авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 17 ] --

1. Для непосредственного фотометрирования окрашенных хро матографических зон необходимо иметь соответствующее обору дование. При использовании этого метода в качестве реагента для обнаружения можно пользоваться серной 'кислотой. При этом для получения воспроизводимых результатов следует соблюдать опре деленные правила [13]. Образование пятен с оттенками от корич невого до черного после обугливания органических соединений зависит не только от условий сжигания, но и от химической при роды веществ. Разная степень обугливания свойственна, напри мер, насыщенным и ненасыщенным соединениям. Поскольку раз л и ч а в степени ненасыщенности проявляются особенно заметно при переходе от одной липидной фракции к другой, детектирова ние рекомендуется осуществлять опрыскиванием насыщенным рас твором бихромата калия в 80%-ной серной кислоте (,Д 66) с по следующим нагреванием при 180 °С в течение 25 мин. *В этих ус ловиях упомянутые различия сводятся к минимуму. Тем не менее для каждой фракции необходимо предварительно построить ка либровочную кривую при соблюдении стандартных условий ана лиза..Ошибка определения составляет 5—10%.

2. Количественное определение разделенных веществ после их элюирования в принципе вполне возможно. Однако этот метод имеет Два существенных недостатка: а) вымывание загрязнений из сорбента, которые иногда мешают цветной реакции;

б) непол ное вымывание вещества, обусловленное главным образом оста точной адсорбцией некоторых веществ на слое сорбента.

Положение разделенных пятен выявляется после обнаружения хроматограммы, например, 2,7-дихлорфлуоресцеином (ДЗЗ) или раствором бромтимолового синего (Д 17). После выделения части Специальная часть слоя, занимаемого пятном, в ходе дальнейшей обработки часто требуется полностью удалить остатки использованного для обна ружения реагента. При другом способе обнаруживают только края пластинки, закрывая все участки слоя, предназначенные для последующего анализа.

При количественном определении элюированного с пластинки вещества необходимо при каждом анализе элюировать параллель но и неокрашенный участок хроматограммы, соответствующий размерам пятна. Этот так называемый холостой опыт позволяет исключить влияние возможных загрязнений сорбента на резуль таты определения. Точность анализа зависит от тщательности вы полнения методических указаний и от используемой цветной ре акции.

Количественный анализ состава суммарных липидов сыворотки крови [20] Приготовление хроматографических пластинок. Пластинки с силикагелем G размером 20X20 см готовят из суспензии 32 г силикагеля G фирмы Merck в Таблица Относительный состав суммарных липидов сыворотки ' крови здорового человека [20] Липиды Содержание, % Лизофосфатидилхолин 4,5±2, Сфингомиелин 31,1±3, Фосфатидилхолин 61,1±3, Фосфатидилэтаноламин 3,2±2, Свободные жирные кислоты 5,5±2, Холестерин 18,6±4, Триглицериды 30,4±4, ЭФиоы холестерина 40,5+6, Таблица Количественный состав фосфолипидов сыворотки крови здорового человека [20] Содержание, % Липиды Лизофосфатидилхолин 4,7±2, Сфингомиелин 30,5+3, Фосфатидилхолин 61,2±3, Фосфатидилэтаноламин 3,6±0, 540 Специальная часть 60 мл дистиллированной воды и активируют их нагреванием при 120°С в те чение 1 ч.

Экстракция липидов. В пробирку или колбу помещают 6 мл смеси хлоро форм— метанол (1:1) и при непрерывном перемешивании прикапывают 0,5 мл сыворотки крови. После тщательного перемешивания смесь оставляют на 15 мин и затем фильтруют или центрифугируют. Осадок белка промывают 2X1 мл омеси хлороформ — метанол ( 1 : 1 ) ;

после промывания хлороформ-метанольный слой объединяют с основным экстрактом. К объединенному экстракту добавля ют 4 мл хлороформа и 2 мл промывного раствора I (1 г хлорида натрия и 1 мл 2 н. серной кислоты в 1 л дистиллированной воды), смесь тщательно взбалты вают и оставляют отстаиваться на ночь в холодильнике. Верхнюю водно-метанольную фазу отсасывают, а нижнюю хлороформную (при правильно проведенной экстракции ее объем должен быть в пределах 8 мл) пере ливают в мерный цилиндр и дают постоять несколько минут. Остаток верхней фазы от сасывают, а стенки колбы споласкивают 2X1 мл промывного раствора II (15 мл хлороформа, 250 мл метанола и 250 мл 0,1 н. водного раствора хлорида натрия).

После перемешивания и разделения фаз верхний слой опять отсасывают, а очищен ный экстракт доливают метанолом до объ ема 10 мл (1 мл этого раствора соответ ствует 0,05 мл сыворотки крови).

Хроматографирование. После нанесения образца на стартовую линию длиной 1,5 см хроматограмму элюируют последовательно сначала в системе хлороформ — метанол — вода — н-гептан (65 : 25 : 4 : 9) до подъема уровня фронта на высоту 14 см и затем после высушивания при комнатной темпе ратуре в системе «-гептан — диэтиловый эфир—уксусная кислота (95 : 4 : 1) до подъ ема фронта на 18 см.

Обнаружение. Высушенную хромато грамму опрыскивают 20%-ным раствором сульфата аммония в 2%-ной серной кисло те и нагревают 45 мин при 200 °С.

Рис. 101. Разделение липидов сыворотки крови и спинномозговой жидкости чело века [20].

Сорбент: силикагель G;

системы: 1) хлороформ — метанол — вода — «-гептан (65 : 25 : 4 : 9);

2) к-геп тан — диэтиловый эфир — уксусная кислота (95:4:1);

обнаружение: 20%-ный сульфат аммо ния в 2%-ной серной кислоте.

а — липидный экстракт спинномозговой жидкости;

б — липиды сыворотки крови. / — лизофосфати дилхолин;

2 — сфннгомиелнн;

3 — фосфатидилхо лин;

4 — фосфатидилэтаноламин;

5 — свободные жирные кислоты;

6 — холестерин;

7 — триглицери ды;

8 — эфиры холестерина.

Специальная часть Количественный анализ. Количественное определение осуществляют намере нием интенсивности окраски полос с помощью денситометра.

Количественный состав липидов сыворотки крови здорового человека, оп ределенный с помощью описанного метода, приведен в табл. 113 и 114;

пример •разделения показан на рис. 101.

6.6.2. Глицериды Возможности разделения моноглицеридов, диглицеридов и три глицеридов обсуждены в предыдущем разделе. Труднее опреде лить молекулярный состав каждого из перечисленных типов гли церидов. Основная трудность заключается в сложном составе природных глицеридов, который определяется прежде всего на бором и характером жирных кислот. Хотя разделение смесей глицеридов — первоочередная задача при анализе растительных жиров и масел, некоторые проблемы клинической биохимии тоже требуют проведения детального анализа глицеридной фракции крови либо других тканей.

Хроматопрафическое разделение глицеридов в тонком слое можно осуществить несколькими способами. Поскольку подроб ное описание этих методик выходит за рамки настоящей моногра фии, ниже приведено только их краткое содержание. Методиче ские подробности читатель может найти в цитируемых работах.

Разделение различных типов моно- и диглицеридов Изомерные моноглицериды и диглицериды можно разделить на силикагеле, импрегнированном борной кислотой, в системе хлороформ — ацетон (94:6) [19]. Однако в этих условиях насы щенные моноглицериды не отделяются от ненасыщенных. Разде ление моноглицеридов описано в работе Прайветта и Бланка [12].

Метод заключается в окислении вторичной спиртовой группы этих соединений йодной кислотой и в озонолизе двойных связей нена сыщенных моноглицеридов. Образующиеся при этом продукты, различающиеся по полярности, хорошо разделяются на силикаге ле в смеси петролейного и диэтилового эфиров. Аналогично мож но разделять и диглицериды.

Разделение различных типов триглицеридов Для анализа триглицеридов, как и в случае моно- и диглице ридов, можно использовать восстановительный озонолиз или при менять силикагель, импрегнированный ионами серебра.

В первом случае ненасыщенные триглицериды под действием озона дают соответствующие озониды, которые затем разделяют ся на силикагеле по числу озонидных 'группировок в молекуле в системе петролейный эфир — диэтиловый эфир. Каждую из выде ленных фракций восстанавливали с получением эфиров соответ ствующих альдегидокислот. Полученные продукты вновь хромато 542 Специальная часть графировали. По количеству и типу этих продуктов можно судить о составе исходной смеси триглицервдов.

Этот метод, однако, не пригоден для разделения различных типов насыщенных триглицеридов между собой. Количественный анализ осуществляют обугливанием серной кислотой с последую щим фотометрированием окрашенных полос.

При разделении на силикагеле, импрегнированном азотнокис лым серебром, используется способность двойных связей образо вывать с ионами серебра» координационные комплексы. Образо вание этих комплексов определяется числом двойных связей и их конфигурацией.

Импрегннрованием слоя силикагеля раствором азотнокислого серебра можно приготовить сорбент, который пригоден для раз деления триглицеридов в различных системах растворителей [1, 3, б, 8]. Насыщенные триглицериды или триглицериды с малым количеством двойных связей в молекуле обладают большей хро матографической подвижностью в сравнении с полиненасыщенны ми триглицеридами. Чем меньше двойных связей в молекуле, тем большей подвижностью она обладает. Комплексы, образуемые яонами серебра с олефиновыми двойными связями с грамс-конфи гурацией, менее устойчивы, чем комплексы соответствующих цис двойных связей, поэтому подвижность последних заметно меньше [3]. Положение жирной кислоты в молекуле оказывает неболь шое влияние на хроматографическую подвижность триглицери дов. Однако в некоторых случаях оно достаточно для разделения соответствующих изомеров, йапример 1-олеил-2,3-дистеароилгли церина и 2-олеил-1,3-дистеароилглицерина i[2]. При хроматогра фировании триглицеридов на силикагеле, импрегнированном иона ми серебра, длина цепи жирных кислот практически не влияет на разделение. Напротив, длина алифатических цепей является опре деляющим фактором при разделении триглицеридов методом хро матографии с обращенными фазами.

Для проведения такой хроматографии носитель (обычно крем незем с примесью гипса — кизельгур G) импрегнируют парафино вым маслом, ундеканом или тетрадеканом. Преимущество исполь зования двух последних углеводородов состоит в легкости их уда ления из слоя. Это облегчает детектирование хроматографируе мых веществ, особенно насыщенных триглицеридов, обнаружение которых на парафиновых слоях затруднительно. Как и в случае разделения высших жирных кислот, при разделении триглицери дов методом хроматографии с обращенными фазами существуют «критические пары». Поэтому целесообразно комбинировать дву мерный вариант хроматографии в слое силикагеля с серебром с хроматографией с обращенными фазами.

Обнаружение разделенных триглицеридов осуществляют 2,7 дихлорфлуоресцеином, родамином В и 50%-ной серной кислотой Специальная часть на пластинках с силикагелем, импрегнированным азотнокислым серебром или ундеканом;

иодом и а-ииклодекстрином при разде лении на силикагеле, пропитанном парафиновым маслом.

Количественный анализ разработан сравнительно мало. Очень содержательную работу о разделении триглицеридов опубликова ли недавно Весселс и Раджагопал [23]. Она посвящена в основ ном комбинированию разделения на пластинках с серебром (сили кагель G) хроматографированием на кремнеземе, пропитанном с 7,5%-ным раствором парафинового масла в петролейном эфире Количественный анализ отдельных фракций после их элюирова ния из силикагеля и щелочного гидролиза можно проводить по средством фотометрического определения освободившегося глице рина (окисление йодной кислотой и цветная реакция с хромотро повой кислотой). Хотя эти методики разработаны для анализа триглицеридов в маслах, они вполне применимы для определения триглицеридов в биологическом материале.

6.6.3. Глицерофосфатиды и сфингогликолипиды Хотя качественное и количественное определение глицерофос фатидов и сфингогликолипидов можно успешно осуществлять с помощью колоночной или бумажной хроматографии, метод ТСХ благодаря своей простоте, быстроте и большим возможностям разделения дополняет, а в некоторых случаях и полностью заме няет оба упомянутых метода.

Количественное определение глицерофосфатидов в сыворотке крови и спинномозговой жидкости по методу Робинсона и Филлииса [11, 16] Приготовление пластинок Стеклянные пластинки размером 20X20 см с си ликагелем G готовят обычным способом Слои активируют 30 мин при 110°С непосредственно перед использованием Подготовка образца Сыворотка. 2 мл сыворотки по каплям приливают к 4 мл метанола, хорошо перемешивают и нагревают в течение 10 мин при темпе ратуре 50 СС После центрифугирования супернатант отделяют, а осадок разме шивают в 4 мл смеси метанол — хлороформ (3 1), нагревают и центрифугиру ют Ту же самую операцию повторяют с 4 мл хлороформа Объединенные экст ракты упаривают досуха, остаток растворяют в 0,4 мл хлороформа 0,05 мл образца (100—130 мкг фосфора) в виде полосы длиной 1 см наносят на старт хроматограммы на расстоянии 1 см от нижнего ее края Спинномозговая жидкость.

Фосфолипиды из спинномозговой жидкости экст рагируют по методике, описанной выше для сыворотки крови Исходное коли чество материала от 5 до 10 мл Хроматографирование Хроматографическое разделение проводят в системе хлороформ — метанол—вода (65 25 4) до момента подъема фронта на высоту 10 см (примерно 45 мин) при комнатной температуре (рис 102) Обнаружение Высушенную хроматограмму опрыскивают 18 н серной кис лотой и нагревают несколько минут при 110 °С до появления коричневых полос Количественный анализ. После обнаружения серной кислотой пятна фосфо липидов выскребают и переносят в пробирки для сжигания Участки чистого слоя силикагеля, по площади разные пятнам веществ, тоже переносят в пробир 544 Специальная часть ки II используют в качестве контроля. В каждую пробирку наливают по 1 мл 1 М хлорной кислоты и нагревают в течение 3 ч на песчаной бане. После охлаж дения добавляют точно по 5 мл дистиллированной воды, содержимое пробирок нагревают и фильтруют через фильтровальную бумагу ватман № 44. Пробирку и фильтр промывают теплой дистиллированной водой 3X1 мл и после охлаж дения добавляют 1 мл 2,5%-ного раствора молибдата натрия и 0,4 мл раствора 1-амино-2—нафтол-4-сульфокислоты. Реакционную омесь перемешивают, нагре вают 7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают и проводят фотометрические Рис. 102. Разделение фосфолипидов [11, 16].

Сорбент: силикагель G;

система: хлороформ — метанол — вода (65:25:4);

обнаружение: серная кислота.

СК — экстракт сыворотки крови человека;

СМЖ — экс тракт спинномозговой жидкости;

/ — нейтральные липи ды;

2 — фосфатидилэтаноламин;

3 — фосфатидилхолин;

4 — сфингомиелин;

5 — лизофосфатидилхолин.

измерения при 830 нм против дистиллированной воды. Стандартная калибровоч ная кривая строится по раствору КН2РО4 в пределах концентраций от 0,5 до 5,0 мкг фосфора. Состав фосфолипидов сыворотки крови и спинномозговой жид кости человека, определенный описанным методом, приведен в табл. 115.

Таблица Средний фосфолипидный состав липидов сыворотки крови и спинномозговой жидкости здорового человека [16] Состав сыворотки Состав спинномозговой Липиды крови, % жидкости, % 10,4 7, Лизофосфатидилхолин 19,8 21, Сфингомиелин 66,1 65, Фосфатидилхолин 3,7 5, Фосфатидилэтаноламин Количественное определение фосфолипидов сыворотки крови по методике Рейнишовой и Михалеца [14] Приготовление пластинок. Для разделения применяют фирменные пластинки с смликагелем на алюминиевой фольге (силуфол или силуфол УФгм. предприя тие Kavalier, ЧССР) размером 7,5X4 см. Пластинки перед анализом не активи руют.

Подготовка образца. Образец липидного экстракта, полученного по методи ке', описанной в разд. 6.6.1, растворяют в смеси хлороформ — метанол (2:1) и Специальная часть наносят на стартовую линию в виде полосы длиной 1,5 см, удаленной от ниж него края хроматограммы на расстояние 1 см.

Хроматографирование. Хроматографическое разделение проводят в системе хлороформ — метанол — вода (70 : 30 : 5) в течение 20 мин с перетеканием в камере, не насыщенной парами системы растворителя. В качестве хроматографи ческой камеры очень удобно использовать стеклянные сосуды, в которых окра шивают гистологические препараты.

Рис. 103. Разделение фосфолипидов сы воротки крови на силуфоле [14].

Сорбент: силуфол или ~илуфол УФ254;

система:

хлороформ — метанол — в о д а (70:30:5);

об кислый фуксин — азотнокислый наружение:

уранил.

lyso — лизофосфагидилхолин;

sph — ефингоми елин;

pch — фосфатидилхолин;

ре — фосфати дилэтаноламвн.

Обнаружение. Хроматограмму сушат при комнатной температуре, опрыски вают 0,2%-ным раствором кислого фуксина и 0,2%-ным раствором уранилнитра та в 0,01 н. соляной кислоте, после чего погружают на 10 мин в тот же окра шивающий раствор. Затем хроматограмму два раза с интервалом в 5 мин про мывают 0,2%-ным раствором азотнокислого уранила в 0,01 н. соляной кислоте.

Глицерофосфатиды и сфингомиелин обнаруживаются в виде красно-фиолетовых пятен на бесцветном или слабо-розовом фоне.

Количественный анализ. Количественное определение осуществляют денсито метрированием окрашенных пятен (рис. 103). Фосфолипиды можно обнаружи вать и другими реагентами, например 0,04%-ным раствором бромтимолового синего в 0,01 н. растворе едкого натра, реактивом Цинцадзе, нингидрином и др.

При двумерной хроматографии пластинки 10ХЮ см элюируют в первом направлении в системе хлороформ — метанол — концентрированный аммиак ( 7 0 : 3 0 : 5 ), а после высушивания — во втором направлении в системе хлоро форм — ацетон — метанол — уксусная кислота — вода ( 5 : 2 : 1 : 1 : 0,5). При та ком варианте хорошо расходятся пятна фоефатидилсерина от сфингомиелина и фосфатидилхолина. Нужно подчеркнуть, что подвижность веществ в указанных системах в большой мере определяется степенью насыщенности камеры парами растворителей.

Определение соотношения фосфатидилхолин — сфингомиелин в амниотической жидкости по методике Рейнишовой и Михалеца [15] В последнее время стало известно, что определение фосфоли пидов, составляющих основную часть поверхностно-активных ве 546 Специальная часть ществ в амниотической жидкости, может быть использовано для установления степени зрелости легких плода [31]. Интерес пред ставляет определение двух основных типов фосфолипидов — фос фатидилхолина и сфингомиелина. Соотношение этих фракций, равное 2 и более, характеризует плод со зрелыми легкими, спо собными к нормальному дыханию. Эти определения приобретают важное значение в случае неблагополучного течения беременно сти, когда необходимо заблаговременно знать время родов и оп ределить степень зрелости легких плода. Жидкость получают для диагноза путем амниоцентеза.

Приготовление пластинок и их тип описаны в предыдущей методике.

Подготовка образца. 2 мл амниотической жидкости по каплям добавляют к 8 мл смеси хлороформ — метанол (3:5). После тщательного перемешивания полученную смесь центрифугируют и обрабатывают далее так, как это описано для сыворотки.

Экстракция по методу Глюка. Смешивают одинаковые объемы амниотичес кой жидкости (2 мл) и метанола, добавляют 2 объема хлороформа, встряхива ют и центрифугируют. Нижний слой отсасывают и упаривают. Остаток после упаривания растворяют в 0,1 мл хлороформа. На стартовую линию на расстоя нии I см от нижнего края пластинки наносят по 20—30 мкл раствора в виде полоски длиной 0,8 см.

Рис. 104. Определение соотноше ния фосфатидилхолина и сфинго миелина в амниотической жидко сти [15].

Сорбент: силуфол или силуфол УФ254;

хлороформ — м е т а н о л — кон система:

центрированный аммиак (70 : 30 : 5);

об кислый фуксин — азотно наружение:

кислый уравил.

/ — сфингомиелин;

2 — фосфатидилхо лин (лецитин);

3 — фосфатидилэтанол амин. (Пациентка на 34-той неделе бе ременности, отношение лецитина к сфингомиелину равно 2,7.) Хроматографирование. Хроматографическое разделение проводят в системе хлороформ — метанол — концентрированный аммиак (70 : 30 : 5) в течение 15 мин с перетеканием. Камеру насыщают парами растворителей в течение 30 мин перед началом анализа.

Обнаружение. Высушенную храматограмму опрыскивают 0,02%-ным раство ром кислого фуксина и 0,2%-ным раствором уранилнитрата в 0,01 н. соляной кислоте.

Специальная часть Количественный анализ. Количественные определения проводят методом фо тоденситометрии. Из полученных данных вычисляют соотношение фосфатидил холина и сфингомиелина (рис. 104).

Двумерная хроматография глицерофосфатидов и сфингогликолипидов по методу Раузера и сотр. \[17] Приготовление пластинок. 180 г силикагеля Н фирмы Merck смешивают с 20 г силиката магния. После тщательной гомогенизации 20 г полученной смеси размешивают с 65 мл 0,01 и. раствора едкого кали. Полученную суспензию на носят на стеклянные пластинки размером 20x20 см. Приготовленные пластинки сушат при комнатной температуре и непосредствен но перед использованием активируют 30 мин при 100—120 "С.

Хроматографирование. После нанесения / образца хроматограмму помещают в камеру, насыщенную парами соответствующих систем растворителей. В зависимости от предполагае мого состава анализируемого материала вы- U °9 1.

бирают одну из трех комбинаций систем рас- To творителей. Комбинация А 1 -е направление: хлороформ — метанол — Старт 28%-ный аммиак (65 : 35 : 5).

2. 2-е направление: хлороформ — ацетон — метанол — уксусная кислота —• вода Рис. 105. Двумерная хромато ( 3 : 4 : 1 : 1 :0,5). грамма глицерофосфатидов и Комбинация Б сфингогликолипидов мозга че 1-е направление: хлороформ — метанол — ловека [17].

28%-ный аммиак (65 : 35 : 5). Сорбент: силнкагель Н с 10% сили 2-е направление: хлороформ — ацетон — ката магния: системы: 1-е на метанол — уксусная кислота — вода правление: хлороформ — метанол — 28%-ный аммиак (65 : 25 : 5), 2-е на ( 5 : 2 : 1 : 1 :0,5). правление: хлороформ — ацетон — Комбинация В метанол — уксусная кислота — вода ( 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5);

обнаружение:

1-е направление: хлороформ — метанол — формальдегид и серная кислота.

вода (65 : 25 : 4). / — лизофосфатидилхолин;

2 — фос 2-е направление: н-бутанол — уксусная фатидилсерин;

3 — сфингомиелин;

4 — фосфатидилинозит;

5 — фосфа кислота — вода ( 3 : 1 : 1 ). После первого про тидная кислота;

6 — лизофосфати явления пластинку сушат 10 мин при комнат- дилэтаноламин;

7 — фосфатидилхо ной температуре (лучше в камере с азотом, лин;

8 — фосфатидилэтаноламин;

9 — сульфатиды с незамещенными чтобы исключить возможность автоокисления жирными кислотами;

10 — сульфа некоторых лабильных соединений). На рис. 105 тиды с 2-оксикислотами;

11 — ди приведен пример использования комбина- фосфатидилглицерин;

12 — церебро зиды с незамещенными жирными ции А. кислотами: 13 — цепеброзиды с 2-ок Обнаружение. После высушивания на воз- сикислотами;

14 — свободные жир духе хроматограмму опрыскивают смесью ные кислоты;

15 — неполярные ли пиды (холестерин, триглицериды 3 объемов 37%-ного формальдегида и 97 объе- и т. д. ).

мов 98%-ной серной кислоты и нагревают 30 мин при 180°С. Для облегчения иденти фикации анализируемых веществ полезно наблюдать процесс окрашивания пятен.

В самом начале нагревания холестерин дает красные пятна, которые постепенно чернеют. Гликолипиды после нескольких минут нагревания окрашиваются в пур пурный цвет, который при последующем нагревании тоже переходит в черный.

Фосфолипиды обиаруживаются сразу в виде черных пятен.

Количественный анализ можно проводить после соскребания участков сор бента, занимаемых обнаруженными пятнами, сжиганием органических веществ 548 Специальная часть в сорбенте 72%-ной хлорной кислотой и последующим определением содержа ния фосфора при помощи цветной реакции с молибдатом аммония и аскорби новой кислотой.

Количественное определение продуктов гидролитического расщепления глицерофосфатидов [5] Приготовление пластинок и хроматографирование. Пластинки готовят по обычной методике из суспензии силикагеля G в дистиллированной воде. После нанесения образца хроматографирование ведут в системе хлороформ — метанол— 3 М раствор трихлоруксусной кислоты — вода (40 : 60 : 20 : 12,5) в случае холин содержащих веществ или в системе, хлороформ — метанол—10%-ная трихлор уксусная кислота — вода (45 : 55 : 8 : 4) в случае производных этаноламина в течение 60—90 мин при комнатной температуре.

Обнаружение производных холина. Хроматограмму сушат несколько минут при температуре 100 °С и опрыскивают модифицированным реагентом Хейнза — Ишервуда (Д 77). После высушивания в сушильном шкафу хроматограмму оп рыскивают реактивом Драгендорфа (Д 53). Холин обнаруживается сразу в виде красно-оранжевого пятна, глицерофосфорилхолин и фосфорилхолин проявляют ся спустя несколько минут в виде фиолетовых пятен, а глицерофосфат — в виде синего пятна.

Значения hRF: 80, 53, 32 й 20 для глицерофосфата, холина, фосфорилхоли на и глицерофосфорилхолина соответственно.

Обнаружение производных этаноламина. Хроматограмму после высушива ния опрыскивают нингидриновым реагентом (Д 152). Возникают сине-фиолето вые пятна на розовом фоне. При использовании реагента на производные холи на производные этаноламина не окрашиваются.

Значения HRF: 90, 80, 40 и 18 для глицерофосфата, этаноламина, фосфорил этаноламина и глицерофосфорилэтаноламина соответственно.

Идентификацию продуктов расщепления фосфолипидов, осво бождающихся при кислотном гидролизе последних, можно осуще ствлять по методу [6] на пластинках с силикагелем G в системе 96%-ный этанол — 7%-ный аммиак (1 : 2 ). При обработке хрома тограммы парами иода холин, зтаноламин, N-монометилэтанола мин и М,Ы-диметилэтаноламин обнаруживаются в виде коричне вых пятен. После улетучивания иода (экспозиция пластинки на воздухе в течение 90 мин) хроматограмму опрыскивают 0,5%-ным раствором нингидрина в метаноле с добавкой 5% коллидина. По сле нагревания в течение 30 мин при температуре 80 °С зтанола мин, серии и треонин.обнаруживаются в виде синих пятен, a N монометилэтаноламин дает розово-красное пятно на неокрашенном или слабо-розовом фоне (рис. 106).

Инозит обнаруживается при опрыскивании пластинки 0,5%-ным раствором лерманганата калия в виде желтого пятна на фиолето вом фоне.

Вопросам идентификации и определения фракций церебрози дов и сульфатидов посвящена работа |[9]. При разделении на си ликагеле Н с 10% силиката магния (флорисил) хроматографиро вание ведут сначала в системе хлороформ — ацетон — пиридин — 20%-ный аммиак — вода ( 2 0 : 3 0 : 6 0 : 2 : 2 ) до подъема фронта ра створителя на 8 см от стартовой линии. После 20-минутного вы Специальная часть О ' о о О оо о о о 34 7 2 Рис. 106. Разделение продуктов гидролиза фосфолгшидов [6].

силикагель G;

система: 96%-ный этанол — 7%-ный аммиак ( 1 : 2 ) ;

Сорбент: обнаружение:

перманганат калия или иод и нингидрин.

/ —- холин;

2 — N-монометилэтаноламин;

3 — Ы,Ы-диметилэтанола5:ин;

4 — этгиоламии;

5 — инозит;

6 — смесь веществ 1—8;

7 — серии;

8 — треонин.

Рис. 107. Разделение ганглпозидов мозга человека [18].

силикагель G;

системы 1) к-пропанол — вода ( 7 : 3 ), 2) хлороформ — м е т а н о л — Сорбент:

2,5 н. аммиак (U0 : 35 : 8);

обнаружение: резорцин — соляная кислота.

Количественный анализ отдельных фракций выполнен с помощью денситометрического ме тода, а — Gjvi! (моносиалоганглиозиды);

б — G ^ l a (дисиалоганглиозиды);

в — G д 1 в (ди сиалоганглиозиды);

г — ( 7 T l (трисиалоганглиозиды);

д — тетрасиалоганглиозиды.

сушивания в токе воздуха хроматографируют в том же направле нии в системе хлороформ — ацетон — метанол — уксусная кисло та—^вода ( 6 5 : 3 5 : 1 1 : 4 : 1, 5 ), давая фронту растворителя под няться до верхнего края пластинки. Для качественного определе ния авторы используют цветную реакцию с фосфорной кислотой 550 Специальная часть и уксуснокислой медью. Количественный анализ проводят после увлажнения хроматограммы водой и обработки парами иода.

Пятна сфингогликолипидов выскребают с пластинки. Интенсив ность окрашивания после добавления орсинового реагента изме ряют фотометрическим методом.

Для количественного определения ганглиозидов существует целый ряд методов [30, 43]. Шмид и Рейнишова [18] делят ган глиозиды в системе м-пропанол — вода (7 : 3) или хлороформ — метанол —2,5 н. аммиак ( 6 0 : 3 5 : 8 ). После обнаружения резор циновым реагентом разделенные фракции анализируют количест венно денситометрическим методом (рис. 107). Определению сфингогликолипидов в мозге и других тканях посвящены работы [30,34,38,40].

ЛИТЕРАТУРА 1. Barrett С. В., Dallas M. S. J., Padley F. В., Chem. Ind. (London), 1962, 1050.

2. Barrett С. В., Dallas М. S. J., Padley F. В., J. Amer. Oil Chem. Soc, 40, 580 (1963).

3. De Vries В., Jurriens G., Fette, Seifen, Anstrichmittel., 65, 725 (1963).

4. DobidSovd M., J. Lipid Res., 4, 481 (1963).

5. Doizaki W. H., Zieve L, Proc. Soc. exp. Biol., 113, 91 (1963).

6. Kaufmann H. P., Wessels H., Bondopadhyaya C., Fette, Seifen, Anstrichmit tel., 65, 543 (1963).

7. Mangold H. К., Malins D. C, J. Amer. Oil Chem. Soc, 37, 383 (1960).

8. Morris L. J., Chem. Ind. (London), 1962, 1238.

9. Neskovic N., Sarlieve L., Nussbaum J. L, Kostic D., Mandel P., Clin. chim.

Acta, 38, 147 (1972).

10. Peifer J. J., Microchim. Acta, 1962, 529.

11. Phillips В. М., Robinson N.. Clin. chim. Acta, 8, 832 (1963).

12. Privett O. S., Blank M. L, J. Lipid. Res., 2, 37 (1961).

13. Privett O. S., Blank M. L, Lundberg W. O., J. Amer. Oil Chem. Soc, 38, 312 (1961).

14. ReiniSova I., Michalec C, J. Chromatogr. (в печати).

15. ReiniSova J., Michalec С, неопубликованные результаты.

16. Robinson N.. Phillips В. М., Clin. chim. Acta, 8, 385 (1963).

17. Rouser G., J. Chromatogr. Sci., 11, 60 (1973).

18. Smid F., ReiniSovd I., J. Chromatogr., 86, 200 (1973).

19. Thomas A. E., Scharoun J. E., Ralston H., J. Amer. Oil Chem. Soc, 42, (1965).

20. Tichy J., Z. gesinn. Med., 27, 21 (1972).

21. Vogel W. C, Doizaki W. M., Zieve L, J. Lipid Res., 3, 138 (1962).

22. Wagner H., Pohl P., Glasl H., J. Chromatogr., 42, 75 (1969).

23. Wessels H., Rajagopal N. S., Fette, Seifen, Anstrichmittel., 71, 543 (1969).

24. Wessels П., Fette, Seifen, Anstrichmittel., 75, 478 (1973).

25. Zotlner N.. Wolfram G., Klin. Wschr., 40, 1101 (1962).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 26. Абрамзон М. А., Егорова Р. П., Лаб. дело, № 2, 181 (1971).

27. Atzpodien W., Kreemer G. J., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15, 293 (1977).

28 Bowyer D. E., King J. P., J. Chromatogr. Biomed. App., 143, 473 (1977).

Специальная часть 29 Данильчик В. С, Вергейчик С. Д., Здравоохр. Белоруссии, № 7, 71 (1977).

Eberlein К., Gercken G., J. Chromatogr., 106, 425 (1975).

30.

31. Gartzke I., Z. med. Labor. Diagn., 19, 101 (1978).

32. Halpaap H, Kontakte (Merck), No. 1, 32 (1978).

33. Chedid A., Haux P., Natelson S., Clin. Chem., 18, 384 (1972).

34. Kerenyi L, Kantian R., Gielen W., Debuch H., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 12, 487 (1974).

Kupke I. R., J. Chromatogr. Biomed. App., 162, 414 (1979).

35.

Kupke I. R., Zeugner S., J. Chromatogr. Biomed. App., 146, 261 (1978).

36.

37. Murawski V., Egge H, Zilliken F., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 12, (1974).

Robert J., Rebel G., J. Chromatogr, 110, 393 (1975).

38.

39. Schmidt R., Kunze D., Egger E., Z. med. Labor.-Diagn., 19, 306 (1978).

40 Trubsbach A., Jaross W., Z. med. Labortechn., 15, 192 (1974).

41. Вартанян К. 3., Лаб. дело, № 9, 524 (1971).

Vitiello F., Zanetta J. P., J. Chromatogr, 166, 637 (1978).

42.

Zanetta J. P., Vitiello F, Robert J., J. Chromatogr., 137, 481 (1977).

6.7. Стерины, желчные кислоты и стероидные гормоны 6.7.1. Холестерин и его производные Систематическая разработка разделения сложных эфиров хо лестерина и высших жирных кислот является заслугой главным образом Целльнера и сотр. [31]. Они пользовались слоями, при готовленными из силикагеля, и многократным хроматографирова нием в четыреххлористом углероде. В вытяжках сыворотки крови людей им удалось разделить сложные эфиры холестерина на фракций, которые можно было обнаруживать хлоридом сурьмы (III). Из других систем удовлетворительной оказалась смесь пет ролейный эфир (т. кип. 50—70 °С) —изопропиловый эфир (99: 1), при использовании которой удавалось более четко разделить пят на, особенно если пробы наносили в форме полосок 2 см [32, 33].

В этих способах эфиры холестерина разделялись в зависимо сти от степени иенасыщенности остатка жирной кислоты. Наи большую подвижноеib обнаружили насыщенные эфиры. Дальней шие фракции по направлению к старту были: моноеновая, диено вая, три + тетраеновая и полиеновые (с 5 — 6 двойными связя ми). Прочие фракции оставались на старте или в непосредствен ной близости от него.

Применение хроматограмм длиной до 40 см привело к даль нейшему, более тонкому фракционированию (например, к частич ному разделению пальмитата и стеарата холестерина), особенно при использовании техники проточного проявления [33].

Количественное определение можно осуществить денситометри рованием окрашенных пятен, однако этот способ требует очень точного соблюдения условий реакции. Опрыскивание хромато граммы 25%-ным раствором хлорида сурьмы(III) в хлороформе 552 Специальная часть необходимо выполнить совершенно равномерно и точно выдержать также температуру и время для появления окрашивания (3 — 5 мин при 110°С). Фотометрирование проводят при длине волны 575 нм. Другая возможность количественного определения заклю чается в фотометрировании окрашенного раствора, образующегося при прибавлении раствора хлорного железа и серной кислоты пря мо к элюатам пятен соответствующих эфиров, вырезанным из хроматограммы [33]. Гораздо более удобный метод разделения эфиров холестерина разработали Тихий и Денкер [26].

Количественное определение сложных эфиров холестерина в плазме крови по Тихому и Денкеру [26] Приготовление слоя. Стеклянные пластин ки (20x20 см) покрывают слоем силикагеля, который получают из суспензии 32 г силика геля G (Merck) в 60 мл дистиллированной воды, затем активируют при 120°С в течение 60 мин.

Приготовление пробы и нанесение. Вы тяжку плазмы крови готовят способом, опи санным» при определении спектра липидов (разд. 6.6). Аликвотную часть вытяжки, соот ветствующую 15 мкл плазмы, выпаривают до суха в атмосфере азота. Остаток растворяют в 10 мкл смеси и-пропанол — хлороформ — метанол ( 3 : 2 : 1 ) и наносят яа хроматограм му в виде полоски 1,5 см.

Хроматограмму Хроматографирование.

трижды элюируют смесью «-гептан — толуол (8 :2) без предварительного насыщения каме ры парами растворителя на расстояние 16 см от старта;

между отдельными элюированиями хроматограмму высушивают при комнатной температуре.

Обнаружение. После высушивания пла стинку опрыскивают раствором 20 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды с до бавлением 4 мл концентрированной серной кислоты. Хроматограмму сначала сушат в то ке горячего воздуха, а затем нагревают в те чение 45 мин при 200°С (рис. 108).

Количественное определение. Производят Рис. 108. Разделение слож путем денситометрирования окрашенных пятен.

ных эфиров холестерина Содержание различных эфиров холестери плазмы крови человека на, определенное этим способом, приведено в [26].

табл. 116.

Сорбент: силикагель G;

систе н-гептан — толуол (8:2);

ма:

Дальнейшую возможность разде сульфат аммо обнаружение:

ния — серная кислота.

ления сложных эфиров холестерина / — эфиры насыщенных кислот;

2 - эфиры мононенасыщенных в зависимости от степени ненасыщен кислот;

3 — диеновые эфиры;

ности представляет хроматография на три- и тетраеновые эфиры;

' иолисновые эфиры (на стар слоях сорбента, обработанного ионом U 1 - остальные липиды).

Специальная часть Таблица Содержание сложных эфиров холестерина в нормальной сыворотке крови человека [26] Сложные эфиры Содержание Сложные эфиры Содержание кислот (относительное), % (относительное), % кислот Триеновых и тетрае 13,6±2, Насыщенных новых 1 2, 9 ± 1, 27,9±2, Моноеновых 2,1±1, Полиеновых 43,5±6, Диеновых Ag+ [22]. Этот способ отличается своей высокой разделяющей способностью (рис. 109).

А Б и ОО 0О о О 0 0 Рис. 109. Разделение сложных эфиров холестерина на слое силикагеля, обра ботанного азотнокислым серебром [22].

Сорбент: силикагель Q, обработанный 5%-ным раствором AgNOs;

системы: А — эфир — к-гек о сан (1:4), Б —эфир;

обнаружение: 2',7'-ди- хлорфлуоресцеав.

S — вытяжка сыворотки нормальной крови че- О О о О Q ловека;

0 — насыщенные эфиры;

1 — моноено- Стар/ Старт 3 вые;

2 и 3 —диеновые (ближе к фронту);

3 — 2+3 5* триеновые;

4 — тетраеновые;

5 и 6 — пентаено вые и гексаеновые (ближе к старту) эфиры.

Слой силикагеля обрабатывают, опрыскивая 10%-ным водным раствором gNCb или применяют непосредственно раствор AgNO3 вместо воды при при готовлении суспензии сорбента. Обычно готовят слой, суспендируя 23,75 г сили кагеля G в 50 мл 2,5%-ного водного раствора азотнокислого серебра, и затем активируют при П0°С в течение 30 мин. Приготовленные таким способом пла стинки необходимо предохранять от прямого освещения во избежание излиш него потемнения.

При разделении насыщенных, моноеновых, диеновых и триеновых эфиров рекомендуется смесь эфир — м-гексан ( 1 : 4 ). Для разделения тетра-, пента- и гексаеновых эфиров лучше пользоваться просто эфиром. Разделенные вещества обнаруживают в ультрафиолетовом свете после опрыскивания 0,2%-ным раство ром 2',7'-дихлорфлуоресцеина в этаноле (Д 33) или 60%-ной серной кислотой с последующим нагреванием.

Метод можно использовать и для препаративных целей. Эфи ры от насыщенных до триеновых можно извлечь эфиром, от тет ра- до гексаеновых — смесью хлороформ — метанол ( 2 : 1 ).

36— 554 Специальная часть Принцип адсорбции позволяет делить эфиры главным образом по степени ненасыщенности и частично также в зависимости от длины цепи жирной кислоты. Если объединить этот принцип с распределительной хроматографией с обращенными фазами, удает ся добиться полного разделения всего спектра эфиров. Кауфманн и сотр. [18] проводили разделение на силикагеле четыреххлори стым углеродом или смесью тетралин — н-гексан (2,5:7,5) в пер вом направлении и после обработки слоя 5%-ным раствором вазе линового масла в петролейном эфире смесью метилэтилкетон — ацетонитрил (7:3), насыщенной вазелиновым маслом, во втором направлении. При таком порядке очень четко делятся эфиры кислот Ci — Cis. Для обнаружения более всего удобна 5%-ная фосфорномолибденовая кислота в этаноле;

после опрыскивания и нагревания в течение 10 мин при 100 °С образуются синие пятна на желтовато-зеленом фоне. При нагревании необходимо наблю дать, чтобы не произошло чрезмерного потемнения фона, сопро вождающегося потерей контрастности между пятном и фоном.

Определение сложных эфиров холестерина описали Крехова и сотр. [45].

Значительное внимание было уделено разделению производ ных холестерина, образующихся при его биосинтезе или катабо лизме. Каргилл [5] занимался отделением холестерина от родст венных холестанолов и холестанонов. Наиболее важным резуль татом его исследования явилась разработка системы, позволив шей отделить холестерин от (5-холестанола. Эта проблема была.решена при помощи бромирования;

на пробу, нанесенную на старт хроматограммы, приготовленной из силикагеля G, по кап лям наносят 2—3-кратное количество 0,1%-ного раствора брома в хлороформе. Образующийся из холестерина дибромид полярнее р-холестанола и имеет более высокую хроматографическую под вижность в системе бензол — этилацетат ( 2 : 1 ). Одновременно происходит также окисление, и холестерин частично превращает ся IB продукты окисления;

последние, во всяком случае, не меша ют делению. Наиболее удобным для обнаружения реактивом слу жит 10%-ный раствор фосфорно-молибденовои кислоты в этаноле, насыщенный раствор хлорида сурьмы(III) в хлороформе или «0,15%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина в этаноле для холестанонов. Михалец [21] рекомендует двумерное разделение иа окиси алюминия G (Merck): в первом направлении бензолом разделяют холестерин и р-холестанол, а-копростанол и р-копро станол, а также а-холестанол. Затем во втором направлении ра створом 0,5% брома в бензоле отделяют холестерин и р-холеста нол. Метод был применен для разделения этих стероидов в вы тяжках из кала. Азарнов и Тернер [2] разделяли холестерин и §-холестанол после превращения лервого в эпоксихолестерин реак Специальная часть цией с ж-хлорнадбензойной кислотой на силикагеле G в смеси" бензол — бутилацетат — бутанон (75 : 25 : 10). Обнаружение про водили 20%-ным раствором хлорида сурьмы(Ш) в хлороформе.

Для разделения холестерина, р-холестанола, копростанола, А7-холестенола, 7-дегидрохолестерина, эргостерина, р-ситостерина и стигмастерина Моррис [23] пользовался слоем силикагеля G, обработанного 5%-ным раствором AgNO3, и обнаруживал вещества 50%-ной серной кислотой (рис. ПО).

В исследовании промежуточных продуктов биосинтеза холестерина тонкослойной хроматографией поль зовались, например, для разделе ния холестерина и десмостерина сыворотки крови. Авиган и сотр.

[1] и Вольфманн и Закс [30] опи сали методы, последний из которых представляет распределительную хроматографию на слое силикагеля G, пропитанного ундеканом. Слой, Рис. ПО. Разделение стеринов по приготовленный обычным образом, Моррису [23].

/ Сорбент: силикагель G, обработанный пг\ ПОСЛе аКТИВаЦИИ (В Т е ч е н и е 6 0 МИН % ным раствором AgNO3;

система при температуре 120 °С) пропиты- хлороформ;

2 — холестанол;

3 — /-копростанол;

— Д7-холестенол;

ваЮТ ВОСХОДЯЩИМ СПОСобоМ ДО ВЫ- холестерин;

5—• 7-дегидрохолстерин;

6 — эргостерин;

соты около 15 см 15%-ным раство- 7 — Рнситостерин;

8 — стигмастерин ром ундекана в петролейном эфире.

После сушки (5 мин) на воздухе на пластинку наносят пробу и элюируют смесью уксусная кисло т а — ацетонитрил (1:1) до расстояния 10 см (смесь насыщена ун деканом до 70%). После высушивания при комнатной темпера туре и затем в течение 1 ч при 150°С сухую хроматограмму оп рыскивают 10%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. Для предотвращения нежелательного потемнения фона, которое обусловливается неполным удалением ундекана, обнару жение следует проводить немедленно но и (влечении пластинки из сушильного шкафа. Стерши,! дают к-мпо-спнпе пятна на бледно желтом фоне бе 1 дальисшнет п;

п реигиши. Г.слп же окраска пя тен недостаточно шпепсиинл, хромлто! рамму нагревают 10— 20 мин при температре 100- 120°С.

Значения hRF: холестерин 42, десмопернн 53, лапостерин 38, дигидрохолестерин 39, 5,7-холсс1адиен-Зр-ол 49.

Определению холестерина в плазме крови посвящена также статья Петера и сотр. [49].

36* 556 Специальная часть 6.7.2. Желчные кислоты Тонкослойная хроматография чрезвычайно удобна для обна ружения и количественного определения желчных кислот в био логическом материале, так как позволяет легко и надежно разде лить свободные и сопряженные кислоты при незначительном ко личестве исследуемого материала.

Для собственно клинического рутинного определения желч ных кислот в желчи, в содержимом двенадцатиперстной кишки или в сыворотке крови удобно пользоваться методом Вагнера и Фроша [29].

Качественная двумерная хроматография желчных кислот [29] Приготовление слоя. На стеклянные пластинки (20X20 см) наносят слой силикагеля G. Сушат сначала 30 мин при комнатной температуре, затем 60 мин при 100 "С.

Экстракция и нанесение проб. На стартовую точку в 3 см от крае» пла стинки в левом углу хроматограммы наносят пробу желчных кислот, получен 2.

Рис. 111. Двумерная хроматография желчных кислот [29].

Сорбент- силикагель G;

системы: первое направление — к-бутанол — уксусная кислота — во • да (10 1 1 ), второе направление — толуол — уксусная кислота —вода (7,5:12,5:1);

обна ружение- 50%-ная серная кислота и нагревание до 120 "С.

Специальная часть ную, например, экстракцией желчи или содержимого двенадцатиперстной кишкк этанолом. Необходимо позаботиться, чтобы диаметр нанесенного пятна не пре зышал 4 мм.

Хроматографирование. В первом направлении элюируют смесью к-бутанол— уксусная кислота — вода (10: 1 : 1) на расстояние 13 см от старта (около 5 ч при комнатной температуре). После высушивания в токе воздуха до исчезновения запаха к-бутанола во втором направлении элюируют смесью толуол — уксусная кислота — вода (7,5:12,5:1) на расстояние 14 см (около 2 ч). По окончании сушат при температуре 100 °С.

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают 50%-ным раствором хлорида сурьмы(Ш) в уксусной кислоте (Д 876) и нагревают в течение 5 мин при 90 °С.

Желчные кислоты образуют пятна, флуоресцирующие в ультрафиолетовом свете желтым, зеленым или голубым цветом При дневном свете пятна окрашены в цвета от розового до красно-фиолетового В содержимом двенадцатиперстной кишки главными составными частями являются тауро- и гликосопряженные холевой, дезоксихолевой и хенодезоксихолевой кислот. В некоторых случаях бы ли обнаружены и небольшие количества свободных кислот. В обеих применяе мых системах холестерин перемещается с фронтом растворителя (рис. 111).

Количественное определение желчных кислот описали Фрош и Вагнер [12]. Способ заключается в проведении одномерной хро матографии кислот на слое силикагеля G в смеси толуол — уксус ная кислота — вода ( 5 : 5 : 1 или 7,5 : 12,5 : 1). После обнаружения на контрольной полоске по обеим сторонам хроматограммы соот ветствующие зоны вырезают и после добавления 65%-ной серной кислоты проводят опектрофотометрическое определение. Для каж дой кислоты необходимо построить отдельный калибровочный график.

Обширные исследования хроматографического разделения целого ряда желчных кислот и их производных опубликовали Энерот [10] и Хара и Такеути [17]. Этому же вопросу посвящены статьи Госвами и сотр. [37], Икава и сотр. [44], Накагаки и сотр.

[47].

Количественное определение сопряженных желчных кислот в плазме крови по Фрошу [31] Приготовление слоя. Слой готовят из силикагеля G и сушат в течение ночи при комнатной температуре. Перед проведением определения пластинку очи щают восходящим методом в системе н-бутанол — уксусная кислота — вода (10:1:1).

Приготовление проб. 5 мл сыворотки смешивают с 50 мл абсолютного эта нола и кратковременно нагревают при температуре 70 "С. После охлаждения в течение 12 ч при —10°С осадок белков центрифугируют, промывают трижды по 10 мл 70%-ного горячего этанола и после фильтрования соединенные фильт раты выпаривают в вакууме при температуре 60 °С досуха. Если при выпари вании образуется большое количество пены, ее устраняют добавлением несколь ких капель абсолютного этанола. Остаток экстрагируют четырежды по 4 мл абсолютного этанола, перемешивая стеклянной палочкой. При этом желчные кислоты растворяются, тогда как неорганические соли остаются в осадке. Объ единенные вытяжки переносят в колбу на 100 мл и этанол отгоняют в вакууме.

Остаток снова экстрагируют 4 раза по 5 мл 50%-ного этанола. Полученный* раствор экстрагируют в делительной воронке сначала 10 мл эфира, затем 10 млс «^гептана. Верхний слой отделяют, а нижний экстрагируют дважды по 20 млг верхней фазы смеси эфир — к-гептан — абсолютный этанол—вода ( 1 : 1 : 1 : 1 ).

37— 558 Специальная часть Снова отделяют верхний слой. Нижний водно-спиртовой слой выпаривают в ва кууме досуха и остаток растворяют \в 1 мл абсолютного этанола.

Хроматографирование. На приготовленный слой силикагеля на расстоянии 2 см от края пластинки наносят 0,05—0,1 мл этанольного раствора желчных кислот в форме полоски 1,5 см. На эту же пластинку подобным же способом наносят эталонную смесь кислот таурохолевой, тауродезоюсихолевой, гликохоле вой, гликодезоксихолевой и гликохенодезоксихолевой. Хроматографируют вос ходящим способом в системе м-бутанол—уксусная кислота — вода ( 1 0 : 1 : 1 ) в течение 3,5—4 ч, причем фронт растворителя продвигается приблизительно на 16 см от линии старта.

После высушивания хроматограммы на воздухе части слоя, содержащие исследуемый образец плазмы, осторожно закрывают, например, стеклянной пла стинкой, а часть с эталонами открывают, опрыскивая 25%-ным спиртовым рас твором фосфорномолибденовой кислоты. При осторожном нагревании до 90 "С места хроматограммы, содержащие желчные кислоты, окрашиваются в синий цвет на желто-зеленом фоне.

Количественное определение. В зависимости от положения обнаруженных на контрольных полосах пятен вырезают, например лезвием безопасной бритвы, зоны, соответствующие желчным кислотам, и проводят определение, как описы вается далее.

Определение гликодезоксихолевой и тауродезоксихолевой кислот Вырезанное пятно сар-бента переносят в центрифужную пробирку, прибав ляют 3 мл реактива (34 мл разбавленной равным объемом дистиллированной воды серной кислоты и 1 мл салицилового альдегида;

реактив должен быть всегда свежеприготовленным) и после осторожного перемешивания содержимое нагревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 40 °С. Затем до бавляют 20 мл уксусной кислоты и немедленно центрифугируют (15 мин при 3000 об/мин). Жидкость сливают и фотометрируют при 720 нм параллельно с холостым опытам, который проводят с равным по площади количеством свобод ного сорбента (приблизительно с тем же значением RF). Интенсивность окра шивания измеряют через 20 мин после прибавления уксусной кислоты.


Определение гликохолевой и таурохолевой кислот Участки сорбента с пятнами, соответствующие указанным кислотам, пере носят в центрифужные пробирки и после прибавления 3 мл 65%-ной серной кислоты нагревают при 60 °С в течение 60 мин. Затем центрифугируют (20 мин при скорости 3000 об/мин) и прозрачную желто-зеленую жидкость фотометриру ют при длине волны 386 нм параллельно с холостым опытом (см. выше).

Определение гликохенодезоксихолевой и таурохенодезоксихолевой кислот К. вырезанным участкам сорбента с пятнами в центрифужных пробирках прибавляют по 2 мл свежеприготовленной смеси этилацетат — серная кислота (15: 1). После тщательного перемешивания стеклянной палочкой оставляют сто ять на 15 мин при комнатной температуре, затем в течение 15 мин центрифу гируют при скорости 3000 об/мин.

1 мл прозрачной жидкости осторожно переносят в пробирку и при переме шивании прибавляют 0,7 мл уксусного ангидрида. Фотометрируют через 15 мин (таурохенодезоксихолевая кислота) и через 60 мин (гликохенодезоксихолевая кислота) после прибавления уксусного ангидрида при длине волны 420 нм, срав нивая с холостым опытом.

Концентрацию каждой кислоты рассчитывают по калибровочной кривой.

Специальная часть Количественное определение желчных кислот по Иствуду и сотр. [9] Приготовление слоя. Слой (0,6 мм) готовят из силикагеля G. Сушат в те чение 2—3 ч при комнатной температуре и сохраняют в эксикаторе. Перед упот реблением активируют в течение 30 мин при 100 °С.

Приготовление проб. Сыворотка. 1—2 мл сыворотки экстрагируют пятикрат ным объемом пропанола-2 в течение 30 мин при 65 °С с обратным холодильни ком. Затем центрифугируют (10 мин при 3000 об/мин), жидкость сливают и оса док белковых веществ дважды экстрагируют одно- или двукратным объемом пропанола-2. Объединенные вытяжки выпаривают досуха в токе азота и оста ток растворяют в 10 мл 2,5 М NaOH. Из полученного таким образом раствора неполярные липиды удаляют экстракцией 3 объемами петролейного эфира (т. кип. 60—80 °С). Сопряженные желчные кислоты подвергают гидролизу в течение 3 ч при температуре 110°С;

после подкисления гидролизата 1 н. НС до рН 4 экстракцией петролейным эфиром удаляют остаточные липиды. Желч ные кислоты экстрагируют затем трижды равными объемами свежеперетнанного эфира. Эфирный раствор промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, снова выпаривают досуха в токе азота и растворяют остаток в малом объеме этанола. Этот раствор наносят в форме полоски на подготовленную пластинку.

Содержимое двенадцатиперстной кишки. 1—2 мл материала экстрагируют при комнатной температуре 9 объемами смеси хлороформ — метанол (9:1) и осажденные белки отфильтровывают. Наносят соответствующую часть фильт рата.

Хроматографирование. Пластинку сначала элюируют смесью хлороформ — метанол (9:1) для удаления возможных загрязнений. После высушивания при комнатной температуре проводят разделение свободных желчных кислот систе мой изооктан — этилацетат — уксусная кислота ( 1 0 : 1 0 : 2 ), а сопряженные кис лоты в смеси амилацетат — н-пропа»ол— пропионовая кислота — вода ( 2 0 : 1 0 :

: 15:8).

Обнаружение. После сушки хроматограмму опрыскивают 0,05%-ным раство ром пирена в петролейном эфире (т. кий. 60—80 °С) и наблюдают пятна при длине волны 350 нм.

Количественное определение. Пятна слегка очерчивают острой иглой и ре актив удаляют элюированием смесью хлороформ — иетролейный эфир (т. кип.

60—80 °С) ( 9 : 1 ). Параллельно с исследуемыми пробами хроматографнруют также эталоны. Очерченные пятна соскабливают и переносят в центрифужные пробирки. Аналогично проводят холостой опыт.

К каждой пробе прибавляют по 5 мл 70%-ной серной кислоты, содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин при 42±2°С. Затем прибавля ют по 1 мл 0,25%-ного раствора фурфурола, хорошо перемешивают и оставля ют на 60 мин при комнатной температуре. После центрифугирования (25 мин при скорости 3500 об/мин) осторожно отбирают жидкость пипеткой и спустя 90 мин после прибавления фурфурола измеряют интенсивность окрашивания при 510 нм.

Количества свободных и сопряженных желчных кислот рассчитывают по калибровочным кривым, которые строят по данным, полученным аналогичным образом с эталонами.

Хроматографией свободных и сопряженных желчных кислот занимались также Батта и сотр. i[34], Госвами и сотр. [38], Пармантье [48], Шавез [41].

6.7.3. Стероидные гормоны Определение стероидных гормонов, без сомнения, является одним из важнейших диагностических методов при обследовании состояний, вызываемых нарушениями метаболизма этих веществ.

560 Специальная часть Поскольку стало необходимым, чтобы клиническое определение «стероидов не ограничивалось только установлением их общего уровня в моче или крови, но и проводилось комплексное фракци онирование стероидов и их метаболитов, мы описываем в этом разделе некоторые методики тонкослойной хроматографии, мо гущие в известной степени удовлетворить клиническим требова ниям и возможностям клинических биохимических лабораторий.

Подбор, разумеется, не является исчерпывающим;

заинтересован ные лица найдут дальнейшую информацию в специальных моно графиях и оригинальных статьях.

Определение сопряженных стероидов по Эртелю и сотр. \[24] Приготовление слоя. 15 г целлюлозы MN 300 G DEAE или MN 300 G ECTEOLA (Macherey — Nagel) смешивают с 80 или соответственно 75 мл ди стиллированной воды. После нанесения слоя на пластинку оставляют на 2 ч при комнатной температуре, затем сушат 45 мин при 50 °С.

Хроматографирование. После нанесения пробы (25 мкг) хроматографируют я одной из следующих систем:

С1) 0,5 М ацетатный буферный раствор, рН 4,25;

С2) 0,5 М ацетатный буферный раствор, рН 4,75;

СЗ) 1 М ацетатный буферный раствор, рН 4,75;

С4) 1,5 М ацетатный буферный раствор, рН 5,0;

С5) проланол-2 — вода—муравьиная кислота ( 6 3 : 3 3 : 2 ) ;

С6) этанол — вода — уксусная кислота (80: 15:3);

С7) метанол — вода — уксусная кислота (75: 15: 10).

Обнаружение. После высушивания хроматограммы конъюгаты 17-кетосте роидов обнаруживают опрыскиванием реактивом Циммермана (2 объема 2% ного раствора л-динитробензола в 95%-ном этаноле и 1 объем 15%-ного рас твора КОН в 95%-ком этаноле) и нагревают до 75 °С. Д5-Зр-Оксистероиды об наруживают опрыскиванием смесью 1 части 95%-ного этанола и 2 частей кон центрированной серной кислоты.

Значения hRr сопряженных стероидов приведены в табл. 117 и 118.

Таблица Значения hRF производных стероидов на DEAE-целлюлозе [24] сз а CI С2 С4 С5 С Производное 7 Эстрон-сульфат 3 8 14 Дегидроэпиандростерон-сульфат 9 22 22 Андростерон-сульфат 15 33 Прегненолон-сульфат 17-Оксипрегненолон-сульфат 41 Дегидроэпиандростерон-глюкуронид 38 72 48 Андростерон-глюкуронид 62 45 45 Этиохоланолон-глюкуронид 40 75 Специальная часть Таблица Значения hRF производных стероидов на ECTEOLA-целлюлозе [24] сз Производное С4 С С5 С С С Эстрон-сульфат 7 54 8 23 Дегидроэпиандростерон-сульфат 14 15 79 Андростерон-сульфат 23 18 21 Прегненолон-сульфат 17-Оксипрегненолон-сульфат Дегидроэпиандростерон-глюкуронид 45 64 65 Андростерон-глюкуронид 72 49 91 Этиохоланолон-глюкуронид 47 67 65 Разделение сопряженных стероидов по Крепи, Жюда и Лашезу [6] Глюкурониды Приготовление слоя. К смеси силикагеля G и кремнезема G (кизельгур G) в отношении 1 : 9 прибавляют двойной объем дистиллированной воды и суспен зию наносят на стеклянные пластинки размером 20X20 см. Слой активируют при 105 °С 30 мин и сохраняют в эксикаторе.

Хроматографирование. После нанесения проб (старт 1,5 см от края пла стинки, диаметр пятна 3 мм) хроматограмму выдерживают 90 мин в камере, насыщенной парами водной фазы системы толуол — грег-бутанол — уксусная кислота — вода (82: 1 8 : 3 0 : 7 0 ). После этого хроматографируют в органическом слое этой системы до расстояния 15 см при комнатной температуре, затем су шат на воздухе и элюируют во втором направлении этой же смесью в течение 90 мин при 45 °С (фронт 15 см). После высушивания проводят обнаружение.

Обнаружение. Сухую хроматограмму опрыскивают реактивом Д 171. Пятна глкжуронидов — фиолетовые на желтом фоне. Тон окрашивания быстро меня ется и при сушке хроматограммы переходит в зеленый. Чувствительность реак ции 1—2 мкг (табл. 119).

Таблица Значения hRF глюкуронидов стероидных гормонов [6] Направление Производное первое второе 5х-Прегнан-За-ил-20-она 47 5Р-Прегнан-За-ил-20-она 38 5а-Прегнан-За-ил-20-ола 32 5Р-Прегнан-За-ил-20-ола 24 562 Специальная часть Сульфаты Приготовление слоя. Слой готовят, как и для хроматографии глкжуронидов из смеси сорбентов 1:9 (I) или 1 : 19 (II).

Хроматографирование. Для слоев, приготовленных из сорбентов в отноше нии 1:9, пользуются системой бутилацетат — толуол — 4 н. раствор аммиака— метанол ( 1 1 : 9 : 1 2 : 1 6 или 8,5:3,5:5:7) для слоев из сорбентов в отношении 1 : 19. Сначала проводят насыщение камеры парами водной фазы указанных систем (в течение 2 ч). Затем пластинку сразу переносят в камеру, содержа щую органическую фазу, и элюируют до расстояния 15 см.

Обнаружение. После сушки на воздухе сульфаты обнаруживают опрыски ванием раствором метиленового синего (Д 144). Окрашивание устойчиво в те чение нескольких часов. Чувствительность 1—2 мкг (табл. 120).

Таблица Подвижность сульфатов стероидных гормонов [6] Подвижность, см Окрашивание метиленовым Производное синим (Д 144) I И Дегидроэпиандростерон-сульфат Розовое 8,5 5, Андростерон-сульфат Синее 8,2 5, Розово-оранжевое Эпиандростерон-сульфат 8,7 5, Андростендиол-сульфат Розовое 3, 6, Андростандиол-сульфат Фиолетовое 7,6 4, Двумерная хроматография 17-кетостероидов по Хамману и Мартину [16] (см. также [33, 36, 43, 54]) Приготовление слоя. 30 г окиси алюминия G (Merck) смешивают с 50 мл дистиллированной воды. Суспензию наносят на пластинки размером 20X20 см;


слой сушат 30 мин при комнатной температуре и 60 мин при ПО "С. Сохраня ют в эксикаторе.

Приготовление пробы. 25—30 мл образца суточной мочи, содержащих 50— 200 мкг общих нейтральных 17-кетостероидов, гидролизуют р-глкжуронидазой.

Освобожденные стероиды экстрагируют 4 объемами метиленхлорида. Вытяжку промывают 1/5 по объему 0,1 н. NaOH в 25%-ном хлориде натрия и далее 1/ объема 0,02 н. уксусной кислоты. После высушивания безводным сульфатом натрия фильтруют и выпаривают досуха. После ферментативного гидролиза проводят еще кислотный гидролиз и свободные стероиды экстрагируют подоб ным же образом.

Хроматографирование. Аликвотную часть этанольного раствора остатка по сле упаривания растворителя, содержащего 20—75 мкг 17-кетостероидов, нано сят на старт в углу пластинки на расстоянии 2 см от краев. Эталонный раствор, содержащий 5 мкг андростерона, этиохоланолона, дегидроэлиандростерона, 11 кетоэтиохоланолона, 11-оксиэтиохоланолона и 11-оксиандростерона, наносят в правый нижний и левый верхний углы пластинки. Размер пятен не должен пре вышать 5 мм. Этим же способом готовят вторую хроматограмму для количест венного определения. В первом направлении хроматографируют в 3,5%-ном растворе метанола в бензоле до расстояния 16 см. После высушивания на воз духе в течение 10 мин элюируют во втором направлении смесью эфир — этил ацетат (1:1) на расстояние 16 см. Системы следует менять после 12 опреде лений (рис 112) Специальная часть Обнаружение. Хроматограмму, предназначенную для обнаружения 17-кето стеровдов, опрыскивают реактивом Циммермана (Д 45) и идентифицируют стероиды по эталонам. Пластинку, предназначенную для количественного опре деления, накрывают, например, целлулоидной пленкой и проводят детектирова ние только по краям, где были нанесены эталоны. Потом пластинку приклады вают к первой хроматограмме и на просвет очерчивают обнаруженные пятна.

[ 1.

Рис. 112. Двумерная хроматография 17-ке- *:

тостероидов [16]. • Сорбент: окись алюминия;

системы: первое на правление— бензол — метанол (66,5:3,5), второе •б \ направление — эфир — этилацетат (1:1);

обнару жение: реактив Циммермана.

I — 4-андростендион;

2 — андростандион;

3 — ан- Старт дростерон;

4 — дегидроэпиандростерон;

5 — этио коланолон;

5—11-оксиандростерон;

7—11-кето этиохоланолон, 8 — 11-оксиэтиохоланолон г..

Этот способ позволяет их точно локализовать. Отмеченные пятна соскаблива ют и элюируют пять раз по 5 мл абсолютного этанола После фильтрования выпаривают досуха, прибавляют 2 мл метиленхлорида и проводят реакцию с реактивом Циммермана. Полнота экстракции колеблется в пределах 80,8—99,3% (табл. 121).

Таблица Значения IIRF 17-кетостероидов [16] Направление Стероид Обозначение первое второе Андростендион 4-АД 69 Андростандион 74 АД А Андростерон 49 Дегидроэпиандростерон 42 ДГЭА 41 44 ЭА Эпиандростерон 37 Э Этиохоланолон 11-Оксиандростерон 26 30 П-ОА п-кэ 11-Кетоэтиохоланолон 11 -Оксиэтиохоланолон 14 11-ОЭ Разделение 2,4-динитрофенилгидразонов 17-кетпстсроидов по Хаклю '[/5] Приготовление слоя. Слой готовят из суспензии силикагеля G и силикагеля HF254-366 (Merck) в отношении 3 : 1 в воде. Сушат в течение ночи при комнат ной температуре.

Специальная часть Рис. 113. Двумерная хроматография 2,4-динитрофенилгидразонов 17-кетостерои дов [15].

Сорбент: силикагель G+силикагель HFJ 5 4-«M (Merck);

системы: первое направление — эфир — петролейный эфир (7:3), второе направление — хлороформ — ацетон (92:8);

обнаружение:

в ультрафиолетовой свете при 366 нм.

/ — дегидроэпиандростерон;

2 — андростерон;

3 — этиохоланолон;

4— 11-оксиандростерон;

5— 11-оксиэтиохоланолон;

6— 11-кетоандростерон;

7 — 11-кетоэтиохоланолон.

Приготовление пробы. 2,4-Динитрофенилгидразоны 17-кетостероидов получа ют по Трайберу и Эртелю [28].

Хроматографирование. Раствор производных наносят на хроматограмму (при одномерном элюировании на расстояние 3 см, при двумерном — 2 см от края пластинки). Проводят двукратное хроматографирование в смеси эфир — петролейный эфир (7: 3) на расстояние 16 ом от старта. После первого этапа хроматограмму сушат 5 мин в токе холодного воздуха и 5 мин при комнат ной температуре. Разделение проводят в камере, насыщенной парами применяе мой системы растворителей, в течение 3 ч перед хроматографией.

Таблица Значения hRF 2,4-динитрофенилгидразонов 17-кетостероидов {15] hRF hRp Стероид Стероид Дегидроэпиандростерон 11-Оксиэтиохоланолон 11-Оксоандростерон Андростерон 11 -Оксоэтиохоланолон Этиохоланолон 38 2,4-Динитрофенилгидра 11-Оксиандростерон зин Специальная часть Обнаружение. После сушки хроматограммы пягна наблюдают в ультрафио летовом свете при длине волны 366 нм (темные пятна на светлом фоне).

Двумерное хроматографирование. В первом направлении двукратно элюи руют смесью эфир — петролейный эфир (7:3) и во втором — смесью хлоро форм—ацетон (92:8) (рис. 113 и табл. 122).

Количественное определение 2,4-динитрофенилгидразонов кетостероидов по Кенту и Равичу [19] Приготовление слоя. Слой (18X18 см) готовят обычным образом из водной суспензии силикагеля G;

активируют 60 мин при 110°С.

Хроматографирование. 0,5—4 мкг гидразонов кетостероидов наносят на рас стоянии 3 см от края пластинки и элюируют смесью этилацетат — я-гексан (15:

:85), пока фронт растворителя не достигнет 5 см от верхнего края пластинки.

Обнаружение. Производные дают темные пятна при ультрафиолетовом осве щении (390 нм).

Количественное определение. После соскабливания слоя сорбента с пятнами его суспендируют в 2 мл абсолютного этанола. После центрифугирования экст ракцию повторяют и объединенные элюаты выпаривают в токе азота при тем пературе 37 °С. Остаток растворяют в 1,5 мл свежелерегнанного хлороформа и фотометрируют при 390 нм.

Количество кетостероидов в анализируемой пробе рассчитывают по кали бровочной кривой, построенной для 2,4-динитрофенилгидразона тестостерона при концентрации в пределах 0,5—5 мкг.

Количественное определение кортикостероидов по Брейнфельсу [4] Приготовление слоя. Слой приготовляют из суспензии силикагеля G в воде, к которой добавляют 3% флуоресцентного индикатора (зеленый S5/1 фирмы Leuchtstoffwerk GmbH, Vertriebsgesellschaft, Гейдельберг, ФРГ).

Хроматографирование. После нанесения проб и эталонов стероидов хромато графируют 8%-ным раствором этанола в хлороформе в течение 60 мин при температуре 38,5 "С.

Значения hR?: альдостерон 37, гидрокортизон 25, кортизон 50, кортикосте рон 62.

Обнаружение. Пятна кортикостероидов обнаруживают в ультрафиолетовом свете. Эстрон и эстрадиол могут быть обнаружены даже спустя 24 ч Количественное определение. После обнаружения сорбент с пятнами альдо стерона переносят в центрифужные пробирки. После добавления 1 мл концент рированной серной кислоты содержимое основательно перемешивают и оставля ют стоять 60 мин при комнатной температуре. Сорбент центрифугируют и про бирку нагревают в течение 60 мин на масляной бане при 100 °С. При охлажде нии во льду измеряют интенсивное!i флуоресценции.

Гидрокортизон и кортико'Стором определяют после элюирования смесью эта нола и серной кислоты.

Удобство описанного метода заключается в быстром опреде лении кортикостероидов на основе чрезвычайно чувствительной реакции (надежно можно определить 0,5—4 мкг альдостерона).

В то же время нет необходимости удалять из гидролизата мочи эстрогены, так как они хорошо отделяются от альдостерона и при определении гидрокортизона также не мешают. Степень экс тракции составляет 95 ±3,4%- Определение кортикостерона в плазме описывают Сегура и сотр. [51].

566 Специальная часть Количественное определение альдостерона в моче ' по Гердесу и Штайбу [13] Приготовление слоя. 3,5 г силикагеля HF254 (Merck) смешивают с разбав ленным водой (9:1) этанолом и наносят на пластинки размером 10X12 см.

Приготовление вытяжки из мочи. Одну десятую суточного образца мочи (минимум 100 мл) подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1, оставляют стоять 24 ч при 20 °С, затем трижды экстрагируют метиленхлоридом (1/3 от объема мочи) в течение 3 мин при механическом перемешивании. Соеди ненные вытяжки промывают до нейтральной реакции 1/10 по объему 0,5 н.

NaOH и такими же по объему количествами 0,5 н. уксусной кислоты и воды.

Вытяжку сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха. Остаток растворяют в 1,5 мл 96%-ного этанола, прибавляют 5 мл воды и экстрагируют 20 мл циклогексана. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют 40 мл метиленхлорида. После его выпаривания остаток снова растворяют в ми нимальном количестве этого же растворителя.

Хроматографирование. На старт на расстоянии 2 см от нижнего края пла стинки количественно наносят раствор в форме полоски 2 см. По обеим сторо нам исследуемой пробы наносят эталонный раствор альдостерона (3 мкг).

Элюируют смесью хлороформ — этанол ( 9 : 1 ). После детектирования в ультра фиолетовом свете пятен альдостерона его вымывают из сорбента в центрифуж ной пробирке трижды по 2 мл метанола. После центрифугирования жидкость переливают в центрифужную пробирку на 10 мл, растворитель выпаривают и к остатку прибавляют 0,03 мл уксусного ангидрида, 0,17 мл бензола и 0,025 мл пиридина и оставляют стоять 24 ч при 37 °С. После добавления 0,5 мл 25%-ного этанола и 5 мл четыреххлористото углерода основательно перемешивают и сно ва центрифугируют. Верхний водный слой отделяют и всю операцию повторяют.

Четыреххлористый углерод выпаривают и остаток растворяют в метиленхлори де. После нанесения этого раствора на пластинку проводят разделение в систе ме циклогексан — хлороформ — уксусная кислота ( 4 : 5 : 1 ). Пятна диацетата альдостерона идентифицируют сравнением с эталоном и элюируют 6 мл мета нола. Далее поступают, как описано выше при экстракции метанолом. Пятна диацетата альдостерона повторно хроматографируют в смеси хлороформ — эта нол (90:1). После соскабливания пятен анализируемой пробы диацетата аль достерона, холостого опыта и двух одновременно хроматографированных этало нов (1 и 3 мкг) проводят реакцию с 3 мл смеси концентрированная серная кис лота— абсолютный этанол (3:1) с последующим нагреванием при температуре 75 °С в течение 5 мин. После охлаждения до комнатной температуры центрифу гируют. Прозрачную жидкость фотометрируют при 405 и 436 нм с вторичным фильтром 500—3000 нм, сравнивая с холостым опытом.

Этому же вопросу посвящены статьи Геркнера и сотр. [40], Челноковой и сотр. [42], а также Леунга и сотр. [46].

Количественное определение кортизола (гидрокортизона) в моче по Гердесу и Штайбу [14] Приготовление слоя — как в предыдущей методике.

Приготовление вытяжки из мочи. 10 мл мочи нейтрализуют до рН 7. Экст рагируют петролейным эфиром, затем метиленхлоридом (60 мл, 10-минутное взбалтывание). Водную фазу отделяют, органический слой промывают 5 мл 0,1 н. NaOH, 5 мл 0,1 н. уксусной кислоты и 5 мл воды. После высушивания с 1 г безводного сульфата натрия фильтруют через пористый стеклянный фильтр G3 и по окончании промывания выпаривают 5 мл вытяжки.

Хроматографирование. Остаток после выпаривания растворяют в метилен хлориде и наносят на пластинку в трех точках (3X50 мкл). Между пятнами исследуемого образца наносят эталонный раствор кортизола (5 мкг). Элюируют диукратно в смеси хлороформ — этанол ( 9 : 1 ). После первого этапа 2—3 мин iiir при комнатной температуре.

Специальная часть Детектирование. Пятна обнаруживают в ультрафиолетовом свете.

Количественное определение. После переноса пятен исследуемого образца, холостого опыта и эталона в центрифужные пробирки объемом 15 мл их дву кратно промывают по 1,5 мл 50%-ного метанола. Объединенные вытяжки экст рагируют в пробирках объемам 10 мл с притертой пробкой с помощью 6 мл метиленхлорида;

после центрифугирования в течение 1 мин при скорости 3000 об/мин верхний слой отделяют и дихлорметановую фазу взбалтывают 2 мин со смесью концентрированной серной кислоты и этанола ( 3 : 1 ). После инкуба ции при 22 °С в течение 15 мин и последующего охлаждения ледяной водой верхний слой отделяют и интенсивность флуоресценции нижнего слоя измеряют при длине волны 436 нм, учитывая результат холостого опыта.

Количество кортизола рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по эталонным растворам кортизола обычным способам в интервале 0,2—4 мкг.

В статье Станчаковой [52] описано разделение свободного кортизола, кор тизона и их сульфатов на готовых пластинках силуфол.

Количественное определение тестостерона в моче по Середаю и Заксу [25] Приготовление слоя. Слой готовят обычным способом из водной суспензии силикагеля G (толщина слоя 0,3 мм).

Приготовление вытяжки из мочи. 100 мл мочи очищают двукратным извле чением эфиром, вносят р-глюкуронидазу и инкубируют в течение 48 ч при 37 °С (рН 4,6). Гидролизат трижды извлекают равными объемами эфира. Соединен ные вытяжки концентрируют и промывают 1 н. NaOH и водой. После выпари вания остаток растворяют в 0,1 мл этанола и прибавляют 0,2 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина (20 мг растворяют в 10 мл этанола и прибавляют 0,15 мл концентрированной соляной кислоты). После 15-минутного нагревания на водяной бане при 60 °С реакционную смесь выпаривают досуха и остаток растворяют в хлороформе.

Хроматографирование. Раствор гидразона в хлороформе наносят на пластин ку одновременно с эталонными образцами гидразонов тестостерона и этиохола нолона и элюируют смесью хлороформ — ацетон (9: 1).

Количественное определение. Желтые пятна гидразона тестостерона перено сят в центрифужные пробирки, заливают 1 мл хлороформа, перемешивают и центрифугируют. Окрашенную жидкость фотометрируют при 410 нм и сравни вают с холостым опытом.

Если пятна недостаточно четко разделены, необходимо повторное хрома тографирование.

Количественное определение прегнандиола в моче по Бангу [3] (см. также [35]) Приготовление слоя. Слой готовят обычным образом из силикагеля G Приготовление пробы 100 мл мочи (возможно и меньшее количество в за висимости от концентрации прегнандиола) гидролизуют соляной кислотой (10 мл) в течение '10 мин при 90 °С на водяной бане и по охлаждении проточ ной водой экстрагируют в делительной воронке 3 раза по 125 мл циклогексана.

Соединенные вытяжки промывают дважды по 100 мл 1 н. NaOH, затем дваж ды по 150 мл дистиллированной воды и сушат безводный сульфатом натрия.

Растворитель отгоняют в вакууме при 40 СС досуха и остаток растворяют в 0,5 мл хлороформа.

Хроматографирование. 50 мкл раствора наносят на пластинку;

одновремен но хроматографируют и эталоны (например, 30 и 50 мкл 0,1%-ного раствора прегнандиола в хлороформе). Элюируют смесью хлороформ — ацетон (9:1) до расстояния 10 см и высушивают хроматограмму.

Обнаружение. Храматограмму слегка увлажняют дистиллированной водой, очерчивают пятна и снова сушат.

568 Специальная часть Количественное определение. Пятна переносят в центрифужные пробирки и прибавляют по 3 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое перемеши вают, после 10-минутного стояния при комнатной температуре центрифугируют и жидкость фотометрируют при 430 нм. Холостой опыт проводят с пятном си ликагеля равной площади. Эталоны определяют таким же способом, как и ис следуемую пробу. Окрашивание устойчиво в течение 40 мин после прибавления серной кислоты;

калибровочная кривая линейна в интервале 20—120 мкг прег нандиола.

Разделение сопряженных эстрогенов по Крокеру и Лоджу [7] Приготовление слоя. Слой готовят из суспензии 40 г силикагеля G в 100 мл 15%-ного водного раствора AgNOe. Сушат в темноте при комнатной температуре и сохраняют в эксикаторе.

Хроматографирование. 4—5 миг конъюгатов в форме водного раствора на носят в виде полосок на старт и четырежды элюируют на расстояние 15 см (•после каждого хроматографирования пластинку сушат при комнатной темпера туре) в смеси изооктан — хлороформ — этанол ( 4 0 : 7 0 : 1 8 ). Камеру необходимо насытить парами системы в течение не менее чем 1 ч перед проявлением (табл.

123).

Таблица Значения hRF сопряженных эстрогенов [7] hRF hRF Вещество8 Вещество Na-Эстрон-сульфат Na-a-Дигидроэквиленин сульфат Na-Эквиленин-сульфат Na-a-Дигидроэквилин Na-Эквилин-сульфат сульфат Na-a-Эстрадиол-сульфат Na-P-Эстрадиол-сульфат Na-ifJ-Дигидроэквилин сульфат а Свободные фенолы передвигаются практически с фронтом растворителя.

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают 50%-ной серной кислотой в этаноле и нагревают в течение 15 мин при 100 °С. Пятна окрашены в желто-ко ричневый цвет, за исключением а-эстрадиолсульфата, который образует розова то-коричневое окрашивание на почти бесцветном фоне.

Определение эстрогенов в моче по Луизи и сотр. [20] Приготовление слоя. Слой (20X20 см) готовят из суспензии силикагеля Q в дистиллированной воде.

Приготовление пробы. Мочу гидролизуют 10%-ной соляной кислотой при кипячении. Полученный гидролизат экстрагируют бензолом и после промывания бензольной вытяжки 9%-ным раствором NaHCO 3 эстрогены извлекают 2 н.

NaOH. После подкисления НС1 стероиды снова извлекают бензолом. После вы сушивания безводным сульфатом натрия и фильтрования растворитель выпари накм II остаток растворяют в абсолютном этаноле.

Специальная часть Хроматографирование. 0,5—5 мкг раствора эстрогенов наносят на пластинку на расстоянии 1,5 см от края. Хроматографирование ведут горизонтально в ка мере BN (разд. 3.1.2) (производство фирмы Desaga, Гейдельберг) в течение при близительно 20 мин в омеси циклогексан — этилацетаг (35 : 65).

Значения hRF: эстрон 87, 17|3-эстриол 73, 16-эпиэстриол 45, эстриол 17.

Обнаружение. После сушки на воздухе и 10 мин при 60 "С производят об наружение свежеприготовленным 0,5%-ны1М раствором 2,4-динитрофенилгидра зина в этаноле с добавлением 10% серной кислоты.

Определение эстрогенов в моче по Деттеру и сотр. [8] Приготовление слоя. Суспензию 50 г силикагеля G в 100 мл дистиллиро ванной воды наносят на стеклянные пластинки размерам 20X20 см. Сушат 30 мин при 105 °С или 24 ч при комнатной температуре.

Приготовление вытяжки из мочи. 100 мл мочи разбавляют 50 мл дистил лированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты и ки пятят с обратным холодильником 60 мин. Охлажденный гидролизат экстраги руют в делительной воронке трижды по 100 мл эфира (если образуется эмуль сия, ее разрушают, добавляя еще эфир или разбавляя водой).

Кислотную фракцию получают экстракцией объединенных эфирных вытяжек 50 мл насыщенного раствора №гСОз—NaHCO 3 (pH 10,5). Затем извлекают 10 мл 2 н. NaOH и 50 мл 8%-ного NaHCO 3. Эстрогены снова переходят в эфир, тогда как большая часть хромогенов остается в водном слое. Эфирный слой промывают 20 мл 8%-ного NaHCO 3 и 10 мл воды и после сушки безводным NajSCu выпаривают досуха. Остаток растворяют в 1 мл 90%-ного этанола, прибавляют 20 мл бензола и 20 мл петролейного эфира. Бензольно-петролейно эфирный слой взбалтывают трижды с 20 мл 1 н. NaOH. Нейтральные стероиды остаются в органическом слое. Водный слой подкисляют концентрированной НС1 и трижды экстрагируют по 50 мл эфира. После промывания 8%-ным NaHCO 3 и 10 мл воды снова сушат безводным сульфатом натрия и выпарива Таблица Значения hRF эстрогенов и окрашивание после реакции с фосфорной кислотой [8] сз Ьещество Флуоресценция С1 С2 С4 Н3РО Эстриол КрК-Ф Фиолетовая 16 23 50 ОКр От оранжевой 17|3-Эстрадиол до 38 48 желтой жо Эстрон Зелено-желтая 52 53 Обозначения:

С1 бензол — этанол (90 10), С2 бензол — уксусная ьиолог,! «ынол (87 i 10), СЗ хлороформ — уксусная кисло и ('10 10), С4 хлороформ — ацетон — укс с11.ш кислот,] (85 ЮГ), Сокращения:

КрК — красно-коричневая, Ф — фиолетовая;

О — оранжевая;

Кр — красная;



Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.