авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 5 ] --

Прямое соединение методов ГХ и ТСХ осуществляется очень просто и не требует особых затрат. Практически каждый газовый хроматограф можно модифицировать для сочетания с хромато графией в тонком слое. В принципе возможны два варианта такой комбинации. В первом из них тонкослойная пластинка служит только в качестве детектора (статический вариант). Во втором варианте эффективно используется разделительная способность обоих хроматографических методов (динамический вариант).

3.6.1.1. Статический (не непрерывный) вариант Статический вариант комбинации ГХ и ТСХ можно осущест вить двумя способами. В первом из них элюат из газохромато графической колонки поглощается сразу слоем сорбента на пла 144 Общая часть стинке. Второй способ предусматривает предварительное вымора живание разделенных веществ из элюата (с использованием мик ропрепаративных методов) и их последующее нанесение на старт тонкослойной пластинки.

Благодаря большому количеству селективных методов обна ружения, применяемых в ТСХ, тонкослойная пластинка сама по себе может служить в качестве дополнительного детектора, се лективного к отдельным компонентам смеси. Тонкослойную пла стинку можно применить для анализа только тех фракций, кото рые достаточно хорошо удерживаются тонким слоем сорбента.

При использовании недеструктивных газохроматографических де текторов, например катарометра, элюат из колонки проходит че рез детектор и затем адсорбируется слоем сорбента. При исполь зовании деструктивных детекторов, например пламенно-ионизаци онного, газовый поток из колонки необходимо делить на две ча сти: меньшую пропускают через детектор, а основной поток ад сорбируют в тонком слое. Эффективность улавливания элюата достигает 80% [108] при условии, что толщина слоя на пластинке достаточна и в трубке, соединяющей выход колонки с пластинкой, не происходит конденсации веществ.

При другом способе комбинирования ГХ и ТСХ применяют микропрепара тивные сборники фракций, отличающиеся более высоким процентом улавливания (при оптимальных условиях до 98%) разделенных веществ в сравнении с тонким слоем сорбента на пластинке. Преимуществом этого способа является возмож ность с помощью повторных разделений накапливать компоненты, присутствую щие в разделяемой смеси в следовых количествах. В качестве ловушек применя ют U-образные капилляры с внутренним диаметром от 1 до 3 мм [221, 222].

В капилляр вводят около 2 мкл подходящего растворителя (обычно четыреххло ристого углерода). Ловушку опускают в сосуд Дьюара с жидким азотом. Как только детектор хроматографа начинает регистрировать хроматографический пик, ловушку с помощью силиконовой или тефлоновой трубки соединяют с выхо дом газохроматографической колонки. Фракция, элюирующаяся из колонки, почти количественно адсорбируется на пористой поверхности кристаллических частиц растворителя. После выхода зоны вещества ловушку отсоединяют и ото бранную фракцию либо сразу хроматографируют в тонком слое, либо хранят в жидком азоте. По окончании газохроматографического разделения отдельные фракции размораживают, содержимое ловушек смывают соответствующим рас творителем (около 20 мкл) и наносят на старт хроматографической пластинки.

Для нанесения образца целесообразно один из концов ловушки предварительно вытянуть в капилляр.

Недостаток описанного способа состоит в том, что он не по зволяет использовать преимущества непосредственной связи меж ду газовым хроматографом и тонкослойной хроматограммой. Кро ме того, минорные компоненты, не зарегистрированные газохро матографическим детектором, могут уйти из поля зрения и при обнаружении на тонком слое. Чтобы разработать программу от бора фракций для анализа в тонком слое, необходимо произвести предварительный газохроматографический анализ разделяемой смеси [108].

Общая часть 3.6.1.2. Динамический (непрерывный) вариант Этот вариант предполагает дозирование элюата из газохро матографической колонки в тонкий слой сорбента в процессе га зохроматографического разделения. Это дозирование можно осу ществлять дискретно (в виде точек) или непрерывно (в виде ли нии). Пластинка с тонким слоем перемещается с помощью меха низма, регулируемого газохроматографическим детектором. Ско рость перемещения может быть постоянной [90] или замедлять ся в логарифмической шкале [96]. Пластинка может перемещать ся дискретно в соответствии с выходом фракций из колонки.

Каждый вариант перемещения имеет свои преимущества и недо статки.

При перемещении слоя с постоянной скоростью простое срав нение газожидкостной хроматограммы с хроматограммой в тон ком слое (обе движутся равномерно) дает возможность произве сти прямую корреляцию отдельных хроматографических зон. При проведении изотермического газохроматографического разделения концентрации отдельных фракций на единицу длины стартовой линии постепенно уменьшаются из-за расширения газохромато графических зон, пропорционального времени анализа. Это явле ние ухудшает возможности обнаружения пятен на тонкослойной хроматограмме. Этот недостаток можно устранить, осуществляя газохроматографическое разделение в режиме программирования температуры. При правильно подобранной скорости повышения температуры ширина отдельных газохроматографических зон должна быть одинакова (в идеальных условиях). В этом случае будут одинаковыми и пятна на старте тонкослойной хроматограм мы (на тонкослойной хроматограмме одинаковыми будут также расстояния между членами гомологического ряда).

Если газохроматографический анализ проводят в изотермиче ском режиме, то при изменении скорости перемещения пластинки по логарифмическому закону отдельные компоненты размещаются на стартовой линии хроматограммы линейно аналогично системе индексов удерживания [96]. Разбавление компонентов на старте при этом не происходит. Некоторое затруднение вызывает только конструирование соответствующего оборудования.

Дискретное перемещение хроматографической пластинки име ет то преимущество, что отдельные газохроматографические зо ны дозируются в точку, т. е. повышается концентрация веществ в сорбенте. Этот способ дозирования элюата иногда позволяет об наружить с помощью ТСХ компоненты смеси, которые из-за боль шого разбавления газом-носителем на колонке не фиксируются газохроматографическим детектором. Однако дискретное переме щение пластинки не позволяет непосредственно коррелировать обе хроматограммы.

10— 146 Общая часть По окончании газохроматографического анализа и фиксиро вания разделенных фракций на старте тонкослойной хроматограм мы пластинку насыщают парами системы растворителей, прояв ляют и обнаруживают обычными методами, применяемыми в тон кослойной хроматографии.

3.6.1.3. Аппаратура и оборудование Как уже говорилось выше, каждый газовый хроматограф мож но оборудовать для комбинирования с хроматографией в тонком слое. Особое внимание при этом следует обращать на трубку, соединяющую выход газохроматографической колонки с тонким слоем. Применяют трубки с внутренним диаметром от 0,5 до 1 мм.

Конец трубки должен находиться на расстоянии 0,6—2 мм от по верхности слоя в зависимости от скорости потока газа-носителя.

Трубка должна заканчиваться сужением с диаметром 0,4—0,6 мм.

Во избежание конденсирования фракций внутри трубки ее тем пература должна быть равна температуре колонки или чуть пре вышать ее. Соединительная трубка не должна иметь местных пе регревов во избежание возможного разложения менее термоста бильных компонентов смеси. В противном случае на тонкослойной хроматограмме могли бы появиться соединения, отсутствовавшие в исходной смеси '[107]. С этой точки зрения наиболее удобна цельностеклянная система, описанная Кайзером [108];

. Не менее важно установить нужное соотношение потоков газа-носителя из колонки в детектор и на пластинку. Плавная установка любых соотношений осуществляется с помощью пневматической системы [108]. Для перемещения пластинки в горизонтальном направле нии применяют небольшой электромотор, который либо непосред ственно сдвигает пластинку, либо приводит в движение валики, на которые помещают хроматограмму [219].

3.6.1.4. Круг вопросов, разрешаемых комбинированием методов ГХ и ТСХ Сочетание обоих методов позволяет получать больше информа ции о разделяемой смеси, чем в случае раздельного их примене ния [109]. Перед анализом (особенно при исследовании минор ных компонентов и при программировании температуры) реко мендуется провести предварительное разделение образца в тон ком слое, чтобы впоследствии исключить пятна, не принадлежа щие присутствующим в исходной смеси компонентам. Посторон ние вещества могут попасть в газохроматографический элюат вследствие частичного уноса неподвижной фазы (особенно при программировании температуры) и продуктов ее разложения, а также могут быть занесены с растворителем. Идентификацию этих Общая часть нежелательных примесей проводят с помощью контрольных экс периментов.

Комбинирование обоих методов анализа прежде всего дает информацию о полноте газохроматографического разделения.

Если на газохроматографической колонке разделяются не все компоненты исследуемого образца, то количество пятен на тонко слойной хроматограмме будет превышать число пиков на газо вой хроматограмме. Можно также определить, все ли компоненты образца вышли из колонки: если количество пятен на тонкослой ной хроматограмме исходного образца превышает число пиков на газовой хроматограмме, то это означает частичные потери образ ца на колонке. Аналогичным образом можно проверить, все ли компоненты, вышедшие из колонки, зарегистрированы детектором.

В процессе газохроматографического разделения под влиянием температуры из-за неправильного выбора неподвижной фазы или по каким-либо другим причинам может иметь место химическое превращение некоторых веществ. При этом регистрируются ве щества, отсутствующие в исходном образце. Комбинирование га зовой и тонкослойной хроматографии позволяет решить и эту проблему. Если на тонкослойной хроматограмме после газохро матографического разделения появляются пятна, отсутствовав шие на тонкослойной хроматограмме исходного образца, то это означает, что в процессе газохроматографического анализа име ют место химические превращения. Образец может разлагаться при дозировании (мгновенно) или на колонке, т. е. в ходе процесса разделения. В первом случае продукты разложения обнаружи ваются в виде четких компактных пятен, во втором — в виде раз мытых пятен. При комбинировании ГХ и ТСХ возможны и такие случаи, когда число пятен на тонкослойной хроматограмме мень ше числа газохроматографических пиков. Это может произойти из-за неправильного выбора типа сорбента или из-за разложе ния фракции на участке между выходом из хроматографической колонки и слоем (например, при перегреве соединительной труб ки, под действием кислорода или влаги воздуха и т. п.).

Комбинирование методов ГХ и ТСХ может быть использовано для анализа соединений, присутствующих в образце в следовых количествах. С этой целью проводят многократное газохромато графическое разделение с фиксированием элюата на стартовой зоне одной и той же пластинки. При этом элюат наносят на ли нию или в точки или комбинируют оба этих способа [108].

3.6.1.5. Практическое применение Примером динамического варианта сочетания ГЖХ и ТСХ мо жет служить анализ летучих компонентов кофе [107]. Образец анализировали на колонке с неполярной неподвижной фазой (си 10* Д48 Общая часть V CHj i CH сн3 Ю (Tjl^ 1150 00 00 Индекс удерживания Рис. 61. Анализ летучих компонентов кофе посредством комбинирования газовой хроматографии с тонкослойной хроматографией [107].

ликоновое масло) в режиме линейного программирования темпе ратуры. На рис. 61 представлены результаты разделения с по мощью системы индексов удерживания. Тонкослойная хромато грамма изображена на фоне газожидкостной хроматограммы.

В качестве сорбента использован кизельгур. Проявление прово дили в системе бензол — диэтиловый эфир (5:1). Хроматограм му обнаруживали опрыскиванием серной кислотой в смеси с ани совым альдегидом с последующим нагреванием в течение 10 мин Общая часть 78 9/ 5б ' Рис. 62. Тонкослойная хроматограмма (а) и газожидкостная хроматограмма (б) смеси 12 стероидов [42].

при температуре 100°С. Из рисунка видно, что на газовой хро матограмме имеется около 12 пиков, тогда как на тонкослойной хроматограмме можно различить более шестидесяти пятен, де сять из которых были идентифицированы, как показано на верх ней части рисунка.

Куртиус и Мюллер [42] применили этот принцип для анали за стероидов. Поскольку стероиды малолетучи, их анализ мето 150 Общая часть дом ГЖХ проводили в виде триметилсилильных производных на колонке с 3% ХЕ-60 (цианоэтилсиликоновый полимер) на носите ле газ-хром Р при температуре 210 °С. Элюат из колонки непре рывно наносили на тонкий слой силикагеля. Стартовую зону пла стинки предварительно смачивали смесью НС1 — метанол, с тем чтобы триметилсилильные производные сразу после адсорбции гидролизовались. В тонком слое лучше происходит разделение свободных стероидов, чем их производных. Обе хроматограммы представлены на рис. 62.

Баттиста и Махата [11] применили сочетание ГЖХ с ТСХ в токсикологических исследованиях. Эти авторы анализировали кислые и нейтральные лекарственные препараты, производные барбитуровых кислот и их метаболиты. Анализом пищевых про дуктов занимался Винтер с сотр. [220]].

3.6.2. Комбинирование тонкослойной хроматографии с другими методами анализа Для изучения структуры веществ, разделенных и выделенных с помощью тонкослойной хроматографии, часто используют ИК спектроскопию [6, 33, 48, 78, 158, 182, 190, 196, 258]. Большое число авторов занималось методами выделения необходимых для этой цели количеств веществ. Образец вещества, предназначен ный для снятия ИК-спектра, не должен содержать тонкодисперс ных частиц хроматографического материала. Поскольку удалить такие частицы фильтрованием или центрифугированием не всегда удается, были разработаны различные методики, гарантирующие чистоту выделенного препарата. Метод «фитиль-брусок» (Wick Stick) [196] является одним из таких приемов. Сорбент с пятном вещества помещают на дно чашки Петри и добавляют небольшое количество растворителя. Поверх смоченного сорбента помещают заостренную кверху призмочку из бромида калия. Растворитель всасывается призмочкой и испаряется на ее вершинке, причем вместе с растворителем увлекается вещество, которое концентри руется на вершинке. Вершинку отрезают, высушивают и использу ют для приготовления таблеток.

В той же работе описаны другие способы прямого переноса вещества из хроматографического слоя в порошкообразный бромид калия На рис. 63 пока зан один из них. Сорбент с пятном вещества помещают в маленькую пробирку.

В слой сорбента вставляют стеклянный капилляр, заполненный бромидом калия.

С помощью шприца к сорбенту прикапывают небольшое количество растворите ля Раствор вещества всасывается бромидом калия, при этом тонкие частицы сорбента остаются в нижней части столбика. Операцию повторяют несколько раз, так что раствор вещества концентрируется в верхней части столбца. Еще один способ показан на рис. 64. Вокруг пятна на хроматограмме удаляют сорбент.

К одной стороне оставшегося слоя подсыпают примерно 20 мг бромида калия, а с противоположной стороны к слою с помощью шприца подводят раствори тель. Вещество с растворителем переходит из слоя сорбента в слой бромида ка Общая часть лия. Передняя часть этого слоя (5) содержит чистое вещество и используется для дальнейшей работы, остаток удаляют.

Принцип, аналогичный приведенному в последнем примере, был использован ранее в работе [158]. Несколько иная методика показана на рис. 65. Сорбент вокруг пятна удаляют и в непо - - - -Г Рис. 63. Схема прибора Рис. 64. Схема переноса вещества из хро для переноса вещества матографического слоя в порошок бромида из хроматографического калия.

слоя в порошок бромида / — остаток слоя;

2 — пластинка, с которой уда лен хроматографический слой;

3 — пятно вещест калия.

ва;

4 — порошок бромида калия;

5 — передняя / — пробирка;

2 — металли- чистая часть порошка бромида калия;

6 — место ческая крышка;

3— капил- подвода растворителя с помощью шприца.

ляр длиной 80 мм, диамет ром 1 мм;

4— стекловата;

5 —сорбеят с веществом;

6 — порошок бромида калия.

ми*.

л. Рис. 65. Схема переноса вещества из хроматографического слоя в порошок бро мида.

а — полукруглый валик;

б — валик в виде кольца.

/ — пятно вещества;

2 — бромид калия;

3 — пластинка, с которой удален хроматографиче ский слой.

средственной близости от пятна насыпают полукруглый валик из порошка бромида калия. Через пятно вещества пропускают по лярный растворитель, который всасывается слоем бромида калия [48] (рис. 65,а). Валиком из бромида калия можно окружить все пятно [78] (рис. 65,6).

152 Общая часть Рис. 66. Различные способы переноса вещества из слоя в бромид калия.

а — с помощью пипетки;

6 — шприцем.

столбик сорбента с веществом;

2 — стекловата;

3 — сорбент;

4 — бромид калия;

5 ацетон.

Клеметт [33] предлагает снимать зоны веществ с тонкослойной хромато граммы с помощью пипетки, изображенной на рис. 66, а. В пипетку отсасывают сорбент и промывают его растворителем. Этим растворителем затем пропитывают порошкообразный бромид калия, который после высушивания прессуют в таб летки. Амос [6] описал применение шприца, в иглу которого помещают поро шок бромида калия. Силикагель с веществом с помощью микрошпателя поме щают на вершинку столбика бромида калия в игле. К игле присоединяют мик рошприц с ацетоном, и бромид калия с сорбентом постепенно промывают ацето ном, который скапывает с иглы на порцию сухого бромида калия (рис. 66,6).

Шталь и Шилд [190] использовали стеклянную трубку длиной 60—80 мм и ди аметром 1—2 мм (рис. 67, а). В трубку с помощью вакуума засасывают сорбент с веществом, трубку поворачивают на 180° и затыкают тампоном из стекловаты (вещества, которые могут окисляться кислородом воздуха, помещают в трубку с помощью шпателя), фиксируя слой сорбента. Затем трубку опять поворачива ют на 180° и заполняют ее порошком бромида калия. Постукивая по стенке ка пилляра, формируют столбик бромида калия и уплотняют его шпателем, чтобы он не высыпался из трубки. Трубку снова поворачивают, так чтобы вверху ока зался слой сорбента, и с помощью шприца заполняют элюентом ее расширенный конец. Вещество переходит в столбик бромида калия. Еще до момента впитыва ния всего количества растворителя трубку снова поворачивают на 180° и опуска ют в пробирку с растворителем. Растворитель поднимается кверху, увлекает с собой вещество, и испаряется из верхней части столбика. Верхняя часть стол бика бромида калия обогащается веществом. Из этой части столбика затем го товят микротаблетки. Вещество можно извлечь из пятна хроматограммы с по мощью полоски фильтровальной бумаги, касающейся пятна (рис. 67,6) [182].

В этой же работе описан также перенос вещества с бумажной хроматограммы на слой;

при этом вещество концентрируют в полоске фильтровальной бумаги (рис. 67, в), вырезанной из хроматограммы вблизи пятна. С кончика этой полоски пятно смывают в слой.

Ьакуум \ hr* Рис. 67. Схема метода Шталя для переноса веществ из слоя в порошкообразный бромид калия (а), в полоску фильтровальной бумаги (б), из бумажной хрома тограммы в слой (в).

/ — хроматографический слой;

2 — сорбент;

3 — растворитель;

4 — бромид калия;

5 — стек ловата;

6 — пятно вещества;

7 — часть хроматограммы, с которой снят слой;

8 — фильтро вальная бумага;

9 — место, где концентрируется вещество.

154 Общая часть Из других вариантов комбинирования ТСХ с другими физико химическими методами, имеющих меньшее значение, следует упо мянуть сочетание ТСХ с колоночной хроматографией [140], жид костной хроматографией высокого давления {262], масс-спектро метрией [125, 160]i и полярографией при анализе стероидов [72], некоторых лекарственных препаратов [211, 249] и пестицидов [234].

3.7. Количественный анализ Количественный анализ смеси веществ с помощью хроматогра фии в тонком слое во многих случаях дает надежные результаты, сравнимые с результатами анализа другими методами. Примеры количественных определений веществ имеются в отдельных гла вах. В настоящем разделе освещаются лишь вопросы общего ха рактера. Имеющаяся литература на эту тему в настоящее время настолько обширна, что объем настоящей монографии не позво ляет перечислить даже наиболее важные работы. Поэтому при написании этой главы авторы старались быть очень краткими, особенно в части, касающейся описания сложной измерительной аппаратуры.

Из двух основных способов определения вещества — после вы деления из слоя и непосредственно на хроматограмме (in situ) — первый способ более употребим*. Этот способ, хотя и занимает больше времени, не требует применения слишком сложного обо рудования. Выбор аналитической методики зависит от типа и ко личества разделяемых веществ. Обычно для количественного оп ределения применяют следующие методы [104, 105]:

Количественное определение после элюирования вещества из слоя:

1—10 мг—взвешивание, титрование, иоляриметрия;

50—100 мкг — полярография, УФ- и ИК-спектроскопия, масс спектрометрия, газовая хроматография, изотопные методы;

1—500 нг — флуоресценция, фосфоресценция, биофизиологиче ские методы.

* В результате разработки оптических сканирующих приборов для количе ственного определения содержания вещества в разделенных зонах непосредствен но на слое второй метод бурно развивается, и, по-видимому, в ближайшие годы он станет основным в лабораториях с большим числом аналитических определе ний методом ТСХ. — Прим. ред.

Общая часть Количественное определение непосредственно на хроматограмме вещества в микро- или нанограммовых количествах:

фотометрия (пропускание и поглощение);

сравнение величины пятен или зон;

измерение люминесценции или радиоактивности.

При проведении самого разделения в тонком слое используют обычные методики. Основное внимание обращают на чистоту хро матографических материалов и на качество нанесения образца на хроматограмму. Ряд авторов [87, ПО, 207]] для нанесения образ ца рекомендует использовать полностью автоматизированные при способления. Однако обычные способы тоже вполне пригодны.

3.7.1. Количественное определение непосредственно на хроматограмме 3.7.1.1. Полу количественное определение сравнением величины пятна со стандартом Этот метод аналогичен известному методу, используемому в хроматографии на бумаге. На хроматограмму наносят поочередно измеряемое вещество в убывающем количестве и стандарт в воз растающей концентрации. Метод не дает такого эффекта в ТСХ, как при хроматографии на бумаге [209].

3.7.1.2. Определение, основанное на зависимости площади пятна от количества вещества Определение такого типа пригодно при работе с некоторыми группами веществ. В принципе можно использовать несколько ви дов такой зависимости. Иногда бывает достаточно выразить гра фически ход зависимости между площадью пятна и количеством вещества [167]. Чаще пользуются математическим выражением зависимости между логарифмом площади пятна и логарифмом количества вещества, между корнем квадратным из площади пят на и логарифмом количества вещества или между площадью и логарифмом количества вещества [155, 156]. Для Сахаров и не которых органических кислот (включая аминокислоты) найдена достаточно строгая зависимость между площадью пятна и лога рифмом количества вещества и между корнем квадратным из площади пятна и логарифмом количества вещества [142]!. Зави симость между площадью пятна и логарифмом количества веще ства определяется толщиной слоя;

это соотношение соблюдается лучше при работе с тонкими слоями. При работе с толстыми слоя ми эта зависимость лучше выражается соотношением между лога рифмом площади пятна и логарифмом количества вещества. На 156 Общая часть хроматограмму наносят возрастающее количество вещества и из меряют величину пятна с помощью планиметра или перерисовы вают пятно на полупрозрачную миллиметровую бумагу. Нибом [142] доказывает, что, по всей вероятности, не существует единой теоретической зависимости между площадью пятна и количест вом вещества: характер связи между этими параметрами меня ется при переходе от вещества к веществу и зависит от их хими ческих свойств, толщины слоя, метода обнаружения и в опреде ленной степени от абсолютного количества вещества в пятне, т. е.

изменяется с изменением кон центрации. Однако при соблюде нии стандартных условий зависи мость между величиной пятна и количеством вещества можно ча сто с успехом использовать.

Иногда применим простой ме тод Бертольда [19]. Принцип этого метода изображен на рис.

Рис. 68. Схематическое изображение 68. В хроматографическом слое принципа метода Бертольда.

проделывают канавки шириной 2 мм и длиной 40 мм. На старт наносят 5 различных известных количеств вещества. Измерить площади пятен и построить калибровочный график не составляет труда. В этих же условиях проводят хроматографию исследуемой смеси веществ и количество определяемого вещества находят по калибровочному графику.

3.7.1.3. Количественная интерпретация хроматограммы с помощью специальной аппаратуры Широкое распространение получил фотоденситометрический метод, применимый в тех случаях, когда вещества дают при об наружении достаточно интенсивное окрашивание. Необходимым условием при этом является воспроизводимость метода обнару жения. До нанесения веществ исходную хроматографическую пластинку промеряют денситометром;

только после этого наносят образец, проводят проявление и обнаружение [147, 155, 202, 255].

Измерение проводят с помощью фотоденситометров различных ти пов, широко известных и производимых в большом количестве.

Полученные значения с учетом поправки на пустой слой наносят на график против количества вещества. Иногда для проведения денситометрических измерений используют фотографию хрома тограммы (негативное изображение) [31]'. Для обсчета хрома Общая часть тографических слоев небольших размеров используется, например, автоматический денситометр Vitatron UFiD 500 или TLD 100.

Для обсчета хроматограмм больших размеров можно применять те же приборы с простой приставкой [201]. Модель TLD 100 поз воляет измерять в проходящем свете интенсивность абсорбции тех пятен, которые поглощают в области 350—650 нм. Денситометр Chromoscan можно использовать для обсчета микрослоев [63].

Аппарат позволяет осуществлять двумерный обсчет площади зо ны вещества лучом монохроматического излучения;

вычисления производятся автоматически. Сравнительно простой денситометр описан в работе [171]. Двухлучевой обсчет точнее, так как умень шает ошибки измерения, вызванные неравномерностью формы и плотности пятен i[23, 150, 151]]. Основными факторами, опреде ляющими точность денситометрирования, являются толщина слоя, время проявления, положение измеряемого пятна в денситометре и содержание воды в сорбенте [44]. Рекомендуется работать в области низких концентраций разделяемых веществ, где соблю дается линейный характер зависимости между измеряемыми ве личинами и количеством веществ [23]. Более подробное описание метода денситометрии и конструкции ряда приборов можно най ти в работах [23, 150, 151]. Денситометрирование можно исполь зовать и для определения величин RF анализируемых веществ {25] (разд. 2.7).

Нередко применяют флуориметрические методы, при которых измеряют флуоресценцию некоторых веществ. Флуориметры име ют источник УФ-излучения, которое через фильтр попадает на хроматографический слой. Вторичное излучение, которое произ водят отдельные вещества, проходит через другой фильтр и попа дает в регистрирующее устройство, снабженное фотоэлементом.

Можно работать и с фотометрами, используемыми в бумажной хроматографии, если слой снять со стеклянной пластинки, или сфотографировать его, или использовать хроматограммы на гиб кой фольге [114]. Измерения производятся по поглощению [60, 85, 264] или пропусканию [64], причем предпочтение чаще отда ется первой методике [60]. При измерениях методом УФ-спектро метрии часто мешают примеси, экстрагируемые из сорбента, от которых бывает очень трудно избавиться;

контрольные экспери менты дают слишком высокие и невоспроизводимые значения.

Положение удается улучшить фильтрованием растворов через синтетические мембранные фильтры (разд. 3.5.4) [175]. Из це лого ряда приборов следует назвать Фотовольт TLC, денситометр модель 530, пригодный для измерения флуоресценции [59], спект рофлуориметр Aminco Bowman [66, 74], применимый не только для измерений флуоресцирующих пятен, но и пятен, погло щающих свет [66], спектрофотометр PMQ II Цейсе с приставкой Camag-Z-Scanner [99, 113]. Упомянутый выше автоматический 158 Общая часть денситометр Vitatron TLD 100 позволяет также измерять флуорес ценцию (при 254, 280, 313, 354, 365, 405, 434, 492, 546 и 578 нм), гашение флуоресценции и проводить измерения поглощения (от ражения) пятен, которым свойственна абсорбция при 254, 280, 313 и 354 нм.

Из других методов заслуживает упоминания количественное определение веществ с помощью рентгеноэмиссионной спектромет рии [5, 121].

Применение методов денситометрии, флуориметрии и спектро фотометрии для количественного определения компонентов сме сей различных органических соединений, разделенных тонкослой ной хроматографией, хорошо освещено в обзорных работах [252, 263,272,276,278].

Подробное описание некоторых современных методов денсито метрического определения лекарственных препаратов имеется в работе [226]1 Сравнительно простая конструкция флуороденсито метра описана в работе польских авторов [231].

3.7.2. Количественное определение веществ после их элюирования из слоя При обнаружении и вымывании веществ из слоя сорбента сле дует придерживаться положений, описанных в разделе, посвящен ном препаративной хроматографии, с той лишь разницей, что в данном случае приходится манипулировать с много меньшими ко личествами веществ. Как и в случае количественного анализа не посредственно на хроматограмме, описываемая методика предпо лагает предварительное построение калибровочного графика, т. е.

на слой наносят раствор стандартного вещества в возрастающей концентраций, а на график наносят измеренные величины. Если в распоряжении имеется раствор стандартного вещества известной концентрации, то можно не строить калибровочный график, а каждый раз сравнивать раствор измеряемого вещества со стан дартным раствором. На хроматограмму наносят как раствор стан дартного вещества, так и раствор определяемого вещества, осу ществляют обычное количественное определение и из полученных данных простым расчетом определяют чистоту исследуемого ве щества. Эта методика удобна тем, что на результаты измерений не оказывают влияния возможные изменения качества и свойств сорбента, а также условия эксперимента. Подробное описание методики приведено в разд. 5.5.2.3. При каждом количественном определении следует проводить контрольный опыт. С хромато граммы отбирают часть свободного слоя сорбента того же разме ра и с той же величиной RF, что и пятно, из которого было элюи ровано вещество. Значения, полученные при обсчете этого образ Общая часть ца, вычитают из значений, полученных при измерении вещества.

Количественные определения чаще всего проводят с помощью ме тодов спектрофотометрии и колориметрии.

Некоторые авторы отдают предпочтение определению ве ществ после их элюирования из слоя, поскольку этот метод поз воляет проводить различные операции с выделенным веществом, повышающие воспроизводимость количественного анализа (взаи модействие с химическими реагентами, гомогенизация, удаление мешающих определению примесей [3]). Удобно работать со слоя. 2-е элюирование О, О б Рис. 69. Способы удаления тонких частиц сорбента при элюировании веществ.

а, б—с помощью фильтровальной бумаги;

в —двумерным проявлением.

ми на гибкой фольге. Вещества с вырезанных пятен можно экст рагировать в аппарате Сокслета [55]. Хроматография на фольге облегчает также проведение элюирования неустойчивых соеди нений в инертной атмосфере [194]1. Для удаления тонких частиц сорбента можно использовать прием, схематически показанный на рис. 69, а, б [47]. С хроматограммы удаляют сорбент (заштри хованная площадь), а к пятнам веществ прикладывают заострен ные полоски фильтровальной бумаги, прикрывают сверху стек лом и проявляют в горизонтальном положении, причем острия бумажных полосок остаются открытыми. В этих местах раствори тель испаряется, а вещества концентрируется на концах полосок.

Эти концы отстригают и экстрагируют. Еще проще можно скон центрировать вещества по схеме, изображенной на рис. 69, в.

С хроматограммы удаляют заштрихованную часть слоя сорбен та и проявляют в открытой кювете в направлении, перпендику лярном направлению предшествовавшего проявления хромато граммы;

при этом вещества скапливаются в заостренных участках слоя [47].

Описано также несколько способов определения веществ пос ле их вымывания из сорбента с использованием техники микро 160 Общая часть элементного анализа. Это относится к азотсодержащим [116] и галогенсодержащим веществам [89]'. Описано также применение ультрамикроанализа органического углерода [204].

i 3.8. Электрофорез в тонких слоях Техника электрофоретического разделения • в тонких слоях в принципе не является новинкой, так как уже в 1946 г. Консден, Гордон и Мартин [36] применили слой силикагеля для разделения этим методом аминокислот и пептидов. Впоследствии на основе этого принципа было разработано много модификаций, и ассор тимент применяемых носителей значительно расширился.

Большое распространение получил электрофорез в тонких сло ях для разделения высокомолекулярных веществ на различных носителях, особенно на агаровом, крахмальном и полиакриламид ном гелях. Благодаря замечательной разделительной способности этот метод нашел применение прежде всего в клинической био химии. Напомним, что в подавляющем большинстве случаев раз деление с помощью этого метода осуществляется на носителях, приготовленных в форме геля. Опыт, накопленный в области хро матографии в тонких слоях, показал, однако, что для разделения некоторых групп веществ, в первую очередь низкомолекулярных, можно с успехом применять и суспензии некоторых сорбентов.

Хотя в настоящее время мы располагаем хорошо разработан ным методом электрофореза на бумаге, пригодным для решения многих задач, использование слоев силикагеля, целлюлозы, а в меньшей мере и иных сорбентов по сравнению с бумагой имеет ряд преимуществ, перечисленных ниже:

1) меньшая адсорбция и, следовательно, меньшая «растяну тость» пятен;

2) меньшая степень диффузии способствует формированию уз ких компактных зон, что одновременно повышает чувствительность обнаружения;

3) возможность использования агрессивных реактивов для обнаружения, особенно при применении сорбентов неорганической природы;

4) большой выбор сорбентов для специальных случаев разде ления;

5) возможность использовать слои различной толщины для препаративного разделения;

6) возможность применять меньший градиент потенциала и более короткое время разделения;

7) более простая техника охлаждения при использовании вы сокого напряжения;

Общая часть 8) сравнительно более простое и легкое вымывание разделен ных веществ из слоя сорбента, что имеет большое значение для количественных определений и препаративного выделения;

9) возможность сочетания электрофоретического и хромато графического разделений.

Необходимая аппаратура и техника разделения в основном такие же, что и при обычно используемых вариантах электрофоре за на других носителях. Электрофорез в слое легко освоить в каж дой лаборатории [144, 145]. Один из стандартных комплектов для электрофореза в тонком слое производит швейцарская фирма Camag [1].

3.8.1. Приготовление слоев для электрофоретического разделения Пластинки готовят обычным способом, как и для простого хроматографического разделения. Для общей информации ниже приведено несколько примеров.

Приготовление слоя силикагеля согласно работе [145]. Стеклянную пластин ку (200X80 мм) тщательно промывают этанолом. На края пластинки приклеива ют полоски фильтровальной бумаги (например, ватман № 1) размером 80X65 мм, которые для улучшения притока буферного раствора имеют продоль ные разрезы. Клей наносят только в отдельные точки, чтобы буфер мог равно мерно проходить через полоски бумаги. Из 4,5 г силикагеля G и 8 мл 3%-ного раствора борной кислоты готовят суспензию, наливают ее на пластинку и раз равнивают, причем слой силикагеля должен покрыть и участки бумажных поло сок, приклеенных к краям пластинки. Слой высушивают 25 мин при комнатной температуре. Толщина слоя составляет около 0,4 мм. После фиксирования на пластинке места старта и нанесения образца последующие операции производят согласно обычным методикам, применяемым в электрофорезе. По окончании раз деления полоски бумаги отрезают, слой высушивают и проводят обнаружение.

Та же методика используется и при работе со слоями из кизельгура.

Если градиент напряжения не превышает 10 В/см, слой можно не охлаж дать. При работе с большим градиентом стеклянную пластинку со слоем поме щают на металлический блок с водным охлаждением.

Приготовление слоя окиси алюминия по Хонеггеру [81]. 25 г окиси алюми ния G (фирма Merck) смешивают с 50 мл дистиллированной воды или 0,1 М цитратного буфера рН 3,8. Полученную суспензию наносят на стеклянную пла стинку размером 200X200 мм. После высушивания при комнатной температуре или при П0°С для получения нужной степени влажности (90—200%) слои, при готовленные из водной суспензии, опрыскивают подходящим буфером или, наобо рот, слои, приготовленные из суспензии в буфере, опрыскивают дистиллирован ной водой. После нанесения образца проводят разделение.

Приготовление слоя целлюлозы по методу Уолкера и Барка [212]. На стек лянную пластинку размером 100X100 или 200X200 мм наносят водную суспен зию целлюлозы ватман СС 41 или MN 300 (толщина слоя 250 мкм). Слои сушат сначала в токе теплого воздуха, затем 30 мин при 120 °С или в эксикаторе над силикагелем — это зависит от конкретных условий эксперимента. После высу шивания с каждой стороны пластинки срезают лезвием примерно односантимет ровую полоску слоя и опрыскивают пластинку раствором соответствующего бу фера так, чтобы слой стал матовым (90—200% влажности). Потом пластинку помещают в камеру и бумажными полосками соединяют ее с электродными ван 11— 162 Общая часть ночками, заполненными буферным раствором. Образец наносят на стартовую линию в минимальном объеме растворителя и по возможности быстро, чтобы буферный раствор не упаривался.

В некоторых случаях суспензию сорбента готовят сразу в буферном раство ре;

перед проведением разделения слой смачивают дистиллированной водой.

Этот способ применим только в том случае, если буфер не содержит летучих соединений.

В настоящее время многие фирмы производят готовые пластинки на фольге для электрофоретического разделения. При использовании таких пластинок от падает необходимость довольно трудоемкого приготовления слоев сорбентов.

В ЧССР такие пластинки производит предприятие Kavalier, завод в Вотице, под названием силуфол для электрофореза. Эти пластинки представляют собой слои силикагеля силпирл, нанесенные на фольгу из электроизоляционного материала (на бумагу, пропитанную полиэтиленом).

Для улучшения разделения компонентов смеси можно комбинировать элект рофорез с хроматографией. Для электрофоретического разделения, однако, нуж но использовать такой буфер, который не помешал бы при последующем хрома тографическом делении во втором направлении (лучше всего использовать ле тучие буферы). После электрофоретического разделения в одном направлении слой высушивают, например, в струе теплого воздуха, чтобы полностью удалить следы кислот, часто входящих в состав буферных смесей, и затем проводят хро матографическое разделение во втором направлении.

Сочетание методов в обратной последовательности (хроматография — элект рофорез) не очень удобно, так как возможное вымывание и размывание зон не которых разделенных веществ при опрыскивании буферным раствором перед электрофорезом может сильно ухудшить качество разделения.

ЛИТЕРАТУРА 1. Camag thin layer electrophoresis, 1972 (проспект фирмы).

2. Abbott D. С, Thomson J., Analyst, 89, 613 (1964).

3. Ackermann G., Lowe W., J. Chromatogr., 78, 175 (1973).

4. Achaval A., Ellefson R. D., J. Lipid Res., 7, 329 (1966).

5. Alter J., Diehlmann D., Beydatsch R., Kohler P., Quass D., Spichale W., Z.

Analyt. Chem., 233, 1888 (1968).

6. Amos R., J. Chromatogr., 48, 343 (1970).

7. Arm H., Cramer Y., Chimia, 27, 541 (1973).

8. Arx E., von, J. Chromatogr., 64, 297 (1972).

9. Bacon M. F., J. Chromatogr., 16, 552 (1964).

10. Bancroft К. С С, Chem. Ind. (London), 1966, 621.

11. Battista H. ]., Machata G., Chromatographia, 1, 104 (1968).

12. Bazan N. G., Joel С D., J. Lipid Res., 11, 42 (1970).

13. Beckstead H. D., French W. N.. Smith S. J., J. Chromatogr., 31, 226 (1967).

14. Bell С. E., Chem. Ind. (London), 1965, 1025.

15. Bennett R. D., Heftmann E., J. Chromatogr., 9, 353 (1962).

16. Bennett R. D., Heftmann E., J. Chromatogr., 12, 245 (1963).

17. Bennett R. D., Heftmann E., J. Chromatogr., 21, 488 (1966).

18. Bergelson L. D., Djatlovickaya E. V., Voronkova V. V., J. Chromatogr., 15, 191 (1964).

19. Berthold I., Z. Analyt. Chem., 240, 320 (1968).

20. Bierl B. A., Beroza M., Aldridge M. H., Analyt. Chem., 43, 636 (1971).

21. Bloomer J. L, Eder W. R., J. Chromatogr., 34, 548 (1968).

22. Borka L, J. chem. Educ, 45, 401 (1968).

23. Boulton A. A., Pollak V., J. Chromatogr., 45, 189 (1969).

24. Boyle P. H., Nelson P. H., Chem. Ind. (London), 1967, 1220.

25. Brain K- R-, J. Chromatogr., 75, 124 (1973).

Общая часть 26. Brendel К-, Steele R. S., Davidson E. A., J. Chromatogr., 30, 232 (1967).

27. Brenner M., Niederwieser A., Experientia, 17, 237 (1961).

28. Brinkmann N. A. Th., de Vries G., J. chem. Educ, 49, 545 (1972).

29. Brockmann H. P., Volpers F., Chem. Ber., 80/77 (1947).

30. Cartoni G. P., Cavalli A., J. Chromatogr., 37, 159 (1968).

31. Caster W. O., Andrews J. W., J. Chrom. Sci., 7, 408 (1973).

32. Clark G. W., J. Chromatogr., 34, 262 (1968).

33. Clemett J. J., Analyt. Chem., 43, 490 (1971).

34. Collins R. F., Chem. Ind. (London), 1969, 614.

35. Conolly J. P., Flanagan P. J., Dorchai R. O., Thomson J. В., J. Chromatogr., 15, 105 (1964).

36. Consden R., Gordon A. H., Martin A. I. P., Biochem. J., 40, 33 (1946).

37. Contractor S. F., J. Chromatogr., 20, 182 (1965).

38. Copius-Peereboom J. W., Beekes H. W., J. Chromatogr., 9, 316 (1962).

39. Cremer E., Deutscher F., Fill P., Nau H., J. Chromatogr., 48, 132 (1970).

40. Cremer E., Kraus Th., Nau H., Z. Analyt. Chem., 245, 37 (1969).

41. Curry A. S., In: Porter E (Editor): Gas chromatography in biology and me dicine. Churchill, London, 1969, p. 132.

42. Curtius H. Ch., Muller M., J. Chromatogr., 32, 222 (1968).

43. Cerny V., Joska J., Ldbler L., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 26, 1658 (1961).

44. Dallas M. S. J., J. Chromatogr., 33, 337 (1968).

45. Dallas M. S. J., J. Chromatogr., 48, 193 (1970).

46. Davies В. Н., J. Chromatogr., 10, 518 (1963).

47. De Deyne V. J. R., Vetters A. F., J. Chromatogr., 31, 261 (1967).

48. De Klein W. J., Analyt. Chem., 41, 667 (1969).

49. De Osso F. J., J. Chromatogr., 58, 294 (1971).

50. De Osso F. J., J. Chromatogr., 60, 270 (1971).

51. Deyl Z., Posmus J., Pavlicek M., Chromatogr. Rev., 6, 19 (1964).

52. De Zeeuw R. A., Analyt. Chem., 40, 915 (1968).

53. De Zeeuw R. A., Analyt. Chem., 40, 2134 (1968).

54. De Zeeuw R. A., J. Chromatogr., 48, 27 (1970).

55. Dibbern H. W., Ott D., Wirbitzki E., Dtsch. Apoth.-Ztg., I l l, 1649 (1971).

56. Di Tullio V., Chem. Ind. (London), 1965, 1026.

57. Elgamal M. H. A., Fayez M. В. Е., Z. Analyt. Chem., 226, 408 (1967).

58. Farmer L. В., J. Chromatogr., 16, 412 (1964).

59. Fischer L. J., Riegelman S., J. Chromatogr., 21, 268 (1966).

60. Frei R. W., J. Chromatogr., 64, 285 (1972).

61. Ganshirt H., Waldi D., Stahl E., In: Stahl E.: Dunnschicht-Chromatographie.

1. ed. Springer-Verlag, Berlin, 1962;

p. 367.

62. Geiss F., Sandroni S., J. Chromatogr., 33, 201 (1968).

63. Goldman J., Goodall R. R., J. Chromatogr., 40, 345 (1969).

64. Goldman J., Goodall R. R., J. Chromatogr., 47, 386 (1970).

65. Goodall R. R., J. Chromatogr., 73, 161 (1972).

66. Gordon H. Т., J. Chromatogr., 22, 60 (1966).

67. Grindlay J. W., Wright L C, Chem. Ind. (London), 1966, 1377.

68. Gritter R. J., Albers R. ]., J. Chromatogr., 9, 392 (1962).

69. Gupta G. N., J. Chromatogr., 41, 467 (1969).

70. Hais I. M., J. Chromatogr., 48, 200 (1970).

71. Хайс И. М., Мацек К-, Хроматография на бумаге. — М.: Мир, 1962.

72. НаЫ /., Chromatographia, 5, 357 (1972).

73. HalpaapH., Chem. Ing. Technik, 35, 488 (1963).

74. Hamman B. L, Martin M. M., Analyt. Biochem., 20, 423 (1967).

75. Hamman B. L., Martin M. M., Steroids, 10, 169 (1967) 76. Hannig G., Lenk H. P., Z. Analyt. Chem., 247, 281 (1969).

77. Hara S., Mibe K., J. Chromatogr., 66, 75 (1972).

11»

164 Общая часть 78. Hayden A. L, Brannon W. L., Craig N. R., J. pharm. Sci., 57, 858 (1968).

79. Heusser D., Dtsch. Apoth.-Ztg., 105, 1101 (1965).

80. Hirayama K-, I. Chromatogr., 26, 276 (1967).

81. Honegger С G., Helv. chim. Acta, 44, 173 (1961).

82. Honegger С G., Helv. chim. Acta, 45, 1409 (1962).

83. Honegger С G., Helv. chim. Acta, 46, 1730 (1963).

84. Horobin R. W., J. Chromatogr., 37, 354 (1968).

85. Huber W., J. Chromatogr., 33, 378 (1968).

86. Huttenrauch R., Schulze J., Pharmazie, 19, 334 (1964).

87. Chahl J. S., Kratzing С. С, Clin. chim. Acta, 26, 177 (1969).

88. Ikan R., Rapaport E., J. chem. Educ, 44, 297 (1967).

89. Imai Y., Yamaucti K-, Terabe S., Konaka R., Sugita J., J. Chromatogr., 36, 545 (1968).

90. landk J., J. Chromatogr., 15, 15 (1964).

91. Janak J., J. Chromatogr., 48, 279 (1970).

92. Janak J., J. Gas Chromatogr., 1, No. 10, 2P (1963).

93. Janak J., Nature, 195, 696 (1962).

94. Janak J., In: Macek K- (Editor): Pharmaceutical applications in thin-layer and paper chromatography. Elsevier Publishing Company, Amsterdam, 1972, p. 91.

95. Jandk J., In: Pataki G. (Editor): Progress in thin-layer chromatography and related methods. Vol. II. Humphrey, Ann Arbor, 1971.

96. Janak J., KUmes /., Hdna K., J. Chromatogr., 18, 270 (1965).

97. Janchen D., J. Chromatogr., 14, 261 (1964).

98. Janchen D., J. Chromatogr., 33, 195 (1968).

99. Janchen D., Pataki G., J. Chromatogr., 33, 391 (1968).

100. Johansson L., Kashemsanta S., J. Chromatogr., 45, 471 (1969).

101. Jordan D., J. chem. Educ, 45, 510 (1968).

102. Jordan D. M., J. Chromatogr., 57, 427 (1971).

103. Jordan D. M., J. Chromatogr., 63, 442 (1971).

104. Jork H., J. Chromatogr., 33, 297 (1968).

105. Jork H., Analyt. Chem., 236, 310 (1968).

106. Kaess A., Mathis C, Ann. pharm. franc., 24, 753 (1966).

107. Kaiser R., Chromatographie in der Gasphase, IV. Quantitative Auswertung, Bibliographisches Institut, Manheim, 1965, p. 278.

108. Kaiser R., In: Ettre L. S., McFadden W. H. (Editors): Ancillary techniques of gas chromatography. Wiley Interscience, New York, 1969, p. 299.

109. Kaiser R., Z. Analyt. Chem., 205, 284 (1964).

110. Kasang G., Rembold H., J. Chromatogr., 71, 101 (1972).

111. Kaufmann M. P., Makus Z., Khoe T. F., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, (1962).

112. Kaye I. A., Mikrochim. Acta, 2, 315 (1967).

113. Keuker H., Chromatographia, 4, 40 (1971).

114. Keyworth D. A., Swensen R. F., Talanta, 13, 829 (1966).

115. Klein F. K., Rapoport H., J. Chromatogr., 47, 505 (1970).

116. Konaka R., Terabe S., J. Chromatogr., 24, 236 (1966).

117. Ldbler L, Schwarz V. et al., Chromatografie na tenke vrstve. Nakladatelstvi CSAV, Praha, 1965.

118. Lautenschtager №., Pahlke S., Tolg G., Z. Analyt. Chem., 260, 203 (1972).

119. Lehrfeld J., J. chem. Educ, 46, 848 (1969).

120. Lenk H. P., Gleich W., J. Chromatogr., 43, 350 (1969).

121. Libby R. A., Analyt. Chem., 40, 1507 (1968).

122. Liebemann R., Schuhmann H., Chem. Technik (Berlin), 19, 693 (1967);

Chem.

Abstr., 69, 8282 (1968).

123. Lisboa B. P., Acta Endocrinol., 43, 47 (1963).

124. Lisboa B. P., J. Chromatogr., 24, 475 (1966).

125. Lisboa B. P., J. Chromatogr., 48, 364 (1970).

Общая часть 126. Ma J. С. N.. J. Chromatogr., 21, 151 (1966).

127. Maing I. Y., Lillard H. S., Ayres I. C, J. Amer. Oil Chem. Soc, 47, (1970).

128. Mangold H. K., Kammereck R., Chem. Ind. (London), 1961, 27, 1032.

129. Marcus B. J., Fono A., Ma T. S., Mikrochim. Acta, 1967, 960.

130. Marian M., J. Chromatogr., 42, 117 (1969).

131. Marujama Y., Igaku to Seibutsugaku, 73, 20 (1966);

Chem. Abstr., 69, (1968).


132. Matthews J. S., Pereda L., Aguilera A., J. Chromatogr., 9, 331 (1962).

133. Mistrjukov E. A., J. Chromatogr., 9, 311 (1962).

134. Mitsev I., Slavceva J., Popov A., C.R. Acad. Bulg. Sci., 20, 693 (1967);

Chem.

Abstr., 68, 18469 (1968).

135. Morgan M. E., J. Chromatogr., 9, 379 (1962).

136. Morris L. J., Chem. Ind. (London), 1962, 1238.

137. Mulder J. L., Veenstra G. J., J. Chromatogr., 24, 250 (1966).

138. Musgrave A., J. Chromatogr., 41, 470 (1969).

139. Narasimhulu S., Keswani I., Flickinger G. L, Steroids, 12, 1 (1968).

140. Netting A. G., J. Chromatogr., 53, 507 (1970).

141. Nixon R., Analyt Biochem., 48, 460 (1968).

142. Nybom M., J. Chromatogr., 28, 447 (1967).

143. Pastuska G., Z. Analyt. Chem., 179, 427 (1961).

144. Pastuska G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 85, 535 (1961).

145. Pastuska G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 86, 135 (1962).

146. Petrowitz H. J., Chemiker-Ztg., 93, 329 (1969).

147. Pfeifer I. J., Microchim. Acta, 1962, 529.

148. Pogacar P., Kienle В., Krapp P., Lohrsen K-, J. Chromatogr., 29, (1967).

149. Polesuk J., Ma T. S., Microchim. Acta, 1971, 662.

150. Pollak V., Boulton A. A., J. Chromatogr., 45, 200 (1969).

151. Pollak V., Boulton A. A., J. Chromatogr., 63, 87 (1971).

152. Porges E., Porgesova L., Chem. zvesti, 19, 497 (1965).

153. Prusikova M., Experientia, 15, 460 (1959).

154. Przybylowicz E. P., Staudenmayer W. J., Perry E. S., Baitsholts A. D., Ti scher T. N.. J. Chromatogr., 20, 506 (1965).

155. Purdy S. I., Truter E. V., Analyst, 87, 802 (1962).

156. Purdy S. J., Truter E. V., Chem. Ind. (London), 1962, 506.

157. Reisert P. M., Schumacher D., Experientia, 19, 84 (1963).

158. Rice D. D., Analyt. Chem., 39, 1906 (1967).

159. Ritter F. J., Meyer G. M., Nature, 193, 941 (1962).

160. Rix M. J., Webster B. R., Wright I. C, Chem. Ind. (London), 1969, 452.

161. Rozumek К. Е., J: Chromatogr., 40, 97 (1969).

162. Ruseva-Atanosova N.. Janak J., J. Chromatogr., 21, 207 (1966).

163. Rybicka S. M., Chem. Ind. (London), 1962, 308.

164. Samuels S., J. Chromatogr., 32, 751 (1968).

165. Sandroni S., Schlitt H., J. Chromatogr., 52, 169 (1970).

166. Sounders D. L., Snyder L. R., J. Chrom. Sci., 8, 706 (1970).

167. Seher A., Nahrung, 4, 466 (1960).

168. Seher A., Homberg E., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 73, 557 (1971).

169. Seller N., J. Chromatogr.,. 63, 97 (1971).

170. Shaw P. E., Carter R. E., Berry R. E., J. Chromatogr., 47, 507 (1970).

171. Schekerdijev N., Dshoneydi M., Koleva M., Budewski O., Pharmazie 28, 199 (1973).

172. Schwartz J. #., Pade A., J. Chromatogr., 34, 549 (1968).

173. Schwarz V., не опубликовано.

174. Sims R. P. R., Ings G. M., McKUlican M. E., Larose J. A. G., Lipids, 1, 452 (1966).

175. Spencer R. D., Beggs В. Н., J. Chromatogr., 21, 52 (1966).

166 Общая часть 176. Stahl E., Analyst., 94, 723 (1969).

177. Stahl Е., Angew. Chem., 73, 646 (1961).

178. Stahl E., Arch. Pharm., 292, 411 (1959).

179. Stahl E., Arch. Pharm., 293, 523 (1960).

180. Stahl E., J. Chromatogr., 37, 99 (1968).

181. Stahl E., Parf. und Kosmetik, 39, 564 (1958).

182. Stahl E., Z. Analyt. Chem., 221, 3 (1966).

183. Stahl E., Dutnont E., J. Chrom. Sci., 7, 517 (1969).

184. Stahl E., Dutnont E., Talanta, 16, 657 (1969).

185. Stahl E., Fuchs J., Dtsch. Apoth.-Ztg., 108, 1227 (1968).

186. Stahl E., Kaltenbach U., J. Chromatogr., 5, 458 (1961).

187. Stahl E., Kraus Lj., Arzneimittel-Forsch., 19, 684 (1969).

188. Stahl E., Kraus Lj., Cs. farm., 18, 486 (1969).

189. Stahl E., Kraus Lj., Gross H., Fette, Seifen, Anstrichmittel.

190. Stahl E., Schild W., J. Chromatogr., 53, 387 (1970).

191. Stdrka L., J. Chromatogr., 4, 334 (1960).

192. Starka L., Hampl R., J. Chromatogr., 12, 347 (1963).

193. Suchy V., Rada K-, Majerova A., Farm, obzor, 34, 354 (1965).

194. Suter H., Conti J., Litmanowitsch M., Grossmann A., Hedinger A., Helv.

chim. Acta, 56, 866 (1973).

195. Szekely G., J. Chromatogr., 42, 543 (1969).

196. Szekely G., J. Chromatogr., 48, 313 (1970).

197. Tate M. E., Bishop С. Т., Canad. J. Chem., 40, 1043 (1962).

198. Teichert K-, Mutschler E., Rochelmeyer H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 100, (1960).

199. Teichert K, Mutschler E., Rochelmeyer H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 100, 477 (1960).

200. Thonia J. A., Analyt. Chem., 35, 214 (1963).

201. Tichy~ J., J. Chromatogr., 32, 580 (1968).

202. Touchstone J. C, Balin A. K-, Murawec Т., Kasparow M., J. Chrom. Sci., 8, 443 (1970).

203. Truter E. V., J. Chromatogr., 14, 57 (1964).

204. Tsujino Y., Imai Y., Yamauchi K., Sugita J., J. Chromatogr., 42, 419 (1969).

205. Turina S., Marjanovic-Krajovan V., Soljic Z., Analyt. Chem., 40, 471 (1968).

206. Turner С R., J. Chromatogr., 22, 471 (1966).

207. Vandenheuvel F. A., J. Chromatogr., 25, 102 (1966).

208. Van Dijk J. H., Z. Analyt. Chem., 236, 326 (1968).

209. Vioque E., Holman R. Т., J. Amer. Oil Chem. Soc, 39, 816 (1962).

210. Visser R., Analyt. chim. Acta, 38, 157 (1967).

211. Volke J., Oelschlaeger H., Sci. Pharm. Proa, 25th, 1965, 2, 105;

Chem. Abstr., 70, 31694 (1969).

212. Walker W. H. C, Bark M., Clin. chim. Acta, 13, 241 (1966).

213. Walsh J. M., J. chem. Educ, 44, 24 (1967).

214. Wang К. Т., Wang I. S. Y., J. Chromatogr., 24, 458 (1966).

215. Wasicky R., Naturwissensch., 50, 569 (1963).

216. Weaver T. D., Teegarden D. M., J. Chromatogr., 41, 118 (1969).

217. Wieland Th., Determann #., Experientia, 18, 430 (1962).

218. Wilk M., Hoppe U., Taupp W., Rochlitz J., J. Chromatogr., 27, 311 (1967).

219. Willhalm B. W., Symposium on the combination of gas chromatography and mass spectrometry. Zurich, February 24, 1968.

220. Winter M., Gautschi F., Flament I., Willhalm B. W., SMI M., Aroma und Geschmacksstoffe in Lebensmitteln. Forster-Verlag, Zurich, 1967, p. 165.

221. Witte K., Dissinger O., J. Chromatogr., 28, 413 (1967).

222. Witte K, Dissinger O., 2. Analyt. Chem., 236, 119 (1968).

223. Wollenweber P., J. Chromatogr., 33, 175 (1968).

224. Wood R., Snyder F., J. Amer. Oil Chem. Soc, 43, 53 (1966).

225. Barrett G. C, Adv. Chromatogr., 11, 145 (1974).

226. Bethke H., Frei R. W., J. Chromatogr., 91, 433 (1974).

Общая часть 227. De Deyne V. J. R., Vetters A. F., J. Chromatogr., 103, 177 (1975).

228. Folk H., Krummen K-, J. Chromatogr., 103, 279 (1975).

229. Frgasic S., Kniewald Z., J. Chromatogr., 94, 291 (1974).

230. Holler H. J. A., Sci. Pharm., 43, 117 (1975).

231. Chelkowski J., Kokomlak L, Chem. analityczna, 19, 555 (1974).

232. Karig F., Dtsch. Apoth.-Ztg., 115, 325 (1975).

233. Kirchner J. G., J. Crom. Sci., 13, 558 (1975).

234. Косматый E. С, Бублик Л. И., Укр. хим. журн., 40, 1316 (1974);

Chem.

Abstr., 82, 137835 (1975).

235. Macek К., Hais I. M., Farm, obzor, 44, 497, 533 (1975).

236. Martin I. L, Duncombe R. E., Shaw W. H. C, Analyst., 100, 243 (1975).

237. Perry J. A., J. Chromatogr., 113, 267 (1975).

238. Prasad R. S., Gupta A. S., Sukh Dev, J. Chromatogr., 92, 450 (1974).

239. Ripphahn J., Halpaap H., J. Chromatogr., 112, 81 (1975).

240. Rosencwaig A., Hall S. S., Analyt. Chem., 47, 548 (1975).

241. Sable-Amplis R., Agid R., Abadie D., J. Chromatogr., 94, 287 (1974).

242. Gietz W., Boulton A. A., Pollak V., J. Chromatogr., 107, 81 (1975).

243. Stahl E., Karig F., Z. Analyt. Chem., 265, 81 (1973).

244. Stahl E., Muller Th. К- В., Z. Analyt. Chem., 274, 257 (1975).

245. Stahl E., Schmitt W., Arch. Pharm., 308, 570 (1975).

246. Sita F., Chmelova-Hlavata V., Chmel K, J. Chromatogr., 91, 441 (1974).

247. Thielemann H., Z. Analyt. Chem., 271, 32 (1974).

248. Van Den Eijnden D. H., Analyt. Biochem., 57, 321 (1974).

249. Wiegrebe W., Wehrhahn L, Arzneimittel-Forsch., 25, 517 (1975).

250. Wotschokowsky M., Kontakte (Merck.), 1975, Nr. 1, 14.

251. Zullich G., Braun W., Lisboa B. P., J. Chromatogr., 103, 396 (1975).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА 252. Blesova M., Zahradnicek M., Cs. farm., 27, 77 (1978).

253. Bucher D., Chromatographia, 10, 723 (1977).

254. Davies R. D., Chem. Ind. (London), 845, 1978.

255. Ebel S., Hocke J., Chromatographia, 10, 123 (1977).

256. Faber D. В., J. Chromatogr., 142, 421 (1977).

257. Fenimore D. C, Meyer C. J., Davis С M., Hsu F., Zlatkis A., J. Chromatogr., 142, 399 (1977).

258. Георгиевский В. П., Бублик Н. П., Фарм. журнал (Киев), (1974), №5, 29, 46.

259. Gietz W., Boulton A. A., Pollak V., J. Chromatogr., 107, 81 (1975).

260. Gilpin R. К., Sisco W. R., J. Chromatogr., 124, 257 (1976).

261. Halpaap H., Ripphahn J., Chromatographia, 10, 613, 643 (1977).

262. Hara S., J. Chromatogr., 137, 41 (1977).

263. Hezel U., GIT Fachz. Lab., 22, 595 (1978);

Chem. Abstr., 89, 145097J (1978).

264. Hiermann A., Kartnig Т., J. Chromatogr., 140, 322 (1977).

265. Jupille Т. Н., Perry J. A., Science, 194, 288 (1976).

266. Jupille T. H., J. Am. Oil Chem. Soc, 54, 179 (1977).

267. Kreuzig F., J. Chromatogr., 142, 441 (1977).

268. Perry I. A., J. Chromatogr., 110, 27 (1975);

ibid (1975), 113, 267.

269. Perry J. A., Jupille T. H., Glunz L. J., Analyt. Chem., 47, No. 1, 65A—74A (1975).

270. Platt S. G., Anal. Biochem., 91, 357 (1978).


271. Preiss E., Analyt. Chem., 49, 671 (1978).

272. Segura R., Gotto A. M., J. Chromatogr., 99, 643 (1974).

273. Sita P., Chmelova-Hlavata V., Chmel K-, J. Chromatogr., 91, 441 (1974).

274. Sliwowski J. K-, Caspi E., i. Steroid Biochem., 8, 42 (1977).

275. Thielemann H., Pharmazie, 32, 243 (1977).

276. Touchstone J. C, Dobbins M. F., Can. Res. Dev., 8, No. 3, 13 (1975);

Chem Abstr., 83, 74835m (1975).

277. Treiber L. R., J. Chromatogr., 124, 69 (1976).

278. Zeches M., Ledouble G., Massa V., Sci. Tech. Pharm., 3, 617 (1974).

РАДИОХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКИХ СЛОЯХ 4.

Подобно другим хроматографическим методам, хроматографию в тонких слоях все чаще применяют для разделения радиоактив ных соединений и для анализа сложных систем с использованием радиоактивных индикаторов. Радиохроматографию в тонких сло ях применяют при изучении метаболизма веществ, для определе ния чистоты продуктов синтеза этих соединений, для доказатель ства наличия следовых загрязнений, для определения продуктов разложения в лекарственных препаратах и т. д. [63, 118, 120, 143—145]. Хотя радиохроматография в тонком слое имеет много общих черт с радиохроматографией на бумаге, между этими ме тодами существуют большие различия, перечисленные в табл. 7.

Методика разделения радиоактивных соединений ничем не от личается от разделения неактивных веществ. Разница заключа ется только в способе обнаружения. Методом ТСХ можно разде лять как радиоактивные вещества, так и радиоактивные произ водные неактивных веществ. С помощью радиоактивных обнару жителей можно детектировать и неактивные вещества, присутст вующие на хроматограмме.

Таблица Основные различия между радиохроматографией в тонком слое и на бумаге [117] Емкость Метод Преобладающий процесс Измерение радиоактивности От мкг Радиохрома- Адсорбция (за исключе- 1) обсчет полосы в геомет тография в нием хроматографии до мг рии 2я;

2) авторадиография;

тонком слое с обращением фаз, в слоях с ионообменной 3) применение жидких смолой, полиамидом, сцинтилляторов — сос сефадексом) кабливание мкг Распределение в систе- 1) обсчет полосы в геомет Радиохрома тография на ме жидкость — жид- рии 4я;

бумаге 2) авторадиография;

кость (за исключением 3) применение жидких сцин пропитки сорбентом) тилляторов — разреза ние хроматограммы на сегменты Общая часть 4.1. Методика и оборудование для проведения радиохроматографии в тонких слоях Тонкослойные радиохроматограммы обсчитывают либо непо средственно, либо после элюирования исследуемых соединений, как и при работе с неактивными веществами. Обнаружение радио активных изотопов и меченых соединений, разделенных в слоях сорбентов, осуществляют авторадиографическим или радиометри ческим методом.

4.1.1. Расчет тонкослойных радиохроматограмм с помощью метода авторадиографии Радиоактивное излучение действует на фотографическую эмульсию точно так же, как свет. После проявления фоточувст вительного материала возникает изображение, фиксирующее ло кализацию радиоактивности в изучаемом объекте (авторадио грамма). Авторадиографический метод может быть использован и для обнаружения тонкослойных радиохроматограмм. При этом получают устойчивое изображение размещения радиоактивных пятен. Преимущества этого метода состоят в том, что он не тре бует применения сложной аппаратуры, прост, дешев и позволяет получать изображение пятна (положение и форму) с точностью, превышающей точность многих других методов. Этот метод ис пользуется прежде всего в тех лабораториях, которые не обору дованы счетчиками. Основы авторадиографии разбираются во многих публикациях, например [4, 12, 29, 30, 95, 157].

В лабораторной практике чаще всего применяется безопасная пленка No-Screen Medical X-Ray фирмы Eastman Kodak (Роче стер, 4, Нью-Йорк, США). Эмульсия этого материала очень чув ствительна, и разрешающая способность его [111] соответствует требованиям метода хроматографии в тонких слоях [90]'. С ус пехом можно использовать аналогичные материалы других фирм, например Agfa или Foma. Важно, чтобы пленка была предназна чена для использования без экрана, как, например, пленки, при меняющиеся в стоматологии.

Техника авторадиографии тонкослойных радиохроматограмм сравнительно проста. Сухую хроматограмму прикладывают к рентгеновской пленке, заворачивают в черную бумагу и произ водят экспонирование. Удобно использовать специальные держа тели (кассеты с прижимным устройством), которые обеспечивают тесный контакт хроматограммы с фотографическим материалом (рис. 70) [121]. Равномерный контакт пленки с хроматограммой очень важен, особенно при детектировании соединений, меченных тритием, так как каждая десятая доля миллиметра зазора (при измерении в воздухе) означает гашение излучения на 15%.

170 Общая часть При использовании этого метода на хроматограмме должны отсутствовать немеченные соединения, обладающие восстанавли вающими свойствами, например фенолы, способные вызвать по чернение эмульсии. Хроматограмму после проявления необходимо тщательно высушить, чтобы при контакте с пленкой в хромато графическом слое полностью отсутствовал растворитель. Часто даже следы химикатов, которые были использованы для приго товления системы растворителей, могут вызвать появление на пленке артефактов. В случае ес ли имеет место взаимодействие между определяемым веществом, например эстрадиолом [101], и фотографической эмульсией, хро матограмму покрывают пласт массовой пленкой.

Поскольку тонкослойные хро а матограммы, как правило, не от личаются механической прочно Рис. 70. Схема установки для снятия авторадиограмм с тонкослойных ра- стью, их целесообразно укре диохроматограмм.

пить, опрыскивая специальным а — кассета для пленки и хроматограммы;

составом, например крилоном / — тонкослойная хроматограмма;

2 — рент геновская пленка;

3 — крышка-держатель;

(фирма Krylon, Норристаун, Пен б — система, обеспечивающая тесный кон сильвания, США). Крилон прак такт пленки с хроматограммой;

4 — п р у жинный з а ж и м ;

5 — фанера;

6 — пружиня тически не поглощает излучение щие губчатые прокладки.

даже в том случае, если приме няются р-излучатели с низкой энергией, например тритий. Если используются р-излучатели более высокой энергии, то при прове дении авторадиографии всю хроматограмму заворачивают в тон кую пластмассовую пленку, например, марки Mylar (фирма Е. P. Dupont de Nemours, Уилмингтон, США).

Для приблизительного определения продолжительности экс позиции при получении авторадиограмм можно пользоваться таб лицей Снайдера (табл. 8) [121].

При использовании соединений, меченных С, хроматограмму выдерживают в контакте с рентгеновской пленкой от 1 до 8 дней (рис. 71). Длительность экспозиции пленки с хроматограммой ве ществ, меченных тритием, составляет несколько недель, в то вре мя как при работе с веществами, меченными 3 2 Р и Ш 1, это время колеблется от 30 мин до 1 ч. При работе с радиоизотопами, требу ющими для снятия авторадиограммы многонедельной экспозиции, тонкослойные хроматограммы в контакте с пленкой хранят в хо лодильнике. По истечении необходимого времени экспозиции пленку проявляют по стандартной фотографической прописи [31, 75, 109, 121] Определенные трудности связаны с получением авторадиограмм Таблица Руководство для выбора приблизительной продолжительности экспозиции при снятии авторадиограмм с тонкослойных радиохроматограмм [121] Радиоактивный Радиоактивность, Рекомендуемое приблизи Площадь пятнаа, мм2 имл./мин изотоп тельное время экспозиции м с 4 сут 10 000 2 сут 20 000 17 ч 17 ч 200 4 сут ] 10 000 3 сут 20 000 2 сут 20 000 2 сут 2 000 150 сут •"Н 20 000 150 сут 50 000 150 сут 500 000 20 сут 2 20 000 — 50 000 1 5 0 сут 500 000 20 сут Зф 24 ч 500 12 ч 2 500 3ч 25 000 3ч 50 000 3ч 24 ч 500 12 ч 2 500 3ч 25 000 3ч 50 000 3ч 131J 24 ч 500 24 ч 1000 8 ч 5 000 2 ч 10 000 0,5 ч 0,5 ч 20 24 ч 380 24 ч 24 ч 5 000 4 ч 2 ч 10 20 000 0,5 ч а Объему 5Я, на тонкослойной хроматограмме соответствует пятно площадью около 130 мм2, а объему образца 50Л, — пятно площадью примерно 380 мм2.

172 Общая часть веществ, меченных тритием, из-за короткого пути пробега р-ча стиц в фотографической эмульсии [153]. В этих случаях приме няют пленки с очень чувствительной эмульсией, например пленку кодак типа NTD [109] ил'и другой специальный фотоматериал [31]. Чувствительность авторадиографии можно повысить им прегнированием слоя сорбента сцинтиллирую ||§|щ#1§|щш|шшр|ш§1111 щей жидкостью, I. с п р и м е н и в сцигии^ихмци ^^^^^^^^^В Авторадиограммы рассчитывают, исполь ^•••«•••••^И у Я фотометрическое определение степени по чернения;

однако количественные определе ния занимают много времени. Вещества, при сутствующие в меньших количествах, количе «m ственно оценить очень сложно, так как излу чение основных компонентов анализируемой смеси насыщает фотографический материал раньше, чем можно заметить действие излу чения минорных продуктов. Применение мето дов фотоденситометрии и планиметрирования невозможно, если различные радиоактивные фракции разбавлены различными количества ми немеченого материала.

Авторадиография является наиболее про стым методом детектирования радиоактивно сти на двумерных хроматограммах. Этот ме тод дает возможность получать записи рас пределения активности на хроматограммах, которые можно сравнивать визуально. Полу чение авторадиограмм с тонкослойных хрома Рис. 71. Авторадио тограмм описано во многих работах (напри грамма соединений, меченных 1 4 С, разде- мер, [16, 52].

ленных хроматогра В последние годы получил широкое рас фией в тонком слое.

пространение метод сцинтилляционной авто радиографии [17, 54, 70, 71, 153]. Тонкослой ную хроматограмму помещают в плоский сосуд с хорошо гермети зирующей крышкой, заливают сцинтилляционной жидкостью, на пример раствором /z-дифенилбензола в толуоле, не содержащем серы (3 г на литр), или насыщенным раствором антрацена в бен золе и покрывают медицинской рентгеновской пленкой так, чтобы между пленкой и хроматограммой не образовывалось пузырей.

Энергия р-излучения радиохроматограммы превращается сцинтил лятором в световую энергию, которая вызывает почернение фото пленки. В работе [54] этот метод использован для детектирования соединений, меченных 1 4 С и 3 Н. Вильсон и Спеддинг [153] указы вают, что продажный силикагель сам по себе является сцинтилля тором и что чувствительность увеличивается вдвое при импрегни Общая часть ровании антраценом. Люти и Васер [70] описали метод добавле ния антрацена в суспензию силикагеля перед приготовлением слоя. Антрацен обладает рядом преимуществ в сравнении с дру гими сцинтилляторами: он малорастворим, химически инертен и обладает очень высокой способностью к флуоресценции.

4.1.2. Радиометрический расчет тонкослойных радиохроматограмм 4.1.2.1. Измерение радиоактивности после вымывания вещества из слоя сорбента и измерение радиоактивности веществ в суспензии Перед тем как измерить радиоактивность вещества, элюиро ванного из пятна хроматограммы, и радиоактивность вещества в суспензии, необходимо определить положение пятна исследуемо го соединения. Это делается с помощью авторадиографии или обычными химическими методами (например, опрыскиванием рас творами обнаруживающих реагентов). Выявленные зоны отдель ных веществ соскребают с закрепленных слоев шпателем, а с не закрепленных— отсасывают, используя вакуум водоструйного насоса, в стеклянную трубку и элюируют подходящим раствори телем.

Удаленный с хроматограммы сорбент с веществом помещают на стеклянный фильтр с величиной пор 20—25 мкм, соединенный с водоструйным насосом. Сорбент промывают соответствующим растворителем. Элюирование можно проводить и непосредственно в трубке, с помощью которой сорбент удаляли с пластинки, или, после пересыпания сорбента, в обычной хроматографической ко лонке или трубке, суженной на конце. Сорбенты с очень тонким зернением, использованные для приготовления закрепленного слоя, встряхивают в пробирке с растворителем, центрифугируют и отбирают супернатант.

Активность измеряют одним из обычных способов, например счетчиком Гейгера — Мюллера [37, 74]. Удобно измерять актив ность с использованием жидких сцинтилляторов. Этот метод от личается высокой чувствительностью и при работе с излучателя 14 ми низких энергий ( С, Н) [34, 41, 43, 48, 60, 62, 73, 117—119, 123—131]. В качестве растворителей при вымывании веществ из сорбента пригодны многие растворы сцинтиллирующих веществ [130, 131]. Их применение облегчает количественный расчет тон кослойных радиохроматограмм.

Для веществ, хорошо растворимых в неполярных растворителях, можно ис пользовать сцинтиллирующий раствор следующего состава [41, 130]: 4—5 г 2,5-дифенилоксазола (ДФО) и 0,05—0,3 г n-бис-(2,4-диметил-5-фенилоксазо лил) бензола (ДМФОБ) в 1 л толуола.

174 Общая часть Для веществ, растворимых в полярных растворителях, можно использовать другой сцинтиллирующий раствор [60]: 80 г нафталина 5 г ДФО и 0 а-нафтилфенилоксазола в 1 л смеси, приготовленной из ксилола, диоксана и эта нола в объемном отношении 5 : 5 : 3. Этот раствор может содержать до 7% об.

Во избежание выпадения осадка в сцинтиллирующем растворе измерения проводят при +10 "С. Источником ошибок при измере нии радиактивности веществ после их вымывания из сорбента мо жет быть неполное вымывание. Этот недостаток исключается при использовании метода определения активности без элюирования Рис. 72. Фотографии ручного (а) и автоматического (б) устройств для снятия хроматографических зон с тонкослойных радиохроматограмм.

(измерения радиоактивности проводят в суспензии), который был предложен Снайдером и Стефенсоном [130].

Принцип измерения радиоактивности в суспензии состоит в том, что сорбент (силикагель G) с пятном вещества, удаленный с пластинки, гомогенизируют с гелем, содержащим растворенные сцинтилляторы. Сцинтиллирующий гель состоит из толуольного раствора сцинтиллятора (5 г ДФО и 0,3 г ДМФОБ в 1 л толуола) и 4% об. кабосила (Cab-0-sil) (тонкого порошка окиси кремния который быстро диспергируется в толуоле с образованием опти чески прозрачных тиксотропных систем;

кабосил производится фир мой Packard Instr. Co., (Ля Гранж, Иллинойс, США) [34, 130].

К 15 мл сцинтиллирующего геля можно добавить до 100 мг си ликагеля из хроматографичеокого слоя без сколько-нибудь замет ного снижения измеряемого числа импульсов и осаждения суспен зии. Этот метод наиболее пригоден для проведения точного изме рения активности вещества, выделенного с помощью тонкослойной хроматографии. Применяя спектрометры с жидкими сцинтилля Обшая часть Рис. 73. Фотография автоматического прибора для снятия зон с пластинки в комплекте со сборником фракций (фирма Analabs).

торами, можно в одном и том же образце определить наличие нескольких радиоактивных изотопов.

Снайдер и сотр. [118] нашли, что удаление больших зон из хроматографического слоя, которые соответствуют авторадиохро матографическому пятну или пятну, обнаруженному химическим реагентом, не является оптимальным вариантом изучения распре деления активности на хроматограмме, так как химическое рас пределение не всегда идентично распределению радиоактивности.

Соединения с высокой удельной активностью и пятна с низким уровнем активности легко могут остаться недетектированными, если границы пятна перед его удалением с пластинки устанавли вать химическими методами обнаружения. В связи с этим Снайдер и сотр. сконструировали устройства для ручного [117—119, 121, 123] и автоматического [118, 121, 124—126] выделения зон и от бора фракций, позволяющие очень точно, количественно и воспро изводимо снимать с пластинки узкие зоны (1—2 мм или больше) вдоль всей хроматограммы. Снятые зоны помещают во флаконы с жидким сцинтиллятором и измеряют активность сцинтилляци онным методом. На рис. 72 приведены фотографии ручного (а) и автоматического (б) устройств для снятия зон со сборником фракций [118].

Первоначально авторы предназначали сконструированные ими устройства для зонального анализа на узких тонкослойных хрома 176 Общая часть тограммах размером 2X20 см. Хроматографический слой делили на две полосы, одну из которых предназначали для разделения радиоактивных соединений, другую — для нанесения нерадиоак тивных стандартов. В последней модификации (рис. 72,6) держа тель ножа сконструирован таким образом, что позволяет снимать зоны с хроматограммы (5X20 см) последовательно на трех или четырех полосах.

200 зоо 150 гоо 100 vWV О 60 100 мм Рис. 74. Автоматическая запись ра- Рис. 75. Автоматическая запись ра диохроматограммы смеси липидов, диохроматограммы липидов, мечен меченных 1 4 С. ных 3 Н.

Фотография фирменного автоматического прибора для снятия зон с пластинки в комплекте со сборником фракций приведена на рис. 73 (Snyder-Kimble Automatic TLC Zonal Scraper, фирма Analabs, Inc.). На рис. 74 приведена запись радиохроматограммы липидов, меченных И С, полученная с помощью этого устройства (величина каждой порции слоя сорбента 2 мм). На рис. 75 приве дена радиохроматограмма липидов, меченных Н (величина каж дой зоны 4 мм).

Количественный обсчет тонкослойных радиохроматограмм за нимает довольно много времени из-за большого количества одно образных вычислений и необходимости построения графика. Снай дер и Смит [128, 129] автоматизировали этот процесс. Данные с жидкостного сцинтилляционного счетчика автоматически перено сятся на перфокарту прибором IBM 026, размещенным в блоке обработки данных. Авторы разработали программу для вычисли тельной машины IBM 7090 и регистратора Бенсона — Легнера.

Этот регистратор, преобразующий данные, нанесенные на перфо ленту, в графическое изображение распределения радиоактивно сти вдоль всей хроматограммы, позволяет осуществлять радио метрический анализ как узких (1—2 мм), так и широких зон, ере Общая часть заемых с тонкослойных радиохроматограмм. Применимость раз работанной аналитической системы авторы доказали на примере разделения синтетических производных алкоксиглицериновых эфи ров, меченных 1 4 С, и продуктов реакций, катализируемых липазой.

4.1.2.2. Методы измерения радиоактивности непосредственно на слое сорбента Проще всего измерить радиоактивность пятна как такового.

Однако и в этом случае необходимо знать положение пятна иссле дуемого вещества. Хроматографический слой вокруг пятна закры вают экраном, материал которого определяется характером излу чения данного радиоизотопа. Активность изолированного таким образом пятна измеряют счетчиком Гейгера — Мюллера или сцин тилляционным счетчиком.

Тонкослойную радиохроматограмму можно промерять, переме щая ее вручную или автоматически. В первом случае под счет чиком, снабженным диафрагмой, вручную передвигают хроматог рафическую пластинку по направляющей планке. Величина одного перемещения определяется шириной применяемой диафрагмы. На одну сторону стеклянной пластинки наносят деления, отстоящие друг от друга на расстоянии 3—10 мм. Перед каждым новым из мерением хроматограмму сдвигают вперед на одно деление. Как правило, каждый участок хроматограммы промеряют одинаковое время. Полученные значения наносят на график, как и в случае бумажной радиохроматографии.

Непрерывный обсчет радиохроматограмм обеспечивается авто матизацией перемещения хроматограммы. Для обсчета тонкослой ных радиохроматограмм многие авторы предлагают модифициро вать аппаратуру, предназначенную для обработки радиохромато грамм на бумаге [8, 11, 13, 80, 83, 84, 102]. Другие авторы обхо дятся без этих модификаций и работают со слоями на очень тон кой фольге из пластмассы [133] или фиксируют хроматограмму водной суспензией поливинилпропионата [20]. После высыхания весь слой приклеивают к тонкой пластмассовой фольге и снимают со стеклянной пластинки. Затем так же обрабатывают и приклеи вают противоположную сторону хроматограммы. Измерение про изводят аналогично измерению бумажных радиохроматограмм.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.