авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 13 | 14 || 16 | 17 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 15 ] --

В качестве системы растворителей авторы статьи [24] поль зовались бинарными смесями полярных органических раствори телей (метанол, м-бутанол, ацетон, тетрагидрофуран, уксусная кислота, циклогексанон) с 1, 2, 3, 6 и 12 М соляной кислотой в отношении (20:1). Для обнаружения катионов служили раз личные реактивы. Cr(III) и Ti обнаруживали перекисью водорода (Д 165), Se(IV) и Te(IV) —раствором хлорида олова (Д 89), А1, Be и In—ализарином (Д 1) и Са и Mg—тимолфталеииом (Д 188).

Для детектирования Bi(III), Mo(VI), Re(VII), Sb(III), Sn(IV) и W(VI) авторы применяли дитиол (Д50), а для обнаружения Hg(II), T1(I) и Z n — дитизон (Д 516). 3а обнаруживали рода мином В (Д176), Nh(V)—галловой кислотой (Д137), Hf, акти ноиды и лантаноиды, Sc, Th, U(VI), Y и Zr — реактивом арсена зо III ( Д Ю б ). Некоторые тяжелые металлы, например Ag, Аи, Cd, Co, Cu(II), Fe(III), Ir(IV), Ni, Pb(II), Pd(II), Pt(IV), Rh(III) и Ru(III) обнаруживали на хроматограмме действием Na 2 S.

Ва и Sr обнаруживают родизонатом натрия (Д179), Ge — фенил флуороном (Д70), As(IH), Mn(II) и V(IV)—аммиачным раст вором окиси серебра (Д59а).

В упомянутой работе авторы графически изобразили зависи мость значений RF всех катионов от молярности соляной кислоты в системе растворителей. Во второй части работы они приводят обзорную таблицу оптимальных систем растворителей для деле ния различных смесей катионов.

Специальная часть Бергер и сотр. [1] подвергали делению катионы на слоях ка тионита целекс 100 (Na+). В качестве растворителей они приме няли растворы различных солей (хлорид лития и азотнокислый аммоний) и концентрированную азотную кислоту.

Москвин и сотр. [77] применили для разделения смеси многих ионов метод непрерывной двумерной хроматографии.

ЛИТЕРАТУРА 1. Berger J. A., Meyniel G., Petit J., J. Chromatogr., 29, 190 (1967).

2. Brinkman N. A. Th., de Vriss G., van Dalen E., J. Chromatogr., 22, (1966).

3. Brinkman N. A. Th., de Vries G., von Dalen E., J. Chromatogr., 23, (1966).

4. Brinkman N. A. Th., Veltkamp H., J. Chromatogr., 24, 489 (1966).

5. Brinkman N. A. Th., de Vries G., van Dalen E., J. Chromatogr., 25, (1966).

6. Brinkman N. Th., Sterrenburg P. J. J., de Vries G., J. Chromatogr., 54, (1971).

7. Brinkman N. A. Th., de Vries G., J. Chromatogr., 56, 103 (1971).

8. Faner H. A., Analyst, 94, 392 (1969).

9. Frei R. W., Ryan D. E., Analyt. Chim. Acta, 37, 187 (1967).

10. Frei R. W., Stillman H., Microchim. Acta, 1970, 184.

11. Frodyma M. M., Zaye D. F., Lien V. Т., Analyt. chim. Acta, 40, 451 (1968).

12. Gagliardi E., Likussar W., Microchim. Acta, 1965, 765.

13. Gagliardi E., Pokorny G., Microchim. Acta, 1967, 228.

14. Gagliardi E., Pokorny G., Microchim. Acta, 1967, 550.

15. Galik A., Vincourova A., Analyt. chim. Acta, 46, 113 (1969).

16. Graham R. I. Т., Bark L. &., Tinsley D. A., J. Chromatogr., 39, 200 (1969).

17. Hashmi M. H., Shahid M. A., Chunghiai F. R., Microchim. Acta, 1968, 309.

18. Hashmi M. N.. Chunghtai F. R., Microchim. Acta, 1971, 924.

19. Ikeda N., Oguma K., J. Chromatogr., 31, 289 (1967).

20. Janauer G. E., Johnston R. C, Analyt. Chem., 38, 786 (1966).

21. Johri K. N.. Mehra H. C, Microchim. Acta, 1971, 317.

22. Konig K. H., Demel K., J. Chromatogr., 39, 101 1969).

23. Konig K. H., Graf H., J. Chromatogr., 67, 200 (1972).

24. Kuroda R., Yoshikuni N., Kawabuchi K., J. Chromatogr., 47, 453 (1970).

25. Kuroda R., Kojima N., Oguma K., J. Chromatogr., 69, 223 (1972).

26. Lederer M., Rinalduzzi В., J. Chromatogr., 68, 237 (1972).

27. Lepri L, Desideri P. C, Coas V., Cozzi D, J. Chromatogr., 47, 442 (1970).

28. Lepri L, Desideri P. C., Mascherini R., J. Chromatogr., 70, 212 (1972).

29. Lesigang M., Microchim. Acta, 1964, 34.

30. Lesigang M., Hecht F., Microchim. Acta, 1964, 508. * '31. Lesigang-Buchtela M., Microchim. Acta, 1966, 408.

32. Lesigang-Buchtela M., Microchim. Acta, 1969, 1027.

33. Merkus F. W., J. Chromatogr., 41, 497 (1969).

34. Miket'ukovd V., Frei R. W., J. Chromatogr., 47, 427 (1970).

35. Miket'ukovd V., Frei R. W., J. Chromatogr., 47, 435 (1970).

36. Murray R. W., Passarelli R. J., Analyt. Chem., 39, 282 (1967).

37. Oguma K-, J. Chromatogr., 42, 96 (1969).

38. Oguma K., Kuroda R., J. Chromatogr., 52, 339 (1970).

39. Oguma K., Kuroda R., J. Chromatogr., 61, 307 (1971).

40. Pierce Т. Е., Flint R. F., Analyt. Chim. Acta, 31, 595 (1964).

41. Pierce Т. В., Flint R. F., J. Chromatogr., 24, 141 (1966).

42. Pokorny G., Microchim. Acta, 1968, 386.

47И Специальная часть 43 Praiptrt Т., Lederer М„ J. Chromatogr., 65, 460 (1972).

44, Stltir Нч Seller M., Helv. chim. Acta, 43, 1939 (1960).

4ft Setltr N.. Seller M., Hfilv. chim. Acta, 44, 939 (1961).

4в Seller H., Rothweiler W., Helv. chim. Acta, 44, 941 (1961).

47. Seller H., Helv. chim. Acta, 46, 2629 (1963).

48. Seller H., Seller M., Helv. chim. Acta, 48, 117 (1965).

49. Senf H., J. Chromatogr., 21, 363 (1966).

50. Senf H., J. Chromatogr., 28, 331 (1967).

51. Senf H., Microchim. Acta, 1969, 552.

52. Shimlzu Т., Ishlkura R., J Chromatogr., 56, 95 (1971).

53. Soljid Z., Turtna S., Marjanovii V., Microchim. Acta, 1969, 552.

54. Soljie 1., J. Chromatogr. 61, 390 (1971).

55. Tukeshita R., Agakl H., Fujita M., Sakagami Y., J. Chromatogr., 58, (1970).

56. Zaye D. F., Frei R. W., Frodyma M. М„, Analyt chim. Acta, 39, 13 (1967).

57. Zetlmelsl S. J. M. H., Haworth D. Т., J. Chromatogr., 30, 637 (1967).

58. Hashml M. H., et al., Microchim. Acta, 1970, 200.

59. Hul K. S., Davis B. A., Boulton A. A., J. Chromatogr., 115, 581 (1975).

60. Kellner R., Microchim. Acta, 1975, 253.

61. Massoomi Z., Haworth D., J. Chromatogr., 48, 581 (1970).

62. Muchovd A., Jokl V., Acta Fac. pharm. Univ. Comeniana, 17, 99 (1969).

63. Shimizu Т., Katsuno M., Ilzuka N.. J. Chromatogr., 106, 230 (1974).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 64. Brinkman V. A. Th., de Vrles G., lochensen R., de Jong G. J., J. Chromatogr., 102, 309 (1974).

65. Dutklewicz Т., Podeskl A., Komsta-Szumska., Llsczyna I., Bromatol. Chem.

Toksykol., 6, 381 (1973).

66. Gilt S., Luczklewicz I., Farm. Pol., 33, 145 (1977).

Haworth D. Т., Hung Y.-W., J. Chromatogr., 108, 201 (1975).

67.

68. Husain S. W., Bayburdi A., Analysis, 2, 746 (1974).

69. Ishlda K, Orуи F., Morite Т., Talanta, 24, 70 (1977).

70. de Jong G. J., Кок W. Th., Brinkman U. A., J. Chromatogr., 135, 249 (1977).

71. Костиков А. П., Егорова С. Н., Буленков Т. И. Изв. высш. учебн. зав., хим.

технол., 17, 1257 (1974).

72. Kuroda R., Ogutna К., Otani M., J. Chromatogr., 96, 223 (1974).

73. Kuroda R., Takahashi Т., Oguma K-, Bull. Chem. Soc. Japan, 49, 815 (1976).

74. Kuroda R., Yoshikuni N.t Tateno K., Z. anal. Chem., 290, 46 (1978).

75. Leprl L, Deslderi R. G., Tanturti G., J. Chromatogr., 147, 375 (1978).

76. Lohmutler M., Heizmunn P., Ballschmiter K-, J. Chromatogr., 137, 165 (1977).

77 Москвин Л. Н., Мозжухин А. В., Царицына Л. Г. Ж. анал. хим., 30, (1975).

78. Pal Ch. К., Chakraburthy А. К., J. Indian Chem. Soc, 50, 667 (1973).

79. Pawelczyk J., Sierzant M., Farm. Pol., 30, 37 (1977).

80. Qureshi M., Rawat J. P., Mathur K. N.. Blndra Т., Experientia, 31, 13 (1975).

81. Мясоедова Г. В., Валынец М. П., Ковешникова Т. А., Беляев Ю. И., Дубро ва Т. В. Ж. анал. хим., 29, 2262 (1974).

82 Rao A. L. J., Shekbar Ch., Z. anal. Chem., 277, 126 (1975).

83 Suzuki M., Kaiho F., Takltani S., Eisei Kagaku, 21, 47 (1975).

84 Szarvas P., Keleman J. В., Acta Phys. Chim. Lebrecina, 18, 235 (1973).

85. Soljlc Z., Grba V., Z. anaL Chem., 278, 363 (1976).

86. Thielemann H, Z. anal. Ghem., 275, 206 (1975).

Специальная часть 5.9.2. Анионы Число статей, описывающих применение метода ТСХ для раз деления анионов, значительно меньше числа статей, посвященных разделению катионов.

5.9.2.1. Галогениды и псевдогалогениды Гальярди и Покорный [4] подвергали разделению галогенид- и псевдогалогенид-ионы SCN~, N 3, Fe(CN)|", Fe(CN) " и CN~ на слоях MN-силикагеля G HR в системах низших алифатических спиртов с добавлением бутиламина или бензиламина. Тилеманн [10] для разделения хлоридов, гипохлоритов, хлоратов и перхлора тов пользовался готовыми пластинками силикагеля по Шталю и системой бутанол—ацетон—аммиак—пиридин (60 : 25 : 5 : 10) или пластинками силуфол UV254 и системой бутанол — пиридин — ам миак ( 4 : 4 : 2 ). Этот метод он применил для анализа хлорирован ной питьевой воды. Зайлер и Зайлер [8] для отделения С1~ от SO2f и РО|~ применяли MN-силикагель S HR без связующего вещества и систему метанол — к-пропанол — вода — концентриро ванный раствор аммиака—10%-ная трихлоруксусная кислота ( 5 0 : 3 0 : 1 5 : 8 : 1, 5 ). Барк и сотр. [1] разделяли галогениды на слое целлюлозы MN 300 HR в системе ацетон — вода ( 4 : 1 ).

Обнаружение галогенидов осуществляли азотнокислым сереб ром и флуоресцеином (Д62а) [1] и (Д62Ь) [4]. Гальярди и По корный [4] для обнаружения CN~ пользовались раствором флуо ресцеина и сернокислой меди (Д74), а для F~ — раствором рода нида железа (Д178). Некоторые из упомянутых исследователей обнаруживали анионы бромкрезоловым зеленым (Д15) [8] или бромкрезоловым красным (Д 14) [10].

5.9.2.2. Анионы, содержащие фосфор и мышьяк Зайлер [6] подвергал разделению смесь Н2Р2О7~, Н 2 РО7, Н 2 РОз и Н 2 РО 2 на очищенном силикагеле с крахмалом как связующим в системе метанол — концентрированный раствор ам миака — 10%-ная трихлоруксусная кислота — вода (50 : 15 : 5 : 30).

Клешери и Ли [3] разделили на целлюлозе смесь. РО|~ и РгО*" в системе диоксан —вода — трихлоруксусная кислота — аммиак (65:27,5:5:0,25). Сен [9] для разделения смеси Р О Г, Р О Г, AsOf"", AsOl" и некоторых других анионов пользовался в качестве сорбента смешанным слоем гипса с крахмалом (45:55) и в ка честве подвижной фазы дистиллированной водой. Разделение смеси Р2О7", H2PO4, НРО!~ и Н 2 Р О 2 описали Чандратиллаке н сотр. [13].

474 Сцецщштл часть Для обнаружения неорганических фосфатов и арсенатов удо бен раствор молибденовокислого аммония и хлорида олова (Д147а) [6], а также раствор азотнокислого серебра (Д56) [9].

Клешери и Ли [3] определяли разделенные хроматографически ионы радиометрически с применением Р. Зависимость между подвижностью и строением полиортофосфатов изучал Бринкман [12].

5.9.2.3. Сульфаты и другие содержащие серу анионы Для анализа сульфатов необходимо пользоваться сорбентами особой чистоты, содержащими в качестве связующего крахмал (или не содержащими связующего вообще), но не гипс, так как последний может содержать свободный сульфат-ион, что будет нарушать анализ исследуемого образца.

Зайлер и Эрленмайер [7] на слое MN-силикагеля S HR раз деляли смесь сульфатов, сульфитов и тиосульфатов в системе метанол — к-пропанол — концентрированный раствор аммиака — вода (50:50:5:10). Для разделения смеси некоторых политиона тов они пользовались системой метанол — диоксан — концентри рованный раствор аммиака — вода ( 3 : 6 : 1 : 1 ). Анионы обнару живали либо аммиачным раствором окиси серебра (Д59 6), либо бромкрезоловым зеленым (Д 15а).

Даусон и Джонс [11] изучали хроматографическую подвиж ность политионатов на слоях силикагеля и целлюлозы, пользуясь смесью органических растворителей. Хроматографическое пове дение гетерополиселеновых кислот изучал Деркач [14].

5.9.2.4. Полный анализ неорганических анионов Бергер и сотр. [2] разработали способ разделения различных смесей анионов на слоях ионообменных смол. Галогениды разде ляли на слое дауэкса IX 10 (в ОН~-форме). В качестве раство рителя применяли растворы азотнокислого натрия различных концентраций. Отдельные галогенид-ионы детектировали радио метрически сцинтилляционным методом, применяя метки 36С1, Вг и Ш 1. Фосфаты разделяли на смоле биорекс 5 (в С1--форме) также в растворе азотнокислого натрия и обнаруживали раство ром молибдата аммония и хлорида олова ( Д147Ь). Для разде ления арсената и арсенита на этом же ионите в качестве раство рителя они пользовались 2М раствором хлорида натрия. В этой же хроматографической системе они отделяли формиат от аце тата и после разделения обнаруживали их бромкрезоловым крас ным (Д 14). СЮз, ВЮз, Юз разделяли на слое HZO-1 (биорад) и детектировали раствором иодида калия (Д 106). Для разделе ния SCN~, ферро- и феррицианида авторы пользовались как Специальная часть растворителем ЗМ раствором хлорида натрия и обнаруживали анионы хлоридом железа(III) (Д97).

Хафтон [5] подвергал разделению POi", SO*" и СОз" вместе с некоторыми катионами на слое микрокристаллической целлю лозы авицель SF. Для проявления использовали различные смеси органических растворителей, подкисленные соляной кислотой, в некоторых случаях с добавкой жидкого ионообменника. Он обна руживал анионы бромкрезоловым зеленым (Д156), или бром крезоловым красным (Д 14) (С1~-форма). Для обнаружения фос фатов служили молибдат аммония и хлорид олова (Д 147а).

ЛИТЕРАТУРА 1. Bark L. S, Graham R J. Т., McCormick D., Analyt. chim. Acta, 35, (1966).

2. Berger J. A., Meyniel G., Petit J., J. Chromatogr., 29, 190 (1967).

3. Clesceri N. L., Lee G. P., Analyt. Chem., 36, 2207 (1964).

4. Gagliardi E., Pokorny G., Microchim. Acta, 1965, 699.

5. Houghton F. D., J. Chromatogr., 24, 494 (1966).

6. SeUet Й ^ В Д м & т. Acta, 44, 1753 (1961).

7. Seiler H., Erlenmayer H., Helv. chim. Acta, 47, 264 (1964).

8. Seder H., Seiler M., Helv. Chim. Acta, 48, 117 (1965).

9. Sen B. N., Analyt. Chim. Acta, 23, 152 (1960).

10. Thielemann H., Microchim. Acta, 1971, 746.

11. Dowson W. M., Jones W. F., Microchim. Acta, 1974, 339.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 12. Brinkman U. A. Th., Jochensen R., Z. anal. Chem., 278, 199 (1976).

13. Chandratttlake R. M., Newton G. W. A., Robinson V. !., Radiochem. Radioanal.

Letters, 19, 187 (1974).

14. Деркач Л. В. Ж. неорг. хим., 20, 459 (1975).

6 ПРИМЕНЕНИЕ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ В своем современном состоянии клиническая биохимия не яв ляется собранием различных простых методов исследования био логически важных веществ в крови, моче или других биологиче ских жидкостях. Клиническая биохимия, особенно в последнее время, необычайно расширила и улучшила арсенал аналитических методов и вместе с классической биохимией, постоянно заимствуя из ее богатого опыта новые импульсы, сильно расширила и уточ нила области своего применения.

Неустанный методический поиск влечет за «собой модерниза цию рутинной и исследовательской работы, связанной с введени ем новых аналитических методов. Эти последние могут обеспечить более детальные, более точные и чем далее, тем более высокие по качеству результаты, которые затем отражаются в широкой клинической практике при диагностике различных патологических изменений в организме человека.

В клинической биохимической диагностике метод ТСХ приоб ретает все большее распространение бл-агодаря простоте прибо ров и оборудования, быстроте и легкости проведения анализа, а в некоторых случаях не в последнюю очередь и из-за воз можности получения количественного результата.

Разумеется, тонкослойная хроматография не является уни версальной и не может заменить целиком все употребительные в в настоящее время методы.

При расположении материала авторы этой книги руководство вались задачами, стоящими перед клиническими лабораториями.

Хотя некоторые методы в своем настоящем виде и не приспособ лены непосредственно для определения каких-либо наперед за данных параметров биологического материала, ОНИ ПО своей раз делительной способности могут быть для этого применены. В тех случаях, когда, например, способы выделения не приводятся, можно руководствоваться опытом и обычной повседневной прак тикой.

Хотя в предлагаемом втором издании этой книги приводится целый ряд методик из первого издания, в первую очередь авто ры заботились о том, чтобы дополнить эту часть такими хрома тографическими методами, которые в настоящее время приобре Специальная часть тают все большее значение — скрининговыми тестами. Эти тесты приобретают огромное значение для обнаружения токсического действия некоторых веществ на организм. Авторы хорошо пред ставляют себе, что эта важная область применения тонкослойной хроматографии далеко не исчерпана. Цель, которую ставят перед собой авторы книги, заключается в том, чтобы показать чрезвы чайную важность методов ТСХ в клинической биохимии и дать основные приемы, необходимые для успешной работу.

6.1. Белки Детально разработанные методы анализа веществ белковой -природы в настоящее время позволяют решать многие клиниче ские проблемы, вытекающие из качественных и количественных изменений в различных патологических состояниях.

Если не говорить о весьма распространенной технике электро форетического разделения на бумаге или других носителях, из вестно сравнительно немного способов, пользующихся тонкослой ной хроматографией или хроматографией на бумаге. Лишь в по следнее время для фракционирования белков начали применять порошкообразные целлюлозные носители, основанные на ионном обмене, и гель-фильтрацию в тонком слое.

В одной из первых работ этого рода Деттерман [1] пользо вался слоями из сефадекса G-25. В методе Иохансона и Рима [2] применяются сефадексы G-25 и G-75. В последнем случае удалось с успехом разделить некоторые белки с низкой молеку лярной массой. Основной успех был достигнут в работах Морриса S4] и позже — Иохансона и Рима [3], а также Миллера и сотр.

9].

Качественное разделение белков на слое сефадекса по Моррису [4] Приготовление слоя сорбента Суспензию геля готовят смешиванием 6 г се фадекса G-100 (water regain 10, typ No TO 1992) или 4 г сефадекса G- (water regain 20, typ No 224 С) с размером частиц менее 400 меш (Pharmacia Fine Chemicals Aktiebolag, Упсала, Швеция) со 100 мл 0,5 М раствора хлорида натрия. Указанная концентрация имеет определяющее значение и должна быть строго выдержана. Взятое количество достаточно для покрытия 6 пластинок размером 10X20 см. Суспензию геля выдерживают в закупоренном сосуде не менее 48 ч, чтобы гель достаточно набух. На пластинки обычным способом на нрсят слои толщиной 0,9 мм. Немедленно после нанесения слоя пластинки по мещают в камеру, в которой находится сосуд с 0,5 М раствором NaCl, и в го ризонтальном положении дают насытиться парами в течение не менее чем 18 ч перед процессом разделения. Методика приготовления пластинок очевидным об разом влияет на качество разделения, и необходимо ее строго придерживаться.

Нанесение проб 0,5—1 мкл исследуемой пробы, содержащей 1—20 мкг бел ковых веществ, наносят на пластинку на расстоянии 3 см от края. Пятна долж ны иметь диаметр не более Эмм, необходимо следить, чтобы не повредить слой.

Специальная mat»

4D Рис. 83. Прибор для разделения веществ белковой природы на слоях сефа декса [4].

/ — слой;

2 — фильтровальная бумага;

3—полоска фильтровальной бумаги (фитиль) для подвода элюирующей жидкости;

4 — сосуд с элюнрующей жидкостью;

— угол, образуе р мый пластинкой с дном камеры.

Хроматографирование. Простое устройство для хроматографии белков по казано на рис. 83. Удобно также пользоваться специальным прибором, постав ляемым фирмой Pharrhacia l[7].

Систему растворителей для проявления (0,5 М NaCl) подводят к слою / полоской фильтровальной бумаги ватман 3 ММ 3. Излишек жидкости поступа ет на фильтровальную бумагу 2, которую увлажняют для лучшего контакта со слоем геля. Верхний конец пластинки должен располагаться на 1—1,5 см выше уровня раствора NaCl в сосуде 4. Угол наклона пластинки для сефадекса G- должен составлять около 10°, для G-200 — около 20°. В таком устройстве гемо глобин крови человека перемещается на расстояние около 70 мм в течение 4— 5 ч. Слишком быстрое перемещение приводит к растягиванию пятен, и, наоборот, чрезмерно медленное движение указывает на неудовлетворительное приготовле ние слоя. По окончании разделения (индикатором подвижности служат гемогло бин, цитохром С или миоглобин) хроматограмму вынимают' из камеры и осто рожно удаляют фитиль 3.

Обнаружение на влажном слое геля. Избыток влаги устраняют, помещая хроматограмму на 5—10 мин в термостат с температурой 37 °С. Затем в тече ние 10-—15 мин слой подвергают действию хлора и далее выдерживают несколь ко минут в токе воздуха. Избыток хлора удаляют опрыскиванием слоя раство ром, содержащим 20% сульфата аммония и 5% бикарбоната адтрия. При по следующем опрыскивании пластинки раствором, содержащим 1% крахмала и 1% иодида калия, на белом фоне появляются синие пятна белковых веществ.

Обнаружение на высушенном слое геля. Влажную хроматограмму сушат при 50—60"С (для сефадекса G-200 достаточно, например, 15—30 мин). Обнару жение на сухом слое можно проводить, например, в насыщенном растворе ами дочерного 10 В в смеси метанол—уксусная кислота —вода (8:1:1), с после дующим промыванием смесью метанол — уксусная кислота — вода (7:1,5:1,5) f[2]. Окрашивающий и промывной растворы не должны содержать более 40% воды во избежание набухания геля.

Специальная часть Обнаруокение методом, «отпечатка». Этот способ основан на переносе пятен разделенных веществ на фильтровальную бумагу, на которой далее проводят детектирование аналогично тому, как это делается в хроматографии на бумаге.

Полоску фильтровальной бумаги ватман 3 ММ размером, соответствующим размеру пластинки, осторожно прикладывают на одну минуту к слою так, что бы между нею и гелем не образовывались воздушные пузыри. После снятия со слоя бумагу высушивают и белки обнаруживают амидочерным 10 В, кумас си бриллиантовым голубым R 250 |[0,25%-ный раствор в смеси метанол — ледя ная уксусная кислота ( 9 : 1 ) ] и промывают в воде или смеси метанол — ледяная уксусная кислота — вода ( 5 : 1 : 5 ) или других реактивах, употдебляемых для обнаружения белков.

Ввиду того что при этом способе невозможно отметить фронт подвижной фазы, величины подвижности разделяемых веществ относят к подвижности ге моглобина (Явь) и рассчитывают по формуле ХЯ " dm' где dp обозначает расстояние от старта до пятна соответствующего белка, а dHb — эту же величину для гемоглобина.

При правильном проведении хроматографирования образуются слегка эл липтические пятна. Наивысшая концентрация белка в пятне должна быть 20— 30 мкг, наинизшая зависит от чувствительности способа обнаружения В неко торых случаях применимо и двумерное проявление или комбинация хроматогра фии с электрофорезом или иммунодиффузией С клинической точки зрения описанная методика особенно удобна для идентификации аномальных макроглобулинов в плаз ме крови, низкомолекулярных белков в моче, белковых состав ляющих в спинномозговой жидкости и т. п.

Полученный при хроматографии ца тонких слоях сефадексо вых гелей опыт в общих чертах можно обобщить следующим об разом:

1. Сефадексы G-25 и G-50 пригодны для отделения белков от низкомолекулярных примесей и для группового разделения пеп тидов. На сефадексе G-75 можно надежно отделить альбумин бычьей сыворотки от р-лактоглобулина и а-лактальбумина. Аль бумин образует два пятна* которые соответствуют, вероятно, ди мерполимерам, альбумин сыворотки человека дает только одно пятно.

2. Разделение на сефадексе G-100 аналогично делению на се фадексе G-75. При помощи сефадскса G-200 белки нормальной сыворотки человека разделяются на два компонента — альбумин и •углобулины. Этот тип геля пригоден для идентификации ано мальных составляющих (парапротеинов) у пациентов с множест венной миеломой и макроглобулинемией (рис. 84).

• 3. Липопротеиды передвигаются в наиболее быстрой фракции, не разделяясь.

4. Методом можно пользоваться для обнаружения фермента тивной активности либо непосредственно на хроматограмме, либо ш?еле получения отпечатка на фильтровальной бумаге. Так, на Специальная часть 4( пример, сырая фракция щелочной фосфатазы из слизистой бычь его кишечника обнаруживает на сефадексе G-75 два неполностью разделенных вещества, обладающих активностью с §-нафтилфос фатом. На сефадексе 'G-200 в человеческой моче реакцией с фе нолфталеинглкжуронидом была идентифицирована р-глкжурони даза.

Из изложенного следует, что хроматография на сефадексах (табл. 84) в первую очередь применима для установления пата 23 5 б 00 0 0 Рис. 84. Разделение белков сыворотки на 0 0°ч 0 сверхтонком сефадексе G-200 в 0,5 М рас творе NaCl [3].

Обнаружение: нафталиновый черный 12 В.

б0о !

11 1 — нормальная съгаоротаа;

2 — мнелопатнческая сыворотка y-G-глобулинового типа;

3 и 4 — мяе лопатнческая сыворотка у-А-глобулинового типа-;

\\ 5 — сыворотка, содержащая патологический мак роглобулин;

6 — сыворотка кролика, меченная и флуоресцеинизотиоцианатом.

Заштрихованное пятно флуоресцирует в ультра фиолетовом свете А— альбумины. f-G — глобулины.

логических белков и для приблизительного определения молеку лярной массы веществ белкового характера, доступных лишь в незначительных количествах.

Обнаружение миоглобина и гемоглобина по Странскому и Срху )[6] Приготовление слоя. Слой готовят из сверхтонкой суспензии сефадексов G-50 и G-75 в 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,4 или в смеси этого буфера н 0,9%-ного раствора NaCl (1:1).

Хроматографирование. Проводят нисходящее хроматографирование (пластин ка должна быть накловена иод углом 12°), иодводя растворитель полоской бу маги ватман № 3. При применении сефадекса G-50 и фосфатного буферного раствора (рН 7,4) уже через 40 мин достигается очень хорошее разделение мио глобина и гемоглобина. Подобные же результаты были достигнуты и на сефа дексе G-75 в смеси фосфатного буфера и 0,9%-ного раствора NaCl (1:1).

Обнаружение. Пользуются реакцией с бензидином и перекисью водорода, о-анизидином и бромфеноловым синим.

Из Других материалов Симонян и Рыбак [5] пользовались слоями, приготовленными из порошкообразной фосфоцеллюлозы.

Слои, полученные многократным опрыскиванием пластинок вод ной суспензией фосфоцеллюлозы, сохраняют во влажной камере и лишь перед нанесением проб высушивают на воздухе. Для раз деления белков плазмы крови человека авторы пользовались 0 005 М фосфатным буфером рН 8,0. Разделение в этом случае Специальная часть Таблица Значения hRHb некоторых белков на сефадексах G-100 и G-200 в системе О, 5М раствора NaCl |[3] Молекуляр- hR Hb ная Белок массах10-з G-100 G- 13,0 68 ' Цитохром с 13,6 68 Рибонуклеаза 14,5 65 Лизоцим 16,9 79 Миоглобин 22,5 а-Химотрипсин 23,8 Трипсин 27,0 94 Овомукоид 35,0 99 Пепсин 45,0 103 Овальбумин 68,0 100 Гемоглобин 65,0 114 Альбумин бычьей сыворотки 180,0 128 гл Бычий У" °булин 650,0 Тиреоглобулин 1000,0 — Макроглобулины протекает так же, как и на слоях сефадекса, с тем различием, однако, что подвижности альбумина и ^-глобулина обращены, т. е. альбумин перемещается быстрее. Метод удобен для того, чтобы отличать нормальную и миеломную сыворотки. Для разде ления гемоглобинов применяли также слои СМ-целлюлозы- [10]. Кремер и сотр. [8] методом ТСХ определили лецитин — хо лестерин — ацилтрансферазу.

ЛИТЕРАТУРА 1. Datterman H., Experientia, 18, 430 (1962).

2. Johansson В., Rymo L,, Acta chem. scand., 16, 2067 (1962).

,3. Johansson В., Rymo L, Acta chem. scand, 18, 217 (1964).

4. Morris С J., J. Chromatogr., 16, 167 (1964).

5. Simonian E., Rybak M., Biochim. biophys. Acta, 93, 194 (1964).

6. Stransky Z., Srch M., J. Chromatogr., 28, 146 (1967).

7. Thin-layer gel filtration with the Pharmacia TLG-apparatus. Pharmacia Fine Chemicals AB. Uppsala, 1971.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 8. Kremer Т., Skarupinsky M., Z. med. Labortechn., 13, 91 (1972).

9. Miller J. N-, Erinle O., et al., J. Chromatogr., 105, 317 (1975).

10. Schroedsr W. A,, Nelson N. C, J. Chromatogr., 116, 527 (1975).

т_ Специальная часть 0J. Аминокислоты и азотистые вещества небелковой природы Определение спектра аминокислот в моче имеет большое значение в первую очередь для диагностики нарушений азотисто го метаболизма. Это важно для патологических состояний, при которых аминокислоты или соответственно продукты их метабо лизма выделяются в чрезмерных количествах, и для состояний, при которых выделяющиеся вещества не являются продуктами нормального метаболизма.

Для обнаружения и количественного определения таких ве ществ предложены многочисленные способы хроматографии: на колонках, на бумаге или электрофорез на бумаге. Разработка метода ТСХ привело главным образом к повышению четкости разделения, потребности в ничтожном количестве исследуемого материала, значительному ускорению и упрощению всего процес са разделения.

Как и в хроматографии на бумаге, в тонкослойной хромато i рафии для разделения сложных смесей рекомендуется двумер 1.

з;

._О О Оа О»

Старт 2.

Рис. 85. Двумерная хроматография аминокислот [7].

Сорбент- сяликагель G;

системы: первое направление — хлороформ — метанол — 34%-ный аммиак —вода ( 4 : 4 : 1 : 1 ), второе направление — фенол — вода (3:1);

в обоих направле ниях элювровали на расстояние 15 ом от старта;

обнаружение: нингидрин.

Специальная часть гл и Рис. 86. Двумерна^ хроматография аминокислот в моче [14].

Сорбент: силнкагель Н;

системы: первое направление — к-бутанол — уксусная кислота — во да (4 • 1 : 1), второе направление —фенол— вода ( 3 : 1);

обнаружение- ниигидрин Нанесено 25 мкл обессоленной мочи. Заштрихованные пятна — свободные аминокислоты, присутствующие в моче, остальные — аминокислоты, которые могут встречаться в моче ный способ.

Для этого был предложен целый ряд систем раство рителей. Бреннер и Нидервизер.[3] применяли системы н-бута нол — уксусная кислота — вода ( 4 : 1 : 1 ) и фенол — вода 3 : 1 (по массе), а также хлороформ — метанол — 34%-ный аммиак — вода ( 4 : 4 : 1 : 1 ) и фенол — вода (3:1) [7] (рис. 85). В указанных системах лейцин и изолойцин не разделялись, серии и глицин, ррисутствуя в больших количествах, перекрывались. Во всех случаях разделение вели на слоях силикагеля G в стандартных условиях [4, 12]. Опеньска-Блаут [14] для хроматографии ами нокислот мочи рекомендует использование силикагеля Н (рис. 86) см. также рис. 87. Для отделения гистидина, лизина, орнитина, аргинина, цистина, а также кислот: (3-аминоизомасляной, р-ами щ-м-маеляной и у-амино-н-масляной для хроматографирования в первом направлении хорошо себя зарекомендовала смесь раст ворителей м-пропанол — вода ( 7 : 3 ). Идентификация нейтраль ных аминокислот не представляет затруднений, за исключением смесей лейцин — изолейцин — метионин и фенилаланин — триито 484 Специальная часть оо - о 6° Об П Старт 1.

Рис. 87. Двумерная хроматография аминокислот плазмы крови [14].

Сорбент: целлюлоза MN 300;

системы: первое направление — н-бутанол — уксусная кисло та—вода ( 4 : 1 : 1 ), второе направление — фенол — вода (3:1);

обнаружение: нингидрин.

Нанесено 20 мхл плавны.

фан. Для их разделения удобно окислять смесь надмуравьиной кислотой и затем хроматографировать проточным способом в си стеме метилэтилкетон — пиридин — вода — уксусная кислота (7:1,5:1,5:0,2) на слоях силикагеля G в течение приблизитель но 4 ч [7].

Введение целлюлозных носителей открыло большие возмож ности, что явилось заслугой главным образом фон Аркса и Негера [281.

На слоях целлюлозы определяли аминокислоты: в плазме кро ви— Берри |[33], в моче — Розе и сотр. [44]. Фелькль и сотр. [51] определяли также на целлюлозе гликоциамин, креатин, креатинин и другие родственные соединения.

Двумерная хроматография аминокислот по фон Арксу и Негеру \[28] Приготовление слоя. 8 г целлюлозы MN 300 (фермы Macherey—Nagel), 48 мл дистиллированной воды и 2 мл этанола гомогенизируют в смесителе в течение 2—3 мин. После нанесения на стеклянные пластинки (20X20 см) сушат в течение ночи при комнатной температуре.

Хроматографирование. На шесть пластинок наносят пробы аминокислот так, чтобы диаметр пятен не превышал 3 мм (содержание не более 10 мкг каждой Специальная часть аминокислоты). После высушивания в токе прохладного (или теплого) воздуха все пластинки хроматографируют в первом направлении в системе к-бутанол— ацетон—диэтиламин—вода ( 1 0 : 1 0 : 2 : 3 ) при 22 "С (I). За 2,5 ч фронт раствори теля перемещается на 15 см. После сушки в течение 5—10 мин при 90 "С или 12 ч при комнатной температуре четыре пластинки хроматографируют во втором направлении в системе пропанол-2 — 99%-ная муравьиная кислота — вода (40:

: 2 : 10), причем фронт растворителя через 3,5 ч достигает 15 см (II);

одну хроматограмму элюируют в системе бутанол-2 — метилэтилкетон — дициклогек силамин — вода ( 1 0 : 1 0 : 2 : 5 ), в которой фронт перемещается на 15 см через 2 ч (III), и последнюю пластинку хроматографируют в смеси,фенол — вода ( 3 : 1 ) в камере, насыщенной 3%-ным раствором аммиака;

фронт здесь пере местится на 15 см через 4 ч (IV). Пользуются во всех случаях свежеприготов ленными смесями без предварительного насыщения камеры (за исключением хроматограммы IV). Сушат 20 мин при 90 °С.

Обнаружение. 1. На трех хроматограммах ( I + I I, I — III и I+IV) проводят —f обнаружение нингидрином с добавлением коллидина (Д 154). Равномерно оп рысканные хроматограммы сушат при 90 "С до появления пятен, причем фон должен еще оставаться неокрашенным Пятна очерчивают прямо на слое каран дашом немедленно, так как близко расположенные пятна при комнатной тем пературе через несколько часов сливаются, и это может затруднить их иденти фикацию.

2. Вторую хроматограмму (I+II) опрыскивают реактивом Паули (Д164).

3. Последнюю хроматограмму опрыскивают каким-либо из следующих реак тивов в зависимости от специальной надобности в идентификации определен ных аминокислот, например раствором изатина (Д 103), реактивом Рейнделя— Гоппе (Д 174) или реактивом Д 157.

Сравнивая окрашивания, образующиеся при специфических реакциях, с картой аминокислот (табл. 85), можно идентифици ровать 52 аминокислоты. Метод делает возможным полное разде ление сложных смесей биологически важных аминокислот.

Для быстрого обнаружения аминокислот в моче можно поль зоваться методом Рокконена [22], который наносил на слой си ликагеля G такое, количество обессоленной мочи, которое соот ветствовало 20 мкг креатинина, и проводил двумерное хромато графирование в системе хлороформ — метанол — 17%-ный амми ак ( 2 : 2 : 1 ) в первом направлении (фронт перемещался на рас стоянии 10 см) и после высушивания при 110 °С — в системе фе н о л — вода (3:1) во втором. Обнаружение проводили раствором нингидрина и азотнокислой меди (Д 153) (табл. 86).

Количественное определение можно осуществить элюировани ем пятен после нингидриновой реакции [1, 2, 18]. При использо вании калибровочной кривой погрешность определения составля ет 10—30%;

точность метода можно повысить, одновременно хроматографируя эталонные пробы;

погрешность определения становится равной всего лишь 2—5%.

Очень распространенным способом является разделение ди иитрофенильных производных (ДНФ-производных) аминокислот йосле реакции с 1-фтор-2,4-динитробензолом. В этом случае тоже рекомендуется двумерное хроматосрафирование, для которого предложено много систем. Ниже мы приводим только от Таблица Цветные реакции аминокислот с различными реактивами на слое целлюлозы [28] Реактив Окрашивание8 Нитропру ссид—фер Сокращенное Аминокислота рДОианид обозначение Рейндель-Гоппе (Д 157) Нннгидрин Паули Изатин (Д 164) ( Д 153) (ДЮЗ) ( Д 174) _ а-Алании А1а Фиолетовое Фиолетовое Зеленое Ц-Аланвн Р-А1а Лиловое + а-АМино-и-масляная Фиолетовое »

Abu (+) а-Аминоизомасляная iso Abu Желтое (+) + Р-Аминомасляная P-Abu Лиловое Желтоватое + Р-Аминоизомасляная Фиолетовое P-iso Abu Лиловое у-Аминомасляная + »

Y-Abu е-Амино-«-капроновая » Розовое' e-Acap + + rt-Амянопдапуровая p-Ahip Желтое + + Аргинин Розовое Arg + Аспарагин Желтое Asp (NH 2 ) »

Аспарагиновая Зеленое Фиолетовое Asp (+) + + Канаванннсульфат Фиолетовое Коричневое Can Цитруллнн + » Розовое Cit Цистеиновая CySO 3 H Желтое (+) Цистин Коричневое Желтое (Cys) 2 Розовое a.Y-Диаминомасляная Фиолетовое + Dabu »

a,a-Диаминопииелиновая Серое Dapim » Красное Диоксифенилаланин Серое Желтое Dopa Лиловое Дииодтирозин (+) + Dijtyr Фиолетовое Днметилцистеин — Dimecys » Розовое Глутамин (+) Glu (NH 2 ) Глутаминовая Лиловое Qlu Глицин Коричневое Розовое Gly + Гликоциамин + (+) — Gey ГиСтидин + Серое Серое Лиловое His Оксиглутаминовая Hyglu Фиолетовое Розовое (+) Оксилизин + Hylys Лиловое Синее Желтое Hyp го Оксипролин Розовое Hyval Фиолетовое {Юксивалин »

lieu Изолейцин »

allolleu йлло-Изолейцин Желтое Кп Креатин Knin Креатинин Желтое Розовое Куп Коричневое Кинуренин Розовое Оранжевое Lan Фиолетовое Лантионин Розовое Leu Лейцин Красное Lys Лизин + Розовое Met Метионин MetSO* Метионинсульфон MetSO Метионинсульфоксид Коричневое Лиловое Nleu Норлейцин Красное Nval Норвалин Orn Орнитин + Лиловое Phe а-Фенила ланин Желтое Желтое Phegly Желтое а-Фенилглицин Коричневое »

Pro • Пролин » (+) »

Sar + Саркозин Серое Оранжевое Ser Желтое Серии Фиолетовое Желтое Tau Таурин Розовое Thr Треонин alloThr алло-Треонин Коричневое Коричневое Thyron Тиронин Желтое »

Thyrox (+) Тироксин Лиловое Коричневое Фиолетовое Триптофан Try Розовое Красное Коричневое Тирозин Tyr Розовое Фиолетовое В алии Val а Окрашивание при нннгидриновой реакции соответствует концентрациям в пределах 0,05—10 мкг, в остальных реакциях 0,5—5 мкг При реакции с реактивом Паули образуется окрашивание от желтого до красноватого, при действии реактива Рейнделя-Гоппе — черно синее и при реакции с нятропруссидом — феррицианидом — бледное красное окрашивание Таблица Значения hRF аминокислот и окрашивание при действии реактива (Д 153) 1[28] Направление Аминокислота Окрашивание первое второе Розовое Алании Синевато-красное 36 (J- Алании Розовое-красное Аминомасляная Темно-желтое Р-Аминомасляная у-Амино-к-масляная Желто-розовое Розовое Аргинин 42 Коричнево-оранжевое Аспарагин 4 Мальвово-серое Аспарагиновая 32 Розовое Цитруллин 45 Красновато-серое Цистеиновая То же Циегеин »

Цистин 21 Красноватое Этаноламин Розовое Глутаминовая 49 Желто-розовое Глутамин 22 Оранжевое Глицин 30 Темно-красное Гистидин 45 Розовое Изолейцин Лейции 15 Желто-красное Лизин 69 Светло-оранжевое Метионин 63 Мальвово-желтое Метионинсульфон 43 Мальвовое 1-Метилгистидин 6 Темно-розовое Орнитин 43 Желтовато-серое Оксипролин Желтое 42 Пролин 71 Оранжево-коричневое Фенилаланин Фосфоэтаноламин Красноватое 3 Желто-кр асное 41 Серии Сероватое 61 Таурин Желто-красное 56 Треонин Синее 69 Триптофан Желто-красное 62 Тирозин Розовое 66 Валин Специальная часть Таблица Системы для разделения растворимых в эфире ДНФ-производных аминокислот, не разделимых двумерной хроматографией (рис. 88) Направление Литера Смесь тура первое второе Толуол — 2-хлорэта- Хлороформ — метанол Лизин+тирозин нол — пиридин — уксусная кислота Изолейцин -(-лейцин 25%-ный NH4OH (98:2:1 или95:5:1) [12, 3 0 ] (50 : 35 : 15 : 7) Хроматографирование ведут 3 ч проточно Аспарагиновая кисло- То же Хлороформ — метанол— [30J та -(-глутаминовая уксусная кислота кислота+цистин+ 2—3 раза (70 : 30 : 5) +аспарагин+глу тамин Изолейцин -(- лейцин Бензол — пиридин — То же [ уксусная кислота 2 раза (70 : 20 : 2) Хроматографирование ве дут 3 ч проточно дельные примеры: за подробностями мы отсылаем читателя к ис черпывающему обзору Росмуса и Дейля [23, 24].

Вальц и сотр. [30] двукратно хроматографировали аминокис лоты сначала смесью толуол — 2-хлорэтанол — пиридин — 25% ный NH4OH (50:35:15:7) и во втором направлении смесью хлороформ — бензиловый спирт — уксусная кислота (70:30 : 3 ).

При таком способе не разделялись ДНФ-производные лизина и тирозина. Для растворимых в воде ДНФ-производных применяли одномерную хроматографию в «-бутаноле, насыщенном аммиаком [12]. В случае необходимости получения более детальной иден тификации удобна и двумерная модификация [17] (табл. 87).

Обнаружение ДНФ-производных не представляет труда, так как они окрашены в желтый цвет, а также дают темные пятна в, ультрафиолетовом свете.

Количественное определение их осуществляют фотометриче ски при длине волны 360 нм (для производных пролина и окси аролина при 385 нм) после извлечения из слоя. Погрешность определения около 4—5%.

По способу Патаки и Келлера [15] 2—6 мл плазмы крови чэевобождают от белка двойным объемом ацетона. К экстракту Прибавляют 5 н. NaOH до щелочной реакции и смешивают с § мл карбонатного буферного раствора (ЫаНСОз— ЫСЩ 490 Специальная часть рН 8,8). После добавления 0,2 мл 10%-ного раствора 1-фтор-2,4 динитробензола в абсолютном этаноле ставшую молочной смесь перемешивают в течение 60 мин при 40 °С. После охлаждения ДНФ-производные экстрагируют ЗхЮ мл эфира. Водный слой подкисляют 6 н. НС1 до кислой реакции (конго красный) и рас творимые в эфире ДНФ-производные экстрагируют 6x10 мл эфира. Оставшийся водный слой взбалтывают шестикратно с 10 мл смеси равных объемов этилацетата и н-бутанола;

вытяжка содержит ДНФ-производные, растворимые в кислой среде. Хро матографируют по Вальцу и сотр. [20] (рис. 88) и по Патаки и Келлеру [12].

Для обнаружения малых количеств аминокислот удобна хро матография их производных, полученных реакцией с 1-диметилами нонафталин-5-сульфонилхлоридом (дансилхлоридом) [25]. Эти производные получают, например, реакцией 1 мл раствора ами нокислот (6,5 мкМ в 0,1 М NaHCO3) с 1 мл раствора дансилхло рида (6 мг в 1 мл ацетона) после стояния при комнатной темпе ратуре в течение ночи. Добавлением 8 мл ацетона осаждают NaHCO3 и после фильтрования или центрифугирования соответ ствующее количество фильтрата хроматографируют. Производные следует предохранять от прямого дневного света. Одномерная хроматография не обеспечивает полного разделения, поэтому удобнее двумерное хроматографирование сначала в- системе ме тилацетат— пропанол-2 — концентрированный раствор аммиака (45 :35:20) и далее либо в смеси хлороформ — метанол — уксус ная кислота (75 :25 : 5), либо в смеси хлороформ — этилацетат — метанол — уксусная кислота (30 : 50 : 20 :1). Между отдельными разделениями слой силикагеля G (20x20 см) активируют 10 мин при 110°С. В ультрафиолетовом свете удается обнаружить менее чем 1Q- М производных в виде флуоресцирующих желтым цве том пятен. Непрореагировавший дансилхлорид не мешает разде лению, так как практически во всех системах он перемещается с фронтом.

Биогенные амины, как и аминокислоты, можно превратить в дансильные производные. Метод приложим для определения их в биологическом материале. Зайлер и Викман [26] применяли си зшкагель Q и двумерную хроматографию. В первом направлении они проявляли смесью этилацетат — циклогексан (75 : 50) и после пятиминутной сушки — во втором направлении смесью бензол — метанол — циклогексан (85 :5 :10) или бензол — триэтиламин (100:20). См. также [46]. Дансильные производные аминокислот в этих системах не движутся, и, наоборот, в системах, пригодных для аминокислот, производные аминов перемещаются практиче ски с фронтом растворителя (рис. 89).

Иодированные аминокислоты можно разделять по Массалья и Роза [13] на слое силикагеля G в системе к-бутанол-» уксусная Специальная часть Аг QNH | 26+ О QOH А, о ° 2С "О О О О„ •х 73 19 * Старт 2.

Рис. 88. Двумерная хроматография ДНФ-производных аминокислот [30].

Сорбент: силикагель G;

системы: первое направление — толуольная система (см. текст);

второе направление — хлороформ — бензиловый спирт — уксусная кислота (70:30:3);

об наружение: в ультрафиолетовом свете.

Разделенные ДНФ-произ|одные аминокислот, растворимые в эфире: 1 — а-аланин;

2 — Р-аланин;

3 — а-аминомасляная кислота;

4 — а-аниноизомасляная кислота;

5 — Р-аминомас ляная кислота;

6 — Р-аминоизомасляная кислота;

7 — v-аминомасляная кислота;

& — е-ами нокапроновая кислота;

9 — а-аминоадипиновая кислота;

10 — а-аминокаприловая кислота;

//— аргинин;

12 — аспарагин;

13 — аспарагиновая кислота;

14—цитруллин;

15 — цистеино вая кислота;

16 — цистнн;

17 — цистеин;

18 — глутамин;

19 — глутаминовая кислота;

20 — глицин;

21 — гистидин;

22 — оксилизин;

23 — оксипролин;

24 — изолейцин;

25 — лейцин;

25 — лизин;

27 — метиоинп;

28 — метионинсульфон;

29 — метионинсульфоксид;

30 — орнитин;

31 — фенилаланин;

32— пролин: 33 — саркозин;

34 — серии;

35 — таурин;

36 — треонин;

37 — трип тофан;

38 — тирозин;

39 — пялим;

40 — фосфоэтаноламин;

41 — глутатион;

42 — гистамин;

43 — метилгистидин Ai и Aj — артефакты, ОН — динитрофгнол, NIIj — динитроанилин.

кислота — вода ( 4 : 1 : 5 ). Значения hRF следующие: моноиодти розин 65, дииодтирозин 75, тиро.чин 36 и неорганический иод 28.

Простой метод для разделения дииодтирозина, с?,/-моноиодти ронина, й,/-дииодтиронина, с!,/-трииодтиронина и й,/-тироксина предложил Грис с сотр. [8]. Он пользовался силикагелем G и системой метанол — 0,5 н. уксусная кислота ( 2 : 8 ). После высу шивания хроматограмм при комнатной температуре обнаружение производилось нингидрином или реактивом Паули (Д164).

Хотя все описанные способы хроматографии аминокислот в биологических материалах отличаются высокой разрешающей 492 Специальная часть Рис. 89. Двумерная хроматография дансиламидов [26].

Сорбент: силикагель О;

хроматограмма А: первое направление — этилацетат — циклогексан (75:50), второе направление — бенаол — метанол — циклогексав (83:5:10);

хроматограм ма В: первое направление —этнлацетат— цвклогексан (75:50), второе направление — бен зол — трнэтнламин (100:20);

обнаружение: в ультрафиолетовом свете.

1 — аммиак;

2 — метиламин;

3 —• дяметиламии;

4 — этиламви;

5 — этааоламнн;

5 —цнстеамин 2-мерцаптоэтнлмип1)! 7 —язоашшамнв;

* —епермядая;

9 — спермин;

10 — пиперидин;

11 — гштамин;

13 — ОДенилэтнлаиин;

13 — 4-оксн-Э-феннлэтвл*мнн;

14 — 4-метокси^-фенилэтил амнн;

/ | — 3,4-дноквн-Р-феиял»твл*1€нн (допамни);

/в — З-метокси-4-оксн-Р-февилэтнламнн;

17 — М-диметокси-е-феннлэтнламин;

/8 — яорадревадив;

19 — адреналин;

Ю — трвптамин;

21 — 5-окситрвптаынн (серотовиа);

32 — паридоксамин;

23— гордеиин.

способностьк», однако в большинстве случаев они требуют до больно много времени.

Для быстрого клинического определения в последнее время 0Ыл разработан "целый ряд хроматографических методов, которые могут служить и в качестве простых скрининговых тестов для обнаружения патологических изменений в метаболизме амино кислот.

Определению аминокислот в моче, а также в крови посвящены многочисленные работы [37—41, 43, 45, 47—491.

Одномерная и двумерная хроматография аминокислот по Эрссеру и сотр. i[5, 6) Приготовление слоя. Пользуются (товарными) сортами микрокристалличес кой целлюлозы на алюминиевой или пластмассовой подложке (Merck, Macherey— Nagel, Sklarny Kavalier) размерами 10X20 или 20X20 см.

Приготовление пробы.-Для разделения можно пользоваться неподготовлен ными заранее пробам» плазмы крови или мечи;

однако вследствие мещающего Специальная часть влияния некоторых веществ, особенно солей, для более совершенного разделе ния рекомендуется перед хроматографированием отделить белки от плазмы или обессолить мочу.

Хроматографирование неподготовленных проб плазмы и мочи. На хромато грамму наносят 3 мкл гепариновой плазмы или 2—12 мкл консервированной Мертиолатом мочи (количество зависит от содержания креатинина) в форме Полосок длиной 1,5 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края. Одновременно наносят эталонную смесь аминокислот. Для ускорения высыхания места нане сения образца мочи можно сушить в токе теплого воздуха, а образца плазмы— током холодного воздуха. Хроматографируют двукратно в системе м-бутанол— ацетон — уксусная кислота — вода ( 7 : 7 : 2 : 4 ) на расстояние 7,5 см от старта.

Обнаружение. После высушивания хроматограмму погружают в 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне и нагревают до 40—50 °С. Разумеется, для иден тификации аминокислот можно пользоваться и другими реактивами.

Хроматографирование подготовленных проб плазмы и ночи.

Удаление белков и обессиливание плазмы. 1 об. часть плазмы крови смешивают с 4 об. частями 96%-ного этанола, оставляют на 30 мин при комнатной темпе ратуре и затем центрифугируют. 0,5 мл жидкости взбалтывают 5 мин с 1 мл 50%-ной водной суспензии катионита зеокарб 225 SRC -10 в Н+-форме. После центрифугирования жидкость сливают и катионит промывают 1 мл обессоленной воды (взбалтывание 20 с). Снова центрифугируют, жидкость сливают и амино кислоты элюируют 1 мл 5 н. аммиака (взбалтывание в течение 5 мин). 0,2 мл элюата испаряют (например, в эксикаторе) и остаток растворяют в 10%-ном водном пропаноле.

Обессолившие мочи проводят так же, как описано для плазмы (берут 0,5 мл мочи).

Хроматографирование и обнаружение проводят таким же образом, как и (ля неподготовленных проб плазмы или мочи.

Описанная методика пригодна для идентификации аминокислот и в других биологических жидкостях, например в содержимом двенадцатиперстной кишки, в спинномозговой жидкости и в кале. Последний, однако, сначала необходимо экстрагировать ацетоном и для разделения пользоваться соответствующей ча стью вытяжки. Кровь нельзя непосредственно наносить на пластинку для раз деления. Сначала рекомендуется нанести каплю крови на небольшой кусочек фильтровальной бумаги и аминокислоты элюировать в течение 2—3 ч разбав ленным этанолом (100 мкл 70%-ного этанола на пятно крови диаметром 1 см).


20 мкл полученной таким образом вытяжки подвергают затем хроматографи рованию.

При двумерной хроматографии аминокислот без предварительного обессо ливания материала с успехом можно пользоваться в первом направлении сис темой трег-бутанол — метилэтилкетон — 25%-ный аммиак — вода ( 5 : 3. 1 : 1 ) и во втором направлении хроматографируют дважды смесью н-бутанол — ацетон— уксусная кислота — вода ( 7 : 7 2 : 4 ).

В некоторых случаях (особенно для патологической мочи) трудно достиг нуть удовлетворительных результатов без предварительного обессоливания. По этому оказывается необходимым или обессолить мочу, или пользоваться ком бинацией хроматографического и электрофоретического разделения.

Комбинация электрофоретического и хроматографического разделения аминокислот мочи и плазмы по Эрссеру и сотр. \[6] Приготовление слоя. Пользуются готовыми пластинками микрокристалличе ской целлюлозы MN 400 (Macherey — Nagel) размером 16X7,5 см.

Хроматография и электрофорез. На слой наносят 1,5 мкл мочи или 10 мкл спиртового экстракта плазмы в форме полоски шириной 0,5 см на стартовую линию ближе к аноду и высушивают теплым воздухом. Пластинку затем равно 494 Специальная часть мерно опрыскивают 1%-ной муравьиной кислотой (рН около 1,8) так, чтобы она хорошо увлажнилась;

затем помещают в электрофоретическую камеру пласт массовой подложкой кверху. Буферный раствор из электродного пространства подводят к слою полоской фильтровальной бумаги (к широкой стороне). Раз деление ведут в течение 20—25 мин при 200 В (30 В/см) и 3 мА (0,2 мА/см).

По окончании разделения пластинку высушивают, удаляют части слоя, сопри касавшиеся с бумагой, и хроматографируют во втором направлении в системе к-бутанол — ацетон — уксусная кислота — вода ( 7 : 7 : 2 : 4 ).

Обнаружение. Универсальным реактивом может служить 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне с добавлением 1,5% пиридина. Как и в хроматографии, можно пользоваться и другими реактивами.

Некоторые аминокислоты не удается хорошо делить в обычных смесях;

по этому мы приводим системы, позволяющие их полное разделение. Лейцин, изо лейцин и валин хорошо разделяются в системе трег-бутанол — метилэтилкетон— вода ( 3 : 1 : 1 ), а гистидин — в системе грег-бутанол — метилэтилкетон — 25% -ный аммиак — диэтиламин — вода ( 5 0 : 3 0 : 1 0 : 0, 4 : 2 0 ). Кислоты гомоцистеиновую и цистеиновую в пробах, окисленных надмуравьиной кислотой, удается удовлетво рительно разделить электрофоретически на слое целлюлозы в 1%-ной муравьи ной кислоте (рН 1,8), кислоты аспарагиновую, глутаминовую, а-аминоадипино вую и р-аминоизомасляную — при рН 4,4 и кислоту аргининянтарную — при рН 5,2 в пиридин-ацетатном буферном растворе.

Подобной же комбинацией электрофореза и тонкослойной хроматографии Мацусита и сотр. i[42] определяли Y- aMHHO "P-° KCHMa ^HHyio кислоту в моче.

В описанных системах одно- и двумерной хроматографией можно надежно диагностировать гистидинемию и имидаэолпептидурию.

Открытие метаболитов триптофана по Амбелю и Марсо [10] Приготовление слоя. Пользуются пластинками ЭКТЕОЛА-целлюлозы (Мас herey — Nagel) размером 20X10 см. Перед собственно хроматографией необхо димо очистить пластинку, хроматографируя дистиллированную воду до верхнего края слоя. Сушат в токе холодного воздуха.

Хроматографирование. Эталоны 3-оксиантраниловой кислоты, кинуренина и 3-оксикинуренина наносят на пластинку в виде растворов в 0,1 н. НС1. Кис лоты антраниловую, кинуреновую, ксантуреновую, кинуренин, 8-метиловый эфир ксантуреновой кислоты и аминогиппуровую растворяют в 0,2 н. растворе аммиа Таблица Окраска пятен метаболитов триптофана при обнаружении в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм [10] Вещество Флуоресценция Ксантуреновая кислота Светло-голубая »

8-Метиловый эфир кннуреновой кислоты Кинуреновая кислота Зеленая З-Оксйантраниловая кислота Зелено-голубая З-Оксикинуренин Желто-зеленая Антраниловая кислота Светло-голубая Зелено-голубая Кинуренин о-Аминогиппуровая кислота Светло-голубая Специальная часть ка (1 мг/мл). 2 мкл каждого эталона наносят на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. На эту же пластинку наносят 5 мкл исследуемой мочи. Хрома тографируют в растворе 10 г NaCl и 1 мл ледяной уксусной кислоты в 100 мл дистиллированной воды до верхнего края пластинки (15—20 мин).

Обнаружение. Хроматограмму сушат при комнатной температуре в гори зонтальном положении и пятна детектируют при 254 нм (табл. 88).

Количественное определение метаболитов триптофана в моче по Уолшу \[29\ (см. также [35]) Приготовление слоя. Пластинки готовят обычным образом из целлюлозы MN300 (Macherey — Nagel).

Хроматографирование. 5 мкл мочи, 5 мкл эталонного раствора и смесь мочи и эталонного раствора наносят на слой на расстоянии 2 см от края пластинки.

Для количественного определения 100 мкл наносят в форме полоски. Хромато графируют в 0,2 М ацетатном буферном растворе, рН 5,4, при 4 °С до дости жения верхнего края пластинки.

Обнаружение. После высушивания хроматограммы при 80 °С вещества об наруживают в ультрафиолетовом свете либо реактивом Эрлиха, либо диазоти рованной сульфаниловой кислотой (табл. 89). Окрашивание обоими этими реактивами можно провести на одной и той же хроматограмме, однако перед применением диазореактива следует полностью удалить соляную кислоту. В по следнем случае мешает только мочевина;

ее можно устранить перед нанесением пробы инкубацией мочи с уреазой.

Приготовление эталонных растворов. По 20 мг ксантуреновой кислоты, ки нуренина, 3-оксикинуренина и антраниловой кислоты растворяют в 100 мл ди стиллированной воды.

Таблица Значения hRF и окрашивание пятен некоторых метаболитов триптофана [29] Диазотированная Реактив Эрлиха hRF Вещество сульфаниловая УФ-освещение (Д 37) кислота (Д 25) Ксантуреновая • 40 Светло-голубое Пурпурное — кислота З-Оксикинуренин 48 Бледно-зеленое Бледно-желтое Кинуренмн Голубое Желтое — Антраниловая кис- Пурпурное Оранжевое — лота Количественное определение. После разделения и обнаружения в ультрафио летовом свете участки сорбента с пятнами вырезают и переносят в пробирки.

Определение ксантуреновой кислоты и 3-оксикинуренина. В пробирки, содер жащие сорбент с этими веществами, добавляют по 1,5 мл дистиллированной во Жы и оставляют стоять 60 мин при комнатной температуре. После центрифуги рования по 1 мл жидкости переносят пипеткой в другие пробирки и прибавля ют по 2 мл раствора диазотированной сульфаниловой кислоты, охлажденного д© 10 °С (перед употреблением смешивают 1 часть 1%-ного раствора сульфани ловой кислоты в 10%-ной соляной кислоте с 1 частью 5% -кого раствора нит рита и 2 частями 10%-ного углекислого натрия). Образующееся с ксантуреновой кислотой окрашивание фотометрируют немедленно при 510 нм, а окрашивание 3-оксикинуренина — через 10 мин при длине волны 450 нм.

Определение кину ренина. После добавления 1 мл дистиллированной воды содержимому пробирки дают стоять 30 мин при комнатной температуре. После 496 Специальная часть добавления 2 мл реактива Эрлиха (1%-ный раствор л-диметиламинобензальдеги да в 50% -ной уксусной кислоте) раствор выдерживают 10 мин, центрифугируют и жидкость фотометрируют бри 450 нм.

Определение антраниловой кислоты. Это вещество определяют тем же спо собом, что и кинуренин, с тем отличием, что элюат пятна инкубируют 60 мин с уреазой для удаления мочевины, мешающей определению. После инкубации реакционную среду центрифугируют и образующееся после реакции с реактивом Эрлиха окрашивание фотометрируют при длине волны 470 нм. Линейная зави симость наблюдается для ксантуреновой кислоты, кинуренина и 3-оксикинуре нина в интервале 0—30 мкг, для антраниловой кислоты — в пределах 0—10 мкг.

Количественное определение триптофана и обнаружение индола в моче и крови [15] (см. также {50}) Приготовление слоя. Из водной суспензии силикагеля G приготовляют слой толщиной 0,3 мм (20X20 см).

Хроматографирование. 30 мкл мочи или 20 мкл освобожденной от белка крови или сыворотки наносят на пластинку и хроматографируют в смеси про панод-2 —25%-ный аммиак — вода (20:1:2). Если проводят двумерное хро матографирование, то затем во втором направлении используют смесь н-бута вол — уксусная кислота — вода (15:3:5) (табл. 90).

Обнаружение. После высушивания хроматограммы вещества обнаруживают в ультрафиолетовом свете опрыскиванием реактивом Эрлиха 1[10%-ный раствор к-диметиламинобензальдегида в смеси концентрированной соляной кислоты и ацетона в отношении (1 :4)] или Адамкевича — Гопкинса (56 мг Fe в 1000 мл уксусной кислоты с добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты) (табл. 91).

Таблица Значения hRP некоторых производных индола [15] • Пропанол-2— к-Бутанол— уксусная АОуцтЯЫМ Вещество кислота—вода раствор шишака—вода (15: з : 5) ( 2 0 : 1 : 2) И Триптофан Серотонинкреатинсульфат 5-Окситриптофан 8 З-Индолилуксусная кислота 26 5-Оксииидрлилуксусная кислота 18 З-Индолилпропионовая кислота 31 Количественное определение. После детектирования в ультрафиолетовом свете участки сорбента с пятнами триптофана срезают с хроматограммы и сме шивают в центрифужной пробирке с 0,5 мл ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДЫ И 1,5 мл ре актива Адамкевича — Гоякинса. После основательного перемешивания центри фугируют и жидкость фотометрируют при 530 им;

параллельно проводят хо лостой опыт.

Концентрацию триптофана & исследуемой пробе рассчитывают по калибро вочной кривой.

Специальная часть Таблица Окрашивание и чувствительность некоторых производных индола при реакциях обнаружения [15] Реактив Адамкевича—Гопкинса Реактив Эрлиха (Д 37) чувстви чувстви Вещество тель тель окрашивание окрашивание ность, ность, мкг мкг Триптофан Розово-фиолето- Желто-фиолето 0,03 0, вое вое Серотонинкреатинсуль- Серо-голубое Желто-голубое 0,04 0, фат 5-Окситриптофан То же 0, Сине-фиолетовое 0, З-Индолилуксусная кис- Фиолетовое 0,02 Фиолетовое 0, лота 5-Оксииндолилуксусная Голубое 0,02 0, Голубое кислота З-Индолилпропиомовая 0,03 Серо-фиолетовое Фиолетовое 0, кислота Количественное определение мочевины в моче по Ринку и Гелю [19] Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel) гомоге низируют в течение 2 мин с 90 мл дистиллированной воды и суспензию наносят на стеклянную пластинку. Указанного количества достаточно для покрытия пластинок размером 20X20 см слоем толщиной 0,25 мм.


Хроматографирование. 0,03 мл мочи хроматографируют одновременно с 0,03 мл эталонного» раствора мочевины (300 мг мочевины растворяют в 100 мл дистиллированной воды) в смеси пропанол-2 — уксусная кислота — вода (80 : 20 :

: 4) в течение 3,5—4 ч (фронт перемещается приблизительно на 15 см от стар та) при комнатной температуре в насыщенной парами растворителя камере Количественное определение. После высушивания хроматограммы обе край ние полосы обнаруживают реактивом Эрлиха (5 г /г-диметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 96% ного этанола и перед употреблением 50 мл раствора смешивают с 5 мл концептрировапной серной кислоты;

по охлаждении долива ют исходным раствором до 100 мл) В зависимости от положения пятен мочевины вырезают соответствующие части неокрашенной хрсматограммы, промывают на пористом стеклянном фильт [je (G-1) 5 мл дистиллированной воды при пониженном давлении, фильтрат переносят в мерную колбочку на 5 мл и доливают до метки. Таким же обра •зом поступают с эталоном и контрольным образцом (площади слоя сорбента соответствуют площадям пятен).

2 мл фильтрата смешивают с 2 мл реактива Эрлиха и спустя 15 мин фо тоиетрируют при длине волны 430 нм, сравнивая с контрольным образцом. Коли чество мочевины рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по раз личным количествам мочевины аналогичным способом Количественное определение мочевой кислоты в моче и сыворотке по Ринку и Гелю 1[20] Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 F25« (Macherey —Nagel) го могенизируют в течение 2 мин с 90 мл дистиллированной воды. После нанесе 498 Специальная часть ния слоя пластинки сушат при комнатной температуре. Указанного количества достаточно для покрытия 5 пластинок размером 20X20 см.

Хроматографирование мочи. 0,05 мл мочи наносят в форме полоски на слой и одновременно хроматографируют 0,05 мл эталонного раствора мочевой кис лоты (20 мг мочевой кислоты растворяют в 100 мл 10%-ного водного раствора пиперазина). Хроматографируют в насыщенной парами растворителя камере в смеси пропанол-2—10%-ный водный раствор пиперазина (1:2) в течение 4 ч (фронт перемещается на 15 см).

Количественное определение. После сушки хроматограммы при комнатной температуре мочевую кислоту обнаруживают в ультрафиолетовом свете (темные пятна на флуоресцирующем фоне) и участки сорбента с пятнами переносят на пористый стеклянный фильтр (G-1). Равновеликим по площади участком слоя пользуются как контрольным образцом. Все образцы промывают 4 мл дистил лированной воды, фильтрат отсасывают, переносят в мерные колбы 5 мл, при ливают по 5 капель насыщенного на холоду водного раствора пиперазина и доливают до метки. К 2 мл такого раствора приливают 2,6 мл глицериносили катного реактива (6 частей 10%-ного водного раствора силиката натрия смеши вают с 1 частью глицерина) и 0,4 мл арсенофосфорновольфрамовой кислоты (100 г NajWO* растворяют в 600 мл дистиллированной воды и прибавляют 50 г As2O8, 25 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 20 мл концентрированной соляной кисло ты;

смесь кипятят 20 мин с обратным холодильником и по охлаждении доводят объем до 1000 мл водой). Через 15 мин проводят измерение при 700 им (ок раска устойчива 10 мин!) Количество мочевой кислоты рассчитывают по кали бровочной кривой, построенной аналогичным способом, или с помощью эталона.

Хроматографирование плазмы крови. В центрифужную пробирку помещают пипеткой 3 мл сыворотки и 6 мл 96%-ного этанола. После основательного пе ремешивания смесь центрифугируют. Жидкость сливают в чашку для выпари вания, а осадок еще раз промывают этанолом. Соединенные вытяжки осторож но выпаривают досуха. Остаток растворяют в 0,2 мл 10%-ного водного раство ра пиперазина и 0,05 мл раствора наносят на пластинку. Далее поступают, как и при определении в моче. Количество мочевой кислоты рассчитывают либо с помощью одновременно хроматографированного эталонного вещества, либо по калибровочной кривой, которую строят по растворам соответствующих концент раций (основной раствор готовят растворением 0,18 г мочевой кислоты в 100 мл 10%-ного водного раствора пиперазина). Средняя погрешность метода около ±0,9%.

Количественное определение креатинина и креатина в моче по Ринку и Кребберу \[21] Определение креатинина Приготовление слоя. Из целлюлозы MN 300 F264 (Macherey — Nagel) гото вят слой обычным способом.

Хроматографирование. На слой наносят 6 образцов анализируемой мочи (20—30 мкл) и 6 образцов эталонных растворов (20, 40 и 60 мкл раствора кре атинина (50 мг) в 100 мл дистиллированной воды, что соответствует количест вам 10, 20 и 30 мкг) полосками 3 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Хроматографируют в насыщенной парами растворителя камере смесью пропанол-2 — уксусная кислота — вода (20 : 10 : 5) в течение 3,5 ч (фронт перемещается на 15 см). Хроматограмму высушивают 2 ч при ПО "С и пятна креатинина обнаруживают в ультрафиолетовом свете.

Количественное определение. Участки сорбента с пятнами: соскребают в про бирки, приливают по 5 мл реактива (4 г NaOH и 2,5 г пикрата натрия раство ряют в 500 мл дистиллированной воды;

раствор устойчив в течение почти неде ли) и основательно перемешивают. Через 20 мин фильтруют и через 60 мин ок раску фотометрируют при 490 им. Одновременно аналогичным способом обра батывают 6 контрольных образцов, полученных из равновеликих по площади пятен слоя, и измеренные значения вычитают из соответствующих для исследу Специальная часть емых проб. Количество креатинина рассчитывают по калибровочной кривой.

Погрешность метода около ± 3 %.

Определение креатина Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 F254 гомогенизируют в течение 1 мин с 90 мл 0,2 М раствора NaCl. Суспензию наносят на 5 пластинок (20Х Х20 см) и высушивают при комнатной температуре.

Хроматографирование. На слой наносят 6 проб анализируемой мочи (по 50 мкл) и 6 (эталонных) проб (по 20, 40 и 60 мкл) 50 мг — % -го раствора креатина полосками 3 см. По обоим краям хроматограммы наносят смесь 30 ми эталонных образцов креатина, гликоцианина и гликоциамидина полосками 1 см Хротлатографируют в насыщенной парами растворителя камере смесью этанол— 0,4 М NaCl — 25%-ный аммиак ( 8 0 : 1 8 : 2 ). После сушки хроматограммы при 110°С среднюю часть закрывают и обе боковые полосы с эталонами опрыски вают раствором нитропруссида натрия и красной кровяной соли (1 часть 10% ного NaOH, 1 часть 10%-ного раствора нитропруссида и 1 часть 10%-ного рас твора красной кровяной соли смешивают с 3 частями дистиллированной воды;

перед употреблением раствору дают стоять 20 мин).

Участки сорбента, соответствующие креатину в неокрашенной части хрома тограммы, соскребают и переносят в пробирку и прибавляют 1 мл раствора ct-нафтола (0,5 г а-нафтола и 1 г NaOH растворяют в 50 мл дистиллирован ной воды) и 4 мл раствора диацетила (1 г 1%-наго водного раствора диацети ла разбавляют дистиллированной водой до 160 мл). После перемешивания и стояния в течение 20 мин фильтруют и спустя 45—60 мин фотометрируют при 546 нм. Контрольные образцы исследуют подобным же образом. Количество креатина рассчитывают по калибровочной кривой. Погрешность составляет око ло ± 1, 5 %.

Количественное определение мочевины по Хиткоту и сотр. [9] Приготовление слоя. Слой толщиной 0,4 мм (20X20 см) готовят обычным способом из целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel).

Хроматографирование. 1 мкл мочи наносят на старт на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки и хроматографируют в смеси пропанол-2 — бутанон— Таблица Значения hRF мочевины и других эрлих-положительных веществ [9] hRF hRp Вещество Вещество Мочевина 68 Лллаитоин Индикан 89 я-Амииогиппуровая кислота 5-Окситриптофан 43 Аитраниловая кислота 8-Индолилмолочная кислота 96 З-Ипдолилакриловая кис лота Триптамин Кинуренопая кислота З-Индолилуксусная кислота Кинуреиин Гиппуровая кислота Цитруллин Триптофан Индол N.N'-Диметилтриптамин Ксантуреновая кислота $-Оксикинуренин Тиомочевина 500 Специальная часть 1 н. НС1 (60: 15:25) до перемещения фронта на 13 см (2,5 ч). По окончании разделения хроматограмму сушат 15 мин в токе воздуха и 15 мин при 60 "С.

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают реактивом Эрлиха (10%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в концентрированной соляной кислоте, раз бавленный пропанолом в отношении 1 :4;

реактив устойчив в течение лишь краткого времени, и его следует готовить перед употреблением). После опрыс кивания хроматограмму нагревают в течение 45 мин при 60 "С до достижения оптимальной интенсивности окрашивания. Мочевина образует пятна, окрашен ные в желтый цвет (табл. 92).

Количественное определение. Из основного раствора мочевины (0,05 М в 10%-ном водном пропаноле-2) '[9] готовят рабочий раст вор (0,005 М). Наносят количества этого раствора, соответствую щие количествам в интервале от 3 до 30 мкг мочевины. Далее поступают, как при определении мочевины в моче.

Количественное определение мочевинного азота в сыворотке крови реактивными бумажками урастрат [31] Хотя этот метод и нельзя безусловно относить к способам тонкослойной хроматографии, мы упоминаем о нем главным об» разом потому, что он основан на хроматографическом принципе, а также потому, что он представляет собой современный скринин говый метод, применяемый в клинических лабораториях.

Проведение опыта. В пробирку (10X75 мм) пипеткой вносят 0,2 мл плазмы крови так, чтобы она не попала на стенки. Реактивную бумажку, на которой в соответствующих зонах нанесены реактивы (рис. 90), вертикально помещают в пробирку зоной уреазы, предохраняемой листочком пластмассы, книзу и укреп ляют зажимом. Благодаря силам капиллярности сыворотка поднимается по ре активной бумажке. В зоне 3 мочевина действием уреазы расщепляется на угле кислоту и аммиак. Последний реагирует с фосфатным буфером, образуя фосфат аммония. Содержащийся в верхней части зоны 3 углекислый калий выделяет аммиак из фосфата, и он диффундирует через крилоновый барьер 2, препятст вующий дальнейшему подъему сыворотки, в индикаторную зону /. Здесь ам миак реагирует с винной кислотой;

образуется виннокислый аммоний, изменяю щий значение рН, и первоначальная желтая окраска индикаторной зоны меня а д Рис. 90. Количественное ферментативное определение мочевинного азота в плазме крови [31].

а — индикаторная бумажка;

б — устройство для проведения определения;

/ — индикаторная зона (бронкрезоловый зеленый, подкисленный винной кислотой);

2 — крилоновый барьер;

& — зона очищенной уреазы с фосфат ным буфером я углекислого калия, с обеих сто рон защищенная пластмассовой пленкой;

4 — ме ниск окрашенной зоны;

5 — плазма;

$ — пробир ка.

Специальная часть ется на синюю. Высота окрашенной части прямо пропорциональна количеству мочевинного азота.

Реакция протекает при комнатной температуре (20—26 °С) и заканчивает ся в течение 30 мин. Верхний край мениска зоны, окрашенной в синий цвет, отмечают карандашом.

Расчет. Количество оценивают либо по эталонному образцу, либо следую щим способом. Линейкой измеряют высоту окрашенной в синий цвет части индикаторной зоны и умножают на 5 (1 мм высоты окрашенной зоны соответ ствует 5 Mr*— % мочевинного азота). Ввиду того что значения ниже 10 мг—% не могут быть измерены, эти 10 мг—% следует прибавить к измеренному зна чению.

Пример. Окрашенная зона имеет высоту 6 мм. Количество мочевинного азо та в плазме крови составляет:

6 x 5 мг—% + 10 мг—% = 40 мг—%.

При пересчете значений мочевинного азота на количество мочевины полу ченный результат следует умножить на коэффициент 2,14.

40 мг—% мочевинного азотах2,Н = 85,6 мг—% мочевины.

При пересчете количества мочевины на мочевинный азот содержание мо чевины (в мг—%) умножают на коэффициент 0,47.

Расчет повышенных количеств мочевинного азота. Вследствие того что опи санными реактивными бумажками можно определить значения не более 75 мг— % мочевинного азота (что соответствует около 160,5 мг—% мочевины), патоло гическую сыворотку необходимо разбавлять. Для разбавления удобно пользо ваться заранее определенными нормальными сыворотками или эталонными и контрольными сыворотками (версатол и др.). В этом случае исследуемый мате риал разбавляют, например, версатолом в отношении 1 : 4 ( 1 часть исследуемой пробы и 3 части версатола). К пробе прибавляют 0,2 мл разбавленной сыворот ки и рассчитывают следующим образом:

количество азота в исследуемой сыворотке =1количество азота мочевины в разбавленной сывороткеХполный объем пробы —мочевинный, азот версатолаХобъем взятого версатола Пример. Высота окрашенной зоны для исследуемой сыворотки, разбавленной версатолом в отношении 1 : 4, составила 5 мм. Содержание азота в версатоле 15 мг— %.

Мочевинный азот разбавленной сыворотки = = 5 мм (высота окрашенной зоны)Х5 мг—% + 10 мг—%=35 мг—%.

Мочешшный азот исследуемой сыворотки = = 3 5 мг—% (азот разбавленной сыворотки) Х4 (объемная доля в смеси) — 15 мг—% (азот в версатоле) ХЗ (объемная доля версатола) =95 мг—%.

Примечания. Для получения воспроизводимых результатов необходимо при держиваться следующих условий:

1. Реактивные бумажки сохраняют в сухом месте при температуре 0—5 "С.

Перед употреблением необходимо довести их до комнатной температуры. Надо предохранять реактивные бумажки от действия аммиака или других химических испарений. Не следует излишне подвергать действию прямого освещения.

] 2. При введении исследуемой сыворотки пипеткой в пробирку не следует касаться стенок, 'так как попадание сыворотки сбоку на бумажку будет иска жать результаты анализа.

3. Индикаторную зону нельзя трогать руками.

4.. Время проявления (30 мин) необходимо выдерживать точно, иначе ок рашенная в синий цвет зона распространится выше.

В02 Специальная часть На этом же принципе основывается определение мочевинного азота индикаторными бумажками, выпускаемыми фирмой Merck под названием Merckognost Harnstoff [32]. В отличие от выше описанного способа эти бумажки следует хранить в специальных камерах из пластических масс;

результат определения отсчиты вается прямо на реактивной бумажке (не требуется шаблон для отсчета), и ход проведения опыта несколько другой. Определение можно производить не только в сыворотке и моче, но и в цельной крови.

Круговая хроматография катехоламинов по Кэзеру ([//] Приготовление слоя. Слой готовят из микрокристаллической целлюлозы обычным способом.

Подготовка пробы. К 10 мл мочи, подкисленной хлорной кислотой до рН 1— 2, приливают 0,5 мл 1%-ного раствора метабисулырита натрия и 0,5 мл 0,2 М раствора ЭДТА. Затем 0,5 н. раствором КгСОз устанавливают рН 8,7. После добавления 0,5 г А1гО3 смесь перемешивают 10 мин и центрифугируют. Жид кость сливают, осадок промывают ЗХЮ мл раствора, содержащего 1% КНСОз, 0,01% Na2Ss08 и 0,002 М ЭДТА. Добавляя 5 н. К2СО3, устанавливают рН 8, и трижды экстрагируют по 7 мл 0,5 н.уксусной кислоты. Соединенные вытяжки выпаривают при 37 С и остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды.

Хроматографирование. После нанесения образца (20 мкл) хроматографи руют в течение &—4 ч при комнатной температуре смесью н-бутанол — уксус ная кислота — вода ( 4 : 1 : 1).

Обнаружение. Высушенную хроматограмму опрыскивают раствором этилен диамина и красной кровяной соли (Д67),[27] и нагревают 30 мин при 50 °С;

флуоресцирующие пятна наблюдают при 366 им (табл. 93).

Таблица Значения hRF и цвета флуоресценции катехоламинов [8] hRp Флуоресценция Вещество ДОФА Светло-желтая Норэпинефрин (норадреналин) 33 Желтая Эпинефрин (адреналин) Желто-коричневая Дофамин 42 Светло-желтая 3,4-Диоксифенилуксусная кис-' То же лота ЛИТЕРАТУРА 1. Biserte С, Нап К., Paysant P., Boulanger P., Cliri. chim. Acta, 8, (1963).

2. Braun L, Biochem. Z., 339, 8 (1963).

3. Brenner M., Niederwieser A., Experientia, 16, 378 (1960).

4. Brenner M., Niederwieser A., Pataki G., Fahmy A. R., Experieritia, 18, (1962).

Специальная часть 5. Ersser R. S., Seakins J. W., Nature, 223, 1388 (1969).

6. Ersser R. S., J. Med. Lab. Technol., 27, 142 (1970).

7. Fahmy A. R., Niederwieser A., Pataki C, Brenner M., Helv. chim. Acta, 44, 2022 (1961).

8. Gries G., Pfeifer K. N.. Zappfi E. J?, Klin. Wschr., 43, 514 (1965).

9. Heathcote J. G., Davies D. M., Haworth C, J. Chromatogr., 60, 103 (1971).

10. Humbel R., Marsault G., J. Chromatogr., 79, 347 (1973).

11. Kaser H., J. Chromatogr., 82, 127 (1973).

12. Keller M,, Pataki G., Helv. chim. Acta, 46, 1687 (1963).

13. Massaglia A., Rosa U., J. Chromatogr., 14, 516 (1964).

14. Opienska-Blaut J., неопубликованные данные.

15. Opienska-Klaut I., Kraczkowski M., Brzuszkiewicz H., Zagorski Z., J. Chroma togr., 17, 288 (1965).

16. Pataki G., Keller M., Z. klin. Chem., 1, 157 (1963).

17. Pataki G., Keller M., Helv. chim. Acta, 47, 787 (1964).

18. Relvas M. A., Clin. chim. Acta, 8, 12, 533 (1963).

19. Rink M., Geht A., J. Chromatogr., 18, 240 (1965).

20. Rink M.t Gehl A., J. Chromatogr., 24, 220 (1966).

21. Rink M., Krebber D., J. Chromatogr., 25, 80 (1966).

22. Rokkonen Т., Scand. J. clin. Lab. Invest., 16, 149 (1964).

23. Rosmus J., Deyt Z., Chromatogr. Rev., 13, 163 (1971).

24. Rosmus J., Deyt Z., Chromatogr. Rev., 16, 221 (1972).

25. Seiler N., Wieckmann J., Experientia, 20, 559 (1964).

26. Seiler N., Wieckmann I., Experientia, 21, 203 (1965).

27. Takahashi S., Gjessing L. R., Clin. chim. Acta, 36, 369 (1972).

28. Von Arx E., Neher R., J. Chromatogr., 12, 329 (1963).

29. Walsh M. P., Clin. chim. Acta, 11, 263 (1965).

30. Walz D., Fahmy A. R., Pataki G., Niederwieser A., Brenner M., Experientia, 19, 213 (1963).

31. Urastrat-Teststreifen zur quantitativen enzymatischen Bestimmung des Harns toffes in Serum. Godecke A. G., Berlin, 1973. (Реактивные бумажки Urastrat для количественного ферментативного определения мочевины в сыворотке, фирма Godecke, Берлин.) 32. Merckognost Harnstoff zur Harnstoffbestimmung in Vollblut, Serum und Plasma. E. Merck, Darmstadt 1973. (Merkognost, бумага для определения мочевины в цельной крови, фирма Merck, Дармштадт.) ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 33. Berry H. К, J. Chromatogr., 56, 316 (1971).

34. Bremer J. H., Marx D., Niitzennadel W., Bickel H, Klin. Wochenschr., 11, 682 (1970).

35. Byrd D. J., Kochen W., hlzko D., Knorr П., Л. Chromatogr., 94, 85 (1974).

36. Fleisher I. H., Russell D. M., J. Cliromatogr., 110, 335 (1975).

37. Geisler H. E., Mutschler E., J. Clin Chem. Clin. Biochem., 12, 151 (1974).

38. Giguere R., Shapcott D., Lemieux В, J Chromatogr., 95, 122 (1974).

39. Heby O., Anderson G., J. Chromatogr. Biomed. App., 145, 73 (1978).

40. Kochen W., Byrd D. L, Buhner R, Biihrlen E., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 13, 1 (1975).

41. Kraffczyk F., Helger R., Lang H., Clin. Chim. Acta, 31, 489 (1971).

42. Matsushita K, Gjessing L. R., J. Chromatogr, 162, 427 (1979).

43. Mehta M. C, Saini A. S., J. Chromatogr., 96, 148 (1974).



Pages:     | 1 |   ...   | 13 | 14 || 16 | 17 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.