авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Курский государственный медицинский университет»

Министерства

здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Белоусов

Василий Александрович

Новое в диагностике и лечении острого панкреатита с учетом роли

наследственных факторов 14.01.17 – хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И.П. Парфёнов доктор медицинских наук, профессор М.И. Чурносов Курск- ОГЛАВЛЕНИЕ Введение……………………………………………………………………….. Глава 1. Обзор литературы………………………………………………........ 1.1. Современные взгляды на этиопатогенез острого панкреатита……... 1.2. Факторы некроза опухоли и их рецепторы: молекулярно генетические характеристики и медико-биологические аспекты……… 1.3. Генетические исследования острого панкреатита …………………. 1.4. Способы прогнозирования течения острого панкреатита…………. Глава 2. Материалы и методы исследования ……………………………. 2.1.Общая характеристика клинических наблюдений………………... 2.2. Лабораторные и инструментальные методы исслелования…...... 2.3 Молекулярно-генетические методы…............................................ 2.4. Биометрические и генетико-статистические методы….……….. Глава 3. Особенности течения острого панкреатита ……………………... 3.1. Особенности течения острого панкроеатита в ферментативную фазу……………………………………………………………………………. Характеристика реактивной фазы острого 3.2.

панкреатита…..……………………………………………………………….. 3.3. Анализ развития фазы секвестрации у больных с острым деструктивным панкреатитом………………..……………………………… 3.4. Анализ изменений поджелудочной железы, парапанкреатической и забрюшинной клетчатки в зависимости от степни тяжести острого панкреатита…………………………………………………………………… 3.5. Использованные методы лечения при различных формах острого панкреатита …………………………………………………………………. Глава 4. Генетические исследования острого панкреатита……………..… 4.1.Изучение ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с клинико-лабораторными показателями острого панкреатита на различных фазах патологического процесса…………………………………….……… 4.2. Анализ вклада сочетаний генов факторов некроза опухоли и их рецепторов в генетическую предрасположенность к тяжелому течению острого панкреатита………………………………………………………….

. Глава 5. Эффективность использования нового диагностико-лечебного алгоритма у больных с острым панкреатитом…………………………….. Выводы……………………………………………………………………… Практические рекомендации…………………………………………….. Список литературы……………………………………………………….. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ IL — интерлейкин Lt — лимфотоксин TNF — фактор некроза опухоли TNFb — фактор некроза опухоли b TNFR1 — рецептор фактора некроза опухоли первого типа TNFR2 — рецептор фактора некроза опухоли второго типа VNTR — вариабельное число тандемных повторов АЛТ — аланиновая трансаминаза АСТ — аспарагиновая трансаминаза ВЛХЭ — видеолапароскопическая холецистэктомия ЖКБ — желчнокаменная болезнь ИВЛ — искусственная вентиляция лёгких ОДП- острый деструктивный панкреатит ОП- острый панкреатит ПОН-полиорганная недостаточность СВР- системная воспалительная реакция СКПО- синдром компенсаторного противовоспалительного ответа СПОН-синдром полиорганной недостаточности СРК- свободные радикалы ССВО- синдром системного воспалительного ответа ПЦР — полимеразная цепная реакция УЗИ — ультразвуковое исследование ЩФ — щелочная фосфатаза ЭПСТ- эндоскопическая папиллосфинктеротомия ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Острый панкреатит (ОП) сегодня, несмотря на достигнутые за последние годы успехи в диагностике и лечении, является одной из основных проблем абдоминальной хирургии, актуальной социальной и экономической проблемой. По частоте среди острой хирургической патологии до 2005года он занимал третье место после острого холецистита и острого аппендицита. Однако, в последнее время во всем мире заболеваемость ОП имеет неуклонную тенденцию к росту, достигая от 20 до 80 случаев на 100 000 человек в год. В странах Западной Европы и Америке официальные цифры заболеваемости населения острым панкреатитом варьируют в достаточно широких пределах: от 2 до 80 человек на 100 тыс.

населения, что обусловлено демографическими и этническими особенностями страны, а так же уровнем экономического и социального развития регионов [29,104,135,136,146,149,163,201]. За последние 5 лет по темпам роста эта нозологическая форма опережает все другие неотложные заболевания органов брюшной полости, а по итогам 2004-2005г.г. в стационарах Москвы и Санкт-Петербурга ОП уверенно занял вторую лидирующую позицию. [29,37,104,105,117]. Отмечено увеличение частоты деструктивных форм до 11,5 – 64%, (в среднем 15-30%) которые являются основными «поставщиками» высокой летальности [6,80]. Общая летальность при остром панкреатите составляет от 2,9 до 20% и имеет слабую тенденцию к снижению. Летальность при некротическом остром панкреатите, несмотря на разработку и внедрение новых методов лечения, остаётся стабильно высокой и достигает при тяжёлых, осложнённых формах 25-85%, при фульминантном течении заболевания - до 100% [6,29,37,47,80,104,105,117].

Вместе с тем, широкий диапазон летальности и различия в тактике лечения панкреонекроза в большинстве наблюдений обусловлены рядом причин: отсутствием четких критериев ранней диагностики панкреонекроза и прогноза течения заболевания, несвоевременной диагностикой, отсутствием единых и согласованных взглядов на формы заболевания, проведение неадекватной интенсивной терапии – без учета тяжести состояния больного, выполнение необоснованно ранних или запоздалых операций, противопоставление миниинвазивных вмешательств традиционному хирургическому лечению больных панкреонекрозом и наоборот [37,42,47,].

Как правило, диагностика и прогнозирование строится на комбинации или интеграции целого ряда клинико-лабораторных, биохимических, иммунологических параметров и данных инструментальных методов исследования, объединенных в так называемые интегральные шкала оценки и прогноза (Ranson, Osborne, APACHE-2, SAPS и др.), которые зачастую громоздки и не всегда доступны в работе большинству дежурных хирургических стационаров [53]. Существующие оценочные системы направлены на определение риска развития летального исхода в ранние сроки заболевания и при их использовании трудно корректно предсказать динамику течения патологического состояния [61].

В связи с этим, остается актуальной проблема определения дополнительных предикторов тяжелого течения ОП и оценки вероятности летального исхода. Это особенно важно у больных, органные дисфункции у которых при поступлении не свидетельствовали о тяжелых нарушениях [125].

Среди факторов, вызывающих возникновение, полиморфизм клинического течения, в т.ч. вероятность развития гнойных осложнений, исход заболевания, пожалуй, наименее изученной является роль наследственных факторов.

Цель исследования:

Улучшение результатов лечения больных острым панкреатитом путем прогнозирования на ранних этапах вариантов тяжелого течения заболевания с использованием результатов изучения полиморфизмов генов.

Задачи исследования:

1. Установить взаимосвязь клинико-диагностических признаков с течением острого панкреатита на различных стадиях заболевания.

2. Провести анализ связей генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов с клинико-лабораторными показателями у больных с острым панкреатитом и их роль в развитии гнойно-септических осложнений острого деструктивного панкреатита.

3.Определить роль молекулярно-генетических факторов цитокинов и их сочетаний в развитии и клиническом течении острого панкреатита.

4. Разработать эффективный диагностический алгоритм при остром панкреатите, позволяющий выделять пациентов группы риска развития тяжелых форм заболевания с использованием результатов изучения полиморфизмов генов.

5. Определить новую лечебную тактику при остром панкреатите до манифестации симптоматики распространенного панкреонекроза.

Научная новизна работы.

Впервые изучен генетический полиморфизм фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663 G/A TNFR2) у больных острым панкреатитом.

Впервые определено влияние генетических вариантов фактора некроза опухоли, лимфотоксина, рецепторов фактора некроза опухоли первого и второго типа, а так же их сочетаний на особенности течения острого панкреатита.

Впервые изучена роль генетического разнообразия цитокинов и их рецепторов в развитии гнойно-септических осложнений ОДП.

Разработан новый диагностический алгоритм, позволяющий в условиях тестирования наследственных факторов, прогнозирование тяжелых форм течения острого панкреатита на ранних этапах заболевания.

Определены показания к проведению интенсивного лечения острого панкреатита у пациентов с установленными полиморфизмами генов, определяющими высокий риск развития тяжелого панкреонекроза.

Практическая значимость.

Результаты проведённого исследования расширяют представления о генетических детерминантах формирования и клинического течения острого панкреатита. Для выявления индивидуумов с неблагоприятным клиническим течением ОП, и, в частности, пациентов с высоким риском развития гнойно септических осложнений. Рекомендуется проведение молекулярно генетического тестирования фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663 G/A TNFR2) у пациентов с данной патологией.

С учетом роли генетических факторов оптимизирован и применен на практике диагностический алгоритм у больных с острым панкреатитом.

Включение в диагностический алгоритм при ОП изучения полиморфизма генов факторов некроза опухолей и их рецепторов позволило в 15,7% случаев среднетяжелого и 9,7% случаев тяжелого течения заболевания до появления клинической симптоматики прогнозировать соответствующее течение. Это, в свою очередь, сделало возможным на ранних этапах течения заболевания корректировать лечебную тактику и достоверно снизить частоту (2 =4,45;

р=0,035) гнойных осложнений с 26,3% до 2,8% при среднетяжелой форме и с 71,8% до 37,5%, (2 =3,72;

р=0,05) при тяжелой форме ОП и соответственно улучшить показатели летальности: достоверное снижение при среднетяжелом с 26,3% до 2,8% (2 =3,72;

р=0,05). В группе с тяжелым течением ОП отмечена явная тенденция снижения летальности (в 1,6 раз) с 30,8% до 18,8%.

Основные положения, выносимые на защиту.

1)В дебюте заболевания, на основании клинико-лабораторных показателей и прогностической системы SAPS тяжелое течение ОП можно прогнозировать только в 56,4% случаев.

2)Полиморфные варианты генов фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663 G/A TNFR2) ассоциированы с клинико-лабораторными показателями и клиническим течением острого панкреатита.

3)Молекулярно-генетические факторы +250G/G и +250A/G лимфотоксина связаны с ранним развитием гнойно-септических осложнений ОДП.

4) Разработанный алгоритм диагностики с учетом генетических полиморфизмов генов цитокинов и их рецепторов позволяет достоверно у 15,7% больных с легким панкреатитом прогнозировать среднетяжелое течение и у 9,7% со среднетяжелым панкреатитом прогнозировать тяжелое течение.

5. Определенная на основании разработанного алгоритма новая лечебная тактика позволяет достоверное снизить количество «открытых»

операций, снизить количество гнойно-септических осложнений и улучшить результаты лечения у больных с острым панкреатитом.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены в материалах межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов» (г. Белгород, декабря 2009г.);

IV Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 25-26 февраля 2010г.);

IХ Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010г.);

VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 14-18 мая 2010г.);

Научно-практической конференции хирургов Центрального федерального округа Российской федерации «Актуальные вопросы хирургии» (Белгород, 27-28 мая 2010г.).

Внедрение результатов работы.

Разработанные рекомендации внедрены в работу хирургических отделений МБУЗ «Городская клиническая больница №1» г. Белгорода, МБУЗ «Городская клиническая больница №2» г. Белгорода. Материалы диссертации вошли в рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедры хирургических болезней №1 ФГАОУ ВПО БелГУ;

кафедры общей хирургии с курсом оперативной хирургии и топографической анатомии ФГАОУ ВПО БелГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в местной и центральной печати, из них 3 в рецензируемых ВАК изданиях, получены решения о выдаче 2 патентов на изобретение.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана на русском языке, изложена на 123 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Библиографический указатель содержит 216 наименований, из которых иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и рисунками.

ГЛАВА I. Обзор литературы Современные взгляды на этиопатогенез острого панкреатита 1.1.

Существующие многочисленные теории этиопатогенеза острого панкреатита на протяжении более 100 лет не претерпели существенных изменений [5,19,43,135,149,201]. Сам факт существования множества теорий, подвергнутых в той или иной степени критике, говорит о неоднозначности и сложности в установлении причин острого панкреатита. Несмотря на это, большинство авторов склонно условно разделять панкреатит по этиологическому фактору на билиарный (вследствие острой блокады Фатерова сосочка) и алиментарный, на долю которых приходится более 90% всех острых панкреатитов. Данные современных публикаций указывают на то, что, наряду с многообразием причин возникновения, патогенетические механизмы развития острого панкреатита протекают однотипно. Комбинация различных этиологических пусковых факторов становится толчком для начальной внутриацинарной активации протеолитических ферментов и аутокатолитического переваривания поджелудочной железы. Эта активация происходит под воздействием цитокиназы кишечной, (билиарной, панкреатической). При этом скорость развития патологического процесса зависит от соотношения ферментоактивирующих и ингибирующих механизмов [30].

По современным представлениям, трипсин- это первичный активатор каскада тяжелых патобиохимических реакций, а выраженность патологических реакций объясняется действием интегральной совокупности всех ферментных систем поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина, липазы, фосфолипазы А, эластазы, карбоксипептидазы, коллагеназы и др.) Активированные ферменты поджелудочной [29,30,50,53,68,72,78,104].

железы выступают в качестве первичных факторов агрессии, оказывают при этом как местное действие, так и поступают в забрюшинное пространство, брюшную полость, по воротной вене в печень, по лимфатическим коллекторам в системный кровоток. Фосфолипаза А разрушает мембраны клеток, липаза гидролизует внутриклеточные триглицериды до жирных кислот, которые соединяясь с кальцием, образуют элементы структуры жирового некроза в поджелудочной железе, клетчатке забрюшинного пространства и брюшине. Трипсин и химотрипсин осуществляет протеолиз белков тканей, эластаза разрушает стенку сосудов и межтканевые соединительно-тканные структуры, что приводит к развитию геморрагического некроза. Формирующиеся очаги некробиоза, некроза с перифокальной демаркационной зоной воспаления в поджелудочной железе (ПЖ), забрюшинной клетчатке первично асептичны [29,30,50,53,68,72,104].

Важным звеном патогенеза ОП является активация трипсином каллекреин-кининовой системы с образованием вторичных факторов агрессии - брадикинина, гистамина, серотонина. Именно активация кининов сопровождается увеличением сосудистой проницаемости, нарушением микроциркуляции, формирование отека в зоне ПЖ и забрюшинном пространстве, повышенной экссудацией в брюшную полость.

К факторам агрессии третьего порядка, участвующими в патогенезе местной и системной воспалительной реакции, нарушении микроциркуляции и системной гемодинамики, миокардиальной и дыхательной недостаточности, относятся различные медиаторы воспаления (цитокины). Они определяют способность острого панкреатита быстро прогрессировать от лёгкой формы к тяжёлой, угрожающей жизни, развития синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), что в значительной степени определяет тяжесть ОП [29,30,50,53,68,72,104]. В последние годы доказано что тяжесть ОП определяется не [24,103,124,181,206], самоперевариванием ПЖ и не феноменом «уклонения ферментов», а запуском каскада событий, приводящих к развитию синдрома системного воспалительного ответа, характерного так же и для других тяжелых состояний: множественной травмы, ожога, сепсиса. При остром панкреатите все типичные для ССВО черты проявляются наиболее ярко и отчетливо.

Именно ССВО ответственен за дальнейшее прогрессирующее повреждение паренхимы ПЖ, её некроз и развитие полиорганной недостаточности (ПОН)- основного звена в патогенезе острого панкреатита. По современным представлениям [24,100,103,104,105,124] ведущую роль в патогенезе ОП играют медиаторы воспаления: про- и противовоспалительные цитокины.

Цитокины — это разнообразные биологически активные молекулы, секретируемые клетками «с целью» воздействия через специфические рецепторы для каждого из цитокинов на рядом расположенную клетку (или на себя же) [24,100,103,105]. Они являются своего рода «эсперанто» в межклеточном общении. В норме это близкодействующие медиаторы локальных взаимодействий клеток в очагах тех или иных процессов, т.е.

типичное место работы цитокина — межклеточный синапс. Могут оказывать аутокринные (на саму клетку, секретировавшую цитокин) и паракринные эффекты (на рядом расположенные клетки). При тяжелой системной патологии типа септического шока для части цитокинов (в том числе для ФНО) выявлены и эндокринные (дистантные, системные) эффекты, так как при этом цитокин достигает клетки–мишени, циркулируя с кровью. (Хаитов Р.М., 2006). Секреция цитокина очень четко отрегулированный процесс и экспрессия большинства цитокинов модулируется факторами транскрипции, такими как «ядерный фактор Каппа Б» (NF-kB), которому принадлежит фундаментальная роль в регуляции острого воспаления [24,103,124].

Цитокиновая система включает в себя 5 обширных классов, объединенных по доминирующему действию на другие клетки. Деление на группы весьма условно, поскольку для всех цитокинов характерно так называемое плейотропное действие [103] т.е. они – полифункциональные молекулы, действующие более чем на одну клетку мишень и стимулирующие у различных мишеней различные процессы. Спектры биологических активностей цитокинов иммунной системы в значительной степени перекрываются: один и тот же процесс может стимулироваться в клетке более чем одним цитокином. Совокупность цитокинов иммунной системы образует «каскад цитокинов». Антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов «первой волны» – ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-6, которые индуцируют биосинтез центрального регуляторного цитокина ИЛ-2, а также ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФН-g и др. В свою очередь, цитокины «второй волны» влияют на биосинтез ранних цитокинов. Такой принцип действия позволяет не только регулировать иммунный ответ, но и амплифицировать его, вовлекая в реакцию все возрастающее число клеток [24,103,124]. Возникающий при остром панкреатите «цитокиновый шторм» - потенциально фатальная иммунная реакция, состоящая из положительной обратной связи между цитокинами и иммунными клетками. Когда иммунная система борется с поврежденными клетками и инфекционными агентами, цитокины сигнализируют иммунным клеткам, таким как Т-лимфоциты и макрофаги, чтобы они направлялись в соответствующий участок. Дополнительно цитокины активизируют клетки, стимулируя их произвести еще больше цитокинов. Эта положительная обратная связь становится бесконтрольной, и слишком много иммунных клеток активизируется в одном месте.

Цитокиновый шторм имеет потенциал для значительного повреждения тканей и органов. Эти факты объясняют механизм, посредством которого выброс большого количества цитокинов способствует прогрессированию тяжелого ССВР при остром панкреатите [24,98,100,103,124]. В последнее время появилось большое количество работ, посвященных изучению патогенеза ОП на молекулярном уровне, что является ключом к пониманию этого заболевания. После повреждения клеток ПЖ запускается «каскад»

воспалительной реакции, который можно разделить на 3 фазы: локальное воспаление в ПЖ, генерализованный воспалительный ответ и финальная фаза сепсиса. Процесс может самостоятельно купироваться на уровне локальной воспалительной реакции, результатом чего будет развитие легкого течения ОП (отечная форма), при инициации каскада ССВО развивается панкреонекроз [37,103,196]. В развитии панкреонекроза выделяют 2 стадии заболевания. Первая, начальная, стадия обусловлена формированием системного воспалительного ответа, когда панкреонекроз носит стерильный характер. Ферменты и другие биологические вещества, циркулирующие в крови, действие которых на моноцитарно-макрофагальное звено аналогичное действию микробного эндотоксина, у части больных приводят к развитию панкреатогенного шока (в 9%) и ранней полиорганной недостаточности [26].

Вторая стадия панкреонекроза связана с развитием инфекционных осложнений в зонах некроза и обусловлена активацией синтеза аналогичной первой фазе провоспалительных субстанций. В этот период порочный круг патологических реакций составляет качественно новый этап формирования системной воспалительной реакции в виде септического (инфекционно токсического) шока и септической полиорганной недостаточности при панкреонекрозе [104, 105, 106]. В ответ на гиперстиммуляцию или прямое повреждение ацинарной клетки в том числе даже после [124], кратковременного нарушения физиологического состояния поджелудочной железы (внутрипротоковое повышение давления при прохождении камней или во время РПХГ, механическая травма во время операции, физические факторы, свободные радикалы, воздействия липополисахаридов клеточной оболочки бактерий, вирусов, митогенов и цитокинов), на фоне высочайшей чувствительности панкреатоцитов к повреждающим факторам, происходит синтез провоспалительных цитокинов. При этом происходит активация сигнальных путей Toll-подобных рецепторов (TLR) клеток поджелудочной железы, играющих ключевую роль в патогенной идентификации и врожденном иммунитете [98,199,207,216] и воздействие на плейотропный ядерный фактор транскрипции (NF-кВ), который в цитоплазме интактной клетки находится в неактивной форме, будучи связан с ингибиторными белками. В результате происходит фосфорилирование и протеолиз белков ингибитора, что позволяет ядерному фактору переместиться в ядро и связаться с определенными участками ДНК. Это вызывает активацию рано включающихся в клеточный ответ на стресс гены, такие, как гены цитокинов, молекул адгезии, белковой острой фазы и др. и резко возрастает синтез данных субстанций [124]. При моделировании ОП доказано, что в ацинарных клетках происходит активация генов ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, фактора активации тромбоцитов (ФАТ) и содержание соответствующих белков в течение нескольких часов в ткани поджелудочной железы резко увеличивается.

Вследствие этого происходит миграция нейтрофилов в очаг поражения через стенку постъкапиллярных венул. После чего происходит “респираторный взрыв” с выбросом протеолитических ферментов, свободных радикалов и цитокинов, способных разрушить ткани и микробные тела, а так же вызвать приток новых лейкоцитов, в том числе и моноцитов. Моноциты превращаются в активные макрофаги под действием фактора ингибиции миграции макрофагов, которые также вырабатывают большое количество провоспалительных медиаторов и растворимых рецепторных белков, что определяет появление второй волны цитокинов (цитокиновый каскад).

Выброс ИЛ-1в, ФНО-а и ФАТ может активировать лейкоциты в системной циркуляции и эндотелии микроциркуляторного русла печени, легких, селезенки и других органов. Здесь также могут произойти задержка, краевое стояние, миграция и активация лейкоцитов, возникнуть воспалительные инфильтраты и как следствие- очаги повреждений тканей, что клинически проявляется нарушением функции органов вплоть до полиорганной недостаточности [124].

Важнейшим звеном в развитии ОП является транслокация эндогенной микрофлоры и эндотоксина граммотрицательных бактерий кишечника, которая происходит в условиях функциональной (реже морфологической) несостоятельности метаболической и барьерной функции ЖКТ, ретикулоэндотелиальной системы печени и легких [105, 115]. и составляет своеобразное звено между начальной (доинфекционной) и поздней фазами острого панкреатита При (септической) [15,23,37,57,72,105].

инфицировании зон панкреонекроза происходит реактивация и репродукция аналогичных первой фазе про- и противовоспалительных медиаторов, триггером которых являются токсины микроорганизмов, колонизирующие зоны некроза. В инфекционную фазу заболевания создается порочный круг патологических реакций. Он становится качественно новым этапом формирования разнообразных инфицированных форм панкреонекроза и системной воспалительной реакции в виде септического шока и полиорганной недостаточности. При различных инфицированных формах панкреонекроза летальность увеличивается в 2-3 раза по сравнению со стерильными формами заболевания [57,105].

Схематично патогенез системной воспалительной реакции (СВР) при остром панкреатите выглядит следующим образом:

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ В РАЗВИТИИ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА (М.А.Агапов) (Патогенез системной воспалительной реакции при панкреатите) Пусковые механизмы Активация ферментов Повреждение ацинарных клеток циркулирующие Активация свертывающей системы цитокины активированные ферменты Медиаторы воспаления Про Анти ФНО-альфа ИЛ- ИЛ1-бетта С5 А ИЛ-6 ИЛ- ИЛ- ФАТ Системная воспалительная реакция Развитие системной воспалительной реакции при ОП является закономерной, но не фатальной реакций организма на повреждение, ему противодействует система противовоспалительных медиаторов (ИЛ-2, 4, 10, 11, 18, растворимые рецепторы к a-ФНО и антагонисты рецепторов ИЛ-1b, активация нейтрализации a-ФНО в печени) – синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (СКПО, CARS). При сбалансированном течении CARS подавляет системную воспалительную реакцию. В то же время, при чрезмерной выраженности или пролонгированном течении CARS может индуцировать развитие глубокой иммунодепрессии, что клинически проявляется хронизацией или диссеминацией инфекции, нарушением процесса репарации, утяжелением эндотоксикоза и формированием поздней полиорганной недостаточности, что в совокупности предопределяет летальный исход на поздних этапах гнойно-септического процесса. В целом системное проявление воспаления, развитие осложнений и исход заболевания определяется балансом этих двух ответов [120].

Цитокины в развитии системной противовоспалительной реакции (А.А.Останин и др., 2002г.) CARS ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ И МЕДИАТОРЫ Противовоспалительные цитокины и ТН 1 – ЦИТОКИНЫ (ИЛ-10, ИЛ-4, ТРФ-) ФНО-, ИЛ–1, ИЛ–12, Растворимые ингибиторов ИЛ–6, ИЛ–8, ИФН–, (ФНО- R,ИЛ–1 R, ИЛ–1 RA) ИЛ – Глюкокортикоиды, простагландин Е СИСТЕМНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ Таким образом, исходя из современных представлений об этипатогенезе острого панкреатита, наряду с другими механизмами, роль цитокиновой системы, цитокинов в развитии ССВО, а при наличии инфекции – панкреатогенного сепсиса, полиорганной недостаточности и развитии фатальных исходов течения заболевания является определяющей.

Но, несмотря на значительные успехи в изучении проблем ОП, в патогенезе этого заболевания в настоящее время больше вопросов, нежели ответов.

Доказана первостепенная роль иммунных механизмов в развитии острого панкреатита, но что является лидирующим- чрезмерная иммунная агрессия или же иммуносупрессия, адаптивный или врожденный механизмы иммунного ответа, остается до сих пор неясным. В подтверждение изложенному выше, практические врачи порой наблюдают самопроизвольное выздоровление от острого панкреатита одних пациентов и фатальное течение заболевания, приводящее к гибели, несмотря на весь арсенал лечебных мероприятий, других [24,103]. Дальнейшее изучение роли цитокинов и других низкомолекулярных медиаторов воспаления в патогенезе ОП является ключом к пониманию развития данной патологии, возможного раннего прогнозирования течения и исхода заболевания, а так же создания новых способов лечения.

1.2. Факторы некроза опухолей и их рецепторы: молекулярно генетические характеристики и медико-биологические аспекты По мнению большинства учёных, ФНО служит основным медиатором воспаления и важным регулятором иммунного ответа и является центральным патогенетическим фактором системных и местных воспалительных процессов, а также различных болезней, в которых активация макрофагов играет важную роль: септическом шоке и мультиорганной дисфункции при сепсисе, политравме и других критических состояниях, в том числе и при остром панкреатите, перитоните и др.

[26,53,103,113]. В группу факторов некроза опухолей включают TNF-a и TNF-b (лимфотоксин). TNF-a является продуктом моноцитов/макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, клеток нейроглии, в особых случаях – активированных Т-лимфоцитов. Последние являются основными продуцентами Противоопухолевое действие, связанное с TNF-b.

геморрагическим некрозом и давшее название ФНО, однако, не ограничивает спектр действий данного фактора. ФНО- относится к цитокинами «первой волны», наряду с ИЛ-1, ИЛ-6. Синтезируется как мембранный белок с молекулярной массой 26 кДа (233 аминокислоты). После действия специфической металлопротеазы, т.н. ФНО-конвертирующего фермента, мембрано-связывающий фрагмент отщепляется и образуется растворимый ФНО с молекулярной массой 17 кДа (157 аминокислот). Активной формой белка является гомотример, теряющий активность при диссоциации субъединиц, так как только тример способен связываться с рецептром и олигомеризовать его, что необходимо для запуска сигнального пути. Ген TNF a расположен в шестой хромосоме человека (6р21.3) в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-А,В,С) и второго классов ( HLA-DP, DQ, DR), между генами Lta и Ltb (Байнак О.В. и др., 2005;

Seideman K. et al., 2005). Известно более 30 полиморфных вариантов этого гена (SPN-полиморфизмы, микросателлиты), но только около половины из них влияют на экспрессию TNF-a in vivo. Отдельные полиморфизмы были найдены благодаря сильной связи с определенными HLA –аллелями [197]. Из них два полиморфизма у человека ассоциированы с некоторыми инфекционными заболеваниями, например, -308 G/А полиморфизм промоторной области гена TNF-a : замена гуанинана на аденин в позиции 308 обусловливает появление редкого аллеля TNF2 и жестко привязана к галотипам В8, главного комплекса HLA-А1, DR гистосовместимости [169]. Отмечено, что такое замещение влияет на усиление активности промоторной области (Brinkman В.М. et al.,1995;

Kroeger К.М. et al., 2000;

Majetschak М. et al., 2002). При этом происходит 6 7кратное повышение индуцируемого уровня транскрипции гена TNF-a.

Наряду с этим в другом полиморфном варианте гена TNF-a (-238 G/А), аллель А ассоциирован с понижением продукции TNF-a (Плоткин В.Я. и др., 2007г;

Trajkov Д. et al., 2008). После стимуляции секреция фактора регистрируется через 40 минут;

максимум её достигается через 1,5 - 3 часа. ФНО-а имеет короткий плазменный период полураспада- 14-18 мин вследствие быстрого клиренса печенью, желудочно-кишечным трактом и почками, что делает достаточно сложным его оценку серологическими пробами. Поэтому отсутствие или низкий уровень ФНО-а в сыворотке не коррелирует с фактическими событиями, происходящими во внутренней среде. Несмотря на это в ряде работ показано достоверное увеличение ФНО-а в сыворотке 30 больных острым панкреатитом и коррелирует со степенью 40% эндотоксикоза [53].Так, по данным О.В. Первовой (2006г.), в результате проведенных иммунологических исследований оказалось, что у больных деструктивным панкреатитом, начиная с первых суток госпитализации, концентрация основных провоспалительных цитокинов - интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли превышали нормальные значения в 2,3 и в 4,3 раза, соответственно. На 5-е сутки содержание указанных медиаторов воспаления несколько уменьшалось, оставаясь все же выше нормы более чем в 1,5 раза, а затем вновь увеличивалось, причем концентрация фактора некроза опухоли возрастала до исходного уровня.

Существует три основных направления действия TNFа :

- цитотоксическое, направленное на клетки опухоли либо клетки, пораженные вирусами - иммуномодулирующее и прововоспалительное, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток - влияние на метаболизм Данный фактор усиливает пролиферацию Т- и В-клеток, цитотоксических лимфоцитов, фагоцитоз, стимулирует мононуклеарные фагоциты и другие типы клеток к продукции цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6 ;

ИЛ-2 и др.), хемоаттрактантов, адгезивным молекул и др.), (IСАМ-1, VСАМ- острофазных белков, активирует фибробласты, синтез коллагена и коагуляцию;

оказывает интерфероноподобное защитное действие в отношении вирусов. В результате высвобождения TNFа повышается проницаемость капилляров, повреждается эндотелий сосудов, он способен угнетать фибринолиз, способствовать тромбообразованию, тем самым усугубляя нарушения микроциркуляции [186]. TNFа активно участвует в процессе быстрого увеличения размеров клетки и инициации апоптоза [36,170]. Помимо прямого провоспалительного действия, TNFа обладает широким спектром иммунорегуляторных эффектов и участвует в регуляции обменных процессов [36,170]. Известно, что гиперпродукция ФНО-а приводит к снижению чувствительности к действию инсулина и, как следствие, изменению метаболизма глюкозы в жировой, мышечной тканях и печени. при травмах, инфекциях, опухолевых заболеваниях. [36,88,89] Биологические эффекты ФНО зависят от его концентрации (Хаитов Р.М., 2006). В низких концентрациях он действует в месте своего «рождения», как пара- и аутокринный регулятор иммуновоспалительной реакции против травмы или инфекции. Он основной стиммулятор для нейтрофилов и эндотелиальных клеток, для их адгезии и дальнейшей миграции лейкоцитов, пролиферации фибробластов и эндотелия при заживлении раны. В средних концентрациях ФНО-альфа, поступая в кровь, действует как гормон, оказывая пирогенный эффект, стимулирует образование фагоцитов, усиливает свёртывание крови;

снижает аппетит, являясь важным фактором развития кахексии при хронических заболеваниях, таких как туберкулёз, рак Высокие концентрации, определяемые при грамм-отрицательном сепсисе, являются важнейшей причиной возникновения септического шока вследствие снижения тканевой перфузии, снижения артериального давления, внутрисосудистого тромбоза, резкого, несовместимого с жизнью, падения концентрации глюкозы в крови.

Фактор некроза опухоли бета (ФНО-, лимфотоксин-а) – гликопротеид, массой около 33 кДа, который продуцируется стимулированными митогенами Т-лимфацитами и лейкоцитами, а так же секретируется фибробластами, астроцитами, миеломными клетками, эпителио- и эндотелиоцитами [45,114].

Вырабатывается значительно позже, чем TNF-a (2-е-3-и сутки после активации). Ген Lt-a находится в шестой хромосоме (6р21.3), содержит экзона, расположен на близком расстоянии от гена TNF-а. Lt-a обладает рядом подобных ФНО-а биологических активностей, включая способность вызывать геморрагический некроз опухолей [169]. Тем не менее, оба этих гена регулируются независимо друг от друга.. Lt-a связывается с теми же рецепторами, что TNF-а, однако способность активировать рецепторы у Lt-a менее выражена, зачастую он проявляет лишь частичную агонистическую активность. Lt-a является хемоаттрактантом для нейтрофилов, стимулирует в них образование пероксид-ионов, усиливает фагоцитоз и адгезию к эндотелию, стимулирует активность фибробластов, играет роль в процессе заживления ран, а так же провоцирует выработку стресс-гормонов, влияет на метаболизм глюкозы Способствует развитию лихорадочной [45,182].

реакции, усиливает основные функции лейкоцитов, стимулирует выброс гистамина базофилами и тучными клетками, вызывает активацию фибробластов, гладких миоцитов и эндотелия сосудов в очаге воспаления, индуцирует синтез белков острой фазы. Действуя синергично с ИЛ-1 и ИЛ-6, повышает функциональную активность цитотоксических Т-лимфоцитов и их способность к разрушению инфицированных вирусом клеток, что ведет к элиминации вируса. Лимфотоксины - вещества белковой природы, обладают свойствами цитотоксинов, вызывают лизис клеток-мишеней.

Цитотоксическое действие лимфотоксинов неспецифично, под их влиянием могут повреждаться не только те клетки, которые вызвали их образование, но и интактные клетки. Лимфотоксин повреждает лимфоциты, фибробласты, макрофаги, эритроциты и другие клетки.

Свои биологические эффекты ФНО проявляют при взаимодействии со специфическими рецепторами. Надсемейство рецепторов TNF содержит более 20 структурно родственных трансмембранных белков, специфически активируемых соответствующими представителями подобных TNF-а цитокинов, что приводит к возникновению широкого спектра ответов клетки, включая активацию транскрипции генов, индукцию апоптоза [167].

Семейство рецепторов TNF составляют два рецептора: TNFR1 и TNFR 2;

рецептор лимфотоксина Р, р75(рецептор NGF), СД 40, СД 30 и СД (Хаитов Р.М., 2006;

Lockslej R.M. et al., 2001). Во внеклеточной части молекул семейства рецепторов TNF содержится от двух до шести цистеинобогащенных доменов, аминокислотные последовательности которых весьма схожи у различных представителей семейства, в результате чего гомология этого района белков достигается 25%. Цитоплазматические же части рецепторов отличаются значительной вариабельностью. [148,178].

TNFR1, известный также как СД 120а, является белком с молекулярной массой 55-60 кДа (р55). Данный рецептор опосредует все виды действия ФНО -апоптоз, дифференцировку и пролиферацию клеток, а так же обладает противовирусной активностью. Ген TNFR1 у человека расположен на хромосоме 12р13 [148,171]. Рецептор ФНО первого типа ответственен за острый воспалительный ответ и экспрессируется на поверхности большинства типов клеток человека. Описано несколько полиморфизмов гена полиморфизм ассоциированный с развитием TNFR1: -308 G/Т гепатоцеллюлярной аденокарциномы, экзонный полиморфизм TNFR (+36А/G/), взаимосвязанный с течением ревматоидного артрита, а так же с другими заболеваниями (Dieude Р. et al., 2004, Kim S. et al., 2008) и другие полиморфизмы (Soo J.C. et al., 2008).

Ген TNFR2 локализован в хромосоме 1р36.2 и состоит из 10 экзонов, занимающих область размером 26 килобаз. Этот рецептор опосредует главным образом метаболические эффекты ФНО, в частности регулирует жировой и углеводный обмен, а так же ответственен за TNF индуцированную пролиферацию тимоцитов. Данный рецептор вовлечен преимущественно в транскрипцию генов, ответственных за адаптацию клетки, ее рост и дифференцировку [148,167]. Изучены некоторые полиморфизмы гена TNFR2. Так микросателлитный маркер в четвертом интроне ассоциирован с гипертензией и семейной гиперлипидемией. Другой маркер девятом экзоне) ассоциирован с ожирением и (в инсулинорезистентностью при сахарном диабете второго типа. Так же выявлена ассоциация полиморфизма -196R TNFR2 (замена метионина на аргинин) с некоторыми ревматическими заболеваниями, такими, как системная красная волчанка (Sankar V. et al., 2005). Hohjoh Н. et al. (2008) сообщают об ассоциации этого полиморфизма с нарколепсией у человека, при этом предполагается однонаправленное влияние полиморфизмов -196R TNFR2 и -857Т TNF на ее развитие.Следует отметить, что связывание факторов некроза опухолей с рецептором первого типа практически необратимо, тогда как взаимодействие с рецептором второго типа имеет обратимый характер, диссоциация проходит в 30 раз быстрее, чем в случае с TNFR1. Таким образом, растворимый рецептор TNFR2 может служить лигандом-проводником для связывания TNF с TNFR1, тем самым проявляя провоспалительный эффект [148]. Внеклеточные области рецепторов TNFR и TNFR2 имеют сходную архитектуру, но у внутриклеточных нет существенного соответствия, поэтому данные рецепторы обеспечивают различные пути передачи сигналов: например, TNFR1, но не TNFR2, вызывает апоптоз [ 162]. Внутри клетки сигнал передаётся посредством сложной системы белков к факторам контролирующим транскрипцию, в частности ядерному фактору кВ (NF-кВ). Данный путь передачи сигнала регулирует рост, гибель клетки, канцерогенез и ответ на стрессовую реакцию (Хаитов Р.М., 2006;

Ахматова Н.К., 2008). По данным многих исследований рецептор 1типа р55 играет главную роль в передаче сигнала, а рецептор р не может преобразовывать сигнал самостоятельно и играет модулирующую роль. Тем не менее была высказана гипотеза о том, что оба рецептора в зависимости от концентрации могут быть как агонистами, так и антагонистами (Хаитов Р.М., 2006;

Ахматова Н.К., 2008). Вероятно, роль р состоит в усилении сигнала р55 и увеличении адгезии лиганд-рецептор.

Таким образом, только соотношение уровней экспрессии обоих рецепторов и концентрации ФНО определяют окончательный эффект комплекса лиганд рецептор. Поэтому более важным при изучении интраабдоминального воспаления представляется определение уровня экспрессии и концентрации рецепторов ФНО-р55 и р75, а не только самого ФНО. Обобщая материалы по действию факторов некоза опухолей, следует отметить, что они обусловливают ряд важных биологических эффектов. TNF, являясь основным цитокином «первой волны», наиболее универсальным эффектором, отвечает за регуляцию воспалительного каскада, клеточной пролиферации и апоптоза, влияет на микроциркуляцию, жировой и углеводный виды обмена.

Lt преимущественно влияет на пролиферацию и метаболизм глюкозы.

Клеточные эффекты факторов некроза опухолей невозможны без их связи с соответствующими рецепторами, при этом TNFR1 способен запускать как провоспалительные, так и апоптотические изменения клеток, а TNFR2 в большей степени опосредует метаболические сдвиги и пролиферативные реакции. Каждый из названных биологических эффектов имеет патогенетическое значение в развитии острого панкреатита и степень выраженности этих эффектов будет определяться содержанием данных цитокинов и их рецепторов. При этом уровень экспрессии TNF, Lt, TNFR и TNFR2 будет изначально зависеть от полиморфизма генов, кодирующих их синтез.

1.3.Генетические исследования острого панкреатита Одно из наиболее современных направлений изучения острого панкреатита исследование факторов генетической предрасположенности к тяжелым формам заболевания [9,10,25,41,68,91].

Однако в отечественной литературе, несмотря на то, что значимость генетических факторов отмечается многими авторами, имеются единичные сообщения. К настоящему моменту идентифицирован ряд мутаций, касающиеся ферментных систем, которые рассматриваются как основные факторы наследственной предрасположенности к панкреатиту. Так, мутация в гене катионного трипсиногена приводит к тому, что (PRSS1) трипсиноген становится устойчивым к аутолизу и подверженным более легкой аутоактивации, что может провоцировать развитие генетически обусловленного острого панкреатита [63,64,174,187,188]. При мутации в гене панкреатического ингибитора трипсина нарушается (SPINK1) инактивация трипсина в ткани ПЖ, что приводит к активации панкреатических ферментов, протеолитическому некрозу ткани поджелудочной железы и лизису стенок венул [60,63,64,157]. Мутации в гене трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) реализуются на клеточном уровне недостаточной гидратацией, защелачиванием первичного секрета экзокринных желез и увеличением его вязкости [4,10,48,63.64,75,101,161].

Газенкампф А. А., Карапчук Л. А и др. так же отмечают несомненную значимость наследственного фактора в патогенезе острого панкреатита.

Разработка этого направления перспективна и необходима для наиболее полного понимания процессов этиологии и патогенеза острого панкреатита, и, следовательно, наиболее качественного лечения и профилактики этого заболевания. В своих работах авторы выявили основные мутации, являющиеся причинами развития наследственного, идиопатического, и, возможно, других форм панкреатита. Это мутации генов катионного трипсиногена (PRSS1), ингибитора трипсиногена (PINK1), трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (CFTR).

Вопросы, касающиеся генетически детерминированного острого панкреатита, находятся в начальной стадии изучения. Помимо описанных генетических мутаций в патогенезе острого панкреатита могут принимать участие мутации других генов и их комбинации [140]. В современной отечественной литературе мы встретили единичные сообщения об исследованиях, касающихся генетики цитокинов, в частности TNF, Lt и их рецепторов, которые являются важными звеньями в патогенезе ОП. В частности, об использование полиморфизма гена фактора некроза опухолей альфа в качестве маркера развития абдоминального сепсиса у пациентов с тяжелым острым панкреатитом сообщают Лутфарахманов И. И., Викторова Т.В.

(2007г). В своей работе авторы заключают, что генетические факторы могут играть роль в вариабельности течения тяжелого острого панкреатита и что полиморфизм ассоциирован с септическими -308GА TNF-альфа осложнениями тяжелого острого панкреатита и может быть полезным маркером для прогнозирования случаев абдоминального сепсиса у пациентов с тяжелым острым панкреатитом [44].

Анализируя материалы зарубежных публикаций, касающиеся наследственной предрасположенности к ОП и, в частности, генетического разнообразия генов цитокинов и их рецепторов, отмечается противоречивость приводимых данных. Так, многие авторы указывают, что, несмотря на то, что выработка цитокинов вызвана рядом внешних стимулов, генетические факторы могут играть важную роль в определении уровня секреции цитокинов. Приводятся данные, что вариации последовательности ДНК (полиморфизм), в том числе и ФНО, влияющие на транскрипцию генов, играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, и частности в наследственной предрасположенности к острому панкреатиту [145,184,205,209,215]. Широкий спектр мутаций и полиморфизмов в генах, связанных с функцией поджелудочной железы, участвуют в развитии панкреатита, а также генетически обусловленные различия в уровне цитокинов могут объяснить различия в тяжести заболевания (Malleo,G.;

Mazzon, E.;

Siriwardena, A.;

Cuzzocrea, S. 2007). В последние годы в ряде исследований рассматривается вклад ФНО полиморфизма в - определении восприимчивости к болезни и степени тяжести у больных с острым панкреатитом. В большинстве из приводимых работ статистически значимых различий в распределения частот генотипов ФНО -308, у пациентов с легкой и средней тяжести заболевания не были обнаружены [139,141,142,159,164,214]. Тем не менее, было показано, что пациенты с острым панкреатитом, сопровождавшегося септическим шоком, имели значительно более высокую распространенность TNF-2 аллеля, чем больные без явлений септического шока. Эти показатели так же коррелировали с уровнем летальности.

В своих исследованиях, проведенных на кафедре биохимии медицинского факультета г. Анкара (Ibis et all., 2004) авторы пришли к выводу, что в крови пациентов с острым панкреатитом уровень TNF-альфа был выше, чем при хронической форме заболевания., но его концентрация не коррелирует с тяжестью заболевания.

В работах Balog A. et all., 2005 показал, что частота TNF-1/2 генотипа у пациентов с тяжелым панкреатитом выше по сравнению с пациентами с легкой формой панкреатита, у которых генотип TNF-1/1 встречался значительно чаще. Это исследование показывает, что наличие TNF-2 аллеля не является фактором, предрасполагающим к развитию панкреатита, но может служить потенциальным маркером тяжести заболевания. В работе так же высказывается идея о сочетании «неблагоприятных» генетических полиморфизмов (в частности одновременное присутствие TNF-2 и низкий к производству белка теплового шока) с такими осложнениями панкреонекроза как инфицирование[194]. Проведенные за последние годы исследования [139,142] свидетельствуют о том, что генетические факторы оказывают значительное влияние на выраженность иммунного ответа и соответственно легкое или тяжелое течение ОП. Данные исследования касались изучениния полиморфизма генов TNF-308, ИЛ-1 и IL-1-рецепторов;

IL-8 [23].,IL-10;

белков теплового шока 70 (HSP70) За последние несколько лет были выявлены несколько полиморфизмов генов иммунной системы, которые влияют на тяжесть острого панкреатита.

В исследованиях Tukiainen E., Kylanpaa et all., 2008 проведен анализ генотипов фактора некроза опухоли (ФНО) -308 у 397 пациентов с острым алкогольным панкреатитом. Достоверных различий тяжести течения заболевания в зависимости от полиморфизмов ФНО не было установлено.

Таким образом, подводя итог литературных данных, касающихся исследований в области наследственной предрасположенности к ОП и его возможному течению, можно сделать вывод, что:

в свете современных представлений генетические полиморфизмы 1) генов играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, и частности в наследственной предрасположенности к острому панкреатиту генетическое разнообразие ФНО и их рецепторов, а так же 2) сочетание «неблагоприятных» полиморфизмов генов может обуславливать тяжелое (осложненное) течение ОП В виду того, что приводимые данные немногочисленны и 3) противоречивы, это напраление требует дальнейшего изучения, что может пролить свет на механизм патобиохимических реакций у больных острым панкреатитом.

Не исключено, что генотипирование больных острым панкреатитом позволит установить истинную причину заболевания и прогнозировать тяжесть течения патологического процесса.

1.4. Способы прогнозирования тяжести ОП Оценка тяжести и прогнозирование состояния больных ОП и его осложнений чрезвычайно важны, являются неотъемлемой частью лечения [8,13,30,53,61,72,77]. Как будет протекать заболевание у конкретного пациента с ОП- ключевая задача для клиницистов. Ведь тяжелый больной сразу привлекает к себе внимание и не требует дополнительных стимулов.


Обескураживает неблагоприятный исход у пациентов, которые поначалу не вызывали опасения [53]. «Увидеть то, чего пока нет (но обязательно будет)», по А.Д. Толстому,- вот задача прогноза.

Роль оценки тяжести и прогнозирования ОП заключается: 1) в выявлении больных, требующих интенсивного лечения с момента поступления;

2) определении мероприятий, необходимых для купирования болезни;

3) возможности сравнения групп больных [30]. В настоящее время существует множество шкал интегральной оценки состояния больного, на основании изменений объективных показателей которых осуществляется выбор оптимальной тактики [3,5,8,13,30,61,72, 77]. Оценка тяжести и прогнозирования течения ОП, как правило, основана на создании прогностических систем, которые могут быть условно разделены на группы: шкалы, специально разработанные для ОП (Ranson, Imre, гонконгские критерии, Leese, Blamey, Balthazar и др.) и «неспецифические»

шкалы общереаниматологического профиля (APACHE 2, SAPS, MODS, SOFA) [53].

Первая прогностическая система для больных ОП была предложена в 1974г. Американским хирургом John H. Ranson, включающая 11 критериев, пять из которых (возраст, глюкоза крови, лейкоциты крови, сывороточная ЛДГ, сывороточная АсАТ) оцениваются при поступлении больного в стационар, а остальные шесть (уменьшение гематокрита, увеличение мочевины крови, сывороточный кальций, парциальное давление кислорода, дефицит оснований, секвестрация жидкости) – через 48 часов. Пациентов с ОП, у которых показатель шкалы Ranson менее 3, относят к группе с легким течением заболевания и низкой вероятностью развития летального исхода, обычно не превышающего 1%. При значениях шкалы от 3 до 5 летальность больных достигает 10-20%. С увеличением показателя шкалы до 6 и более летальность больных возрастает до 60% и более. По такому же принципу построены и другие оценочные системы, отличающиеся друг от друга используемыми клиническими и лабораторными критериями.

Необходимость градации пациентов с различными формами ОП по данным компьютерной томографии (КТ) привела к созданию таких инструментальных шкал, как Balthazar, согласно которой выделяют пять степеней тяжести ОП [13,53,72]: А) нормальная поджелудочная железа ( баллов);

В) локальное или диффузное увеличение ПЖ в сочетании с гиподенсивными включениями в ее ткани с нечеткими контурами, расширение панкреатического протока (1 балл);

С) изменения в ПЖ, аналогичные в стадии В, к которым присоединяются воспалительные изменения в парапанкреатической клетчатке (2 балла);

D) изменения С+ единичные жидкостные образования вне ПЖ (3 балла);

Е) изменения D+два или более жидкостных образования вне ПЖ или наличие абсцесса газообразование (4 балла). Позже авторы дополнили шкалу Balthazar данными об объеме панкреонекроза: меньше 1/3 объема ПЖ (2 балла);

меньше ПЖ (4 балла);

больше объема ПЖ 6 баллов). Полученные баллы суммируются в виде шкалы интегральной оценки распространенности и характера поражения при ОП, которая получила название CTSI (Computed Tomography Severity Index). При индексе тяжести 2-3 балла летальность составляет 3%, частота осложнений-8%;

4-6 баллов- 6 и 35% соответственно;

7-10 баллов- 17 и 92% соответственно.

Среди собственно панкреатических шкал, наряду с вышеперечисленными, заслуживает внимание способ прогнозирования течения острого деструктивно панкреатита, предложенный В.С. Савельевым (1981г). По данной методике выделены следующие прогностические критерии:

респираторный синдром, гемодинамический синдром, синдром динамической кишечной непроходимости, перитонеальный синдром, септический синдром.

Из лабораторных критериев максимальной разделительной способностью между группами больных обладали уровень глюкозы, парциальное давление кислорода, ЛДГ, дефицит ОЦК, эластаза, мочевина. Согласно данному способу прогнозирования выделены три группы больных в зависимости от тяжести течения ОП: 1-я- больные с относительно благоприятным течением ОП (положительны 1 клинический и 1-2 лабораторных прогностических критерия);

2-я-больные с высоким риском развития тяжелых осложнений (положительны 2 клинических и не менее 3 лабораторных прогностических критерия);

3-я- больные с высоким риском летального исхода (положительны как минимум 3 клинических и 4 лабораторных прогностических критерия).

[29,104,105,106] В работах А.Д. Толстого так же большое значение уделено проблеме прогнозирования панкреонекроза. Анализ большого клинического материала позволил авторам сконструировать собственную прогностическую систему, адаптированную к условиям современной отечественной медицины. Она представлена в виде двух списков признаков- основного и дополнительного.

К основным признакам относятся: 1) кожные симптомы (мраморность, цианоз, экхимозы на брюшной стенке);

2) геморрагический перитонеальный экссудат;

3)гипотония;

4)частота пульса более 120 или менее 70 в минуту;

5)олигоанурия;

6) гемолиз или фибринолиз в сыворотке крови. К дополнительным признакам относятся: 1) первый по счету приступ ОП;

2) госпитализация в сроки до 6 часов;

3)тревожный диагноз догоспитального этапа («острый живот», «перитонит», «острый инфаркт миокарда» и т.п.);

4) вторая половина беременности или недавние роды;

5) беспокойство и возбуждение;

лица;

выше ммоль/л;

6)гиперемия 7)гипергликемия лейкоцитоз выше 13 на 10/9 л;

билирубин крови выше 30 мкмоль/л (при отсутствии ЖКБ);

10) концентрация гемоглобина выше 140 г/л. Согласно представленной прогностической системе у пациентов с установленным диагнозом ОП имеется минимум 2 основных или 1 основной и дополнительных признака, то имеет место тяжелое течение заболевания. При меньшем числе признаков ОП носит среднетяжелое течение, а при их отсутствии ОП либо является легким, либо отсутствует [79, 126] Среди шкал общереаниматолоческого профиля, оценивающих тяжесть состояния больных и степень выраженности полиорганной недостаточности независимо от нозологии, наибольшее распространение наибольшее распространение получили APACHE 2 и SAPS. Шкала APACHE 2 состоит из 14 параметров и включает ректальную температуру, среднее АД, пульс, частоту дыхания, парциальное давление кислорода, рН артериальной крови, натрий, калий сыворотки крови, креатитинин, гематокрит, лейкоциты крови, шкалу Глазго, возраст больного. В настоящее время шкала APACHE признана золотым стандартом и широко используется для оценки качества, организации интенсивного лечения и аргументации выводов у больных с перитонитом, деструктивным панкреатитом, септическим шоком и при травмах. Она отражена более чем в 1500 статьях, освещающих опыт работы в клиниках многих стран [29,104,105]. Согласно полученных в сумме баллов, пациенты, у которых в течение 24-48 часов от начала заболевания показатель шкалы не превышает 8 баллов, обычно выживают. При показателях более балов наблюдается увеличение показателя летальности. При значении шкалы 11-15 летальность составила 16%. При значении шкалы 16-20 летальность составляет 33% [30].В Европе получила распространение упрощенная система оценки физиологических реакций SAPS (Simplified Acute Physiology Score) и новая упрощенная шкала острых физиологических реакций SAPS 2, включающая 15 клинических, лабораторных и анамнестических критериев, оцененных в баллах, позволяющая использовать ее в обычных лечебных учреждениях. При показателях 4 балла летальных исходов не отмечено;

баллов (тяжелое течение) летальный исход наблюдался у 19% больных;

при показателях 20 баллов-у 50%;

свыше 21 балла –у 81% больны ОП [30,72].

Подводя итог данному разделу главы, можно утверждать, что диагностика и прогнозирование острого панкреатита, как правило, строится на комбинации или интеграции целого ряда клинико-лабораторных, биохимических, иммунологических параметров и данных инструментальных методов исследования, объединенных в так называемые интегральные шкалы оценки и прогноза (Ranson, APACHE-2, SAPS, Blamey, Balthazar и др.). Но существующие прогностические системы, в целом, редко применяются в повседневной клинической практике, так как имеют ряд недостатков: оценка состояния пациента осуществима только соответствии лабораторно диагностических возможностей научного центра, разработавшего шкалу, и рядового стационара, который ее применяет. При этом чувствительность и специфичность лучших из них в идентификации тяжелого ОП ограничивается 80-85% [53]. По результатам проведенных исследований, ряд авторов [8] отмечают несовершенство существующих интегральных шкал в прогнозировании и течении острого панкреатита. Доказано, что прогностическая способность рекомендуемых для оценки тяжести остро панкреатита оценочных систем преимущественно направлена на определение риска развития летального исхода в ранние сроки заболевания. В то же время при их использовании трудно корректно предсказывать динамику течения патологического состояния [61]. В связи с этим, остается актуальной проблема определения дополнительных предикторов тяжелого течения ОП и повышенной вероятности летального исхода, доступных в работе большинству дежурных хирургических стационаров. Это особенно важно у больных, органные дисфункции у которых при поступлении не свидетельствовали о тяжелых нарушениях. В силу этого генотипирование больных ОП является перспективным направлением для определения течения и исхода данного заболевания.


ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений В исследуемую группу всего вошло 291 больных с ОП (в контрольную 196, в основную-95), являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. Все клинические исследования проводились с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после, связанной с заболеванием. Сбор данных проводился по специально разработанной нами анкете-опроснику, включающей клинические, лабораторные параметры, а так же данные, полученные при инструментальном обследовании и во время операций. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно инструментальных методов обследования. Клинико-лабораторное обследование больных проводилось на базе хирургических отделений №1, №2 Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, городских клинических больниц №1, №2 г. Белгорода;

хирургического отделения Шебекинской ЦРБ Белгородской области. Основанием для установления диагноза «острый панкреатит» при поступлении считали сочетание минимум двух из следующих выявленных признаков:

А) типичная клиническая картина (интенсивные боли опоясывающего характера, неукротимая рвота, вздутие живота, наличие ЖКБ в анамнезе и др.);

В) УЗИ (увеличение размеров, снижение эхогенности, нечеткость контуров поджелудочной железы;

наличие свободной жидкости в брюшной полости) С) Лабораторные показатели.

Тяжесть состояния пациентов при поступлении оценивалась по бальной шкале SAPS. В последующем для более детального изучения течения острого панкреатита пациенты контрольной группы были распределены в подгруппы (таблица №1) Распределение больных по тяжести заболевания контрольной группы Таблица Вид панкреатита Абс. Отн., % Легкий (отечный панкреатит) 98 Среднетяжелый (мелко- и 59 среднеочаговый панкреонекроз) Тяжелый (крупноочаговый и 39 тотально-субтотальный пакреонекроз) ВСЕГО: 196 В проведенном нами исследовании пациенты контрольной группы с отечным панкреатитом составили 98 (50%), с деструктивным панкреатитом в целом так же составили 98 (50%), к которым в свою очередь для более углубленного рассмотрения применили простейшее подразделение на среднетяжелую (мелко- и среднеочаговый панкреонекроз) и тяжелую (крупноочаговый и тотально-субтотальный панкреонекроз) форму [6, 79,80].

(данные таб.1).

Таблица Распределение больных по полу и возрасту в контрольной группе Возраст, Легкий панкреатит Среднетяжелый Тяжелый панкреатит лет панкреатит (ВОЗ, Муж. Жен. Муж. Жен. Муж. Жен.

1963) Абс. Отн., Абс. Отн. Абс. Отн, Абс. Отн, Абс. Отн. Абс. Отн.

% % % % % % До 44 32 52,5 7 18,9 19 46,3 5 27,8 14 56,0 2 14, 45-59 18 29,5 11 29,8 16 39,0 3 16,7 4 16,0 4 28, 60-74 10 16,4 12 32,4 4 9,8 7 38,9 6 24,0 4 28, 75-89 1 1,6 7 18,9 2 4,9 2 11,1 1 4,0 4 28, 90 и - - - - - - 1 5,5 - - - более ВСЕГО 61 100 37 100 41 100 18 100 25 100 14 :

Исходя из таб. 2, установлено, в рассматриваемой нами группе пациентов с ОП преобладали лица мужского пола -127 (64,8%), тогда как количество лиц женского пола составило 69 (35,2%). Распределение пациентов по возрастным категориям представленное в таб.2, показало, что среди мужчин во всех группах преобладали пациенты в возрасте до 44 лет и от 45 до 59 лет;

среди женщин большинство случаев заболевания отмечено у категории от 45 до 59 лет и 60-74 года. По этиологическому фактору пациенты острым панкреатитом были распределены на группы с билиарным и алкогольным панкреатитом, как наиболее часто встречающиеся формы:

Распределение больныхконтрольной группы по этиологическому фактору Таблица Легкий панкреатит Среднетяжелый Тяжелый панкреатит Вид панкреатита панкреатит Абс. Отн., % Абс. Отн., % Абс. Отн., % Алкогольный 65 66,3 41 69,5 30 76, Билиарный 33 33,7 18 30,5 9 23, ВСЕГО: 98 100 59 100 39 Из приведенной таблицы следует, что в исследуемой нами группе преобладали пациенты с алкогольным панкреатитом- 136 (69,4%), больные с билиарной формой составили 60 (30,6%).

Распределение больных контрольной группы по срокам от начала Таблица заболевания до поступления в стационар Легкий панкреатит Среднетяжелый Тяжелый панкреатит Сроки панкреатит поступления с Абс. Отн., % Абс. Отн., % Абс. Отн., % стационар До 24 часов 52 53,1 10 16,9 7 17, 24-72 часа 39 39,8 24 40,7 14 35, Более 72 часов 7 7,1 25 42,4 18 46, ВСЕГО: 98 100 59 100 39 Из даных, представленных в таб.4, прослеживается тенденция развития деструктивных форм ОП со сроками от начала заболевания до поступления в стационар и соответственно, от начало проведения терапии, что согласуется с данными современных публикаций [6, 25, 29, 63, 66, 79], но эти данные не являются достоверными.

В целом, при исследовании контрольной группы нами установлено, что этиологический фактор, пол, возраст, время госпитализации с момента заболевания существенного влияния на прогноз и течение острого панкреатита не имеют. Поэтому при дальнейшей работе в основной группе, состоящей из 95 больных острым панкреатитом, нами не рассматривались данные показатели. С учетом наибольшей актуальности для хирургического лечения больных деструктивными формами панкреатита, нами были изучены пациенты со среднетяжелым и тяжелым панкреатитом. Пациентам основной группы, параллельно с клиническим и лабораторно-инструментальным обследованием и предварительной оценкой тяжести ОП по шкале SAPS, в течение 12-24 часов с момента поступления в стационар, проводилось тестирование генетических вариантов ФНО, лимфотоксина, рецепторов ФНО 1 и 2 типа. В последующем после полученных результатов, при выявлении с неблагоприятных генетических маркеров было проведено окончательное перераспределение пациентов в группы со среднетяжелым и тяжелым течением ОП и незамедлительно проводилось лечение, согласно прогнозируемому течению.

2.2 Лабораторные и инструментальные методы исследования На этапе установления диагноза пациентам выполнялось клиническое обследование по общепринятым методикам;

исследования клеточного состава крови, гематокрит, общий анализ мочи. При биохимическом исследовании крови учитывалось содержание билирубина, глюкозы, электролитов плазмы;

альфа-амилазы крови, диастазы мочи, мочевины.

Полученные результаты клинико-лабораторных и инструментальных исследований, а так же данные, полученные во время оперативных вмешательств, отражались в разработанных анкетах с последующей обработкой материалов.

На этапе установления диагноза и в процессе лечения, с целью динамического наблюдения за изменениями в поджелудочной железе парапанкреатической и забрюшинной клетчатке, печени, желчного пузыря и желчных протоков, а так выявления жидкостных образований в брюшной полости, сальниковой сумке, забрюшинном пространстве и своевременного распознавания внутрибрюшных осложнений использовали ультразвуковое исследование на аппаратах «Logiq 400 CL» и «Logiq 9000» экспертного класса, фирмы «General Elektric» с универсальным конвексным датчиком с частотой генерируемых ультразвуковых колебаний 3,5-5 Мгц, и линейным мультичастотным биопсийным датчиком.

Спиральную компьютерную томографию проводили у (СКТ) пациентов с деструктивным панкреатитом на 2-х спиральном компьютерном томографе «Hi Speed» фирмы «General Elektric» с последующей оценкой полученных данных в системе Бальтазар.

С лечебно-диагностической целью, верификации инфицированного панкреонекроза, проводили исследование жидкости или тканевого материала, полученных при тонкоигольной аспирации под ультразвуковым наведением. Для пункции использовали эхотипированную иглу производства фирмы «МИТ» ОЭП МПИ, 19 G, длиной 20 см., с мандреном. Материал, полученный при тонкоигольной аспирации, направляли на бактериологическое, биохимическое и цитологическое исследования.

Для проведения эндоскопического осмотра пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК), а также для проведения сопряженных эндохирургических вмешательств на большом дуоденальном сосочке (БДС) и желчевыводящих протоках использовалась видеосистема, комплект которой состоял из гибкого эндоскопа, источника света, электрохирургического блока, аспиратора-ирригатора, и набора внутриканального инструментария. В качестве источника света использовался галогеновый осветитель фирмы «OLYMPUS»CLE-10. Для выполнения эндоскопических вмешательств мы использовали дуоденоскопы JF-1T-20, (Olympus® Corp.) с инструментальным каналом 4,2 мм, и в течении последних трех лет ED250XT5 (Fudginon), с торцевым расположением оптики. Для осмотра желудка и ДПК применялись эндоскопы со средним наружным диаметром 12 мм. Наличие широкого инструментального канала диаметром 4,2 мм позволяло проводить через него весь имеющийся арсенал инструментов и, не извлекая из канала инструмента, обеспечивать адекватную аспирацию дуоденального содержимого, контраста, дыма, а в случае возникновения осложнений, позволяло более эффективно с ними бороться.

Эндоскопическая папиллосфинктеротомия (ЭПСТ) выполнялась в зависимости от анатомических и технических особенностей различными видами папиллотомов. В частности мы использовали однопросветные папиллотомы KD-28Q 9, а также торцевые папиллотомы (needle-knife), рабочей частью которых является выдвигающаяся с торцевой части инструмента игла или струна KD-10QN и KD-11QN (Olympus® Corp.).

Для захватывания и извлечения конкрементов из желчевыводящих протоков использовался арсенал инструментов, состоящий из корзины Дормиа, баллонного дилятатора-экстрактора В-230Q с «Olympus»

раздувающейся дистальной манжетой, механического билиарного литотриптора «Olympus» BML-2(4)Q корзинного типа с жесткой наружной оплеткой и усиливающей вращающейся рукояткой. ЭПСТ производилась с помощью высокочастотного электрохирургического блока монополярной диатермокоагуляции Лапароскопические «OLYMPUS» UES-10.

вмешательства выполнялись с использованием видеолапароскопического комплекса "Karl Storz". При наличии хирургических показаний, больным с осложненным панкреонекрозом проводились традиционные вмешательства на поджелудочной железе, органах брюшной полости и забрюшинного пространства.

2.3. Молекулярно-генетические методы Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории "Молекулярной генетики человека" медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета (руководитель – профессор, д.м.н. М.И.Чурносов).

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8- мл, взятая из локтевой вены. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы. К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37 С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут.

После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола.

Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованной воде и хранили при -200С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе IQ производства компании Bio-Rad с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» (Таб. 5). Генотипирование Структура праймеров и ферменты рестрикции, используемые для Таблица генотипирования ДНК-маркеров методами ПЦР Полиморфизм и его Ген Структура праймеров Литература локализация в гене F: 5’-GAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAG-3’ -308G/A R: 5’-GGCCACTGACTGATTTGTGTGTAG-3’ TNF (Hulkkonen J., 2002) (промотор) 5’-FAM-CCGTCCTCATGCC- RTQ1-3’ 5’-ROX-CCGTCCCCATGCC - RTQ1-3’ F: 5’-CAG TCTCATTGTCTCTGTCACACATT-3’ +250A/G R: 5’-ACAGAGAGAGACAGG AAGGGAACA-3’ (Mirjam M. de Jong Lt (1 интрон) et al., 2003) 5’-FAM:CCATGGTTCCTCTC-RTQ1-3’ 5’-ROX:CTGCCATGATTCC-RTQ1-3’ F: 5’- AGCCCACTCTTCCCTTTGTC-3’ +36A/G (Soo Jin Chae et al., R: 5’-CCACCGTGCCTGACCTG-3’ TNFR (1 экзон) 2008) 5’- FAM: CTGCTGCCACTGGT-RTQ1 -3’ 5’- ROX: CTGCTGCCGCTGGT-BHQ2 -3’ F: 5’- TGACCTGCAGGCCAAGAG-3’ F: 5’- CCATGGCAGCAGAGGCTTT-3’ (Lynnette R. et al., TNFR2 +1663А/G 2009) 5’-FAM: CACAACCCGCTGCC - RTQ1--3’ 5’-ROX: CCACAACTCGCTGCC - BHQ2-3’ Полиморфизм гена фактора некроза опухоли (- 308 G/A TNF). Ген TNF расположен на шестой хромосоме (6p21.3) в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, B, C) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR).

Анализ полиморфизма гена TNF проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 5) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей.

Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин. при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при 52°С;

денатурация – 15 сек при 95°С.

При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленном на рисунке 3. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM –аллелю A.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси y) на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси y).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля A отложены по оси x).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец – отрицательный контроль).

Рис. 1. Дискриминация аллелей по локусу -308 G/A TNF (где - гомозиготы -308АА, - гомозиготы -308GG, - гетерозиготы -308GA).

Полиморфизм гена лимфотоксина (+250 A/G Lt ). Ген Lt локализуется на 6 хромосоме в регионе p21.33. Ген лимфотаксина имеет сходную с геном фактора некроза опухоли экзон-интронную структуру.

Степень аминокислотной гомологиии Lt и TNF составляет около 30%, причем области выраженной гомологии локализуются в консервативных участках молекулы.

Анализ полиморфизма гена Lt в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 4) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей.

Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин. при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при 50°С;

денатурация – 15 сек при 95°С.

При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленном на рисунке 4. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM –аллелю G.

Рис. 2. Дискриминация аллелей по локусу +250 A/G Lt (где - гомозиготы +250GG, - гомозиготы +250AA, - гетерозиготы +250AG).

Полиморфизм гена рецептора фактора некроза опухоли 1 типа (+36 A/G TNFR1). Ген TNFR1 расположен на хромосоме 12р13. Его продукт – рецептор фактора некроза опухоли 1 типа ответственен за острый воспалительный ответ и найден в большинстве типов клеток. Фактор некроза опухоли, соединяясь со своими рецепторами, образует димер, обусловливающий конформационные изменения этого рецепторного домена и инициацию определенного клеточного сигнала.

Анализ полиморфизма гена TNFR1 в области 1 экзона проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей.

Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при 62°С;

денатурация – 15 сек при 95°С.

При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленном на рисунке 5. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM –аллелю А.

Рис. 3. Дискриминация аллелей по локусу +36A/G TNFR1 (где - гомозиготы 36AA TNFR1, - гомозиготы 36GG TNFR1, - гетерозиготы 36AG TNFR1).

Полиморфизм гена рецептора фактора некроза опухоли 2 типа (+1663A/G TNFR2). Ген TNFR2 локализуется на 1 хромосоме в регионе p36.2.

Анализ полиморфизма гена +1663A/G TNFR2 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей.



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.