авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 16 ] --

44. Rose H. J., Jenz I., Z. med. Labortechn., 13, 197 (1972).

45. Sounders R. A., Powell S., J. Chromatogr., 97, 284 (1974) 46. Seiler N.. J. Chromatogr. Biomed. App., 143, 221 (1977) 47. Schen R., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 14, 501 (1976).

48. Schwartzmann R. M., Halliwell R. E. W., J. Chromatogr., 115, 129 (1975) 504 Специальная часть 49. Stingsby J. М., Boulton A. A., J. Chromatogr, 123, 51 (1976).

50. Trefz F. К., Byrd D. J., Kochen W., J. din. Chem. Clin. Biochem., 14, (1976).

51. Votkl A., Berlet H. H., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15, 267 (1977).

6.3. Нуклеиновые кислоты и их составные части В настоящее время тонкослойная хроматография представляет собой единственный метод, позволяющий установить весь спектр луринов, пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотидов и надежно раз делить самые сложные смеси этих соединений в вытяжках из био логических материалов, когда в распоряжении имеется лишь не значительное количество материала. Этот метод оказался незаме нимым при исследовании строения нуклеиновых кислот.

В качестве носителя пользуются как неорганическими матери алами (силикагель G и окись алюминия с добавлением гипса), так и в значительно большей степени порошкообразной целлюлозой и модифицированными целлюлозосодержащими носителями на ос нове анионитов, например ECTEOLA-, DEAE-, PEI- и QAE-целлю лозы, или катионитов, например Р-, СМ- и РР-целлюлозы.

Для разделения мононуклеотидов и олигонуклеотидов Ранде рат [4—61 пользовался PEI-целлюлозой.

На ECTEOLA-целлюлозе подвергали разделению пуриновые аналоги производных нуклеиновых кислот [12], на РЕ1-целлюло зе — пуриновые нуклеозиды и нуклеотиды [15, 16], на слоях цел люлозы— мононуклеотиды РНК [13], на целлюлозе и силикаге ле — метилированные нуклеозиды РНК,[Н].

Принятые сокращения: ECTEOLA-целлюлоза — анионит, полу ченный в результате реакции целлюлозы с эпихлоргидрином и триэтаноламином;

DEAE-целлюлоза — диэтиламиноэтилцеллюло за;

целлюлоза Р — фосфат целлюлозы;

PEI-целлюлоза — целлю лоза, обработанная полиэтиленимином;

СМ-целлюлоза — карбок симетилцеллюлоза;

РР-целлюлоза — целлюлоза, содержащая по ляфосфат;

QAE-целлюлоза — целлюлоза, содержащая четвертич ные аммониевые группы.

Двумерная хроматография нуклеотидов [7, 8] Приготовление слоя. 30 г порошкообразной целлюлозы гомогенизуют в 200 мл 1%-яого диализованного раствора лолиэтиленимина в течение 30 с.

Слои (10X20 или 20X20 см), приготовленные обычным способом, сушат в те чение ночи прч комнатной температуре. Перед собственно хроматографировани ем слой элюируют 10%-ным раствором NaCl до расстояния 5 см н затем сразу дистиллированной водой до верхнего края пластинки. После высушивания в токе холодного воздуха промывание водой повторяют еще раз. После повтор ной сушки при комнатной температуре (12—15 ч) пластинки готовы для хро матографирования.

Пластинки могут сохраняться без видимых изменений в темноте на холоду 4 °С) в течение нескольких месяцев. Суспензии целлюлозы в растворе по Специальная часть -Cmapm 1.

Рис. 91, Двумерная хроматография нуклеотидов {7, 8].

Сорбент: PEI-целлюлоза;

системы: первое направление — градиентное проявление раство ром ЫС1, второе направление — градиентное проявление формиатным буфером (см. текст);

обнаружение: в ультрафиолетовом свете.

1 — цитидин-5'-фоофат (ЦМФ);

2 — аденозин-5'-фосфат (АМФ);

3 —уридин-5'-фосфат (УМФ);

4 — цитидиндифоырат-глюкоэа (ЦДФГ);

5 — уридиндифоофат-М-ацетилглюкозамин (УДФАГ);

5 — аденозиндифосфат-глюкоза (АДФГ);

7 — уридиндифосфат-глкжоза (УДФГ);

8 —инозин S'-фосфат (ИМФ);

9 — гуанозин-5'-фосфат (ГМФ);

10 — гуанозиндифосфат-манноза (ГДФМ);

//— цитидиндифоофат (ЦДФ);

12 — аденоэиндифосфат (АДФ);

13 — уридиндифосфат (УДФ);

14 — инозиндифосфат (ИДФ);

15 — гуанозиндифосфат (ГДФ);

16 — уридиндифосфат-глюку роновая кислота (УДФГК);

П - цитидинтрифосфат (ЦТФ);

18 - уридинтрифосфат (УТФ);

19 — аденозинтрифосфат (АТФ). 20 — ииозинтрифосфат (ИТФ);

21 — гуанозинтрифосфат (ПГФ).

лиэтнленимина и приготовленные ил них слон при комнатной температуре срав нительно малостойки. На слоях юргоных сортов PEI-целлюлозы получается другая картина разделения.

Приготовление проб. Исследуемый образец нередко может содержать зна чительное количество солей, неблагоприятно влияющих на разделение. Боль шую часть олей удается удалить погружением хроматограммы с нанесенными пробами на 10 мин в безводный метанол, причем свыше 90% нуклеотидов оста ется на месте нанесения. После высушивания можно хроматографировать.

Хроматографирование. Пробы наносят на старт, отстоящий от края пластин ки на 3 см, и после сушки в течение 3 мин в токе прохладного воздуха прояв ляют в направлении, перпендикулярном направлению накатки слоя. В первом направлении хрома тографируют сначала 2 мин в 0,2 М L i d, затем 6 мин в 1 М 506 Специальная часть LiCl и, наконец, в 1,6 М LiCI до предварительно намеченного расстояния 13 см от старта. Хроматограмму сушат при температуре около 50 °С в токе теплого воздуха. После просмотра в ультрафиолетовом свете удаляют часть слоя в тех местах, где разделения не прошло (рис. 91, заштрихованная полоса), и пластин ку погружают на 15 мин в 1000 мл безводного метанола для удаления LiCl, который может оказать помехи при хроматографировании во втором направле нии. После сушки на воздухе пластинку выдерживают 30 с в 0,5 М, 2 мин в 2 М и, наконец, в 4 М формиатном буфере рН 3,4, до подъема раствора на расстояние 15 см. После высушивания на воздухе просматривают в ультрафио летовом свете.

Если необходимо идентифицировать неизвестный нуклеотид, к анализируе мому образцу добавляют такое количество эталонной смеси, чтобы ее состав ные части едва просматривались;

тогда неизвестное вещество проявится благо даря своей повышенной интенсивности по сравнению с прочими веществами.

Для того чтобы отличить гуаниновые нуклеотиды, хроматограмму следует подвергнуть в течение нескольких минут действию газообразного хлорида водо рода. После такой обработки они обнаруживают в ультрафиолетовом свете яр ко-голубую флуоресценцию, тогда как производные аденина, гипоксантина, ци тозина и урацила наблюдаются в виде темно-синих пятен.

Чувствительность определения очень высока;

легко удается идентифициро вать 0,15—1,2 мкг нуклеотидов Для разделения больших количеств нуклеоти дов рекомендуются слои толщиной 1—1,5 мм.

Для разделения нуклеотидов и фосфатов углеводов Дитрих и сотр. [2] пользовались слоями из порошкообразной ECTEOLA целлюлозы (2 г просеянного порошка сильно взбалтывают с 18 мл 0,004 Мэтилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,0, в течение мин). Суспензию наносят на пластинку размером 20X20 см. После сушки в течение ночи при комнатной температуре слой опрыскива ют 0,1 М раствором тетрабората аммония, рН 9, и сушат в тече ние 3G мин при 50 "С. После нанесения проб на стартовую линию Таблица Значения hRe нуклеотидов в системе ECTEOLA-целлюлоза — 95%-ный этанол —0,1 М тетраборат аммония, рН 9,0, (3:2) [2] hRp hRF Вещество* Вещество УТФ ТДФ-глюкоза УДФ УДФ-ацетилглюкозамин УМФ УДФ-глюкоза АТФ УДФ-галактоза АДФ АДФ-глюкоза АМФ 50 АДФ-манноза ТМФ 40 НО АДФ-галактоза АДФ-глицериновая кислота Неорганический фосфор а Расшифровку сокращений см. в подписи к рис. 91.

Специальная часть Таблица Значения hRF нуклеотидов и нуклеозидов [1] Вещество I Вещество И I II 2-Дезоксицитидин 66 Аденозин-2'-фосфат 5'-фосфат 59 Аденозин-З'-фосфат Тимидин-5'-фосфат 47 Гуанозин-2'-фосфат Аденозин Гуанозин-З'-фосфат 29 Гуанозин Цитидин-2'-фосфат Цитидин Цитидин-З'-фосфат Уридин Уридин-2'-фосфат 2-Дезоксиаденозин Уридин-З'-фосфат 2-Дезоксигуанозин 2-Дезоксиаденозин 5'-фосфат 69 2-Дезоксицитидин 2-Дезоксигуанозин- Тимидин 5'-фосфат I изомасляная кислота — раствор аммиака (уд. масса 0,90 з~)~ вода (66 • 2. 32);

II 0,005 н HCI.

на расстоянии 3 см от края пластинки хроматографируют в смеси 95%-ный этанол — 0,1 М тетраборат аммония, рН 9,0 ( 3 : 2 ). Как только фронт' растворителя достигнет верхнего края пластинки, хроматограмму просматривают в ультрафиолетовом свете (табл.

94).

Способ, предложенный Коффи и Ньюбургом [1], позволяет успешно разделять 2'- и З'-фосфаты четырех главных нуклеотидов, образующихся при щелочном гидролизе рибонуклеиновой кисло ты, и 5'-фосфаты четырех главных нуклеотидов, содержащихся в ферментативном гидролизате дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Слои для этой цели готовят из суспензии 9,5 г 300 G DEAE цбллюлозы (содержащей 10% CaSO 4 • 0,5 Н 2 О) в 62 мл воды.

Сушка при температуре 50 °С длится 2 ч. Образцы наносят на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Нуклеотиды раство ряют в 0,1 н. растворе аммиака, нуклеозиды — в нейтральных растворах, пурины и пиримидиновые основания — в 0,1 н. НС1.

Наилучшее взаимное разделение рибонуклеотидов было до стигнуто в смеси изомасляная кислота — NH4OH (уд. масса 0,90)—вода ( 6 6 : 2 : 3 2 ), изомерные мононуклеотиды хорошо раз делились в 0,005 н. НС1. Для дезоксирибомононуклеотидов, как и для рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов, подходит первая 33* 508 Специальная часть Таблица Значения hRF свободных оснований [1] н I I Вещество' П Вещество Урацил Аденин 13 0 Гуанин Тимин Цитозин 56 I насыщенный раствор (NH4hSO — I М ацетат натрия (рН 7,5) — пропанол-2 (80 : IS : 2);

II 0,005 н. HCI.

смесь (табл. 95). Для разделения свободных оснований удобна система насыщенный раствор сульфата аммония — 1М ацетат натрия (рН 7,5) —пропанол-2 (80: 18:2). Для разделения пйри мидиновых оснований цитозина и тимина, которые в этой системе обладают почти одинаковыми значениями hRF, следует пользо ваться 0,005 н. НС1 (табл. 96).

Тиминовые нуклеопроизводные исследовал Баудендистель с сотр. [10], основания в нуклеиновых кислотах — Томаш [17]. Ме тод определения пуриновых оснований в моче предложил Браун Количественная двумерная хроматография составных частей ДНЩЗ] Приготовление слоя. Порошок целлюлозы, содержащий гипс (Excorna Zel lulosepulver), наносят на стеклянные пластинки размером 20X20 см. После высушивания в течение 30 мин при комнатной температуре и 30 мин при тем пературе 105 *С пластинки сохраняют в эксикаторе над безводным СаС12.

лроматографирование. После нанесения проб перед собственно хроматогра фировалием пластинку выдерживают 60 мин в камере, насыщенной парами сме си «-бутанол— вода — 90%-ная муравьиная кислота (6:3:0,1);

нижний слой служит для насыщения камеры, верхний — для разделения. Хроматографирова ние в первом направлении заканчивается через 2—2,5 ч, и после кратковремен ной сушки во втором направлении пропускают смесь к-бутанол — этанол — 5 н.

НС1 ( 3 : 2 : 2 ). Другой удобной комбинацией является хроматографирование в первом направлении последней омесью и смесью «-бутанол — ацетон — уксусная кислота —5%-ный NH4OH — вода (3,5:2,5:1,5:1,5:1) во втором направлении.

Открытие и количественное определение. После обнаружения в ультрафио летовом свете участки сорбента с пятнами вырезают и элюируют при комнат ной температуре в течение 16 ч 0,1 н. НС1, периодически взбалтывая. После фильтрования, проводят спектрофотометрическое определение. Для холостого опыта служцт элюат из равновеликих по площади участков сорбента.

Разделение пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеозидов по Тортолани и Колози :[9] Приготовление слоя. 16 г тонкодисперсногр сефадекса G-10 (Pharmacia) я 4 г силикагеля GFSM (Merck) или микрокристаллической целлюлозы (Merck) несколько раз промывают дистиллированной водой и после добавления 45 мл Специальная часть Таблица Значения hRF пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеотидов [9] hRf hRF Вещество Вещество А Б Б А • Ксантозин 100 Уридин 56 96 Гипоксантин Цитидин 90 91 Гуанозин Тимидин 41 83 86 Аденозин Инозин — 83 Ксантин Цитозин 26 77 77 Аденин Урацил Тимин А целлюлоза — сефадекс;

Б силвкагель — сефадекс.

0,05 М фосфатного буфера (рН 7,0) суспензию наносят на стеклянные пластинки (20X20 см, толщина слоя 0,6 мм), оставляют в горизонтальном положении при комнатной температуре в течение 60 мин, затем сушат в токе горячего воздуха почти до полного высыхания.

Хроматографирование. После нанесения 20 мкг водных растворов анализи руемых веществ хроматографируют 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,0) при комнатной температуре в течение приблизительно 4 ч (сефадекс — силикагель) или 6 ч (сефадекс — целлюлоза).

Обнаружение. После высушивания в токе теплого воздуха веществ детекти руют в ультрафиолетовом свете. Образуются фиолетовые пятна на бесцветном или обладающем желто-зеленой флуоресценцией фоне.

ЛИТЕРАТУРА 1. Coffei/ R. С Newburgh R. W., J. Chromatogr., 11, 376 (1963).

2. Dietrich С. P., Dietrich S. С. M., Pontis H. G., J. Chromatogr., 15, 27 (1964).

3. Chmielewicz Z. F., Acara M., Analyt. Biochem., 9, 94 (1964).

4. Randerath K., Biochim. biophys Acta, 61, 852 (1962).

5. Randerath K-, Thin-layer Chromalography. Academic Press, New York, 1963.

6. Randerath K-, Weimann G, Biochim. biophys. Acta, 76, 129 (1963).

Randerath K., Randerath E., J. Chromatogr., 16, 111 (1964).

7.

8. Randerath E., Randerath К, J Chromatogr., 16, 126 (1964).

9. Tortolani G., Colosi M. E., J. Chromatogr, 70, 182 (1972).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 10. Baudendistel L. }., Run T. S., J. Chromatogr., 148, 500 (1978) 11. Brown I. R. F., J. Chromatogr., 125, 530 (1976).

12. Harber M. I., Maddocks J. L., J. Chromatogr., 101, 231 (1974).

43. Kluge H. O., Heilman W., Z. med. Labortechn., 14, 351 (1973).

14. Munns T. W., Sims H. F., J. Chromatogr., I l l, 403 (1975).

15. Reibel D. K., Rovetto M. I., J. Chromatogr., 161, 406 (1978).

,16. Schwartz P. M., Drach J, C, J. Chromatogr., 106, 200 (1975).

Hjl7. Tomasz J., J. Chromatogr., 128, 304 (1976).

510 Специальная часть Сахара 6.4.

При изучении патологических состояний, сопровождающихся нарушениями углеводного обмена, сталкиваются с проблемой идентификации Сахаров в биологических жидкостях. В первую очередь.речь идет о состояниях, при которых происходит чрезмер ное выделение глюкозы, галактозы, фруктозы й пентоз. Детальное обсуждение с биохимической точки зрения показывает, насколько важную информацию о характере изменений метаболизма углево дов можно получить с помощью хроматографических методов.

Разделение моно-, ди- и трисахаридов описал Ганзен [13].

Определению Сахаров в биологических жидкостях посвящена статья [12].

Здесь мы приведем некоторые методы, пригодные для сравни тельно легкого и надежного определения этих веществ.

Открытие Сахаров по Барону и Экономидису в моче![3] Приготовление слоя. 1 часть силикагеля G смешивают с 2 частями 0,1 М борной кислоты. После нанесения на пластинки слой сушат 2 ч при комнатной температуре и затем 30 мин при 105 °С.

Нанесение проб и хроматографирование. После нанесения 5 мкл исследуе мой мочи и 5—10 мкг эталона хроматографируют до расстояния 12—15 ом при 37 °С в системе м-бутанол — уксусная кислота ( 1 : 1).

Обнаружение. После сушки хроматограммы сахара обнаруживают опрыс киванием анилиновым реактивом (Д6) (табл. 98).

Таблица Значения hRF Сахаров и окрашивание пятен под действием анилинового реактива (Д 6) hRp hRp Сахар Сахар Окрашивание Окрашивание 7 Лактоза Сине-серое Фруктоза Коричневое Сахароза Коричнево-се- Глюкоза Мальвово-серое рое Галактоза Мальвово-се- Синее Ксилоза рое Количественное определение Сахаров по Банхеру и сотр. ([/] Приготовление слоя. 30 г силикагеля G смешивают с 65 мл дистиллирован ной воды и после нанесения на пластинки слой сушат в течение ночи при ком натной температуре. По утверждению авторов, так получаются более воспро изводимые результаты, чем при сушке слоя при повышенной температуре.

Хроматографирование. Образец наносят на старт в углу пластинки на рас стоянии 1,5 см от краев. В первом направлении элюируют смесью этилацетат— ацетон — вода (40 :50:10), пока фронт не пройдет расстояние 15—18 см. После высушивания во втором направлении пользуются смесью к-бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (45: 30: 15:5).

Обнаружение. Сахара или их производные обнаруживают анилиновым ре активом (Д6)—после опрыскивания хроматограмму сушат 10—15 иин при Специальная часть О о' о О О х Старт Рис. 92. Разделение Сахаров и родственных веществ [1].

Сорбент: силикагель О;

системы: первое направление — этилацетат — ацетон — вода второе (40:50:10), направление — к-бутанол — уксусная кислота — эфир — вода (45 : 30 : 15 : 5);

обнаружение: анилиндифениламиновый реактив.

1 — глюкоза;

2— арабиноза;

3 — рибоза;

4 — ксилоза;

5 — эрнтроза;

S — глицериновый аль дегид;

7 — гликолевый альдегид;

8 — диоксиацетон;

9 — метилглиоксаль;

10 — глиоксаль;

// — редуктон.

80—100 °С и окраску пятен наблюдают в видимом и ультрафиолетовом свете (рис. 92), или орсиновым реактивом (Д 162)—хроматограмму сушат 10—15 мин при 100 "С (табл. 99).

Количественное определение. После одномерного хроматографирования мож но определять сахара реакцией с бемшднмом;

этот способ удобнее, чем предло женный Пастуской 1[9], по которому окисляют вещества на хроматограмме или в.растворе хромовой смесью и после добавпения иодида калия титруют выде лившийся иод тиосульфатом.

Ход определения. 1—2 мкл пробы наносят на старт на расстоянии 1,5 см от края слоя, приготовленного из силикагсля G Одновременно на эту же пла етинку наносят эталон в 4 различных концентрациях в интервале 10—15 мкг.

После разделения обнаруживают сахара, опрыскивая 0,2%-ным раствором бен зидина в уксусной кислоте и нагревают в течение 10 мин при 100 °С. Альдозы Эбразуют коричневое окрашивание. После переноса в пробирку сорбента с пят JOM и равновеликого по площади количества сорбента для холостого опыта 1риливают по 0,2 мл смеси этанол—вода ( 3 : 2 ), непродолжительно взбалты *ают и после добавления 2 мл 0,2%-ного раствора бензидина в ледяной уксус Юй кислоте нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин в случае гентоз иди 30 мин при определении гексоз. По охлаждении доливают бензиди 512 Специальная часть Таблица Цветные реакции Сахаров И родственных им веществ * Орсии (Д 162) Анилин—дифениламин (Д 6) Окрашивание Вещество дневной свет дневной свет УФ-свет Альдогексозы Синее Желтая флуорес- Чер но-фиолетовое ценция Кетогексозы Красно-коричне- Красно-коричневое То же вое Альдопентозы Синее Оливково-зеленое Светло-желтое Тетрозы Желтое Желтое Ярко-белое — —.

Триозы От желтого до ко ричневого — Глицериновый альде- Желтое Белое гид — Гликолевый альдегид Желто-коричневое Ярко-белое — Глиоксаль Бледно-желто-ко- Белое ричневое » — Метилглиоксаль То же » — Редуктон новым реактивом до 2,5 мл и после центрифугирования фотометрируют при 350 им, учитывая результат холостого опыта. Погрешность определения около 5%, и в интервале 1—50 мкг наблюдается линейная зависимость интенсивности окрашивания от количества вещества.

Определение Сахаров в моче на слоях целлюлозы \[11] Приготовление слоя. 15 г порошкообразной целлюлозы MN 300 (Macherey— Nagel) гомогенизируют в течение 30 с с 90 мл дистиллированной воды. Получен ный слой (0,25 мм) высушивают в течение 10 мин при 100°С.

Приготовление пробы и нанесение. Мрчу можно наносить непосредственно, однако присутствие других веществ, в особенности неорганических солей, мо жет заметно нарушать процесс разделения. Поэтому перед хроматографией сле дует подготовить пробы.

К 10 мл исследуемой мочи прибавляют смесь равных количеств амберлита IR—120 (в Н+-форме) и амберлита IRA (в ацетатной форме). В стеклянной колонке (750X30 мм) слой ионитов промывают 150 мл дистиллированной воды (расход 0,9 мл/мин) в колбу, содержащую 2—3 мл толуола. Элюат выпаривают досуха в вакууме при 50 "С и остаток растворяют в 1 мл насыщенного водного раствора бензойной кислоты. Содержимое экстрагируют горячим метанолом и объединенные вытяжки упаривают в токе воздуха до объема около 1 мл. Из этого раствора на пластинку наносят соответствующий объем в зависимости от концентрации Сахаров.

Хроматографирование. Разделение можно проводить в насыщенной камере в одной из следующих систем: этилацетат — пиридин— вода ( 2 : 1 : 2 ) ;

фенол, насыщенный водой, с 1% аммиака;

пропанол-2 — пиридин — уксусная кислота вода ( 8 : 8 : 1 : 4 ). После достижения фронтом растворителя края пластинки Специальная часть хроматограмму сущат. При использовании первой системы после сушки прово дят повторное элюирование. Такое двукратное хроматографирование требует около 4 ч при комнатной температуре.

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают реактивом Д 8. Гексозы дают зеленое окрашивание (в ультрафиолетовом свете — зеленую флуоресценцию), пентозы — красно-фиолетовое, метилпентозы — желто-зеленое и уроновые кисло т ы — коричневое. Чувствительность для гексоз и метилпентоз около 0,5 мкг, для пентоз и уроновых кислот 0,1—0,2 мкг. В первой системе хорошо разделяются моносахариды (значения HRF составляют: глюкоза 100, галактоза 90, манноза 109, арабиноза 111, ксилоза 125, рибоза 142, рамноза 152). Так как манноза и арабиноза в этой системе обладают практически одинаковой по'движностью, для их разделения удобнее вторая система. Третья система пригодна для раз деления глюкуроновой, маннуроновой и талактуроновой кислот. Оптимальные количества для хорошего разделения гексоз около 2 мкг, пентоз 1 мкг.

Помимо свободных Сахаров для хроматографичешого разделения с успе хом можно пользоваться и их производными, например фенилозазонами По следнее можно разделять в форме их боратных комплексов.

Определение фенилозазонов Сахаров по Ринку и Германну [10] Приготовление слоя. 30 г кремнезема с примесью гипса (кизельгур G) сме шивают с 60 мл 0,05 М раствора буры. После нанесения на пластинки сушат при 80 СС в течение 30 мин. Указанного количества достаточно для покрытия 5 пластинок размером 20X20 см.

Получение производных. К 10 мл мочи прибавляют 0,4 г хлоргидрата фе нилгндразина и 6 г уксуснокислого натрия. Смесь нагревают 30 мин на кипя щей водяной бане. После охлаждения проточной водой кристаллический осадок отфильтровывают, промывают водой и на холоду растворяют в смеси равных объемов диоксана и метанола.

Эталоны готовят таким же образом из 1%-ных растворов добавлением 0,2 г хлоргидрата фенилгидразина и 0,3 г ацетата натрия.

Хроматографирование. На хроматограмму наносят по 5—10 мкг производ ных. Применяют смесь растворителей хлороформ — диоксан — тетрагидрофу ран — 0,1 М раствор тетрабората натрия ( 4 0 : 2 0 : 2 0 : 1, 5 ), которую готовят, сильно перемешивая 40 мл хлороформа и 20 мл диоксана с 1,5 мл 0,1 М рас твора буры, затем прибавляют 20 мл тетрагидрофурана. Хроматографируют в камере, насыщенной парами растворителя. Процесс заканчивают, когда фронт Таблица Значения hRF фенилозазонов Сахаров [6] Окрашивание Окрашивание пятен после пятен после опрыскивания опрыскивания Фенилоэазон Фенилозазон hRp hRp диазотированной диаэотированной сахара сахара сульфаниловой сульфаниловой кислотой (Д 26) кислотой (Д 26) Глюкоза Коричневое Сорбоза 21 Коричневое 39 фруктоза — Ксилоза 91 — Красно-корич- Рибоза Арабиноза невое Мальтоза Галактоза Коричневое Лактоза —* 614 Специальная часть растворителя переместится на 10 см при температуре около 23 °С (20—25 мин).

Обнаружение. Фенилозазоны можно наблюдать в виде желтых, сравнитель но быстро бледнеющих пятен. Поэтому после высушивания при комнатной тем пературе их необходимо немедленно очертить. Другой способ, не зависящий от выцветания пятен, заключается в немедленном опрыскивании хроматограммы свежеприготовленным раствором Д 876. Озазоны дают при этом окрашивание от красно-коричневого до коричневого \[6] (табл. 100).

Определение Сахаров в биологических материалах по Эре/серу и Эндрю 1[5] Приготовление слоя. Пользуются микрокристаллической целлюлозой на пла стмассовой подложке (Merck, Macherey — Nagel).

Приготовление проб. Моча. 1 мл мочи обессоливают взбалтыванием в тече ние 15 мин с половинным объемом смешанного ионита (биодеминролит) в аце татной форме.

Сыворотка крови. Сыворотку освобождают от белка добавлением пикри новой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центри фугирования хроматографируют. Если в распоряжении имеется достаточное ко личество исследуемого материала, можно затем подвергнуть пробу обессолива нию так, как делают с мочой.

Кал. Образец кала (5 г) замораживают, чтобы предотвратить бактериаль ное разложение Сахаров. Последние затем извлекают, гомогенизируя с равным объемом ацетона. После центрифугирования жидкость обессоливают по методи ке, описанной выше для мочи.

Хроматографирование. Образцы, подготовленные, как указано выше, нано сят дважды каждый (по 10 мкл) на слой целлюлозы и подвергают двукратно му элюированию до расстояния 7,5 см от старта в системе этилацетат — пири дин — вода (6:3:2) одновременно с эталонами.

Обнаружение. После высушивания одну часть хроматограммы погружают в раствор реактива (10 мл раствора 2 г n-аминобензойной кислоты в 36 мл ле дяной уксусной кислоты, 40 мл дистиллированной воды и 1,6 мл 90%-ной фос форной кислоты разбавляют 15 мл ацетона). После 10-минутного нагревания при 80—90 °С наблюдают пятна альдоз.

Вторую часть хроматограммы погружают в нафторезорциновый реактив (20 мл 0,2%-ного раствора нафторезорцина в ацетоне смешивают с 2 мл 15% ной НС1). После нагревания в течение 3—5 мин при 80—90 °С обнаруживают кетозы.

Описанный метод удобен для быстрой диагностики галактозе мии (рис. 93).

Определение Сахаров в моче, крови и кале двумерной хроматографией в тонком слое описали Краффчик и сотр. [15]. Различные способы определения Сахаров в моче описаны в работах [14, 16—19], в моче и плазме крови в ра боте [20].

Ди- и полисахариды в исследуемом материале можно идентифицировать по сле превращения в моносахариды предварительным гидролизом (1 мл обессо ленного образца нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане с 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и после охлаждения избыток кислоты уда ляют с помощью ионита).

Эта модификация удобна для диагноза первичной и вторичной непереносимости дисахаридов, фруктоземии и для выявления недостаточности галактокиназы.

Специальная часть Рис. 93. Разделение Сахаров в плазме и моче больного галактоземией [5].

Сорбент: целлюлоза;

система: этилацетат — пиридин — вода ( 6 : 3 : 2 ) ;

обнаружение: я-ами нобензойная кислота.

а—плазма;

б — эталоны;

в —моча (0,5 мкл);

г — моча (5 мкл).

/ — глюкоза;

2 — галактоза;

3 — З-О-метилглюкоза;

4 — «силоза;

5 — лактоза.

Количественное определение фосфорных эфиров Сахаров в крови по Дэвидсону и Дрю \[4] Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel) суспен дируют в 85 мл дистиллированной воды. После нанесения на стеклянные пла стинки размером 20X20 см слой (0,25 мм) сушат в течение ночи при комнат ной температуре.

Приготовление проб. Эритроциты извлекают трихлоруксусной кислотой и после обессоливания на колонке со смолой дауэкс 50Х8-Н элюат нейтрализу ют разбавленным аммиаком и лиофилизуют до окончательного объема 4 мл.

Хроматографирование. 10 мкл нейтрализованного элюата наносят на пла стинку на расстоянии 3 см от нижнего края. Для количественного определения готовят две хроматограммы. Пластинки помещают в камеру и после насыще ния в течение 30—45 мин элюируют смесью метанол — NH4OH (уд масса 0,88)—вода ( 7 : 1 : 2 ) до расстояния 10 см от старта (приблизительно 35 мин) при комнатной температуре. После высушивания в токе теплого воздуха хрома тографируют во втором направлении (после насыщения камеры парами рас творителя в течение 30—45 мин) в смеси метанол — ледяная уксусная кислота— Вода / 8 0 : 1 5 : 5 ) ;

через 30 мин фрош досшгасг расстояния 10 см (рис. 94).

Обнаружение. Сначала необходимо удали и. растворители сушкой при 60 °С (60 мин). После хроматографирования в первом направлении удобно в ультра фиолетовом свете при 254 нм идентифицировать аденин и пиридиновые нуклео тиды. После элюирования во втором направлении хроматограмму опрыскивают 10—12 мл молибдатного реактива Ишервуда — Хейнза для обнаружения фос форных эфиров (Д77). Немедленно после опрыскивания неорганический фосфат проявляется в виде желтого пятна. Затем хроматограмму нагревают в течение 10 мин при 80 "С;

при этом глюкозо-1 -фосфат образует зеленовато-желтое окра шивание. После охлаждения до 50—60 °С хроматограмму в течение 2—3 мин выдерживают над парами кипящей водяной бани. При этом происходит гидро Специальная честь Olfl Рис. 94. Двумерная хроматография гексозо- и триозофосфатов в свежей вытяж ке нормальных эритроцитов человека [4].

t — неорганический фосфат;

2 — АТФ;

3 — АДФ;

4 — 2,3-глицернндифосфат;

5-рибозо-5'-фог фат;

6 — фрухтозо-1,6-дифосф»т;

7 — глнцернн-3-фосфат;

8 — глицерин-2-фосфат;

9 — 3-фос фат глицеринового альдегида;

10 — глюкозо-1-фосфат;

//— глхжозо-6-фосфат;

12 — пиро фосфат.

Пятна, обнаруживаемые только в некоторых образцах: а — фруктозо-1-фосфат;

б — фрукто зо-6-фосфат;

в — трифоофопнридинвуклеотид.

лиз даже наиболее стойких эфиров. После ультрафиолетового облучения в те чение Ю—15 мин пятна фосфорных эфиров окрашиваются в синий цвет на прак тически бесцветном фоне. Окрашивание достигает максимальной интенсивности через 2—3 ч.

Количественное определение. К хроматбграмме, подвергнутой действию реак тива, прикладывают вторую хроматограмму, очерчивают соответствующие места на вей, вырезают их, переносят сорбент в стеклянные микрохроматографические колонки н вещества вымывают 0,1 н. НС1. В 1,5—2 мл элюата находится более 90% фосфора, который можно определить обычными фотометрическими спосо бами.

Определение трифосфопиридиннуклеотида (ТФПН) необходимо проводить перед хроматографированием во втором направлении, так как на этой стадии происходят еро потери. Ббльшая часть дифосфопиридиннуклеотида (ДФПН) уда ляется при обессолквании на колонке ионита.

Пятна фруктозо-1,6-дифосфата и фруктозо-6-фосфата удобно обнаруживать специфическим нафторезорциновым реактивом. При этом образуется вишнево красная окраска.

Для дифференциального диагноза различных типов мукополи сахаридоэов наряду с электрофоретическими методами пользуют ся и тонкослойной хроматографией.

Специальная часть Хроматографический способ определения мукополисахаридов в моче по Амбелю, Маршалю и Фаллю [7] и по Амбелю и Шамолю [8] Приготовление слоя. Для анализа авторы пользовались целлюлозой фирмы Merck на пластинках 20X20 см.

Приготовление проб. К 2 мл мочи прибавляют 0,1 мл 5%-ного раствора хлорида цетювяридиния в 1 М цитратном буферном растворе (рН 6). Реак ционную смесь помещают на ночь в холодильник;

образующийся осадок центри фугируют, сливают жидкость, осадок промывают 5 мл абсолютного этанола, насыщенного NaCI, и снова центрифугируют. Очищенные кислые мукополисаха риды растворяют в 0,1 мл 0,05 н. NaOH. 10—20 мкл раствора наносят в виде полоски шириной 2 см на старт на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки.

Хроматографирование. Проводят ступенчатое хроматографирование последо вательно в 6 камерах всякий раз на расстояние 2 см в системах, перечисленных в табл. 101. Одновременно хроматографируют и эталонные вещества, растворен ные в 0,05 н. NaOH (табл. 102).

Обнаружение. Разделенные вещества обнаруживают, погружая хроматограм му на 3 мин в 1%-ный раствор толуидинового синего в смеси 70%-ный этанол— уксусная кислота (95:5). Гиалуроновая кислота окрашивается в течение 10 мин Таблица Системы растворителей для разделения кислых мукополисахаридов в моче [8] Камера Ацетат кальция, % Этанол, % 1 60 2, 5, 2 3 40 5, 4 30 5, 5 20 5, 6 10 5, Таблица Подвижность мукополисахаридов [7, 8] Вещество Подвижность Между 1-м и 2-м фронтом Дерматансульфат Между 2-м и 3-м фронтом Гиалуроновая кислота Между 3-м и 4-м фронтом Гепаринсульфат Хондроитин-4-сульфат Между 4-м и 5-м фронтом Хондроитин-6-сульфат Между 5-м и 6-м фронтом С фронтом Кератансульфат Специальная часть б|Н Ж tra/n Рис. 95. Разделение мукополисахаридов мочи [7, 8].

Сорбент: целлюлоза (Merck);

система: этанол — уксуснокислый кальций;

обнаружение: то луидиновый синий и альциановый синий.

1—6 — фронт систем растворителей (см. табл. 101 и 102).

а —тип I (синдром Харлера-Пфаундлера);

б —тип II (синдром Хантера);

в —тип III (синд ром Санфилиппо);

г —тип IV (синдром Моркно);

д — тип V (синдром Ульриха-Шайе) и тип VI (синдром Марото-Ланни).

в 1%-ном растворе альцианового синего в смеси 70%-ного этанола и уксусной кислоты (95:5). Избыток красителя вымывают (около 10 мин) 10%-ной уксус ной кислотой (рис. 95).

ЛИТЕРАТУРА 1. Bancher Е., Scherz И., Kaindl К, Microchim. Acta, 1964, 1043.

2. Bancher., Scherz H., Microchim. Acta, 1964, 1159.

3. Baron D. N.. Economldls I., J. Clin. Path., 16, 484 (1963).

4. Davidson I. W. P., Drew W. G., J. Chromatogr., 21, 319 (1966).

5. Ersser R. S., Andrew B. C, J. Med. Lab. Technol., 28, 335 (I 971 ) 6. Haas H. J., Seeliger A., J. Chromatogr., 13, 575 (1964).

7. Humbel R., Marchal С. М., Fall M., Helv. paediatr. Acta, 24, 648 (1969).

8. Humbel R.. Chamoles N, A., Clin. chim. Acta, 40, 290 (1972).

9. Pastuska Q., Z. Analyt. Chem., 179, 427 (1961).

10. Rink M., Herrmann S., J. Chromatogr., 12, 415 (1963).

11. Schwetger A., J. Chromatogr., 9, 374 (1962).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 12. Ghebregzabher M., J. Chromatogr., 95, M., Rufflni S., Ciuffini G., Lato (1974).

13. Hansen S. A» i. Chromatogr., 107, 224 (1975).

Специальная часть 14. Koslowski H., Jung G., Fiehrong G., Dtsch. Gesundheitswes, 32, 1567 (1977).

15. Kraffczyk F., Helger R., Bremer H. I., Clin. Chim. Acta, 42, 303 (1972).

16. Menzies I. S., Mount J. N.. Wheeler M. I., Ann. Clin. Biochem., 15, 65 (1978).

17. Mischer O., Kabus Ch., Schenk M., Helm Т., Z. med. Labor.-Diagn., 19, (1978).

18. Prinz W., Meldrum W., Wilkinson L., Clin. Chim. Acta, 82, 229 (1978).

19. Stuber A., CHn. Chim. Acta, 36, 309 (1972).

20. Szustkiewitz C, Demetrion J., Clin. Chim. Acta, 32, 355 (1971).

6.5. Органические кислоты Определение органических кислот вообще, за немногими иск лючениями, не относится к обычным клиническим биохимическим исследованиям. Однако целый ряд этих веществ представляет со бой важные промежуточные продукты метаболизма углеводов и липидов. Наряду с этим, например, высшие жирные кислоты вхо дят в состав липидов, и установление их природы может иметь значение при диагностике многих патологических состояний. Хотя в настоящее время качественное и количественное определение органических кислот является задачей газовой хроматографии, мы приводим в этом разделе несколько методик, использующих тонкослойную хроматографию, которые, по нашему мнению, могут оказаться полезным дополнением в лабораторных исследованиях.

6.5.1. Низшие жирные кислоты Разделение низших жирных кислот по Лайнзу \[11] Приготовление слоя. Слои готовят из силикагеля G на стеклянных пла стинках размером 20X20 см обычным способом.

Xроматографирование. После нанесения проб кислот, выделенных из биоло гического материала перегонкой с водяным паром, и эталонов пластинку хро матографируют в смеси метилацетат—2,5%-ный аммиак (95:5). Бели пользу ются свежеприготовленной смесью, для хорошего разделения следует проводить двукратное хроматографирование;

если же смесь будет находиться в камере 24 ч, достаточно однократное (табл. 103).

Обнаружение. Хроматограмчу сушат в течение 2—3 мин при 105 °С, затем опрыскивают спиртовым pact вором метилового красного (Д 145). При после дующем нагревании при этой же юмпературе кислоты образуют темно-красные пятна на оранжевом фоне. Чувспипельнопь реакции около 5 мкг.

Разделение низших жирных кислот и оксикислот в форме Ы,М-диметил-п-аминобсн.юлазпфинациловых зфиров по Зелигману и Дою [18] Приготовление слоя. Из силикагеля G (Merck) обычным способом готовят слои (0,25 мм).

Приготовление проб. Кислоты (приблизительно 1 мкг), выделенные из био логического материала перегонкой с водяным паром или экстракцией, нейтрали зуют 0,01 н. NaOH по фенолфталеину и раствор выпаривают досуха. К эквимо лекулярным количествам натриевых солей кислот и Ы,Ы-диметил-л-аминобензол азофенацилхлорида прибавляют 0,2—1 мл смеси диметилформамид — вода (15:

: 1) и нагревают в запаянной ампуле или с обратным холодильником на водя Специальная часть Таблица Значения hRr низших жирных кислот [11] Двукратное Хроматографированне хроматографнрование через 24 ч Кислота в свежеприготов ленной смеси двукратное одноразовое Муравьиная 5 Уксусная 6 Пропноновая 15 15 Масляная 24 22 Изомасляяая 27 Валериановая 30 Капроновая 52 34 Энантовая 55 39 Каприловая 43 Пеларгоновая 45 ной бане в течение 60 мин. По охлаждении смесь разбавляют дистиллированной водой и эфиры извлекают хлороформом или этилацетатом. Органический слой выпаривают досуха в вакууме и окрашенный в красный цвет остаток растворя ют в минимальном количестве ацетона.

Хроматографирование. Ацетоновый раствор эфиров кислот наносят на стар товую линию в форме точек или полосок. Для разделения эфиров низших жир ных кислот пользуются смесью бензол — этнлацетат (20:1), для эфиров окси кнслот — смесью бензол — этилацетат ( 3 : 1 ). При элюированин в течение 30— 60 мни происходит хорошее разделение (табл. 104, 105).

Обнаружение. Производные кислот окрашены, и нет необходимости в спе циальных реактивах. Чувствительность составляет около 0,05 мкг'кислоты.

Таблица Значения hRr «зофенацидовых эфиров низших жирных кислот [18] hRF hRp Кислота Кислота 21 Пеларгоновая Муравьиная 19 Уксусная Кротоновая 25 Пропионовая Изомасляная 32 Метилмасляная Масляная 40 Валериановая NvN-Диметил-я-амино бензолазофенацилхло Капроновая рид Каприловая Специальная часть Таблица Значения hRF азофенациловых эфиров оксикислот [18] hRF Кислота а-Оксипропионовая (молочная) - а-Оксиизомасляная а-Оксиизокапроновая р-Оксипропионовая (гидроакриловая) {5-Окси-и-масляная Р-Оксиизомасляная NyN-Диметил-п-аминобензолазофенацилхлорид 6.5.2. Высшие жирные кислоты Хотя и для высших жирных кислот в настоящее время наибо лее удобна газовая хроматография, тонкослойная хроматография позволяет предварительно фракционировать сложные смеси кис лот, выделенные из биологического материала.

Среди многочисленных способов наилучшими оказались деле ние метиловых эфиров высших жирных кислот в форме коорди национных комплексов с ионами серебра и распределительная хроматография с обращенными фазами. Для идентификации ме тиловых эфиров полиеновых кислот удобным оказалось разделе ние ацетоксимеркуриметоксипроиЗ'Водных, образующихся при реакции эфиров кислот с ацетатом ртути и метанолом [20].

Разделение высших жирных кислот по Бергельсону и сотр [4] Приготовление слоя Суспензию 6,5 г силикагеля КСК (можно пользоваться и другими сортами, величина частиц 150—200 меш), 0,4 г гипса и 17 мл 12% ного раствора азопюкиошю серебра наносят на пластинку размером 9X24 см.

После высушивания в течение 5 8 ч на воздухе (в темноте) активируют в те чение 30—60 мин при поаенешю повышаемой до 104—106 °С температуре При достижении ее выдерживают при э т и темпераiype еще 60 мин Хотя приготов ленный таким способом слой при дальнейшем хранении темнеет, это не влияет на его разделительную способность Общие высшие жирные кислоты в плазме крови Приготовление пробы. 1 часть сыворотки крови смешивают с 16 частями смеси хлороформ — метанол (1 1), кратковременно кипятят на водяной бане и по охлаждении доливают хлороформом до объема 25 мл После перемеши вания и фильтрования к части вытяжки (например, 5 мл) приливают 1/5 по объему 0,02%-ного водного раствора хлорида кальция и хорошо перемещнвают.

Через $—16 ч водно-метанолькый слой отделяют, слой хлороформа выпарива ют в вакууме досуха. Остаток после добавления 10 частей 2 н. раствора КОН Специальная часть Таблица Значения hRp метиловых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот при двумерной хроматографии [4] Направление Кислотэ первое второе Додекановая (лауриновая) 78 Тетрадекановая (миристиновая) 67 Гексадекановая (пальмитиновая) 56 Октадекановая (стеариновая) 46 Эйкозановая (арахиновая) 36 Докозановая (бегеновая) 28 цис-Гексадецен-9-овая (пальмитолеиновая) 71 tjuc-Гексадецен-11 -овая 71 цис-Октадецен-7-овая 60 ^ис-Октадецен-9-овая (олеиновая) tyuc-Октадецен-11 -овая (вакценовая) 60 грсшс-Октадецен-9-овая (элаидиновая) цыс-Эйкозен-11-овая цис-Докозен-5-овая цис- Докозен-11 -овая цис- Гексакозен-9-овая Октадека-9,12-диеновая (линолевая) 71 Октадека-9,12,15-триеновая (линоленовая) Эйкоза-5,8,11,14-тетраеновая (арахидоновая) в метаноле подвергают гидролизу нагреванием1 на кипящей водяной бане с Ъбратным холодильником в течение 2—3 ч. Затем охлаждают, разбавляют рав ным объемом дистиллированной воды и извлекают 2—3 раза 10 частями эфира (удаление неомыляемой части). После подкисления 2 н. НС1 жирные кислоты Извлекают 2—3 раза 10 частями петролейного эфира;

вытяжку промывают ди стиллированной водой и сушат безводным сульфатом натрия. Растворитель вы паривают и кислоты сразу же этерифицируют диазометаном. По окончании 'реакции растворитель отгоняют, избыток диазометана удаляют в токе азота при температуре около 50 °С. Остаток растворяют в таком количестве эфира, чтобы концентрация метиловых эфиров составляла 10—50 мкг в 10 мкл.

Подобным же образом можно получить метиловые эфиры кислот из экст рактов тканей или липидных фракций, выделенных, например, хроматографией на колонке, и т. д. Разумеется, для выделения липидов из биологического мате риала1 можно воспользоваться и другими способами, например способом, описы ваемым при определении спектра общей липндной фракции (разд. 6.6.1).

Одномерная хроматография. На подготовленную пластинку наносят 100— 200 мкг смеси метиловых эфиров и хроматографируют смесью диизопропиловый эфир-н-гексан (2:3) в камере, предварительно насыщенной в течение 40— 50 мин парами растворителей.

Специальная часть О' о4do, Ои о Од о8 о о ю 0" о О»

О/а О "1.

Старт 2.

Рис. 96. Двумерная хроматография метиловых эфиров высших жирных кислот [4].

Сорбент, силикатель КСК;

системы: первое направление — ацетонитрил — ацетон (1 • 1) (слой обработан 10%-ным раствором додекана), второе направление — диизопропиловый эфир — к-гексан (2.3) (слой обработан 20%-ным раствором AgNO3);

обнаружение- бромтимоловый синий.

/ — арахидоновая;

2 — линоленовая;

3 — линолевая;

4 — пальмитовакценовая;

5 — цнс-окта децен-7-овая, 6 — олеиновая, 7 — цыенвакценовая;

8 — элаидиновая;

9 — ц«с-эйкозен-11-овая;

10 — чис-докозен-5-овая, Л — чыс-докозен-11-овая;

12 — цие-гексакозен-9-овая;

13 — лауринй вая, 14 — миристиновая, 15 — пальмитиновая, 16 — стеариновая;

17 — арахиновая;

18— бе геновая Обнаружение По окончании разделения хроматограмму сушат при комнат ной температуре и после опрыскипяния 50%-ной серной кислотой нагревают 5— 10 мин инфракрасной лампой (500 В) Кислоты образуют коричневые пятна.

Удобно также пользоваться рошпипом Д Двумерная хроматография Сюклннную пластинку размером 20X20 см по крывают слоем, полученным HI суспензии 10 г силикагеля КСК, 0,6 г гипса й 25 мл дистиллированной воды После нысуишпания (30 мин при 110°С) слой обрабатывают погружением в 10%-ный раствор додекана в н-гексане. Обработку можно с успехом осуществить и восходящей хроматографией.

После нанесения смеси метиловых эфиров (100—200 мкг) в первом направ лении элюируют смесью ацетонитрил — ацетон (1 • I), насыщенной додеканом (6—6,4 мл додекана на 90 мл смеси при 18—20 °С), в течение 70—90 мин. По сле сушки в течение 30 мин при комнатной температуре и 30—40 мин при 90— 95 "С хроматограмму оставляют на ночь на воздухе.

Часть А (рис. 96) опрыскивают 20%-ным раствором AgNO3 и активируют 60 мин при медленно возрастающей температуре до 100°С и еще 60 мин при этой температуре. Так как обнаружение насыщенных жирных кислот Ка. лое, обработанном азотнокислым серебром, менее чувствительно, ту часть хрвжато 624 Специальная часть граммы где следует эти кислоты идентифицировать (часть Б) не обрабатыва ют этим реактивом Для элюировзния во втором направлении пользуются смесью диизопропиловый эфир — к гексан (2 3) Обнаружение После сушки (20 мин при 70—80 °С) часть Б опрыскивают раствором бромтимолового синего (40 мг в 100 мл 0 01 н NaOH) и нагрева ют 10—15 мин при той же температуре Насыщенные;

эфнры образуют желтые пятна на синем фрне,, чувствительность около 15—20 мкг Затем хроматограмму опрыскивают 40 « л указанного реактива в 100 мл 20% ного раствора аммиака Ненасыщенные эфнры образуют светлые или темные быстро бледнеющие пятна на сером фоне Чувствительность 40—50 мкг Для идентификации свободных кислот Ci2—С2о сравнительно надежным методом оказалась хроматография на гипсовом слое по Кауфману и Хо [8] Приготовление слоя На пластинку матового стекла (20X20 или 10X20 см) наносят слой гипса полученный из 25 г CaSO 0 5 Н2О в 35 мл дистиллиро ванной воды Слон сушат 15 мин при комнатной температуре и 60 мин при 80— 90 "С По охлаждения в эксикаторе пластинка готова к употреблению Приготовление проб и хроматографирование Смесь жирных кислот из био логического материала готовят обычными способами как описано выше но не проводят этерификацию После выпаривания петролейного эфира остаток рас творяют в бензоле или толуоле так чтобы в 10 мкл содержалось около 5 мкг кислот ТакЭ е количества наносят на слой предварительно обработанный погру жением в 10% ный раствор ун дека на в петролеином эф-ире Элюируют смесью ацетоннтрнл — уксусная кислота (1 1) насыщенной ундеканом Обнаружение После сушки хроматограммы (60 мин при 80—90 °С) прово дят открытие реактивом Д Разделение высших жирных кислот по Анкеру и Сонанини [1] Приготовление слоя Из суспензии кремнезема кизельгур G (Merck) и воды в отношении 1 2 обычным способом готовят слой Пластинку высушивают в течение 4-5 мин при температуре 110°С и сохраняют в эксикаторе Обрабаты вают восходящим способом раствором 10%-ЙОГО вазелинового масла в петро леином эфире сушат 5 мни при комнатной температуре и затем 1—2 мин пря температуре 100 X Хроматографирование После нанесения проб свободных жирных кислот хроматографнруют либо в ледяной или соответственно в 90% ной уксусной кис лоте либо в смеси ледяная уксусная кислота — вода (1 I) (табл 107) Обнаружение После сушки хроматограммы при 120 С С (5 мнн) ненасыщен ные кислоты обнаруживают парами иода Насыщенные кислоты детектируют опрыскивая хроматограмму сначала 0 05% ным водным раствором родамина В а затем 10 н КОН Пятна появляются немедленно или спустя несколько минут в виде светлых зон на розово-красном или синевато красном фоне Метиловые эфиры высших жирных кислот успешно удается разделить в зависимости от степени ненасыщенности на пластин ках си л у фол УФ|«4* обработанных 5%-ным водным раствором AgNO3, нагреванием пластинки в течение 15 мин при 110 °С и по следовательным хронатографированнем в смесях I к Гексан — бензол (65 35У II « Гексан — бензол (S0 50) III Бензол — метанол (99 I) Специальная часть Таблица Значения hRF высших жирных кислот по Анкеру и Сонанинн [1] 90% ная Уксусная Уксусная уксусная кислота—вода Кислота 10 см (1 1) 5 см 8 см Лигноцериновая 45 10 Бегеновая 16 62 25 Арахиновая+эруковая 70 38 Стеариновая+эикозеновая 78 48 Пальмитиновая+олеиновая Миристиновая+линолевая 60 90 72 Лауриновая+линоленовая 95 Каприновая — 98 90 — Каприловая 100 100 Рицинолеиновая Для более четкого разделения пятен рекомендуется ступенча тая хроматография (до 7г 3lt длины и на всю длину пластинки) В качестве реактива для обнаружения пользовались 5% ным ра створом фосфорномолибденовой кислоты в этаноле с добавлением 4% НС1 После нагревания до 100—110°С кислоты наблюдаются в виде синих пятен на бледно желтом фоне [12] 653 Оксикарбоновые, дикарбоновые и трикарбоновые кислоты Выделение кислот из мочи Мочу оставляют стоять несколько часов при 4 °С чтобы осела большая часть мочевой кислоты По еле отфильтровывания 50 мл заливают в колонку амберлита IR 4B (в ацетатной форме) размер 2 X 18 см скорость протека ния 1 мл/мин Колонку промывают 500 мл дистиллированной во ды и кислоты вымывают 50 мл 1% ной муравьиной кислоты и за тем 500 мл 11% ной муравьиной кислоты Элюаты концентриру ют в вакууме при 40 °С и досушивают в эксикаторе Остаток рас створяют в 10 мл дистиллированной воды и обесцвечивают про пуская через пермутатовую колонку ( 1 X 1 8 см) которую затем промывают 250 мл дистиллированной воды Раствор выпаривают досуха а остаток растворяют в 0 5 мл воды и центрифугируют Прозрачный раствор наносят на пластинку Разделение по Пассера Педротти и Феррари [13] Приготовление слоя и хроматография Слои готовят обычным способом из енлнкагеля G и после нанесения 5—10 мкг проб хроматографируют в системе «тдропанол — 2&% аый аммиак (70 30) (I см табл 108) или этанол — хлоро Специальная часть Таблица Значения hRp некоторых биологически важных кислот [13] Система Система Кислота Кислота I II I и а-Кетоглугаровая Адипиновая 27 р-Кетомасляная Щавелевая Пировиноградная Молочная 42 Дегидроаскорбиновая Яблочная 7 Аскорбиновая Янтарная Левулиновая Гликолевая 30 Фумаровая форм — 28%-ный аммиак —вода ( 7 0 : 4 0 : 2 0 : 2 ) (II, до расстояния 13 см от старта), Обнаружение.


После сушки под инфракрасной лампой хроматограмму оп рыскивают 0,1%-ным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола в 95%-ном этаноле (Д 31). После кратковременного нагревания все вещества кислого характера проявляются в виде розовых пятен на голубом фоне. Если продолжить нагре вание, пятна кетокислот бледнеют, тогда как карбоновые кислоты сохраняют розовую окраску. При действии на хроматограмму паров аммиака в течение нескольких секунд можно улучшить контрастность розовых пятен.

Для разделения дикарбоновых кислот в литературе предложено несколько способов |[10, 14], » которых используются слои силикагеля, кремнезема или порошкообразной целлюлозы. Разделение моно-, ди- и трикарбоновых кислот описал Ганзен [23].

Разделение дикарбоновых кислот и оксикислот по Банхеру и Шерцу \[2] Приготовление слоя. 15 г порошкообразной целлюлозы MN 300 (Macherey— Nagel) без связующего вносят в 70 мл дистиллированной воды и гомогенизиру ют в течение 1 мин. После нанесения на стеклянную пластинку сушат в течение ночи при комнатной температуре.

Таблица Значения hRF некоторых оксикарбоновых, дикарбоновых и трикарбоновых кислот [2] Система Система Кислота Кислота и ш и I I Ш 44 35 Винная Глиоксиловая 48 42 58 28 Лимонная Пировиноградная 63 90 Поло са 75 Молочная 33 Щавелевая 68 Гликолевая Малоновая 64 Яблочная Янтарная 95 Специальная часть Хроматографирование. Около 10 мкг пробы наносят на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки и разделяют в одной из следующих систем:

I. Этилацетат—-муравьиная кислота — вода ( 3 : 1 : 1 ).

II. «-Бутанол — муравьиная кислота — вода (30 : 5 : 10).

III. н-Пропанол — концентрированный раствор аммиака ( 6 : 4 ).

За 60 мин перемещение составляет около 14 см.

Обнаружение. После испарения растворителя хроматограмму опрыскивают реактивом Д 31. Кислота образует ярко-красные пятна на голубом фоне.

Кетокислоты 6.5.4.

Кетокислоты можно разделить после превращения в родани новые (4-оксо-2-тионтиазолидиновые) производные на слоях аце тилированной целлюлозы или в форме 2,4-динитрофенилгидразо нов на силикагеле.

Разделение роданиновых производных кетокислот по Ринку и Германну \[16] Приготовление производных. 2 мл 0,5%-ного раствора кетокислот в 96%-ном этаноле смешивают с 4 мл охлажденного реактива (250 мг роданина, 5 капель 25%-ного аммиака и 50 мг хлорида аммония растворяют при нагревании в Таблица Значения liRr роданиновых производных кетокислот [16] Система Кислота I и ш IV 22 32 а-Кетопропионовая 22 32 Щавелевоуксусная 34 44 а-Кетомасляная 47 53 а-Кетоизовалериановая 51 57 а-Кето-к-валериановая 26 41 Y-Кето-я-валериановая 4 9 а-Кетоглутаровая 65 68 а-Кетокапроновая — 58 a-Kero-D-глюконовая, калиеиая соль 70 67 а-Кетоизокапроновая 79 77 а-Кетоэнантовая 83 85 а-Кетокаприловая 54 47 Фенилглиоксиловая 62 50 а-Кетопеларгоновая 47 66 Фенгошировиноградная 42 49 4-Оксифенилпирбвиноградная — 60 Родаяин — 528 Специальная часть 100 мл этанола) и смесь нагревают с обратным холодильником на водяной ба не при 65 — 75 "С в течение 10 мин.

Приготовление слоя. 10 г целлюлозы MN 300 Ac (Macherey — Nagel) сме шивают с 50 мл метанола и 5 мЛ дистиллированной воды и гомогенизирую!

1—2 мин. Суспензию наносят на пластинки размером 20X20 см и сушат 5— 10 мин при 60 "С.

Хроматографирование. После нанесения 0,5—2 мкг производных на пластин ку хроматографируют до высоты 10 см (приблизительно 100—120 мин в зави симости от системы растворителей) в одной из следующих смесей:

I. и-проланол—к-бутанол— раствор углекислого аммония (2 части 10%-ного раствора углекислого аммония и 1 часть 5 н. раствора аммиака) (40:20:30).

II. м-Пропанол — «-бутанол—раствор углекислого аммония (30:30:30).

III. к-Пропанол — я-бутанол — раствор углекислого аммония (35:25:30).

IV. «-Пропанол — раствор углекислого аммония (2 :1).

Используют камеры без насыщения.

Производные наблюдают в УФ-свете при 365 нм в виде темных пятен.

Разделение кетокислот в форме 2,4-динитрофенилгидразонов по Ронкайнену [17] Получение производных кетокислот из крови. 1 часть крови из вены смеши вают с 4 частями 0,66 н. серной кислоты и к смеси при постоянном перемеши вании прибавляют 1 часть 10%-ного раствора вольфрамовокислого натрия. Ос тавляют стоять 10 мин, затем фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным и иметь рН 4—4,5.

В пробирке с притертой пробкой смешивают 20 частей фильтрата с 1 ча стью 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 н. НС1. После пере мешивания и стояния в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин прибавляют 2 капли формальдегида. Экстрагируют повторно эфиром, пока эфирный слой не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Объединенные вы тяжки выпаривают в вакууме досуха при температуре ниже 35 "С. Остаток хорошо перемешивают с 1 мл раствора двууглекислого натрия, добавляют 1 мл хлороформа, перемешивают и центрифугируют. Нейтральные гидразоны и воз можный избыточный динитрофенилгидразин находятся в органическом слое, а в верхнем водном слое находятся гидразоны кетокислот.

Рис. 97. Разделение кетокислот в форме 2,4-динитрофенилгидразонов [17].

Сорбент: сялвкагель G;

система: петролейный эфир (т. кип. 60—«0 "С) — этялфорынат (13 : 7);

в УФ-свете.

обнаружение:

R — 2,4-диттррфешиицдраат;

;

_ а-кето-ft метилвалернановая;

2 — снсетоиэекалроновая;

S — а-кетоазовалержановая;

* — а-кетомасля / 2 34 б 7в 5 ная;

5 — пнроеиноградная;

S — левулнновая;

7 — а-кетоглутаровая;

в — щавелевоуксусная.

Специальная часть Хроматографирование. После нанесения определенного количества раствора гидразонов на слой силикагеля, полученный из суспензии 30 г силикагеля G в 60 мл дистиллированной воды с добавлением 5 мл пропионовой кислоты, хроматографируют в смеси петролейный эфир (т. кип. 60—80 °С) — этилформиат (13:7). На рис. 97 можно видеть пример разделения некоторых кетокислот.

Хроматографическое обнаружение ацетоуксусной кислоты и ацетона в моче i[15] Приготовление слоя. 10 г порошкообразной целлюлозы MN 300 Ac (Mache геу — Nagel) гомогенизируют в течение 1 мин в смеси метанол — вода (50:5).

Приведенного количества достаточно для нанесения слоя на 5 пластинок раз мером 20X20 см. Слои сушат сначала при комнатной температуре, затем в те чение 5—10 мин при 60 °С.

Получение производных. К 5 мл прозрачной (в случае необходимости про фильтрованной) мочи приливают по каплям 0,4%-ный раствор 2,4-динитрофенил гидразина в 2 н. НС1 до прекращения образования мути или осадка. После стояния в прохладном месте в течение 30 мин экстрагируют 1—2 мл этилацета та и требуемое количество органической фазы (необходима предварительная проба!) наносят на хроматограмму. Одновременно с пробой хроматографируют эталон.

Хроматографирование. Хроматограмму элюируют смесью I метанол — во да — 25%-ный аммиак ( 9 0 : 1 0 : 3 ) или II к-пропанол — раствор углекислого ам мония (2 части 10%-ного раствора углекислого аммония на 1 часть 5 н. аммиа ка) в отношении 2,5: 1. По окончании разделения (30—40 мин, перемещение на 10 см) сушат на воздухе.

Обнаружение. 2,4-Динитрофенилгидразоны ацетоуксусной кислоты и ацето на наблюдают в виде желтых пятен на свету и темных пятен в УФ-свете.

Значения hRF: ацетоуксусная кислота 82 (I) и 91 (II), ацетон 48 (I) и 52 (И).

Разделение а'кетокислот в форме 2,4-динитрофенилгидразонов по Байзеру [3] Приготовление слоя. Слои (20X20 см) приготовляют обычным способом из микрокристаллической целлюлозы MN 300 (Macherey—Nagel).

Получение производных описывается в предыдущей методике.

Хроматографирование. После нанесения проб на пластинку хроматографи руют в смеси н-бутанол — этанол—0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ). Разделение длится около 4 ч.

Двумерное электрофоретически-хроматографическое разделение. В первом направлении проводят электрофорез в буферном растворе пиридин — ледяная ук сусная кислота —вода (10: 1 :80) с рН 6,2 при 45—50 В/см в течение прибли зительно 2 ч. Вместо этого буфера можно пользоваться также 0,05 М раствором №гСОз, но четкость разделения несколько ухудшается. После высушивания в токе воздуха разделение во втором направлении ведут в системе к-бутанол— этанол — 0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ) (рис. 98).

Обнаружение. Гидразоны ввиду их собственной желтой окраски легко на блюдаются без применения реактивов (чувствительность около 1 мкг). Окраску пятен можно сделать более яркой, опрыскивая насыщенным спиртовым раство ром КОН.

Количественное определение. Участки сорбента с пятнами после разделения вырезают и элюируют 0,2 М раствором №НСОз. После центрифугирования прозрачный фильтрат фотометрируют при 370—380 нм. Для построения кали бровочной кривой подобным же образом хроматографируют заведомые образ цы гидразонов кислот.

630 Специальная часть Рис. 98. Двумерное разделение 2,4-динитрофенилгидразонов а-кетокислот ком бинацией электрофореза и тонкослойной хроматографии [3].

Сорбент: целлюлоза MN 300;

системы: первое направление — электрофорез, пиридин — ледя ная уксусная кислота — вода (10: 1 : 89), рН 6,2, 45 В/см, второе направление — хроматогра фия, к-бутаиол — этанол — 0,5 н. аммиак ( 7 : 1 : 2 ).


/ — 2,4-Динитрофенилгадразин;

2а — ttuc-ДНФГ пировиноградной кислоты;

26 — гракс-ДНФГ пировиноградноя кислоты;

За — цис-ДНФГ глиоксиловой кислоты;

36 — гракс-ДНФГ глиокси ловой кислоты;

4а — цис-ДНФГ щавелевоуксусной кислоты;

46 — граке-ДНФГ щавелевоук сусной кислоты;

3 — ДНФГ а-кетоглутаровой кислоты.

Фенолкарбоновые кислоты 6.5.5.

Адреналин и норадреналин относятся к соединениям, оказы вающим наибольший вазопрессорный эффект. В последнее время был хорошо изучен биосинтез этих веществ, предшественником которых является тирозин. Были обнаружены два пути их мета болизма. Первый проходит через катехоламины, второй связан с метилированием норадреналина. Из всего, что известно в настоя щее время, следует, что для изучения причин гипертонической болезни весьма желательно уметь контролировать уровень аминов в крови и их выделение с мочой. Одновременно следует характе ризовать конечные продукты метаболизма. Нарушения метабо лизма могут корениться в промежуточных метаболических про цессах или в повышенном продуцировании аминов (например, в новообразованиях или при феохромоцитоме) и соответственно вы* Специальная часть ражаться в их накоплении (серотонин в эритроцитах). Определение этих веществ в моче может служить не только для диагностики раковых заболеваний или феохромоцитомы, но и для оценки функционального состояния симпатико-адренальнои системы.

У пациентов с раковыми заболеваниями с мочой выделяются значительные количества 5-окситриптамина (серотонина) и его метаболитов, например 5-оксииндолилуксусной и 4-окси-З-метокси миндальной кислот. При феохромоцитоме в моче наблюдаются из быточные количества 4-окси-З-метоксиминдальной кислоты. В мо че пациентов с нейробластомой, ганглионейроном и меланомой отмечается интенсивное выделение гомованилиновой кислоты.

Открытие фенолкарбоновых кислот по Эрссеру и сотр. [7] Приготовление слоя Пользуются коммерческими готовыми слоями микро кристаллической целлюлозы на алюминиевой или пластмассовой подложке (Merck или Macherey — Nagel).

Приготовление проб. 1—5 мл свежей мочи с содержанием 1 мг креатинина (количество анализируемой пробы согласовывают с концентрацией креатинина) подкисляют концентрированной соляной кислотой, насыщенной сульфатом ам *~-^Q 2.

Рис 99 Двумерная хроматография фенолкарбоновых кислот в моче больного фенилкетонурией [7].

Сорбент целлюлоза MN 400, системы первое направление — пропанол-2 — н-бутанол — трет бутанол — NH4OH (уд масса 0,88) — вода ( 4 2 2 1 2), второе направление — бензол — уксусная кислота — вода (70 29 1), обнаружение реактив Паули а — фенилмолотаая кислота, б — о-оксифенилуксусная кислота, в — я-оксифенилуксусная кислота;

г — гомованилиновая кислота, д — N-ацетилтирозин;

е — 4-окси-З-метоюсиминдаль ная кислота;

ж — л-оксифенилмолочная кислота, з — га-оксиминдальная кислота, и — Б-о»са индолилуксусная кислота.

532 Специальная часть мония, и быстро экстрагируют четырехкратным объемом эфира (2X20 с). После центрифугирования эфирный слой выпаривают досуха при 40—50 "С. Остаток растворяют в 0,2 мл 50%-ного водного пропанола-2.

Хроматографирование. 10 мкл раствора наносят на пластинку и элюируют смесью бензол — уксусная кислота — вода (70:29 :1) до расстояния 7,5 см от старта (25 мин). Если проводят двумерное разделение, в первом направлении хроматографируют в смеси пропанол-2 — к-бутанол— грет-бутанол — аммиак (уд. масса 0,88) — вода ( 4 : 2 : 2 : 1 : 2 ) и во втором — смесью бензол — уксусная кислота — вода (70: 29 :1) (рис. 99).

Обнаружение. После высушивания хроматограммы ее опрыскивают реакти вом Паули (1 объем 5%-ного раствора NaNOj и 1 объем 9%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 1 н. НС1);

через 5 мин прибавляют 2 объема на сыщенного раствора ЫазСОз и 1%-ным водным раствором прочного красного GG. Наиболее сильного контраста между пятнами я фоном достигают, предва рительно опрыскивая слой насыщенным раствором Na2CO3.

Система пропанол-2 — к-бутанол — трег-бутанол — аммиак (уд. масса 0,8) — вода ( 4 : 2 : 2 : 1 : 2 ) удобна для разделения гиппуровой и фенилмолочной кислот;

детектирование производят 5%-ным раствором п-диметиламинобензаль дегида в смеси уксусной кислоты и ацетона (1:4).

Гомогентизиновая и 4-окси-З-метоксиминдальная кислоты удовлетворительно делятся в системе «-бутанол — этанол — вода (20 : 1 : 2) на силикагеле G.

Выделение метилмалоновой кислоты можно контролировать хроматографи чески на силикагеле G. После нанесения двукратного количества эфирной вы тяжки (приготовление см. в предыдущей методике) разделение ведут в смеси амилацетат — уксусная кислота — вода (30:10:3) до расстояния 7,5 см от старта. После высушивания хроматограмму погружают в 0,5%-ный раствор диазосоли прочного синего В в этаноле с добавлением 4% уксусной кислоты и 10 мин нагревают в токе теплого воздуха.

Круговая хроматография фенолкарбоновых кислот и фенолоспиртов по Кэзеру [9] Приготовление слоя. Слой готовят обычным образом из микрокристалличе ской целлюлозы.

Приготовление пробы. К 5 мл мечи или надосадочной жидкости А после центрифугирования прибавляют НС1 до рН 1, гидролизуют нагреванием в тече ние 30 мин при 100 С, затем экстрагируют трижды по 5 мл этнлацетата. Со единенные вытяжки упаривают досуха и остаток растворяют в 0,5 мл мета нола.

Таблица Значения hRF фенолкарбоновых кислот и фенолоспиртов [9] UD Окрашивание Вещество с диааотированным ПКр л-нитроанилином Ванилиновая кислота Фиолетовое 5-Оксииндолилуксусная кислота Красное 4-Окси-З-метоксиминдальная кислота Фиолетовое Синее Гомованилиновая кислота л-Оксифенилуксусная кислота Розовое о-Оксифенилуксусная кислота Розово-фиолетовое З-Метокси-4-оксифенилэтанол Синее 533" Специальная часть Таблица Значения hRF фенольных аминов [9] Окрашивание с hRp диазотированным Вещество л-нитроанилином Фиолетовое Норметанефрин »

Вещество X 66 Красное Октопамин 70 Синее З-Метокситир амин Фиолетовое Метанефрин 86 Красное л-Симпатол Хроматографирование. 5 мкл раствора наносят на пластинку и хроматогра фируют в течение ~ 4 ч системе пропанол-2 — аммиак — вода (8 1 1) в Обнаружение. После сушки хроматограммы при комнатной температуре проводят обнаружение раствором диазотированного /г-нитроанилина (табл 111, 112).

Скринингу З-метокси-4-оксифенилэтанола в моче посвящена работа Эбинге ра и сотр. [21]. Хроматографическим обнаружением ванилиновой кислоты в мо че занимались Ярсумбек и сотр. [25] и Кнуппен и сотр. [26], гомогентизиновой кислоты — Амбель и сотр. [24], гиппуровой — Гарцке и сотр [221, гиппуровой и метилгиппуровой — Ван Керховен и сотр. [30]. Кислоты цикла Кребса иссле довали Крайкер и Берчи [28].

Круговая хроматография фенольных аминов по Кэзеру [9] Приготовление слоя. Слой готовят из микрокристаллической целлюлозы обычным способом.

Приготовление пробы. 5 мл мочи или надосадочной жидкости А после цент рифугирования доводят до рН 1 и гидролизуют в течение 30 мин при темпера туре 100 °С. Затем 5 н. раствором К2СО3 устанавливают рН 5, прибавляют катионит дауэкс 502 (100—200 меш, в Н+-форме в количестве 5 г) и хоро шо взбалтывают. После центрифугирования сливают жидкость, осадок промыва ют сначала трижды по 0,5 мл 0,1 М раствором ацетата натрия и далее четыреж ды 1 н. раствором аммиака в 65%-ном этаноле. Промывные воды соединяют и выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл метанола.

Хроматографирование. 40 мкл раствора хроматографируют в смеси пропа нол-2— аммиак — вода ( 8 : 1 : 1 ).

Обнаружение. Пятна обнаруживают способом, описанным для фенолкарбо новых кислот.

Количественное определение гомованилиновой, ванилиновой и 4-окси-З-метоксиминдальной кислот в моче по Тауце и сотр. [19] Приготовление слоя. 25 г смеси силикагеля G и кремнезема G (Merck) в от ношении 1:1 и 2,5 г красителя ZS супер суспендируют в 90 мл дистиллирован ной воды. Слои толщиной 0,25 мм готовят на стеклянных пластинках размером 20X20 см и сушат в течение 60 мин при 105 °С.

Приготовление проб. 10—20 мл мочи подкисляют, насыщают твердым хло ридом натрия и экстрагируют трижды по 50 мл эфира. Соединенные вытяжки выпаривают и остаток растворяют в 1 мл этанола.

'$34 Специальная часть Хроматографирование. 100 мкл раствора наносят на пластинку и сначала хроматографируют на расстояние 8 см смесью прояанол-2 — этилацетат — NH4OH — вода (45: 30 : 17:8). После сушки дважды элюируют смесью бензол— уксусная кислота (9:1) на расстояние 15 см в насыщенной парами раствори теля камере.

Обнаружение. Пятна веществ наблюдают в ультрафиолетовом свете при 254 нм.

Количественное определение. Пятна эдюируют 2,5 мл смеси 2%-ного рас твора ШгСОз и метанола (1:3) в центрифужных пробирках. После центрифу гирования при 5°С 2 мл надосадочной жидкости смешивают с 0,2 мл свеже приготовленного реактива Розе (раствор 1:0,25-ный раствор л-аминофенил-фе нил-р-диэтиламиноэтилсульфона в 1%-ной НС1;

раствор II: 0,5%-ный раствор NaNC^;

перед употреблением хорошо перемешивают оба раствора в отношении 3:1 при 0 5 С).

Окрашенные растворы, образующиеся из оксиметоксиминдальной и ванили новой кислот, фотометрируют при 490 нм, а при реакции с гомованилиновой кислотой — при 370 нм (через 30 и 60 мин). Аналогично проводят холостой опыт. Количество кислоты определяют по калибровочной кривой.

Открытие катехоламинов и их метаболитов по Де Поттеру и сотр. '[6] (см. также [27, 30]) Приготовление слоя. 7,5 г целлюлозы MN 300 (Macherey — Nagel) смеши вают с 45 мл метанола и через 5 мин наносят слой толщиной 0,3 мм. Сушат 10 мин при 105 °С и сохраняют в эксикаторе над безводным хлоридом кальция.

Хроматографирование. После нанесения проб на пластинку элюируют к-бу танолом, насыщенным 3 н. НС1, на расстояние 15 см (около 3 ч) при комнат ной температуре.

Обнаружение. Высушенную хроматограмму опрыскивают раствором крас ной кровяной соли [0,44 г Кз [Fe(GN)e] в 100 мл фосфатного буферного раство ра] (рН 7,8) и раствором этилендиамина, разбавленного дистиллированной во дой в отношении 1:1. После высушивания при 50 — 60 "С пятна наблюдают при 360 нм.

Другой способ обнаружения основан на опрыскивании хроматограммы рас твором диазотированного я-нитроанилина (раствор I: 0,1 г я-нитроанилина рас творяют в 2 мл концентрированной НС1 и доливают дистиллированной водой до 100 мл;

раствор II: 2 г NaNCb в 100 мл дистиллированной воды;

раствор III:

10%-ный раствор КгСОз", перед употреблением смешивают растворы в отноше нии 1:1:2). После этой реакции можно провести и количественное определение, вырезая участки сорбента с пятнами, элюируя их 0,1 н. НС1, с последующим фотометрированием.

Значения hRp некоторых веществ: адреналин 38, норадреналин 31, норме танефрин 48, метанефрин 58, 3,4-диоксимивдальная кислота 80, 4-окси-З-мето ксиминдальная кислота 89.

ЛИТЕРАТУРА 1. D., P h a r m. A c t a Helv., 3 7, 3 6 0 ( 1 9 6 2 ).

Anker L, Sonanini H., M i c r o c h i m. Acta, 1964, 1159.

2. Bancher E., Scherz H., J. C h r o m a t o g r., 57, 281 ( 1 9 7 1 ).

3. Bayzer Chromatogr., 4. J.

Bergelson L. D., Djatlovitskaja E. V., Voronkova V. V., 15, 191 ( 1 9 6 4 ).

D., Geenen H., J. C h r o m a t o g r., 7, 5 6 ( 1 9 6 2 ).

5. Braun A. F., E x p e r i e n t i a, 2 1, 4 8 6. De Potter W. P., Vokten R. F., De Schaepdryver (1965).

I., CHn. c h i m. A c t a, 3 0, 2 4 3 ( 1 9 7 0 ).

7. Ersser R. S., Oakley S. E., Seakins 8. Kaufmann N. P., Khoe Т. Н., Fette, Seifen, Anstrichmittel., 64, 81 (1962).

9. fii.w H., J. Chromatogr., 82, 127 (1973).

Специальная часть 10. Кпарре Е., Peteri D., Z. Analyt. Chem., 188, 184 (1962).

11. Lynes A., J. Chromatogr., IS, 106 (1964).

12 Michdlec C, Reinisova I., Kurs tenkovrstve chromatografie. Sbornik pfedna §ek., Praha, 1973, 84.

13. Passera C, Pedrottt A., Ferrari G. G., J. Chromatogr., 14, 289 (1964).

14. Petrowitz H. L, Pastuska G., J. Chromatogr., 7, 128 (1962).

15. Rink M., Herrmann S., J. Chromatogr., 12, 249 (1963).

16. Rink M., Herrmann S., J. Chromatogr., 14, 523 (1964).

17. Ronkainen P., J. Chromatogr., 11, 228 (1963).

18. Seligman I. M., Doy F. A., Analyt. Biochem., 46, 62 (1972).

19. Tautz N. A., Voltmer G., Schmid E., Klin. Wschr., 43, 233 (1965).

20. Wagner H.. Pohl P., Biochem. Z., 340, 337 (1964).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 21. R., J. C l i n. C h e m. C l i n. Biol., 1 3, 2 1 3 ( 1 9 7 5 ).

Ebinger G., Verheyden 22. H. J., J. C h r o m a t o g r. B i o m e d. A p p., 162, 234 (1979).

Gartzke J., Weigmann S. A., J. C h r o m a t o g r., 124, 123 ( 1 9 7 6 ).

23. Hansen 24. M., J. C l i n. C h e m. C l i n. B i o c h e m., 1 1, Humbel R., Marchal C, Neu-Fischer 446 (1973).

25. farsumbeck В., Wendelin Т., Hubl W., Z. med. Labortechn., 14, 259 (1973).

26. Knuppen R., Helger R., Kraffczyk F., Lang H., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15, 515 (1977).

27. Kohler P., Baufeld H., Aerztl. Lab., 10, 224 (1974).

28. Kraiker H. P., Burch R. E., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 11, 393 (1973).

29. Nakamura H., Pisano J. J., J. Chromatogr., 154, 51 (1978).

30. Van Kerckhoven G, Blaton V, Vandamme D., Peelers H., J. Chromatogr., 100, 215 (1974).

6.6. Липиды Липиды представляют собой группу биологически важных ве ществ, химический состав которой крайне.разнообразен. В связи с этим анализ липидов, особенно липидов, выделенных из биоло гического материала, является сложной задачей. В клинической биохимии до сих пор применяются традиционные методы количе ственного определения суммарного холестерина, фосфолипидов и т. д. Эти определения имеют безусловную ценность для диагно стики, однако во многих случаях они уже недостаточны. Ясно, что детальный анализ липидов позволяет получить много новой цен ной информации. Применение современных аналитических мето дов, особенно хроматографических, полностью это подтверждает.

В настоящее время среди аналитических методов, применяе мых в исследовании липидов, тонкослойная хроматография зани мает одно из первых мест. Многие из рабочих методик, разрабо танных в последнее время в этой области, могут быть использо ваны для определения липидов в биологическом материале, преж де всего в крови [11, 14, 16, 20, 26, 27, 29, 32, 35—37, 41] и других биологических жидкостях и тканях [11, 15, 16, 28, 30, 31, 33, 34, 37—40, 42, 43].

S36 Специальная часть Разделение липндов по классам 6.6.1.

Для такого разделения можно с успехом применять методику Мангольда $ Малинса [7], предложивших системы, обеспечиваю щие полное разделение липидов крови.

Приготовление хроматографических пластинок. Суспензию силикагеля G в воде наносят на стеклянные пластинки размером 20X20 или 10X20 см. Слои активируют нагреванием в течение 30 мин при 110 "С.

Экстракция суммы липидов сыворотки крови. 1 мл сыворотки крови смеши вают с 16 мл смеси хлороформ — метанол ( 1 : 1 ) и некоторое время нагревают на кипящей водяной бане. По охлаждении до комнатной температуры объем смеси доводят хлороформом до 25 мл и после тщательного перемешивания фильтруют. 5 мл экстракта смешивают с 1 мл 0,02%-ного раствора хлорида кальция и интенсивно перемешивают. После 8—16 ч расслаивания смеси водно метанольный слой удаляют,, а нижний хлороформный слой, содержащий липиды, анализируют с помощью тонкослойной хроматографии.

Хроматографирование. После нанесения образца хроматограмму помещают в смесь петролейный эфир (т. кип. 30—60 °С) — диэтиловый эфир — уксусная кислота. Соотношение растворителей выбирают в зависимости от цели разде ления. Для обычного анализа суммарных липидов используют систему петро лейный эфир — диэтиловый эфир — уксусная кислота ( 9 0 : 1 0 : 1 ), а для разде ления фосфолипидов и моноглицеридов, не разделяющихся в этой системе, при меняют более полярную систему с соотношением тех же компонентов ( 3 0 : 7 0 :

:1) Обнаружение. Из большого числа реагентов наиболее употребимы следую щие:

1. Опрыскивание 50%-ной серной кислотой с последующим нагреванием в течение 10 мин при 160—180 °С. При этом возникают коричнево-черные пятна на почти бесцветном фоне. Порог чувствительности около 2 мгк вещества.

2 Опрыскивание насыщенным раствором бихромата калия в 80%-ной сер ной кислоте (Д 66) с последующим нагреванием при 160—180 "С. Ненасыщенные липиды обнаруживаются в виде коричневых пятен сразу после опрыскивания, насыщенные — после нагревания.

3 Опрыскивание 0,2%-ным раствором дихлорфлуоресцеина в 96%-ном эта ноле (Д 33). В УФ-свете липиды видны в виде желтых флуоресцирующих пятен.

4. Опрыскивание 10%-ной фосфорномолибденовой кислотой в 96%-ном эта ноле (Д 115). После нагревания при 80—90 "С зоны липидов окрашиваются в темно-синий цвет на желто-зеленом фоне. При применении этого реагента не обходимо контролировать процесс проявления пятен при нагревании, так как при небольшом перегреве фон темнеет.

5 Опрыскивание раствором бромтимолового синего (Д 17). Липиды обна руживаются в виде желтых пятен на синем фоне, который быстро становится бледно-желтым. Пятна можно сделать лучше различимыми, обработав хромато грамму парами аммиака (восстановление синей окраски). Порог чувствительно сти 1 мкг.

6 Ненасыщенные липиды обнаруживаются в виде коричневых пятен при обработке хроматограммы парами иода (Д 104).

Из других систем растворителей можно рекомендовать смесь петролейный эфир (т. кип. 50—70 °С) — метилэтилкетон — уксус ная кислота (95:4:1 или 84:15:1), применение которой позво ляет получить практически такое Же разделение, как и в приве денных выше системах [25]. (рис. 100).

Фогель и сотр. [21] предложили использовать одну хромато грамму для разделения образца в нескольких системах. Слой си Б CD CD CD C D CD CD О CD © t т.

VJ 6 ^ 2 Рис. 100 Разделение липидных фракций [25] Сорбент- снликагель G;

системы А - петролейный эфир (т кип 50-70 °С) - диизобутилке ТОн-Хсусная шслота (87-13 0,7);

Б - петролейный эфир - метнлэтилкетон - уксусная кислота (95-4-l), обнаружение бромтимоловый синий А 1 - фосфолвпвды;

2 - холестерин;

3 - стеариновая кислота. 4 - олеиновая кислота, 5 - л и пядный Экстракт• сыворотжи крога здорового человека, 6 - триглицериды, 7 - э ф, р ы хоче Б. I - фосфолипиды и моноглицериды;

2-"местерин, 3 - диглицериды (1 2 и 13 изомеры) 4- стеариновая и олеиновая кислоты, S-лнпидный экстракт сыворотки кровч здорового человека, 6 — триглицериды;

7 — эфиры холестерина 538 Специальная часть ликагеля G продольными линиями разграничивают на несколько полос. Образец липидов наносят на старт первой полосы и прояв ляют в системе петролейный эфир — дизтиловый эфир — уксусная кислота. Оставшиеся полосы хроматограммы можно потом исполь зовать для разделения фосфолипидов и т. д. После обнаружения можно на одной хроматограмме получить не только картину со отношения фракции липидов в образце, но и состав фракций.

Хорошее разделение липидов можно получить с помощью ми крохроматографии на силикагеле G, нанесенном на стеклянные пластинки малых размеров (предметные стекла и т. п.) [10].

Препаративный вариант этой методики описан Добиашовой [4]. Эта методика позволяет разделять очень малые количества липидов при минимальном расходовании сорбента и растворите лей. Как показывает опыт авторов, эта методика очень эффектив на, проста и достаточно воспроизводима.

Количественный анализ. Количественное определение разде ленных липидных фракций можно осуществить несколькими спо собами.



Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.