авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO FARMACII A V ...»

-- [ Страница 10 ] --

количественно переносят на пористый микрофильтр G3, на дно которого кладут кружок фильтровальной бумаги. Отделенный таким об­ разом витамин элюируют 5 мл 99,5%-ного этанола, которому дают свободнс стечь через фильтр. Поглощение полученного элюата измеряют в ультрафиоле­ товой области при длине волны 240—280 нм, сравнивая с чистым этанолом в кварцевой кювете объемом 1 мл. Для обычных определений достаточно изме­ рять поглощение при длине волны 265 нм. Поглощение элюата из чистого сор­ бента измеряют таким же способом. Для элюирования берут одинаковое весо­ вое количество окиси алюминия с не подвергнутой действию реактива хромато граммы из зоны, где нет никаких пятен. Полученное таким образом поглощение вычитают из величины, полученной при измерении элюата, содержащего вита­ мин. Способ удобен и для определения витамина D3 в образцах ветеринарного препарата «гидрозоль витамина D3», содержащего 10 000 ME витамина D3 в 1 мл. Дальнейшие подробности описаны в оригинальной работе ([227].

Витамин Е Сорбенты. Разделением этой группы веществ (витамин Е — смесь родственных соединений а-, р- и 7"т°коферола) методом ТСХ на силикагеле G занимался Зеер [183—185], а также ряд других исследователей [15, 25, 73, 141, 178, 190, 207, 244]. Неко­ торые пользовались пропитанными парафином слоями силикагеля и кремнезема [164] и слоями силикагеля, обработанными сквала ном или соответственно ундеканом [132]. Некоторые авторы [116, 117] пользовались окисью алюминия со связующим веществом, другие — фосфорнокислым магнием [25]. Давидек и Покорный [43] и другие [55] разделяли токоферолы на слоях полиамида.

Системы растворителей. При разделении смеси антиоксидантов относящийся к ним токоферол выделяли одно- или двумерной хроматографией на силикагеле G. В качестве системы растворите­ лей пользовались хлороформом [184], толуолом или бензолом [183], тогда как при разделении различных токоферолов [153] ра­ ботали в хлороформе (табл. 43). В работе [183] а-токоферол отде­ ляли от р-токоферола и (3-токоферол от •у-токоферола двумерной хроматографией в системе петролейный эфир — диизопропиловый эфир — ацетон — эфир — ледяная уксусная кислота (85 : 1 2 : 4 : 1 :

: 1) [183]. Для выделения §- и у " т о к о Ф е Р о л о в в присутствии а-токоферола и ацетата ретинола применяли систему циклогек сан — гексан — диизопропиловый эфир — NH4OH ( 4 0 : 4 0 : 2 0 : 2 ), для отделения некоторых соединений фенольного характера, род­ ственных токоферолу, и отделения продуктов их окисления поль­ зовались хлороформом, бензолом, циклогексаном и тетрагидро фураном;

а-токоферол и его сложные эфиры разделяли в системе циклогексан — эфир (4:1) или циклогексан — хлороформ [240].

Рафем [177] применял в качестве системы хлороформ, бензол, бензол — метанол (98:2) и др. (табл. 43). При разделении на слоях окиси алюминия со связующим веществом работали в бен­ золе [178], при делении на полиамиде — в системе метанол — аце­ тон— вода ( 3 : 1 : 1 ) или ( 6 : 1 : 3 ) [43, 55]. В системах ацетона с Специальная часть Таблица Хроматографическое разделение токоферолов Значения hRp в различных системах растворителей Вещество СЗа С1а С5а С2° С4° — Токол 58. 56 а-Токоферол 35 34 51 Р-Токоферол 37 31 48 •у-Токоферол 49 48 |г-Токоферол 23 21 6-Токоферол 32 — 28 41 т)-Токоферол 32 — 30 е-Токоферол 27 — р-Метилтокол 71 а-Токоферолацетат — — — 30— а-Токоферолсукцинат — — — — а Силикагель G.

Окись алюминия G.

вгор-Фосфат магния.

Обозначения:

С1 хлороформ [159];

С4 петролейный эфир — эфир (85 : 15) [207];

С2 бензол [25];

С5 циклогексан — эфир (4: 1) [207].

СЗ бензол — метанол (98 : 2) [207];

водой, насыщенных парафином, разделяли токоферолы и продук­ ты их окисления [185].

Обнаружение. Токоферолы обнаруживали раствором 2,6-ди хлорхинонхлоримида (Д 35), раствором сернокислого церия (Д 180) и фосфорномолибденовой кислотой (Д 115) [183—185].

Применяли также раствор хлорида железа (III) (Д 97) i[240], фос форномолибденовую кислоту (Д 115) или 2,7-дихлорфлуоресцеин в абсолютном спирте [52]. Удобны также слои сорбента, содержа­ щие 0,02% натриевой соли флуоресцеина [25]. Разделенные ве­ щества наблюдались в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне.

Некоторые реактивы позволяют отличить токоферолы на осно­ вании цветных реакций. После реакции токоферола с раствором 2,2'-дипиридила и хлорида железа(III) (Д 49) образуется ржаво красное окрашивание;

этот известный реактив не дает, однако, 310 Специальная часть цветных реакций со сложными эфирами. Цветное окрашивание да­ ют также пары иода и раствор желтой кровяной соли и хлорида железа (III) (Д 100), а также концентрированная серная кислота, азотная и хлорная кислоты [196, 197]. С токоферолами реагиру­ ют 60%-ная серная кислота (после нагревания при температуре 150°С) или нейтральный раствор азотнокислого серебра в ацетоне (Д 55) |[196]. Диазотированной сульфаниловой кислотой (Д 25), которая оказалась удобным реактивом для обнаружения токофе­ ролов при разделении на полиамиде [42], Зеер [183] пользовался при делении этих веществ на слоях силикагеля G.

Применение. Методом ТСХ на силикагеле G разделяли смеси токоферолов из растительных материалов [17, 23, 178] или об­ наруживали их в различных концентратах и лекарственных фор­ мах. Токоферолы в маслах обнаруживали Мюллер-Мюло и сотр.

[277, 278]. Скиннер и сотр. [196, 197] разделяли методом ТСХ токоферол и продукты его окисления. Другая работа [15] была посвящена хроматографическому разделению а-токоферола, а-то коферолхинона и холестерина. В обзорной работе [132] рассмат­ риваются все способы разделения этих веществ методом ТСХ.

Рафем [177] подвергал разделению а- и fJ-токоферолы. Вюил люмье [235] обнаруживал а-токоферол на слоях окиси алюминия.

Токоферолы в смесях обнаруживают следующим способом [184].

Разделение проводили на слоях силикагеля в хлороформе или на окиси алюминия G в бензоле. Отдельные токоферолы разделяли в зависимости от чис­ ла метильных групп на триметил-, диметил- и метилтокоферолы. На обоих сор­ бентах разделенные таким образом вещества открывали 20%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты (Д 115), которая уже при комнатной темпера­ туре реагировала с ними в течение 2—3 мин. Затем на эти хроматограммы дей­ ствовали парами аммиака, причем пятна обнаруженных веществ окрашивались в темно-синий цвет. е о л а Раствор сернокислого церия (Д 180) позволил отличить р-то коферол от у - т о к о Ф Р (первый дает коричневое, а второй — синее окраши­ вание). Таким образом удалось различить отдельные токоферолы и устранить некоторые сопутствующие балластные вещества, например жидкие масла, жи­ ры и т. д.

Количественное определение. Токоферолы определяли количе­ ственно, фотометрируя элюаты пятен после обнаружения их реа­ гентами или при локализации их с помощью ультрафиолетового освещения [178]. Удобным оказалось также спектрофотометриче ское определение небольших количеств витаминов Е [49] и плани­ метрическое определение токоферолов после их отделения от по­ сторонних примесей и цветной реакции с фосфорномолибденовой кислотой [184]. Возможно и прямое определение спектрофотомет рическим методом в отраженном свете без опрыскивания пятен разделенных веществ. Некоторые работы были посвящены спект рофотометрическому (минимально 0,01 мкг/мл) или радиометри­ ческому определению радиоактивных токоферолов с применением сцинтилляционного детектора [184].

Специальная часть 3J Витамины К и убихиноны Разделением этих веществ (витамины К — производные 2-ме тил-1,4-нафтохинона, а убихиноны — бензохинона) занимались многие исследователи.

Сорбенты. Биллетер и сотр. [18] разделяли витамины К на си ликагеле, пропитанном раствором натриевой соли флуоресцеина, Глоор [68], Манес и сотр. [144], Тилеманн [217] и другие авторы [4]—на силикагеле G. На силикагеле G, пропитанном 5%-ным раствором парафина в петролейном эфире, разделяли убихиноны и витамины К[148,178]. Боллигер и Шталь [25] разделяли эти веще­ ства на смешанных слоях силикагеля и кремнезема, обработанных вазелиновым маслом, другие авторы [117] разделяли витамины К на силикагеле G или на окиси алюминия G. Витамины К в смесях с про­ чими липофильными витаминами разделяли на незакрепленных сло­ ях окиси алюминия [23]. В качестве сорбента пользовались также смесью целлюлозы MN300 F254 и силикагеля HF254 (66:34), про­ питанной вазелиновым маслом, или смесью полиамида и целлю­ лозы MN 300 F254 (85: 15) [55]. В работе [35] исследовали слои силикагеля G с азотнокислым серебром (9:1), полученные обыч­ ным способом с водным раствором азотнокислого серебра.

Системы растворителей. При разделении витаминов К на сили­ кагеле G сначала в системе гептан — бензол (1:1) отделяли балластные вещества от витаминов, которые оставались почти на старте, а после высушивания хроматограммы для разделения соб­ ственно витаминов использовали бензол [18]. Витамины К под­ вергали также разделению в системах ацетон — вода (95 : 5) и (9:1) [35] и бензол — этилацетат (97:3) [51]. С этими же систе­ мами работали при разделении убихинонов на силикагеле G, про­ питанном парафином [35, 111], тогда как при.применении смешан­ ных слоев силикагеля и кремнезема (1:1), пропитанных вазели­ новым маслом, убихиноны разделяли в системе метанол, насыщен­ ный парафином— пропанол-2 (9:1) [117].

Обнаружение. Витамин К на слоях, пропитанных натриевой солью флуоресцеина или другими флуоресцентными индикатора­ ми, обнаруживали в ультрафиолетовом свете [18]. Для обнаруже­ ния витаминов К оказалась пригодной серная кислота после на­ гревания хроматограммы при 130 °С;

применяли также раствор фосфорномолибденовой кислоты (Д 115), 2,4-динитрофенилгидра зин (Д 46), ксантгидрол (Д 191) и диэтилкарбамат натрия [18].

При действии концентрированной азотной кислоты образовыва­ лись желтые пятна [18], а при действии хлорной — желто-корич­ невые [23]. Витамины К обнаруживали реакцией с амидопирином [96]. Убихиноны идентифицировали в ультрафиолетовом свете при разделении на слоях с флуоресцентными добавками или поль­ зовались для их обнаружения раствором фосфорномолибденовой 312 Специальная часть кислоты (Д 115), хлорида сурьмы(III) в хлороформе (Д 87а) или раствором родамина В (Д 175) |[237].

Применение. Хроматографией в тонком слое силикагеля G пользовались для разделения витаминов К в лекарственных пре­ паратах [116], а также в материалах животного происхождения [68, 148, 217]. Многие исследователи [118—121, 195, 237] отделя­ ли этим способом витамины Ki—Кз, известные как фотолабиль­ ные соединения, от продуктов их фотолиза. Целью некоторых ра­ бот было определение убихинонов в биологических материалах [68] и в растительных и животных вытяжках [97, 160], а также обнаружение липохинонов в микроорганизмах [160] и в фарма­ цевтических препаратах [279].

Количественное определение. Несмотря на то что фотолабиль­ ность витаминов К сильно затрудняет количественное определе­ ние, некоторые исследователи пытались их определять радиомет­ рическим способом после разделения в тонком слое и извлечения из пятен [8, 33, 237], а также планиметрически или фотометриче­ ски [23]. Убихиноны определяли спектрофотометрически [160].

Разделение смесей липофильных витаминов Разделение смесей липофильных витаминов, имеющее практи­ ческое значение для анализа поливитаминных препаратов, не представляет затруднений, так как эти вещества, как уже упоми­ налось выше, сильно различаются по своей химической природе.

Сорбенты. Для деления этих смесей пользовались силикагелем G [55, 67, 108, 217] и силикагелем, пропитанным полиэтиленгли колем 200—400 [143]. Другие авторы применяли окись алюминия [25] или незакрепленную окись алюминия [23].

Системы растворителей. Смеси липофильных витаминов под­ вергали разделению на силикагеле G в системе циклогексан — эфир (4: 1) [217], а на окиси алюминия — в бензоле [55];

в упо­ мянутой уже работе [23] для разделения такой смеси на окиси алюминия без связующего вещества применяли 14 систем (табл. 44). Хроматографическое разделение проводили также в системах циклогексан — эфир и циклогексан — этилацетат [26], в бензоле или хлороформе [100, 117] и в четыреххлористом углеро­ де [23] (табл. 45).

Обнаружение. Пятна отдельных липофильных витаминов, вы­ деленных из смесей, обнаруживали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 или 366 нм или делали их видимыми действием концентрированной серной кислоты и раствором хлорида сурь­ мы (III) [25]. Липофильные витамины обнаруживали также с по­ мощью 70%-ной хлорной или 90%-ной серной кислоты, проводя хроматографирование в кислотах в направлении, перпендикуляр­ ном направлению первого элюирования.

Так как липофильные витамины в этих кислотах нерастворимы, пятна обнаруженных Специальная часть Таблица Хроматографические характеристики некоторых липофильных витаминов [23] Значения hRp некоторых витаминов Растворитель а-ка- 3-ка к А Е Ki D2 Кз ротин ротин ' 76 78 80 81 Метанол 87 91 89 Этанол абсолютный 90 93 91 н-Бутанол 90 89 92 90 89 89 98 92 Бензиловый спирт Гексан 90 79 85 90 92 Циклогексан 100 64 Петр олеины й эфир 75 88 98 5 31 Керосин 50 50 24 0 Бензол 87 91 24 93 94 Толуол 88 91 17 69 Ксилол 91 89 72 Хлороформ 94 93 58 87 94 Четыреххлористый угле­ род 90 90 63 9 54 74 Ацетон ~ таким образом веществ не смещаются. С фосфорномолибденовой кислотой липофильные витамины давали серовато-голубые пятна, а в ультрафиолетовом свете пятна казались темными на светлом фоне [71]. Для обнаружения этих веществ пригоден также рас­ твор о-толидина и иодида калия;

при действии хлора на пятна ли­ пофильных витаминов они оказываются белыми на сером фо­ не [25].

применение. Описанными выше способами пользовались для выделения липофильных витаминов из фармацевтических препара­ тов и пищевых продуктов,[23,'25, 26, 117, 208, 264, 284], а также из биологических и растительных материалов i[16, 59, 237].

Количественное определение. Для количественного определения смесей липофильных витаминов некоторые исследователи поль­ зовались денситометрическим [125, 261], другие—[Ш] фотомет­ рическим и спектрофотометрическим методами.

Разделение проводили на слоях нейтральной} окиси алюминия без связую­ щего вещества. Для обнаружения пользовались ультрафиолетовым светом с дли­ ной волны 254 ям. Изолированные и экстрагиреваняме литюфияьные витамины определяли фотометрически. Спектрофотометринеско^огфедедеддавшыполняли н а 21—264 ТЕХ?" SHE ".'.lis ИНГ..• 13-466 ;

Специальная часть Таблица Значения hRt липофильных витаминов [26] Значения hR„ в различных системах Витамин СЗ С5 С4 С С2 С4 С5 С С 90 100 89 86 84 87 100 (З-Каротин Витамин Аа — 10 35 22 16 8 Ацетат витамина Аа 72 78 45 74 65 41 Пальмитат витамина Аа — 87 72 84 84 75 — 32 53 37 68 66 35 а-Токоферол 73 80 40 77 67 81 Ацетат а-токоферола 15 17 51 40 D2 и D 3 45 9 73 80 К, 75 61 82 81 — — К3 63 75 — 38 транс-соединения.

Обозначения:

С4 бензол;

О циклогексан — эфир (8:2);

С5 хлороформ;

С2 циклогексан — эфир (8:5);

Сб четыреххлористый углерод.

СЗ циклогексан — этилацетат (75:25):

УФ-спектрофотометре Optica CF 4P (Милан). Определяемые вещества растворя­ ли в бензоле и наносили микропипеткой на пластинку. Ретинол, кальциферол и токоферол хроматографировал'и в бензоле и затем после экстракции веществ из слоя сорбента определяли фотометрически [23]. Для определения витаминов спектрофотометрическим способом необходимо хроматографировать в хлорофор­ ме. При обнаружении выделенных веществ в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм ретинол появлялся в виде желтого флуоресцирующего пятна. Ви­ тамины D2 и D3 обнаруживали по тушению флуоресценции.

Ацетат ретинола определяли фотометрически после экстракции из сорбента безводным хлороформом и реакции с хлоридом сурьмы (III) (Д87а). Интенсив­ ность образующегося окрашивания измеряли спустя 30 с при длине волны 619 нм в кюветах длиной 1 см. Раствор сравнения приготовляли тем же путем, элюируя чистую окись алюминия. Калибровочную кривую строили на основании хроматографирования 40—60, 80 и 100 мкг ацетата ретинола;

для измерения брали затем 4—10 мкг вещества.

Витамин А в присутствии витамина D2 и витамина Е определяли описан­ ным способом '[23], нанося такое количество анализируемого вещества, которое соответствовало 60—80 мкг витамина А.

При определении витамина А в масляном растворе в присутствии витамина D2 0,25 мл масла — такое количество содержит около 12 500 ME (3750 мг) ви­ тамина А — омыляют спиртовой щелочью при кипячении с обратным холодиль­ ником;

после разбавления водой экстрагируют эфиром и эфирную вытяжку про­ мывают дистиллированной водой до' нейтральной реакции. После высушивания эфирного раствора безводным сульфатом натрия и разбавления эфиром выпа­ ривают досуха такое количество раствора, которое соответствует 0,750 мг вита Специальная часть мина А. Остаток после выпаривания растворяют в бензоле и наносят в необхо­ димом количестве на хроматограмму. Далее поступают, как описано выше.

Перед количественным определением витамин D2 элюируют из сорбента 95%-ным этанолом/ Раствор разбавляют до точного объема. На аликвотную часть его действуют 85%-ной серной кислотой. Спустя 10 мин измеряют интен­ сивность образующегося окрашивания в кюветах длиной 1 см при длине волны 496 нм. Раствор сравнения готовят элюированием чистой окиси алюминия тем же способом. Для построения калибровочной кривой хроматографируют 400, 800, 1200 и 1600 мкг витамина D2, а для определения берут 40—160 мкг веще­ ства.

Витамин D2 в присутствии витамина А определяют таким способом: наносят такое количество смеси, которое соответствовало бы 400 мкг витамина D2.

Витамин Е определяют следующим образом. Точно отвешенное количество витамина Е (50 мкг ацетата D, L-токоферола) кипятят в течение. 3 ч с обрат­ ным холодильником с 5 н. спиртовой серной кислотой, при этом удаляются все мешающие определению вещества, кроме каротинов. Витамин элюировали 3 раза абсолютным спиртом (по 2,5 мл). Соединенные вытяжки окисляют 0,2%-ным рас­ твором хлорида железа (III). Образующиеся при этом ионы железа (II) реаги­ руют с 0,25%-ным раствором а,а'-дипиридила, давая красное окрашивание, ин­ тенсивность которого измеряют в кюветах длиной 1 см при длине волны 510 нм.

Калибровочную кривую строят, хроматографируя 62,5, 125, 180,5 и 250 мг, ви­ тамина Е и фотометрически определяя интенсивность образующегося окрашива­ ния после элюирования изолированных пятен отдельных.веществ из слоя.

Витамин Е в смеси с витамином А определяют таким же способом, только количество наносимой смеси соответствовало 70 мг витамина Е.

Ретинол и холекальциферол определяли спектрофотометрически в ультра­ фиолетовом свете. Для этого после хроматографического разделения веществ в хлороформе в качестве растворителя обнаруживали пятна на еще влажной пластинке, освещая ее ультрафиолетовым светом и очерчивая контуры. Затем окись алюминия вместе с веществами количественно переносили на пористый микрофильтр G3. Выделенные вещества экстрагировали из сорбента абсолютным этанолом. Разделенные таким образом витамины определяли спектрофотометри­ чески в кюветах длиной 1 см при длине волны 326 и 265 нм.

5.5.1.2. Водорастворимые витамины К группе гидрофильных витаминов относятся витамины В, а также витамин С и витамин Р. Эти вещества химически различ­ ны;

некоторые из них чрезвычайно нестойки. Растворимость их сильно различается. При хроматографировании на сухих слоях силикагеля они, однако, более устойчивы, чем группа липофиль ных витаминов.

Витамины группы В Методом ТСХ были разделены тиамин [196, 260, 285, 292] и его эфиры [44, 93, 102, 108, 147, 162, 288], рибофлавин [131, 139, 240], пиридоксин [115, 248, 293], никотиновая кислота и ее амид [67, 159, 287], пантотеновая кислота и пантотенол [25, 26, 100], затем биотин [67, 290], фолиевая кислота [25, 26, 100] и циано кобаламин {30, 34, 80].

Сорбенты. Для разделения тиамина и его эфиров пользовались слоями силикагеля G [108, 147, 161, 196], целлюлозы [102] и по 21* 316 Специальная часть лиамида [40, 97]. Рибофлавин обнаруживали на слоях силикаге ля G [131, 199] и силикагеля Н {240]. Для разделения и обнару­ жения пиридоксола, пиридоксаля и пиридоксамина пользовались силикагелем [115] или целлюлозой [251]. Нюрнберг [159] разде­ лил никотиновую кислоту и ее амид на слоях силикагеля G, дру­ гие авторы [67] разделяли на силикагеле пантотеновую кислоту и пантотенол, а также биотин. Фолиевую кислоту выделяли и обна­ руживали на силикагеле G [18] или окиси алюминия [25]. Чима и сотр. [30] для выделения цианокобаламина пользовались окисью алюминия. Другие исследователи работали на слоях окиси алю­ миния с гипсом в качестве связующего и на слоях кремнезема [35] или целлюлозы [80]. Блешова и сотр. [286] подвергали во­ дорастворимые витамины разделению на готовых пластинках силуфол.

Системы растворителей. Отделение тиамина от тиаминпирофос фата на силикагеле проводили в системе пиридин — уксусная кис­ лота— вода (10:1:40) (рН 5,8) или 20%-ный раствор мочеви­ ны— 80%-ная муравьиная кислота — н-пропанол ( 1 : 2 : 3 ) [80].

Пользовались также системой пиридин —вода — ЫШОН — мета­ нол— ледяная уксусная кислота ( 6 : 6 : 5 : 1 : 1 ) [147].

Рибофлавины отделяли от рибофлавинфосфата на силикагеле G в системе пиридин — уксусная кислота — вода (10:1:40) [76], в изоамиловом спирте, насыщенном водой, или в системе н-бута нол — этанол — вода ( 7 : 2 : 1 ). Для разделения пиридоксаля и пи­ ридоксамина Нюрнберг [159] пользовался так называемым сту­ пенчатым хроматографированием по Шталю (разд. 3.1.1). Сначала эти вещества подвергали разделению на слоях высушенного на воздухе силикагеля в камере, насыщенной парами ацетона, элюи руя ацетоном (растворитель проходил расстояние 14 см). Затем ацетон испаряли и продолжали хроматографирование в том же направлении в системе ацетон — диоксан — NH4OH (45:45:10) (растворитель проходил то же расстояние).

Никотиновую кислоту и ее амид отделяли в системе н-пропа­ нол— 10%-ный NH4OH (95:5) без насыщения камеры [159], а также в системе уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол ( 5 : 5 : 2 0 : 7 0 ) [67]. При использовании первой системы раствори­ телей деление проводили на слоях высушенного на воздухе сили­ кагеля, вторую систему растворителей применяли на активирован­ ном силикагеле. В качестве растворителя пригодна и дистиллиро­ ванная вода, однако различия в величине RF оказываются недостаточно большими.

Биотин выделяли в системе уксусная кислота — ацетон — мета­ нол — бензол (5 : 5 : 20 : 70) или в воде [67].

Для выделения фолиевой кислоты пользовались 10%-ным NH4OH [25], системой ледяная уксусная кислота — ацетон — ме Специальная часть танол — бензол ( 5 : 5 : 2 0 : 7 0 ), в некоторых случаях ледяная уксус­ ная кислота — н-бутанол — вода (1 : 4 : 5 ) [30].

Выделение витамина B i2 на силикагеле G проводили в воде [25], в системе пиридин — 75%-ный фенол (10%) [34] или в ле­ дяной уксусной кислоте и водном растворе тимола, насыщенном хлоридом натрия [35], а на окиси алюминия — в системе мета­ нол— вода (95:5) [35].

Обнаружение. Из витаминов группы В тиамин обнаруживали либо по его фиолетовой флуоресценции в ультрафиолетовом свете, либо после опрыскивания хроматограммы свежеприготовленным раствором желтой кровяной соли (Д71);

продукт окисления, так называемый тиохром, образующийся при этом, при освещении светом ртутной лампы с длиной волны 366 нм обнаруживал ярко синюю флуоресценцию, а при опрыскивании иодоплатинатом ка­ лия (Д 109) давал серые пятна [32].

Рибофлавин после его выделения на' силикагеле G идентифици­ ровали по интенсивно-желтой флуоресценции при освещении ртут­ ной лампой. Его можно обнаружить в количествах 0,01 мкг па флуоресценции при длине волны 366 нм.

Витамины Be обнаруживали в ультрафиолетовом свете при ис­ пользовании флуоресцентных добавок или при действии паров ам­ миака после опрыскивания 0,4%-ным раствором 2,6-дибромхинон хлоримида в метаноле (Д 35) или 0,1%-ным раствором 2,6-ди хлорхинонхлоримида в этаноле (Д34). Все производные витамина Be дают синие пятна.

Так как никотиновую кислоту и ее амид разделяли на флуорес­ центных слоях, обнаружение вели в ультрафиолетовом свете.

Идентифицировать можно также действием раствора п-аминобен зойной кислоты и парами бромциана (Д16). Никотинамид окра­ шивался в оранжевый, а кислота — в красный цвет [207].

Пантотеновую кислоту и пантотенол обнаруживали опрыскива­ нием 0,5%-ным раствором нингидрина (Д 152) и нагреванием при 160°С [67], биотин—действием раствора иодоплатината калия (Д 109) или раствором n-толидина и иодида калия с последующим хлорированием (Д 102) ;

[61]. При обнаружении фолиевой кисло­ ты в ультрафиолетовом свете ее пятна были синими, тогда как после хлорирования и опрыскивания раствором о-толидина и иоди­ да калия — серыми. Обнаружение ее раствором перманганата ка­ лия (Д 142) является специфичным.

Витамин Bi2 идентифицировали при дневном свете по красному окрашиванию, в ультрафиолетовом свете по темным пятнам на ярком фоне, а также по фиолетовому окрашиванию после опрыс­ кивания раствором о-толидина и иодида калия [25].

Применение. Чжуан и сотр. [97] разработали разделение ти­ амина и его производных. Хельковский и сотр. [260] обнаружива­ ли тиамин и его производные в пищевых продуктах на слоях ре 318 Специальная часть зорциновых смол. Отделение побочных продуктов и продуктов рас­ пада рибофлавина от самого рибофлавина осуществили Генсхирт и Мальцахер [67], которые совместно с Нюрнбергом [159] иссле­ довали также разделение витаминов группы Be- Последний иссле­ довал также количественное определение никотиновой кислоты и ее амида в фармацевтических препаратах [159].

Разделение витаминов труппы В„ в поливитаминных препаратах Отвешивают количество вещества, соответствующее 10 мг хлорида пиридок­ саля, и кипятя^ с обратным холодильником в 20 мл абсолютного метанола в течение 1 ч. Пиридоксаль при этом количественно превращается в диметилаце таль. Метанол отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл воды. 5 мл этого раствора с содержанием 1 мг хлорида пиридоксаля после добавления 5 мл буферного раствора с рН 1 осаждают 10 мл водного раствора тетрафенилбора та натрия и оставляют стоять в течение ночи. Образовавшуюся кристаллическую кашицу отсасывают, кристаллы растворяют в 50 мл ацетона и в количестве, со­ ответствующем 0,1 мкг (0,01 мл), наносят на слой воздушно-сухого силикагеля.

Одновременно наносят эталонные растворы пиридоксаля, которые приготавли­ вают подобно пробе поливитаминного препарата;

иногда наносят ацеталь пири­ доксаля, который приготовляют кипячением 10 мг хлоргидрата пиридоксаля с 10 мл абсолютного метанола с обратным холодильником на водяной бане без доступа света;

по охлаждении количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят метанолом до метки.

Хроматографируют в системе хлороформ — этанол (99:1). После опрыски­ вания 0,4%-ным метанольным раствором дибромхинонхлоримида образуются си­ ние пятна.

Количественное определение никотиновой кислоты и ее амида Количества-препаратов, соответствующие 5—10 мкг определяемых веществ, хроматографируют на воздушно-сухом силикагеле G на стеклянных пластинках размером 20X20 см. Система для элюирования: к-пропанол—10%-ный NH4OH (95:5). Хроматографирование ведут до длины пробега растворителя 8 см;

разделе­ ние длится 60 мин. После высушивания опрыскивают 5%-ным метанольным раство­ ром n-аминобензойной кислоты. Затем хроматограмму обрабатывают в герметич­ ной камере парами хлорциана, который получают, наливая в проявительную ка­ меру свежеприготовленную смесь 20 мл водной 28%-ной суспензии хлорамина, 20 мл соляной кислоты и 10 мл 10%-ного раствора цианистого калия. Образу­ ются оранжево-красные пятна никотинамида и красные — никотиновой кислоты.

Количественное определение производят визуально по достижении через 6 мин максимальной яркости окраски, сравнением с эталонными пробами, при­ готовленными подобным же образом.

Пантотенол и пантотеновую кислоту в косметических.препара­ тах также подвергали разделению [67]. Иван [103] исследовал разделение фолиевой кислоты и родственных ей веществ. Генс­ хирт с сотр. [67] разработал обнаружение цианокобаламина мето­ дом ТСХ. Он применял щелочную окись алюминия и систему изо бутанол — пропанол-2 — вода ( 1 : 1 : 1 ). Этот способ позволяет разделить цианокобаламин, фактор В, псевдовитамин В и другие вещества. Другие исследователи [169] отделяли витамин Bi2 от оксицианокобаламина или некоторых коферментов. Губер и сотр.

Специальная часть [90] разработали отделение цианокобаламина от цианокобал амида..

Количественное определение. Витамины В после их обнаруже­ ния количественно определяли сравнением интенсивностей окра­ шивания с эталонными образцами, хроматографированными таким же способом [67, 159]. После элюирования из слоя количественно определяли тиамин и рибофлавин по их собственной флуоресцен­ ции, а рибофлавин, пантотеновую кислоту и пантотенол — фото­ метрически [18]. В другой работе [81] рибофлавин определяли денситометрическим способом. Фрай и сотр. [62] количественно определяли никотиновую кислоту и ее амид флуориметрически, а цианокобаламин — фотометрически [25, 45]. Штроэкер и Пис [209] определяли витамины В полярографическим методом.

Витамин С Витамин С, или аскорбиновая кислота, которая для фармацев­ тических целей употребляется в форме сложных эфиров или со­ лей, представляет собой сравнительно нестойкое вещество. При действии кислорода воздуха отщепляется водород и образуется де гидроаскорбиновая кислота;

поэтому при извлечении аскорбино­ вой кислоты из лекарственных препаратов и из природного сырья необходимо работать в атмосфере углекислого газа или азота.

Сорбенты. Аскорбиновую кислоту и ее производные разделяли на слоях силикагеля G [114], на этом же сорбенте после превра­ щения в динитрофенилгидразоны [25] или на активированном си ликагеле [101]. Из прочих сорбентов применяли незакрепленные слои окиси алюминия [104] и полиамида [93]. См. также рабо­ ту [294].

Системы растворителей. Для отделения аскорбиновой кислоты от родственных соединений, например дегидроаскорбиновой кис­ лоты и пальмитата аскорбиновой кислоты, на силикагеле G поль­ зовались системой ледяная уксусная кислота — ацетон — мета­ нол — бензол (5 : 5 : 20 : 70) или водой и соответственно этанолом [114]. В системе хлороформ — этилацетат (1:1) аскорбиновую кислоту выделяли после превращения в динитрофенилгидразон [25]. На слоях полиамида пользовались системой этанол — вода (65:35) [93].

Обнаружение. Витамин С можно обнаруживать по тушению флуоресценции в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 им.

После нагревания до 120°С аскорбиновая кислота при длине вол­ ны 366 нм проявляется как флуоресцирующее вещество. При об­ наружении аскорбиновой кислоты опрыскиванием раствором иодо платината калия (Д 109) образуется желтоватое окрашивание на розовом фоне. Витамин С обнаруживали также щелочным раство­ ром азотнокислого серебра (Д57), фосфорномолибденовой кисло­ той (Д115), раствором хлорида титана(Ш) (Д96) и т. д. [209].

320 Специальная часть Для обнаружения аскорбиновой кислоты пригодны также раство­ ры дихлорфенолиндофенола (Д31) и дипиридила с хлоридом же леза(Ш) (Д49) [45].

Применение. Методом ТСХ пользовались для отделения ве­ ществ, родственных аскорбиновой кислоте, от самой кислоты [114]. Так определяли аскорбиновую кислоту в пищевых продук­ тах [196, 197], поливитаминных препаратах [18] и идентифици­ ровали ее в присутствии кортикоидов [256].

Количественное определение. Полуколичественное определение аскорбиновой кислоты разработал Тилеманн [270]. Аскорбиновую кислоту определяли после экстракции из слоя по цветной реак­ ции фотометрическим методом [196, 209].

Прочие гидрофильные витамины Кацуи и Исикава [117] для выделения рутина, холина, инози­ та и др. пользовались силикагелем G или активированной окисью алюминия (Merck). В обоих случаях они применяли систему ук­ сусная кислота — ацетон — метанол — бензол ( 5 : 5 : 2 0 : 7 0 ). Для обнаружения оказались удобными несколько реактивов (табл.46).

Таблица Значения hRp и обнаружение некоторых водорастворимых витаминов [117] Предел Обнаружение прямое чувстви­ А Окраска Витамин Б или после действия тельности реактива Рутин 0 0, Темно-корич­ УФ-освещение невая (366 им) 3 20 Реактив Драгендор- Красная Карнитин (вита­ мин В() фа (Д 53а) »

Холин (витамин 2 45 То же вР) 0, Инозит 2 0 раствор Коричневая Аммиачный азотнокислого се­ ребра 60 л-Аминобензой- гг-Диметиламинобенз- Желтая 0, ная кислота альдегид (Д 36) Система: ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5:5:20:70);

толщина слоя около 0.25 мм;

А — активированный силикагель G (Merck);

Б — активированная окись алюминия (Merck).

Разделение смеси гидрофильных витаминов В качестве сорбентов для разделения гидрофильных витаминов пригодны силикагель, окись алюминия и ионообменные смолы.

При выделении гидрофильных витаминов из фармацевтиче­ ских препаратов в присутствии витаминов Bi, B2, Be, никотинами Специальная часть да и пантотената кальция на силикагеле G пользовались систе­ мой бензол — метанол — ацетон — уксусная кислота (70 : 20 : 5 : 5).

Камеру при этом не насыщали парами растворителя. Зна­ чения hRp в этой системе на силикагеле с флуоресцентным инди­ катором следующие: Bi 0, Be 15, С 30, В2 35, пантотенат каль­ ция 57, никотинамид 65, биотин 80. Эта же система пригодна и для разделения гидрофильных витаминов на окиси алюминия [67].

В качестве растворителя применяли также воду [25, 67] или эта­ нол [67]. Система этанол — вода (1:9) оказалась пригодной при разделении на ионообменной смоле вофатит СР 300 [117]. Другие исследователи [255] разделяли водорастворимые витамины в воде на готовых пластинках силуфол. Тиамин, пиридоксин, рибофлавин, никотинамид, пантотеновую кислоту, цианокобаламин и аскорби­ новую кислоту подвергали разделению на слоях крахмала [166].

Риенци и сотр. [267] обнаруживали эти витамины в животных жирах. Разделению смеси рутинозидов посвящена статья Гейсле ра [291].

5.5.2. Стероиды Стероидные соединения самых разнообразных типов относятся к тем органическим веществам, для которых тонкослойная хрома­ тография оказывается наиболее пригодной. Различия в структуре,.

конфигурации заместителей, конформации отдельных частей моле­ кулы обычно весьма четко проявляются в различиях хроматогра фической подвижности, так что, за исключением некоторых спе­ циальных случаев, разделение стероидных веществ не представ­ ляет особых трудностей. В тех случаях, когда адсорбционная хро­ матография оказывается a priori непригодной для разделения не­ которых веществ (например, гомологов), хорошую службу может сослужить распределительная хроматография. Для разделения некоторых пар веществ, различающихся, например, степенью не­ насыщенности молекулы, пригодны специально приготовленные сорбенты или можно воспользоваться простыми химическими ре­ акциями in situ, которые позволяют преодолеть затруднения с разделением.

В этом разделе мы ограничиваемся лишь кратким и общим обзором деления стероидных соединений методом ТСХ, предназ­ наченным главным образом для химиков-аналитиков;

применение в клинической биохимии подробно рассматривается в разд. 6.7.

Сорбенты. Стероидные вещества успешно разделяли на всех известных хроматографических материалах для адсорбционной и распределительной хроматографии. Применение насыпных, неза­ крепленных слоев, которое утратило свое прежнее значение и уже принадлежит истории, мы будем упоминать лишь выборочно. Ча 322 Специальная часть ще всего пользуются хорошо зарекомендовавшими себя слоями силикагеля как наиболее универсальными и доступными.

Иногда, особенно в случае веществ сложного строения и пото­ му менее устойчивых, встречаются затруднения при препаратив­ ном извлечении их из слоя сорбента. Было показано, что собственно разделение веществ обычно не сопровождается их деструкцией [99];

. последняя наблюдается при элюировании и концент­ рировании образцов. Рекомендуются поэтому сравнительно мало­ полярные растворители, однако с высокой элюирующей способно­ стью, например смеси дихлорметана с небольшими количествами метанола", которые существенно экономнее чистого метанола [98, 99]. Благоприятно сказывается тщательное удаление частиц захва­ ченного хроматографического материала и других загрязнений пе­ ред концентрированием [3, 98, 99]. Влияние относительной влаж­ ности на разделение стероидов на силикагеле изучал Хмель [295].

Системы растворителей. Хотя для стероидных веществ описано большое количество разнообразных систем растворителей, в боль­ шинстве случаев оказывается достаточно лишь несколько главных систем. По нашему опыту для работы на силикагеле достаточны три основных растворителя, а именно: петролейный эфир (или иногда другой углеводород), хлороформ (или соответственно ди хлорметан) и спирт (лучше всего метанол или этанол). Для ли пофильных веществ пользуются смесью петролейного эфира и хлороформа, для полярных или среднеполярных веществ приме­ няют хлороформ с большим или меньшим количеством спирта.

Соответствующим подбором и регулированием полярности можно добиться того, чтобы вещества располагались на середине хрома тограммы, т. е. в местах с наибольшей делящей способностью.

При применении смеси хлороформ — спирт на хроматограмме иногда образуется несколько фронтов. Это приводит к неправиль­ ному разделению, что, как известно, наблюдается довольно часто в случае систем растворителей, компоненты которых различаются своей полярностью. Тогда рекомендуется пользоваться смесью бен­ зол — ацетон, у которых различия в полярности не столь ярко вы­ ражены. Для мало устойчивых веществ, когда применение хлоро­ форма может приводить к частичной деструкции, хлороформ мож­ но заменить эфиром, имеющим одинаковую элюирующую способность, или диоксаном, тетрагидрофураном и т. д.

В литературе часто упоминается смесь циклогексан — этилаце тат в различных соотношениях. Обычно эта смесь обладает хоро­ шей разделительной способностью. Однако необходимо пользо­ ваться тщательно очищенным этилацетатом, так как он не вполне устойчив (образование перекисей) и в случае нестойких веществ, какими являются, например, кортикоиды, приводит к разложению.

Пары родственных стероидов (5сс-насыщенные и 5р-насыщенные изомеры и т. п.) можно разделять повторным хроматографирова Специальная часть нием в смеси циклогексена и циклогексанона (9:1) или (8:2) [249].

Обнаружение. Известны многочисленные реактивы для обнару­ жения стероидов. Из неспецифичных это прежде всего кислоты, имеющие высокую чувствительность (в соединении с нагреванием хроматограммы до 100 °С). Удобно опрыскивать хроматограмму концентрированной или разбавленной серной кислотой, причем, как правило, образуются пятна характерной для отдельных типов сте­ роидных соединений окраски [82]. Различные окрашивания об­ разуются при опрыскивании хромовой смесью (Д66) [189];

в ли­ тературе также часто рекомендуется смесь ароматического альде­ гида (ванилина, анисового альдегида и др.) с серной кислотой (Д132,Д135) (например, [128]). Молибденовая кислота (Д 148) также является высокочувствительным реактивом, но, разумеется, все вещества образуют и пятна близкой окраски (от серо-синей до синей [297]). Часто применяют фосфорную кисло­ ту (Д119) и классические реактивы — хлориды сурьмы(Ш) (Д87а) и (V) (Д86), а также AsCl3 [296]. Обнаружением с по­ мощью паров иода пользуются в препаративной хроматографии и при количественном определении. Мнение о нежелательных необ­ ратимых изменениях некоторых веществ (например, эстрогенов) под действием иода по меньшей мере спорно [152, 205]. Ряд ве­ ществ различных типов можно также обнаруживать комплексны­ ми соединениями ртути (II) [171].

Из специфических реактивов следует упомянуть пары хлорида водорода, которыми в комбинации с исследованием слоя в ультра­ фиолетовом свете после определенного промежутка времени об­ наруживают 5-(и соответственно 4-) ненасыщенные Зр-стерины [105, 106]. Для идентификации стеринов пользуются также об­ разованием четвертичных пиридиниевых солей (Д 156) [168];

по­ мимо спиртовой гидроксильной группы так можно обнаружить и фенольный гидроксил и карбоксил, так как аминогруппа, эфирная и сложноэфирная группировки друг другу не мешают. Для обна­ ружения кетонов пользуются реактивом Циммермана (Д45) или 2,4-динитрофенилгидразином (Д 46а) [135]. Для кортикоидов с характерной а-кетольной группировкой пользуются известными из хроматографии на бумаге реактивами, а именно щелочным рас­ твором хлорида трифенилтетразолия (Д187) или тетразолиевым синим (Д185). Описано также применение реактива Циммермана совместно с тетразолиевым синим (Д186). Вещества с кетогруп пой в положении 17 реагируют быстро, а с кетогруппой в положе­ нии 3 или 20 нередко требуют повторного опрыскивания и нагре­ вания хроматограммы [224].

Для специфического обнаружения эстрогенов используют фе­ нольный гидроксил. Удобен реактив Фолина-Чокальте (Д75), смесь желтой кровяной соли и хлорида железа (III) (Д100а);

324 Специальная часть можно проводить азосочетание со стабильными солями диазония (Д 169) и т. д. [140]. Темно-синие пятна образуются при обна­ ружении фосфорномолибденовой кислотой с одновременным под щелачиванием соли (Д115) [85]. Целый ряд реактивов со ссыл­ ками на литературу перечисляется в обзоре Барона и сотр. [231];

особенно рекомендуется дихлорфлуоресцеин. Наиболее чувстви­ тельным является обнаружение смесью фенолсульфоновой и фос­ форной кислот (Д114). Обзор удобных способов обнаружения эстрогенов можно найти также в статье Лисбона и Дисфалуши [140].

Для обнаружения желчных кислот рекомендуется 8-окси-1,3,6 пирентрисульфокислота (Д82) [123] или смесь хлорида марганца и серной кислоты (Д91) [70]. Несколько сложнее обнаружение сульфатом церия — аммония [213]. В этой же работе автор приво­ дит описание большого числа других способов идентификации.

Для обнаружения холестерина и его эфиров удобен кислый раствор хлорида железа(III) (Д99) [142].

Для обнаружения стероидов в препаративных целях или при количественном определении (после извлечения из слоя) помимо иода и флуоресцентных индикаторов пользуются и другими спосо­ бами. Опрыскивание раствором примулина в водном ацетоне ре­ комендуется для слоев, содержащих гипс как связующее;

для слоев с крахмалом чувствительность меньше, в случае целлюлозы способ непригоден. При рассматривании еще влажных слоев в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм целый ряд ве­ ществ образует флуоресцирующие пятна на темном фоне. Если слой высох, его можно увлажнить, опрыскивая водным ацетоном для того, чтобы флуоресценция возобновилась [250]. Применяют также слои силикагеля с добавкой кислого сульфата аммония;

после нагревания в течение 15 мин при температуре 140 °С появ­ ляются пятна, по которым можно производить прямое спектроден ситометрическое определение (4-ненасыщенные 3-кетопроизвод ные — при длине волны 365 нм, холестановые производные — при 380 нм, эстрогены — при 340 и 370 нм) [223]. Удобна также ло­ кализация веществ с помощью красителей, причем окрашивание, указывая положение определяемого стероида, не мешает дальней­ шим операциям [155, 228].

5.5.2.1. Гестагены, противозачаточные средства В связи с возрастанием значения противозачаточных средств наблюдается и рост числа публикаций, посвященных их хромато графическому разделению в фармацевтических целях. Здесь мы упоминаем также о разделении некоторых веществ андростанового ряда, проявляющих гестагенную активность, и эстрогенов, состав­ ных частей многих противозачаточных препаратов.

Специальная часть & Таблица Значения hRF некоторых противозачаточных средств на силикагеле С7 а сз С С4 С С1 С Вещество 27 52 43 Мегестрол-ацетат 77 64 Этинодиол-диацетат 67 60 61 63 Этинилэстренол (линэстренол) 23 46 33 Этинилэстр адиол 55 65 61 Местранол 61 Диметистерон 63 Норэтинодрел 37 45 59 Норгестрел 47 72 28 30 Хлормадинон 29 Норэтистерон (норэтиндрон) 35 40 58 Норзтистерон-ацетат Суп ер лу тин Хлорсуперлутин Суперлутин-капронат Неолутин Прогестерон 17а-Ацетоксипрогестерон Силуфол.

Обозначения:

С1 этилацетат —' циклогексан — ацетон (25 : 75 : 10) [176];

С2 циклогексан — этилацетат (46:54) [176];

СЗ бензол — метанол ( 9 5 : 5 ) [194];

С4 бензол — ацетон ( 8 : 2 ) [194];

С5 хлороформ — метанол ( 9 : 1 ) [194];

С6 дихлорметан — метанол— вода ( 1 5 0 : 9 : 0, 5 ) [194];

С7 хлороформ — метилэтилкетон (92,5:7,5) [172].

Классические гестагены относятся к сравнительно простым, обладающим средней полярностью стероидам C2i прегнанового ря­ да;

они хорошо поддаются разделению методами хроматографии.

В настоящее время, однако, применяется много новых средств (главным образом 19-норстероидов), химически относящихся к андростанам. Кроме того, противозачаточные препараты нередко состоят из гестагенных и эстрогенных веществ в определенном со­ отношении, хотя все большее распространение приобретают про­ тивозачаточные средства на основе 19-норстероидов, в которых эстроген отсутствует. Вещества эти в большинстве случаев стой 326 Специальная часть ки, среднеполярны, и их хроматографическое разделение обычно несложно [298]. Значения IIRP важнейших из этих веществ при делении на силикагеле приведены в табл. 47. Некоторые противо­ зачаточные препараты, включая и андростановые производные, подвергали также разделению на кремнеземе, обработанном форм амидом [226]. Для разделения некоторых сложных композиций применяли двумерную хроматографию в первом направлении с си­ стемой СЗ и во втором — с системой С1 (табл. 47). Интересный случай качественного разделения некоторых смесей (главным об­ разом 16-ненасыщенных производных) заключается в двумерном хроматографировании — в первом направлении системой бензол — эфир (9:1) и во втором — бензол — метанол (9:1) [14]. Предме­ том работы Лисбона [138] явилась хроматография значительного числа веществ ряда прегнана. Многие вещества он подвергал раз­ делению на силикагеле, обработанном азотнокислым серебром, в системах этилацетат — циклогексан (иногда с добавлением неболь­ шого количества спирта), бензол — спирт и хлороформ — спирт.

Диокси- и триоксипроизводные можно разделять на силикагеле с борной кислотой, удобно — в форме изоникотингидразонов. Напри­ мер, в трудноделимой паре прегненолон—16-дегидропрегненолон первый образует изоникотингидразон, тогда как второй не реаги­ рует. Эпимерные 5-прегнен-Зр,20-диолы можно разделить только после действия 20|3-окси-оксидоредуктазы;

образующийся фермен­ тативным путем прегненолон далее легко отделяется от 20х-окси производного (см. также [299]). Изоникотингидразоны получают непосредственно на хроматографическом слое [136].

На стартовую зону шириной 1,5 см наносят каплями 0,5%-ный раствор изо никотингидразида в 10%-ной уксусной кислоте. После полного высыхания на стартовую линию наносят исследуемую смесь и оставляют на 1 ч при комнат­ ной температуре.

Количественный анализ противозачаточных препаратов обыч­ но выполняют спектрофотометрическим методом (за исключением норэтистерон-ацетата) [176] или полуколичественным сравнением размера пятен и интенсивности окрашивания [194]. При анализе этих препаратов комбинируют также методы ТСХ и ИК-спектро скопии [10]. Бичан-Фиштер [11, 12] анализировала масляные рас­ творы прогестерона.

Прогестерон снимают с пластинки, раствор центрифугируют от сорбента и прибавляют к нему приготовленный заранее (за 24 ч) изоникотингидразидный реактив (растворяют 0,4 г изоникотингид разида в метаноле, добавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и разбавляют до объема 100 мл метанолом). Спустя 1 ч измеряют поглощение при длине волны 380 нм и сравнивают со стандартным раствором;

содержание прогестерона рассчитывают из соотношения величин поглощения пробы и стандартного об­ разца.

Специальная часть Хорак [86] описывает определение 3-метилового эфира этинил эстрадиола (местранола) в присутствии 17х-ацетокси-16-метилен 4,6-прегнандиен-3,20-диона-(суперлутина) в чехословацком проти­ возачаточном препарате антигест.

Хроматографическое разделение проводят на незакрепленном слое силика геля в системе бензол — метилэтилкетон (1 : 1);

пробег растворителя 20 см.

Пятно местранола находится на расстоянии 60—100 мм от стартовой линии.

Поэтому, не проводя обнаружения, снимают с этого места силикагель и вещест­ во экстрагируют, взбалтывая силикагель в течение 30 мин со смесью хлоро­ форм— метанол — вода ( 5 : 4 : 1, 5 ). 2 мл вытяжки выпаривают досуха, остаток растворяют в 0,2 мл смеси метанол — хлороформ (1:1) и раствор смешивают с 8 мл смеси серной кислоты и метанола (2: 1). Спустя 60 мин измеряют погло • щение при длине волны 540 нм.

Флуориметрическое определение норгестрела описано в статье Каллена и сотр. [38].

5.6.2.2. Эстрогены Разделение главных эстрогенов, достаточно различающихся своей полярностью, легко осуществляется на наливных и насып­ ных слоях практически любого нейтрального или кислотного сор­ бента. Как можно видеть в табл. 48, значения IIRF подвергаемых разделению веществ, как правило, достаточно различаются. Боль­ шое число эстрогенов подвергали разделению Лисбон и Дисфалу ши [139], хотя их работа преследовала чисто синтетические цели.

Сёньи и сотр. [214, 301] разделяли эти вещества на силикагеле в системах циклогексан — хлороформ — уксусная кислота ( 7 : 2 : 1 ) или ( 2 : 2 : 1 ), гептан — ацетон (2:1), бензол — этанол (9:1) и бензол — афир (I : 1). Было описано получение дансильных произ­ водных эстрогенов и их хроматографирование в системе раствори­ телей хлороформ — этанол (95:5). Способ удобен для определе­ ния эстриола в моче беременных женщин [53]. Крокер и Лодж [36] рекомендуют для разделения эстрогенов силикагель, обра­ ботанный азотнокислым серебром, для которого наблюдается луч­ шее различие значений hRF, чем для необработанного сорбента.


На этом же сорбенте были разделены и сопряженные эстрогены, причем проводилось четырехкратное хроматографирование в сис­ теме изооктан — хлороформ — этанол (40:70:18) [37]. Захве и сотр. [179] анализировали масляные растворы эстрадиолбензоата.

Количественное определение эстрогенов также привлекло к се­ бе значительное внимание [300]. Для определения основных эст­ рогенов удобной оказывается спектрофотометрия после извлече­ ния вещества из слоя сорбента [175], а также фотоденситометрия после диазотирования эстрогена прямо на слое [220]. Колори­ метрически после реакции с серной кислотой (при 530 нм) опреде­ ляли этинилэстрадиол и его метиловый эфир (местранол) в лекар­ ственных препаратах [84]. Для обеспечения воспроизводимости результатов при денситометрическом определении веществ после Таблица Значения hRp некоторых эстрогенов сз в спв С12е С1 а С2 б С5 В С7 Г С10 в С4 В С6 В С8 Д С9В Эстроген 64 Эстрон 57 51 72 72 48 58 59 82 36 30 61 64 41 29 Эстрадиол 17 11 29 30 6 7 7 Эстриол Эквилин Эквиленин 37 46 Этинилэстр адиол 75 З-Метиловый эфир эстрона 74 72 З-Метиловый эфир эстрадиола 68 65 З-Метиловый эфир эстриола 28 17 Эстр адиолбензоат Эстр адиолпр опионат 17а-Эстриол 17а-Эстрадиол Местранол 67 Силикагель — окись алюминия.

Силикагель с крахмалом.

Силикагель гипсом.

г Полиамид.

д Силикагель, импрегнированный флуоресцеином.

е Силуфол.

Обозначения:

С6 этилацетат — циклогексан (1:1) [139];

С1 бензол — этанол (85:15) [50];

С7 хлороформ — бутанол (95 : 5) [225];

С2 бензол — этилацетат (1:1) [200];

С8 хлороформ — этанол (24: 1) ['175];

СЗ бензол — этанол (9:1) [210];

С9 хлороформ — ацетон (13: 1) i[©];

С4 этилацетат — циклогексан — абсолютный этанол (45 : 45 :10) СЮ динзопропиловый эфир — ацетон (4:1) [222];

[210];

СП хлороформ — уксусная кислота (10:1) [20];

С5 этилацетат — гексан (насыщенный водой) — абсолютный эта­ С12 хлороформ — метилэтилкетон (96:4) [172].

нол (85: 15: 15),[139];

Специальная часть реакции с фосфорномолибденовой кислотой Тачстон и сотр. [221] пользовались силикагелем, импрегнированным 10%-ной фосфор­ номолибденовой кислотой. После хроматографирования (которому не мешает импрегнирование) хроматограмму нагревали в течение 20 мин при температуре 110°С. Темплтон и сотр. [216] описали флуориметрическое определение местранола в таблетках. Кроль и сотр. [129] при определении свободных эстрогенов поступали следующим образом.

Для определения служили две одинаковые пластинки, которые по оконча­ нии хроматографирования высушивали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем проводили измерения в отраженном свете при длине волны 280 нм. Да­ лее первую хроматограмму опрыскивали 9 н. H 2 S0 4 (с последующим нагрева­ нием в течение 7 мин при температуре 125 °С) и накрывали стеклом. Вторую пластинку опрыскивали раствором фторбората д-нитробензолдиазония (500 мг в 100 мл 50%-ной уксусной кислоты). Для веществ первой хроматограммы изме­ ряли отражение при 360 и 550, нм и пропускание при 550 нм, для веществ второй хроматограммы — то и другое при 435 нм. Хроматографировали на си ликагеле в системе циклогексан — хлороформ — триэтиламин — коллидин (670 :

:280: 17:46) (процесс непрерывный). Применяется и многократное элюирование этой же системой в соотношении (66 : 29 : 2 : 3).

Штрук [210] описал количественное определение эстрогенов, основанное на измерении поглощения.

Хроматографическое разделение проводили на слоях приблизительно квад­ ратной формы. Перед работой пластинку промывали метанолом, высушивали и активировали нагреванием в течение 30 мин при температуре 100 °С;

при этом из слоя удалялись случайные мешающие вещества. Слой делили четырьмя про­ дольными надрезами на пять одинаковых частей. Смесь эстрогенов наносили на обе крайние полосы и на среднюю;

вторую и четвертую полосы оставляли пустыми для холостого опыта. Хроматографировали смесью бензол — этанол (9: 1). После высушивания три средние полосы прикрывали и обе крайние ча­ сти опрыскивали хлоридом сурьмы (V) (Д 86). Затем слой сушили 5—10 мин при температуре 100°С до появления пятен. С трех средних полос соскабливали зоны, соответствовавшие положению пятен на крайних полосах, и элюировали 3 мл 0,05 н. NaOH в 80%-ном этаноле. Силикагель отделяли центрифугировани­ ем и эстроген определяли спектрофотометрически при длине волны 242 нм.

Очень любопытный, хотя до настоящего времени и единствен­ ный пример количественного определения основан на измерении электропроводности диссоциирующих веществ [156].

Хроматографирование в потоке проводят в модифицированной BN-камере.

Слой размером 5X20 см разделяют надрезами на две полосы шириной 1 см.

Через отверстия в крышке к обеим зонам подводят две пары платиновых элект­ родов (диаметр 0,8 мм, расстояние между электродами 1 мм). Электроды могут двигаться вертикально в тефлоновых втулках в крышке. После нанесения пробы смеси на одну из зон (через другие отверстия в крышке камеры) проводят раз­ деление с помощью системы растворителей. Отдельные компоненты смеси разде­ ляются и постепенно перемещаются вдоль зоны к электроду. Левая полоса слу­ жит для проведения холостого опыта. Сопротивление обеих электродных пар выравнивают при помощи мостика Уитстона. В качестве растворителей удобны кетоны, имеющие сравнительно высокие дипольный момент и диэлектрическую проницаемость, например ацетон или метилизобутилкетон, насыщенный водой, и способствующие диссоциации эстрогенов. Как только отдельные вещества дости 22— 330 Специальная часть гают первой электродной пары, сразу происходит изменение электропроводности по сравнению с холостым опытом. Граница чувствительности — около 1 нг эст­ рогена.

Каммерль и Мучлер [263] определяли этинилэстрадиол в таб­ летках в смеси с мегестролацетатом или D-норгестрелем. Опреде­ ление этинилэстрадиола в форме дансильного производного осно­ вано на прямом измерении флуоресценции при длине волны 525 нм. Определение эстрогенов в таблетках изучал также Шре­ дер с сотр. [269].

5.5.2.3. Кортикоиды Хроматографии кортикоидов было уделено значительное вни­ мание, так как это фармакологически чрезвычайно важные веще­ ства, содержащиеся в ряде препаратов и имеющие широкое кли­ ническое применение. Кортикоиды — полярные соединения прег нанового ряда, и для их разделения в общих чертах характерно все то, что и для других прегнановых соединений;

однако необхо­ димо применять более полярные системы растворителей. Для раз­ деления кортикоидов пригодны слои сорбентов, импрегнированные антиоксидантами, например аскорбиновой кислотой [256], но при этом нельзя осуществить обнаружение в ультрафиолетовом свете.

Из данных табл. 49 следует, что для хорошего разделения целого ряда веществ следует использовать различные системы раствори­ телей на разных сорбентах. Лисбон [135] опубликовал обшир­ ную статью, посвященную Систематическому анализу смеси корти­ коидов и их производных. Анализ 34 веществ проводили в десяти системах растворителей, причем кетоны отделяли от соединений, не содержащих карбонильной группы, реактивом Жирара. Приме­ няли также повторное и двумерное проявление. Мак-Карти и сотр.

[150] подвергали разделению кортизон, кортизол (гидрокортизон), кортексолон и дезоксикортикостерон (ДОК) в системе хлоро­ форм— этанол — вода (92:8:0,5). Беннет и Хефтман [8] хромато графировали большое число кортикоидов на силикагеле, пользу­ ясь различными смесями хлороформа, метанола и воды. Пригодна также смесь этилацетат — хлороформ — вода (90:10:1). Раз­ деление производных прегнана, способных отщеплять формальде­ гид, составляет предмет статьи уже упомянутого автора [137].

Быстрый способ обнаружения преднизона и преднизолона в мас­ ляных растворах описан Нейнингером [157]. Растворы этих ве­ ществ после разбавления хлороформом в отношении (1 : 10) нано­ сили на пластинку и элюировали смесью бензол — ацетон (1:1).

Значение hRF преднизона составляло около 51, преднизолона 43, нейтральные триглицериды оставались на старте. Ваба и сотр.

[238] исследовали методом ТСХ деградацию дексаметазона в таб­ летках. Описан также анализ кортикоидных фосфатов в фарма Специальная часть цевтических препаратах [271]. Идентификация кортикоидов опи­ сана в статье [303].

Количественным определением кортикоидов занимались многие исследователи. В нашей лаборатории был испытан сравнительно простой метод, который авторы применили при анализе смесей пос­ ле микробиологических превращений и для анализа таблеток [193].

Калибровочную кривую строят обычным способом, нанося точно известные, постепенно возрастающие количества стандартного образца на хроматограмму, на крайних полосах оставляют место для холостого опыта. После хроматогра фического разделения вещества обнаруживают парами иода и после очерчива­ ния пятен дают иоду испариться. Вокруг каждого пятна подходящим предметом, например открытым концом пробирки, вырезают в слое сорбента кружки, ог­ раничивающие во всех случаях одинаковую площадь. Из крайних полос также вырезают кружки при тех же значениях RF, кбторые будут служить для холо­ стого опыта. Вырезанные кружки снимают шпателем с хроматограммы и элюи руют, как описано у Мэтьюза и сотр. |[149] —• всасыванием сорбента с веще­ ством в прибор, изображенный на рис. 58, и прокачиванием через сорбент около 8 мл полярного растворителя (лучше всего смеси хлороформа и метанола) пря­ мо в мерную колбу вместимостью 10 мл. Доливают растворителем до метки и с полученным раствором производят измерения — спектрофотометрические, ко­ лориметрические и т. д. Результаты сравнивают с данными холостого опыта.


Подобным же образом поступают и при анализе неизвестной пробы;

затем по калибровочной кривой определяют содержание вещества.

Растворы веществ наносят калиброванной пипеткой объемом около 0,01 мл, которую легко изготовить в лаборатории. Так как при нанесении раствора на слой известная часть его поднимается по стенкам капилляра, необходимо увлаж­ нить пипетку снаружи каплей растворителя.

Если имеется в распоряжении раствор определяемого вещества (чистого для анализа) известной концентрации, количественное определение можно вы­ полнить без калибровочной кривой. На пластинку наносят исследуемый и эта­ лонный растворы, каждый в трех частях, беря среднее из трех определений.

Концентрацию анализируемого вещества определяют из выражения cV _ xEx с *— VE ' где сх — концентрация анализируемого вещества в мг/мл, с — концентрация эта­ лонного раствора в мг/мл, Vx — объем раствора анализируемого вещества, V — объем эталонного раствора, Ех-—поглощение исследуемого раствора и Е — по­ глощение эталона.

Мэтьюз и сотр. [149] описали количественное колориметриче­ ское определение стероидных соединений после реакции с реакти­ вом Циммермана. Способ пригоден для стероидных кетонов раз­ личных типов, следовательно, не только для кортикоидов, но и для андрогенов и эстронов.

На хроматограмму наносят раствор 10, 50 и 100 мкг эталона и после элю ирования, локализации, вырезания и экстракции пятен к стероидному кетону, выделенному после выпаривания вытяжки, прибавляют 0,2 мл 2%-ного этаноль ного раствора ж-динитробензола и 0,2 мл 2,5 н. спиртового КОН. Смесь остав­ ляют на 1 ч в темноте при 25 °С, затем доводят до метки, проводят измерение, сравнивая с холостым опытом, и строят калибровочную кривую. Аналогично по­ ступают с анализируемыми пробами;

количество вещества в пробе определяют по калибровочной кривой.

22* Таблица Значения hRf некоторых кортикоидов сзв сюв спв С2 б С7 Г сэД С1 а С4В С5 В С6В С8В С12а Вещество 100 77 37 31 63 Кортексолон 182 54 ДОК-ацетат 13 23 58 18 42 23 Кортизол (гидрокортизон) 54 12 Эпикортизол 23 51 30 29 Кортизон Тетрагидрокортизол Тетрагидрокортизон 108 88 35 К.ортизол-21 -ацетат 86 26 19 39 Преднизон 9 12 Преднизолон 23 51 70 Кортикостерон 10 27 58 Альдостерон.;

32 Триамцинолон Медрон Дексаметазон ' Бетаметазон Флурандренолон Флур-андренолонацетонид Флурандренолонацетонид-21 -ацетат бр-Фтор-16а-оксикортизолацетонид 6а- Фтор -16а-оксикортизонацетонид-21 - ацетат 6а-Фтор-16а-оксикортизолацетонид Флуоцинолонацетонид 57 Параметазон-21 -ацетат Параметазон Пар аметазон-17а,21 -диацетат 6а- Фтор -16а-метилпреднизон-21 -ацетат Силуфол.

" Целит, обработанный формамидом.

Силикагель.

г Полиамид.

" Готовые слои силикагеля.

Обозначения:

С1 хлороформ — метанол (92: 8);

hRр отнеген к кортексолону [ С2 бензол — хлороформ (1 : 1) [226];

СЗ этилацетат — хлороформ — вода (90 : 10 : 1) [8];

С4 гептан — хлороформ — уксусная кислота (25 : 25 : 50) [223];

С5 толуол — этилацетат — этанол (60 : 35 : 5) [57];

С6 толуол — Р-этоксиэтилацетат ( 2 : 3 ) [57];

С7 дихлорметан [91];

С8 эфир, насыщенный водой, двукратное проявление [229];

С9 бензол — этилацетат (1 : 1) [19];

СЮ хлороформ — ацетон ( 7 : 3 ) [96];

СП этилпропионат, двукратное проявление [21];

С12 хлороформ — этанол — вода ( 9 2 : 8 : 0, 5 ) [172).

334 Специальная часть Другие исследователи определяли после экстракции из сорбен­ та бетаметазон и дексаметазон спектрофотометрическим [181], а кортикоиды — спектрофотометрическим или колориметрическим способом в дерматологических препаратах [133, 333]. Количест­ венное определение кортизола и его 21-ацетата в молоке проводи­ ли колориметрическим способом после реакции с фенилгидразином [153];

для экстракции молока пользовались смесью дихлор метана и гексана. Описано также полярографическое определе­ ние, при котором пятна веществ вместе с силикагелем, который не оказывает влияния, переносят в электролитические кюветы и после добавления этанола и буферного раствора производят из­ мерение [78]. Количественному колориметрическому определению кортикоидов на полиамиде посвящена статья Хубля [91]. По его способу хроматограмму опрыскивают тетразолиевым синим и под­ вергают действию паров хлористого водорода. Образующееся ок­ рашивание устойчиво в течение нескольких суток, и его интенсив­ ность удобно измерять как в отраженном, так и в проходящем свете. Известен также полуколичественный анализ флурандрено лонацетонида визуальным сравнением величины пятен [22]. Кам мерль и Мучлер [263] занимались определением преднизолона на силикагеле. Для хроматографического разделения служила систе­ ма этилацетат — циклогексан — этанол ( 4 : 4 : 2 ), а определение проводили прямыми измерениями при длине волны 248 нм.

В разд. 3.1.3 приведено подробное описание метода отделения неполярных примесей при определении малых количеств кортикои­ дов в плазме крови [268].

5.5.2.4. Андрогены и анаболические вещества Андрогены и анаболики относятся преимущественно к стеро­ идам Cig ряда андростана;

они сравнительно малополярны и до­ статочно стойки, поэтому их можно хроматографировать на всех обычных сорбентах, в том числе щелочных и кислотных. Значе­ ния hRF некоторых наиболее важных веществ этой группы приве­ дены в табл. 50.

Обширную статью о хроматографии 19-норстероидов, часть ко­ торых обладает анаболическим действием, опубликовали Голомб и Лейн [69]. Черри и Маффи [29] исследовали хроматографию нескольких фармацевтически важных андрогенов в таблетках и инъекционных растворах. Некоторые глюкурониды стероидных соединений, в том числе тестостерона, андростерона и 11-кетоан дростерона (значения HRF 66, 75 и 66, а также 35, 57 и 35 соответ­ ственно) были разделены на полиамиде в системах метанол — во­ да— муравьиная кислота (60:35:5) и этилформиат — метанол — вода — муравьиная кислота (50:20:25:5) [182]. Хакль [77] хро матографировал 2,4-динитрофенилгидразоны некоторых наиболее Специальная часть Таблица Значения hRp некоторых андрогенов и анаболиков сз в С4 а С4 Г С2 б С1 а Стероид Андростендиол Метиландростендиол Нортестостерон 30 70 Метилтестостерон Дигидротестостерон 77 Тестостеронпропионат 82 Тестостер онизобутир а т Нортестостеронфенилпропионат 92 Дегидроэпиандростеропацетат Нортестостеронацетат Дианабол (метандростенолон) 4-Андростен-3,17-диоп 79 Этинилтестостерон Силуфол.

Целит, обработанный формамидом. ' Силикагель с крахмалом.

Силперл.

Обозначения:

С1 хлороформ — метилэтилкетон (9:1) [172];

С2 гексан — бензол (1 : 1),[226];

СЗ этилацетат [200];

С4 хлороформ;

HR р отнесено к дегидроэпиандростеронацетату [95] важных 17-кетостероидов на силикагеле либо двукратным элюи рованием в системе эфир — петролейный эфир (7:3), либо дву­ мерным способом. Он пользовался также смесями хлороформа и ацетона в различных соотношениях. Эти же производные можно разделять и на полиамиде [165]. Тестостерон и эпитестостерон удалось полностью разделить пятикратным элюированием на си­ ликагеле системой растворителей дихлорметан — этилацетат (9:1) [174];

непрерывное или двумерное хроматографирование также приводит к хорошим результатам. Анализом некоторых стероидов анаболического действия занимался Грохульский [257] и другие [304, 305].

Лисбон и Гоффман [265] описали хроматографию некоторых трудноразделимых производных андростана. Им удалось добиться успешного разделения проточным способом;

они работали с пла 336 Специальная часть стинками, на конце которых находился толстый слой сорбента или металлический контейнер, наполненный сорбентом. Пригодными оказались системы циклогексан — этилацетат (1:1) (время элюи рования 120 мин), гексан — этилацетат (3:1) (90 мин), циклогек­ сан— этилацетат (4:1) (90 мин), бензол — этилацетат (1:1) (90 мин). Для разделения некоторых производных андростана применяли также кремнезем, обработанный формамидом [215].

Бичан-Фиштер [11, 12] количественно определяла тестостерон пропионат в масляных растворах колориметрически после реак­ ции с изоникотингидразидом и хлорной кислотой. Кавина и Мо ретти [28] описали количественное определение стероидов в мас­ ляных растворах проточным способом. Этим способом оказалось возможным отделить стероиды от главных составных частей мас­ ла, которые в противном случае мешают определению. Колори­ метрически можно определить тестостерон, 19-нортестостерон и другие вещества.

Масляный раствор для разжижения, и понижения концентрации стероидов разбавляют пентаном. После нанесения, разделения и обнаружения в ультра­ фиолетовом свете участки сорбента с пятнами соскребают, элюируют в делитель­ ной воронке с помощью 10 мл воды и водный слой четырежды извлекают пор­ циями по 5 мл хлороформа. После фильтрования через безводный сульфат нат­ рия раствор разбавляют до объема 25 мл. Отбирают 10 мл раствора и раство­ ритель упаривают в атмосфере азота в пробирках с делениями;

остатки раство­ ряют в 10 мл этанола и измеряют поглощение при 225—250 нм.

5.5.2.5. Стерины Хроматография стеринов для целей клинической биохимии под­ робно рассматривается в разд. 6.7.1. Здесь мы ограничиваемся лишь некоторыми общими сведениями, которые относятся к хро­ матографии этой липофильной группы стероидных соединений.

Стерины довольно чувствительны в растворах к окислению кислородом воздуха;

изучению продуктов, образующихся при ау тоокислении стеринов, посвящено несколько статей [87, 201].

В смесях стеринов, выделенных из природных материалов, очень часто присутствуют гомологи, для разделения которых обычная адсорбционная хроматография на силикагеле недостаточна. Хо­ рошего разделения смеси некоторых стеринов удалось добиться, пользуясь хроматографией с обращенными фазами. В качестве носителя применяли кремнезем, обработанный вазелиновым мас­ лом, подвижной фазой служила смесь ацетон — вода (4:1) [46].

Для хроматографии стеринов на силикагеле пригодны известные в хроматографии на бумаге системы Буша, например циклогек­ сан — толуол—метанол — вода или циклогексан — толуол — ук­ сусная кислота — вода и т. д. [241]. Многие авторы для разделе­ ния стеринов, различающихся степенью ненасыщенности, рекомен­ дуют сорбенты, обработанные азотнокислым серебром. Подготов Специальная часть ленный таким образом сорбент применяли для отделения витами­ на D от стеринов в системе хлороформ — ацетон (9:1) в инертной атмосфере [198] и при разделении ацетатов стеринов [234]. Поль­ зовались также окисью алюминия, обработанной азотнокислым серебром [112]. Холестерин и его эфиры можно хроматографиро вать на MgO в системе циклогексан — эфир — уксусная кислота (20 : 79,5 : 0,5) или (50 : 49,5 : 0,5) (значения tiRF некоторых стери­ нов: холестерин 51, стигмастерин 41, р-ситостерин 60, эргосте рин 27, кампестерин 55, лумистерин 15, ланостерин 75 (см. также [306, 307]). Для эфиров стеринов пригодны смесь петролейный эфир — ацетон (98 : 2) или четыреххлористый углерод. Этот способ авторы [113] применяли при анализе растительных масел после осаждения Зр-оксисоединений дигитонином. Слой окиси алюминия активировали нагреванием в течение 30 мин при температуре 130°С и помещали в эксикатор. Некоторые стерины в форме 3,5-динитробензоатов были разделены на смеси окиси магния и окиси алюминия с крахмалом с помощью клинового [87, 186] или непрерывного [186] элюирования. Беннет и Гефтман [9] также применяли непрерывный способ. Так как этот способ неудобен в случае систем, содержащих малые количества растворителя, бо­ лее летучего, чем главный (например, гексан — эфир), они поль­ зовались системами гексан — дихлорметан (3:7), дихлорметан — эфир (199:1) или бензол — метанол (399:1). Таким способом удобно делить и другие типы стероидных веществ. Некоторые ис­ следователи [245] делили трудноразделимые стерины с помощью хроматографии с программированной упругостью паров (разд. 3.1.9).

Количественное определение стеринов можно осуществить ден ситометрическим путем после реакции с ванилином и фосфорной кислотой [201] или спектрофотометрически при длине волны 318 нм после реакции с серной кислотой [ИЗ, 308]. Хорват [87] пользовался реакцией стеринов с хлоридом железа (III) в хлор­ ной и фосфорной кислотах и измерением поглощения при 450 нм.

Локвуд и сотр. 1[266] подвергали разделению стерины и сапогени ны из растительных экстрактов на силикагеле в системе гексан— ацетон (4:1);

значения hRp составляли для ланостерина, ситосте рина и диосгенина 53, 43 и 35 соответственно. После реакции с хлоридом сурьмы(III) (слой нагревали 8 мин при температуре 100°С) вещества определяли денситометрическим путем.

5.5.2.6. Желчные кислоты Желчные кислоты — сильнополярные стероидные соединения, обычно отличающиеся числом и положением гидроксильных групп.

Их удобнее всего хроматографировать в форме метиловых эфи­ ров. Подробное описание хроматографии желчных кислот будет приведено ниже (разд. 6.7.2).

338 Специальная часть Таблица Значения liRF некоторых желчных кислот сзб С1а С2б С4б Кисл ота 21 Литохолевая 39 Гиодезоксихолевая 53 67. 51 Хенодезоксихолевая 71 Дезоксихолевая Гиохолевая 88 Холевая Уродезоксихолевая Дегидрохолевая 0 Таурохолевая Гликохолевая 44 • Аллохолевая а Полиамид с крахмалом, разделение на клиновидном слое.

Силикагель.

Обозначения:

С1 вода — м.тилэтилкетон — 25%-ный аммиак (80 : 20 : 5) [63];

С2 изооктан — диизопропиловый эфир — уксусная кислота — пропанол-2 ( 2 : 1 : 1 : 1 ) [71];

СЗ система G2 в отношении (10 : 5 : 6 : 1) [75];

С4 бутанол — уксусная ки-слота — вода ( 1 7 : 2 : 1) [130].

Из табл. 51 можно видеть, что желчные кислоты удобно де­ лить на силикагеле и полиамиде;

на силикагеле можно также хро матографировать сопряженные кислоты [71, 130, 211, 309]. Суб биах и Куксис [211] рекомендуют щелочные проявляющие систе­ мы (например, хлороформ — метанол — аммиак), однако, по-види­ мому, этот способ не имеет никаких особых преимуществ. Другие исследователи [212] для разделения трудноделящейся пары дезок­ сихолевая кислота — хенодезоксихолевая кислота пользовались системой изооктан — этилацетат — уксусная кислота-—бутанол (10:5:1,5:1,5). Количественное определение желчных кислот можно осуществить прямой денситометрией после реакции с фос­ форной кислотой [187, 206]. ц Хуан и Николе [258, 259] подвергали разделению свободные и II сопряженные холевые кислоты на силикагеле в системе изооктан— | диизопропиловый эфир — уксусная кислота — вода ( 1 0 : 5 : 5 : 3 ) ;

]] значения hRF этих кислот составляли для холевой, хенодезоксихо- | левой, дезоксихолевой и литохолевой 12, 27, 37 и 50 соответствен- м но;

значения hRF метиловых эфиров этих кислот— 18, 34, 39 и соответственно;

при делении в системе хлороформ — метанол — во Специальная часть да (70:25: 3) значения HRF этих кислот были для холевой, хено дезоксихолевой, литохолевой, дезоксихолевой 38, 53, 75 и 86 со­ ответственно. При разделении сопряженных кислот пользовались системой изооктан — диизопропиловый эфир — уксусная кислота — н-бутанол — пропанол-2 — вода ( 1 0 : 5 : 5 : 3 : 6 : 1 ). Другие авторы [261] хроматографировали свободные и сопряженные желчные кислоты на силикагеле G или силикагеле Н с двумерным разделе­ нием— в первом направлении в системе хлороформ — этанол — 28%-ный аммиак (25:3:1) и во втором — хлороформ — этанол — этилацетат — уксусная кислота — вода ( 8 : 6 : 5 : 4 : 1 ). Разделение, однако, не было вполне удовлетворительным.

5.5.3. Тиреостатики и гормоны щитовидной железы Тиреостатики — лекарственные вещества, ослабляющие синтез тироксина в щитовидной железе. К веществам, обладающим по­ добным действием, относятся тиоурацилы, 3,5-дииодтирозин, ами нотиазолы и меркаптоимидазолы. Чаще всего в качестве тиреоста тика применяется 4-метил-2-тиоурацил. Разделением веществ этой группы методом ТСХ занимались лишь немногие авторы.

Сорбенты. При разделении тиреостатиков тироксина и иодти розинов пользовались слоями силикагеля G [66, 146, 191, 192, 239].

Шталь и Пфайфле [204] хроматографировали эти вещества на слоях силикагеля с крахмалом в качестве связующего. Бергер и сотр. [254] делили их на комбинированных слоях с узкой полос­ кой, наполненной хлоридом серебра, и покрытых анионитом дау экс 1;

Грис и сотр. [72] пользовались слоями целлюлозы.

Системы, растворителей. Для разделения 2-тиоурацила, 3,5-ди иод-ь-тирозина, D-тироксина и ь-тироксина, а также 2-меркапто бензимидазола пользовались системами н-бутанол — метанол—5 н.

аммиак ( 6 : 2 : 2 ), хлороформ—ацетон — н-бутанол—5 н. NH4OH— метанол (20 : 12 : 20 : 18 : 20) и циклогексан — ацетон — пиридин (4:5:1) [66]. Для разделения дииод- и трииодтиронина пользо­ вались системой н-бутанол — метанол — 5 н. аммиак ( 1 : 4 : 1 ) [192]. Эта система оказалась пригодной и для разделения 3,5,3' трииодтиронина и тироксина, хотя в этом случае более удобна система ацетон — метиловый эфир n-оксибензойной кислоты — 1 н.

аммиак (16:1:3). Другие исследователи рекомендуют систему уксусная кислота — бензол — ксилол ( 3 : 1 : 1 ) главным образом для разделения дииодтирозина и дииодтиронина, систему аце­ тон— фенол — 1 н. аммиак ( 7 : 2 : 1 ) в атмосфере аммиака — для деления дииодтиронина и трииодтиронина. Массалья и Роза [146] подвергали разделению тироксин и моно- и дииодпроизводные ти ронина в системе уксусная кислота — н-бутанол — вода (1:4:5) (см. также работу [310]).

340 Специальная часть Таблица Значения hRp некоторых тиреостатиков в различных системах растворителей [66] Значения hR „ в различных системах Вещество С2 СЗ С 37 3,5-Дииод-Ь-тирозин 50 2-Тиоурацил Трииодтиронин [2] 50 — — 0,Ь-Тироксин 2-Меркаптобензимидазол 72 Дииодтиронин 75 — — Обозначения:

С! к-бутанол — метанол — 5 н. аммиак (3:1 : 1);

С2 хлороформ — ацетон — к-бутанол — метанол — 5 н. аммиак (20 : 12 : 20 : 20 : 18);

СЗ циклогексан — ацетон — пиридин ( 4 : 5 : 1 ).

Обнаружение. Тиреостатики можно обнаруживать реактивом Драгендорфа (Д53), раствором родамина В (Д 175) и раствором иодоплатината калия (Д 109). Их можно также наблюдать в ульт­ рафиолетовом свете (при применении флуоресцентных слоев) в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне [204]. Для обнару­ жения их пользуются также раствором нингидрина (Д152) [146].

Применение. Вещества этой группы выделяли из смесей ле­ карственных средств и из различных комбинаций (табл. 52). Тон­ кослойной хроматографией пользовались для обнаружения этих веществ в моче пациентов при диагностике гиперфункции щитовид­ ной железы [191], а также для идентификации их в плазме крови человека [243].

ЛИТЕРАТУРА | 1. Adamski R., Dobrucki R., Acta Pol. pharm., 25, 307 (1968).

2. Ames S. R., J. Assoc. Offic. Analyt. Chem., 49, 1071 (1966).

3. Attal J., Hendeles S. M., Engels J. A., Eik-Nes К. В., J. Chromatogr., 1967, 27, 167.

4. Azerad R., Bleiler-Hill R., Lederer E., Biochem. biophys. Rev. Commun., 19, 194 (1965).

5. Azerad R., Cyrot M. 0., Biochemie, 55, 591 (1973).

6. Barany Z., Szasz G., Vegh A., Acta pharm. hung, 42, 122 (1972).

7. Barton G. M., J. Chromatogr., 20, 189 (1965).

8. Bennett R. D., Heftmann E., J. Chromatogr., 9, 348 (1962).

9. Bennett R. D., Heftmann E., J. Chromatogr., 21, 488 (1966). • •• 10. Beyermann K-, Roder E., Z. analyt. Chem., 230, 347 (1967)..• 11. Bican-Fister Т., J. Chromatogr., 22, 465 (1966).

12. Bican-Fister Т., J. pharm. Sci., 57, 169 (1968).

Специальная часть 13. Bican-Fister Т., Brazin V., J. Chromatogr., 77, 389 (1973).

14. Bicknell D. C, Gower D. В., J. Chromatogr., 61, 358 (1971).

15. Bieri J. C, Poukka K., Prival E. L., J. Lipid Res., 11, 118 (1970).

16. Bieri J. G., Prival E. L., Proc. Soc. Exp. Biol., 120, 554 (1965).



Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.