авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 4 ] --

3.2.1.2. Слои, импрегнированные химическими реагентами Химическое импрегнирование часто позволяет произвести раз деление смесей веществ, не поддающихся разделению обычными методами. Для разделения смесей веществ, отличающихся друг от друга наличием а-гликольной группировки или конфигурацией гидроксильных групп, применяют силикагель, импрегнированный Общая часть борной кислотой [136] или бурой (силикагель с борной кислотой был успешно использован при хроматографии карденолидов, разд. 5.6.4). Пластинки с импрегнированным силикагелем готовят, добавляя в суспензию водный раствор борной кислоты или буры.

Широко применяется хроматография на пластинках с силика гелем, импрегнированным азотнокислым серебром. Такие плас тинки используют для разделения веществ по степени ненасыщен ности. Ненасыщенные соединения связываются с ионами серебра координационными связями, благодаря чему адсорбируются проч нее, чем насыщенные вещества. Приготовленные пластинки следу ет хранить в темноте, а элюировать быстро и не на прямом солнеч ном свету. Для импрегнирования обычно используют 12,5%-ный раствор азотнокислого серебра [136]. Еще лучше использовать аммиачное азотнокислое серебро:

30 г силикагеля смешивают с 60 мл 12,5% -него раствора азотнокислого се ребра в 28—30%-ном гидрате окиси аммония [224]. Модифицированная методи ка импрегнирования силикагеля нитратом серебра описана в работе [274].

Прасад и сотр. [238] рекомендуют импрегнировать силикагель перхлоратом серебра, применение которого дает лучшие результа ты по сравнению с азотнокислым серебром. При этом способе слой силикагеля нецелесообразно закреплять гипсом, так как последний ухудшает разделение веществ.

15 г перхлората серебра растворяют в 23 мл дистиллированной воды. Рас твор постепенно разбавляют 250 мл ацетона при перемешивании в темноте. За тем к раствору при перемешивании добавляют 100 г силикагеля. После 15 мин отстаивания раствор отсасывают на фильтре в темноте Силикагель хранят в склянках из коричневого стекла. Приготовленные пластинки сушат 4 ч при ком натной температуре, затем активируют 2,5 ч нагреванием при 105 °С. После охлаждения в сухом воздухе пластинки готовы к употреблению.

Импрегнирование сорбента можно осуществить также опрыс киванием хроматографических пластинок раствором реагента или их погружением в раствор реагента. При анализе некоторых ве ществ, чувствительных к окислению кислородом воздуха (липиды), хроматографические пластинки можно стабилизировать, опрыскав их раствором антиокислителя [134]. Для этой цели применяют насыщенный раствор аскорбиновой кислоты в абсолютном этаноле {этот метод успешно использован при хроматографировании не которых нестабильных кортикоидов). После импрегнирования этим реагентом нельзя осуществлять обнаружение в УФ-свете [229].

Для разделения толуидинов применялся силикагель, импрегни рованный диазидо-1,Г-дисульфо-4,4'-стильбеном [247].

Импрегнирование хроматограмм химическими реагентами для обнаружения описано в разд. 2.6.

Приготовление пластинок с неполярной фазой, химически свя занной с силикагелем, описано в работе [260].

108 Общая часть 3.2.1.3. Хроматографические слои, импрегнированные неподвижной фазой Хотя при разделении методом тонкослойной хроматографии ис пользуется преимущественно адсорбционный принцип, встречается все большее количество работ по разделению в тонком слое на основе распределительной хроматографии. Этот способ пригоден, например, для разделения гомологов одного ряда. Большую об ласть применения этот метод имеет в химии липидов, а также используется с успехом для разделения жирных кислот, стеринов и т. д.

В распределительной хроматографии слой импрегнируют не подвижной фазой, а элюируют не смешивающейся с ней подвиж ной фазой. Неподвижная фаза может быть как полярной, так и неполярной. В качестве полярной неподвижной фазы при импрег нировании используют высшие гликоли, диметилформамид, форма мид и др. Пластинку со слоем носителя импрегнируют раствором неподвижной фазы в низкокипящем растворителе, играющем роль разбавителя. После импрегнирования растворитель испаряют с поверхности пластинки.

Для импрегнирования неполярной фазой чаще всего применяют высококипящие парафиновые углеводороды или их смеси (унде кан, тетрадекан, парафиновое масло, силиконовое масло и т. д.).

Импрегнирование хроматографического слоя можно осущест вить двумя способами. В первом из них хроматографическую плас тинку прямо погружают в раствор неподвижной фазы в низкоки пящем растворителе. Некоторые авторы считают этот способ не удовлетворительным, поскольку он не обеспечивает проникания раствора в поры сорбента, и при последующем элюировании хро матограммы неподвижная фаза может вымываться системой рас творителей. Согласно этим авторам, лучшие результаты дает им прегнирование раствором неподвижной фазы с использованием обычной техники хроматографирования. По-видимому, оба способа имеют одинаковое право на существование;

выбор между ними определяется типом используемого сорбента и его свойствами.

Для импрегнирования слоев применяют специальную камеру, удобную для погружения пластинок в раствор импрегнирующего вещества с максимальной осторожностью. Камера снабжена слив ной трубкой, соединенной с делительной воронкой. После поме щения хроматограммы в камеру нужный уровень раствора над слоем сорбента можно установить с помощью делительной воронки [172].

3.2.2. Клинообразные слои Клинообразные слои, в которых толщина слоя постепенно ме няется от старта к фронту, применяют в тех случаях, когда тре Общая часть буется отделить небольшое количество исследуемого менее поляр ного компонента смеси от большого количества нежелательных примесей, которые останутся в более толстом слое сорбента вбли зи старта. Пластинки такого типа применяли авторы работы [98] при изучении влияния толщины слоя на подвижность веществ. Для приготовления клинообразных слоев можно использовать модифи цированный аппликатор фирмы Desaga, нижняя грань которого Рис. 38. Подставка для приготовления хроматографических пластинок с пере менной толщиной слоя.

имеет клиновидный срез от 2 мм с одной стороны до 100 мкм — с другой [2]. Пластинки с переменной толщиной слоя можно при готовить также, используя подставку, изображенную на рис. 38;

после нанесения суспензии слой приглаживают ровной стеклянной пластинкой [12]. Применяют также рамку с подставкой, у которой можно менять высоту всех углов. Это устройство позволяет при готавливать слои произвольной толщины по всем четырем сторо нам. В рамку на подставку помещают стеклянную пластинку, заливают ее суспензией сорбента;

избыток суспензии удаляют стеклянной палочкой, перемещая ее по верхнему краю рамки [13].

3.2.3. Градиентные слои В некоторых специальных случаях разделения используют хро матографические слои с постепенно меняющимися свойствами. Так, например, для разделения некоторых алкалоидов и сапогенинов использовали хроматографические слои с постепенным повышени ем концентрации азотнокислого серебра от старта к фронту [161].

Сравнительно часто работают с так называемыми кислотно-основ ными слоями, у которых рН изменяется от 0 до 9. Это позволяет исследовать хроматографическое поведение веществ, имеющих со 110 Общая часть ответствующие значения рК [183]. Для приготовления слоев этого типа применяют модифицированный аппликатор фирмы Desaga под названием GM-Streicher nach Stahl [184]. Описаны также слои с непрерывно меняющейся активностью. Обзорная статья о градиентных слоях и способах их приготовления опубликована Шталем [182].

3.2.4. Слои, состоящие из нескольких сорбентов Сравнительно часто применяют хроматографию в тонких сло ях, приготовленных из двух или более сорбентов. Пластинки, на которых полосы отдельных сорбентов расположены продольно, т. е. от старта к фронту, используют для подбора оптимальной хроматографической системы для данной смеси веществ. Отдель ные полосы сорбентов отделяют друг от друга канавками, прове денными до самого стекла, потому что растворитель проходит через различные материалы с разной скоростью [122], Чаще при меняют пластинки с поперечным расположением слоев сорбентов.

В этом случае используют разные свойства различных сорбентов, способствующие улучшению качества разделения веществ. Для быстрого нанесения сравнительно большого количества смеси ве ществ, например при анализе нестойких соединений, можно ис пользовать следующий способ [138]:

Стеклянная пластинка длиной 20 см в нижней части (стартовая зона) по крыта слоем кизельгура длиной 4,5 см, за которым следовал 15,5 см слой сили кагеля. Поскольку кизельгур имеет малую адсорбционную способность, на него наносят быстро, не заботясь о тщательности, смесь веществ и производят прояв ление. Как только смесь достигает сильно адсорбирующего слоя силикагеля, она начинает разделяться на узкие, четко разграниченные полосы. Кизельгур, упот ребляемый для этой цели, предварительно промывают 18%-ной соляной кисло той, а затем водой для удаления железа и сульфата кальция.

Слои из двух или более сорбентов готовят с помощью модифи цированного аппликатора, производимого, например, фирмой De saga, резервуар которого снабжен перегородками, разграничива ющими объемы, которые заполняются суспензиями из отдельных сорбентов.

3.2.5. Цилиндрические слои Самым простым примером цилиндрических слоев являются слои, нанесенные на стеклянные палочки или на внутреннюю по верхность пробирок. Палочку окунают на несколько секунд в сус пензию сорбента или на короткое время заполняют суспензией пробирку, после чего лишнюю суспензию сливают, а оставшийся на стенках пробирки слой высушивают. В последнем случае про бирка одновременно служит и хроматографической камерой. На 11 Г Общая часть слой вблизи открытого конца пробирки наносят смесь веществ и опускают ее этим концом в растворитель [88, 148]. Так называе мые хроматографические трубки (chromatotubes) производит фир ма Desaga;

их длина 125 мм, диаметр 20—24 мм [120]. На по крытых силикагелем трубках длиной 33 см разделяли афлатоксины [127]. Слои наносят на хроматографические трубки с помощью специальных устройств [76].

Особый тип цилиндрических слоев был использован Ван Дей ком [208] для количественного и непрерывного элюирования с / подача сжатого газа \ а о Рис. 39. Устройство для непрерывного вымывания и сбора фракций.

J_— капилляр, покрытый слоем сорбента;

б — стеклянный прибор, в — рабочая схема устрой ства 1 — стеклянный капилляр, 2 — нанесенный слой, 3 — стеклянный пористый фильтр;

4 — стартовая линия с нанесенной смесью веществ;

5 — насадка для подачи сжатого газа;

6 — растворитель;

7 — разделенные зоны веществ;

8 — силиконовое уплотнение.

отбором элюата (НЭО — ТСХ) без повреждения слоя. Хро матографическую пластинку в этом случае заменяет специальный капилляр, покрытый сорбентом (рис. 39, а). Капилляр помещают в стеклянный прибор (рис. 39,6). На рис. 39, в изображена хро матограмма с разделенными зонами веществ. Растворитель под нимается по слою (возможно применение небольшого избыточного давления) и увлекает зоны веществ к верхней части капилляра, закрытой пористой стеклянной пластинкой. Как только раствори тель достигнет стеклянного фильтра, он начнет стекать вниз по внутренней поверхности капилляра и скапывать вместе с разде ленными веществами в приемники. Прибор снабжен сборником микрофракций. В этой же работе [208] аналогичный принцип осу ществлен на плоских пластинках, сужающихся кверху. При вос ходящем хроматографировании зоны веществ мигрируют вверх, 112 Общая часть подача сжатого газа К а 6 Рис. 40. Оборудование для работы с цилиндрическими слоями.

а — сосуд с отверстием;

б — нанесение раствора образца, в — проявление.

/ — сосуд для приготовления слоя;

2 — стеклянная палочка, 3 — резиновая пробка;

4 — от верстие в нижней части сосуда;

5 —нанесенный слой;

б — пипетка для введения раствора разделяемой смеси или растворителя;

7 — раствор образца разделяемой смеси, 8 — раство ритель.

достигая суженного конца слоя, откуда их отбирают через крышку камеры.

Другой вариант цилиндрических слоев изображен на рис. 40.

Специальной формы сосуд в нижней части снабжен отверстием.

Это отверстие закрывают резиновой пробкой, укрепленной на стек лянной палочке, и сосудик смачивают снаружи суспензией сор бента вплоть до начала расширения сосуда в его верхней части (а). После высушивания слоя в сосудик с помощью пипетки вво дят раствор разделяемой смеси и дают ей впитаться в слой при одновременном продувании инертным газом (б). Остатки образца смывают с внутренних стенок малым количеством растворителя, которому тоже дают впитаться в слой. При хроматографировании внутрь сосуда наливают растворитель, прекращают подачу инерт ного газа, а на дно камеры через нижнюю трубку вводят раство ритель, которым насыщают объем внешней камеры (в). Таким образом, образец разделяемой смеси наносится очень просто и без нарушения слоя. Растворитель можно упаривать в токе инертного газа [80].

Общая часть Специальная техника микроцилиндрической хроматографии опи сана в работе [242]. Стеклянную палочку диаметром около 0,6 мм покрывают слоем сорбента погружением в суспензию силикагеля в воде. На один конец палочки наносят смесь веществ (лучше все го флуоресцирующий краситель) и проявляют хроматограмму в маленькой пробирке. Этот способ позволяет определять до 10 пг вещества в виде компактной круговой зоны. Чувствительность можно повысить с помощью фотографической техники.

3.2.6. Рифленые слои В некоторых случаях применяют слои, разделенные продоль ными бороздами (царапинами) на ряд полос. На полученные та ким образом изолированные друг от друга полосы наносят от дельные вещества или смеси веществ;

при этом царапины в слое препятствуют диффузии пятен в стороны. Разграничивающие по лосы— канавки — наносят на слой вручную. Описаны также прос тые приспособления, облегчающие эту операцию. Одним из них является пластмассовая пластинка, положенная на стеклянные палочки. В пластинке имеются отверстия, в которые вставлены гвоздики острием наружу. Хроматографический слой подкладыва ют под эту пластинку, которую перемещают по направляющим стеклянным палочкам. При этом острия гвоздиков разрезают слой сорбента [213]. Для приготовления хроматографических пласти нок такого типа можно использовать также толстые рифленые стекла, предназначенные для застекления дверей.

3.2.7. Очень тонкие слои Недавно было опубликовано несколько работ, посвященных описанию предельного варианта хроматографии в тонких слоях.

Это так называемая хроматография в тонкой пленке. Подвижной фазой при этом служит тонкая пленка жидкости, которая проте кает через тонкий слой некоторых окисей (например, In 2 O 3 ), нанесенный на пластинку сублимированием в высоком вакууме.

Толщина слоя составляет около 1 мкм [39, 40]. На таких хрома тограммах можно определять субнанограммовые количества ве ществ. Помимо окиси индия, для приготовления таких пластинок используют окиси цинка, серебра, магния, алюминия [39], а также алюминиевую фольгу после анодного окисления [39, 118]. Мариан [130] описал следующий способ приготовления очень тонкого слоя силикагеля (6 мкм) (рис. 41):

В раствор силиката натрия (продажный силикат калия растворяют в из бытке гидрата окиси натрия) погружают обернутую на торец полого цилиндра полупроницаемую мембрану (целлофан), смоченную дистиллированной водой.

При этом раствор силиката смачивает только одну сторону мембраны (рис. 41).

8— 114 Общая часть Другую сторону мембраны в течение 5—10 с обрабатывают 4,5%-ным раствором соляной кислоты. На стороне целлофановой пленки, обращенной в сторону си ликатного раствора, сразу образуется тонкая пленка силикагеля. Мембрану с пленкой силикагеля промывают водой и спиртом, затем разрезают на полоски нужных размеров. Мембраны можно укрепить желатином или фиксировать на твердой бумаге. При хроматографическом разделении на таком слое длина про бега фронта растворителя составляет 2—3 см. На таких микрослоях хорошо разделяются некоторые стероиды и красители. Приготовление высокоэффектив ных пластинок с силикагелем описано также в работе [179].

Рис. 41. Схема приготовления очень тонкого слоя силикагеля.

/ — раствор силиката натрия;

2 — раствор соляной кислоты;

3 — целлофан.

Так называемая высокоэффективная микротонкослойная хро матография (ВМТСХ) [253, 256, 257, 261, 266, 267] проводится на фирменных слоях силикагеля толщиной 12 мкм. Вещества, погло щающие в видимой и ультрафиолето вой частях спектра, на таких пластин ках можно определять в количествах от 100 пг до 100 нг. Интервал опреде ления флуоресцирующих веществ со ставляет от 10 пг до 100 нг. Анализи руемые образцы наносят с помощью специального микрокапилляра таким образом, чтобы диаметр стартового пятна не превышал 1 мм [239].

3.2.8. Некоторые другие типы хроматографических слоев Слой в форме буквы Z изображен на рис. 42. С исходной хроматограм Рис. 42. Z-образный хромато- мы удаляют заштрихованную часть графический слой.

слоя, остается слой сорбента упомя нутой выше формы. Длина пробега растворителя на такой пластинке увеличивается. В суженных ме стах перегиба слоя движение пятен разделенных веществ ускоря ется, тем самым увеличивается расстояние между пятнами [49].

Общая часть Слои с желобком [34] используют для отделения полярных примесей от малого количества исследуемого вещества. Пластинки на месте стартовой линии имеют желобок (рис. 43, а). При при а б Рис. 43. Хроматографический слой с желобком.

а — пластинка для приготовления слоя;

б — проявление.

/ — хроматограмма;

2 — уровень растворителя.

готовлении слоя в этом месте образуется толстый слой сорбента, удерживающий балластные полярные вещества. Чтобы предот вратить образование широких полос веществ, поступают следую щим образом. f В камеру, имеющую в крыш ке щель, помещают хроматограм му. Растворитель поднимается по ШШШ пластинке до уровня щели, где начинает испаряться. При этом широкая зона вещества концент рируется и формируется в виде узкой полоски (рис. 43,6). Затем производят элюирование в обыч г":

ной камере.

Хроматографические слои с желобом применяют при выде лении пестицидов из большого объема биологического мате риала.

Микропластинки 3.3.

Для быстрого Хроматографи- р и с 44. Устройство для приготовле ческого анализа несложных сме- ния микропластинок.

сей веществ можно использовать МИКрОПЛаСТИНКИ, ПОЗВОЛЯЮЩИе хроматограмм;

4 - шпатель.

116 Общая часть экономить как время, так и хроматографический материал. Как правило, слой сорбента наносят на предметные стекла размером 25X75 мм. Слои наносят вручную или с помощью соответствую щих аппликаторов. Описано, например, приготовление слоев с по мощью подставки, к которой приклеены две алюминиемые план ки (рис. 44). Стеклянные пластинки вставляют между планками.

Слой сорбента разравнивают алюминиевым шпателем [112].

В другой работе [65] описано устройство, позволяющее за один прием приготовить 4 микропластинки размером 75X75 мм;

слой сорбента наносят латунным аппликатором, размеры и конструк ция которого приводятся в работе. Эти микропластинки использо вали для анализа пентагастрина. Анализ занимает 10 мин, в то время как хроматографирование на обычных пластинках длит ся 1 ч.

Для контроля за ходом разделения на колонке используют хроматографические пластинки размером 5X20 см, на которые можно наносить до 30 образцов. Камеру для проявления изготов ляют из трубки с заплавленным концом. Свободный конец камеры при проявлении хроматограммы закрывают алюминиевой фольгой [119]. Подробные методики работы с микропластинками описаны в публикации Бринкманна и Де Врие [28].

3.4. Приготовление производных.

Микрореакции в слое Часто возникает необходимость хроматографировать вещества в виде их производных. Известно, например, что соединения, име ющие одну и ту же полярную функциональную группу, но отли чающиеся друг от друга наличием менее полярных группировок, разделяются неудовлетворительно. Если с помощью подходящей химической реакции по месту функциональной группы получить менее полярное производное, то вклад оставшихся в молекуле менее полярных группировок в адсорбируемость этих соединений становится более ощутимым. Иногда анализ производных бывает полезен для предварительного выяснения характера исследуемых веществ, для сравнения их со стандартными образцами и т. д. По лучение соответствующих производных позволяет разделять ве щества, прямой анализ которых невозможен из-за их высокой ле тучести (низшие спирты, карбонильные соединения).

Производные можно получать до нанесения образца на хрома тограмму или непосредственно на хроматограмме.

3.4.1. Получение производных до проведения хроматографического разделения Для получения производных пригодны обычные химические реакции и методы. Часто используются микрореакции, позволяю щие работать с малыми количествами труднодоступного материа Общая часть ла. Приведенные ниже примеры иллюстрируют получение неко торых наиболее употребимых производных, хотя ни в коем слу чае не исчерпывают всего их многообразия.

Для отделения кетонов от веществ, не содержащих кетогруппу, кетоны переводят в соответствующие гидразоны [123, 124], хро матографическая подвижность которых отличается от исходных веществ.

К 2 мл смеси метанола и уксусной кислоты ( 3 : 1 ), содержащей 400 мг реа гента Т Жирардо (хлорид триметиламмонийацетгидразида), добавляют раствор, содержащий 1—20 мг смеси веществ. Реакционную смесь оставляют на ночь при 37 °С в атмосфере азота, затем упаривают в вакууме досуха;

остаток наносят на хроматограмму.

Летучие низшие спирты можно перевести в эфиры 3,5-динитро бензойной кислоты Спирты растворяют в эфире, смешивают с избытком 3,5-динитробензоилхло рида. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником 30 мин. Затем смесь выливают в воду, подщелачивают 5—10%-ным раствором едкого натра до рН 9—10 и отделяют органическую фазу. Водную фазу экстрагируют бензолом.

Объединенную органическую фазу промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия и отгоняют растворитель [61].

Следующая методика, разработанная для метода бумажной хроматографии, вполне применима для хроматографирования в тонких слоях 5—50 мг спирта растворяют в 5 мл бензола, к раствору добавляют 50 мг 3,5-динитробензоилхлорида и 0,3 мл пиридина. Смесь кипятят 1 ч, промывают 20%-ным раствором едкого натра, водой, 5%-ной серной кислотой п водой. Рас творитель упаривают [71].

Спирты можно перевести в трифторацетаты 0,2 мл 0,01—0,1%-ного раствора вещества в гексане или метиленхлориде смешивают с 2 мкл ангидрида трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь встряхивают 1 мин. Затем к смеси добавляют 1 мл 2 н. раствора карбоната нат рия и снова встряхивают. Органическую фазу наносят на пластинку.

Летучие карбонильные соединения можно перевести в практи чески нелетучие 2,4-динитрофенилгидразоны К не менее чем 2%-ному раствору вещества с карбонильной группой в соот ветствующем растворителе (растворителем не может служить ацетон или дру гой растворитель с карбонильной функцией) добавляют избыток раствора 2,4-ди нитрофенилгидразина в 2 н. НС1. Реакционную смесь оставляют стоять при ком натной температуре и после выпадения кристаллического гидразона кристаллы отделяют фильтрованием или центрифугированием и наносят на хроматограмму в виде раствора в смеси метанол — пиридин (10: 1) [71].

Описана также методика приготовления семикарбазонов низ ших карбонилсодержащих веществ в капилляре [106]. В капилля ре можно проводить и другие микрореакции (ацетилирование, восстановление комплексными гидридами и т. д.) [106].

118 Общая часть 3.4.2. Микрореакции на хроматограмме Вещества, имеющие одинаковую подвижность, но различаю щиеся наличием пространственно незатрудненной двойной связи, можно разделить в виде их бромпроизводных, имеющих другие значения RF- Бромирование двойной связи осуществляют добавле нием небольшого количества брома (~0,5% об.) к системе рас творителей. Эта методика была использована для разделения не которых так называемых критических пар стероидов [38], а также высших жирных кислот [111]. Другой вариант бромирования in situ заключается в следующем.

После нанесения анализируемого образца хроматограмму опрыскивают хло роформом и сразу помещают в закрытую камеру, в которой имеется 10%-ный раствор брома в хлороформе [57].

Хлорирование можно провести, выдержав хроматограмму с нанесенным об разцом ненасыщенных соединений в течение 20 мин в камере, заполненной хло ром [149].

Приготовление трифторацетатов спиртов На стартовое пятно нанесенного образца помещают каплю ангидрида три фторуксусной кислоты и высушивают, обдувая воздухом в течение нескольких минут [15].

Ацетилирование спиртов Хроматограмму с нанесенным образцом опрыскивают смесью ангидрид ук сусной кислоты — пиридин (1:1) и помещают в эксикатор, насыщенный парами ацетангидрида. Эксикатор обогревают снаружи инфракрасной лампой, чтобы температура внутри была 40 °С (1,5 ч). Затем стартовую зону греют дополни тельно несколько минут при 100°С [57].

Ацетилирование в более жестких условиях, необходимое, на пример, при этерификации пространственно затрудненных гидрок сильных групп, осуществляется следующим образом.

На стартовое пятно образца капают раствор плавленного ацетата натрия в смеси ацетангидрид — уксусная кислота ( 3 : 1 ), хроматограмму опрыскивают ацетангидридом и выдерживают в указанных выше условиях 3 ч при 50 °С [57].

Щелочной гидролиз сложных эфиров 7%-ный раствор карбоната калия в этаноле накапывают на старт, и после опрыскивания смесью метанол — вода (2:1) хроматограмму помещают в закры тую камеру, насыщенную парами смеси этанол — метанол — диоксан ( 2 : 2 : 0,5) и выдерживают в ней при 55 °С 4 ч. Затем хроматограмму высушивают при 100°С [57].

Смесь свободных жирных кислот переводят в смесь соответст вующих метиловых эфиров действием диазометана. Этот прием был использован при разделении образца стероидных кислот.

0,3 мл 40%-ного водного раствора едкого кали перемешивают с 1 мл эфира или петролейного эфира. При охлаждении льдом к смеси добавляют 100 мг нитрозометилмочевины. Диазометан, освобождающийся при разложении нитро Общая часть зометилмочевины, растворяется в органической фазе. Метанольный раствор об разца кислот смешивают с раствором диазометана в небольшой пробирке или наносят на хроматограмму: на еще влажное стартовое пятно последовательно прикапывают несколько капель раствора диазометана. Следует работать в вы тяжном шкафу и следить, чтобы поблизости не было открытого огня [173].

По другой методике хроматографический слой опрыскивают эфирным раствором диазометана [131].

Описано гидрирование ненасыщенных соединений при хрома тографировании на импрегнированных слоях.

Стартовую зону хроматографической пластинки шириной 1,5—2 см опрыс кивают 1—2%-ным раствором коллоидного палладия. Пластинку сушат 1 ч при повышенной температуре и дают остыть в эксикаторе. Часть слоя с катализато ром импрегнируют высококипящим растворителем. После нанесения образцов смеси на стартовую зону хроматограмму помещают в вакуумный эксикатор, ко торый после откачивания заполняют водородом. По истечении 1 ч остаток слоя импрегнируют тем же растворителем, затем хроматограмму проявляют подвиж ной фазой [111].

Применима и другая методика На стартовую полосу наносят 5%-ный раствор хлорида палладия или пла тины в 50%-ной соляной кислоте. Слой опрыскивают смесью 20 мл формальде гида и 80 мл 20%-ного раствора едкого кали, высушивают и опрыскивают 5%-ной уксусной кислотой. Затем опять высушивают (при 80 °С), на полосу вос становленного катализатора наносят смесь веществ, хроматограмму опрыскивают уксусной кислотой и выдерживают в эксикаторе, заполненном водородом, от до 72 ч [57].

Восстановление карбонильных соединений in situ описано Хам маном и Мартином i[75] Стартовую полосу два раза опрыскивают свежеприготовленной смесью оди наковых объемов 10%-ного раствора боргидрида натрия в этаноле и 0,1 н. рас твора едкого натра. Через 30 мин избыток реагента разлагают 25%-ной уксусной кислотой.

По другой методике поступают следующим образом Хроматографический слой опрыскивают 10%-ным раствором боргидрида нат рия в смеси метанол — вода (1 :5), потом метанолом и выдерживают 1,5 ч в со суде, насыщенном парами смеси этанол — метанол — диоксан ( 2 : 2 : 0, 5 ) при 55 °С '[57].

Окислительное расщепление ненасыщенных соединений соглас но методике [18] осуществляют следующим образом 10 мл водного раствора, который содержит 0,001 моля карбоната калия и 0,001 моля перманганата калия, смешивают с 10 мл водного раствора, содержа щего 0,001 моля периодата натрия. Приготовленную окислительную смесь с по мощью капилляра накапывают на пятно или полосу ненасыщенного вещества.

Пластинку нагревают до исчезновения розового окрашивания. Эту операцию повторяют 2—3 раза, пока не возникнет коричневое пятно, которое смачивают каплей 2 н. соляной кислоты.

Получение ацетонидов ^мс-гликольных группировок Пятно гликоля смачивают каплей сухого ацетона, содержащего 1 % концент рированной серной кислоты. Хроматограмму опрыскивают сухим ацетоном и вы держивают в парах 40%-ного раствора хлорсульфоновой кислоты в ацетоне [55].

120 Общая часть Получение 2,4-динитрофенилгидразонов карбонильных соедине ний Пятно вещества смачивают раствором 2,4-динитрофенилгидразина в уксусной кислоте. Слой опрыскивают уксусной кислотой и помещают в эксикатор над ук сусной кислотой, где выдерживают при 55 °С 1—1,5 ч [57].

В той же работе описаны нитрование, получение хлорангид ридов кислот, этерификация спиртов и расщепление веществ кис лотами. В другой работе [129] описано диазотирование в хрома тографическом слое.

Получение гидразонов Жирардо 0,1%-ный раствор реактива Т Жирардо в 10%-ном метанольном растворе уксусной кислоты наносят капилляром в виде пятна диаметром около 1,5 см.

Через 3 мин на это пятно наносят раствор исследуемой смеси веществ, хромато грамму выдерживают 15 мин в камере, насыщенной парами уксусной кислоты, а потом нагревают в течение 10 мин при 80 °С [124].

Уилк и сотр. [218] описали методику идентификации аромати ческих соединений, которая заключается в проведении нескольких реакций окисления различными реагентами непосредственно на хроматограмме. Обзорная статья о проведении химических реак ций в слое опубликована Далласом [45]. Следует упомянуть также о реакции в слое эпоксисоединений с фосфорной кислотой. Эта реакция используется для разделения пространственно-незатруд ненных эпоксидов (реакция проходит за 5 мин) от пространствен но-затрудненных эпаксисоединений, которые реагируют гораздо медленнее [20].

Описан также метод [236], разработанный для анализа стерои дов и некоторых антибиотиков. Вещества наносят на хроматограм му, осуществляют пиролиз этих веществ вместе со стандартными веществами (в случае стероидов хроматограмму нагревают в те чение 18 ч при 110°С), после охлаждения хроматограмму прояв ляют и обнаруживают. Этот метод применим для анализа многих сложных смесей.

3.4.3. Комбинированные методы РПР и ИР* Метод РПР (TRT Trennung-Reaktion-Trennung), называемый также диагональной техникой [70, 177, 179], пригоден для изуче ния изменений, вызываемых, например, термолизом, окислением, воздействием облучения и т. д. Смесь веществ наносят в левый нижний угол квадратного слоя и элюируют в одном направлении.

По окончании элюирования хроматограмму высушивают и левую * Комбинированные методы: разделение образца (получение производных на слое после первого разделения)—повторное разделение (РПР) и испарение — разделение (ИР). В последнем методе испаряют летучие компоненты образцов, наносят их на пластинку и разделяют. — Прим. ред.

Общая часть часть, на которой находятся разделенные вещества, и подвергают соответствующей обработке. Затем хроматограмму вторично элюи руют в той же системе растворителей, но в направлении, перпен дикулярном первому. Не из менившиеся после обработки ~~ вещества обнаруживаются пятнами, лежащими на пря мой, соединяющей стартовую точку с точкой пересечения фронтов обоих разделений.

Пятна, не лежащие на этой прямой, принадлежат продук там соответствующих реакций (рис. 45).

Метод ИР (TAS Thermo mikro-Abtrenn-und Applikati ons-verfahren)—новейший ме тод, предложенный Шталем 2-е наппавление [176, 180, 185, 187—189]. Он пригоден для анализа сложных Рис. 45. Хроматограмма, полученная диа гональным методом.

смесей (например, экстрактов биологического материала).

Метод часто позволяет избежать проведения длительной и трудоем кой экстракции природного материала и подготовки образца для нанесения на пластинку. Метод применяется для разделения ве ществ, которые при повышенной температуре представляют собой 3 5 б Рис. 46. Метод TAS.

/ — слой сорбента;

2 — нагревательный блок;

3 — стеклянная трубка;

4 — силиконовое уплот нение;

5 — нагреваемая смесь веществ;

6 — стекловата.

жидкость, имеющую достаточно высокую упругость паров. Смесь веществ (или непосредственно образец природного происхожде ния) нагревают в стеклянной трубке (рис. 46), конец которой вы тянут в капилляр, накрытый кусочком стекловаты. Капилляр поч ти касается старта хроматограммы. Нагревание проводят в метал лическом блоке. Вещества, испаряющиеся при нагревании, адсор бируются стартовой зоной хроматограммы. Метод позволяет так 122 Общая часть же отгонять вещество с паром (для этого в стеклянную трубку с помощью шприца вводят небольшое количество воды или другого растворителя или вносят некоторое количество силикагеля, смо ченного водой).

Недавно Шталь и Кариг [243] описали принцип термофракто графии (ТФГ). Соответствующий прибор производит фирма De saga под названием Tasomat. При работе методом термофракто графии на слой наносят жидкие продукты, тоже получаемые на греванием образца. Исследуемый образец нагревают ступенчато, например при 100, 150, 200 и 250 °С, причем при каждом новом повышении температуры хроматограмму перемещают в горизон тальном направлении на расстояние 1 см. Жидкие продукты тер мического разложения смеси наносятся, таким образом, на стар товую линию хроматограммы в виде ряда образцов. Старт имеет вид продолговатого пятна, в котором соединения с более низкой температурой кипения оказываются предварительно отделены от веществ с более высокой температурой кипения [246]. В работе [246] описан соответствующий прибор чехословацкого производ ства.

Описание последних двух методов имеется и в других работах [232, 244, 245, 273] и обзорных статьях [233, 235].

3.5. Препаративная хроматография в слоях сорбента* Параллельно с развитием аналитического метода хроматогра фии в тонком слое шла разработка применения этого метода в препаративных целях. Благодаря большим успехам, достигнутым в этой области, препаративная хроматография в слоях сорбента в настоящее время широко применяется в лабораториях для вы деления малых и средних количеств веществ из смесей. По срав нению с более привычной колоночной хроматографией техника разделения в слоях имеет два основных преимущества:

1. Разделение в слое происходит гораздо быстрее: если при менять заранее приготовленные пластинки, разделение смесей обычно реализуется в течение нескольких часов.

2. Разделение смесей происходит четче, поскольку влияние диф фузии сказывается в меньшей мере, чем при хроматографировании на сравнительно широком столбике сорбента.

Безусловно, хроматография в слое не позволяет разделять боль шие количества смесей. Однако при наличии соответствующего оборудования разделение смесей в количествах до нескольких * Хроматографию на препаративных пластинках, толщина слоя которых мо жет достигать и 5 мм, уже нельзя называть тонкослойной хроматографией. Не которые авторы даже употребляют термин «толстые слои».

Общая часть граммов, как правило, не является проблемой. Разделение неболь ших количеств смеси (примерно до 250 мг) можно осуществить на одной пластинке размером 20ХЮ0 см при толщине слоя 1 мм.

В настоящем разделе обсуждается главным образом выделение веществ в несколько больших масштабах, поскольку выделение чистых соединенеий в количестве нескольких миллиграммов, необ ходимом для проведения элементарного анализа, определения фи зических констант, для сравнения со стандартом и т. д., не требует применения специальных приемов и оборудования.

Следует помнить, что при препаративной хроматографии в слоях сорбента отношение количества хроматографического ма териала к количеству разделяемой смеси веществ много выше, чем в колоночной хроматографии, поэтому этот метод менее эко номичен. С другой стороны, хроматография в слое связана с мень шим расходованием растворителя и занимает меньше времени, что особенно важно для выделения нестойких соединений: сравнитель но малое время контакта с сорбентом уменьшает риск их разло жения.

3.5.1. Материалы Для препаративной хроматографии чаще всего применяют си ликагель и окись алюминия. Широко используются также слои из целлюлозы. Силикагель и окись алюминия обладают наиболь шей емкостью. Из этих сорбентов можно приготовить слои тол щиной до нескольких миллиметров. Чтобы нанести на пластину возможно большее количество разделяемой смеси, используют пла стинки, толщина слоя которых намного превышает толщину слоя обычных аналитических пластинок. Применялись пластинки с тол щиной слоя до 5 мм [82], однако следует отметить, что приготав ливать такие пластинки довольно сложно;

с другой стороны, при такой толщине начинает сказываться диффузия, что приводит к ухудшению качества разделения по сравнению с более тонкими слоями. Чаще всего толщина препаративных слоев находится в пределах от 0,75 до 2 мм [159]. При использовании полиамида верхняя граница толщины препаративного слоя не превышает 0,6 мм (разд. 5.6.3). При приготовлении закрепленных слоев для препаративных работ содержание гипса в сорбенте должно быть на 2% выше, чем при приготовлении аналитических пластинок, а высушивание слоев следует проводить при более низкой темпе ратуре [82]. В некоторых работах [73] описывается приготовле ние препаративных слоев без связующего вещества. Безусловно, выбор того или иного способа приготовления слоя зависит от типа и свойств используемого хроматографического материала. Для приготовления незакрепленных слоев используют обычные матери алы. Их недостатком является малая механическая прочность, ко 124 Общая часть торая вызывает затруднения прежде всего при работе со слоями больших размеров.

Как и в случае аналитической хроматографии, при количест венном определении выделенных веществ предъявляются особые требования к чистоте хроматографического материала. В ряде работ рекомендуется тщательно промывать материал перед при готовлением слоев. Эту промывку следует проводить полярным растворителем, с помощью которого удаляются примеси, которые загрязняли бы выделяемые вещества или могли бы мешать опе рациям очистки. Необходимо учитывать и то обстоятельство, что сорбент, поставляемый в емкостях из пластмассы, может быть загрязнен различными примесями, которые затем обнаруживаются при физико-химических измерениях (например, ЯМР-спектроско пия [126]).

Вотщоковски [250] в своей обзорной статье подробно освещает возможности предупреждения загрязнения неорганических сорбен тов органическими веществами из упаковочного материала и воз духа. Более того, органические примеси могут разлагаться под влиянием «каталитического контакта» с активной поверхностью сорбента. В сорбентах было показано присутствие спиртов, пести цидов, пластификаторов, различных органических и неорганиче ских солей, низкомолекулярных компонентов связующих материа лов в случае фирменных слоев и т. д. В органических полимерных сорбентах можно обнаружить мономеры и олигомеры, в целлюло з е — органические вещества растительного происхождения и ве щества, зависящие от способа химического производства. Автор рекомендует чистить слои сорбентов элюированием в системе ме танол—метиленхлорид (1:1) и хранить готовые пластинки в за крытой емкости и не на прямом солнечном свету.

3.5.2. Определение емкости слоя При проведении препаративной хроматографии целесообразно наносить на слой максимально возможное количество исходной смеси веществ. Поскольку емкость сорбента несколько меняется от партии к партии, а эффективность разделения, в частности, зависит и от разницы в полярности отдельных компонентов сме си, иногда бывает целесообразно заранее установить максималь ное количество смеси, которое еще можно нанести на слой без ухудшения эффективности разделения.

На старт пробной хроматограммы, приготовленной из того же материала и той же толщины размером 20X20 см, наносят данную смесь веществ в равномер но возрастающей концентрации. После элюирования, которое одновременно пока жет пригодность использованной системы растворителей, и обнаружения хрома тограммы находят, при какой максимальной нагрузке компоненты еще достаточ но хорошо разделяются между собой. Эту или чуть меньшую нагрузку затем применяют при проведении препаративного разделения.

Общая часть Обычно считается, что на слой силикагеля толщиной 1 мм можно наносить 2—2,5 мг смеси на 1 см длины стартовой линии.

Таким образом, на большой слой размером 20X100 см можно на носить до 250 мг смеси, если в ней отсутствуют компоненты с очень близкой подвижностью.

3.5.3. Приготовление препаративных пластинок Хотя приготовить незакрепленный слой толщиной 5 мм нетрудно, не реко мендуется работать со слоями, толщина которых превышала бы 2 мм: на более толстых слоях качество разделения ухудшается. Так как незакрепленные слои не отличаются хорошей разделительной способностью, их используют главным образом при работе с простыми смесями веществ. Наиболее употребимые раз меры пластинок 20X20 или 20X40 см;

работать с пластинками больших разме ров трудно.

Приготовление препаративных закрепленных слоев имеет свои особенности. Если пластины готовят с помощью обычного аппли катора с регулируемой шириной щели по Шталю (разд. 2.3Л.2), то нужно учитывать, что объем камеры прибора ограничен. Его объема хватит на изготовление препаративного слоя размером 20X40 см, но на приготовление препаративных пластин большего размера, например 20ХЮ0 см, эта емкость недостаточна. Если никакого другого приспособления нет, то резервуар аппликатора в момент нанесения слоя необходимо непрерывно доливать до статочным количеством суспензии. Можно увеличить объем резер вуара для суспензии с помощью подходящей насадки, лучше из пластмассы. Такую насадку можно изготовить собственными си лами. Фирма Desaga и Shandon производят аппликаторы с регу лируемой шириной щели, снабженные резервуарами больших раз меров. Фирма Shandon производит очень простое и очень удобное устройство для приготовления серии слоев (или одного большого слоя) размером 20ХЮ0 см. Схема этого устройства приведена на рис. 47. Оно представляет собой простой резервуар, изготовлен ный из нержавеющего металла, передняя и задняя стенки которого имеют тщательно отшлифованные щели различной ширины, на пример 0,75;

1,0;

1,5 и 2 мм. Через щель вытекает слой суспензии нужной толщины. Поскольку щели предусмотрены на верхней и нижней гранях спереди и сзади, с помощью одного резервуара можно готовить слои четырех различных толщин. Аналогичное устройство можно изготовить и из пластмассы. Усовершенство ванное устройство, основанное на том же принципе, описали Белл [14] и Ди Туллио [56]. Оба прибора имеют регулируемую щель. Первый из них снабжен горизонтальной площадкой, обес печивающей нужную толщину и равномерность слоя.

Необходимо отметить, что при заливке препаративных пластин с помощью аппликатора начало и конец слоя использовать для работы нельзя, они должны быть потом удалены.

126 Общая часть Рис. 47. Устройство, используемое для приготовления препаративных хромато графических пластинок.

а — паз, определяющий толщину слоя (размеры даны в сантиметрах) Слои готовят на совершенно горизонтальной подставке. Мож но использовать подставку, описанную в разд. 2.3.1.2. Этот спо соб, конечно, требует применения более густой суспензии сорбен та, в противном случае слишком жидкая суспензия начнет стекать с пластинок. Можно рекомендовать раму с бортиками, в которую укладывают пластинку или серию пластинок. Удобную раму про изводит фирма Shandon (рис. 48).

Рама из нержавеющего металла выстлана изнутри полосами пористой рези ны. Короткие боковые створки, подвижно соединенные с одной из длинных сто рон рамы, можно с помощью зажимов неподвижно скрепить с другой длинной стороной рамы. Стеклянную пластину размером 20X100 см вкладывают в откры тую раму и зажимают в ней, запирая подвижные створки зажимами. Полосы пористой резины плотно прилегают к краям пластины и предупреждают возмож ное стекание суспензии с пластины. Затем пластину заливают суспензией. Резер вуар с суспензией, с помощью которого готовят слой, должен поместиться в ра ме;

его длина должна быть чуть меньше 20 см, чтобы полосы пористой резины не мешали его перемещению. Удобные размеры аппликатора приведены на рис. 47.

Эту раму можно использовать также для приготовления пла стинок вручную при условии, если рама положена на абсолютно горизонтальную подставку, чтобы суспензия распределялась рав номерно по всей поверхности пластинки. При заливке пластин ручным способом суспензию целесообразно готовить более жид Общая часть кой. Равномерное распределение можно обеспечить, осторожно наклоняя раму с пластиной в разные стороны. Опыт авторов на стоящей монографии показал, что ручной способ приготовления препаративных пластинок нисколько не уступает приготовлению пластинок с помощью аппликатора;

более того, при ручном спо собе используется вся поверхность пластины.

Чтобы приготовить суспензию для пластины или серии пла стин размером 20ХЮ0 см с толщиной слоя около 1 мм (щель на I X X Рис. 48. Рама для приготовления препаративных слоев.

/ — пористая резина;

2 — зажимы.

дне аппликатора определяет толщину слоя суспензии, но не тол щину сухого слоя), можно пользоваться следующей методикой.

1. 100 г силикагеля G (Merck) суспендируют в 200 мл воды.

2. 80 г силикагеля силпирл (или силикагеля СН) и 20 г гипса в сухом состоя нии тщательно перемешивают в закрытой 500 мл колбе. Затем добавляют при мерно 220 мл дистиллированной воды и суспензию интенсивно встряхивают 1 мин. Количество добавляемой воды может колебаться в зависимости от кон кретных условий приготовления пластинок.

Кларк [32] предложил использовать пластины из нержавею щей стали вместо стеклянных пластинок. Эти пластины имеют бортики по краям, которые значительно облегчают заливку пла стин суспензией.

Недавно предложено использовать два новых типа препара тивных слоев: слои цилиндрические и конические. Цилиндриче ский слой проще всего изготовить, смачивая стеклянные сосуды, например пробирки, суспензией сорбента [101]. Суспензию сили кагеля можно готовить в смеси хлороформ — метанол (2:1) в узком высоком сосуде, диаметр которого примерно на 25 мм шире, чем цилиндр, на который наносят слой [102]. Преимущество ци линдрических слоев состоит в легкости нанесения растворов раз деляемых смесей: растворы наносят иглой шприца на закруглен ную поверхность пробирки [102]' или по кругу вокруг вершины 128 Общая часть пробирки при одновременном вращении слоя [103]. Сказанное выше относится к слоям сравнительно малых размеров, применя ющимся для выделения небольших количеств веществ. Описано также приготовление цилиндрических препаративных слоев боль ших размеров [67] с использованием высоких стаканов большого диаметра.

Слои гораздо больших размеров можно наносить на внешнюю или внутреннюю поверхность конических воронок (конические препаративные слои). В первом случае готовят слой погружени ем воронки в суспензию сорбента [67]. Для приготовления слоев на внутренней поверхности воронки используют воронки с отрезан ной трубкой;

образовавшееся отверстие затыкают пробкой. В во ронку наливают суспензию и весь конус вращают с помощью мо тора со скоростью 100—200 об/мин, так что суспензия распреде ляется равномерно по всей поверхности [26]'. Полезно также пред варительно разогреть воронку (10—15 мин при 100 °С). Суспен зию вливают в горячую воронку (для проведения этой операции нужно пользоваться защитными рукавицами). Нанесенный слой сушат 3 ч при комнатной температуре, затем активируют, нагре вая при 100 °С 1 ч [170]. Удобство работы с коническими слоями заключается в простоте нанесения разделяемой смеси. Раствор наносят пипеткой в зону над закрытым пробкой нижним концом воронки. Затем на дно конуса наливают небольшое количество полярного растворителя, с помощью которого нанесенный обра зец концентрируется в узкую зону. Операцию повторяют несколь ко раз. При проявлении систему растворителей подводят ко дну воронки;

воронку сверху покрывают стеклом и через отверстие в этом стекле с помощью капельной воронки по мере надобности доливают систему растворителей [26].

3.5.4. Нанесение разделяемых смесей на хроматографическую пластинку Нанесение раствора смеси на стартовую полосу хроматогра фической пластинки, как правило, представляет наиболее труд ную и ответственную операцию в препаративной хроматографии.

Нужно помнить, что, как и в случае колоночной хроматографии, успех разделения зависит от правильного и равномерного нане сения раствора смеси на хроматографический материал. Сущест вует целый ряд приемов нанесения, каждому из которых свойст венны свои преимущества и недостатки;

выбор одного из них оп ределяется целью разделения. Если разделяется малое количест во смеси или если разница в величинах RF отдельных веществ до статочно велика, то некоторые неравномерности нанесения разде ляемой смеси допустимы. Однако при разделении большего ко личества веществ, когда целесообразно использовать полностью Общая часть емкость слоя, а также в случае разделения сложных смесей, ком поненты которых имеют близкие значения RF, правильное нане сение исходного образца на стартовую зону определяет успех всей работы. Флуктуация концентрации веществ вдоль стартовой ли нии может повлечь за собой слияние зон отдельных веществ.


При разделении малых количеств смеси вещество в раствори теле можно наносить с помощью микропипетки или пипетки с су женным наконечником в отдельные точки, расположенные близ ко друг к другу, причем в каждую точку наносят одинаковое ко личество образца. Этот способ, хотя и гарантирует равномерность нанесения, очень трудоемок и занимает много времени. Описана конструкция простого устройства для нанесения смеси с помощью серии пипеток [135]. Более быстрый, но требующий ловкости и навыка способ состоит в нанесении пипеткой непрерывной стар товой полосы. При этом способе довольно трудно обеспечить по стоянство концентрации образца вдоль всей стартовой зоны. Кро ме того, нужно следить за тем, чтобы не повредить слой концом пипетки (небольшое повреждение допустимо). При перемещении вдоль пластинки пипетку следует прижимать к линейке.

Описанные ниже приемы облегчают задачу равномерного на несения образца на старт пластинки.

В зоне старта двумя глубокими царапинами (до самого стекла) разграни чивают узкую, около 3 мм, полосу, в которую наносят раствор исследуемой сме си веществ. Эти царапины, отделяющие зону старта от остального слоя, препят ствуют расползанию раствора смеси на разную ширину и тем самым предотвра щают образование расплывчатых неравномерных зон при проявлении. После на несения образца царапины в слое заполняют сухим сорбентом с помощью алю миниевой фольги с продольной щелью. Фольгу кладут на пластинку таким обра зом, чтобы щель приходилась точно на одну из царапин. Этот прием позволяет заполнить канавки в слое сорбентом без повреждения хроматограммы [35].

При нанесении на хроматограмму разделяемого образца в виде твердого сыпучего материала поступают следующим образом. Лезвием бритвы с помощью шаблона удаляют с хроматографической пластинки полоску сорбента на уровне стартовой зоны. Объем удаленного материала измеряют мерным цилиндром. 0,5 г смеси веществ смешивают с 0,5 мл сорбента, тщательно гомогенизируют, добав ляют свежую порцию сорбента, доводя объем полученной смеси до объема выре занной зоны сорбента, и опять тщательно перемешивают. Полученную смесь с помощью шпателя насыпают в желобок в месте старта и слегка приминают стек лянной пластинкой, иногда предварительно смочив бензолом. При насыпании стартовой зоны пользуются шаблоном [216].

При нанесении на пластинку больших количеств раствора об разца, особенно если растворитель полярный, стартовая зона не избежно расширяется до нежелательных размеров. В этом случае нанесенную зону можно сконцентрировать, проявив ее до линии старта полярным растворителем (метанолом), как показано на рис. 49 [73]!.

Стремясь обеспечить равномерность нанесения смеси веществ вдоль всей длины стартовой линии, некоторые авторы предложи ли простые устройства, пригодные для коротких пластин (до 9— 130 Общая часть 20 см). Фармер [58] работает с двумя стеклами размером 19Х Х5 см, заточенными снизу до получения острой грани (рис. 50).

Между стеклами в верхней части помещено 16 слоев алюминие вой фольги, обеспечивающие зазор между этими пластинками.

Рис. 49. Схематическое изображение метода концентрирования широкой старто вой зоны с получением узкой зоны.

1 — нанесенный образец.

Стекла и фольга скрепляются вместе с помощью липкой ленты.

Все устройство крепится на держателе. Раствор разделяемой сме си веществ наливают в узкую кювету соответствующей длины и, опуская в нее описанную конструкцию, заполняют раствором ниж нюю часть пространства между стекла ми (описываемое устройство позволяет за один раз отбирать до 1 мл раствора).

Препаративную пластинку укладывают на лабораторный подъемный столик и поднимают ее до момента касания сло ем сорбента узкого зазора между пла стинками по всей его длине. Это устрой ство пригодно и для нанесения разделяе мой смеси на незакрепленные слои. При меняется также аналогичное устройство Рис. 50. Двумерная пипетка.

(так называемая двумерная пипетка), / — алюминиевая фольга;

2 — • изготовленное из нержавеющей стали [4, липкая лента.

115].

Аналогичное устройство для нанесения малых объемов рас твора описано Беннеттом и Гефтманном {16]. Оно состоит из двух предметных стекол размером 75X50X1 мм, между которыми вложена липкая лента, фиксирующая ширину щели. Вся конст рукция скреплена липкой лентой. Несколько таких устройств мож но разместить одно возле другого в простом держателе, изготов ленном из двух стеклянных палочек, и после заполнения раствором прикладывать к поверхности слоя. При работе с еще меньшими объемами раствора можно использовать методику Тернера [206]|.

Предлагаемое этим автором устройство состоит из пластмассовой Общая часть Рис. 51. Приспособление фирмы Shandon для нанесения раствора разделяемой смеси на препаративную пластинку.

подставки, на которой между двумя шурупами натянуты две те риленовые нити длиной 70 мм, удаленные друг от друга на рас стояние 1,5 мм. На эти нити пипеткой наносят около 100 мкл раствора. Раствор удерживается между нитями благодаря поверх ностному натяжению. При нанесении образца на пластинку эти нити слегка прижимают к поверхности слоя. Этот метод приго ден и для нанесения образцов с последующим количественным определением выделенных компонентов.

Другое, более сложное устройство, принцип действия которого используют многие авторы, выпускает фирма Shandon (рис. 51).

Оно представляет собой небольшую пластину, на которой укреп лен шприц, оканчивающийся очень тонкой форсункой. Пластина, упирающаяся в край хроматографическои пластинки, соединена с длинным винтом, на котором свободно вращается колесико, снабженное шкивом. Это колесико давит на поршень шприца.

Шприц заполняют раствором смеси веществ, укрепляют на несу щей пластине и перемещают колесико на винте до его соприкос новения с поршнем шприца. При перемещении всего устройства вдоль хроматограммы одновременно вращается колесико на вин те, которое вдавливает поршень внутрь шприца. Раствор наноси мой смеси вытекает из форсунки тонкой струйкой. Очень важно, 132 Общая часть чтобы при заполнении шприца в него не попали пузырьки возду ха, в противном случае нанесение было бы неравномерным, осо бенно ближе к концу стартовой зоны. Действие описанного устрой ства в определенных пределах не зависит от скорости перемеще ния, поскольку ускорение перемещения влечет за собой более интенсивную подачу смеси из форсунки на слой. Устройство пере л V Рис. 52. Способы затачивания конца иглы шприца.

мещают вдоль хроматограммы до тех пор, пока вся смесь не бу дет нанесена на стартовую зону.

Устройство подобного типа описал Бекон [9]. Оно представля ет собой платформу на четырех колесиках, вращающихся на мик рометрическом винте, соединенном с поршнем шприца. Контрак тор [37] применил специальный штатив, у которого на опорной плите перемещается устройство для нанесения образца, вращаю щее микрометрический винт, соединенный со шприцем. Хромато грамму укрепляют в штативе. Игла шприца должна быть сточе на, как показано на рис. 52 [164].

Очень хорошее, но дорогое и занимающее много места устройство произво дит фирма P. R. L Enginiering Ltd., Англия, конструкция которого предложена сотрудниками лаборатории Dyson Perrins Laboratory Оксфордского университе та. Этот прибор, применение которого окупается лишь там, где препаративная хроматография используется очень широко, представляет собой металлическую подставку с электрическим обогревом (нагревание ускоряет испарение раствори теля из слоя при нанесении большого объема раствора), на которой размещается хроматограмма. Над этой подставкой по направляющей планке перемещается ме ханизм, состоящий из шприца с тонкой форсункой и специального затвора, обес печивающего герметическое соединение полости шприца (без поршня) с источни ком избыточного давления. Механизм для нанесения образца приводится в дви жение электромотором посредством цепной передачи и перемещается поперемен но от одного края хроматограммы к другому. При подходе к концу слоя на правление перемещения меняется на противоположное с помощью автоматиче ского переключателя. Раствор разделяемой смеси выдавливается через форсунку сжатым воздухом Регулируя давление, можно изменить количество наносимого раствора таким образом, чтобы вытекание жидкости из шприца было минималь ным, но непрерывным. Концевые автоматические переключатели направления движения шприца вдоль хроматограммы можно перемещать по направляющей планке, что позволяет использовать это устройство для работы с хроматограм мами любого размера. Прибор позволяет автоматически наносить и большие количества раствора;

раствор необходимо предварительно тщательно отфильтро Общая часть Рис. 53. Устройство для фильтрования фирмы Millipore.

Рис. 54. Устройство для фильтрования, изображенное на рис. 53, присоединенное к шприцу.

вать во избежание засорения тонкого отверстия форсунки. Фирма Millipore Filter Corporation, США, производит оборудование для фильтрования с применением специального фильтрующего материала, обеспечивающего очень быструю и эф фективную фильтрацию данного раствора. Соответствующее устройство изобра жено на рис. 53 и 54. Металлический сосуд состоит из крышки и нижней части (обе части свинчиваются друг с другом). Внутри нижней части имеется круглая тефлоновая прокладка, на которой лежит тонкая металлическая сетка. На эгу сетку помещают фильтрующий материал (при использовании галогенсодержа щих растворителей используют фильтрующую насадку RAWP 02500). Поверх фильтрующего элемента помещают плоскую тефлоновую прокладку (рис. 53).


Обе части свинчивают вместе и присоединяют к концу шприца с тефлоновым поршнем. В шприц предварительно набирают раствор, предназначенный для фильтрования (рис. 54). Под давлением поршня раствор продавливается через фильтрующий элемент в другой шприц без поршня. Этот шприц, снабженный форсункой, присоединяется к описанному выше устройству для нанесения образ ца. Размеры форсунки таковы, что раствор из шприца выливается только под давлением.

134 Общая часть Полностью автоматизированный прибор, основанный на том же принципе, производит также и фирма Desaga. В литературе имеется целый ряд описаний других полуавтоматических устройств, подробное рассмотрение которых выходит за рамки настоящей книги.

3.5.5. Проявление препаративных хроматограмм Методика проявления препаративного слоя зависит от его типа и размеров. Пластинки небольших размеров можно прояв лять в обычных камерах. Незакрепленные слои, которые можно проявлять только при небольшом наклоне, требуют применения камер больших размеров. Для проявления слоя размером 20Х Х20 см пригодна чашка Петри диаметром 30 см, прикрытая свер ху стеклянной пластинкой. Сложнее проявлять незакрепленные слои больших размеров. Поэтому удобнее работать с закреплен ными слоями, которые можно проявлять в вертикальном положе нии. В достаточно большую камеру, снабженную штативом, мож но поместить целую серию хроматограмм, что позволяет макси мально использовать ее объем при экономии времени и раствори теля. Как и в случае проявления аналитических хроматограмм, рекомендуется применять камеры минимального объема, которые легче насытить парами системы растворителей. Для лучшего на сыщения в камеры помещают полоски фильтровальной бумаги.

Камеры для проявления больших препаративных пластин разме ром 20ХЮ0 см производятся несколькими фирмами. Фирма Shandon производит камеры из нержавеющей стали (рис. 55), герметически закрывающиеся крышкой со стеклянным оконцем.

В камеру помещают штатив, позволяющий разместить одновре менно до пяти пластин. Выпускаются также камеры для проявле ния в инертной атмосфере. Для этой цели можно использовать также и обычные камеры, которые заполняют двуокисью углерода (если это позволяет сделать характер разделяемых веществ и си стема растворителей). Описаны также огромные камеры для од новременного проявления до 40 хроматограмм. При проявлении в камере, объем которой насыщен парами растворителя, хромато граммы размещают попарно слоями друг к другу, причем между слоями помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную растворителем. При проявлении в камерах, не насыщенных па рами растворителя, пластинки размещают слоями в разные сто роны [8]'.

Длина пробега растворителя не должна превышать 20 см, в противном случае начинает сказываться диффузия, кроме того, скорость подъема растворителя уменьшается и сильно увеличива ется время проявления. Помимо диффузионного размывания зон разделенных компонентов увеличение времени проявления пред Общая часть Рис. 55. Камеры для проявления препаративных хроматограмм, выпускаемые фирмой Shandon.

ставляет определенный риск при разделении неустойчивых соеди нений. В связи с этим наиболее употребимыми размерами препа ративных слоев являются 20X20, 20X40 или 20X100 см.

При проведении препаративной хроматографии, особенно при разделении веществ с близкими RF, часто применяют повторное хроматографирование (разд. 3.1.1). В этих случаях перед каждым новым хроматографированием слой необходимо тщательно высу шить. Поскольку толстый слой содержит значительное количество растворителя, сушить препаративные пластинки можно только в вытяжном шкафу. Особую осторожность следует соблюдать при работе с хроматограммами, элюированными в легко воспламеня ющихся растворителях. В продаже имеются специальные сушилки, однако для обычной работы вполне достаточно проводить сушку при комнатной температуре. Такая сушка хотя и занимает много времени, однако осуществляется в мягких условиях.

Проявление цилиндрических и конических слоев уже описано в разд. 3.5.3.

Чтобы свести к минимуму некоторые недостатки препаратив ной хроматографии, связанные с возможным загрязнением разде ленных зон органическими примесями, присутствующими в сор бенте (эти примеси целесообразно предварительно удалить тща 136 • Общая часть тельным промыванием сорбента), и с попаданием мелкодисперс ных частиц сорбента во фракции элюированных с пластинки соединений, применяют вариант непрерывного горизонтального разделения (разд. 3.1.2). Разделение осуществляют в BN-каме ре;

зоны веществ доходят до участка пластины, не закрытого крышкой камеры, откуда растворитель испаряется, и первона чально широкая зона концентрируется до узкой ровной дюлоски, занимающей малый объем сорбента. Когда первая зона сконцент рируется, крышку камеры смещают вниз примерно на 4 см и кон центрируют следующую зону.

3.5.6. Обнаружение Успех препаративного разделения в немалой мере определяет ся выбором метода обнаружения. Естественно, применимы толь ко те методики, которые не приводят к разложению вещества.

Проще всего работать с окрашенными соединениями, как и с ве ществами, видимыми в УФ-свете без каких-либо вспомогательных операций. Согласно опыту авторов в области химии стероидов, зоны некоторых веществ, невидимые при аналитической хромато графии, можно различать визуально при хроматографии препара тивной, где количество наносимых веществ во много раз больше.

Другой очень распространенный способ обнаружения пред усматривает импрегнирование сорбента флуоресцентным красите лем или люминофором или опрыскивание хроматограмм этими реагентами. Как уже говорилось ранее, многочисленные препара ты, включая силикагель силпирл УФ254 производства ЧССР, со держат люминофор, обеспечивающий надежное обнаружение ве ществ, имеющих в молекуле хромофор. При хроматографировании на окиси алюминия для импрегнирования применяют морин [29], который прочно связывается с сорбентом за счет образования хе латного комплекса и не вымывается при элюировании веществ с сорбента [43].

500 г окиси алюминия в 500 мл метанола смешивают с раствором 300 мг морина в 500 мл метанола. Суспензию перемешивают до обесцвечивания, окись алюминия отфильтровывают, промывают метанолом, высушивают и, если нужно, активируют. Полученный материал желтого цвета флуоресцирует в УФ-свете.

При приготовлении флуоресцирующих закрепленных слоев к смеси сорбента со связующим веществом добавляют примерно 0,4% -ный раствор флуоресцентного индикатора.

Мягкое обнаружение многих веществ проводят обработкой хроматограммы парами иода. После фиксирования хроматогра фических зон иоду дают испариться с пластинки, что обычно за нимает мало времени. Обнаружение иодом проводят в камере, на дно которой помещают кристаллики иода. Другой, более эффек Общая часть тивный вариант заключается в нанесении свежеприготовленного раствора иода в органическом растворителе, например в ацето не, на чистую стеклянную пластинку. После упаривания раство рителя на пластинке остаются мелкие кристаллики иода. Пластин ку, покрытую слоем кристаллического иода, помещают над хро матограммой в непосредственной близости от слоя сорбента. При обнаружении слоев больших размеров (20X40 или 20ХЮ0 см) пластинку с иодом перемещают над слоем с такой скоростью, что бы на хроматограмме успевали выявляться зоны вещества. Вме сто плоской пластинки можно использовать и полуцилиндриче ский желоб [24]. Конечно, следует учитывать возможность взаи модействия некоторых веществ с иодом, приводящего к их ча стичной деструкции или к образованию комплексов (разд. 2.6 и 5.6.1).

Закрепленные слои можно обнаруживать водой. При насы щении слоя водой на темном фоне обнаруживаются зоны липо фильных веществ в виде плотных непрозрачных полос в прозрач ном слое [68, 197].

Метод обнаружения, называемый методом горячей линии, за ключается в приближении слоя на расстояние 1 мм к раскален ной проволоке. Под действием высокой температуры на хромато грамме образуется узкая полоса карбонизации имеющихся зон веществ шириной 1—2 мм;

при этом близлежащие участки слоя не разрушаются. Проволока поддерживается в натянутом поло жении пружинкой, поэтому остается натянутой и в нагретом со стоянии [21].

Если перечисленные способы обнаружения оказались неэф фективными, необходимо пожертвовать частью слоя. Использу ется прием, заимствованный из бумажной хроматографии: основ ную часть хроматограммы закрывают, оставляя открытыми узкие полосы по обеим сторонам. Эти полоски обнаруживают подходя щим реагентом. Рекомендуют разграничивать эти полосы от ос новной части хроматограммы, чтобы предупредить возможное просачивание раствора реагента в основной слой. Если по ходу обнаружения хроматограмму необходимо нагревать, то закрытую часть слоя покрывают асбестовой пластиной, а свободные боко вые участки хроматограммы после опрыскивания обнаружителем нагревают под инфракрасной лампой. Чтобы быть уверенным в том, что зоны веществ, обнаруженные по краям пластинки, нахо дятся на том же уровне по всей длине слоя, необходимо работать с качественными слоями, равномерно нагруженными на старте разделяемой смесью и проявленными в камере, насыщенной пара ми растворителя. Можно также пользоваться и таким приемом, при котором обнаруживают предварительную, вспомогательную хроматограмму, а полученные значения RF переносят вслепую на препаративный слой. Этот способ, однако, требует строжайшего 138 Общая часть соблюдения одинаковых условий хроматографирования в обоих случаях.

Обзор методов обнаружения, не связанных с деструкцией ве ществ, опубликован Барреттом [225]. Уместно упомянуть о но вом методе, носящем название фотоакустической спектрометрии, который можно использовать для мягкого обнаружения веществ, причем не только при препаративном разделении. Этот очень чув ствительный и сравнительно простой способ локализации и иден тификации веществ, не приводящий к их деструкции, основан на принципе фотоакустического эффекта в газах, который регист рируется чувствительным микрофоном после облучения хромато граммы монохроматическим светом [240].

3.5.7. Вымывание веществ из хроматографического слоя Для дальнейшей работы локализованные на хроматограмме зоны веществ необходимо перенести в устройство, где производят элюирование веществ и их выделение в чистом виде. Существует целый ряд приемов извлечения зоны из хроматографического слоя.

Ниже приводятся только некоторые из них. Небольшие количе ства сорбента (при закрепленных слоях зону сначала соскаблива ют со слоя скальпелем, шпателем, пластмассовым скребком и т.д.;

при работе с незакрепленными слоями эта операция, естественно, опускается) можно собрать с помощью стеклянной трубки, один конец которой загнут, а в другой помещен тампон ваты. Конец с ватой присоединяют к вакууму. Сорбент засасывается в трубку.

Затем трубку отсоединяют от источника вакуума, поворачивают концом с ватным тампоном вниз, а в открытый конец пипеткой вводят полярный растворитель. Вытекающий из трубки элюат со бирают в приемник (рис. 56).

Рис 56 Простое устройство для снятия зон веществ с препаративного слоя.

Общая часть Другое простое устройство изображено на рис. 57.

Колба нужного объема снабжена насадкой на шлифе. Короткое плечо на садки (с ватным тампоном) присоединяют к вакууму (водоструйный насос), длинное плечо насадки заканчивается резиновой или стеклянной трубкой, с по мощью которой отсасывают зону вещества. Сорбент элюируют непосредственно в колбе. Более эффективный способ вымывания вещества, применимый и для больших количеств хроматографического материала, предусматривает помещение сорбента в трубку для колоночной хроматографии с последующим вымыванием вещества полярным растворителем. Вместо колонки можно использовать и стек лянный фильтр.

Рис. 57. Приспособление для отсасывания зон веществ с пластинки.

Устройство, удобное для переноса зон меченных изотопами ве ществ с аналитических пластинок непосредственно во флаконы для измерения сцинтилляции, описано в работе i[271].

Простой и эффективный прибор (рис. 58), применяемый глав ным образом для элюирования веществ с их последующим коли чественным определением, но пригодный также и при проведении препаративных работ, описан Мэттьюсом и др. [132].

Зону вещества отсасывают в прибор, где она задерживается на пористом фильтре. Затем прибор присоединяют на шлифе к колбе или мерной емкости и вымывают вещество прямо в колбу, просасывая растворитель через слой сорбен та. Промывку прибора осуществляют в противоположном направлении, т. е. при соединяют источник вакуума к наконечнику трубки, а растворитель подают через трубку под пористой пластинкой.

Оригинальная конструкция для отбора хроматографических зон с пластинок, отличающаяся удобством в работе, предложена Платтом [270].

Для задерживания большего количества сорбента удобно поль зоваться устройством, показанным на рис. 59, в которое вклады вают патрон, используемый при экстракции в аппарате Сокслета;

этот патрон задерживает сорбент с веществом {159].

140 Общая частр Рис. 58. Приспособление для отсасывания зон веществ с пластинки и последую щего вымывания веществ.

/ — пористая стеклянная пластинка;

2 — вакуум.

Чтобы снизить количество сорбента в зоне перед вымыванием вещества (чем больше сорбента в зоне, тем больше вероятность загрязнения элюируемого соединения мелкими частицами сорбен та и органическими примесями), рекомендуется проводить после довательное концентрирование разделенных веществ с помощью упомянутого выше метода непрерывного горизонтального прояв ления [137]1.

Обычно для элюирования рекомендуется обходиться минималь ным количеством растворителя, поскольку при отгоне больших количеств растворителя повышается риск загрязнения самого вещества. Смесь метанол — дихлорметан (1:4) еще не вымывает органическое связующее вещество, применяемое для приготовле ния закрепленных слоев. Для разделения и выделения полярных веществ следует применять слои без связующего вещества орга нического происхождения [250].

Количественно элюировать вещество из пятна, не вырезая его из слоя, можно с помощью приспособления Eluchrom фирмы Са Общая часть mag. Применение этого аппарата позволяет уменьшить потери вещества и улучшить воспроизводимость результатов [233, 250].

Это приспособление представляет собой набор миниатюрных кру говых камер, которые накладывают на хроматографические зо ны. Каждая такая камера, приложенная к пятну вещества, обра зует замкнутую полость. В камеру с одной стороны поступает растворитель, который просачивается через слой, ограниченный Т Рис. 59. Устройство для отсасывания хроматографических зон по Риттеру и Мейер.

/ — вакуум;

2 — патрон от экстрактора.

камерой, концентрирует вещество в виде узкой полоски и пере мещает его к противоположной стороне камеры, откуда раствори тель с элюированным веществом отсасывается и затем обрабаты вается обычным способом.

Некоторые другие варианты 3.5.8.

препаративной хроматографии Горобин [84] применил нисходящий вариант непрерывной хро матографии на слоях, нанесенных на пластмассовую фольгу. Ме тодика работы напоминает соответствующую методику бумажной хроматографии. Конец слоя срезается до острия, с которого ска пывает растворитель и увлекает с собой разделенные вещества.

Отдельные фракции собирают в пробирки. Более сложное устрой ство, также позволяющее собирать фракции, последовательно вы текающие из хроматографического слоя, описано в работе [100].

Определенный интерес представляет непрерывная препаратив ная хроматография на слоях, нанесенных на гибкую фольгу [21G]. Схема метода представлена на рис. 60. Ниже приведено его краткое описание.

Сорбент насыпают на движущуюся полоску, фольги, равномерно распределя ют на ней с помощью калиброванной щели и затем накатывают прижимными Общая часть валиками, иногда при одновременном нагревании фольги с помощью термостата.

На движущийся край слоя непрерывно наносят смесь разделяемых веществ, а в непосредственной близости от этого места также непрерывно подают систему растворителей. Разделение осуществляется в направлении, перпендикулярном Л ОТп 5 \/[ \v^~——— *^Л направление переме- ' щения фольги Рис. 60. Схема непрерывной препаративной хроматографии.

/ — камера проявления;

2 — резервуар с сухим сорбентом;

3 — термостат;

4 — прижимной валик, 5 — место старта;

6—место подачи растворителя;

7 — зоны отдельных веществ направлению движения полосы фольги с нанесенным слоем. По завершении раз деления растворитель упаривают, а слои с зонами веществ удаляют вращающи мися щетками и собирают в соответствующие контейнеры.

3.6. Комбинирование хроматографии в тонких слоях с другими методами 3.6.1. Комбинирование газовой хроматографии с хроматографией в тонком слое Газовая хроматография (ГХ) представляет собой метод раз деления, в котором в качестве подвижной фазы используется газ.

Компоненты образца, анализируемого этим методом, должны об разовывать с подвижной фазой, так называемым газом-носите лем, газовую смесь. С помощью газовой хроматографии можно анализировать вещества, парциальное давление которых при тем пературе хроматографической колонки составляет не меньше 1 мм рт. ст. Вещества должны быть химически устойчивыми и термостабильными. В настоящее время газовая хроматография является одним из наиболее распространенных аналитических методов. Этот метод нашел широкое применение в фармации и клинической биохимии. К достоинствам ГХ относится высокая разделительная способность, чувствительность и быстрота ана лиза. ГХ можно использовать и в препаративных целях для вы деления индивидуальных веществ.

Общая часть При комбинировании тонкослойной хроматографии с газовой исследуемый образец чаще всего предварительно разделяют в тонком слое на ряд фракций (например, разделение веществ по функциональным группам), используя высокую селективность этого метода. Примером такого сочетания методов является ра бота Мангольда и Каммерекка [128] 1961 г., в которой авторы анализировали методом ГХ жирные кислоты, предварительно вы деленные хроматографией в тонком слое. В настоящее время со четание ТСХ и ГХ применяется очень часто, особенно в биохимии и токсикологии (например, в работах [30, 41, 42]). Ниже рассмат ривается комбинирование этих методов в обратной последователь ности, т. е. сочетание газохроматографического разделения с по следующим разделением элюата хроматографией в тонком слое.

Пионером в этой области является Я. Янак [90, 92, 93, 96, 162](, который одновременно указал на перспективное значение комби нирования других хроматографических методов [91, 94, 95].

ГХ и ТСХ имеют некоторые общие черты. Прежде всего это касается количества анализируемого вещества (минимальное со держание каждого компонента в пробе составляет около 10"6 г), длительности анализа (около 10—30 мин) и эффективности раз деления (эффективность хроматографии в тонком слое сравнима с эффективностью разделения на газохроматографической колон ке длиной около 1 м).

Основное различие методов ГХ и ТСХ заключается в способе детектирования разделенных веществ. В газовой хроматографии разделение и детектирование происходят одновременно и состав ляют динамическое единство, тогда как в случае ТСХ перед об наружением необходимо прекратить процесс разделения. Отдель ные компоненты после разделения методом ТСХ сохраняются на хроматограмме, что позволяет продолжать их исследование дру гими методами. С этой точки зрения тонкослойную хроматогра фию удобнее использовать для проведения качественного анали за, а газовую хроматографию — для количественного определения.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.