднены и сопоставлены с геномными координатами.

Интенсивности сигналов от точек, расположенных внутри каждого гена, были усреднены.

Для определения и Comr-связанных, Comr-несвязанных промежуточных геномных областей мы использовали Скрытую Марковскую модель с тремя состояниями (Hidden Markow Model, HMM). Геном D.

melanogaster разбили на «окна» длиной 200 п.н., как было описано ранее (Kharchenko et al., 2011). Для определения исходных параметров HMM геном разделили на участки в 5 т.п.н., перекрывающиеся на 1 т.п.н., для каждого из которых посчитали усредненную интенсивность сигнала (Log2(Dam Comr/Dam)). Из общего числа, выбрали по 2,5% участков, демонстрирующих самую низкую интенсивность сигнала, самую высокую и среднюю по геному, которые были использованы для определения Comr-несвязанных, Comr-связанных и индифферентных районов. Для оптимизации параметров HMM и предсказания при помощи алгоритма Витерби использовали R (http://r-project.org) и библиотеку «mhsmm» (O'Connell, Hojsgaard, 2011).

Экспериментальные данные DamID доступны в базе данных GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номером GSE49799.

Анализ профилей экспрессии в семенниках самцов, мутантных по генам comr и can Для анализа профилей генной экспрессии использовали самцов трех cn,comrz2-1340,bw/cn,comrz2-1340,bw;

y-w-/Y;

генотипов: +/Y;

+/+, +/+;

can3,red,e/can3,red,e и +/Y;

+/+;

red,e/red,e] (дикий тип, контроль). По 400 пар семенников от самцов каждого из вышеперечисленных генотипов были собраны в охлажденном T-буфере (183mM KCl, 47mM NaCl, 10mM Tris, pH 6.8). Семенники были гомогенизированы в TRIzol (Invitrogen, США).

Пробоподготовка материала проводилась Dr. H. White-Cooper (Университет Кардиффа, Великобритания). Для дальнейшего выделения и обработки РНК и гибридизации кДНК образцы были отправлены в Glasgow Affymetrix microarray service (http://www.gla.ac.uk/faculties/fbls/functionalgenomicsfacility/). Для каждого генотипа было поставлено три независимых биологических повтора эксперимента. Полученные данные были нормализованы с использованием метода Affymetrix t100. Данные для каждого гена представлены в виде логарифма по основанию 2 от отношения интенсивности сигнала в образце семенников мутантов comr и can к интенсивности в образце семенников линии дикого типа (Log2(comr/wt), Log2(can/wt)). Экспериментальные данные доступны в базе данных GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номером GSE49563.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Для исследования механизма действия комплекса tMAC в регуляции активности генов в сперматоцитах была поставлена задача установить сайты связывания белка Comr, который входит в состав tMAC, методом DamID. Как упоминалось ранее (см. Обзор литературы), в методе DamID для экспрессии химерного белка, состоящего из исследуемого белка и Dam метилтрансферазы, используется базальная активность промотора гена hsp70, которая проявляется во всех клетках организма. Эта особенность является препятствием для картирования тканеспецифичных транскрипционных факторов методом DamID, поскольку химерный белок образуется во всех клетках организма, что может приводить к неконтролируемому искажению картины связывания и не позволить адекватно интерпретировать полученные результаты. Исследуемый транскрипционный фактор Comr in vivo экспрессируется только в клетках мужского зародышевого пути, поэтому необходимо было разработать систему, которая бы позволила проводить DamID только в клетках зародышевого пути. Поставленная задача была решена в два этапа: в ходе первого этапа была создана генетическая система, позволяющая ограничить экспрессию трансгенов популяцией клеток зародышевого пути и, таким образом, избежать неспецифического сигнала из других клеточных типов. В ходе второго этапа мы адаптировали полученную генетическую систему для проведения DamID, и в результате была разработана методика картирования семенник-специфичных транскрипционных факторов.

3.1 Генетическая система для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути Для создания необходимой системы была выбрана методика, в которой активация трансгена происходит за счет удаления специальной стоп-кассеты, блокирующей его транскрипцию (см. Обзор литературы). В геном дрозофилы были введены две генетические конструкции, одна из которых кодирует рекомбиназу Cre под контролем тканеспецифичного промотора, а другая содержит повсеместно активный промотор и целевой трансген, разделенные стоп-кассетой, которая представляет собой терминатор транскрипции, фланкированный сайтами узнавания фермента-рекомбиназы (Struhl, Basler, 1993;

Evans et al., 2009).

Для активации рекомбиназы Cre специфично в клетках зародышевого пути мы использовали регуляторные элементы гена nanos. Такой выбор обуславливается тем, что белок Nanos является специфичным маркером стволовых герминальных клеток в организме дрозофилы. Исключительная роль гена nanos в клетках зародышевого пути подтверждается тем, что во взрослых мухах мутация по нему вызывает только нарушения гаметогенеза и не затрагивает другие функции организма (Forbes, Lehmann, 1998;

Bhat, 1999;

Gilboa, Lehmann, 2004;

Wang, Lin, 2004). Полученная нами конструкция содержала ген рекомбиназы, фланкированный регуляторными областями гена nanos (Рис. 4А, Материалы и Методы). Ранее было показано, что использованные нами регуляторные области обеспечивают паттерн экспрессии трансгенов, неотличимый от нативного гена nanos (Gavis et al., 1996;

Forrest et al., 2004). Полученная конструкция nanos-cre была интегрирована в геном дрозофилы с использованием системы phiC31 опосредованной трансформации дрозофилы в сайт интеграции attP40, расположенный на второй хромосоме (Bischof et al., 2007;

Markstein et al., 2008).

Чтобы убедиться в том, что под контролем регуляторных областей nanos Cre-рекомбиназа нарабатывается и осуществляет удаление стоп кассеты только в клетках зародышевого пути, мы создали вторую, репортерную конструкцию. В ней был использован промотор гена Ubi-p63E (Evans et al., 2009), который активен во множестве органов и тканей, как взрослых мух, так и личинок дрозофилы, и поэтому широко используется для запуска экспрессии трансгенов в различных тканях организма дрозофилы Рисунок 4. Генетическая система для запуска эктопической экспрессии в клетках зародышевого пути.

А – генетические конструкции;

Б - конструкция nanos-cre позволяет запускать экспрессию рекомбиназы в клетках зародышевого пути, что приводит к удалению стоп-кассеты в составе генетической конструкции ubiprostopmCD8-GFP, после этого, под действием промотора Ubi-p63E запускается наработка репортерного белка mCD8-GFP. Вырезание стоп-кассеты происходит в стволовых клетках зародышевого пути, все клетки-потомки наследуют это изменение и также нарабатывают репортерный белок.

(Chintapalli et al., 2007;

Evans et al., 2009). Под контролем этого промотора был размещен ген репортерного белка mCD8-GFP (Lee, Luo, 1999, 2001).

Этот ген кодирует химерный белок, состоящий из флуоресцентного белка GFP и трансмембранного домена мышиного лейкоцитарного рецептора CD8, который позволяет экспонировать GFP на поверхности клеток. Для предотвращения повсеместной экспрессии репортерного белка промотор и последовательность mCD8-GFP были разделены стоп-кассетой, состоящей из терминатора транскрипции гена hsp70AB, фланкированного loxP сайтами узнавания Cre-рекомбиназы (Struhl, Basler, 1993) (Рис. 4А). Полученная конструкция UbiprostopmCD8-GFP была встроена в сайт интеграции attP40, таким же образом, как описано выше.

На следующем этапе проверки мы скрестили линии мух, несущие полученные генетические конструкции и проанализировали флуоресцентный сигнал GFP в семенниках и яичниках потомков (Рис. 4Б).

У потомков были выделены гонады, в которых детектировали флуоресценцию GFP. Анализ экспрессии репортерного белка в семенниках проводили при помощи флуоресцентного микроскопа. Свечение GFP и DAPI в яичниках детектировали при помощи конфокальной микроскопии.

Результаты приведены на Рис. 5 и 6.

В семенниках дрозофилы присутствует соматические клетки и клетки зародышевого пути. Соматические клетки представлены несколькими популяциями: оболочка семенника (мышечные и пигментные клетки), клетки хаба, стволовые соматические клетки гонад и их потомки – цистные клетки.

Цистные клетки формируют оболочку вокруг синцития развивающихся клеток зародышевого пути, такая оболочка сохраняется на протяжении всего сперматогенеза вплоть до стадии обособления зрелых сперматозоидов.

Клетки зародышевого пути представлены клетками, находящимися на разных стадиях развития, начиная от стволовых клеток и заканчивая зрелыми Рисунок 5. Специфическое мечение клеток зародышевого пути в семенниках D.

melanogaster.

A – в семенниках самцов генотипа y1w67/Y;

UbiprostopmCD8-GFP/nanos-cre;

+/+ нарабатывался исключительно в клетках зародышевого пути, стрелкой отмечена область семенника, содержащая сперматогонии;

Б – в семенниках самцов y1w67/Y;

UbiprostopmCD8-GFP/ UbiprostopmCD8-GFP;

+/+ сохранялась стоп-кассета и поэтому наработка репортерного белка не происходила;

В – Для наглядности приведена микроскопическая фотография семенника y1w67/Y;

UbiprostopmCD8-GFP/+;

dsx-cre/+.

В данном случае ген рекомбиназы запускался промотором гена dsx, который экспрессируется в соматических клетках (более подробно описано в (Лактионов и др., 2013)). Репортерный белок экспрессировался клетками оболочки и цистными клетками.

На A и B штрихованной линией ограничена циста, содержащая сперматоциты.

y1w67/Y;

сперматозоидами. В семенниках самцов генотипа UbiprostopmCD8-GFP/nanos-cre;

+/+ репортерный белок нарабатывался исключительно в клетках зародышевого пути (Рис. 5А). Флуоресцентный сигнал GFP обнаруживался на стадии сперматогониев (Рис. 5А, отмечены стрелкой) и достигал максимума на стадии первичных сперматоцитов. На рисунке отчетливо видны отдельные цисты, содержащие по сперматоцитов, экспрессирующих mCD8-GFP (Рис. 5А, пунктирная линия).

На последующих стадиях флуоресцентный сигнал сохранялся, но становился менее интенсивным, по всей вероятности, это объясняется разбавлением флуоресцентного сигнала в ходе усиленного роста клеток на стадии удлиняющихся сперматид. Таким образом, в семенниках самцов y1w67/Y;

UbiprostopmCD8-GFP/nanos-cre;

+/+ репортерный белок нарабатывался исключительно в клетках зародышевого пути, а клетки оболочки семенника, цистные клетки и клетки хаба не экспрессировали флуоресцентный белок.

Для наглядности мы провели контрольный эксперимент, в котором при помощи такого же подхода были специфически помечены соматические клетки семенников дрозофилы (Рис. 5В). В нашем распоряжении имелась линия мух, которые несут генетическую конструкцию, содержащую ген рекомбиназы под контролем регуляторных элементов гена dsx, который активен только в некоторых популяциях соматических клеток дрозофилы (линия предоставлена Максимовым Д. А., ИМКБ СО РАН, Новосибирск) (Camara et al., 2008;

Лактионов и др., 2013). В гонадах самцов генотипа y1w67/Y;

репортерный белок UbiprostopmCD8-GFP/+;

dsx-cre/+ нарабатывался только в соматических клетках, среди которых были клетки хаба (Рис. 5В, отмечены стрелкой), цистные клетки (Рис. 5В, пунктирная линия) и клетки оболочки семенника (Рис. 5В). На Рис. 5А и 5В отчетливо видно, что конструкция позволяет запускать экспрессию nanos-cre репортерного гена только в клетках мужского зародышевого пути, а конструкция dsx-cre – исключительно в соматических клетках мужских y1w67/Y;

гонад. В семенниках самцов UbiprostopmCD8-GFP/ UbiprostopmCD8-GFP;

+/+, у которых между промотором и репортерным геном присутствует стоп-кассета, маркерный белок не активировался (Рис.

5Б).

В яичниках дрозофилы соматические клетки образуют оболочку органа, отдельная популяция соматических клеток контролирует процесс развития стволовых клеток зародышевого пути. Из соматических стволовых клеток-предшественников развиваются клетки-спутники и фолликулярные клетки, окружающие клетки зародышевого пути. В результате деления стволовой клетки зародышевого пути воспроизводится стволовая клетка и образуется цистобласт. Цистобласт претерпевает четыре раунда митотических делений, в результате которых образуется 16 цистоцитов, связанных между собой цитоплазматическими мостиками (Hempel et al., 2008). Один из цистоцитов развивается в ооцит, а остальные – в питающие клетки. В конечном итоге питающие клетки дегенерируют и образуется готовое к оплодотворению яйцо.

У самок генотипа y1w67/y1w67;

UbiprostopmCD8-GFP/nanos-cre;

+/+ репортерный ген активировался в клетках зародышевого пути (Рис. 6А).

Флуоресцентную метку содержали все клетки зародышевого пути – питающие клетки и ооциты (Рис. 6А, стрелка). При этом на более поздних стадиях происходило накопление репортерного белка в ооците. Связано это с усилением экспрессии с промотора Ubi-p63E или с активным транспортом белка из питающих клеток пока неясно. В фолликулярных клетках репортерный ген не активировался (Рис 6А). Аналогично экспериментам на семенниках, в качестве отрицательного контроля использовали яичники самок генотипа y1w67/y1w67;

UbiprostopmCD8-GFP/ UbiprostopmCD8 GFP;

+/+. У таких самок не удаляли стоп-кассету, поэтому активация репортерного гена не происходила (Рис. 6Б).

В результате выполнения этого этапа работы мы установили, что конструкция nanos-cre в качестве источника рекомбиназы позволяет Рисунок 6. Специфическое мечение клеток зародышевого пути в яичниках D. melanogaster.

A – В яичниках самки генотипа y1w67/y1w67;

UbiprostopmCD8-GFP/nanos-cre;

+/+ клетки зародышевого пути экспрессировали репортерный белок;

Б – в яичниках самок линии y1w67/y1w67;

UbiprostopmCD8-GFP/ UbiprostopmCD8-GFP;

+/+ активация репортерного белка не происходила. Ядра окрашены DAPI, стрелками указаны ооциты.

вырезать стоп-кассету и активировать трансгены исключительно в клетках зародышевого пути.

3.2 Генетическая система для проведения DamID в клетках зародышевого пути D.melanogaster На следующем этапе работы необходимо было разработать метод проведения DamID исключительно в клетках мужского зародышевого пути.

Для этого мы модифицировали разработанную генетическую систему, которая описана в предыдущем разделе.

В разработанной нами методике для проведения тканеспецифичного DamID (Рис. 7) в геном дрозофилы вводились две генетические конструкции, одна из которых – описанная выше конструкция nanos-cre для наработки Cre рекомбиназы в клетках зародышевого пути. Вторая конструкция содержала минимальный промотор гена hsp70, стоп-кассету и последовательность, кодирующую либо химерный белок Dam-Comr (hsp70stopdam-comr), либо отдельно (Рис 7А, Материалы и Методы).

Dam (hsp70stopdam) Конструкция hsp70stopdam была использована в экспериментах для контроля фонового метилирования. Конструкция hsp70stopdam-comr была использована для картирования сайтов связывания белка Comr. Кодирующая последовательность comr содержит один экзон, и ранее было показано, что такая последовательность достаточна для спасения мутации comr (Jiang, White-Cooper, 2003).

Для проведения DamID скрещивали линии мух, несущих конструкцию nanos-cre и конструкции для DamID (см. Материалы и методы):

У потомков от скрещиваний избирательно в клетках зародышевого пути происходило удаление терминатора, и запускалась наработка малых количеств химерного белка (либо Dam-метилазы) за счет базальной активности промотора hsp70. В результате метилирование ДНК происходило только в клетках зародышевого пути (Рис. 7Б).

Рисунок 7. Генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID.

А – использованные конструкции;

Б - конструкция nanos-cre позволяет запускать экспрессию рекомбиназы в клетках зародышевого пути, что приводит к удалению стоп кассеты в составе генетической конструкции hsp70stopdam-comr, после этого запускается наработка химерного белка Dam-Comr. Белок Dam-Comr направляется к сайтам связывания, а Dam-метилаза модифицирует GATC в окрестностях таких сайтов.

Для установления сайтов связывания белка Comr процессировались три образца: первый их них – препарат ДНК, выделенный из семенников самцов y1,w67,hsp70stopdam-comr/Y;

генотипа в которых nanos-cre/+;

+/+, экспрессировался химерный белок Dam-Comr. Второй образец, геномная ДНК, выделенная из семенников самцов y1,w67,hsp70stopdam/Y;

nanos cre/+;

+/+, в которых нарабатывалась Dam-метилаза – использовался как контроль фонового метилирования. И третий образец – отрицательный контроль, в качестве которого использовалась геномная ДНК, выделенная из семенников самцов линии y1,w67,hsp70stopdam/Y;

+/+;

+/+, в которых не удалена стоп-кассета и, следовательно, Dam-метилаза не активна. Процедура DamID выполнялась согласно протоколу, описанному в разделе «Материалы и методы».

В результате проведения DamID нами были получены данные о связывании транскрипционным фактором Comr для 11161 из аннотированных в базе данных генов Flybase D. melanogaster (http://flybase.org).

3.3 Связывание Comr с генами в семенниках у D. melanogaster Критерием для оценки связывания или отсутствия связывания белка Comr c тем или иным геном являлось то, во сколько раз интенсивность сигнала в соответствующей этому гену точке микрочипа в экспериментальном образце (Dam-Comr) отличалась от интенсивности в контрольном образце (Dam). Интенсивность сигнала для каждого гена в экспериментальном образце, отнесенная к такому же значению в контрольном образце, отражает относительную представленность метилированных ДНК-фрагментов и позволяет определить, связывался ли исследуемый белок с ДНК в области этого гена. Для удобства изложения в дальнейшем будут использоваться термины «Comr-связанные» и «Comr несвязанные» гены. «Comr-связанными» будут называться гены, для которых интенсивность сигнала в экспериментальном образце превышала контрольное значение в два и более раз (Log2(Dam-Comr/Dam)1), а «Comr не связанными» - для которых интенсивность сигнала в экспериментальном образце более чем в два раза меньше контрольного значения (Log2(Dam Comr/Dam)-1). Также мы будем использовать такие понятия, как «семенник-специфичные» и «специфичные для яичников» гены. Называя гены специфичными, мы подразумеваем, что профиль их экспрессии ограничен одним органом или тканью во взрослом организме дрозофилы.

Список семенник-специфичных генов был опубликован ранее и содержит 1653 гена, данные по связыванию Comr были получены для 1198 из них (Belyakin et al., 2010). В этой же работе был опубликован список специфичных для яичников генов, состоящий из 907 генов (для 760 получены данные по связыванию Comr) (Belyakin et al., 2010).

В результате проведенного картирования было обнаружено, что Comr связанными (Log2(Dam-Comr/Dam)1) являются 3209 генов. Эта выборка была значительно обогащена семенник-специфичными генами, а именно содержала 596 генов, что приблизительно в два раза выше, чем случайно ожидаемое значение (2, P=3.9E-19). В то же время, представленность специфичных для яичников генов в выборке Comr-связанных генов была более чем в два раза снижена по сравнению со случайно ожидаемым числом (75 генов, 2, P=2.5E-18). В группе генов, которые еще более интенсивно связывались транскрипицонным фактором Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)2)), процентное содержание семенник-специфичных генов было немного выше (225 из 1029), а специфичных для яичников – еще ниже (15 из 1029).

Группа Comr-не связанных генов (Log2(Dam-Comr/Dam)-1) состояла из 2431 гена, среди которых содержалось 143 семенник-специфичных гена, что приблизительно в два раза меньше случайно ожидаемого количества (2, P= 1.0E-15). Вместе с тем, эта выборка была значительно обогащена генами, специфичными для яичников - 325 генов, в 2 раза больше случайного ожидаемой величины (2, P=2.8E-25). При применении более строго критерия отсутствия связывания Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)-2), было обнаружено 698 Comr-не связанных генов, среди которых содержалось 39 генов, специфичных для семенников и 103 гена, экспрессирующихся специфично в яичниках.

На данный момент для белков, кодируемых генами aly-класса, нет экспериментальных данных о прямых генах-мишенях. Однако для нескольких генов ранее было показано, что уровень их экспрессии значительно снижается в семенниках самцов, несущих мутации по генам aly класса (White-Cooper et al., 1998). Такие гены (Mst87F, fzo, dj, janB, Mst98C, Mst84D, gonadal) необходимы для протекания спермиогенеза у дрозофилы, и также инактивируются при мутациях по генам can-класса. Мы решили проверить, связывается ли Comr, как часть tMAC, с этими генами. Для генов dj и gonadal экспериментальные данные отсутствовали. Все остальные гены являлись Comr-связанными, и интенсивность сигнала в опытном образце более чем в два раза превышала контрольное значение (Log2(Dam Comr/Dam)1)).

Согласно полученным данным, транскрипционный фактор Comr связывался с большим числом генов, среди которых содержалось множество семенник-специфичных генов, а специфичные для яичников гены были крайне малочисленны. Среди генов, с которыми Comr не связывается, наблюдалась обратная картина – обогащение по специфичным для яичников генам и дефицит семенник-специфичных. На следующем этапе исследования мы решили проанализировать, каким образом связывание Comr влияет на экспрессию генов в семенниках у дрозофилы.

3.4 Влияние белка Comr на экспрессию генов Как упоминалось ранее, в семенниках мух, мутантных по генам aly класса, около тысячи генов значительно снижают уровень экспрессии, а сперматогенез останавливается на стадии первичных сперматоцитов (Jiang, White-Cooper, 2003;

White-Cooper, 2010). Таким образом, мутация по comr может нарушить экспрессию большей части семенник-специфичных генов, которых на данный момент насчитывается около полутора тысяч. Мутация по гену comr индуцирована EMS-мутагенезом, мутированная линия мух носит название comrz2-1340 (Wakimoto, 2000;

Jiang, White-Cooper, 2003).

Профиль экспрессии генов в семенниках линии comrz2-1340 получен с использованием микрочипов Affymetrix в лаборатории Dr. H. White-Cooper (Drosophila Genome 1.0 array;

http://affymetrix.com).

Чтобы выявить гены, экспрессия которых зависит от наличия функционального белка Comr, был проведен анализ представленности транскриптов в семенниках мутантов comr по сравнению с семенниками контрольной линии. В результате этого анализа была охарактеризована экспрессия 12414 генов. Из них 2706 генов снижали экспрессию у мутантов более чем в 2 раза, а 978 генов – более чем в 8 раз. Чтобы оценить, на какие гены оказывает влияние мутация comr, был использован упомянутый выше список семенник-специфичных генов. В качестве контрольной группы использовали гены, специфически активные в яичниках. На Рисунке 8А показаны распределения для этих двух категорий генов в зависимости от их экспрессии у мутантов comr. Третье распределение относится к генам, не попадающим ни в одну из этих категорий. Видно, что гены, активные только в яичниках, распределены практически симметрично относительно значения Однако распределение семенник-специфичных генов Log2(comr/wt)=0.

сильно сдвинуто в сторону отрицательных значений Log2(comr/wt), что Рисунок 8. Влияние мутации comr на экспрессию генов в семенниках D. melanogaster.

А – мутация comr снижает экспрессию семенник-специфичных генов (показаны черным).

Для сравнения показаны гены, специфически активируемые в яичниках и гены (показаны белым), и остальные гены D. melanogaster. Б – доля семенник-специфичных генов увеличивается среди генов, снижающих экспрессию у мутантов comr. Гены, специфически активные в яичниках, демонстрируют обратную тенденцию.

свидетельствует об уменьшении их экспрессии у мутантов comr. На Рисунке 8Б видно, что доля семенник-специфичных генов возрастает со снижением экспрессии у мутантов comr, в то время как доля генов, экспрессирующихся в яичниках, быстро падает. Таким образом, мутация по гену comr приводит к снижению уровня экспрессии множества генов, причем доля семенник специфичных генов возрастает в группе, проявляющей более сильное снижение экспрессии.

Для того чтобы определить, является ли Comr прямым активатором генов в сперматоцитах D. melanogaster, или осуществляется иной механизм, мы сопоставили полученные данные по экспрессии с результатами DamID белка Comr. При этом мы сосредоточились на генах, которые существенно снижают экспрессию у мутантов comr и проанализировали их связывание с Comr согласно полученным данным DamID. Среди 978 генов, снижающих уровень экспрессии более чем в 8 раз (см. выше) данные DamID о связывании с белком Comr имелись для 881 генов, из которых 700 оказались семенник-специфичными. Из этих 881 гена только 375 (42,5%) демонстрировали повышенный уровень связывания транскрипционным фактором Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)1), причем 306 из них оказались семенник-специфичными.

С одной стороны, это говорит о том, что 375 генов проявляют связывание с белком Comr, присутствие которого необходимо для их активации, из чего можно сделать вывод, что он является их прямым активатором. С другой стороны, полученные нами результаты говорят о том, что далеко не все семенник-специфичные гены, экспрессия которых падает у мутантов comr, проявляют связывание с белком Comr. Это указывает на наличие вторичных регуляторов, экспрессия которых, в свою очередь, зависит от Comr. Следует отметить, что гены boule, twine и CycB, которые по разному реагируют на мутации в генах aly и can классов (White-Cooper et al., 1998), вели себя по-разному в отношении связывания Comr. Из трех генов только boule оказался связан с Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)=1,504), с двумя другими Comr не связывался (Log2(Dam-Comr/Dam)=-1,312 и -0,619, соответственно). То есть по нашим данным ген boule является геном мишенью Comr, а twine и CycB должны контролироваться вторичными регуляторами.

Идентификация вторичных Comr-зависимых регуляторов 3. транскрипции Около 6% от всего числа генов D. melanogaster не связывались транскрипционным фактором Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)0), но демонстрировали пониженный уровень экспрессии в семенниках comr мутантов (Log2(comr/wt)-1). Среди семенник-специфичных генов их доля составляла уже около 19%. Эти гены зависят от действия Comr, но не являются его прямыми мишенями. Регуляция таких генов может осуществляться вторичными посредниками, то есть семенник-специфичными транскрипционными факторами, которые сами регулируются белком Comr. В первую очередь мы обратили внимание на гены задержки мейоза. Оказалось, что уровень их экспрессии не снижается в семенниках мутантов comr по сравнению с семенниками самцов дикого типа, так что, по-видимому, не они играют роль вторичных регуляторов в активации Comr-зависимых генов.

Поиск генов, кодирующих семенник-специфичные транскрипционные факторы, был проведен с использованием ресурса GoMiner (Zeeberg et al., 2003). Среди 1653 семенник-специфичных генов было обнаружено 26 генов, имеющих отношение к регуляции транскрипции, включая гены aly и can классов. Сопоставление данных об экспрессии этих генов у мутантов comr и о связывании с ними белка Comr выявило, что ген CG9879 проявил самый высокий уровень связывания в экспериментах DamID, а уровень его экспрессии был снижен в 64 раза в семенниках самцов, несущих мутацию гена comr (Табл. 1). Ген CG9879 не исследован, но согласно аннотации в базе данных FlyBase (www.flybase.org), кодируемый им белок имеет гомологию с Таблица 1. Список генов, кодирующих предполагаемые семенник-специфичные транскрипционные факторы у D. melanogaster Название CG Log2(Dam-Comr/Dam) Log2(comr/wt) CG9879 CG9879 2.08 -6. invected CG17835 -4. Ets96B CG6892 0.24 -3. CG17118 CG17118 -0.78 -2. apontic CG5393 -0.28 0. fushi tarazu CG2047 1.50 -1. gooseberry-neuro CG2692 2.90 -1. doublesex-Mab related 93B CG5737 -2.03 -0. lame duck CG4677 1.15 -0. CG33557 CG33557 1.75 0. cookie monster CG13493 1.11 0. CG8117 CG8117 1.99 1. sisterless A CG1641 1.07 1. skpE CG11942 -1.33 1. CG15262 CG15262 -2.50 2. cannonball CG6577 1.47 2. TfIIA-S-2 CG11639 -0.44 2. vismay CG8821 1. no hitter CG CG15398 CG always early CG2075 -1.49 2. spermatocyte arrest CG11308 -0.06 2. meiosis I arrest CG10390 -2.76 3. tombola CG14016 -0. matotopetli CG8484 -0.48 2. ryan express CG15632 0.83 1. ТАТА-связывающим белком (TATA-binding protein, TBP). Эти данные указывают на то, что ген CG9879 может являться вторичным регулятором в генетическом каскаде, приводящем к массовой активации генов в сперматоцитах.

3.6 Связывание Comr не всегда приводит к изменению экспрессии генов Среди генов, проявляющих повышенное связывание с белком Comr, помимо семенник-специфичных генов были обнаружены гены, специфически активные в яичниках, но не в семенниках. Это может означать, что связывание белка Comr не обязательно приводит к активации генов. Для исследования этого вопроса мы проанализировали выборку генов, значительно обогащенных по связыванию с белком Comr (Log2(Dam Comr/Dam)2). Для 749 из 1029 таких генов имелись экспериментальные данные об экспрессии в семенниках самцов comrz2-1340. Из этих генов только у 320 (43%) генов наблюдалось более чем двукратное снижение уровня экспрессии на фоне мутации по comr (Рис. 9). В составе этой группы генов было обнаружено 152 семенник-специфичного гена и 1 ген, специфичный для яичников.

Интересно отметить, что уровень экспрессии части Comr-связанных генов (82 из 749, 11%) возрастал более чем в два раза в семенниках самцов, мутантных по comr. Многие из этих генов практически не активны в семенниках и имеют очень низкий уровень экспрессии, поэтому наблюдаемый эффект может быть следствием флуктуации данных. Вместе с тем, некоторые гены обладают достаточно высоким уровнем экспрессии в семенниках дикого типа и еще более активны в семенниках мутантных самцов. По всей вероятности, нельзя исключать возможности, что Comr может участвовать в подавлении активности таких генов.

Рисунок 9. Уровень экспрессии Comr-связанных и Comr-не связанных генов на фоне мутации по comr.

Уровень экспрессии 43% Comr-связанных генов ((Log2(Dam-Comr/Dam)2), оранжевые столбики) снижался на фоне мутации, а около половины Comr-связанных генов не изменяли уровень экспрессии на фоне мутации comr. Уровень экспрессии Comr-не связанных генов повышался на фоне мутации по comr, что может являться следствием изменения клеточного состава в семенниках самцов, мутантных по comr.

На Рис. 9 видно, что значительная часть Comr-связанных генов располагается вблизи Log2(comr/wt)=0. Действительно, около половины Comr-связанных генов не изменяли уровень экспрессии на фоне мутации по comr. Из этого следует, что приблизительно в половине случаев связывание Comr не влияет на активность генов.

Гены, с которыми Comr не связывался (Log2(Dam-Comr/Dam)-2), имели тенденцию к увеличению уровня экспрессии в семенниках самцов comrz2-1340 в сравнении с диким типом. На Рис. 9, видно, что распределение таких генов смещено в сторону положительных значений. Для 572 из Comr-не связанных генов имелись экспериментальные данные по экспрессии в семенниках самцов comrz2-1340. Уровень экспрессии 303 (53%) генов из этой группы повышался в два и более раз в семенниках мутантных самцов. Такой эффект может являться результатом накопления сперматоцитов в семенниках самцов, несущих мутацию по comr (Jiang, White-Cooper, 2003), что способно привести к накоплению транскриптов не регулируемых белком Comr генов, активных в сперматоцитах.

В ходе изучения влияния связывания Comr на экспрессию генов мы убедились в его активирующей роли, однако обнаружилось, что около половины Comr-связанных генов не регулируются им. Поэтому мы приступили к более подробному изучению состава выборки Comr-связанных генов.

3.7 Тканеспецифичная принадлежность Comr-связанных и Comr-не связанных генов Выборка генов (Log2(Dam-Comr/Dam)2) была Comr-связанных обогащена семенник-специфичными генами, которые значительно снижали уровень экспрессии в семенниках самцов comrz2-1340. Вместе с тем, около половины Comr-связанных генов практически не изменяли уровень экспрессии на фоне мутации. Для исследования состава выборок Comr связанных и Comr-не связанных генов мы провели анализ их экспрессии при помощи базы данных FlyAtlas, которая содержит профили экспрессии всех генов D. melanogaster в различных органах (Chintapalli et al., 2007).. Группа Comr-связанных (Log2(Dam-Comr/Dam)2)) состояла из 1029 генов, а Comr не связанных – из 698 генов (Log2(Dam-Comr/Dam)-2)). К профилям экспрессии этих генов мы применили метод кластеризации k-means clustering (Eisen et al., 1998) и выделили подгруппы генов, обладающих схожими профилями экспрессии. Среди Comr-связанных генов было выделено три таких подгруппы (Рис. 10А). Подгруппа III состояла из 323 семенник специфичных генов, уровень их экспрессии снижался в семенниках самцов comrz2-1340 по сравнению с семенниками дикого типа (Рис. 10Б). Подгруппа I содержала специфичные для нервной ткани гены, представленность транскриптов этих генов практически не отличалась в семенниках дикого типа и на фоне мутации comr (Рис. 10А,Б). Не изменялся уровень экспрессии и у генов подгруппы II, представители которой неактивны в семенниках и не имеют четко выраженной специфичной экспрессии в других органах (Рис.

10А,Б).

В составе выборки Comr-несвязанных генов (Log2(Dam-Comr/Dam) 2)) было обнаружено четыре подгруппы генов (IV-VII, Рис. 10А). Подгруппа IV была аналогична подгруппе II Comr-связанных генов. Подгруппа V состояла из семенник-специфичных генов. Гены подгруппы VI активируются в нервной ткани. Подгруппа VII состояла из генов, специфичных для яичников. Уровень транскрипции генов подгруппы V снижался в семенниках самцов, мутантных по гену comr. По всей вероятности гены, входящие в состав этой подгруппы, регулируются Comr-зависимыми вторичными регуляторами транскрипции. Уровень экспрессии генов остальных подгрупп несколько повышался в семенниках мутантных по comr самцов, что может быть связано с изменением клеточного состава в мутантных семенниках (Рис. 10Б).

В результате мы установили, что Comr-связанные гены обладают различными профилями экспрессии. И по характеру их активности в различных органах можно выделить две относительно гомогенные группы, одна из которых состоит из семенник-специфичных генов (III), а другая – из генов, экспрессирующихся в нервной ткани (I). Причем гены только группы III регулируются белком Comr. Мы задались вопросом, какие общие свойства могут быть причиной связывания Comr с генами, имеющими настолько различающиеся паттерны экспрессии? Ранее было показано, что в клетках слюнных желез личинок, которые являются соматическими, семенник спецфичные гены у D. melanogaster зачастую содержатся в составе доменов транскрипционно неактивного хроматина, ассоциированных с белком SUUR (Belyakin et al., 2005). Сопоставление данных о связывании генов с белком Comr в семенниках с данными о связывании белка SUUR в слюнных железах выявило существенную положительную корреляцию (Максимов и др., 2013), Это свидетельствует о том, что гены, проявляющие в семенниках связывание с Comr, в слюнных железах имеют тенденцию располагаться в репрессированных доменах хроматина, что может иметь отношение к их регуляции в развитии.

3.8 Гены-мишени обогащены маркерами неактивного Comr хроматина в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути Белок впервые обнаруживается на стадии первичных Comr сперматоцитов (Jiang, White-Cooper, 2003), в которых он необходим для активации нескольких сотен семенник-специфичных генов. На предыдущей стадии сперматогониев эти гены неактивны, причем в подавлении их экспрессии участвует белок Polycomb (Chen et al., 2005;

Gan et al., 2010;

Chen et al., 2011).

Рисунок 10. Транскрипционные и эпигенетические особенности Comr-связанных и Comr-несвязанных генов. А – k-means кластеризация данных об экспрессии генов в различных тканях позволила выявить три основные подгруппы Comr-связанных генов (Log2(Dam-Comr/Dam)2, I-III) и четыре – среди Comr-не связанных (Log2(Dam Comr/Dam)-2, IV-VII);

Б – влияние мутации comr на экспрессию генов в подгруппах I VII;

В,Г – Уровни обогащения промоторных областей генов подгрупп I-VII модифицированными гистонами.

В работе Gan et al. [2010] методом ChIP-seq были установлены профили распределения гистоновых модификаций H3K27мет3 и H3K4мет3 в хроматине семенников самцов, мутантных по гену bam. Мутация по гену bam блокирует переход от стадии сперматогониев к сперматоцитам (Gonczy et al., 1997). Это приводит к тому, что семенники заполняются цистами сперматогониев и не содержат клеток, находящихся на последующих стадиях развития. Поэтому семенники самцов могут быть bam-мутантных использованы в качестве модели для изучения структуры хроматина в недифференцированных мужских клетках зародышевого пути.


Мы воспользовались данными (Gan et al., 2010), чтобы проверить, не является ли состояние хроматина объединяющим свойством для генов мишеней белка Comr. Для этого были просуммированы интенсивности сигналов ChIP-seq для H3K27мет3 и H3K4мет3 в области ±200 п.н. вокруг сайтов инициации транскрипции для каждого гена генов D. melanogaster.

Триметилирование гистона H3 по остатку лизина 27 (H3K27мет3) наблюдается в транскрипционно неактивных районах хроматина, обогащенных белками группы Polycomb. Напротив, метилирование гистона H3 по остатку лизина 4 (H3K4мет3) характерно для генов, проявляющих повышенный уровень транскрипции и повышенное содержание белков группы Trithorax.

Уровни обогащения промоторных областей Comr-связанных и Comr-не связанных генов модифицированными гистонами приведены на Рис. 10В,Г.

На этом рисунке видно, что по сравнению с Comr-не связанными генами, промоторные области всех Comr-связанных обогащены меткой неактивного хроматина H3K27мет3. Кроме того, уровни маркера активного хроматина H3K4мет3, были значительно ниже в группе Comr-связанных генов, чем в группе Comr-не связанных. Причем эти наблюдения справедливы для всех подгрупп Comr-связанных и Comr-несвязанных генов (см. раздел 3.7).

Таким образом, в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути промоторные области Comr-связанных генов обогащены репрессивной гистоновой меткой. Это свойство наблюдается у всех Comr связанных генов, вне зависимости от того, экспрессируются ли они в семенниках или нет, и может свидетельствовать о том, что связывание Comr определяется состоянием хроматина.

3.9 Транскрипционный фактор Comr связывается с протяженными участками хромосом у D. melanogaster Ранее было показано, что репрессированный хроматин в геноме дрозофилы занимает протяженные области хромосом, зачастую достигающие нескольких сотен т.п.н. (Filion et al., 2010;

Sher et al., 2012). Поскольку наш анализ показал обогащение генов гистоновой Comr-связанных модификацией, характерной для репрессированных участков генома, мы решили проверить, не располагаются ли эти гены группами в геноме.

Визуальный анализ полногеномного профиля связывания белка Comr при помощи программного обеспечения UCSC genome browser (Kent et al., 2002) действительно выявил на хромосомах протяженные участки повышенного связывания с белком Comr. Для объективного определения Comr-связанных, связанных и промежуточных геномных областей мы Comr-не проанализировали наши данные с использованием Скрытой Марковской модели (Hidden Markow Model, HMM) (Рис. 11А). В результате мы обнаружили 725 геномных областей, обогащенных белком Comr, и областей, с которыми Comr не связывался. Остальные геномные области принадлежали к промежуточному классу. Размеры Comr-связанных и Comr не связанных областей значительно отличались: размеры 70% Comr связанных областей превышали 20 т.п.н., а 30% - 100 т.п.н. Что касается Comr-не связанных областей, то их размеры были ниже - протяженность только 26% из них превышала 20 т.п.н., и ни одна не достигала 100 т.п.н.

Рисунок 11. Транскрипционный фактор Comr связывается с протяженными участками хромосом.

А – При помощи метода СММ были выявлены протяженные Comr-связанные области.

Фрагмент второй хромосомы, визуализированный в UCSC Genome browser. Comr связанные области, обнаруженный СММ отмечены желтым. Comr-несвязанные области выделены голубым цветом.

Б – Уровень обогащения модифицированными гистонами промоторных областей генов из состава 350 областей, не содержащих семенник-специфичных генов. Для сравнения приведено обогащение модифицированными гистонами промоторных областей всех генов D. melanogaster.

Области связывания Comr содержали 3036 генов, причем лишь 693 из них были семенник-специфичными. Кроме того, 350 областей связывания Comr не содержали семенник-специфичных генов. Протяженность 192 таких областей превышала 20 т.п.н., а 37 из них – 100 т.п.н. В составе этих областей связывания Comr, располагались 638 генов, причем лишь 124 из них снижали уровень экспрессии в два и более раз на фоне мутации по comr, то есть многие такие области вообще не содержали генов, регулируемых Comr.

Тем не менее, мы обнаружили, что промоторные области генов, расположенных в этих 350 районах, были обогащены репрессивной гистоновой меткой H3K27мет3 и обеднены меткой H3K4мет3 (Рис. 11Б). Это означает, что присутствие Comr в этих районах не связано с регуляцией заключенных в них генов, и можно предположить, что именно состояние хроматина определяет связывание с ними белка Comr.

Полученные данные свидетельствуют о том, что Comr-связанные гены склонны располагаться группами в геноме и их промоторные области обогащены репрессивной гистоновой меткой H3K27мет3. Это может означать, что Comr, как часть tMAC-комплекса, участвует в процессах перестройки хроматина, причем связывание Comr определяется состоянием хроматина, а именно наличием репрессивной метки H3K27мет3.

Активация генов в семенниках 3.10 D. melanogaster транскрипционными факторами tMAC и tTAF комплексов Важно отметить, что в отсутствие tTAF действия только белков комплекса tMAC не достаточно для активации генов в сперматоцитах дрозофилы (Chen et al., 2005;

Chen et al., 2011). Согласно существующим данным, регуляторное влияние белков tTAF и tMAC в конечном итоге направлено на пересекающиеся группы генов, однако до сих пор остается не изученным вопрос о возможной совместной регуляции генов белками tTAF и tMAC. Для исследования механизма совместной регуляции генов-мишеней белками, кодируемыми генами aly (tMAC) и can-классов (tTAF), мы сопоставили данные по экспрессии генов в семенниках самцов, мутантных по генам can и comr. Мутация по гену can (can3) вызывала нарушения в транскрипции значительно меньшего числа генов, чем было обнаружено в семенниках comr-мутантов. Так, лишь 309 генов снижали уровень экспрессии в 8 и более раз. Среди них, 277 (90%) также снижали уровень экспрессии в и более раз и в семенниках comr-мутантов. Из 779 генов, снижающих экспрессию в 4 и более раз в семенниках can-мутантов, 702 гена (88%) экспрессировались на таком же или более низком уровне в семенниках comrz2-1340 самцов. Это означает, что активность большинства can-зависимых генов также зависит и от comr. Как уже было упомянуто, белок Comr напрямую связывался приблизительно c 40% генов, снижающих экспрессию в 8 и более раз в семенниках самцов comrz2-1340. Среди 277 генов, снижающих экспрессию не менее чем в 8 раз в семенниках, как самцов can3, так и comrz2, c белком Comr были связаны только 112 генов, что также составляет 40%. Оставшиеся 60% генов в этой группе, по-видимому, регулируются при участии вторичных Comr-зависимых регуляторов, к которым может принадлежать CG9879. Необходимо отметить, что активность гена CG снижается в 8 раз в семенниках самцов, несущих мутацию по can, то есть его активность регулируется как tMAC, так и tTAF.

Заключение В ходе проведенных исследований мы обнаружили несколько принципиальных моментов, касающихся механизма регуляции генов белками tMAC и tTAF в семенниках у дрозофилы. Установлено, что семенник-специфичный транскрипционный фактор Comr является прямым активатором экспрессии, а также необходим для запуска вторичного активационного генетического каскада в сперматоцитах. Обнаружены новые свидетельства в пользу того, что Comr, в составе tMAC-комплекса участвует в процессах перестройки репрессированного хроматина, обогащенного меткой H3K27мет3. Показано, что совместное действие белков Comr и Can направлено только на часть генов, экспрессия которых нарушается у мутантов aly и can классов. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизмах активации генов в семенниках D.

melanogaster и позволяют выдвинуть гипотезу о роли белков tTAF и tMAC в этом процессе.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ Целью нашей работы являлось исследование роли белков Comr и Can в генетическом каскаде активации генов в сперматоцитах. Для понимания роли отдельного транскрипционного фактора в генетической регуляторной сети необходимо обладать тремя типами данных. Во-первых, требуется определить, когда и где он работает в организме. Во-вторых, необходимо установить участки генома, с которыми связывается изучаемый транскрипционный фактор. И в-третьих, надо оценить, какой эффект связывание оказывает на активность генов-мишеней. Обладая такими данными можно реконструировать часть генной сети, контролируемой исследуемым транскрипционным фактором (Wilczynski, Furlong, 2010).

Гены aly и can классов обладают семенник-специфичным профилем экспрессии, активны только в течение первого мейоза G2-фазы сперматоцитов (Lin et al., 1996;

White-Cooper et al., 2000). Следовательно, в организме дрозофилы действие транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, ограничено одной стадией развития клеток зародышевого пути. Значительно менее определенным является механизм действия этих транскрипционных факторов (White-Cooper, 2010).

В проведенных ранее работах исследователи предполагали активирующую роль белков tMAC, к которым принадлежит и Comr, опираясь на тот факт, что они ассоциированы с эухроматином, а у мутантов aly класса снижается уровень экспрессии многих генов (White-Cooper et al., 2000;

Jiang, White-Cooper, 2003;

Wang, Mann, 2003;

Jiang et al., 2007). Однако такие наблюдения не являются однозначным доказательством активирующей роли продуктов генов aly-класса, поскольку на основании имеющихся данных невозможно было исключить возможность активации генов-мишеней посредством подавления неизвестных генных репрессоров. Также, невозможно было исключить и существование tMAC-зависимых вторичных регуляторов, входящих в состав активирующего каскада в сперматоцитах (White-Cooper, Davidson, 2011). Более того, все предположения относительно механизма действия белков tMAC строились на основаниях исследования небольшого числа генов, для которых даже не было показано прямого физического взаимодействия с tMAC комплексом (Lin et al., 1996;


Chen et al., 2011;

White-Cooper, Davidson, 2011).

Поэтому для понимания механизма действия белков tMAC, необходимо было установить прямые гены-мишени белка Comr. Для этой цели нами была разработана генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID, при помощи которой можно проводить полногеномное картирование сайтов связывания транскрипционных факторов в отдельных клеточных популяциях организма. Раньше метод DamID применялся в основном на культуре клеток (van Steensel, Henikoff, 2000;

Filion et al., 2010). Вместе с тем было невозможно картировать тканеспецифичные белки в организме дрозофилы, так как размещение Dam метилазой метильных меток происходило во всех клетках организма, что искажало истинную картину связывания белка. Разработанный метод позволяет преодолеть это ограничение и расширяет возможности изучения действия ДНК-связывающих белков. Система, подобная разработанной, использовалась в работе Luo et al. [2011], однако она не позволяла проводить тканеспецифичный DamID, а использование стоп-кассеты было обусловлено стремлением авторов предотвратить потенциально токсичное влияние Dam метилазы (Luo et al., 2011).

Проведенное нами картирование сайтов связывания белка Comr позволило выявить более трех тысяч генов, вблизи которых детектировалось значительное связывание Comr. Вслед за этим мы провели анализ транскрипционной активности генов в семенниках на фоне мутации по гену comr и в норме. Сопоставив полученные данные о связывании с профилем экспрессии генов в семенниках самцов, мутантных по гену comr, мы обнаружили, что Comr является прямым активатором приблизительно 40% генов, снижающих уровень экспрессии на фоне мутации. Это свидетельствует о том, что более половины генов, снижающих экспрессию у мутантов, не связываются с белком Comr. Наиболее вероятным объяснением такого эффекта является существование регуляторного каскада, в котором Comr, в составе tMAC, активирует вторичные регуляторы, запускающих транскрипцию конечных генов-мишеней (Рис. 12А). Действительно, в списке генов-мишеней белка Comr обнаружился ген CG9879, кодирующий семенник-специфичный TATA binding protein (TBP). Оказалось, что ген CG9879 не способен активироваться как у мутантов comr, так и у мутантов can. Этот ген не описан в литературе, и полученные нами данные делают его кандидатом на роль вторичного регулятора в каскаде активации генов в сперматоцитах, действующего после генов aly и can классов (Рис. 12А).

Выяснение роли CG9879 требует отдельного исследования, однако сам факт того, что в генетическом каскаде, запускаемом генами задержки мейоза, имеются неизвестные вторичные регуляторы, по нашему мнению весьма существенен.

Также было обнаружено, что далеко не всегда связывание с белком Comr влияет на активность генов в семенниках. Действительно, лишь около 40% Comr-связанных генов снижали уровень экспрессии на фоне мутации comr. Такая выборка генов была обогащена семенник-спецфичными генами.

В то же время, больше половины Comr-связанных генов не изменяли уровень экспрессии на фоне мутации, и в состав такой группы входили гены, специфично активирующиеся в нервной ткани. Связывание Comr с генами семенник-специфичной подгруппы вполне логично, однако оставалось неясным, почему Comr также связывается с генами, специфичными для нервной ткани, особенно с учетом того, что это никак не влияет на их активность. Ранее было показано, что тканеспецифичные гены зачастую располагаются в областях репрессированного хроматина в клетках, в которых они не активны (Belyakin et al., 2005;

Kalmykova et al., 2005;

Shevelyov et al., 2009;

Belyakin et al., 2010;

Filion et al., 2010). Так, например, в слюнных железах личинок дрозофилы семенник-специфичные и другие тканеспецифичные гены зачастую располагаются в районах интеркалярного гетерохроматина, основными свойствами которых являются отсутствие генетической активности и поздняя репликация (Belyakin et al., 2005).

Генетическими маркерами таких районов являются белки SUUR, Polycomb, HP1 и B-ламин, кроме того, отличительной особенностью этих хроматиновых областей является присутствие гистоновой модификацией H3K27мет3 (Filion et al., 2010;

Sher et al., 2012). При участии перечисленных белков формируются протяженные хроматиновые домены, содержащие «молчащие гены» (Filion et al., 2010). По всей вероятности, похожие механизмы регуляции участвуют и в поддержании неактивного состояния генов дифференцировки на начальных стадиях развития клеток зародышевого пути. Действительно, в сперматогониях дрозофилы гены дифференцировки обогащены репрессивной гистоновой меткой Н3К27мет3 и содержащих малое количество активных гистоновых меток Н3К4мет3 (Gan et al., 2010), и в поддержании инактивированного состояния этих генов участвуют также белки группы Polycomb (Chen et al., 2005;

Gan et al., 2010;

Chen et al., 2011). Мы обнаружили, что на стадии сперматогониев промоторные области Comr-связанных генов обогащены гистоновой меткой H3K27мет3. Причем такая особенность обнаруживалась у всех Comr связанных генов, включая гены, на активность которых связывание Comr не оказывало влияния. Это наблюдение может свидетельствовать в пользу того, что характер связывания Comr определяется состоянием хроматина. В подтверждение этого наблюдения было обнаружено, что Comr связывается с протяженными участками хромосом, обогащенными репрессивной H3K27мет3 меткой. Такие домены связывания Comr проявляли сходство с областями репрессированного хроматина, наблюдаемыми в политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы (Максимов et al., 2013).

Исходя из полученных данных, можно предположить, что Comr действует на уровне хроматина.

Другое возможное объяснение наблюдаемой картины связывания Comr может быть связано с постановкой эксперимента DamID. В нашей системе вырезание стоп-кассеты может происходить еще на стадии герминальной стволовой клетки. Это означает, что химерный белок Dam-Comr может присутствовать уже на стадии сперматогониев. Поскольку для проведения DamID нами использовалась геномная ДНК, выделенная из целых семенников, в ней присутствует и ДНК сперматогониев. Существует возможность, что полученный нами профиль частично отражает метилирование, прошедшее на стадии сперматогониев. Однако против этого предположения свидетельствуют данные о том, что для транспорта в ядро требуются все компоненты tMAC, которые отсутствуют в сперматогониях, что должно было затруднить попадание белка Dam-Comr в ядро. Характер связывания Comr, обнаруженный в нашем исследовании, также достаточно специфичен и не может быть списан только на присутствие фонового сигнала.

Для активации генов в сперматоцитах требуется действие обоих классов генов задержки мейоза (Chen et al., 2011). Мы обнаружили, что большинство генов, чья активность зависит от действия tTAF, зависели также и от tMAC. По нашим данным, чуть менее половины генов, снижающих экспрессию в семенниках на фоне мутации can, связываются с белком Comr.

Приблизительно такой же была доля Comr-связанных генов, среди генов, снижающих активность на фоне мутации comr. Согласно проведенным ранее исследованиям, белки tTAF являются промотор-специфичными (Hempel et al., 2006) и не способны связываться с генами-мишенями в отсутствии tMAC компонентов (Chen et al., 2011). Опираясь на эти данные, можно предположить, что Comr-связанные гены, активность которых снижается как на фоне мутации comr, так и can, напрямую регулируются и tMAC и tTAF белками.

Полученные нами результаты улучшают понимание механизма массовой активации генов в сперматоцитах D. melanogaster. Мы предполагаем следующий механизм координированной регуляции активности семенник специфичных генов белковыми комплексами tMAC и tTAF (Рис. 12Б). На начальном этапе активации белок Comr в составе tMAC связывается с участками транскрипционно неактивного хроматина, обогащенного гистоновой меткой H3K27мет3, что, вероятно, способствует изменению его структуры. В пользу предположения о способности tMAC изменять свойства хроматина свидетельствует тот факт, что в составе этого комплекса содержится гистоновый шаперон Caf1 (Beall et al., 2007), являющийся также компонентом других комплексов, способных модулировать структуру хроматина, таких как NURF и PRC2 (Martinez-Balbas et al., 1998;

Schwartz, Pirrotta, 2007). По нашему предположению в результате перестройки хроматина становятся доступными сайты связывания промотор специфичных транскрипционных факторов, таких как семенник специфичные tTAF, кодируемых генами класса. Специфичные can транскрипционные факторы активируют свои гены-мишени, среди которых содержатся вторичные регуляторы транскрипции, продолжающие дальнейший активирующий каскад в сперматоцитах.

Предложенная гипотеза способна объяснить ряд экспериментальных наблюдений, описанных ранее. В первую очередь это относится к различиям в фенотипических эффектах от мутаций в генах aly и can классов. Мутанты can класса имеют нормальные хромосомы, характерные для профазы I, в то время как мутанты aly класса демонстрируют явные нарушения в структуре хромосом (Lin et al., 1996), что соотносится с их предполагаемой ролью в ремоделировании хроматина. Также, мутанты aly класса оказывают более сильный негативный эффект на транскрипцию генов в сперматоцитах, чем гены can класса (White-Cooper et al., 1998). Это может говорить о том, что в отсутствие ремоделирующей функции tMAC белки tTAF не могут связаться с Рисунок 12. Предполагаемый механизм активации генов белками tMAC и tTAF в сперматоцитах у D. melanogaster.

А – Предполагаемый генетический каскад, регулирующий активность генов в сперматоцитах. Как tMAC, так и tTAF требуются для активации гена CG9879, который может отвечать за активацию tMAC-не связанных генов;

Б – совместное действие tMAC и tTAF в регуляции активности генов. tMAC действует на уровне хроматина и позволяет tTAF (или другим специфичным транскрипционным факторам) связываться со своими генами-мишенями, включая вторичных регуляторов, как например CG9879. Вторичные регуляторы продолжают активирующий генетический каскад. Экспрессия генов (серый прямоугольник), с которыми связывается tMAC, но для которых отсутствуют специфические активаторы, не запускается.

хроматином и их гены-мишени остаются молчащими. У мутантов can класса tMAC интактен и ремоделирование хроматина происходит, что, возможно, позволяет некоторый низкий, но детектируемый уровень экспрессии генов за счет базальной активности их промоторов.

Также ранее было показано, что для активации некоторых генов дифференцировки (fzo, dj и Mst87F) на стадии сперматоцитов необходимо преодолеть инактивирующее действие белков Polycomb-комплекса. Этот белковый комплекс играет важную роль в поддержании генов дифференцировки в неактивном состоянии, что поддерживает пролиферацию клеток-предшественников, но не дает им развиться в дальнейшие клеточные стадии (Boyer et al., 2006;

Lee et al., 2006a;

Chamberlain et al., 2008). Было установлено, что совместное действие генов aly и can классов приводило к удалению репрессивной гистоновой модификации H3K27мет3, белка Polycomb и загрузке на промоторы РНК-полимеразы II, в конечном итоге приводя к активации fzo, dj и Mst87F в сперматоцитах (Chen et al., 2011).

Причем в отсутствие функционального tMAC удаление белка Polycomb с промоторных областей генов дифференцировки осуществлялось с меньшей эффективностью, чем в отсутствии tTAF (Chen et al., 2011). Такое наблюдение дополнительно подтверждает влияние Comr на структуру хроматина. Необходимо отметить, что для генов fzo, dj и Mst87F показано физическое взаимодействие лишь с белком Sa, кодируемым геном can класса, а взаимодействуют ли с ними tMAC-комплекс оставалось невыясненным. Опираясь на существующие данные, нельзя было сделать однозначный вывод о существовании совместной регуляции одних и тех же генов белками обоих регуляторных комплексов. Существование механизма такой регуляции подтверждается полученными нами данными о связывании Comr и о влиянии Can и Comr на экспрессию генов в семенниках.

Схожие многоступенчатые механизмы регуляции активности тканеспецифичных генов были обнаружены у млекопитающих. Действие таких механизмов начинается с активности первичных транскрипционных факторов (pioneer factors), таких как представители семейства белков Forkhead. Такие транскрипционные факторы обладают тканеспецифичным профилем экспрессии и, как и в предполагаемом нами механизме, распознают особые эпигенетические или белковые метки и связываются с содержащими их областями хроматина. Такие тканеспецифичные факторы участвуют в изменении структуры хроматина, что в конечном итоге позволяет связаться активирующим транскрипционным факторам (Magnani et al., 2011). У млекопитающих такие механизмы регулируют активность специфических генов в процессе дифференцировки различных типов клеток, таких как клетки печени, эмбриональные стволовые клетки и многие другие (Magnani et al., 2011).

Полученные нами данные также позволяют провести некоторые аналогии между гомологичными комплексами tMAC и MMB/dREAM (см.

Обзор литературы). Как уже упоминалось, в состав этих комплексов входят как одинаковые, так и гомологичные субъединицы. В соматических Kc клетках комплекс MMB/dREAM связывается с 3538 генами (Georlette et al., 2007). Белок Comr, входящий в состав комплекса tMAC, также связывается более чем с тремя тысячами генов. MMB/dREAM участвует в активации экспрессии ряда генов и способен подавлять транскрипцию других (Beall et al., 2007). Так, в нейронах под действием MMB/dREAM происходит перестройка хроматина и последующая активация специфичного для клетки рецептора, одновременно с этим комплекс поддерживает множество других генов в неактивном состоянии (Sim et al., 2012). То или иное влияние MMB/dREAM на экспрессию генов-мишеней, по всей видимости, обуславливается набором субъединиц, входящих в состав комплекса (Beall et al., 2007;

Sim et al., 2012).

Среди Comr-связанных генов была обнаружена группа генов, которые активировались на фоне мутации comr. По существующим представлениям, все субъединицы tMAC-комплекса, кодируемые генами aly-класса, являются активаторами экспрессии генов. Вместе с тем, недавно был идентифицирован еще один компонент tMAC-комплекса – белок Wake-up-call, которому приписывается способность подавлять экспрессию генов-мишеней (Doggett et al., 2011). Наличие компонента-репрессора в составе tMAC может объяснять повышение активности некоторых генов при разрушении комплекса.

Раньше предполагалось, что tMAC является семенник-специфичной версией MMB/dREAM (White-Cooper, Davidson, 2011). Вместе с тем, гены, кодирующие субъединицы самого MMB/dREAM, сохраняют активность в семенниках, а мутации по некоторым из них приводят к нарушению сперматогенеза (Beall et al., 2007). Кроме того, на культурах клеток было показано, что комплекс MMB/dREAM подавляет активность генов, участвующих в клеточной дифференцировке (Lee et al., 2010;

Lee et al., 2012). По всей видимости, MMB/dREAM, как и tMAC также функционален в семенниках. Комплекс tMAC в основном является активатором экспрессии в дифференцирующихся клетках, а учитывая способность MMB/dREAM подавлять активность генов дифференцировки, можно предположить антагонистические влияния этих комплексов на активность генов в семенниках. Функции MMB/dREAM в регуляции генов и профиль его связывания в клетках зародышевого пути не изучены, поэтому на данный момент не представляется возможным более подробно изучить этот вопрос.

В результате проведенного исследования мы обнаружили, что существуют Comr-связанные протяженные хромосомные домены, в составе которых располагаются кластеры семенник-специфичных генов. Изучению кластеров семенник-специфичных генов посвящено множество работ, но остается не выясненным функциональный смысл их существования (Boutanaev et al., 2002;

Belyakin et al., 2005;

Kalmykova et al., 2005).

Предположение о том, что кластеризация семенник-специфичных генов обусловлена присутствием одного регуляторного элемента, управляющего всеми генами кластера, было опровергнуто работой, в которой разрушение кластера хромосомной перестройкой не привело к изменению экспрессии входящих в него генов (Meadows et al., 2010). Вместе с тем было обнаружено, что в соматических клетках кластеры семенник-специфичных генов располагаются в репрессированных хроматиновых доменах (Belyakin et al., 2005). Наши исследования свидетельствуют в пользу существования таких же доменов в недифференцированных клетках зародышевого пути. Согласно нашей модели, tMAC связывается с такими доменами и позволяет специфичным транскрипционным факторам связаться со своими генами мишенями, что в результате приводит к синхронной активации семенник специфичных генов. На основе существующих данных можно предположить механизм регуляции тканеспецифичных генов, в котором они располагаются в районах репрессированного хроматина и по умолчанию «выключены» во всех тканях организма. В клеточных популяциях, в которых необходима экспрессия этих генов, работают специальные транскрипционные факторы, которые позволяют изменить свойства хроматина и активировать такие гены.

Существование такой системы могло бы объяснить кластеризацию семенник специфичных генов и их локализацию в репрессированных районах хроматина.

ВЫВОДЫ 1. Создана система для проведения картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.

2. Определен профиль связывания транскрипционного фактора Cookie Monster. Установлено, что Cookie Monster связывается с протяженными участками хромосом, содержащими более трех тысяч генов, промоторные области которых обогащены репрессивной гистоновой модификацией H3K27мет3 и обеднены меткой активного хроматина H3K4мет3 в недифференцированных герминальных клетках.

3. Установлено, что активирующее действие белка Cookie Monster осуществляется за счет прямого воздействия на гены-мишени, а также путем активации вторичных регуляторных генов. Кандидатом на роль такого регулятора является ген CG9879.

4. Установлено, что Cannonball участвует как в активации части генов, напрямую активируемых так и ряда генов, Cookie Monster, контролируемых Cookie Monster через вторичные регуляторы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Лактионов П.П., Андреева Е.Н., Шлома В.В., Максимов Д.А., Белякин 1.

С.Н. Генетическая система для мечения соматических и герминальных клеточных линий в гонадах Drosophila melanogaster // Цитология. 2013.

V. 55. P. 185-189.

Максимов Д.А., Лактионов П.П., Белякин С.Н. Доменная регуляция 2.

экспрессии генов в районах интеркалярного гетерохроматина Drosophila melanogaster // Цитология. 2013. V. 55. P. 190-193.

3. Abremski K., Hoess R. Bacteriophage P1 site-specific recombination.

Purification and properties of the Cre recombinase protein // J Biol Chem.

1984. V. 259. P. 1509-1514.

4. Arbouzova N.I., Zeidler M.P. JAK/STAT signalling in Drosophila: insights into conserved regulatory and cellular functions // Development. 2006. V.

133. P. 2605-2616.

5. Ayyar S., Jiang J., Collu A., White-Cooper H., White R.A. Drosophila TGIF is essential for developmentally regulated transcription in spermatogenesis // Development. 2003. V. 130. P. 2841-2852.

6. Barreau C., Benson E., Gudmannsdottir E., Newton F., White-Cooper H.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.