авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 19 |

«Doc. RNDr. PhMr. Magda SAR50NOVA, DrSc. RNDr. Vladimir SCHWARZ, CSc. RNDr. Cestmir MICHALEC A kolektiv CHROMATOGRAFIA NA TENKYCH VRSTVACH VO ...»

-- [ Страница 6 ] --

Описанная методика применима только для радиоактивных изо топов с жестким излучением: при использовании 14 С или 3 5 S фоль га ослабляет излучение.

Счетчиками Гейгера — Мюллера обычно можно измерять толь ко в геометрии 2я. Эффективность измерения снижается также и абсорбцией излучения слоем сорбента.

Шульце и Венцель [113, 148, 149] для автоматического пере мещения хроматограммы модифицировали аппаратуру фирмы 12— 178 Общая часть Рис. 76. Схема проточного счетчика (размеры даны в мм).

Рис. 77. Прибор для обсчета тонкослойных радиохроматограмм фирмы Vertriebs GMBH fur Messtechnik с 2я-детектором и регистрирующим устройством Autochron.

Frieseke и Hoepfner, предназначенную для обсчета бумажных ра диохроматограмм (тип FH 452). Переделка заключалась в том, что под диафрагму счетчика была помещена подставка, легко пе ремещающаяся по направляющим шинам. На эту подставку, при водимую в движение приводом от электромотора, помещают хро матографическую пластинку.

Для определения на хроматограммах соединений, меченных тритием, те же авторы [113] предложили использовать проточный счетчик специальной конструкции (рис. 76). Нижнюю часть его составляет пластина с узкой длинной щелью, прикрепленная к корпусу счетчика. В качестве газа используют метан. Счетчик был использован для расчета полумикропрепаративных тонкослойных хроматограмм соединений, меченных тритием. Для измерения ак ИМР-Ю Рис. 78. Автоматическая запись раз деления стероидов, меченных С и и Н, на тонкослойной радиохромато грамме.

/ — "С-эстрон;

2 — Н-эстрадиол-17а;

3 — Н-эстрадиол-17а+андростендион;

4— и С-эстрадиол;

5 — Н-андростандион.

Рис. 79. Схема автоматической запи си радиоактивности двумерной тон кослойной радиохроматограммы.

т—:

li- 44 АХ Фронт Старт Фронт Старт Рис. 80. Результаты автоматического обсчета тонкослойной радиохроматограммы стероидных гормонов, меченных 14 С, произведенного с помощью регистрирующего прибора Autochron.

— прогестерон-4-"С;

2 — Д4-прегненон-3-ол-20а.

12' 180 Общая часть Рис. 81. Приставка к системе Actigraph, выпускаемая фирмой Nuclear Chicago Corp. для обсчета тонкослойных радиохроматограмм.

Рис. 82. Радиохроматограф фирмы Telefunken.

тивности соединений, меченных 3 Н и И С, применяют разнообразные типы проточных и пропорциональных счетчиков [91—93, 99].

Аппаратуру для расчета тонкослойных радиохроматограмм, конструкцию которой предложили Шульце и Венцель [113], про изводит фирма Vertriebs-GMBH fur Messtechnik [147]. Фотогра фия этого устройства приведена на рис. 77. С помощью этого при Общая часть бора можно производить расчет радиохроматограмм с пятнами веществ, меченных мягкими р-излучателями 3 5 S, 3 2 P, 3 Н или 1 4 С.

Специальное устройство позволяет приблизить стеклянную пла стинку с хроматографическим слоем к детектору на оптимальное расстояние без повреждения слоя и исключает возможность из менения этого расстояния в процессе измерения. Импульсы счет чика через усилитель поступают в интегратор, соединенный с ре гистрирующим прибором. Изменение активности по длине хрома тограммы регистрируется самопишущим потенциометром на син хронно движущейся бумажной ленте (рис. 78). С помощью этого устройства можно промерять и двумерные хроматограммы (рис. 79). Его применение позволяет сократить время от момента нанесения образца на хроматограмму до получения графической картины до 2—3 ч. На рис. 80 приведены результаты обсчета радиохроматограммы меченых стероидов, полученные с помощью прибора Autochron.

Фирма Nuclear Chicago Corp. производит приставку к своей системе Actigraph, модель 1039 (рис. 81), позволяющую прово дить автоматический промер хроматограмм шириной ~ 5 см, обыч но применяемых при хроматографировании в тонком слое [89].

На рис. 82 показано устройство для обсчета тонкослойных и бумажных радиохроматограмм, выпускаемое фирмой Telefunken [96].

4.2. Примеры практического применения радиохроматографии в тонких слоях Методы радиохроматографии в тонких слоях различаются меж ду собой способом нанесения веществ и приготовления хромато грамм.

1. Если наносят радиоактивные вещества, то:

а) разделяемые вещества могут быть мечены радиоизотопами (например, продукты синтеза соединений, меченных тритием);

б) исследуемые нерадиоактивные вещества перед разделением можно обработать радиоактивными реагентами для получения ме ченых производных. Затем следует выделение исследуемого веще ства с помощью хроматографии в тонком слое. Измеряют радио активность производного определяемого соединения и по ее зна чению судят о количестве радиоактивного реагента, вступившего в реакцию с анализируемым веществом. Если реакция проходит со стехиометрическим выходом или по крайней мере с воспроизво димым выходом, то легко вычислить количество анализируемого вещества, первоначально присутствовавшего в исходном образце [51];

в) к анализируемому образцу до разделения можно добавить определенное количество меченого соединения, аналогичного не 182 Общая часть меченому соединению, присутствие которого в образце следует определить. Добавление радиоактивного вещества облегчает ло кализацию и идентификацию пятна определяемого соединения на хроматограмме. Вычислив удельную активность выделенного ком понента, можно точно определить количество анализируемого ве щества. Описанное определение представляет собой метод изотоп ного разбавления с хроматографическим выделением компонентов (см., например, работы [27, 152]).

2. Если на хроматограмму наносят нерадиоактивные вещест ва, то:

а) проявленную хроматограмму обрабатывают радиоактивным реагентом, в результате разделенные неактивные вещества пере водятся в радиоактивные производные. Избыток реагента обычно упаривают с поверхности хроматограммы. Обработку определяе мого вещества радиоактивным реагентом можно произвести и пос ле вымывания вещества из пятна;

б) неактивные пятна активируют облучением нейтронами или заряженными частицами (метод активирования) [58, 69, 115].

4.2.1. Выделение, очистка, идентификация и контроль чистоты радиоактивных изотопов и меченых соединений В работе [6] радиоактивные галогены разделяли на смеси сор бентов дауэкс 1 — целлюлозный порошок MN 300 (1 : 1). Для про явления хроматограммы использовали 1 М раствор нитрата нат рия. С помощью ТСХ разделяли также неорганические ионы, на 140 140 33 133 47 47 90 пример радиоизотопы Ва, La, i Ba, Cs, Ca, Sc, Y, Sr, 72 72 95 182 95 35 32 90 90 95 Zn, Ga, Nb, Ta, Zr, SO?-, POI~ [83];

Y, Sr, Nb, Zr 55 45 36 36 82 l31 234 238 [13];

Fe [8];

Ca, C1 [103], C1, Br, I [80];

Th, U, C1, 35 32 24 S, P [106];

Na, K [104] и другие [2, 3, 10, 57, 86, 98, 105, 107].

Мангольд, Кеммерекк и Малине [75] использовали хромато графию в тонком слое для микропрепаративного выделения неко 3 14 торых липидов, меченных Н, С и 1. При этом, например, в пре парате стеариновой кислоты, меченной тритием, было показано присутствие по меньшей мере семи различных примесей. Для де тектирования радиохроматограмм использовался авторадиографи ческий метод. Аналогичным образом определяли жирные кислоты после их мечения тритием или 14 С по карбоксильной группе. Ав торадиограмму выделенных жирных кислот промеряли методом фотоденситометрии. Для более наглядного ознакомления с методи кой ниже приведено описание очистки 9,10- Н-стеариновой кис лоты.

5,4 мг 9,10-3Н-стеариновой кислоты в виде ряда точек наносят на слой си ликагеля Q размером 20X20 см. Хроматограмму проявляют в течение 1 ч в си Общая часть стеме петролейный эфир (т. кип. 60—70 °С) —диэтиловый эфир — ледяная уксус ная кислота ( 8 0 : 2 0 : 1 ). Хроматограмму обнаруживают парами иода. Затем пятно радиоактивной стеариновой кислоты выскребают с пластинки и вымывают смесью диэтиловый эфир — метанол — ледяная уксусная кислота (80 : 20 : 1) 3X10 мл. Объединенные элюаты отфильтровывают и упаривают. Выход 2 мг (45о/) Если перегнанное вещество загрязнено веществами с очень близкой полярностью, которые трудно отделить, применяют хро матографическое разделение соответствующих производных. Кис лоты, например, можно разделять в виде их метиловых эфиров, спирты и амины — в виде ацетатов. Эти производные и элюиру ются гораздо легче, чем более полярные исходные соединения.

В приведенном выше примере продажный препарат 9,10-3Н стеариновой кислоты в качестве примесей содержал иодированный моноолеат и диолеат, соответствующие ацетилированные соеди нения, иодированную олеиновую кислоту и небольшое количество метилолеата [142]. Этот препарат наряду с растительными мас лами, меченными радиоактивным иодом, часто применяется в ме дицине для определения абсорбции жиров.

Махадеван и Лундберг [72] использовали авторадиографиче ский метод детектирования тонкослойных радиохроматограмм при определении чистоты синтетического олеата холестерина, мечен ного 1 4 С, и некоторых высших жирных кислот [130], меченных С или 3 Н.

Шульце и Венцель [113] разработали метод разделения сте И роидов и сульфонамидов, меченных тритием или С. В качестве сорбента эти авторы использовали силикагель G. Активность на слое измеряли описанным в разд. 4.1.2.2 проточным счетчиком, а радиохроматограммы детектировали авторадиографическим ме тодом. Карлсон, Маурер и Венцель [55] разделяли стероиды, ме ченные тритием.

Древерт, Бахманн и Рейтер 1[26] разделяли гГ-(2,4-динитро фенил)-аминокислоты, меченные С, на силикагеле G с помощью двумерной хроматографии. Для проявления в первом направлении использовали систему толуол — пиридин — этиленхлоргидрин — 0,8 н. NH 4 OH (100:30:60:60);

во втором направлении хромато граммы проявляли в системе хлороформ — бензиловый спирт — ледяная уксусная кислота (70 :30 : 3).

Снайдер и Пянтадоси [126] определили чистоту меченых ли пидов с помощью ТСХ. Тейлор [139] использовал ТСХ для кон троля радиохимической чистоты фармацевтического препарата радиоактивного иодида натрия Na 1 3 1 I, применяемого при диагно стике и терапии.

Хроматографией в тонком слое разделяли и определяли орга нические соединения, меченные Ш 1 [ПО];

липиды, меченные 1 4 С [31, 42, 45, 56, 74, 102, 112, 117, 119—121, 122, 124, 128], 3 Н ![56, 184 Общая часть 74, 119, 121, 124, 128], 3 2 Р [74, 121, 124], «Ч [74, 121, 124],131 14 [74];

стероиды, меченные С [5, 8, 101, 146], Н [5, 8, 101, 113];

аминокислоты и белки, меченные С [26, 67], 131 1 [79];

сахара, меченные 14 С [54, 85], тритием [54];

нуклеиновые кислоты, ме ченные 3 2 Р, 1 4 С, 131 1 [80, 114], и другие соединения [14, 15, 18, 19, 22, 49, 59, 81, 82, 94, 132, 140]. Хроматография в тонком слое применяется также при изучении радиоактивных превращений веществ [87, 88], при определении устойчивости меченых соеди нений [77] и изучении процессов радиолиза [53].

4.2.2. Анализ с применением радиоактивных реагентов Если классические методы неприменимы из-за слишком ма лого количества анализируемого материала или из-за очень не большой концентрации определяемого компонента в смеси, то очень хорошие результаты может дать метод с применением ра диоактивных реагентов. Этот метод полезен также в случаях, когда нельзя применить метод изотопного разбавления либо ког да исследуемое соединение нельзя получить в радиоактивной форме.

Принцип анализа с применением радиоактивных реагентов состоит в получении радиоактивного производного исследуемого элемента, радикала или молекулы. В результате количество ис следуемого неактивного вещества определяют в виде его радио активного производного радиометрическим методом.

Шаршунова, Толгесси и Градил [138] разделяли с помощью ТСХ компоненты стрихниновой тинктуры (стрихнин и бруцин) в системе эфир—5%-ный этанол, в качестве сорбента использо вали окись алюминия. Пятна веществ удаляли из хроматограмм с помощью микропипетки. Выделенные алкалоиды переводили в растворимую форму нагреванием в 2%-ной уксусной кислоте.

Окись алюминия удаляли фильтрованием, а алкалоиды осаждали раствором радиоактивного иода 1 3 Ч. Измеряли радиоактивность отфильтрованного осадка. Количественное определение произво дили с помощью калибровочной кривой. Разработанная методика пригодна для серийных определений в фармацевтических лабо раториях.

Мангольд [74] применил метод для анализа липидов. Липиды, содержащие свободные гидроксильные группы или аминогруппы, ацетилировали уксусным ангидридом, меченным 1 4 С. Полученные производные разделяли с помощью ТСХ. Жирные кислоты мети лировали меченым диазометаном;

полученные метиловые эфиры разделяли в соответствующей системе растворителей. Для аце тилирования и этерификации применяют методы, разработанные первоначально для получения ацетатов стероидных спиртов [7, 61], аминокислот [150] и метиловых эфиров высших жирных Общая часть кислот [ПО, 116] при анализе перечисленных соединений методом бумажной хроматографии. Меченый диазометан готовят непо средственно перед использованием из метил-14С-1М-нитрозо-п-то луолсульфонамида [135].

Мангольд, Каммерекк и Малине [75] аналогичным образом анализировали жирные кислоты касторового масла. Кислоты обрабатывали меченым диазометаном. Хроматографию в тонком слое использовали для отделения обычных жирных кислот от оксикислот с одной и двумя гидроксильными группами.

Метиловые эфиры трех указанных типов жирных кислот элюи ровали из хроматографического слоя и, измеряя интенсивность излучения, определяли соотношение их количеств. Смесь эфиров неокисленных жирных кислот разделяли бумажной хроматогра фией с обращением фаз. Количественный состав этой фракции определяли обсчетом радиоактивности полоски хроматограммы с помощью проточного пропорционального счетчика. Соотношение моно- и диоксикислот с большой точностью можно было бы оп ределить в виде меченых ацетатов. При этом диоксикислоты име ли бы в молекуле два остатка меченой уксусной кислоты, т. е. их удельная активность в сравнении с удельной активностью моно оксикислот была бы в два раза выше. Это позволило бы увели чить точность определения минорной фракции диоксикислот.

4.2.3. Тонкослойная радиохроматография в биохимических исследованиях Хроматография в тонком слое широко применяется в биоге нетических исследованиях. Грисбах и сотр. [35—39] изучали синтез изофлавонов в растениях с помощью меченых препаратов.

Методами бумажной и двумерной тонкослойной хроматографии разделяли изофлавоны биоханин А, формонетин и некоторые другие продукты, обнаруживая их методом авторадиографии.

Кратцл и Пушманн [65] вводили в ветви березы кониферин-3 И С и с помощью ТСХ выделили два радиоактивных продукта метоксилирования, образовавшихся в растении. Кратцл [64] ис пользовал авторадиографический метод при изучении биогенеза лигнина. Другие авторы [155, 156] выделили ряд каротиноидных альдегидов из природных источников. Во многих случаях только ТСХ позволила приготовить чистые фракции каротиноидов в мик ропрепаративном масштабе. ТСХ применялась и при изучении биосинтеза фуранотерпенидов [1].

Мангольд и Малине [76] выделили из касторового масла окисленные и неокисленные кислоты, монооксикислоты и диокси кислоты на пластинках с силикагелем. Неокисленные кислоты отделяли от кетокислот на окиси алюминия. Применяя меченые 186 ' Общая часть реагенты, авторы доказали наличие в касторовом масле трех •типов кислот.

Радиохроматографию в тонких слоях использовали многие авторы в фармакологических исследованиях и токсикологических анализах. Фулко и Мид [33] применяли этот метод при изучении образования оксикислот в мозгу крыс. Другие авторы [136] ис пользовали этот метод при изучении биосинтетического включе ния радиоактивных жирных кислот в подкожный жир крыс. До пешваркар и Мид [24, 25], работая с препаратами, меченными С, показали, что метиловые эфиры высших жирных кислот присутствуют в животных тканях в виде нативных компонентов.

Туна, Каммерекк и Мангольд [141] методом радиоактивной индикации показали, что фракции природных липидов, разделен ные методом ТСХ, не загрязнены одна другой. Небольшое коли чество меченого трипальмитина смешивали с суммарными липи дами печени акулы и разделяли с помощью ТСХ. Авторадиограм ма, полученная с хроматограммы, показала, что вся радиоактив ность была во фракции триглицеридов. Моноалкиловые эфиры диглицеридов, очень близкие по структуре триглицеридам, не попадают во фракцию триглицеридов.

Применению радиохроматографии в тонких слоях сорбента посвящено много других работ [9, 21, 23, 27, 28, 32, 40, 44, 47, 50, 66, 68, 78, 134, 137, 151, 154].

ЛИТЕРАТУРА 1. Akazawa Т., Uritani /., Akazawa Y., Arch. Biochem. Biophys., 99, 52 (1962).

2. Alberti G., Giammari G., Grassini-Strazza G., J. Chromatogr., 28, (1967).

3. Alvarez С J., de Salas N. G. В., Mitta A. E. A., Raban P., J. Chromatogr., 45, 328 (1969).

4. Benes J., Zaklady autoradiografie, CNTL, Praha, 1965.

5. Benraad J., Kloppenborg P. W. C., Clin. chim. Acta, 12, 565 (1965).

6. Berger J. A., Megniel G., Petit J., Compt. Rend., 255, 1116 (1962).

7. Berliner D. L., Proc. Soc. exp. Biol., 94, 126 (1967).

8. Bleecken S., Kaufmann G., Kummer K-, J. Chromatogr., 19, 105 (1965).

9. Boberg J., Clin. chim. Acta, 14, 325 (1966).

10. Bottura G., Ann. Chim. (Rome), 57, 148 (1967).

11. Boucke G., Atompraxis, 11, 263 (1965).

12. Boyd G. A., Autoradiography in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1955.

13. Breccia A., Apalletti F., Nature, 198, 756 (1963).

14. Buridnek J., Cs. farm., 14, 130 (1966).

15. Catch I. R., U. K. At. Energy Auth., Radiochem. Cent, 1968.

16. Cecil R. C, Jack M., Smith W. G., jr., Contrib. Boyce Thompson Inst., 23, 256 (1966).

17. Contractor S. F., Shane В., J. Chromatogr., 41, 483 (1969).

18. Coppi G., Bonardi G., Arzneimittel-Forsch., 19, 1518 (1969).

19. Crew M. C, Di Carlo F. J., J. Chromatogr., 35, 506 (1968).

20. Csallany S. A., Drapper H. H., Analyt. Biochem., 4, 418 (1962).

Общая часть 21. Darge W., Liss E., Oeff K, Arzneimittel-Forsch., 19, 5 (1969).

22. Dean P. G. D., Whitehouse M. W., Biochem. J., 98, 410 (1966).

23. Dietrich S. M. C, Martin R. O., Biochemistry, 8, 4163 (1969).

24. Dhopeshwarkar G. A., Mead I. F., J. Lipid Res., 3, 238 (1962).

25. Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., Proc. Soc. exp. Biol., 109, 425 (1962).

26. Drawert F., Bachmann O., Reuther К. Н., J. Chromatogr., 9, 376 (1962).

27. Dray F., Bull. Soc. Chim. biol., 47, 2145 (1965).

28. Elsbach P., Biochim. biophys. Acta, 125, 510 (1966).

29. Fitzgerald P. J., Cancer, 5, 165 (1952).

30. Fitzgerald P. J., Simmel E., Weinstein J., Martin C, Lab. Invest., 2, (1953).

31. Fray G., Frey J., Societe de chimie biologique, Bulletin, 45, 1201 (1963).

32. Frey R. W., Duffy J. R., Microchim. Acta, 1969, 480.

33. Fulco A. J., Mead J. F., J. biol. Chem., 236, 2416 (1961).

34. Gordon С F., Wolfe A. L, Analyt. Chem., 32, 574 (1960).

35. Grisebach H., Brandner G., Z. Naturforsch., 16b, 2 (1961).

36. Grisebach H., Doerr N., Z. Naturforsch., 14b, 802 (1959).

37. Grisebach H., Doerr N., Z. Naturforsch., 15b, 284 (I960).

38. Grisebach H., Patschke L., Chem. Ber., 93, 2326 (1960).

39. Grisebach H., Patschke L, Z. Naturforsch., 16b, 645 (1961).

40. Guidotti G. G., Gaja G., Loreti L, Ragnotti R., Rottenberg D. A., Borghet ti A. F., Biochem. J., 107, 575 (1968).

41. Hayes F. N.. Rogers B. S., Langham W. H., Nucleonics, 14, No. 3, (1956).

42. Helf S., In: Conference of liquid scintillation counting, Aug. 20—22, 1957.

Proc. (Belland С G., Hayes F. N., editors), Pergamon Press, New York, 1958, pp. 96—100.

43. Heyns K, Hauber R., Z. physiol. Chem., 348, 357 (1967).

44. Holcomb G. N.. James S. A., Ward D. N.. Biochemistry, 7, 1291 (1968).

45. Holdrick В., Hirsch J., J. Lipid Res., 4, 482 (1963).

46. Hollander V. P., Vinecour J., Analyt. Chem., 30, 1429 (1958).

47. Hoppe G., Zappi E., Gries G., Nucl. Med., 6, 44 (1967).

48. Houx N. W. H., Analyt. Biochem., 30, 302 (1969).

49. Hoye A., J. Chromatogr., 28, 379 (1967).

50. Chamberlain J., Jagarinec N.. Ofner P., Biochem. J., 99, 610 (1966).

51. Ishii H., Aizawa Y., Nakao Т., Jikeidai Med. J., 13, 153 (1966).

52. lack R. C, Smith W. G., jr., Contrib. Boyce Thompson Inst, 23, 215 (1966).

53. Jarboe R. H., jr., Data J. В., Christian J. E., J. pharm. Sci., 57, (1968).

54. Jolchin G., Physiol. Vegetale, 2, 341 (1964).

55. Karlson P., Maurer R., Wenzel M., Z. Naturforsch., 18b, 219 (1963).

56. Kaufman H. P., Wessels H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 68, 249 (1966).

57. Kawamura S., Kurotaku K-, Kuraku H., Izawa M., J. Chromatogr., 26, (1967).

58. Kim Y. S., Kim S. O., Kim К S., Daehan Hwakak Hwoejee, 11, No. 2, (1967).

59. Kimura N., Arima Т., Tasiro H., Mori F., Yokota Y., Kodama S., Yamada K-, Minakawa E., Nanbu S., Mizuguchi Y., Radioisotopes, 17, 391 (1968).

60. Kinard F. E., Rev. Sci. Instr., 28, 293 (1957).

61. Kliman В., Peterson R. E., J. biol. Chem., 235, 1639 (1960).

62. Konigk E., J. Chromatogr., 37, 128 (1968).

63. Kbss F. W., Jerchel D., Radiochim. Acta, 3, 220 (1964).

64. Kratzl K, Holz-, Roh- u. Werkstoff, 19, 219 (1961).

65. Kratzl K, Puschmann G., Holzforschung, 14, 1 (1960).

66. Kuschinsky K, Lullmann H., van Zwieten P. A., Arzneimittel-Forsch., 18.

1602 (1968).

67. Lambiotte M., Atomlight, May 1965, 45, 10.

188 Общая часть 68. Leete E., Weruple J. N.. J. Amer. Chem. Soc, 91, 2696 (1969).

69. Lesigang-Buchtela M., Buchtela M. A., Parkhurst R. M., Microchim. Acta, 1967, 670.

70. Luthi U., Waser P. G., Nature, 205, 1190 (1965).

71. Luthi V., Waser P. G., NEN Labeled Chemicals (Boston), No. 50, 1— (1966).

72. Mahadevan V., Lundberg W. O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).

73. Manara L., Eur. J. Pharmacol., 2, 136 (1967).

74. Mangold H. K-, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).

75. Mangold H. K-, Kammereck R., Malins D. C, In: International Symposium on microchemical techniques, Interscience, New York, 1962, p. 697.

76. Mangold H. K., Malins D. C, J. Amer. Oil Chem. Soc, 37, 383 (1960).

77. Mangold H. K-, Sand D. M., Biochim. biophys. Acta, 164, 124 (1968).

78. Marks F., Hecker E., Biochim. biophys. Acta, 144, 690 (1967).

79. Massaglia A., Rosa U., J. Label. Compounds, 1, 141 (1965).

80. Massaglia A., Rosa U., Sosi S., J. Chromatogr., 17, 316 (1965).

81. Mitta A. E. A., Camin L. L., de Troparevsky M. L. P., Radiochim. Acta, 6, 111 (1966).

82. Mitta A. E. A., de Salas N. G. В., An. Soc. Quim. Argent., 55, 85 (1967).

83. Moghissi A., J. Chromatogr., 13, 542 (1964).

84. Moye С J., J. Chromatogr., 13, 56 (1964).

85. Moye С J., Goldsack R. J., J. Appl. Chem., 16, 209 (1966).

86. Nefedov V. P., Vobecky M., Borak I., Radiochimija, 7, 628 (1965).

87. Nowak Z., Chem. Anal. (Warsaw), 14, 621 (1969).

88. Nowak Z., Chem. Anal. (Warsaw), 14, 777 (1969).

89. Nuclear Chicago Technical Bull. No. 16 (1963).

90. Peknice J. R., Novak H., Radioisotopy, 5, 471 (1964).

91. Prydz S., Meld В., Korea J. F., Symposium V., Chromatographie, Electropho rese. Bruxelles, 1968 (1969), p. 159—164.

92. Rabitzsch G., J. Chromatogr., 37, 241 (1968).

93. Rabitzsch G., Monatsber. Dtsch. Akad. Wiss. (Berlin), 10, 781 (1968).

94. Rabitzsch G., J. Chromatogr., 37, 476 (1968).

95. Радиография. Сборник работ. — M.: ИЛ, 1952.

96. Radio-Chromatograph. Публикация фирмы Telefunken AH2., 1963.

97. Randerath К, Randerath E., Analyt. Biochem., 28, 110 (1969).

98. Rasen H. P., J. Chromatogr., 44, 522 (1969).

99. Ravenhilt J. R., James А. Т., J. Chromatogr., 26, 89 (1967).

100. Reith W. S., Brown B. L, Biochem. J., 100, 10P (1966).

101. Richardson G. S., Weliky I., Batchelder W., Griffith M., Engel L. L, J. Chro matogr., 12, 115 (1963).

102. Rosenberg J., Bolgar M., Analyt. Chem., 35, 1159 (1963).

103. Roucayrol J. C, Bergner J. A., Meyniel G., Perrin J., Intern. J. Appl. Radia tion and Isotopes, 15, 671 (1964).

104. Seiler H., Helv. chim. Acta, 46, 2629 (1963).

105. Seiler H., Helv. chim. Acta, 52, 319 (1969).

106. Seiler H., Seiler M., Helv. chim. Acta, 48, 117 (1965).

107. Seiler H., Seiler M., Helv. chim. Acta, 50, 2477 (1967).

108. Seyama Y., Yamakawa Т., Komai Т., J. Biochem. (Tokyo), 64, 487 (1968).

109. Sheppard H., Tsien W. H., Analyt. Chem., 35, 1992 (1963).

110. Schlenk H., Gellerman J. L., Analyt. Chem., 32, 1412 (1960).

111. Schmeiser K., Radioaktive Isotope, ihre Herstellung und Anwendung. Sprin ger- Verlag, Berlin — Gottingen — Heidelberg, 1957.

112. Schmid H. H. O., Mangold H. K-, Biochim. biophys. Acta, 125, 182 (1966).

113. Schulze P. E., Wenzel M., Angew. Chem., 74, 777 (1962).

114. Simonis W., Gimmler H., J. Chromatogr., 19, 440 (1965).

115. Skinner W. A., Leaffer M. A., Parkhurst R. M,. J. pharm. Sci., 57, (1968).

Общая часть 116. Смирнов Б. П., Попова Р. А., Нисканен Р. А., Биохимия, 25, 368, 1960.

117. Snyder F., Advances in tracer methodology., Vol. 2, 107 (1965).

118. Snyder F., Advances in tracer methodology., Vol. 4 (1967).

119. Snyder F., Analyt. Biochem., 9, 183 (1964).

120. Snyder F., Atomlight, 58 (1967), p. 16.

121. Snyder F., Radioisotope sample measurement techniques in medicine and bio logy. IAEA, Vienna, 1956, p. 521.

122. Snyder F., Separation Sci., 1, 655 (1966).

123. Snyder F., Alford T. J., Kimble H., Radioassay of thin-layer chromatograms blueprints for zonal scraper, ORINS-44, Instruments (TID-4500, 28th Ed.), April, 1964.

124. Snyder F., Kimble H., Analyt. Biochem., 11, 510 (1965).

125. Snyder F., Kimble H., Blueprints of an automatic zonal scraper and sample collector for radioassay on thin-layer chromatograms, ORINS-47, Instruments (TID-4500, 34th Ed.), November, 1964.

126. Snyder F., Piantadosi C, In: Radioactive pharmaceuticals, AEC Symposium series No. 6, CONF-651111, April 1966, p. 553—565.

127. Snyder F., Smith D., In: Keller R. A. (Editor): Separation techniques in che mistry and biochemistry. M. Dekker, New York, 1967, p. 331.

128. Snyder F., Smith D., Separation Sci., 1, 709 (1966).

129. Snyder F., Smith D., Summer symposium in analytical chemistry. Edmonton, Alberta, Canada, June 22—24 (1966).

130. Snyder F., Stephens N.. Analyt. Biochem., 4, 128 (1962).

131. Snyder F., Stephens N.. Oak Ridge Inst. of nucl. studies report, No. (1962).

132. Spencer R. P., Brody K. R-, Gunther W. H. H., Mautner H. G., J. Chroma togr., 21, 342 (1966).

133. Squibb R. L., Nature, 198, 317 (1963).

134. Stoffel W., Sticht G., Z. Physiol. Chem., 348, 1345 (1967).

135. Stoll A., Rutschmann J., von Wartburg A., Renz I., Helv. chim. Acta, 39, 993 (1956).

136. Stein Y., Stein O., Biochim. biophys. Acta, 54, 555 (1961).

137. Stupnicki R., Williams K- I. H., Steroids., 12, 581 (1968).

138. Sarsunova M., Tolgyessy J., Hradil M., Pharmazie, 19, 336 (1964).

139. Taylor E. H., J. pharm. Sci., 54, 639 (1965).

140. Thomas R. C, Ikeda G. J., Harpootlian H., J. pharm. Sci., 56, 862 (1967).

141. Tuna N.. Kammereck R., Mangold H. К;

цитировано в [90].

142. Типа N.. Mangold H. K-, Moser D. G., J. Lab. clin. Med., 61, 620 (1963).

143. Tolgyessy J., Magsugarzas a kemiai analizisben. Miiszaki, Budapest, 1965.

144. Tolgyessy I., Sarsunova M., Hais I. M., Cs. farm., 14, 9 (1965).

145. Tolgyessy J., Varga S., Nuclear analytical chemistry II. VSAV, Bratislava, University Park Press, Baltimore, 1972.

146. Vahauny G. V., Borja С R., Weersing S., Analyt. Biochem., 6, 555 (1963).

147. Vertriebs-GMBH fur Messtechnik. Публикация фирмы, 1973.

148. Wenzel M., Schulze P. E., Tritium-Markierung. Verlag Walter de Gruyter and Co., Berlin, 1962.

149. Wenzel M., Schulze P. E., Wollenberg H., Naturwissensch., 49, 515 (1962).

150. Witehead J. K-, Biochem. J., 68, 662 (1958).

151. Whittle K. I., Audley G. В., Pennock J. F., Biochem. J., 103, 21C (1967).

152. Wiley R. A., Metzger J. L, J. pharm. Sci., 56, 144 (1967).

153. Wilson А. Т., Spedding D. J., J. Chromatogr., 18, 76 (1965).

154. Winterbourn Ch. C, Batt R. D., Biochim. biophys. Acta, 152, 255 (1968).

155. Winterstein A., Angew. Chem., 72, 902 (1960).

156. Winterstein A., Studer A., Rudegg R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).

157. Yagoda H., Radioactive measurements with nuclear emulsions. John Wiley and Sons, Inc., New York, 1949.

190 Общая часть ОСНОВЫ ТЕОРИИ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ* Развитие хроматографических методов за два последних де сятилетия обусловило и развитие исследования их физических основ [17, 22, 29, 56, 70]. Из физического описания протекающих про цессов оказалось возможным получать определенные данные об исследуемых веществах и сравнивать их друг с другом и с дру гими физическими или как-либо иначе полученными величинами.

Благодаря этому тонкослойная хроматография из простого ка чественного, а иногда и количественно-аналитического способа превратилась в инструмент для исследования различных соотно шений, в особенности для исследования связей между строением и другими свойствами веществ. Из-за своей простоты, в особен ности в аппаратурном смысле, инструмент этот приобрел особую ценность.

Из различных типов тонкослойной хроматографии — распре делительной и адсорбционной — последняя имеет сравнительно более сложное теоретическое обоснование. Адсорбционные про цессы широко применяются в промышленности, где они исполь зуются, между прочим, и в гетерогенном катализе. В связи с этим и теория адсорбции довольно глубоко развита.

Теория адсорбционных равновесий исходит из двух основных принципов. Один из них основан на предположении о том, что адсорбированное вещество находится на поверхности адсорбента в определенных адсорбционных центрах, второй, напротив, пред ставляет адсорбированное вещество, как двумерный газ, удержи вающийся на поверхности адсорбента под действием его силового поля. В пользу обоих представлений имеется достаточно дово дов, методами же статистической механики показано, что, исходя из обоих принципов, можно прийти к одинаковым результатам, как это и подтвердили детальные измерения Эверетта [14, 15].

В адсорбционной тонкослойной хроматографии вопросы вывода термодинамических соотношений несколько проще: работу ведут с малыми количествами, чтобы не происходило пересыщения по верхности адсорбента исследуемым веществом;

адсорбент под вергают обработке, называемой стандартизацией, до некоторой степени снижающей его поверхностную активность [7, 22, 23].

Тем самым условия адсорбции при адсорбционной хроматографии в значительной степени сближаются с теми условиями, для ко торых было первоначально предложено простейшее соотношение для равновесия между адсорбированным и неадсорбированным веществом — уравнение изотермы Лэнгмюра [12].

Изотерма Лэнгмюра была выведена на основании следующих допущений:

* Этот раздел написан доктором Зденеком Пержиной.

Общая часть на поверхности адсорбента имеется конечное число адсорбци онных мест (активных центров), равноценных друг другу (лока лизованная адсорбция на гомогенной поверхности);

каждый из активных центров может быть занят лишь один раз (условие однослойной адсорбции);

адсорбированные молекулы не оказывают влияния друг на друга (условие равенства энергетических состояний адсорбиро ванных молекул, исключающего действие значительных сил меж ду адсорбированными молекулами).

При адсорбционной хроматографии эти условия большей ча стью в значительной степени удовлетворяются, что сильно упро щает математическое описание термодинамических соотношений.

Уравнение изотермы Лэнгмюра обычно приводится в следующей форме [14]:

где 8 — степень покрытия поверхности адсорбента веществом X, Nx—молярная доля вещества X в растворе и k — термодинами ческая константа равновесия.

На основании изотермы Лэнгмюра Снайдер [56] вывел ряд чрезвычайно полезных соотношений, связывающих отдельные свойства исследуемого вещества, системы растворителей и адсор бента, которые в определенных границах очень хорошо отражают поведение веществ при адсорбционной хроматографии. Термоди намические соотношения при адсорбции удовлетворяют также уравнению Гиббса для свободной энергии, с которой константа термодинамического равновесия [63] связана соотношением (2) = —^r, ]nk где Ga — свободная энергия адсорбции, R — газовая постоянная и Т — абсолютная температура. Полная свободная энергия скла дывается из четырех слагаемых, два из которых играют сущест венную роль и относятся к исследуемому веществу и растворите лю в адсорбированном состоянии. Два прочих слагаемых отно сятся к тем же веществам в растворенном состоянии. При расчете термодинамического равновесия обоими этими слагаемыми можно пренебречь. Различия в величине этих слагаемых были подтверж дены многочисленными опытами [58]. После перевода в десятич ные логарифмы выражение [2] можно записать в форме (3) EXa-ESa, которая включает оба значащих энергетических слагаемых и пре небрегает двумя малозначащими. Каждое из первых слагаемых в свою очередь можно расчленить на части, относящиеся к соб 192 • Общая часть ственно адсорбированным молекулам /(X), /(S), и атомом адсор бента (а) в виде j } ^ Поскольку константа термодинамического равновесия k не соот ветствует истинным фазовым соотношениям, введем новую кон станту равновесия К°, для которой (5) K°=k-Va и которая учитывает фазовые соотношения, так как Vа есть объем растворителя, адсорбированного в молекулярном слое, отнесен ный к массе адсорбента (размерность мл/г). Логарифмируя по следнее выражение, с учетом уравнений (4) получаем основное уравнение адсорбционной хроматографии:

l g / C ° - l g y e + a. / ( X, S), (6) в котором /(X, S) означает разность / ( X ) — f ( S ). В этом уравне нии уже раздельно отражены свойства (lg Va, a), вещества X и растворителя S. Значения /(X, S) для ряда веществ в определен ных растворителях приводятся в литературе. А поскольку вели чины а и Fa можно определить непосредственно, оказывается возможным рассчитать значения константы К0 и термодинамиче ской константы К- По литературным данным [57] V e =0,00035-Р, (7) где Р — активная поверхность адсорбента в м /г. Для частично насыщенной водой поверхности Va = 0,00035 -Р — 0,01/7, (8) где р — % адсорбированной воды. Разность между измеренными и вычисленными значениями не превосходит 20%.

Для расширения практической применимости основного урав нения (6) необходимо представить его в форме соотношения между легко измеримыми величинами. В хроматографии важной непосредственно измеримой величиной является RF i[30]. Переме щение вещества X вдоль колонки или тонкого слоя адсорбента весом W можно представить как результат равновесных состоя ний адсорбции и десорбции, обусловленных током растворителя объемом V. Поэтому имеет место соотношение Отсюда следует, что RF зависит от массы адсорбента и «свобод ного объема» растворителя — величин, легко измеримых, и соот ношения между адсорбированной Ха и неадсорбированной Xs Общая часть частями вещества X. Это отношение — ни что иное, как выражение истинного равновесия, и его можно сравнивать с коэффициентом распределения или константой равновесия. Введем величину и подстановкой в предыдущее выражение получим уравнение 5 =. (11) RF = Это уравнение в действительности не является вполне точным, так как в адсорбционном слое не устанавливается идеального равновесия. Это объясняется главным образом тем, что в про межутках между частицами растворитель протекает не везде с одинаковой скоростью. В каждом промежутке устанавливается скоростной профиль потока, т. е. в непосредственной близости к частице скорость потока больше или меньше (вследствие действия капиллярных сил), нежели в средней части промежутка, и уста навливается концентрационный градиент. К тому же имеет место диффузия, не учитываемая уравнением (11). Поэтому обычно вводят поправочный коэффициент |, для которого (12) RF(нд.)=lRF(нaбл.).

Кроме того, уравнение (10) предполагает однородность состава растворителя вдоль слоя. Если состав меняется, уравнение ока зывается недействительным [30, 79].

Необходимо также уточнить понятие «свободный объем раст ворителя». Под этим подразумевается объем, заполняющий про межутки между частицами, или разность насыпного и истинного объема адсорбента. Для упрощения символики Бейт-Смит и Уэстолл [2] ввели новую величину RM, являющуюся функцией только RF- Функциональная зависимость имеет вид /?* = l g ( 1 ± r - l ). (13) а обратная 10**+ Простой подстановкой RF из уравнения (13) в (11) получим (15).

При упрощающем предположении lg/C=lgK° можно далее вос пользоваться уравнением (15) для вывода важного соотношения (16) RM = \g(VaW/V°)+a.f(X,S).

13— 194 ' Общая часть С помощью этого соотношения можно охарактеризовать поведе ние вещества в определенной системе растворителей, если извест ны свойства адсорбента, на основании только экспериментально определенного значения RF. И наоборот, с помощью двух или не скольких веществ, для которых известна /(X, S), можно опреде лить свойства адсорбента. Обе экспериментально определяемые величины lg Va и а являются функциями содержания воды в ад сорбенте. Однако адсорбированная вода, пока ее содержание не превышает, например, для окиси алюминия 0,035 г на 100 м активной поверхности, практически не оказывает влияния на значения /(X, S). Из уравнения можно рассчитать изменение RF В зависимости от изменения активности адсорбента. Кроме того, из этого уравнения следует, что повышение активности по нижает селективность разделения двух веществ на одном и том же адсорбенте и в том же растворителе, в предположении что RF для этих веществ различны. В области малых или, напротив, вы соких значений RF этим результатом воспользоваться практиче ски нельзя.

До настоящего времени во всех количественных расчетах влия ние растворителя и свойства исследуемого вещества не разделя ли, вследствие чего невозможно было учесть смену системы раст ворителей. Выбор системы растворителей имеет решающее зна чение при подборе наиболее удобной хроматографической системы. Для расчленения обоих влияний выражение (3) необ ходимо дополнить представлением о том, что молекула вещества в большинстве случаев вытесняет с поверхности адсорбента боль ше или меньше чем одну молекулу растворителя в зависимости от того, сколько активных центров занимает она сама [54]. Обыч но молекула вещества X вытесняет m молекул растворителя, покрывающего поверхность адсорбента мономолекулярным слоем.

На тех же основаниях, что и при выводе выражения (3), можно написать [60]:

(17) \gk^EXa-mESa.

Для отношения Еха/а вводим новую величину So, представляю щую собой безразмерную энергию адсорбции вещества на адсор бенте со стандартной активностью 1. Величину m можно выразить отношением где As и Ае—площади поверхности, необходимые для адсорбции молекулы вещества и молекулы растворителя. В качестве пара метра для характеристики растворителя была выбрана величина 80, представляющая собой энергию адсорбции растворителя на •адсорбенте со стандартной активностью 1, измеряемую относи Общая часть тельной поверхностью, необходимой для адсорбции. Эти новые величины определяются уравнениями (19) S0=EXa/a, (20) %=ESa/Al.a.

Последовательной подстановкой в уравнения (17) и (6) и даль нейшими преобразованиями получаем уравнения:

(21) (22) (23) В окончательном виде °)+a ( S o - е 0 Л 5 ). (24) Важность этих функций, особенно последней из них, вытекает из значения отдельных членов в их правой части [59]. Здесь коли чественно выражены свойства адсорбента \gVa или же \g(VaW/V°) и а, свойства растворителя ео и свойства вещества So и As в виде независимых друг от друга величин. Значения для адсорбента можно определить с помощью стандартных образцов веществ [17, 24, 56]. Значения ео для большого числа обычно применяемых растворителей известны и сведены в таблицы [22, 56, 62]. Они представляют собой, собственно, количественную оценку прежних элюотропных рядов [77, 78]. Остальные величины S o и As непо средственно характеризуют свойства вещества по отношению к адсорбционной системе, и поэтому их можно сравнивать друг с другом для разных веществ и в ряде случаев удобно коррели ровать с прочими свойствами. Кроме того, для одного и того же вещества можно- предсказывать изменение значений RM или RF при изменении системы растворителей на том же адсорбенте, так как разность значений RM прямо пропорциональна разности зна чений ^Afi-^2=^s(8i-e2). (25) При применении этих уравнений необходимо, однако, пом нить, что они выведены на основании ряда упрощающих пред положений. В первую очередь необходимо, чтобы энергетический вклад адсорбированной фазы был достаточно велик, так как значения Va обычно малы и минимальное значение константы равновесия К будет 1 или больше. И хотя влияние энергетиче ского вклада жидкой фазы на адсорбированные молекулы ис пользуется менее чем наполовину, поскольку лишь половина адсорбированной молекулы находится в области воздействия растворителя, взаимодействия в жидкой фазе могут достигать таких значений, которыми уже нельзя пренебречь, как это было 13* 196 Общая часть допущено [49, 50, 51, 52, 55, 65, 67, 79]. Адсорбционная энергия полярных растворителей также может достигать значений, срав нимых с адсорбционной энергией воды, и может происходить вытеснение части воды с поверхности растворителя [6, 37, 38, 59]. Далее, если некоторые из допущений при выводе уравнения изотермы Лэнгмюра не выполняются, например часть активных центров имеет более высокую адсорбционную способность, или происходит многослойная адсорбция, практические результаты более или менее отличаются от приведенного математического описания [23, 47, 48, 53, 81]. В большинстве случаев, однако, было показано, что энергетический вклад жидкой фазы состав ляет менее 10% полной энергии адсорбции, особенно в неполяр ных или слабополярных системах, так что выведенными зависи мостями с успехом можно воспользоваться.

Значения е для смесей растворителей не являются простой линейной комбинацией значений во отдельных составляющих.

Из-за различия молярных объемов логарифмическое отношение для константы равновесия представляет собой значительно более сложное для расчета элюирующей способности выражение ^±ьм. (26) В этом выражении га и е — элюирующая способность чистых & составных частей смеси, приводимая в таблицах, а — активность используемого адсорбента, пь — величина, отнесенная к молярно му объему растворителя Ь, также приводимая в таблицах. Един ственной переменной является Ыь — молярная доля растворителя Ъ, которую можно рассчитать, например, из объемных соотноше ний компонентов смеси, их молекулярных масс и плотностей. Эти величины в свою очередь приведены в таблицах. Практическими расчетами установлено, что элюирующая способность смеси двух растворителей сильнее всего изменяется при малых содержаниях одного из растворителей с более высокой элюирующей способ ностью. Поэтому даже малые количества чужеродных примесей в двухкомпонентных смесях могут оказывать значительное влия ние на результирующую элюирующую способность смеси [19].

Примером может служить примесь воды к эфиру или диоксану.

Было исследовано также влияние рН [25]. Необходимо также учитывать, что значения во неодинаковы для различных адсор бентов [61, 80].

Для так называемых регулярных растворов, т. е. растворов, в которых внутренние взаимодействия значительны, Эверетт [15, 16] вывел уравнение:

In ln SH * + " ^ Pfe-*J+ 7ГР**-*-. (27) Общая часть Второй и третий члены правой части этого уравнения дополняют простое уравнение для константы равновесия и учитывают влия ние взаимодействий в жидкой и адсорбированной фазах, обуслов ленных различием энтропии. Значения констант / = 0,5 и гп — 0,25.

Для данных In k и $/RT можно рассчитать зависимость значений Хаа от данного ха. Исходя из этих результатов, Ошчик и сотр.

[39, 40, 41] вывели уравнение зависимости RM от состава смеси растворителей при условии, что известен коэффициент распреде ления вещества между обеими составными частями подвижной фазы (Л г ) ^.. = 44 • ЛЯм 1.,+ (ф1-Ф1) ( А Я л ^ + ^ + Я м,. (28) где RMXH RM^—значения RM вещества в чистых компонентах и 2 и ARMli2—их разность. Выражение (ц\ — pi) соответствует разности (х'аа—ха), и его можно определить из эксперименталь ных данных с помощью соотношения cos —го — frfaОНPi) «Pi — «Pi— i+ fa-иф, где lgKi=Ai?M 12 и ф]—молярная доля компонента 1 в подвижной фазе, Аг — логарифм гипотетического коэффициента распределе ния вещества между обеими составными частями бинарной смеси.

Значения, применяемые для расчета, зависят как от природы, так и качества адсорбента. Применение приведенных соотноше ний особенно удобно для подбора оптимальных условий разде ления двух или более веществ.

Другой попыткой расчета сложных соотношений в подвижной фазе является применение многопараметрических данных (кон стант Роршнейдера [45, 46]), позволяющих приблизительно сопоставлять дисперсионные взаимодействия в жидкой фазе и отличать полярные свойства растворителей (элюирующую способ ность) и их селективность [64, 69]. Дальнейшие полезные для адсорбционной хроматографии соотношения вывел Сочевиньский с сотр. [18, 65, 66, 67, 68], который сравнивал значения RM с ло гарифмами молярных долей компонентов элюирующей смеси и определял наклон линейной части наблюдаемой кривой. Турина и сотр. [75] для характеристики соотношений пользовались чис ленным анализом. Позже Беленький и сотр. [3, 4] вывели более сложные соотношения для трехкомпонентной смеси.

Распределительная хроматография, т. е. такой вид хромато графии, при котором силы адсорбции в значительной мере по давлены и при котором перемещение веществ в хроматографиче ской системе зависит преимущественно от коэффициентов распре деления веществ между двумя жидкими фазами, описывается;

значительно более простыми соотношениями. Такая тонкослойная хроматография проводится путем применения так называемого 14— 198. Общая часть метода хроматографии с обращенными фазами, большей частью путем насыщения слоя силикагеля (или бумаги) липофильной средой, например парафиновым маслом, этилолеатом, октано лом-1 и т. п., а подвижной фазой служит вода, иногда с добавле нием метанола, ацетона, диоксана и т. п. RF исследуемого веще ства зависит от коэффициента распределения его между обеими жидкими фазами — гидрофильной и липофильной где Р — коэффициент распределения вещества между обеими фа зами, a AmlAs— отношение поперечных сечений подвижной и ста ционарной фаз. После логарифмирования получим +^- (31) Таким образом, при распределительной хроматографии зна чения RM неполярных веществ зависят от логарифма коэффици ента распределения между обеими фазами и логарифма объем ного соотношения обеих фаз [9]. При определении полярных веществ (кислот и оснований) в величину RM необходимо внести поправку, согласно уравнению J L ) ^ (32) где [Н+]—концентрация ионов водорода в подвижной фазе и К.— константа диссоциации вещества.

Величины S o и As, применяемые в адсорбционной хроматогра фии, и величины l g P и RM—-в распределительной, как и ряд других физико-химических величин, относятся к сфере действия линейных соотношений для свободной энергии, или ЛССЭ, как их обычно обозначают в литературе. Действительно, результаты этих соотношений можно назвать «аддитивными», т. е. каждая новая группа, вводимая в исходную молекулу вещества, обуслов ливает одно и то же изменение характеристических величин, и это изменение не является результатом изменения структуры исход ной молекулы. Вклад каждой группы является константой, свя занной с определенными эффектами. Это соотношение можно выразить в форме, (33) где Ао— некая величина из сферы применимости ЛССЭ для не которого данного вещества, ф(х)—вклад группы X для этой ве личины и Ах— эта же величина для вещества, которое можно получить из исходного, вводя в него группу X. Исключения здесь обусловлены некоторыми пространственными влияниями, изме Общая часть нением полярности молекулы, образованием комплексов и г. п.

[72]. Эти соотношения очень удобны. Например, в группах ве ществ нет необходимости проводить измерения для всех предста вителей, так как эти данные оказывается возможным предсказать или рассчитать. Если наблюдается расхождение между найден ным и вычисленным значениями, причину следует искать в одном, из перечисленных исключений.

Одной из важнейших задач фармацевтической науки является обнаружение зависимости между строением и биологическим действием веществ. Из работ Ханша и сотр. [1, 20, 21, 76] сле дует, что в биологическом действии определенного вещества иг рают важную роль его транспортные свойства (в системах и жи вых организмах), определяемые его липофильностью. Последнюю определяют как логарифм коэффициента распределения его меж ду октанолом-1 и водой (lg P) или как логарифм отношения где Ро—коэффициент распределения в этой же системе вещества, содержащего атом водорода в положении, где у вещества Р_ на ходится заместитель. Соотношение для биологической активности веществ по Ханшу имеет следующий вид:


d7..., (35) причем С — такая молярная концентрация вещества, которая вы зывает определенный наблюдаемый эффект, а, Ь, с, d,... — кон станты, относящиеся к этому эффекту, у... — прочие физико-хими ческие константы, характеризующие данное вещество [72, 76], В ряде случаев d и дальнейшие константы равны нулю, тогда биологический эффект является квадратичной функцией я или \gP, наконец, и С может оказаться равной нулю, и зависимость становится линейной. Значения констант при переходе от п к lgP, разумеется, изменяются. Вклады я и прочие физико-химиче ские данные приводятся в литературе [11, 74].

Вместо величин \gP и соответственно п можно пользоваться величинами RM и соответственно ARM ДЛЯ распределительной хроматографии, так как они по большей части линейно зависят от lg Р.[5, 8,28]:

(36) \gP=a+bRM, #Af. (37) В некоторых случаях оказалось необходимым пользоваться более сложными зависимостями (28), (29). Ряд подробностей приводит в своем обзоре Томлинсон [73]. Значения RM, полученные при:

адсорбционной хроматографии, нельзя, однако, применять в при 14* 200. Общая часть веденных соотношениях (36) и (37), так как они были выведены из совершенно иных предпосылок [40]. Тем не менее значениями So, полученными с помощью адсорбционной хроматографии, ус пешно пользовались для некоторых корреляций с активностью веществ [42], а также с их стабильностью [43], так как и здесь речь идет о величинах, для которых можно применять аддитивные соотношения, относящиеся к сфере ЛССЭ [71]. Для корреляции с биологическим действием в исключительных случаях пользова лись также и значениями RM ИЗ адсорбционной хроматогра фии [44].

Для подбора удобных систем растворителей успешно приме няли также численные методы независимо от физической сущно сти протекающих процессов [10, 32], как и для стандартизации методов идентификации основных лекарственных средств [34, 35, 36].

При расчете хроматограмм применяли информационную функ цию Кубелки и Муна [13]. Калишан и Фокс {26] наблюдали корреляцию между значениями Ям и так называемым индексом связываемое™ (величина, выводимая только из структурной фор мулы молекул с помощью теории графов). Из хроматографиче ских данных были выведены константы равновесия и кинетиче ские константы образования комплексов в подвижной фазе [33].

ЛИТЕРАТУРА 1. C h e m. E n g. N e w s 4 9, N o. 4 0, 4 6 ( 1 9 7 1 ).

2. Bate-Smith R. G., B i o c h e m. Biophys. Acta, 4, 427 (1950).

E. C, Westall 3. Belenky B. G., Gangina E. S., Tennikov M. В., Vilenchik L. Z., J. Chroma togr., 147, 99 (1978).

4. Belenky B. G., Kolegov V. I., Nesterov V. V., J. Chromatogr., 107, 265 (1974).

5. Biaggi G. L., Barbaro A. M., Guerra M. C., Forti G. C., Fracasso A. M., J. Med. Chem., 17, 28 (1974).

6. Brenner M., Niederwieser A., Petaki G., Weber K-, Thin-Layer Chromatography (E. Stahl, Editor), Academic Press, N. Y., 1'955, 106—113.

7. Brockmann H., Schodder H., Ber. Dtsch. Chem. Ges., 74, 73 (1941).

8. Brown D., Woodcock D., J. Chromatogr., 105, 33 (1975).

9. Bush I. E., Methods Biochem. Anal., 13, 357 (1965).

10. de Clercq H., Massart D. L, J. Chromatogr., 115, 1 (1975).

11. Dearden J. C, Petel A. M., Tubby J. H., J. Pharm. Pharmacol., 26, Suppl.

74P—75P (1974).

12. Denbigh K. G., Zaklady chemicke thermodynamiky. SNTL, Praha 1965, 496— 506.

13. Ebel S., Kussmaul H., Chromatographia, 7, 197 (1974).

14. Everett D. H., Trans. Faraday Soc, 46, 942 (1950).

15. Everett D. H., Trans. Faraday Soc, 60, 1803 (1964).

16. Everett D. H., Trans. Faraday Soc, 61, 2478 (1965).

17. Giddings J. C., Dynamic of Chromatography, Pt. 1. Principles and Theory.

Marcel Dekker Inc., N. Y., 1965.

18. Golkiewicz W., Chromatographia, 9, 113 (1976).

19. Guinchard C., Truong Т. Т., Masson J. D., Panouse I. J., Chromatographia, 8, 584 (1975).

Общая часть 20. Hansch С, Асе. Chem. Res., 2, 232 (1969).

21. Hansch G., Drug Design (E. J. Ariens, Ed.), Vol. 1. Academic Press, N. Y.

1971.

22. Heftmann E., Ed. Chromatography. 2nd. Ed. Reinhold Publ. Corp., N. Y.

1967.

23. Hermanek S., Schwarz V., Cekan 2., Coll. Czech. Chem. Comtnun., 28, (1963).

24. Hermanek S., Schwarz V., Cekan Z., Coll. Czech. Chem. Commun., 26, (1961).

25. Hsu Hsien-Wen, Chung In-Sae, J. Chromatogr., 138, 267 (1977).

26. Kaliszan R., Foks H., Chromatographia, 10, 346 (1977).

27. Kuchar M., Brunova В., Rejholec V., Rabek V., J. Chromatogr., 92, (1974K 28. Kuchar M., Rejholec V., JeUnkovd M., Nemecek O., J. Chromatogr., 150, (1978).

29. Kirchner J. G., Thin Layer Chromatography. Wiley—Interscience, N. Y., 1967.

30. Marichy-Viricel M., Lamoite A., Chromatographia, 10, 244 (1977).

31. Marichy-Viricel M., Lamotte A., Chromatographia, 10, 79 (1977).

32. Massart D. L, de Clercq H., Analyt. Chem., 46, 1988 (1974).

33. Melenevskij А. Т., El'kin G. E., Samsonov G. V., J. Chromatogr., 148, (1978).

34. Mofjat A. C, J. Chromatogr., 110, 341 (1975).

35. Moffat A. C, Smalldon К •№., Brown C, J. Chromatogr., 90, 1 (1974).

36. Moffat A. C, Smalldon K. W., J. Chromatogr., 90, 9 (1974).

37. Niederwieser A., Brenner M., Experientia, 21, 50 (1965).

38. Niederwieser A., Brenner M., Experientia, 21, 105 (1965).

39. Oscik I., Chojnacka G., Chromatographia, 7, 708 (1974).

40. Oscik I., Chojnacka G., J. Chromatogr., 93, 167 (1974).

41. O'scik J., Rozylo J. K., Chromatographia, 4, 516 (1971).

42. Perina Z., Sarsunova M., Pharmazie, в печати.

43. Perina Z., Sarsunova M., Zentralbl. f. Pharmazie, Pharmakother, Laboratorium diagn., 117, 956 (1978).

44. Pla-Deelfina J. M., Moreno J., del Pozo A., I. Pharmacokinet. Biopharm., 1, 243 (1973).

45. Rohrschneider I., J. Chromatogr., 22, 6 (1966).

46. Rohrschneider I., Analyt. Chem., 45, 1241 (1973).

47. Rozylo J. K-, J. Chromatogr., 93, 177 (1974).

48. Rozylo J. K-, J. Chromatogr., 116, 117 (1976).

49. Rozylo J. K., J. Chromatogr., 116, 125 (1976).' 50. Rozylo J. K., Chem. Analit. (Warszawa), 20, 489 (1975).

51. Rozylo J. К., Chromatographia, 8, 390 (1975).

52. Rozylo J. K., Chem. Analit. (Warszawa), 21, 555 (1976).

53 Rozylo J. K-, Chromatographia, 9, 74 (1976).

54 Sabacky M. J., Jones L. J., Frame H. D. Jr., Strain H. H., Analyt. Chem., 34, 306 (1962).

55. Scott R. P. W., J. Chromatogr., 122, 35 (1976).

56 Snyder R. L., Principles of Adsorption Chromatography. Marcel Dekker Inc.

N.Y., 1968.

57. Snyder R. L., Phys. Chem., 67, 134 (1963).

58. Snyder R. L, Adv. Anal. Chem. Instr., 3, 251 (1964).

59. Snyder R. L., J. Chromatogr., 16, 55 (1964).

60. Snyder R. L., J. Chromatogr., 36, 455 (1968).

61. Snyder R. L, J. Chromatogr., 63, 15 (1971).

202 Общая часть 62. Snyder R. L, Fett E. R., J. Chromatogr., 18, 461 (1965).

63. Snyder R. L, Saunders D. L., J. Chromatogr., 44, 1 (1960).

64. Snyder R. L., J. Chromatogr., 92, 223 (1974).

65. Soczewinski E., Analyt. Chem., 41, 179 (1969).

66. Soczewinski E., Dzido Т., Golkiewicz W., Chromatographia, 10, 298 (1977).

67. Soczewinski E., Golkiewicz W., Dzido Т., Chromatographia, 10, 221 (1977).

68. Soczewinski E., Golkiewicz W., Markowski W., Chromatographia, 8, (1975).

69. Souter P., J. Chromatogr., 92, 231 (1974).

70. Stahl E., (Ed.). Thin Layer Chromatography. Academic Press, N. Y. 1965.

71. Sarsunova M., Perina Z., Pharmazie, 32, 476 (1967).

72. Тафт Р. В., в печати.

73. Tomlinson E., J. Chromatogr., 113, 1 (1975).

74. Tomlinson E., Dearden J. C, J. Chromatogr., 106, 481 (1975).

75. Turina S., Trbojevi'c M., Kastalan-Macan M., Analyt. Chem., 46, 988 (1974).

76. Tute M., Advances in Drug Research, 6, 1 (1971).

77. Trappe W., Biochem. Z., 305, 150 (1940).

78. Trappe W., Biochem. Z., 306, 316 (1940).

79. Viricel M., Gonnet C, Lamotte A., Chromatographia, 7, 345 (1974).

80. Waksmundski A., Rozylo I. K., J. Chromatogr., 78, 55 (1973).

81. Waksmundski A., Rozylo J. K., Os'cik J., Chem. Analit. (Warszawa), 8, (1963).

Специальная часть 5. ПРИМЕНЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗАХ И В КОНТРОЛЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 5.1. Лекарственные средства, действующие на центральную нервную систему 5.1.1. Аналептики Аналептическим действием обладают некоторые синтетические вещества, как, например, кардиазол (коразол)* и корамин (кор диамин), производные пурина — кофеин и в меньшей степени теофиллин, которые вместе с теобромином действуют так же, как диуретики, а из природных веществ — камфора и стрихнин.

Сорбенты. Аналептики подвергали разделению на силикагеле G [5, 10, 49, 52, 78, 79, 143, 152] и на силикагеле HF 2 5 4 [39, 113, 122, 157], на слоях, приготовленных с буферным раствором Зерен сена рН 6,8 [155], или на незакрепленных слоях окиси алюминия [27, 124].

Системы растворителей. При разделении коразола, бемегрида и камфоры на силикагеле G применяли метилэтилкетон, а также смесь циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота ( 4 : 5 : 1 ) [51]. Эти же вещества разделяли также в системе хло роформ— метанол — вода (65:25:4) [5] или в смесях хлороформа с эфиром [16]. При разделении смесей лекарственных средств теофиллин отделяли от папаверина и фенобарбитала в системе бензол — этанол — ледяная уксусная кислота (80:12:5) [12].

Производные пурина подвергали разделению на слоях силика геля с флуоресцентным индикатором в системе хлороформ — че тыреххлористый углерод — метанол [113], но пользовались и бо лее сложными системами [81, 155]. Оказались также пригодными системы ацетон — хлороформ — м-бутанол — 25%-ный аммиак ( 3 : 3 : 4 : 1 ) [155] и хлороформ (насыщенный 25%-ным аммиа к о м ) — ацетон — пропанол-2 — н-пропанол (16:2:1:1) [81].


При разделении этих веществ на слоях при рН 6,8 Тайхерт и сотр. применяли хлороформ—96%-ный этанол (9:1) [138].

На слое окиси алюминия аналептики разделяли в системе хлороформ — я-бутанол (98:2) и бензол — этанол (8:2) [124], а также в хлороформе или метаноле [27].

* Здесь и далее в скобках приведено название препарата, наиболее упот ребимое в СССР, в соответствии со справочником Машковского (Машков ский М. Д. Лекарственные средства. — 8-е изд. — М.: Медицина, 1977.) — Прим. ред.

204 Специальная часть Обнаружение. Для " обнаружения аналептиков, разделенных на силикагеле G, пользовались реактивом Драгендорфа (Д53), которым, однако, нельзя обнаружить коразол и камфору. Для детектирования этих веществ Гёнсхирт [52] проводил разделение на слое силикагеля, пропитанном флуоресцеином, затем опрыски вал пластинку родамином В и раствором карбоната натрия (Д175). Кофеин обнаруживали раствором хлорамина Т (Д84).

Для его детектирования после разделения на незакрепленном слое окиси алюминия пригоден также раствор иода и иодида калия, подкисленный 2%-ной уксусной кислотой (Д108). Для обнаружения теобромина и его солей после разделения на том же самом сорбенте пригоден 1%-ный водный раствор азотнокис лой ртути (Д54), которым опрыскивают влажную хроматограм му. Пятна веществ остаются белыми, а фон — серым. Винсон и сотр. [191] в качестве универсального реактива для обнаруже ния аналептиков, барбитуратов, психотропных и других лекарст венных средств рекомендуют N, 2,6-трихлор-п-бензохинонимин, применяемый в виде 0,1%-ного раствора в хлороформе, и 2,6 дибромхинонхлоримид. Смешивают 9 частей первого раствора с 1 частью диметилсульфоксида, насыщенного NaHCO 3.

Применение. Разделением аналептиков хроматографией на слоях силикагеля занимались Гёнсхирт [49, 52] и ряд других авторов [5, 22, 78, 83, 143, 152]. Кордиамин, коразол и бемегрид в различных комбинациях разделяли подобным же образом [53].

Шаршунова и сотр. [128] (см. также [194]) отделяли кофеин, теобромин и теофиллин от салицилата или бензоата натрия. Од новременно они разработали способ обнаружения кофеина и са лицилата натрия в таблетках после экстракции хлороформом в присутствии вытяжки белладонны, фенобарбитала, кодеина, феназона (антипирина), фенацетина и других веществ, причем использовали либо слой силикагеля со связующим, либо неза крепленный слой окиси алюминия [127, 128]. Другие авторы раз личали с помощью тонкослойной хроматографии [179] синтети ческий кофеин от кофеина природного. Применяли силикагель GUF254 и систему хлороформ — этанол (9:1). Уэсли-Хадзиджа и сотр. [192] обнаруживали подобным же способом теофиллин в плазме даже в присутствии других лекарственных средств.

После разделения на незакрепленных слоях окиси алюминия обнаруживали в капсулах теобромин вместе с папаверином, эфед рином и фенобарбиталом [133]. Другие авторы [79] обнаружи вали его в различных комбинированных препаратах, в частности вместе с феназоном, дипирином (амидопирином) и фенацетином и в других смесях, следующим образом.

Кусочек таблетки растирают в тонкий порошок и переносят на часовое стекло. Порошок смачивают хлороформом, накрывают другим часовым стеклом и основательно встряхивают. Влажный слой наносят на стартовую линию в се Специальная часть редине хроматографической пластинки. По обе стороны поочередно наносят по 0,001 мл 1%-ного спиртового раствора эталонных веществ. В качестве раство рителя пользуются системой петролейный эфир — бензол — ацетон (1:1:1).

Хроматографирование длится около 30 мин. По окончании разделения хромато грамму высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 60 °С. Сухую хроматограмму проявляют парами брома в камере (чашка Петри или кювета с размерами, соответствующими размерам пластинки);

на дно камеры помещают малую чашку Петри с бромом. После проявления избыток брома с хроматограм мы удаляют сушкой на воздухе. Пятна разделенных веществ имеют бледно-жел тую окраску. Затем хроматограмму помещают в такую же камеру с иодом и проявляют парами иода до тех пор, пока пятна веществ не станут отчетливо ко ричневыми. Эту хроматограмму фотографируют. При этом способе удобно рабо тать на пластинках размером 9X12 см с толщиной слоя 0,25 мм.

В другом сообщении i[125] описывается способ разделения пу риновых производных на слоях окиси алюминия При разделении кофеина, теофиллина, теобромина и их солей авторы рабо тали со слоями окиси алюминия марки ЧДА фирмы Lachema с размером зерен 0,075 мм в слое толщины 0,6 мм, который предварительно активировали нагре ванием в течение 6 ч при температуре 400 "С, а затем выдерживали в открытом сосуде при комнатной температуре 24 ч. Полученная таким образом окись алю миния имела активность около III, и ее водная вытяжка имела рН 8,6.

Хроматограммы готовили, насыпая окись алюминия на пластинку размером 9X24 см и устанавливая толщину слоя способом, описанным в разд. 2.3.1.2. Хро матографирование вели в чашках Петри диаметром 30 см. Пластинку с помощью стеклянной подставки устанавливали наклонно, под углом 10°. Вещества наноси ли в растворенном виде в количествах, соответствующих 20 мкг разделяемого вещества, на расстоянии 12—15 мм друг от друга при помощи микропипеток по Винтерробу или в твердом виде с помощью металлических шпателей, на которые наносили каплю растворителя. Хроматограмму погружали в растворитель той стороной, на которой располагались нанесенные вещества. При разделении ис пользовали систему растворителей, содержащую один полярный и прочие непо лярные растворители. Камеру сначала насыщали парами, вкладывая полоску фильтровальной бумаги, увлажненной этой же системой растворителей, внутрь чашки Петри для того, чтобы избежать возникновения так называемого краевого эффекта. Насыщение протекает 2 ч, а само разделение — 20—40 мин в зависи мости от того, какой системой растворителей пользоваться. При обычных анали зах, когда пользуются эталонными веществами и нет необходимости точно уста навливать значения RF, насыщением камеры можно пренебречь. Разделенные ве щества проявляют подкисленным раствором иода и иодида калия (Д108) или 1%-ным водным раствором азотнокислой ртути (Д54);

этот реактив обнаружи вает теофиллин, теобромин и их соли, тогда как реактив Драгендорфа, модифи цированный по Мюнье (Д53), обнаруживает кофеин и его соли. Результаты раз деления пуриновых производных описанным способом приведены в табл. 9. Ав торы таким способом обнаруживали кофеин в присутствии салициловой кислоты (табл. 10).

Методом хроматографии на слоях окиси алюминия удается выделить кофеин в присутствии ацетилсалициловой кислоты, фенацетина, хинина и фенобарбитала. В присутствии вытяжки белладонны, эфедрина, кофеина, соли кодеина и аминофеназона (амидопирина) обнаруживают теофиллин, а вместе с папавери ном и кофеином — теобромин;

кофеин открывают в присутствии фенацетина, хинина, фенобарбитала или вместе с амидопирином, фенацетином и фенобарбиталом.

206 Специальная часть Таблица Разделение некоторых пуринов на окиси алюминия [124] Значения hRp в различных системах Препарат сю сз С1 С2 С4 С5 С6 С7 С9 СП С Аминофиллин 0 6 11 42 10 0 11 (эуфиллин) Геофиллин 11 27 0 6 42 10 с Теобромин 2 19 0 6 15 салицилатом натрия Кофеин Фронт н 0 58 15 75 Метилкофеин 47 Фронт н 0 58 68 48 15 47 Фронт н Кофеин с бен- 0 48 58 15 зоатом - нат рия Теобромин 4 0 2 19 0 6 Обозначения:

н — система непригодна;

образуются С7 этанол, денатурированный бензи ном;

растянутые пятна;

С8 хлороформ;

CI бензол;

С9 хлороформ — этанол (99: 1), С2 бензол — этанол ( 9 8 : 2 ) ;

СЮ хлороформ — к-бутанол ( 9 8 : 2 ) ;

СЗ бензол — этанол ( 9 5 : 5 ) ;

СП хлороформ — ацетон (1 : 1).

С4 бензол — этанол (90: 10);

С5 бензол — этанол (80:20);

С6 бензол — этанол ( 7 0 : 3 0 ) ;

Количественное определение. Количественным определением аналептиков занимался Гёнсхирт [51]. Была исследована корре ляция между площадью пятен разделяемых веществ и концент рацией пуринов [ И З ]. Пурины извлекали из слоя горячим хлоро формом и в элюате определяли спектрофотометрически при 276 нм. В другой работе [45] ошибка определения составила 3% при количествах веществ 25 мкг. Селье и Торре [185] определяли спектрофотометрически теофиллин, эуфиллин и диокситеофиллин после их разделения тонкослойной хроматографией на одной пластинке в смеси с прочими лекарственными веществами — эфедрином, преднизолоном, фенобарбиталом, папаверином и т. д.

Эбель и Херолд [165] определяли кофеин in situ, пользуясь ацетофенетидином в качестве внутреннего стандарта. Погреш ность определения составила 1,4%. Рассчитывать калибровочный коэффициент не было необходимости.

Специальная часть Таблица Отделение соединений, содержащих фенольныи гидроксил, их солей, сложных эфиров и комплексных соединений от пуриновых оснований [128] Значения hh Р в различных системах Вещество СЗ С С6 С С2 С4 С С Кофеин 59 30 48 67 58 Теофиллин 48 57 36 15 Теобромин 33 22 7 13 Бензоат натрия 93 77 82 82 78 83 Салицилат натрия 80 80 84 87 95 Пропиловый эфир /г-оксибензой- 87 81 86 76 88 ной кислоты (пропилпарабен) Метиловый эфир п-оксибензойной 82 74 82 70 68 кислоты (метилпарабен) Кислота салициловая 77 96 86 88 Кислота бензойная 71 78 94 79 90 Кислота л-оксибензойная 66 31 52 38 58 Кислота ацетилсалициловая — — 88 78 86 Фениловый эфир салициловой 83 90 91 89 86 кислоты Метиловый эфир салициловой 100 100 97 90 93 кислоты Обозначения:

С1 хлороформ — этанол — ледяная уксусная кислота ( 9 5 : 2, 5 : 2, 5 ) ;

С2 хлороформ — циклогексан — ледяная уксусная кислота — этанол (80 : 10 : 5 : 5);

СЗ бензол — эфир — ледяная уксусная кислота — метанол (30 : 15 : 4,5 : 0,25);

С4 пентан — диизопропиловый эфир — ледяная уксусная кислота ( 6 0 : 4 0 : 5 ) ;

С5 бензол — диоксан — ледяная уксусная кислота (70 : 26 : 4 ) ;

С6 бензол — метанол — ледяная уксусная кислота (40 : 5,5 : 4,5);

С7 бензол — диоксан — ледяная уксусная кислота (90 : 25 : 4 ) ;

С8 этанол — вода — 25%-ный аммиак (25 : 3 : 0,25).

5.1.2. Антипиретики с анальгетическим действием Антипиретиками, обладающими анальгетическим действием, часто пользуются в комбинациях с другими лекарственными сред ствами, например кодеином, кофеином, снотворными типа барби туратов и в смесях с несколькими веществами этой группы. По своей химической структуре они делятся на производные хиноли на, пиразолона, анилина и производные салициловой кислоты.

Сорбенты. Большинство антипиретиков с анальгетическими свойствами разделяли на слоях силикагеля со связующим [ 8 — 208 Специальная часть Таблица Разделение производных пиразолона и пиразолидиндиона на силикагеле G [132] Значения hRp в различных системах Препарат сз С С7 С8 С С2 С С1 С4 С Амидопирин 70 70 38 45 25 Антипирин 50 62 40 65 20 20 Фенилбутазон (бута- 57 82 90 88 72 90 дион) Кетофенилбутазон 67 72 69 40 55 65 Триметазон 72 78 85 82 75 Обозначения:

С1 хлороформ — этанол ( 8 0 : 2 0 ) ;

С2 хлороформ — этанол (70 : 30);

СЗ хлороформ — этанол ( 5 0 : 5 0 ) ;

С4 циклогексан — ацетон ( 4 0 : 5 0 ) ;

С5 циклогексан — пиридин — хлороформ ( 7 5 : 2 5 : 5 ) ;

С6 хлороформ — ацетон — этанол (70 : 27 : 3);

С7 хлороформ — м-бутанол— диэтиламин (80 : 10 : 10);

С8 диоксан — этанол — диэтиламин (80 : 10 : 10);

С9 диоксан — этанол ( 9 8 : 2 ) ;

СЮ циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота ( 4 0 : 5 0 : 10).

10, 18, 51, 52, 78, 79;

83, 120, 152], на подкисленных слоях сили кагеля или на силикагеле, содержащем азотнокислый висмут в 1,5% -ной азотной кислоте [98], на слоях кремнекислоты с по лиамидом (5:1) [64], окиси алюминия со связующим [51, 120] и на незакрепленных слоях окиси алюминия [125, 127, 129, 134].

Системы растворителей. Известен целый ряд систем раство рителей, пригодных для разделения этих веществ различной хи мической структуры. При их делении на силикагеле G пользо вались более или менее полярными [16, 52, 88] системами от одно- до четырехфазных [9, 10, 18, 24, 52, 79, 93, 120, 152]. При разделении производных пиразолона на силикагеле, имеющем кислую реакцию, пользовались системой хлороформ — этанол — вода (2:0,5:30) [20]. Для деления бутадиона, кетофенилбутазона, амидопирина и антипирина оказалась удобной система хлоро форм— этанол — диэтиламин ( 8 : 1 : 1 ) и др. (табл. 11) [132].

Пиразолоновые производные подвергали разделению на слое полиамида в системе хлороформ — бензол—90%-ная муравьиная кислота (50:10:1) [60]. При делении их на смеси полиамида и кремнекислоты пользовались системой хлороформ — циклогек с а н — ледяная уксусная кислота — диоксан ( 4 0 : 6 0 : 1 : 1 0 ) [5].

На окиси алюминия со связующим антипиретики с анальге Специальная часть Таблица Значения hRF производных пиразолона и пиразолидиндиона при делении на окиси алюминия Значения hRp в ;

различных системах Препарат сз сю С С2 С4 С6 С7 С С1 С 62 83 72 87 72 Амидопирин 52 42 Антипирин 50 85 75 65, 14 14 Вутадион 7 16 10 5 Кетофенилбутазон 0 0 0 10 12 2 10 12 10 Триметазон 5 Обозначения:

С1 бензол — этанол (95:5);

С6 эфир — этанол (95 : 5);

С2 бензол — этанол ( 9 0 : 10);

С7 эфир — этанол ( 9 0 : 1 0 ) ;

СЗ бензол — этанол (80 : 20);

С8 хлороформ — этанол ( 9 0 : 10);

С9 хлороформ — этанол ( 8 5 : 15);

С4 бензол — этанол (70:30);

СЮ хлороформ — этанол ( 7 0 : 3 0 ).

С5 эфир;

тическим действием Подвергали разделению в хлороформе либо в более сложных системах — смесях н-бутанола и ди-м-бутилового эфира, подкисленных ледяной уксусной кислотой или подщело ченных аммиаком [10]. Разделение антипиретиков на незакреп ленных слоях окиси алюминия проводили в смесях бензола или хлороформа с этанолом [124]. Для разделения очень сложных смесей лекарственных веществ, как, например, противогриппозные препараты и таблетки от кашля, удобной оказалась система хлороформ — н-бутанол (98:2) [124, 129];

благодаря большей длине молекулы спирта эта система обладает большей полярно стью, нежели система хлороформ — ацетон ( 1 : 1 ), сильно поляр ный характер которой обусловлен возможностью возникновения водородных связей и в самой системе, и между отдельными ком понентами системы и разделяемыми веществами (табл. 12).

Обнаружение. Вещества этой группы обнаруживали либо на слоях, пропитанных флуоресцирующими веществами, либо оп рыскиванием готовой хроматограммы флуоресцентным реагентом (флуоресцеином, морином, родамином В и т. п.). Обнаруженные таким образом вещества идентифицировали по тушению флуо ресценции при рассматривании в УФ-свете. Для доказательства пользовались как подкисленным раствором иода и иодида калия (Д108), так и парами иода (Д104), модифицированным по Мюнье реактивом Драгендорфа (Д53а) или реактивом Драген дорфа, подкисленным уксусной кислотой (Д536), и, наконец, 210 Специальная часть Таблица Значения hRF различных анатипиретиков с анальгетическим действием и противоревматических средств '[53] Значения hRp в различных системах Лекарственный препарат сз С С1 С Э-Фенил-2,3-диметил-4-метиламинопи- 0.разолон- (5) -N-метансульфонат натрия ((яовальгин, анальгин) 2-Фенилхинолинкарбоновая-4 кислота 3 0. (атофан, цинхофен) Ацетилсалициловая кислота (аспирин) 11 13 1 -Фенил-2,3-диметилпиразолон-5 (анти- 32 пирин) 1 - Фенил-2,3-диметил-4-диметиламино- 58 пиразолон-5 (амидопирин) тг-Этоксиацетанилид (фенацетин) Амид о-этоксибензойной кислоты N-Ацетил-Уг-аминофенол (парацетамол) 3,5-Диоксо-1,2-дифенил-4-н-бутилпира- золидин (бутазолидин, бутадион) Амид о-оксибензойной кислоты (сали- 27 69 циламид) Обозначения:

С1 метилэтилкетон;

С2 циклогексан — ацетон ( 4 0 : 5 0 ) ;

СЗ циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота ( 4 0 : 5 0 : 10);

С4 циклогексан — хлороформ — пиридин (20 : 60 : 5).

раствором иодоплатината калия (Д109). Салициловую кислоту обнаруживали раствором азотнокислого железа (Д65) [124] или перманганата калия (Д142). Это же вещество обнаруживают и в УФ-свете при 366 нм после нагревания хроматограммы до температуры 130—140°С (по интенсивно-синей флуоресценции).

•Фенацетин обнаруживают по образованию желтого окрашивания при действии окислов азота (Д141). Для обнаружения ацетилса лициловой кислоты пригоден раствор хлорида железа(III) и желтой кровяной соли (Д 101) (см. также [202, 204]).

Применение. Разделением смесей антипиретиков с анальгети ческим действием занимались многие авторы. Гёнсхирт [53] раз делял эти вещества следующим способом. После приготовления слоя силикагеля G обычным способом и добавления флуоресци рующего агента Z. S. Super (Riedel de Наёп) вещества, перечис ленные в табл. 13, подвергали разделению методом восходящей хроматографии. После разделения их обнаруживали в УФ-свете при 254 нм в виде темных пятен на зеленом фоне. При разделе нии на слое без добавки флуоресцирующего вещества для обна 21 f Специальная часть ружения пользовались раствором иодоплатината калия (Д109).

Либих в своих работах [78, 79] разделял сложные смеси, под вергая анализу таблетки, содержавшие антипирин, кофеин и фе нацетин;

таблетки, содержавшие ацетилсалициловую кислоту, кодеин и фенацетин;

капсулы с фосфатом кодеина и амидопири ном;

препараты, содержавшие производные барбитуровой кислоты и бутадиона, применяемые в качестве противоревматических средств, и мази, содержавшие никотиновую кислоту, р-бутокси этиловый эфир никотиновой кислоты и амиламид пеларгоновой кислоты. Хроматографическое разделение присутствующих ве ществ проводили в таблетках после растирания и экстракции;

86%-ным этанолом;

в капсулах — после экстракции кипящим этанолом, вымораживания и центрифугирования;

в мазях — после экстракции ацетоном и в густых мазях — после экстракции эта нолом и фильтрования [78, 79]. Зобин и сотр. [206] обнаружи вали эфедрин в готовых препаратах.

Обнаружение этой группы лекарственных средств разрабаты вали Гёнсхирт и Мальцахер [51], Браунелл и сотр. [18] и Би чан-Фиштер [16] (см. также [196]), которая анализировала сме си кодеинфосфата, кофеина, амидопирина, фенацетина и фено барбитала;

прокаина (новокаина) и кофеина, ацетилсалициловой кислоты, фенацетина и кодеина.

Она работала со слоем силикагеля G, нанесенным на пластинку размером 20X20 см, и проводила разделение в 100 мл растворителя. По его окончании хроматограмму высушивали на воздухе в течение нескольких минут, затем про изводили обнаружение. Смесь кодеинфосфата, кофеина, амидопирина, фенацети на и фенобарбитала разделяли после экстракции таблеток с помощью 10 мл ме танола и отделения инертных добавок фильтрованием. Действующие вещества из мазей экстрагировали ацетоном, из густых мазей — этанолом. На сорбент на носили 2 мкл фильтрата и такие же количества соответствующих эталонных ве ществ. Растворителем служил эфир. Хроматографирование длилось около 30 мин, обнаружение производили реактивом Драгендорфа (Д 53а) и водным раствором азотнокислой ртути (Д54). Значения hRp приведены в табл. 14.

Инъекционный раствор новокаина и кофеина Бичан-Фиштер разделяла в системе хлороформ — этанол (100:1) в течение приблизительно 15 мин. Обна ружение производили с помощью реактива Драгендорфа (Д53Ь) или диазореа гентом (Д21). После экстракции таблеток с помощью 10 мл метанола автор) проводила разделение смеси ацетилсалициловой кислоты, фенацетина и фосфата?

кодеина этилацетатом, причем элюирование длилось около 30 мин. Обнаружение производили сначала раствором хлорного железа (Д97), после чего хромато грамму подвергали высушиванию при 150 °С в течение 15 мин;

таким образом доказывали наличие ацетилсалициловой кислоты и фенацетина. Для обнаруже ния фосфата кодеина использовали реактив Драгендорфа.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 19 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.