авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO FARMACII A V ...»

-- [ Страница 16 ] --

Расчет повышенных количеств мочевинного азота. Вследствие того что опи­ санными реактивными бумажками можно определить значения не более 75 мг— % мочевинного азота (что соответствует около 160,5 мг—% мочевины), патоло­ гическую сыворотку необходимо разбавлять. Для разбавления удобно пользо­ ваться заранее определенными нормальными сыворотками или эталонными и контрольными сыворотками (версатол и др.). В этом случае исследуемый мате­ риал разбавляют, например, версатолом в отношении 1 : 4 ( 1 часть исследуемой пробы и 3 части версатола). К пробе прибавляют 0,2 мл разбавленной сыворот­ ки и рассчитывают следующим образом:

количество азота в исследуемой сыворотке =1количество азота мочевины в разбавленной сывороткеХполный объем пробы —мочевинный, азот версатолаХобъем взятого версатола Пример. Высота окрашенной зоны для исследуемой сыворотки, разбавленной версатолом в отношении 1 : 4, составила 5 мм. Содержание азота в версатоле 15 мг— %.

Мочевинный азот разбавленной сыворотки = = 5 мм (высота окрашенной зоны)Х5 мг—%-fl0 мг—%=35 мг—%.

Мочевинный азот исследуемой сыворотки = =35 мг—% (азот разбавленном сыворотки) Х4 (объемная доля в смеси) — 15 мг—% (азот в версатоле) ХЗ (объемная доля версатола) =95 мг—%.

Примечания. Для получения воспроизводимых результатов необходимо при­ держиваться следующих условий:

J. Реактивные бумажки сохраняют в сухом месте при температуре 0—5"С.

Перед употреблением необходимо довести их до комнатной температуры. Надо предохранять реактивные бумажки от действия аммиака или других химических испарений. Не следует излишне подвергать действию прямого освещения.

•• 2- При введении исследуемой сыворотки пипеткой в пробирку не следует касаться стенок, 'так как попадание сыворотки сбоку на бумажку будет иска­ жать результаты анализа.

3. Индикаторную зону нельзя трогать руками.

4v Время проявления (30 мин) необходимо выдерживать точно, иначе ок­ рашенная в синий цвет зона распространится выше. ' B02 Специальная часть На этом же принципе основывается определение мочевинного азота индикаторными бумажками, выпускаемыми фирмой Merck под названием Merckognost Hamstoff [32]. В отличие от выше­ описанного способа эти бумажки следует хранить в специальных камерах из пластических масс;

результат определения отсчиты вается прямо на реактивной бумажке (не требуется шаблон для отсчета), и ход проведения опыта несколько другой. Определение можно производить не только в сыворотке и моче, но и в цельной крови.

Круговая хроматография катехоламинов по Кэзеру [[И] Приготовление слоя. Слой готовят из микрокристаллической целлюлозы обычным способом.

Подготовка пробы. К 10 мл мочи, подкисленной хлорной кислотой до рН 1— 2, приливают 0,5 мл 1%-ного раствора метабисуЛырита натрия и 0,5 мл 0,2 М раствора ЭДТА. Затем 0,5 н. раствором КгСОз устанавливают рН 8,7. После добавления 0,5 г AI2O3 смесь перемешивают 10 мин и центрифугируют. Жид­ кость сливают, осадок промывают ЗХЮ мл раствора, содержащего 1% КНСОз, 0,01% Na2Ss08 и 0,002 М ЭДТА. Добавляя 5 н. К2С03, устанавливают рН 8, и трижды экстрагируют по 7 мл 0,5 н.уксусной кислоты. Соединенные вытяжки выпаривают при 37 С и остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды.

Хроматографирование. После нанесения образца (20 мкл) хроматографи руют в течение 3—4 ч при комнатной температуре смесью н-бутанол — уксус­ ная кислота-^вода (4:1:1).

Обнаружение. Высушенную хроматограмму опрыскивают раствором этилен диамина и красной кровяной соли (Д67),[27] и нагревают 30 мин при 50 °С;

флуоресцирующие пятна наблюдают при 366 им (табл. 93).

Таблица Значения hRF и цвета флуоресценции катехоламинов [8] hRp Флуоресценция Вещество 26 Светло-желтая ДОФА Норэпинефрин (норадреналин) 33 Желтая Эпинефрин (адреналин) 40 Желто-коричневая Дофамин 42 Светло-желтая 3,4-Диоксифенилуксусная кис-i 81 То же лота ЛИТЕРАТУРА 1. Biserte G., Han К., Paysant P., Boulanger P., Clin. chim. Acta, 8, (1963).

2. Braun L., Biochem. Z., 339, 8 (1963). ' 3. Brenner M., Niederwieser A., Experientia, 16, 378 (1960).

4. Brenner M., Niederwieser A., Pataki G., Fahmy A. R., Experientia, 18, (1962).

.'*»

Специальная часть 5. Ersser R. S., Seakins J. W., Nature, 223, 1388 (1969).

6. Ersser R. S., J. Med. Lab. Technol., 27, 142 (1970).

7. Fahmy A. R., Niederwieser A., Pataki G., Brenner M., Helv. chim. Acta, 44, 2022 (1961).

8. Gries G., Pfeifer K. N.. Zappfi E. h, Klin. Wschr., 43, 514 (1965).

9. Heathcote J. G., Davies D. M., Haworth C, J. Chromatogr., 60, 103 (1971).

10. Humbel R., Marsault G., J. Chromatogr., 79, 347 (1973).

11. Kaser H., J. Chromatogr., 82, 127 (1973).

12. Keller M„ Pataki G., Helv. chim. Acta, 46, 1687 (1963).

13. Massaglia A., Rosa U., J. Chromatogr., 14, 516 (1964). * 14. Opienska-Blaut J., неопубликованные данные.

15. Opienska-Klaut J., Kraczkowski M., Brzuszkiewicz #., Zagorski 1., J. Chroma fogr., 17, 288 (1965).

16. Pataki G., Keller M., Z. klin. Chem., 1, 157 (1963).

17. Pataki G., Keller M., Helv. chim. Acta, 47, 787 (1964).

18. Relvas M. A., Clin. chim. Acta, 8, 12, 533 (1963).

19. Rink M., Geht A., J. Chromatogr., 18, 240 (1965).

20. Rink M., Gehl A., J. Chromatogr., 24, 220 (1966).

21. Rink M., Krebber D., J. Chromatogr., 25, 80 (1966).

22. Rokkonen Т., Scand. J. clin. Lab. Invest., 16, 149 (1964).

23. Rosmus J., Deyl Z., Chromatogr. Rev., 13, 163 (1971).

24. Rosmus J., Deyl Z., Chromatogr. Rev., 16, 221 (1972).

25. Setter N., Wieckmann J., Experientia, 20, 559 (1964).

26. Seiler N., Wieckmann J., Experientia, 21, 203 (1965).

27. Takahashi S., Gjessing L. R., Clin. chim. Acta, 36, 369 (1972).

28. Von Arx E., Neher R., J. Chromatogr., 12, 329 (1963).

29. Walsh M. P., Clin. chim. Acta, 11, 263 (1965).

30. Walz )., Fahmy A. R., Pataki G., Niederwieser A., Brenner M., Experientia, 19, 213 (1963).

31. Urastrat-Teststreifen zur quantitativen enzymatischen Bestimmung des Harns toffes in Serum. Godecke A. G., Berlin, 1973. (Реактивные бумажки Urastrat для количественного ферментативного определения мочевины в сыворотке, фирма Godecke, Берлин.) 32. Merckognost Harnstoff zur Harnstoffbestimmung in Vollblut, Serum und Plasma. E. Merck, Darmstadt 1973. (Merkognost, бумага для определения мочевины в цельной крови, фирма Merck, Дармштадт.) ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 33. Berry Н. К, J. Chromatogr., 56, 316 (1971).

34. Bremer J. П., Marx D., Niitzennadel W., Bickel H., Klin. Wochenschr., 11, 682 (1970).

35. Byrd D. ]., Kochen W., Idzko D., Knorr П., Л. Chromatogr., 94, 85 (1974).

36. Fleisher J. H., Russell D. M., J. Chromatogr., 110, 335 (1975).

37. Geisler H. E., Mutschler E., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 12, 151 (1974).

' 38. Giguere R., Shapcott D., Lemieux В., J. Chromatogr., 95, 122 (1974).

39. Heby 0., Anderson G., J. Chromatogr. Biomed. App., 145, 73 (1978).

40. Kochen W., Byrd D. J., Buhner R., Buhrlen E., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 13, 1 (1975).

41. Kraffczyk F., Helger R., Lang H., Clin. Chim. Acta, 31, 489 (1971).

42. Matsushita K, Gjessing L. R., J. Chromatogr., 162, 427 (1979).

43. Mehta M. C., Saini A. S., J. Chromatogr., 96, 148 (1974).

44. Rose H. J., Jenz I., Z. med. Labortechn., 13, 197 (1972).

45. Saunders R. A., Powell S., J. Chromatogr., 97, 284 (1974).

46. Setter N.. J. Chromatogr. Biomed. App., 143, 221 (1977) 47. Schon R., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 14, 501 (1976).

48. Schwartzmann R. M., Halliwell R. E. W., J. Chromatogr., 115, 129 (1975) 504 Специальная часть 49. Slingsby J. M., Boulton A. A., J. Chromatogr., 123, 51 (1976).

50. Trefz F. К- Byrd D. J., Kochen W., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 14, (1976).

51. Volkl A., BerUt H. H., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15, 267 (1977).

6.3. Нуклеиновые кислоты и их составные части В настоящее время тонкослойная хроматография представляет собой адинстзеиный метод, позволяющий установить весь спектр дуринов, пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотиДОв и надежно раз­ делить самые сложные смеси этих соединений в вытяжках из био­ логических материалов, когда в распоряжении имеется лишь не­ значительное количество материала. Этот метод оказался незаме­ нимым при исследовании строения нуклеиновых кислот.

В качестве носителя пользуются как неорганическими матери­ алами (оиликагель G и окись алюмнниясдобавлением гипса),так и в значительно большей степени порошкообразной целлюлозой и модифицированными целлюлозосодержащими носителями на ос­ нове анионитов, например ECTEOLA-, DEAE-, PEI- и QAE-целлю лозы, или катионитов, например Р-, СМ- и РР-целлюлозы.

Для разделения монануклеотидов и олигонуклеотидов Ранде рат [4—61 пользовался PEI-целлюлозой.

На ECTEOLA-целлюлозе подвергали разделению пуриновые аналоги производных нуклеиновых кислот [12], на РЕ1-целлюло зе — пуриновые нуклеозиды и нуклеотиды [15, 16], на слоях цел­ люлозы — мононуклеотиды РНК [13], на целлюлозе и силикаге ле — метилированные нуклеозиды РНК [14].

Принятые сокращения: ECTEOLA-целлюлоза — анионит, полу­ ченный в результате реакции целлюлозы с эпихлоргидрином и триэтаноламином;

DEAE-целлюлоза — диэтиламиноэтилцеллюло за;

целлюлоза Р — фосфат целлюлозы;

PEI-целлюлоза — целлю­ лоза, обработанная полиэтиленимином;

СМ-целлюлоза — карбок симетилцеллюлоза;

РР-целлюлоза — целлюлоза, содержащая по­ лифосфат;

QAE-целлюлоза — целлюлоза, содержащая четвертич­ ные аммониевые группы.

Двумерная хроматография нуклеотидов [7, 8] Приготовление слоя. 30 г порошкообразной целлюлозы гомогенизуют в 200 мл 1%-ного диализованного раствора лолиэтиленнмина в течение 30 с.

Слои (10X20 или 20X20 см), приготовленные обычным способом, сушат в те­ чение ночи при комнатной температуре. Перед собственно хроматографировани ем слой элюируют 10%-ным раствором NaCl до расстояния 5 см н затем сразу дистиллированной водой до верхнего края пластинки. После высушивания в токе холодного воздуха' промывание водой повторяют еще раз. После повтор­ ной сушки при комнатной температуре (12—15 ч) пластинки готовы для хро матографирования.

Пластинки могут сохраняться без видимых изменений в темноте на холоду {0—4 °С) в течение нескольких месяцев. Суспензии целлюлозы в растворе по Специальная часть Cmapm Рис. 91, Двумерная хроматография нуклеотидов [7, 8].

Сорбент: PEI-целлюлоза;

системы: первое направление — градиентное проявление раство­ ром LiCl, второе направление — градиентное проявление формиатным буфером (см. текст);

обнаружение: в ультрафиолетовом свете.

/ — цитидин-5'-фосфат (ЦМФ);

2 — аденозин-5'-фосфат (АМФ);

3 — уридин-5'-фосфат (УМФ) 4 — цитидиндифосфат-глкжоза (ЦДФГ);

5 — уридиндифоофат-Ы-ацетилглюкозамин (УДФАГ) 6 — аденозиндифосфат-глюкоза (АДФГ);

7 — уридиндифосфат-глкжоза (УДФГ);

8 — инозин S'-фосфат (ИМФ);

9 — гуанозик-5'-фосфат (ГМФ);

10 — гуанозиндифосфат-манноза (ГДФМ) //— цитидиндифоофат (ЦДФ);

12 — аденозиндифосфат (АДФ);

13 — уридиндифосфат (УДФ);

14 - инозиндифосфат (ИДФ);

15 - гуанозиндифосфат (ГДФ);

16 - уридиндифосфат-глюку роновая кислота (УДФГК);

/7 — цитидинтрифосфат (ЦТФ);

IS — уридинтрифосфат (УТФ) 19 - аденозинтрифосфат (АТФ);

20 - инозинтрифосфат (ИТФ);

21 - гуанозинтрифосфат (ГГФ).

лиэтнленимина и приготовленные ил них слон при комнатной температуре срав­ нительно малостойки. На слоях торговых сортов PEI-целлюлозы получается другая картина разделения.

Приготовление проб. Исследуемый образец нередко может содержать зна­ чительное количество солей, неблагоприятно влияющих на разделение. Боль­ шую часть солей удается удалить погружением хроматограммы с нанесенными пробами на 10 мин в безводный метанол, причем свыше 90% нуклеотидов оста­ ется на месте нанесения. После высушивания можно хроматографировать.

Хроматографирование. Пробы наносят на старт, отстоящий от края пластин­ ки на 3 см, и после сушки в течение 3 мин в токе прохладного воздуха прояв­ ляют в направлении, перпендикулярном направлению накатки слоя. В первом направлении хроматографируют сначала 2 мин в 0,2 М LiCl, затем 6 мин в 1 М 33- 506 Специальная часть LiCl и, наконец, в 1,6 М LiCl до предварительно намеченного расстояния 13 см от старта. Хроматограмму сушат при температуре около 50 °С в токе теплого воздуха. После просмотра в ультрафиолетовом свете удаляют часть слоя в тех местах, где разделения не прошло (рис. 91, заштрихованная полоса), и пластин­ ку погружают на 15 мин в 1000 мл безводного метанола для удаления LiCl, который может оказать помехи при хроматографировании во втором направле­ нии. После сушки на воздухе пластинку выдерживают 30 с в 0,5 М, 2 мин в 2 М и, наконец, в 4 М формиатном буфере рН 3,4, до подъема раствора на расстояние 15 см. После высушивания на воздухе просматривают в ультрафио­ летовом свете.

Если необходимо идентифицировать неизвестный нуклеотид, к анализируе­ мому образцу добавляют такое количество эталонной смеси, чтобы ее состав­ ные части едва просматривались;

тогда неизвестное вещество проявится благо­ даря своей повышенной интенсивности по сравнению с прочими веществами.

Для того чтобы отличить гуаниновые нуклеотиды, хроматограмму следует подвергнуть в течение нескольких минут действию газообразного хлорида водо­ рода. После такой обработки они обнаруживают в ультрафиолетовом свете яр­ ко-голубую флуоресценцию, тогда как производные аденина, гипоксантина, ци тозина и урацила наблюдаются в виде темно-синих пятен.

Чувствительность определения очень высока;

легко удается идентифициро­ вать 0,15—1,2 мкг нуклеотидов. Для разделения больших количеств нуклеоти дов рекомендуются слои толщиной 1—1,5 мм.

Для разделения нуклеотидов и, фосфатов углеводов Дитрих и сотр. [2] пользовались слоями из порошкообразной ECTEOLA целлюлозы (2 г просеянного порошка сильно взбалтывают с 18 мл 0,004Мэтилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,0, в течение мин). Суспензию наносят на пластинку размером 20X20 см. После сушки в течение ночи при комнатной температуре слой опрыскива­ ют 0,1 М раствором тетрабората аммония, рН 9, и сушат в тече­ ние 3G мин при 50"С. После нанесения проб на стартовую линию Таблица Значения hRP нуклеотидов в системе ECTEOLA-целлюлоза — 95%-ный этанол —0,1 М тетраборат аммония, рН 9,0, (3:2) [2] hRF hRF Вещество8 Вещество* ТДФ-глюкоза УТФ 82 УДФ-ацетилглюкозамин УДФ УДФ-глюкоза УМФ АТФ УДФ-галактоза АДФ-глюкоза 61 АДФ АМФ АДФ-манноза 50 ТМФ АДФ-галактоза 40 НО АДФ-глицериновая кислота Неорганический фосфор Расшифровку сокращений си. в подписи к рис. 91.

Специальная часть Таблица Значения hRF нуклеотидов и нуклеозидов [1] и Вещество Вещество I I II 66 32 2-Дезоксйцитидин Аденозин-2'-фосфат 5'-фосфат. 59 Аденозин-З'-фосфат Тимидин-5'-фосфат 47 Гуанозин-2'-фосфат Аденозин Гуанозин-З'-фосфат 29 Гуанозин Цитидин-2'-фосфат Цитидин Цитидин-З'-фосфат Уридин Уридин-2'-фосфат 2-Дезоксиаденозин Уридин-З'-фосфат 2-Дезоксйгуанозин 2-Дезоксиаденозин 5'-фосфат 69 28 2-Дезоксицитидин 2-Дезоксигуанозин- Тимидин 5'-фосфат 36 г I изомасляная кислота — раствор аммиака (уд. масса 0,90 Г")—вода (66:2:32);

II 0,005 н. HCI.

на расстоянии 3 см от края пластинки хроматографируют в смеси 95%-ный этанол — 0,1 М тетраборат аммония, рН 9,0 ( 3 : 2 ). Как только фронт" растворителя достигнет верхнего края пластинки, хроматограмму просматривают в ультрафиолетовом свете (табл.

94).

Способ, предложенный Коффи и Ньюбургом [1], позволяет успешно разделять 2'- и З'-фосфаты четырех главных нуклеотидов, образующихся при щелочном гидролизе рибонуклеиновой кисло­ ты, и 5'-фосфаты четырех главных нуклеотидов, содержащихся в ферментативном гидролизате дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Слои для этой цели готовят из суспензии 9,5 г 300 G DEAE цвллюлозы (содержащей 10% CaS0 4 - 0,5 Н 2 0) в 62 мл воды.

Сушка при температуре 50 °С длится 2 ч. Образцы наносят на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Нуклеотиды раство­ ряют в 0,1 н. растворе аммиака, нуклеозиды — в нейтральных растворах, пурины и пиримидиновые основания—в 0,1 н. НС1.

Наилучшее взаимное разделение рибонуклеотидов было до­ стигнуто в смеси изомасляная кислота — NH4OH (уд. масса 0,90)—вода ( 6 6 : 2 : 3 2 ), изомерные мононуклеотиды хорошо раз­ делились в 0,005 н. Н О. Для дезоксирибомононуклеотидов, как и для рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов, подходит первая 33* 508 Специальная часть Таблица Значения hRr свободных оснований [1] н Вещество • I И Вещество I 68 13 Урацил Аденин 54 Гуанин 40 Тимин Цитозин 90 •..

I насыщенный раствор (NH,hSO — 1 М ацетат натрия (рН 7,5) — пропанол-2 (80 : 18 : Z);

II 0,005 н. HCI.

| — * — смесь (табл. 95). Для разделения свободных оснований удобна система насыщенный раствор сульфата аммония — 1М ацетат натрия (рН 7,5)—пропанол-2 (80: 18:2). Для разделения пйри мидиновых оснований цитозина и тимина, которые в этой системе обладают почти одинаковыми значениями hRp, следует пользо­ ваться 0,005 н. НС1 (табл. 96).

Тиминовые нуклеопроизводные исследовал Баудендистель с сотр. [10], основания в нуклеиновых кислотах — Томат [17]. Ме­ тод определения пуриновых оснований в моче предложил Браун [П] Количественная двумерная хроматография составных частей ДНК[3] Приготовление слоя. Порошок целлюлозы, содержащий гипс (Excorna Zel lulosepulver), наносят на стеклянные пластинки размером 20X20 см. После Высушивания в течение 30 мин при комнатной температуре и 30 мин при тем­ пературе 105 *С пластинки сохраняют в эксикаторе над безводным СаС1г.

Хроматографирование. После нанесения проб перед собственно хроматогра фированием пластинку выдерживают 60 мин в камере, насыщенной парами сме­ си «-бутанол — вода— 90%-ная муравьиная кислота -(6:3:0,1);

нижний слой служит для насыщения камеры, верхний —для разделения. Хроматографирова­ ние в первом направлении заканчивается через 2—2,5 ч, и после кратковремен­ ной сушки во втором направлении пропускают смесь н-бутанол — этанол — 5 н.

НО (3:2:2). Другой удобной комбинацией является хроматографирование в первом направлении последней омесью и смесью я-бутанол — ацетон — уксусная кислота — 5% -ный NH«OH —вода (3,5:2,5:1,5:1,5:1) во втором направлении.

Открытие и количественное определение. После обнаружения в ультрафио­ летовом свете участки сорбента с пятнами вырезают и элюируют при комнат­ ной температуре в течение 16 ч 0,1 н. НС1, периодически взбалтывая. После фильтрования, проводят спектрофотометрическое определение. Для холостого опыта служит элюат из равновеликих по площади участков сорбента.

Разделение пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеозидов по Тортолани и Колози 1[9] Приготовление слоя. 16 г тонкодисперсиогл сефадекса G-10 (Pharmacia) и 4 г силикагеля GFSM (Merck) или микрокристаллической целлюлозы (Merck) несколько раз промывают дистиллированной водой и после добавления 45 мл Специальная часть Таблица Значения hRF пуриновых и пиримидиновых основании и нуклеотидов [9] hRf hRF Вещество Вещество Б Б А л - Ксантозин 100 Уридин 56 96 Гипоксантин Цитидин 90 91 Гуанозин Тимидин 41 83 86 Аденозин Инозин 83 Ксантин — Цитозин 26 77 77 Аденин Урацил Тимин " А целлюлоза — сефадекс;

В силвкагель — сефадекс.

0,05 М фосфатного буфера (рН 7,0) суспензию наносят на стеклянные пластинки (20X20 см, толщина слоя 0,6 мм), оставляют в горизонтальном положении при комнатной температуре в течение 60 мин, затем сушат в токе горячего воздуха почти до полного высыхания.

Хроматографирование. После нанесения 20 мкг водных растворов анализи­ руемых веществ хроматографнруют 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,0) при комнатной температуре в течение приблизительно 4 ч (сефадекс — силикагель) или 6 ч (сефадекс—целлюлоза).

Обнаружение. После высушивания в токе теплого воздуха веществ детекти­ руют в ультрафиолетовом свете. Образуются фиолетовые пятна на бесцветном или обладающем желто-зеленой флуоресценцией фоне.

ЛИТЕРАТУРА 1. Coffey R. G., Newburgh R. W., J. Chromatogr., 11, 376 (1963).

2. Dietrich С. P., Dietrich S. С M., Pontis H. G., J. Chromatogr., 15, 27 (1964).

3. Chmielewicz Z. F., Acara M., Analyt. Biochem., 9, 94 (1964).

4. Randerath K., Biochim. biophys. Acta, 61, 852 (1962).

5. Randerath K-, Thin-layer Chromatography. Academic Press, New York, 1963.

6. Randerath K., Weimann G., Biochim. biophys. Acta, 76, 129 (1963).

7. Randerath K., Randerath., J. Chromatogr., 16, 111 (1964).

8. Randerath., Randerath K., J. Chromatogr., 16, 126 (1964).

9. Tortolani G., Colosi M.., J. Chromatogr., 70, 182 (1972).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 10. Baudendistel L. I., Ruh T. S., J. Chromatogr., 148, 500 (1978).

11. Brown I. R. F., J. Chromatogr., 125, 530 (1976).

12. Harber M. J., Maddocks J. L., J. Chromatogr., 101, 231 (1974).

13. Kluge H. 0., Heilman W., Z. med. Labortechn., 14, 351 (1973).

14. Munns T. W., Sims H. F., J. Chromatogr., Ill, 403 (1975).

15. Reibel D. K.., Rovetto M. J., J. Chromatogr., 161, 406 (1978).

16. Schwartz P. M., Drach J. C, J. Chromatogr., 106, 200 (1975).

„17. Tomasz I., J. Chromatogr., 128, 304 (1976).

510 Специальная часть 6.4. Сахара При изучении патологических состояний, сопровождающихся нарушениями углеводного обмена, сталкиваются с проблемой идентификации Сахаров в биологических жидкостях. В первую очередь речь идет о состояниях, при которых происходит чрезмер­ ное выделение глюкозы, галактозы, фруктозы и пентоз. Детальное обсуждение с биохимической точки зрения показывает, насколько важную информацию о характере изменений метаболизма углево­ дов можно получить с помощью хроматографических методов.

Разделение моно-, ди- и трисахаридов описал Ганзен [13].

Определению Сахаров в биологических жидкостях посвящена статья {'12].

Здесь мы приведем некоторые методы, пригодные для сравни­ тельно легкого и надежного определения этих веществ.

Открытие Сахаров по Барону и Экономидису в моче ![3] Приготовление слоя. 1 часть силикагеля G смешивают с 2 частями 0,1 М борной кислоты. После нанесения на пластинки слой сушат 2 ч при комнатной температуре и затем 30 мин при 105 °С.

Нанесение проб и хроматографирование. После нанесения 5 мкл исследуе­ мой мочи и 5—10 мкг эталона хроматографируют до расстояния 12—15 см при 37 °С в системе м-бутанол — уксусная кислота ( 1 : 1).

Обнаружение. После сушки хроматограммы сахара обнаруживают опрыс­ киванием анилиновым реактивом (Д6) (табл. 98).

Таблица Значения hRF Сахаров и окрашивание пятен под действием анилинового реактива (Д 6) HRF hRF Сахар Окрашивание Окрашивание Сахар 7 Лактоза Сине-серое | Фруктоза Коричневое Сахароза Корйчнево-се- | Глюкоза Мальвово-серое рое в Галактоза Синее Мальвово-се- 1 Ксилоза рое J Количественное определение Сахаров по Банхеру и сотр. ([/] Приготовление слоя. 30 г силикагеля G смешивают с 65 мл дистиллирован­ ной воды и после нанесения на пластинки слой сушат в течение ночи при ком­ натной температуре. По утверждению авторов, так получаются более воспро­ изводимые результаты, чем при сушке слоя при повышенной температуре, Хроматографирование. Образец наносят на старт в углу пластинки на рас­ стоянии 1,5 см от краев. В первом направлении элюируют смесью этилацетат— ацетон — вода (40 :50: 10), пока фронт не пройдет расстояние 15—18 см. После высушивания во втором направлении пользуются смесью и-бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (45:30: 15:5).

Обнаружение. Сахара или их производные обнаруживают анилиновым ре­ активом (Д6)—после опрыскивания хроматограмму сушат 10—15 мин при, -/a Специальная часть * а О8 о' Q go, X Старт *-2.

Рис. 92. Разделение Сахаров и родственных веществ [1].

Сорбент: силикагель О;

системы: первое направление — этилацетат — ацетон — вода (40:50:10), второе направление — к-бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (45 : 30 : 15 : 5);

обнаружение: анилиндифениламиновый реактив.

/ — глюкоза;

2—араоиноза;

3 —рибоза;

4 — ксилоза;

5 — эритроза;

6 — глицериновый аль­ дегид;

7 — гликолевый альдегид;

8 — диоксиацетон;

9 — метилглиоксаль;

10 — глиоксаль;

// — редуктон.

80—100 °С и окраску пятен наблюдают в видимом и ультрафиолетовом свете (рис. 92), или орсиновым реактивом (Д 162)—хроматограмму сушат 10—15 мин при 100 "С (табл. 99).

Количественное определение. После одномерного хроматографирования мож­ но определять сахара реакцией с бешшднном;

этот способ удобнее, чем предло­ женный Пастуской 1[9], по которому окисляют вещества на хроматограмме или в.растворе хромовой смесью и после добавления иодида калия титруют выде­ лившийся иод тиосульфатом.

Ход определения. 1—2 мкл пробы наносят на старт на расстоянии 1,5 см от края слоя, приготовленного из силикагсля G. Одновременно на эту же пла­ стинку наносят эталон в 4 различных концентрациях в интервале 10—15 мкг.

После разделения обнаруживают сахара, опрыскивая 0,2%-ным раствором бен зидина в уксусной кислоте и нагревают в течение 10 мин при 100 °С. Альдозы образуют коричневое окрашивание. После переноса в пробирку сорбента с пят­ ном и равновеликого по площади количества сорбента для холостого опыта приливают по 0,2 мл смеси этанол—вода ( 3 : 2 ), непродолжительно взбалты­ вают и после добавления 2 мл 0,2%-ного раствора бензидина в ледяной уксус вой кислоте нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин в случае Вентоз или 30 мин при определении гексоз. По охлаждении доливают бензиди 612 Специальная часть Таблица Цветные реакции Сахаров н родственных им веществ * Анилин—дифениламин (Д 6) Орсян (Д 162) Окрашивание Вещество дневной свет дневной свет УФ-свет Альдогексозы Желтая флуорес­ Чер но-фиолетовое Синее ценция Кетогексозы Красно-коричне­ То же Красно-коричневое вое Синее Альдопеятозы Оливково-зеленое Светло-желтое Тетрозы Желтое Ярко-белое Желтое Триозы От желтого до ко­ ричневого Глицериновый альде­ Желтое Белое гид Гликолевый альдегид Желто-коричневое Ярко-белое — Бледно-желто-ко­ Белое Глиоксаль ричневое »

Метилглиоксаль То же — Редуктон новым реактивом до 2,5 мл и после центрифугирования фотометрируют при 350 им, учитывая результат холостого опыта. Погрешность определения около 5%, и в интервале 1—50 мкг наблюдается линейная зависимость интенсивности окрашивания от количества вещества.

Определение Сахаров в моче на слоях целлюлозы 1[//] Приготовление слоя. 15 г порошкообразной целлюлозы MN 300 (Macherey— Nagel) гомогенизируют в течение, 30 с с 90 мл дистиллированной воды. Получен­ ный слой (0,25 мм) высушивают в течение 10 мин при 100 "С.

Приготовление пробы и нанесение. Мочу можно наносить непосредственно, однако присутствие других веществ, в особенности неорганических солей, мо­ жет заметно нарушать процесс разделения. Поэтому перед хроматографией сле­ дует подготовить пробы.

К Ю мл исследуемой мочи прибавляют смесь равных количеств амберлита Ш—120 (в Н+-форме) и амберлита IRA (в ацетатной форме). В стеклянной колонке (750X30 мм) слой ионитов промывают 150 мл дистиллированной воды (расход 0,9 мл/мин) в колбу, содержащую 2—3 мл толуола. Элюат выпаривают досуха в вакууме при 50°С л остаток растворяют в 1 мл насыщенного водного раствора бензойной кислоты. Содержимое экстрагируют горячим метанолом и объединенные вытяжки упаривают в токе воздуха до объема около 1 мл. Из этого раствора на пластинку наносят соответствующий объем в зависимости от концентрации Сахаров.

Хроматографирование. Разделение можно проводить в насыщенной камере в одной из следующих систем: згапацетат — пиридин— вода ( 2 : 1 : 2 ) ;

фенол, насыщенный водой, с }% аммиака;

пропанол-2—пиридин —уксусная кислота— вода ( 8 : 8 : 1 : 4 ). После достижения фронтом растворителя края пластинки. -ft Специальная часть хроматограмму сущат. При использовании первой системы после сушки прово­ дят повторное элюирование. Такое двукратное хроматографирование требует около 4 ч при комнатной температуре.

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают реактивом Д 8. Гексозы дают зеленое окрашивание (в ультрафиолетовом свете — зеленую флуоресценцию), пентозы — красно-фиолетовое, метилпентозы — желто-зеленое и уроновые кисло­ ты— коричневое. Чувствительность для гексоз и метилпентоз около 0,5 мкг, для пентоз и уроновых кислот 0,1—0,2 мкг. В первой системе хорошо разделяются моносахариды (значения hRf составляют: глюкоза 100, галактоза 90, манноза 109, арабиноза 111, ксилоза 125,' рибоза 142, рамноза 152). Так как манноза и арабиноза в этой системе обладают практически одинаковой по'движностью, для их разделения удобнее вторая система. Третья система пригодна для раз­ деления глюкуроновой, маннуроновой и талактуроновой кислот. Оптимальные количества для хорошего разделения гексоз около 2 мкг, пентоз 1 мкг.

Помимо свободных Сахаров для хроматографического разделения с успе­ хом можно пользоваться и их производными, например фенилозазонами. По­ следнее можно разделять в форме их боратных комплексов.

Определение фенилозазонов Сахаров по Ринку и Германку [10] Приготовление слоя. 30 г кремнезема с примесью гипса (кизельгур G) сме­ шиваютС с 60 мл 0,05 М раствора буры. После нанесения на пластинки сушат при 80 С в течение 30 мин. Указанного количества достаточно для покрытия 5 пластинок размером 20X20 см.

Получение производных. К 10 мл мочи прибавляют 0,4 г хлоргидрата фе нилгидразина и 6 г уксуснокислого натрия. Смесь нагревают 30 мин на кипя­ щей водяной бане. После охлаждения проточной водой кристаллический осадок отфильтровывают, промывают водой и на холоду растворяют в смеси равных объемов диоксана и метанола.

Эталоны готовят таким же образом из 1%-ных растворов добавлением 0,2 г хлоргидрата фенилгидразина и 0,3 г ацетата натрия.

Хроматографирование. На хроматограмму наносят по 5—10 мкг производ­ ных. Применяют смесь растворителей хлороформ — диоксан — тетрагидрофу ран —0,1 М раствор тетрабората натрия (40:20:20:1,5), которую готовят, сильно перемешивая 40 мл хлороформа и 20 мл диоксана с 1,5 мл 0,1 М рас­ твора буры, затем прибавляют 20 мл тетрагидрофурана. Хроматографируют в камере, насыщенной парами растворителя. Процесс заканчивают, когда фронт Таблица Значения IIRF фенилозазонов Сахаров [6] Окрашивание Окрашивание пятен после пятен после опрыскивания опрыскивания Фенилоэазон hRp Фенилозазон hRp диазотированной диазотированной сахара сахара сульфаниловой сульфаниловой кислотой (Д 26) кислотой (Д 26) 39 Коричневое Сорбоза Глюкоза Коричневое 39 Ксилоза 72 »

Фруктоза — Рибоза 91 Красно-корич­ 91 — Арабиноза невое Мальтоза Галактоза 52 Коричневое Лактоза 2 — 514 Специальная часть растворителя переместится на 10 см при температуре около 23°С (20—25 мин).

Обнаружение. Фенилозазоны можно наблюдать в виде желтых, сравнитель­ но быстро бледнеющих пятен. Поэтому после высушивания при комнатной тем­ пературе их необходимо немедленно очертить. Другой способ, не зависящий от выцветания пятен, заключается в немедленном опрыскивании хроматограммы свежеприготовленным раствором Д 876. Озазоны дают при этом окрашивание от красно-коричневого до коричневого \[6] (табл. 100).

Определение сахароз в биологических материалах по Эрссеру и Эндрю 1[5] Приготовление слоя. Пользуются микрокристаллической целлюлозой на пла­ стмассовой подложке (Merck, Macherey — Nagel).

Приготовление проб. Моча. 1 мл мочи обессоливают взбалтыванием в тече­ ние 15 мин с половинным объемом смешанного ионита (биодеминролит) в аце­ татной форме.

Сыворотка крови. Сыворотку освобождают от белка добавлением пикри­ новой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центри­ фугирования хроматографируют. Если в распоряжении имеется достаточное ко­ личество исследуемого материала, можно затем подвергнуть пробу обессолива яию так, как делают с мочой.

Кал. Образец кала (5 г) замораживают, чтобы предотвратить бактериаль­ ное разложение сахаров. Последние затем извлекают, гомогенизируя с равным объемом ацетона. После центрифугирования жидкость обессоливают по методи­ ке, описанной выше для мочи.

Хроматографирование. Образцы, подготовленные, как указано выше, нано­ сят дважды каждый (по 10 мкл) на слой целлюлозы и подвергают двукратно­ му элюированию до расстояния 7,5 см от старта в системе этилацетат — пири­ дин—вода (6:3:2) одновременно с эталонами..

Обнаружение. После высушивания одну часть хроматограммы погружают Э раствор реактива (10 мл раствора 2 г n-аминобеизойной кислоты в 36 мл ле­ дяной уксусной кислоты, 40 мл дистиллированной воды и 1,6 мл 90%-ной фос­ форной кислоты разбавляют 15 мл ацетона). После 10-минутного нагревания ярн 80—90 °С наблюдают пятна альдоз.

Вторую часть хроматограммы погружают в нафторезорциновый реактив (20 мл 0,2%-ного раствора иафторезорцина в ацетоне смешивают с 2 мл 15% ной НС1). После нагревания в течение 3—5 мин при 80—90 °С обнаруживают кетозы.

Описанный метод удобен для быстрой диагностики галактозе мии (рис. 93).

Определение Сахаров в моче, крови и кале двумерной хроматографией в тонком слое описали Краффчик и сотр. [15]. Различные способы определения сахаров в моче описаны в работах [14, 16—19], в моче и плазме крови в ра­ боте [20].

Ди- и полисахариды в исследуемом материале можно идентифицировать по­ сле превращения в моносахариды предварительным гидролизом (1 мл обессо­ ленного образца нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане с 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и после охлаждения избыток кислоты уда­ ляют с помощью ионита).

Эта модификация удобна для диагноза первичной и вторичной непереносимости дисахаридов, фруктоземии и для выявления недостаточности галактокиназы.

}Ш Специальная часть Рис. 93. Разделение Сахаров в плазме и моче больного галактоземией [5].

Сорбент: целлюлоза;

система: этилацетат — пиридин — вода (6 : 3 : 2);

обнаружение: я-ами нобензойная кислота.

а—плазма;

б — эталоны;

в —моча (0,5 мкл);

г — моча (5 мкл).

/ — глюкоза;

2 — галактоза;

3 — З-О-метилглюкоза;

4 — ксилоза;

5 — лактоза.

Количественное определение фосфорных эфиров Сахаров в крови по Дэвидсону и Дрю \[4] Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel) суспен­ дируют в 85 мл дистиллированной воды. После нанесения на стеклянные пла­ стинки размером 20X20 см слой (0,25 мм) сушат в течение ночи при комнат­ ной температуре.

Приготовление проб. Эритроциты извлекают трихлоруксусной кислотой и после обессоливания на колонке со смолой дауэкс 50Х8-Н элюат нейтрализу­ ют разбавленным аммиаком и лиофилизуют до окончательного объема 4 мл.

Хроматографирование. 10 мкл нейтрализованного элюата наносят на пла­ стинку на расстоянии 3 см от нижнего края. Для количественного определения готовят две хроматограммы. Пластинки помещают в камеру и после насыще­ ния в течение 30—45 мин элюируют смесью метанол — NH4OH (уд. масса 0,88)— вода ( 7 : 1 : 2 ) до расстояния 10 см от старта (приблизительно 35 мин) при комнатной температуре. После высушивания в токе теплого воздуха хрома тографируют во втором направлении (после насыщения камеры парами рас­ творителя в течение 30—45 мин) в смеси метанол — ледяная уксусная кислота— Вода ( 8 0 : 1 5 : 5 ) ;

через 30 мин фронт достигает расстояния 10 см (рис. 94).

['.... Обнаружение. Сначала необходимо удалить растворители сушкой при 60 °С (60 мин). После хроматографирования в первом направлении удобно в ультра Фиолетовом свете при 254 им идентифицировать аденин и пиридиновые нуклео тйды. После элюирования во втором направлении хроматограмму опрыскивают JO—12 мл молибдатного реактива Ишервуда — Хейнза для обнаружения фос­ форных эфиров (Д77). Немедленно после опрыскивания неорганический фосфат проявляется в виде желтого пятна. Затем хроматограмму нагревают в течение 10 мин при 80 "С;

при этом глюкозо-1 -фосфат образует зеленовато-желтое окра­ шивание. После охлаждения до 50—60 °С хроматограмму в течение 2—3 мин выдерживают над парами кипящей водяной бани. При этом происходит гидро Olfl Специальная часть t Ф °& '' ч *Швк 1 mCmapm 2.-*— Рис. 94. Двумерная хроматография гексозо- и триозофосфатов в свежей вытяж­ ке нормальных эритроцитов человека [4].

t — неорганический фосфат;

2 — АТФ;

3 — АДФ;

4 — 2,3-глицернндифосфат;

5-рибозо-5'-фос фат;

tf — фрухтозо-1,6-дифосфат;

7 — гянцернн-3-фосфат;

* — глицерин-2-фосфат;

3 — 3-фос фат глицеринового альдегида;

/0 —глюкозо-1-фосфат;

/ / — глхжозо-6-фосфат;

12 — пиро _ фосфат.

Пятна, обнаруживаемые только в некоторых образцах: а — фруктозо-1-фосфат;

6 — фрукто зо-6-фосфат;

* — трифоофопнридиннуклеотид.

лиз даже наиболее стойких эфиров. После ультрафиолетового облучения в те­ чение 1.0—15 мин пятна фосфорных эфиров окрашиваются в синий цвет на прак­ тически бесцветном фоне. Окрашивание достигает максимальной интенсивности через 2—3 ч.

Количественное определение. К хроматбграмме, подвергнутой действию реак­ тива, прикладывают вторую хроматограмму, очерчивают соответствующие места на ней, вырезают их, переносят сорбент в стеклянные микрохроматографические колонки и вещества вымывают 0,1 н. НС1. В 1,5—2 мл элюата находится более 90% фосфора, который можно определить обычными фотометрическими спосо­ бами.

Определение трифосфопиридиннуклеотида (ТФПН) необходимо проводить перед хроматографированием во втором направлении, так как на этой стадии происходят его потери. Бблыпая часть дифосфопиридиннуклеотида (ДФПН) уда­ ляется при обессиливании на колонке ионита.

Пятна фруктозо-1,6-дифосфата и фруктозо-6-фосфата удобно обнаруживать специфическим нафторезорцяновым реактивом. При этом образуется вишнево красная окраска.

Для дифференциального диагноза различных типов мукополи сахаридоэов наряду с электрофоретическими методами пользуют­ ся и тонкослойной хроматографией.

Специальная часть Хроматографический способ определения мукополисахаридов в моче по Амбелю, Маришмо и Фаллю [7] и по Амбелю и Шамолю [8] Приготовление слоя. Для анализа авторы пользовались целлюлозой фирмы Merck на пластинках 20X20 см.

Приготовление проб. К 2 мл мочи прибавляют 0,1 мл 5%-ного раствора хлорида цеТШвЯфидиния в 1 М цитратном буферном растворе (рН 6). Реак­ ционную смесь помещают на ночь в холодильник;

образующийся осадок центри­ фугируют, сливают жидкость, осадок промываяот 5 мл абсолютного этанола, насыщенного NaCI, и снова центрифугируют. Очищенные кислые мукополисаха рвды растворяют в 0,1 мл 0,05 н. NaOH. 10—20 мкл раствора наносят в виде полоски шириной 2 ом на старт на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки.

Хроматографирование. Проводят ступенчатое хроматографирование последо­ вательно в 6 камерах всякий раз на расстояние 2 см в системах, перечисленных в табл. 101. Одновременно хроматографируют и эталонные вещества, растворен­ ные в 0,05 и. NaOH (табл. 102).

Обнаружение. Разделенные вещества обнаруживают, погружая хроматограм му на 3 мин в 1%-ный раствор толуидинового синего в смеси 70%-ный этанол— уксусная кислота (95:5). Гиалуроновая кислота окрашивается в течение 10 мин Таблица Системы растворителей для разделения кислых мукополисахаридов в моче [8] Камера Ацетат кальция, % Этанол, % 1 2, 5, 40 5, 30 5, 5 20 5, 10 5, Таблица Подвижность мукополисахаридов [7, 8] Вещество Подвижность Между 1-м и 2-м фронтом Дерматансульфат Гиалуроновая кислота Между 2-м и 3-м фронтом Между 3-м и 4-м фронтом Гепаринсульфат Между 4-м и 5-м фронтом Хондроитин-4-сульфат Хондроитин-6-сульфат Между 5-м и 6-м фронтом С фронтом Кератансульфат Специальная часть 0|H Рис. 95. Разделение мукополисахаридов мочи [7, 8].

Сорбент: целлюлоза (Merck);

система: этанол — уксуснокислый кальций;

обнаружение: то луидиновый синий и альциановый синий.

1—6 — фронт систем растворителей (см. табл. 101 и 102).

а —тип I (синдром Харлера-Пфаундлера);

б —тип II (синдром Хантера);

в —тип III (синд­ ром Санфилиппо);

г —тип IV (синдром Моркяо);

в —тип V (синдром Ульриха-Шайе) и тип VI (синдром Марото-Ланни).

в 1%-ном растворе альцианового синего в смеси 70%-ного этанола и уксусной кислоты (95:5). Избыток красителя вымывают (около 10 мин) 10%-ной уксус­ ной кислотой (рис. 95).

ЛИТЕРАТУРА 1. Bancher Е., Scherz Н., Kaindl К., Microchim. Acta, 1964, 1043.

2. Bancher., Scherz H., Microchim. Acta, 1964, 1159.

3. Baron D. N.. Economldls I., J. Clin. Path., 16, 484 (1963).

4. Davidson I. W. P., Brew W. 0., J. Chromatogr., 21, 319 (1966).

Ersser R. S., Andrew B. C, J. Med. Lab. Technol., 28, 335 (l 971 ) 5.

6. Haas H. J., Seeliger A., J. Chromatogr., 13, 575 (1964).

7. Humbel R., Marchal С M., Fall M., Helv. paediatr. Acta, 24, 648 (1969).

8. Humbel R., Chamoles N. A., Clin. chim. Acta, 40, 290 (1972).

9. Pastuska G., Z. Analyt. Chem., 179, 427 (1961).

10. Rink At., Herrmann S„ J. Chromatogr., 12, 415 (1963).

11. Schwetger A., J. Chromatogr., 9, 374 (1962).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 12. Gkebregzabher M., Ruffini S., Ciuffini G., Lato M., J. Chromatogr., 95, (1974).

13. Hansen S. A» J. Chromatogr., 107, 224 (1975).

MP Специальная часть 14. Koslowski Н., Jung G., Fiehrong G., Dtsch. Gesundheitswes, 32, 1567 (1977).

15. Kraffczyk F., Helger R., Bremer H. I., Clin. Chim. Acta, 42, 303 (1972).

16. Menzies I. S., Mount J. N.. Wheeler M. 1., Ann. Clin. Biochem., 15, 65 (1978).

17. Mischer 0., Kabus Ch., Schenk M., Heim Т., Z. med. Labor.-Diagn., 19, (1978).

18. Prim W., Meldrum W., Wilkinson L., Clin. Chim. Acta, 82, 229 (1978).

19. Stuber A., Clin. Chim. Acta, 36, 309 (1972).

20. Szustkiewitz C, Demetrion J., Clin. Chim. Acta, 32, 355 (1971).

6.5. Органические кислоты • Определение органических кислот вообще, за немногими иск­ лючениями, не относится к обычным клиническим биохимическим исследованиям. Однако целый ряд этих веществ представляет со­ бой важные промежуточные продукты метаболизма углеводов и липидов. Наряду с этим, например, высшие жирные кислоты вхо­ дят в состав липидов, и установление их природы может иметь значение при диагностике многих патологических состояний. Хотя в настоящее время качественное и количественное определение органических кислот является задачей газовой хроматографии, мы приводим в этом разделе несколько методик, использующих тонкослойную хроматографию, которые, по нашему мнению, могут оказаться полезным дополнением в лабораторных исследованиях.

6.5.1. Низшие жирные кислоты Разделение низших жирных кислот по Лайнзу {[11] Приготовление слоя. Слои готовят из силикагеля G на стеклянных пла­ стинках размером 20X20 см обычным способом.

Xроматографирование. После нанесения проб кислот, выделенных из биоло­ гического материала перегонкой с водяным паром, и эталонов пластинку хро матографируют в смеси метилацетат—2,5%-ный аммиак (95:5). Бели пользу­ ются свежеприготовленной смесью, для хорошего разделения следует проводить двукратное хроматографирование;

если же смесь будет находиться в камере 24 ч, достаточно однократное (табл. 103).

Обнаружение. Хроматограмму сушат в течение 2—3 мин при 105 °С, затем опрыскивают спиртовым раствором метилового красного (Д 145). При после­ дующем нагревании при этой же температуре кислоты образуют темно-красные пятна на оранжевом фоне. Чувстипгельность реакции около 5 мкг.

Разделение низших жирных кислот и оксикислот в форме N',М-диметил-п-аминобсн;

юлазофенаи,иловых эфиров по Зелигману и Дою [18] Приготовление слоя. Из силикагеля G (Merck) обычным способом готовят слои (0,25 мм).

Приготовление проб. Кислоты (приблизительно 1 мкг), выделенные из био­ логического материала перегонкой с водяным паром или экстракцией, нейтрали­ зуют 0,01 н. NaOH по фенолфталеину и раствор выпаривают досуха. К эквимо­ лекулярным количествам натриевых солей кислот и Ы,Ы-диметил-л-аминобензол азофенацилхлорида прибавляют 0,2—1 мл смеси диметилформамид — вода (15:

: 1) и нагревают в запаянной ампуле или с обратным холодильником на водя 6^0 Специальная часть Таблица Значения hRr низших жирных кислот [11] Двукратное Хроматографирование хроматографирование через 24 ч., Кислота в свежеприготов­ ленное смеси двукратное одноразовое 3 Муравьиная Уксусная Ю Пропионовая 15 24 Масляная Изомасляная 27 32 30 Валериановая 52 Капроновая Эиантовая 55 43 Каприловая 61 Пеларгоновая ной бане в течение 60 мин. По охлаждении смесь разбавляют дистиллированной водой и эфиры извлекают хлороформом или этилацетатом. Органический слой выпаривают досуха в вакууме и окрашенный в красный цвет остаток растворя­ ют в минимальном количестве ацетона.

Хроматографирование. Ацетоновый раствор эфиров кислот наносят на стар­ товую линию в форме точек или полосок. Для разделения эфиров низших жир­ ных кислот пользуются смесью бензол — этилацетат (20:1), для эфиров окси кислот — смесью бензол — этилацетат ( 3 : 1 ). При элюировании в течение 30— 60 мин происходит хорошее разделение (табл. 104, 105).

Обнаружение. Производные кислот окрашены, и нет необходимости в спе­ циальных реактивах. Чувствительность составляет около 0,05 мкг" кислоты.

Таблица Значения hRr азофенациловых эфиров низших жирных кислот [18] *v HRp Кислота Кислота Пеларгоновая Муравьиная 19 Уксусная Кротоновая Пропионовая Изомаслявая 32 Метилмасляяая Масляная Валериановая 40 NvN-Диметил-я-амино бензолазофенацилхло Капроновая рид Каприловая. Специальная часть Таблица Значения hRF азофенациловых эфиров оксикислот [18] hRF Кислота а-Оксипропионовая- (молочная) - а-Оксиизомасляная а-Оксиизокапроновая Р-Оксипропионовая (гидроакриловая) Э-Окси-к-масляная Р-Оксиизомасляная NyN-Диметил-п-аминобензолазофенацилхлорид 6.5.2. Высшие жирные кислоты Хотя и для высших жирных кислот в настоящее время наибо­ лее удобна газовая хроматография, тонкослойная хроматография позволяет предварительно фракционировать сложные смеси кис­ лот, выделенные из биологического материала.

Среди многочисленных способов наилучшими оказались деле­ ние метиловых эфиров высших жирных кислот в форме коорди­ национных комплексов с ионами серебра и распределительная хроматография с обращенными фазами. Для идентификации ме­ тиловых эфиров полиеновых. кислот удобным оказалось разделе­ ние ацетоксимеркуриметоксипроиэводных, образующихся при реакции эфиров кислот с ацетатом ртути и метанолом [20].

Разделение высших жирных кислот по Бергельсону и сотр. [4] Приготовление слон. Суспензию 6,5 г силикагеля КСК (можно пользоваться и другими сортами;

величина частиц 150—200 меш), 0,4 г гипса и 17 мл 12% ного раствора азотнокислого серебра наносят на пластинку размером 9X24 см.

После высушивания в течение 5 8 ч на воздухе (в темноте) активируют в те­ чение 30—т60 мин при постепенно повышаемой до 104—106 "С температуре. При достижении ее выдерживают при этой температуре еще 60 мин. Хотя приготов­ ленный таким способом слой при дальнейшем хранении темнеет, это не влияет на его разделительную способность.

Общие высшие жирные кислоты в плазме крови Приготовление пробы. 1 часть сыворотки крови смешивают с 16 частями смеси хлороформ — метанол (.1:1), кратковременно кипятят на водяной бане и по охлаждении доливают хлороформом до объема 25 мл. После перемеши­ вания и фильтрования к части вцтяжки (например, 5 мл) приливают 1/5 по объему 0,02% -ного водного раствора хлорида кальция и хорошо перемешивают.

Через 8—16 ч, водно-метанольный слой отделяют, слой хлороформа выпарива­ ют в вакууме досуха. Остаток после добавления 10 частей 2 и. раствора КОН 34— |И_ Специальная часть Таблица Значения Ще метиловых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот при двумерной хроматографии [4] Направление Кислота первое второе Додекановая (лауриновая) 78 Тетрадекановая (миристиновая) 67 Гексадекановая (пальмитиновая) 56 Октадекановая (стеариновая) 46 Эйкозановая (арахиновая) 36 Докозановая (бегеновая) 28 цис-Гексадецен-9-овая (пальмитолеиновая) 71 Чис-Гексадецен-11 -овая 71 Чис-Октадецен-7-овая 60 «{ис-Октадецен-9-овая (олеиновая) #нс-Октадецен-11-овая (вакценовая) 60 гранс-Октадецен-9-овая (элаидиновая) цис-Эйкозен-11-овая "цис-Докозен-5-овая цис- Докозен-11 -овая цис- Гексакозен-9-овая 71 Октадека-9,12-диеновая (линолевая) Октадека-9,12,15-триеновая (линоленовая) 89 Эйкоза-5,8,11,14-тетраеновая (арахидоновая) в метаноле подвергают гидролизу нагреванием1 на кипящей водяной бане с 'обратным холодильником в течение 2—3 ч. Затем охлаждают, разбавляют рав­ ным объемом дистиллированной воды и извлекают 2—3 раза 10 частями эфира (удаление неомыляемой части). После подкисления 2 н. НС1 жирные кислоты Извлекают 2—3 раза 10 частями петролейного эфира;

вытяжку промывают ди­ стиллированной водой и сушат безводным сульфатом натрия. Растворитель вы­ паривают и кислоты сразу же этерифицируют диазометаном. По окончании реакции растворитель отгоняют, избыток диазометана удаляют в токе азота при температуре около 50 "С. Остаток растворяют в таком количестве эфира, чтобы концентрация метиловых эфиров составляла 10—50 мкг в 10 мкл.

Подобным же образом можно получить метиловые эфиры кислот из экст­ рактов тканей или липидных фракций, выделенных, например, хроматографией на колонке, и т. д. Разумеется, для выделения липидов из биологического мате риала можно воспользоваться и другими способами, например способом, описы­ ваемым при определении спектра общей липидной фракции (разд. 6.6.1).


Одномерная хроматография. На подготовленную пластинку наносят 100— 200 мкг смеси метиловых эфиров и хроматографйруют смесью днизопропиловый эфир-н-гёксан (2:3) в камере, предварительно насыщенной в течение 40— •50 мин парами растворителей...

w Специальная часть О' о Ср.

о 4 ;

о О7 do е d° О о 0 " Ою О'?' • о О/а '1.

"5 Старт /5 А :

//,5см *• •Л5ли * Рис. 96. Двумерная хроматография метиловых эфиров высших жирных кислот [4].

Сорбент: силикатель КСК;

системы: первое направление — ацетонитрил — ацетон (1 : 1) (слой обработан 10%-ным раствором додекана),.второе направление — диизопропиловый эфир — к-гексан (2:3) (слой обработан 20%-ным раствором AgNOa);

обнаружение: бромтимоловый синий.

/ — арахидоновая;

2 — линоленовая;

3 — линолевая;

4 — пальмитовакценовая;

5 — цис-окта децен-7-овая;

б —олеиновая;

7 — цыснвакценовая;

8 — элаидиновая;

9 — цис-эйкозен-11-овая;

10 — чис-докозен-5-овая;

Л — цыс-докозен-11-овая;

12 — цис-гексакозен-9-овая;

13 — лаурино вая;

14 — миристиновая;

15 — пальмитиновая;

16 — стеариновая;

17 — арахиновая;

18 — бе геновая.

Обнаружение. По окончании разделения хроматограмму сушат при комнат­ ной температуре и после опрыскивания 50%-ной серной кислотой нагревают 5— 10 мин инфракрасной лампой (500 В). Кислоты образуют коричневые пятна.

Удобно также пользоваться ролктипом Д 192.

Двумерная хроматография. Стеклянную пластинку размером 20X20 см по­ крывают слоем, полученным и.ч суспензии 10 г силикагеля КСК, 0,6 г гипса И 25 мл дистиллированной воды. После имсушивания (30 мин при 110°С) слой обрабатывают погружением в 10%-ный раствор додекана в н-гексане. Обработку можно с успехом осуществить и восходящей хроматографией.

После нанесения смеси метиловых эфиров (100—200 мкг) в первом направо лении элюируют смесью ацетонитрил — ацетон (1:1), насыщенной додеканом (6—6,4 мл додекана на 90 мл смеси при 18—20 °С), в течение 70—90 мин. По­ сле сушки в течение 3Q мин при комнатной температуре и 30—40 мин при 90— 95 "С хроматограмму оставляют на ночь на воздухе.

Часть А (рис. 96) опрыскивают 20%-ным раствором AgN0 3 и активируют 60 мин при медленно возрастающей температуре до 100 "С и еще 60 млн при этой температуре. Так как обнаружение насыщенных жирных кислот нд слое, обработанном азотнокислым серебром, менее чувствительно, ту часть хрвмато 624 Специальная честь граммы, где следует эти кислоты идентифицировать (часть Б), не обрабатыва­ ют этим реактивом". Для элюнровання во втором направлении пользуются смесью диизопропиловыЙ эфир — к-гексан (2:3).

Обнаружение. После сушки (20 мин при 70—80 °С) часть Б опрыскивают раствором бромтимолового синего (40 мг в !00 мл 0,01 и. NaOH) и нагрева­ ют 10—15 мин при той же температуре. Насыщенные;

эфиры образуют желтые пятна на синем фоне;

, чувствительность около 15—20 мкг. Затем хроматограмму опрыскивают 40 «л указанного реактива в 100 мл 20%-ного раствора аммиака.

Ненасыщенные эфиры образуют светлые или темные, быстро бледнеющие пятна на сером фоне. Чувствительность 40—50 мкг.

Д л я идентификации свободных кислот Ci 2 —С 2 о сравнительно надежным методом оказалась хроматография на гипсовом слое по Кауфману и Хо [8].

Приготовление слоя. На пластинку матового стекла (20X20 или 10X20 см) наносят слой гипса, полученный из 25 г CaSCV0,5 H20 в 35 мл дистилЛиро вавной воды. Слой сушат 15 мин при комнатной температуре и 60 мин при ;

80— 90 "С. По охлаждения в эксикаторе пластинка готова к употреблению.

Приготовление проб и хроматографирование. Смесь жирных кислот из био­ логического материала готовят обычными способами, как описано выше, но не проводят этерификацию. После выпаривания петролейного эфира остаток рас­ творяют в бензоле или толуоле так, чтобы в 10 мкл содержалось около 5 мкг кислот. ТакМе количества^ наносят на слой, предварительно обработанный погру­ жением в 10%-ныЙ раствор ундекана в петролейном эфире. Элюируют смесью ацетонвтркл — уксусная кислота (1: 1), насыщенной ундеканом.

Обнаружение, После сушка хроматограммы (60 мин при 80—90 °С) прово­ дят открытие реактивом Д169.

Разделение высших жирных кислот по Анкеру и Сонанини [1] Приготовление слоя. Из суспензии кремнезема кизельгур G (Merck) и воды в отношении 1 :2 обычным способом готовят слой. Пластинку высушивают в течение 4-5 мин при температуре 110°С и сохраняют в эксикаторе. Обрабаты­ вают восходящим способом раствором }0%-«ого вазелинового масла в петро­ лейном эфире, сушат 5 мин при комнатной температуре и затем 1—2 мин при температуре 100 X.

Хроматографирование. После нанесения проб свободных жирных кислот хроматографируют либо в ледяной или соответственно в 9.0% -ной уксусной кис­ лоте, либо в смеси ледяная уксусная кислота —вода (1:1) (табл. 107).

Обнаружение. После сушки хроматограммы при 120 СС (5 мнн) ненасыщен­ ные кислоты обнаруживают парами иода. Насыщенные кислоты детектируют, опрыскивая хроматограмму сначала 0,05%-ным водным раствором родамина В, а затем 10 н. КОН. Пятна появляются немедленно или спустя несколько минут в виде светлых зон на розово-красном или синевато-красном фоне.

Метиловые эфиры высших жирных кислот успешно удается разделить в зависимости отгСтепени ненасыщенности на пластин­ ках си л у фол У Ф т * обработанных 5%-ным водным раствором A g N 0 3, нагреванием пластинки в течение 15 мин при 110 °С и по­ следовательным хроматн*рафнр)ванием в смесях:

I. к-Гексан-—бензол ( 6 5 : 3.

II, «-Гексан — бензол ( 9 б : 5 Й ).

III. Бензол — метанол (99:1).

Специальная часть Таблица Значения hRF высших жнрных кислот по Анкеру и Сонанини [1] 90%-ная Уксусная Уксусная уксусная Кислота кислота—вода кислота, кислота, 10 см (1 : 1), 5 см 8 см Лигноцериновая 10 Бегеновая 55 16 62 25 Арахиновая+эруковая 38 Стеариновая+эйкозеновая Пальмитиновая+олеиновая 78 48 Мнристиновая+линолевая 85 60 -72 Лаурнновая+линоленовая Каприновая — 98 Каприловая — 100 Рицинолеиновая Для более четкого разделения пятен рекомендуется ступенча­ тая хроматография (до '/г, 3А длины и на всю длину пластинки).

В качестве реактива для обнаружения пользовались 5%-ным ра­ створом фосфор но молибденовой кислоты в этаноле с добавлением 4% HCI. После нагревания, до 100—110°С кислоты наблюдаются в виде синих пятен на бледно-желтом фоне [12].

6.5.3. Оксикарбоновые, дикарбоновые и трикарбоновые кислоты Выделение кислот из мочи. Мочу оставляют стоять несколько часов при 4 °С, чтобы осела большая часть мочевой кислоты. По­ сле отфильтровывания 50 мл заливают в колонку амберлита IR4B (в ацетатной форме);

размер 2 X 18 см;

скорость протека­ ния 1 мл/мин. Колонку промывают 500 мл дистиллированной во­ ды-н кислоты вымывают 50 мл 1%-ной муравьиной кислоты и за­ тем 500 мл 11%-ной 'муравьиной кислоты. Элюаты концентриру­ ют в вакууме при 40 °С и досушивают в эксикаторе. Остаток рас створяют в 10 мл дистиллированной воды и обесцвечивают, про­ пуская через пермутитовую колонку ( 1 X 1 8 см), которую затем промывают 250 мл дистиллированной воды. Раствор выпаривают досуха, а остаток растворяют в 0,5 мл воды и центрифугируют.

Прозрачный раствор наносят на пластинку.

Разделение по Пассера, Педротти и Феррара t[13], Приготовление слоя и хроматография. Слой готовят обычным способом из снлнкагеля G и после нанесения 5—10 мкг проб хроматографируют в системе «-Лропанолг-,28В%-ный аммиак (70:30) (I, см. табл. 108) или этанол — хлоро Специальная часть Таблица Значения hRp некоторых биологически важных кислот [13] Система Система Кислота Кислота п I I II а-Кетоглугаровая 27 Ю Адипиновая 53 6-Кетомасляная 4 Щавелевая 42 Пировиноградная 5 Молочная 7 Дегидроаскорбиновая Яблочная 17 Аскорбиновая 22 Янтарная 30 50 Гликолевая 22 Левулиновая Фумаровая 20 форм —28%-ный аммиак —вода (70:40:20:2) (II, до расстояния 13 см от старта).

Обнаружение. После сущки под инфракрасной лампой хроматограмму оп­ рыскивают 0,1%-ным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола в 95%-ном этаноле (Д 31). После кратковременного нагревания все вещества кислого характера проявляются в виде розовых пятен на голубом фоне. Если продолжить нагре­ вание, пятна кетокислот бледнеют, тогда как карбоновые кислоты сохраняют розовую окраску. При действии на хроматограмму паров аммиака в течение нескольких секунд можно улучшить контрастность розовых пятен.

Для разделения дикарбоновых кислот в литературе предложено несколька способов |M0, 14], » которых используются слои силикагеля, кремнезема или порошкообразной целлюлозы. Разделение моно-, ди- и трикарбоновых кислот описал Ганзен [23].

Разделение дикарбоновых кислот и оксикислот по Банхеру и Шерцу ([2] Приготовление слоя. 15 г порошкообразной целлюлозы MN 300 (Macherey— Nagel) без связующего вносят в 70 мл дистиллированной воды и гомогенизиру­ ют в течение 1 мин. После нанесения на стеклянную пластинку сушат в течение ночи при комнатной температуре.

Таблица Значения hRF некоторых оксикарбоновых, дикарбоновых и трикарбоновых кислот [2] Системе Система Кислота Кислота I II I II Ш ш 35 48 Винная Глиоксиловая 75 Лимонная 63 58 28 Пировинрградная 90 86 Поло­ са 87 75 Молочная Щавелевая 80 33 Гликолевая Малоновая 90 74 70 Яблочная Янтарная 95 82..#* Специальная часть Хроматографирование. Около 10 мкг пробы наносят на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки и разделяют в одной из следующих систем:

I. Этилацетат—-муравьиная кислота — вода (3:1:1).

II. «-Бутанол — муравьиная кислота — вода (30 : 5 : 10).

III. н-Пропанол— концентрированный раствор аммиака (6:4).

За 60 мин перемещение составляет около 14 см.

Обнаружение. После испарения растворителя хроматограмму опрыскивают реактивом Д 31. Кислота образует ярко-красные пятна на голубом фоне.

6.5.4. Кетокислоты Кетокислоты можно разделить после превращения в родани новые (4-оксо-2-тионтиазолидиновые) производные на слоях аце тилированной целлюлозы или в форме 2,4-динитрофенилгидразо нов на еиликагеле.


Разделение роданиновых производных кетокислот по Ринку и Германну \[16\ Приготовление производных. 2 мл 0,5%-ного раствора кетокислот в 96%-ном этаноле смешивают с 4 мл охлажденного реактива (250 мг роданина, 5 капель 25%-ного аммиака и 50 мг хлорида аммония растворяют при нагревании в Таблица Значения hRF роданиновых производных кетокислот [16] Система Кислота ш i II IV а-Кетопропионовая 55 32 54 22 32 Щавелевоуксусная 67 34 а-Кетомасляная 71 47 53 а-Кетоизовалериановая 73 51 а-Кето-к-валериановая 59 26 41 Y-Кето-я-валериановая 29 4 9 а-Кетоглутаровая 78 65 68 а-Кетокапроновая 68 58 a-Kero-D-глюкояовая, калиеиая соль — 78 70 а-Кетоизокапроновая 83 79 а-Кетоэнантовая 87 83 а-Кетокаприловая 65 54 Фенилглиоксиловая 74 62 а-Кетопеларгоновая 60 47 Фенилпировиноградиая 67 4-Оксифенилпировиноградная 49 — Роданин — 528 Специальная часть 100 мл этанола} и смесь нагревают с обратным холодильником на водяной ба­ не при 65 — 75 "С в течение 10 мин.

Приготовление слоя. 10 г целлюлозы MN 300 Ac (Macherey — Nagel) сме­ шивают с 50 мл метанола и 5 мЛ дистиллированной воды и гомогенизируют 1—2 мин. Суспензию наносят на пластинки размером 20X20 см и сушат 5— 10 мин при 60 "С.

Хроматографирование. После нанесения 0,5—2 мкг производных на пластин­ ку хроматографируют до высоты 10 см (приблизительно 100—120 мин в зави­ симости от системы растворителей) в одной из следующих смесей:

I. к-пропанол—к-бутанол— раствор углекислого аммония (2 части 10%-ного раствора углекислого аммония и 1 часть 5 н. раствора аммиака) (40:20:30).

II. м-Пропанол — к-бутанол—раствор углекислого аммония (30:30:30).

III. к-Пропанол — я-бутанол — раствор углекислого аммония (35 : 25 : 30).

IV. н-Пропанол— раствор углекислого аммония (2:1).

Используют камеры без насыщения.

Производные наблюдают в УФ-свете при 365 нм в виде темных пятен.

Разделение кетокислот в форме 2,4-динитрофенилгидраэонов по Ронкайнену [17] Получение производных кетокислот из крови. 1 часть крови из вены смеши­ вают с 4 частями 0,66 н. серной кислоты и к смеси при постоянном перемеши­ вании прибавляют 1 часть 10%-ного раствора вольфрамовокислого натрия. Ос­ тавляют стоять 10 мин, затем фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным и иметь' рН 4—4,5.

В пробирке с притертой пробкой смешивают 20 частей фильтрата с 1 ча­ стью 0,2%-яого раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 н. НС1. После пере­ мешивания и стояния в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин прибавляют 2 капли формальдегида. Экстрагируют повторно эфиром, пока эфирный слой не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Объединенные вы­ тяжки выпаривают в вакууме досуха при температуре ниже 35 "С. Остаток хорошо перемешивают с 1 Мл раствора двууглекислого натрия, добавляют 1 мл хлороформа, перемешивают и центрифугируют. Нейтральные гидразоны и воз­ можный избыточный динитрофенилгидразин находятся в органическом слое, а в верхнем водном слое находятся гидразоны кетокислот.

и* о О Q Рис. 97. Разделение кетокислот в форме о 2,4-динитрофенилгидразонов [17].

Сорбент: сялвжагель G;

система: петролейный эфир (т. кип. 60—«0 "С) —этнлфорннат(13 : 7);

°о обнаружение: в УФ-свете.

R — 2,4-дмнтрофенилшдрааин;

1 — а-кето-ft метилвалернановая;

2 — снсетоиэокалроновая;

3 — а-кетоязовалержановяя;

4 — омсетомасля / 2 3 4 5 б 7 в ная;

5 — пнровиноградная;

в — левулнновая;

,7 — а-кетоглутаровая;

в — щавелевоуксусная.

,*fi Специальная часть Хроматографирование. После нанесения определенного количества раствора гидразонов на слой силикагеля, полученный из суспензии 30 г силикагеля G в 60 мл дистиллированной воды с добавлением 5 мл пропионовой кислоты, хроматографируют в смеси петролейный эфир (т. кип. 60—80 °С) — этилформиат (13:7). На рис. 97 можно видеть пример разделения некоторых кетокислот.

Хроматографическое обнаружение ацетоуксусной кислоты и ацетона в моче i[15] Приготовление слоя. 10 г порошкообразной целлюлозы MN 300 Ac (Mache геу — Nagel) гомогенизируют в течение 1 мин в смеси метанол — вода (50:5).

Приведенного количества достаточно для нанесения слоя на 5 пластинок раз­ мером 20X20 см. Слои сушат сначала при комнатной температуре, затем в те­ чение 5—10 мин при 60 °С.

Получение производных. К 5 мл прозрачной (в случае необходимости про­ фильтрованной) мочи приливают по каплям 0,4%-ный раствор 2,4-динитрофенил гидразина в 2 и. НС1 до прекращения образования мути или осадка. После стояния в прохладном месте в течение 30 мин экстрагируют 1—2 мл этилацета та и требуемое количество органической фазы (необходима предварительная проба!) наносят на хроматограмму. Одновременно с пробой хроматографируют эталон.

Хроматографирование. Хроматограмму элюируют смесью I метанол — во­ да — 25%-ный аммиак (90:10:3) или II к-пропанол — раствор углекислого ам­ мония (2 части 10%-ного раствора углекислого аммония на 1 часть 5 н. аммиа­ ка) в отношении 2,5: 1. По окончании разделения (30—40 мин, перемещение на 10 см) сушат на воздухе.

Обнаружение. 2,4-Динитрофенилгидразоны ацетоуксусной кислоты и ацето­ на наблюдают в виде желтых пятен на свету и темных пятен в УФ-свете.

Значения hRp: ацетоуксусная кислота 82 (I) и 91 (II), ацетон 48 (I) и 52 (И).

Разделение а'кетокислот в форме 2,4-динитрофенилгидразонов по Байзеру [3] Приготовление слоя. Слои (20X20 см) приготовляют обычным способом из микрокристаллической целлюлозы MN 300 (Macherey—Nagel).

Получение производных описывается в предыдущей методике.

Хроматографирование. После нанесения проб на пластинку хроматографи­ руют в смеси н-бутанол — этанол—0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ). Разделение длится около 4 ч.

Двумерное электрофоретически-хроматографическое разделение. В первом направлении проводят электрофорез в буферном растворе пиридин — ледяная ук­ сусная кислота —вода (10: 1 :89) с рН 6,2 при 45—50 В/см в течение прибли­ зительно 2 ч. Вместо этого буфера можно пользоваться также 0,05 М раствором Na2C03, но четкость разделения несколько ухудшается. После высушивания в токе воздуха разделение во втором направлении ведут в системе к-бутанол— этанол — 0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ) (рис. 98).

Обнаружение. Гидразоны ввиду их собственной желтой окраски легко на­ блюдаются без применения реактивов (чувствительность около 1 мкг). Окраску пятен можно сделать более яркой, опрыскивая насыщенным спиртовым раство­ ром КОН.

Количественное определение. Участки сорбента с пятнами после разделения вырезают и элюируют 0,2 М раствором NaHC0 3. После центрифугирования прозрачный фильтрат фотометрируют при 370—380 им. Для построения кали­ бровочной кривой подобным же образом хроматографируют заведомые образ­ цы гидразонов кислот.

630 Специальная часть • J:-.

i.

i Cmapm • •* - 1.

+ Рис. 98. Двумерное разделение 2,4-динитрофенилгидразонов «-кетокислот ком­ бинацией электрофореза и тонкослойной хроматографии [3].

Сорбент: целлюлоза MN 300;

системы: первое направление — электрофорез, пиридин — ледя­ ная уксусная кислота —вода (10: 1 : 89), рН 6,2, 45 В/см, второе направление — хроматогра­ фия, к-бутаиол — этанол — 0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ).

/ — 2,4-динитрофенилтвдразин;

2а — цис-ДНФГ пировиноградной кислоты;

26 — тракс-ДНФГ пировиноградной кислоты;

За — цис-ДНФГ глиокслловой кислоты;

36 — тракс-ДНФГ глиокси ловой кислоты;

4а —цис-ДНФГ щавелеооуксусной кислоты;

46 — гракс-ДНФГ щавелевоук сусной кислоты;

3 — ДНФГ а-кетоглутаровой кислоты.

Фенолкарбоновые кислоты 6.5.5.

Адреналин и норадреналин относятся к соединениям, оказы­ вающим наибольший вазопрессорный эффект. В последнее время бьнг хорошо изучен биосинтез этих веществ, предшественником которых является тирозин. Были обнаружены два пути их мета­ болизма. Первый проходит через катехоламины, второй связан с метилированием норадреналина. Из всего, что известно в настоя­ щее время, следует, что для изучения причин гипертонической болезни весьма желательно уметь контролировать уровень аминов в крови и их выделение с мочой. Одновременно следует характе­ ризовать конечные продукты метаболизма. Нарушения метабо­ лизма могут корениться в промежуточных метаболических Про­ цессах или в повышенном продуцировании аминов (например, в новообразованиях или при феохромоцитоме) и соответственно вы Специальная часть 53_ ражаться в их накоплении (серотонин в эритроцитах). Определение этих веществ в моче может служить не только для диагностики раковых заболеваний или фсохромоцитомы, но и для оценки функционального состояния симпатико-адренальной системы.

У пациентов с раковыми заболеваниями с мочой выделяются значительные количества 5-окситриптамина (серотонина) и его метаболитов, например 5-оксииндолилуксусной и 4-окси-З-метокси миндальной кислот. При феохромоцитоме в моче наблюдаются из­ быточные количества 4-окси-З-метоксиминдальной кислоты. В мо­ че пациентов с нейробластомой, ганглионейроном и меланомои отмечается интенсивное выделение гомованилиновой кислоты.

Открытие фенолкарбоновых кислот по Эрссеру и сотр. [7] Приготовление слоя. Пользуются коммерческими готовыми слоями микро­ кристаллической целлюлозы на алюминиевой или пластмассовой подложке (Merck или Macherey — Nagel).

Приготовление проб. 1—5 мл свежей мочи с содержанием 1 мг креатинина (количество анализируемой пробы согласовывают с концентрацией креатинина) подкисляют концентрированной соляной кислотой, насыщенной сульфатом ам t t/ (jtdma/n_ „ ' Рис. 99. Двумерная хроматография фенолкарбоновых кислот в моче больного фенилкетонурией [7].

Сорбент: целлюлоза MN 400;

системы: первое направление — пропанол-2 — н-бутанол — трет бутанол — NH4OH (уд. масса 0,88)—вода ( 4 : 2 : 2 : 1 : 2 ), второе направление — бензол — уксусная кислота — вода (70:29: 1);

обнаружение: реактив Паули.

а — фенилмолочная кислота;

б — о-оксифенилуксусная кислота;

в — л-оксифенилуксусная кислота;

г — гомованилиновая кислота;

д — N-ацетилтирозин;

е — 4-окси-З-метоюсиминдаль ная кислота;

ж — л-оксифенилмолочная кислота;

з —га-оксиминдальнаякислота;

и — Б-оксн индолилуксусная кислота.

532 Специальная часть мония, и быстро экстрагируют четырехкратным объемом эфира (2X20 с). После центрифугирования эфирный слой выпаривают досуха при 40—50 "С. Остаток растворяют в 0,2 мл 50%-ного водного пропанола-2.

Хррматографирование. 10 мкл раствора наносят на пластинку и элюируют смесью бензол — уксусная кислота — вода (70:29:1) до расстояния 7,5 см от старта (25 мин). Если проводят двумерное разделение, в первом направлении хроматографируют в смеси пропанол-2 — «-бутанол — грег-бутанол—аммиак (уд. масса 0,88) — вода ( 4 : 2 : 2 : 1 : 2 ) и во втором — смесью бензол — уксусная кислота — вода (70: 29 :1) (рис. 99).

Обнаружение. После высушивания хроматограммы ее опрыскивают реакти­ вом Паули (1 объем 5%-ного раствора NaNOj и 1 объем 9%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 1 н. НС1);

через 5 мин прибавляют 2 объема на­ сыщенного раствора ЫагСОз и 1%-ным водным раствором прочного красного GG. Наиболее сильного контраста между пятнами и фоном достигают, предва­ рительно опрыскивая слой насыщенным раствором Na2C03.

Система пропанол-2 — «-бутанол— трег-бутанол— аммиак (уд. масса 0,8) — вода ( 4 : 2 : 2 : 1 : 2 ) удобна для разделения гиппуровой и фенилмолочной кислот;

детектирование производят 5%-ным раствором п-диметиламинобензаль дегида в смеси уксусной кислоты н ацетона (1:4).

Томогентизиновая и 4-окси-З-метоксиминдальная кислоты удовлетворительно делятся в системе «-бутанол — этанол — вода (20 : 1 : 2) на силикагеле G.

Выделение метилмалоновой кислоты можно контролировать хроматографи чески на силикагеле G. После нанесения двукратного количества эфирной вы­ тяжки (приготовление см. в предыдущей методике) разделение ведут в смеси амилацетат — уксусная кислота —вода (30:10:3) до расстояния 7,5 см от старта. После высушивания хроматограмму погружают в 0,5%-ный раствор диазосоли прочного синего В в этаноле с добавлением 4% уксусной кислоты и 10 мин нагревают в токе теплого воздуха.

Круговая хроматография фенолкарбоновых кислот и фенолоспиртов по Кэзеру [9] Приготовление слоя. Слой готовят обычным образом из микрокристалличе­ ской целлюлозы.

Приготовление пробы. К 5 мл мочи или надосадочной жидкости А после центрифугирования прибавляют НС1 до рН 1, гидролизуют нагреванием в тече­ ние 30 мин при 100 С, затем экстрагируют трижды по 5 мл этилацетата. Со­ единенные вытяжки упаривают досуха и остаток растворяют в 0,5 мл мета­ нола.

Таблица Значения hRF фенолкарбоновых кислот и фенолоспиртов [9] Окрашивание hRF Вещество с диааотированным л-нитроанилином Ванилиновая кислота Фиолетовое 5-Оксииндолилуксусная кислота 37 Красное 4-Окси-З-метоксиминдальная кислота 44 Фиолетовое 51 Синее Гомованилиновая кислота л-Оксифенилуксусная кислота 62 Розовое о-Оксифенилуксусная кислота 86 Розово-фиолетовое З-Метокси-4-оксифенилэтанол Синее.-J»

Специальная часть Таблица Значения hRF феиольных аминов [9] Окрашивание с hRF диазотированным Вещество л-нитроанилином Фиолетовое Норметанефрин »

Вещество X 66 Красное Октопамин 70 Синее З-Метокситир амин Фиолетовое Метанефрин 86 Красное л-Симпатол Хроматографирование. 5 мкл раствора наносят на пластинку и хроматогра фируют в течение ~ 4 ч в системе пропанол-2— аммиак — вода ( 8 : 1 : 1 ).

Обнаружение. После сушки хроматограммы при комнатной температуре проводят обнаружение раствором диазотированного /г-нитроанилина (табл. 111, 112).

Скринингу З-метокси-4-оксифенилэтанола в моче посвящена работа Эбинге ра и сотр. [21]. Хроматографичееким обнаружением ванилиновой кислоты в мо­ че занимались Ярсумбек и сотр. [25] и Кнуппен и сотр. [26], гомогентизиновой кислоты — Амбель и сотр. [24], гиппуровой — Гарцке и сотр. [22], гиппуровой и метилгиппуровой — Ван Керховен и сотр. [30]. Кислоты цикла Кребса иссле­ довали Крайкер'и Берчи :[Й8].

Круговая хроматография фенольных аминов по Кэзеру [9] Приготовление слоя. Слой готовят из микрокристаллической целлюлозы обычным способом.

Приготовление пробы. 5 мл мочи или надосадочной жидкости А после цент­ рифугирования доводят до рН 1 и гидролизуют в течение 30 мин при темпера­ туре 100 °С. Затем 5 и. раствором КгСОз устанавливают рН 5, прибавляют катионит дауэкс 502 (100—200 меш, в Н + -форме в количестве 5 г) и хоро­ шо взбалтывают. После центрифугирования сливают жидкость, осадок промыва­ ют сначала трижды по 0,5 мл 0,1 М раствором ацетата натрия и далее четыреж­ ды 1 н. раствором аммиака в 65%-ном этаноле. Промывные воды соединяют и выпаривают досуха;

остаток растворяют в 1 мл метанола.

Хроматографирование. 40 мкл раствора хроматографируют в смеси пропа­ нол-2— аммиак — вода ( 8 : 1 : 1 ).

Обнаружение. Пятна обнаруживают способом, описанным для фенолкарбо новых кислот.

Количественное определение гомованилиновой, ванилиновой и 4-окси-З-метоксиминдальной кислот в моче по Тауце и сотр. [19] Приготовление слоя. 25 г смеси силикагеля G и кремнезема G (Merck) в от­ ношении 1:1 и 2,5 г красителя ZS супер суспендируют в 90 мл дистиллирован­ ной воды. Слои толщиной 0,25 мм готовят на стеклянных пластинках размером 20X20 см и сушат в течение 60 мин при 105 °С.

Приготовление проб. 10—20 мл мочи подкисляют, насыщают твердым хло­ ридом натрия и экстрагируют трижды по 50 мл эфира. Соединенные вытяжки выпаривают и остаток растворяют в 1 мл этанола.

•§34 Специальная часть Хроматографирование. 100 мкл раствора наносят на пластинку и сначала хроматографируют на расстояние 8 см смесью пропанол-2 — этилацетат — ЫЬЦОН — вода (45: 30 : 17:8). После сушки дважды элюируют смесью бензол— уксусная кислота (9:1) на расстояние 15 см в насыщенной парами раствори­ теля камере.

Обнаружение. Пятна веществ наблюдают в ультрафиолетовом свете при 254 нм.

Количественное определение. Пятна эдюируют 2,5 мл смеси 2%-ного рас­ твора ШгСОз и С метанола (1:3) в центрифужных пробирках. После центрифу­ гирования при 5 С 2 мл надосадочной жидкости смешивают с 0,2 мл свеже­ приготовленного реактива Розе (раствор 1:0,25-ный раствор п-аминофенил-фе нил-р-диэтиламиноэтилсульфона в 1%-ной НС1;

раствор II: 0,5%-ный раствор NaNC^;

перед употреблением хорошо перемешивают оба раствора в отношении 3 : 1 при 0*С).

Окрашенные растворы, образующиеся из оксиметоксиминдальной и ванили­ новой кислот, фотометрируют при 490 нм, а при реакции с гомованилиновой кислотой — при 370 нм (через 30 и 60 мин). Аналогично проводят холостой опыт. Количество кислоты определяют по калибровочной кривой.

Открытие катехоламинов и их метаболитов по Де Поттеру и сотр. '[6] (см. также [27, 30]) Приготовление слоя. 7,5 г целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel) смеши­ вают с 45 мл метанола и через 5 мин наносят слой толщиной 0,3 мм. Сушат 10 мин при 105 °С и сохраняют в эксикаторе над безводным хлоридом кальция.

Хроматографирование. После нанесения проб на пластинку элюируют к-бу танолом, насыщенным 3 н. НС1, на расстояние 15 см (около 3 ч) при комнат­ ной температуре.

Обнаружение. Высушенную хроматограмму опрыскивают раствором крас­ ной кровяной соли [0,44 г Кз [Fe(GN)e] в 100 мл фосфатного буферного раство­ ра] (рН 7,8) и раствором этилендиамина, разбавленного дистиллированной во­ дой в отношении 1:1. После высушивания при 50 — 60 "С пятна наблюдают при 360 нм.

Другой способ обнаружения основан на опрыскивании хроматограммы рас­ твором диазотированного я-нитроанилина (раствор I: 0,1 г n-нитроанилина рас­ творяют в 2 мл концентрированной НС1 и доливают дистиллированной водой до 100 мл;

раствор 11:2 г NaN02 в 100 мл дистиллированной воды;

раствор III:

10%-ный раствор K2CO3J перед употреблением смешивают растворы в отноше­ нии 1 : 1 : 2 ). После этой реакции можно провести и количественное определение, вырезая участки сорбента с пятнами, элюируя их 0,1 н. НС1, с последующим фотометрированием.

Значения hRp некоторых веществ: адреналин 38, норадреналин 31, норме танефрин 48, метанефрин 58, 3,4-дноксиминдальная кислота 80, 4-окси-З-мето ксиминдальная кислота 89.

ЛИТЕРАТУРА 1. Anker L., Sonanini D., Pharm. Acta Helv., 37, 360 (1962).

2. Bancher E., Scherz H:, Microchim. Acta, 1964, 1159.

3. Bayzer H., J. Chromatogr., 57, 281 (1971).

4. Bergelson L. D., Djatlovitskaja E. V., Voronkova V. V., J. Chromatogr., 15, 191 (1964).

5. Braun D., Oeenen H., J. Chromatogr., 7, 56 (1962).

6. De Potter W. P., Vokten R. F., De Schaepdryver A. F., Experientia, 21, (1965).

7. Ersser R. S., Oakley S. E., Seakins I., CHn. chim. Acta, 30, 243 (1970).

8. Kaufmann N. P., Khoe T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 81 (1962).

9. Paser H., J. Chromatogr., 82, 127 (1973).

.««*.

Специальная часть 10. Кпарре Е., Peteri D., Z. Analyt. Chem., 188, 184 (1962).

11. Lynes A., J. Chromatogr., IS, 106 (1964).

12. Michdlec C, Reinisovd I., Kurs tenkovrstve chromatografie. Sbornik pfedna Sek., Praha, 1973, 84.

13. Passera C, Pedrotti A., Ferrari G. G., J. Chromatogr., 14, 289 (1964).

14. Petrowitz H. L, Pastuska G., J. Chromatogr., 7, 128 (1962).

15. Rink M., Herrmann S., J. Chromatogr., 12, 249 (1963).

16. Rink M., Herrmann S., J. Chromatogr., 14, 523 (1964).

17. Ronkainen P., J. Chromatogr., 11, 228 (1963).

18. Seligman I. M., Doy F. A., Analyt. Biochem., 46, 62 (1972).

19. Tautz N. A., Voltmer G., Schmid., Klin. Wschr., 43, 233 (1965).

20. Wagner H.. Pohl P., Biochem. Z., 340, 337 (1964).



Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.