авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Южный федеральный

университет»

На правах рукописи

Празднова Евгения Валерьевна

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ

НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ СТРЕСС-ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОПЕРОНОВ

Специальность 03.01.04 – биохимия;

03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук Чистяков В.А.;

Доктор биологических наук, профессор Усатов А.В.

Ростов-на-Дону – СОДЕРЖАНИЕ ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 Современная концепция окислительного стресса 1.1 1.1.1 Свободнорадикальные процессы 1.1.2 Роль окислительного стресса в развитии воспалительных процессов и старения Антиоксиданты с потенциальным системным эффектом.

1.2 1.2.1 Каротиноиды 1.2.2 Экранированные фенолы 1.2.3 Липофильные катионы 1.2.4 Олигопептиды 1.2.5 Бактериальные пробиотические препараты МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2 Материалы исследования 2.1 2.1.1 Биосенсорные штаммы 2.1.2 Индукторы окислительного стресса 2.1.3 Потенциальные протекторы. 2.1.4 Экспериментальные животные Методы исследования 2.2 2.2.1 Энзимологические исследования и тесты in vitro. 2.2.2 Биолюминесцентный тест 2.2.3 Культивирование Deinococcus radiodurans 2.2.4 Определение концентрации каротиноидов Deinococcus radiodurans 2.2.5 Тест на антимутагенную активность. 2.2.6

Работа с экспериментальными животными Статистическая обработка данных и достоверность результатов 2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ 3 Изучение антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда 3. соединений в биолюминесцентном тесте 3.1.1 Определение эффективных нелетальных доз прооксидантов и оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров. 3.1.2 Сравнительный анализ результатов биохимического теста на активность каталазы и уровня экспресии Kat-оперона в клетках биосенсорного штамма E.coli MG 1655 (pKatG-lux) 3.1.3 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности контрольных соединений: тролокс, аскорбат, -токоферол 3.1.4 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности липофильных катионов 3.1.5 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности олигопептидов 3.1.6 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности бактериальных пробиотических препаратов Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности потенциальных 3. адаптогенов в биолюминесцентном тесте 3.2.1 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности экранированных фенолов 3.2.2 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности каротиноидов Deinococcus radiodurans Оптимизация параметров культивирования 3.3 Deinococcus radiodurans для экстракции каротиноидов. Изучение антимутагенной активности каротиноидов D.radiodurans.

3.4 Изучение влияния каротиноидов Deinococcus radiodurans на 3. динамику заживления ран у млекопитающих 3.5.1 Динамика уровня глюкозы в крови мышей при CD-I моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне перорального введения каротиноидов 3.5.2 Анализ данных планиметрических исследований влияния каротиноидов в модели механической раны на фоне сахарного диабета I типа 3.5.3 Анализ спонтанной и металл-катализируемой деструкции белков сыворотки крови мышей CD-I при моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне введения каротиноидов ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 4 ВЫВОДЫ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ Приложение 1 Приложение 2 ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода БСА – бычий сывороточный альбумин ГБО – гипербарическая оксигенация ГПО (GSH) – глутатионпероксидаза КОЕ – колониеобразующая единица ОМБ – окислительные модификации белков ПОЛ – перекисное окисление липидов СД – сахарный диабет СОД – супероксиддисмутаза СУА – супероксидустраняющая активность УФ – ультрафиолет SkQ1– 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний ВВЕДЕНИЕ В настоящее время в биологии широкое распространение приобретает концепция системного подхода, рассматривающая живой организм в качестве сложной системы прямых и обратных связей. Многие патологические явления при детальном исследовании демонстрируют свою «системность», являясь, по сути, результатом не столько активации либо инактивации отдельных молекулярных механизмов, сколько результатом дисбаланса в общеорганизменных процессах.

Одним из наиболее ярких примеров системного дисбаланса в живых организмах является окислительный стресс. Существует мнение, что за счет этого механизма (роста свободнорадикальных повреждений на молекулярном уровне, нарушения баланса в работе антиоксидантной системы организма, нарушения регуляции клеточного гомеостаза) реализуются такие явления, как феноптоз (Skulachev, 1997), старение и связанные с ним патологии (Зенков, 2001;

Хавинсон, 2003;

Дубинина, 2006;

Skulachev, 2007). Генерация АФК значительно усиливается также при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Поэтому логичным решением является поиск соединений, обладающих системным биологическим эффектом, среди синтетических и природных антиоксидантов – веществ, способных противостоять окислительному стрессу. При скрининге этих соединений необходимо рассматривать как биохимические, генетические аспекты их функционирования – как способность прямо или опосредованно инактивировать АФК (антиоксидантную активность), так и способность защищать генетический аппарат клетки от окислительных повреждений (антигенотоксическую, или ДНК-протекторную активность).

Первые шаги в этом направлении уже были предприняты российскими и зарубежными геронтологами при изучении адаптогенных свойств олигопептидов (Хавинсон, 2001), фуллеренов (Baati, 2012), соединений ряда SkQ (Skulachev, 2007;

2011;

2012). Адаптогенные и геропротекторные эффекты этих соединений могут быть частично или полностью основаны на их антиоксидантной активности.

Однако исследования in vivo на животных объектах достаточно трудоемки и требуют длительного времени. Очевидно, что для выявления потенциальных системных адаптогенов среди всего разнообразия антиоксидантов необходимы информативные, более простые модельные системы. В качестве таковых систем можно использовать бактериальные биосенсоры. Было сформулировано предположение о возможности прогнозирования адаптогенного эффекта у млекопитающих путем оценки способности соединений снижать окислительный стресс в ходе экспресс скрининга с применением системы LUX-биосенсоров (Чистяков и др., 2013).

Возможность подобной экстраполяции логически вытекает из общности антиоксидантных механизмов для всех живых организмов, поскольку поддержание редокс-статуса клетки является одной из первых эволюционных задач, решенных природой еще на уровне прокариот.

Согласно данным литературы, смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е. для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002;

Lin, 2003). В связи с этим были исследованы как отдельные вещества, так и комплексные смеси.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда соединений в экспресс-тестах с применением бактериальных и LUX-биосенсоров прогнозирование их антимутагенной и системной биологической активности на основе результатов тестов.

Были поставлены следующие задачи:

Провести сравнительный анализ чувствительности к индукторам 1) окислительного стресса энзимологических методов и метода, основанного на детекции уровня экспрессии оперонов, объединяющих стресс-промоторы, промоторы SOS-репарации и структурные гены люциферазного оперона.

Изучить способность ряда веществ с подтвержденной в опытах на 2) млекопитающих геропротекторной и адаптогенной активностью (SkQ1, олигопетиды) защищать клетки биосенсоров от повреждения индукторами окислительного стресса и генотоксинами.

Изучить антиоксидантную и антигенотоксическую активности 3) синтетических и природных соединений (экранированных фенолов, каротиноидов бактерии Deinococcus radiodurans) c целью отбора наиболее эффективного протектора для дальнейших испытаний на экспериментальных животных.

Оптимизировать условия культивирования D. radiodurans для 4) получения максимального содержания каротиноидов.

Изучить способность диоксидина индуцировать устойчивость к 5) рифампицину у Escherichia coli.

Изучить антимутагенную активность каротиноидов D. radiodurans 6) в модели индуцированного мутагенеза у E. coli.

Определить влияние каротиноидов, экстрагированных из D.

7) radiodurans, на динамику заживления ран у мышей линии CD-1 и уровень окислительных модификаций белков в сыворотке крови.

В работе были использованы следующие генноинженерные штаммы: E.

coli pPLS-1, E. coli pBA-5, E. coli MG1655 pRecA-lux, E. coli AB1157 pRecA-lux, E. coli MG1655 pSoxS-lux, E. coli MG1655 pKatG-lux, E. coli MG1655 pColD-lux, E.coliMG1655 pXen7 (штамм с конститутивным промотором).

На первом этапе работы были исследованы антиоксидантные свойства веществ, для которых уже установлена системная биологическая (адаптогенная и геропротекторная) активность. Была показана связь между антиоксидантной активностью химических соединений (пептидов, разработанных под руководством В.Х. Хавинсона, ионов Скулачева и ряда пробиотических препаратов) и их комплексов, и описанной в литературе адаптогенной активностью. На основании полученных данных был сделан вывод о возможности прогнозирования адаптогенного эффекта путем оценки способности соединений снижать окислительный стресс в простых модельных системах.

В ходе дальнейшей работы была произведена оценка антиоксидантной и антимутагенной активности ряда новых синтетических и природных антиоксидантов. Существуют данные, свидетельствующие о том, что смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е. для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002;

Lin, 2003). Поэтому в ряд исследованных веществ были включены такие комплексные смеси, как растительные экстракты.

Были получены данные по антиоксидантной активности изученных соединений и установлены механизмы этой активности – идентифицированы отдельные АФК, с которыми взаимодействуют те или иные антиоксиданты.

Полученные результаты позволили выделить группу перспективных соединений для испытания на животных моделях в качестве основы для препаратов системного действия. Для дальнейшего изучения по ряду параметров был выбран экстракт каротиноидов D. radiodurans. При испытании его на млекопитающих были получены результаты, свидетельствующие о его регенеративной активности, с высокой вероятностью обусловленной антиоксидантными свойствами.

Научная новизна С помощью системы бактериальных биосенсоров впервые изучена антиоксидантная, антигенотоксическая и антимутагенная активности каротиноидов D. radiodurans, ионола и соединений из ряда экранированных фенолов: 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромида и 3-бис(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида;

липофильного катиона с антиоксидантной нагрузкой (SkQ1), четырех олигопептидов (панкраген, пинеалон, везуген, АВ-А (изовилон)), ряда пробиотических препаратов бактериальной природы. Впервые продемонстрирована супероксидустраняющая активность (производного SkQ пластохинонилдецилтрифенилфосфония) в опытах in vivo. Показано, что соединения, для которых в литературе описана адаптогенная и/или геропротекторная активность, обладают и свойствами антиоксидантов и антигенотоксинов.

Впервые показана способность нелетальных для бактерий доз диоксидина вызывать значительное усиление частоты устойчивых к рифампицину мутантов у E. coli, а также способность природных каротиноидов снижать интенсивность этого эффекта.

Практическая значимость Экспериментально подтверждена возможность прогнозирования адаптогенной активности соединений на основании результатов экспресс тестов на антиоксидантную и ДНК-протекторную активности.

Показано, что каротиноиды D. radiodurans стимулируют заживление ран как при наружном, так и при сочетанном (наружном и пероральном) введении, и более эффективно повышает скорость регенерации кожных ран у мышей с со стрептозоциновым диабетом I типа, чем ликопин.

Подобраны оптимальные параметры культивирования D.radiodurans, позволяющие повысить прирост биомассы и содержание каротиноидов по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых фармакологических и косметических препаратов. Область применения – медицина, фармакология, косметология.

Материалы работы используются при чтении лекций на кафедрах генетики, биохимии и микробиологии Южного федерального университета в спецкурсах: «Свободные радикалы в биологических системах», «Современные проблемы генетики», «Мутагены окружающей среды».

Положения, выносимые на защиту Оценка уровня экспрессии плазмидного оперона в 1) KatG биолюминесцентном тесте является более чувствительным методом определения уровня перекиси водорода, чем стандартный энзимологический тест на активность каталазы.

Препарат, проявивший максимальный протекторный эффект в 2) экспресс-тестах, проявляет также антимутагенную активность и стимулирует заживление ран у экспериментальных животных.

Механизмы системной биологической активности ряда веществ 3) могут быть в значительной мере обусловлены их влиянием на антиоксидантный баланс и стабильность генетического аппарата клетки, поэтому возможно прогнозирование подобной активности на основании экспресс-тестов на антигенотоксическую и антиоксидантную активность веществ.

Апробация результатов Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: на XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 16-20 апреля 2011 г.

Новосибирск;

IV Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", Ростов-на Дону, 2011;

Международной конференции «Биология – наука XXI века», г.

Москва, 24 мая 2012 г;

Научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке», 2012, Ростов-на Дону;

Научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». г.Ростов-на-Дону 25-29 марта 2013;

V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2013 г.

Работа проводилась в течение 2010-2013 гг. в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» на базе лаборатории промышленных микроорганизмов и лаборатории экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, а также на кафедре генетики ЮФУ.

Автор выражает глубокую признательность за содействие в работе Скулачеву В.П., Арутюняну А.В., Манухову И.В., Демьяненко С.В., Сазыкиной М.А., Сазыкину И.С, Гутниковой Л.В, Кудеевской Е.М., а также всем соавторам публикаций.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИИ митоинженерии МГУ, Министерства науки и образования РФ и Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Автор как исполнитель участвовала в работе по грантам, поддержанным Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках проекта 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью клеточных биосенсоров».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Современная концепция окислительного стресса 1. Свободнорадикальные процессы 1.1. В живых системах существуют 2 основных типа использования кислорода клеткой (2 пути окисления): оксидазный и оксигеназный. В первом случае в результате последовательных реакций ферментативного дегидрирования углеводов и жиров и последующего транспорта электронов в митохондриях на конечном пункте этого транспорта – ферменте цитохромоксидазе – происходит 4-электронное восстановление кислорода с образованием воды. Таким образом в клетке синтезируется АТФ, а также вода и углекислота. Оксидазный путь не предусматривает включения кислорода в молекулу окисляемого субстрата.

Наряду с этим в клетках протекают реакции прямого присоединения кислорода к органическим веществам (оксигеназный путь). В оксигеназных реакциях полного 4-электронного восстановления кислорода не происходит, а наблюдается в основном неполное одноэлектронное его восстановление.

Появление неспаренного электрона в молекуле кислорода придает ей свойства свободного (активного) радикала.

Свободным радикалом называется молекула, имеющая один или несколько неспаренных электронов на внешней орбитали, что обуславливает наличие у нее дополнительной валентности и высокой реакционной способности (Владимиров и др., 1983).

Установлено, что большая часть кислородных радикалов в клетке образуется в ходе ферментативных оксигеназных реакций (Руководство по гипербарической оксигенации, 1986). К ферментам, участвующим в таких реакциях, относятся, например, различные НАДФ-оксидазы (Perner, 2003).

Основное(около 80%)количество супероксид-аниона образуется при потере электронов электронно-транспортными цепями митохондрий (Halliwell, 1981).

Таковая потеря имеет место при передаче электронов в комплексе НАД(Ф)Н кофермент Q-редуктаза и составляет обычно 1 – 4 % от общего потока электронов в цепи (Терешина, 2005).

В любом живом организме существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава и проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. Большинство АФК постоянно образуются в клетке в качестве продуктов нормального клеточного метаболизма–в частности, они используются в реакциях синтеза простагландинов и лейкотриенов, причем на это расходуется 1-2 % кислорода потребляемого организмом. Иммунная система млекопитающих использует АФК для борьбы с патогенами. Существует целый ряд примеров участия АФК в регуляции клеточных функций 1997). Кроме того, некоторые (Suzuki et al., микроорганизмы используют АФК в борьбе за выживание, выделяя в среду вещества, обладающие прооксидантными свойствами – виологены, феназины или хиноны, что приводит к подавлению роста конкурирующих организмов (Imlay, 2008).Однако внутриклеточный уровень содержания АФК в норме достаточно низок, и клетка либо инактивирует их с помощью антиоксидантной системы, либо восстанавливает нанесенные ими повреждения с помощью репарационных процессов (Кения и др., 1993).

Окислительным (оксидативным) стрессом называют явление, при котором наблюдается нарушение баланса между образованием активных форм кислорода (АФК), и работой клеточных антиоксидантных систем (Sies, 1991).

Окислительный стресс возникает, когда продукция АФК увеличивается вследствие активации АФК-продуцирующих систем, либо в результате снижения способности клетки к их нейтрализации, то есть, при нарушении работы антиоксидантной системы.

Активация процессов свободнорадикального окисления представляет собой однотипную общую системную ответную реакцию организма на действие разнообразных стрессоров, т.е. имеет неспецифический характер (Соколовский, 2008).

Уровень АФК, превышающий защитные возможности клетки, вызывает серьёзные клеточные нарушения, поскольку АФК способны вызывать повреждения важнейших биомолекул (ДНК, белков и липидов). Поврежденные макромолекулы либо подвергаются репарации, либо уничтожаются, однако темпы репарации при окислительном стрессе существенно отстают от темпов накопления повреждений, вследствие чего в организме накапливаются поврежденные молекулы (Grune et al., 1997;

Newcomb, Loeb, 1998). В зависимости от силы стресса клетки могут погибнуть в результате апоптоза, когда внутреннее содержимое клетки успевает деградировать до нетоксичных продуктов распада, или в результате некроза, когда сила оксидативного стресса слишком велика. При некрозе клеточная мембрана нарушается и содержимое клетки высвобождается в окружающую среду, что может в результате повредить окружающие клетки и ткани.

Источниками активных форм кислорода могут быть, помимо нормальных процессов аэробного метаболизма, экзогенные химические вещества, прямо или косвенно генерирующие АФК – так называемые прооксиданты – вещества и факторы, способные вызывать окислительный стресс и увеличивать продукцию АФК (Storz, Imlay, 1999;

Pomposiello, Demple, 2002).

К основным АФК относятся:

. супероксидный анион-радикал - О2 (супероксид-анион);

гидроксильный радикал - ОН.;

пергидроксильный радикал - НОО.

перекись водорода - Н2О2;

синглетный кислород – О2.;

Кроме указанных форм, достаточно активным радикалом является оксид азота NO.. Также можно выделить вторичные продукты, являющиеся маркерами окислительного стресса – алкоксильные (RO.) и пероксильные (ROO.) радикалы, гидроперекиси ROOH, липоперекиси LOOH, модифицированные азотистые основания в ДНК, радикалы антиоксидантов, гемопротеинов, аминокислот и т.п. (Хавинсон, 2003;

Меньщикова, 2006).

По классификации Владимирова (1998) выделяют три группы свободных радикалов:

первичные (образуются за счет реакций одноэлектронного 1) восстановления при участии металлов с переменной валентностью;

к ним относятся супероксид-анион, оксид азота, радикалы убихинона);

вторичные (возникают из радикал-образующих молекул;

к ним 2) относятся гидроксильный радикал и липидные радикалы);

третичные (образуются при действии вторичных на молекулы 3) антиоксидантов и других легко окисляемых соединений).

Первичные радикалы в норме выполняют ряд важных функций в организме, и проявляют негативные эффекты только при нарушении баланса их продукции, тогда как вторичные оказывают цитотоксическое действие;

третичные же занимают промежуточное положение (Владимиров, 1998).

Супероксид-анион, как уже было сказано выше, генерируется в ходе оксигеназных ферментативных реакций, а также митохондриями в результате «утечки» электронов из электронтранспортной цепи. Основные источники его образования — НАДФН-оксидаза, ксантиноксидаза, цитохром-с-оксидаза, монооксигеназы (Владимиров и др., 1991). В водных растворах супероксид анион слабо реактивен (Руководство по гипербарической оксигенации, 1986).

Супероксид-анион имеет заряд, вследствие чего плохо мигрирует через мембраны. Время его жизни в клетке составляет приблизительно 10-6 с. (Осипов и др., 1990). Супероксид-анион нередко является промежуточным продуктом внутриклеточных реакций, таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, либо продуктом метаболизма ксенобиотиков (Dimascio et al., 1997).

Его повреждающее действие на клетки и ткани реализуется через запуск реакций свободно-радикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах, нарушение структуры ДНК и РНК, и белков, окисление SH-групп белков (Nohl, 1981).

В присутствии ионов переходных металлов (медь и железо) супероксид анион взаимодействует с перекисью водорода с образованием гидроксил аниона:

Fe3+Fe2+ О2• + Н2О2 НО• (1) Гидроксил-анион - высокореактивное соединение, мишенью которого становятся биомолекулы: липиды, белки и нуклеиновые кислоты. Он достаточно быстро распадается, поэтому действует непосредственно в месте своего образования, т.е. там, где имеются ионы железа. Гидроксильный радикал в основном образуется:

в реакции Габера - Вейса 1) О2- + Н2О2 ОН-+ ОН-+ О2 (2);

в реакции Фентона, при участии металлов переменной 2) валентности H2O2 + Men+Me(n+1)+ + OH.+ OH- (3).

Гидроксильный радикал характеризуется весьма высоким редокс потенциалом, равным +2,7 В, что позволяет ему атаковать и окислять практически любое химическое соединение. Согласно ряду данных, он является важнейшим компонентом деструктивного действия ионизирующей радиации (Рябченко, 1979;

Комар, Хансон, 1980;

Тимофеев – Ресовский и др., 1980). Этим объясняется сходство в действии этого агента и гипербароксигенации на живые системы.

Основной мишенью для радикалов при их действии на клетку являются двойные связи самых различных биомолекул, при этом происходит насыщение двойной связи с образованием гидропероксида. Главными мишенями деструктивного действия гидроксил-аниона являются нуклеиновые кислоты и мембраны.

В липидном матриксе НО• взаимодействует с ненасыщенными жирными кислотами, что приводит к образованию липоперекисей LOOH. В первую очередь воздействию подвергаются двойные связи биомолекул. При этом происходит насыщение двойной связи с образованием перекиси водорода.

Аналогичным образом гидроксильные радикалы реагируют с нуклеиновыми кислотами и белками (Рябченко, 1979).

Одновременная генерация гидроксильных радикалов и NO также обеспечивает антимикробное и цитостатическое действие структурных элементов клеточного иммунитета – фагоцитов, гранулоцитов, моноцитов, Т лимфоцитов (Кулинский, 1999). При этом генерация OH. стимулированными фагоцитами существенно лимитируется наличием в среде ионов железа (Меньшикова и др., 1994).

При взаимодействии двух гидроксильных радикалов или в реакции дисмутации супероксидных анион-радикалов образуется пероксид водорода H2O2. Некоторое его количество может также возникать в ходе фотохимических реакций, таких как реакция дисмутации супероксид-анионов (Imlay, 2008):

СОД.-. O2 + O2 + 2Н+ H2O2 + O2. (4) Пероксид водорода не обладает зарядом, вследствие чего свободно проникает через мембраны (Sundqvist, 1991).. Показано, что он обладает токсическим и генотоксическим действием способен индуцировать однонитевые разрывы ДНК у бактерий и вызывать лизис эритроцитов человека (Anantaswamy, 1977), остановку роста и гибель клеток E. coli (Carlson, 1980).

Он является наиболее стабильным интермедиатом восстановления кислорода. Перекись водорода может образовываться во многих биологических реакциях, например, при действии оксидаз. В сравнительно больших количествах перекись водорода образуется в суспензии микросом (Boveris et al., 1972), хлоропластов под действием света (Halliwell, 1974), митохондрий (Boveris et al., 1972), гомогенатов многих тканей и т. д. Некоторые микроорганизмы, например, Streptococcus sanguis, выделяют перекись водорода в количествах, достаточных для подавления роста других микроорганизмов (Diquiseppi, Fridovich, 1982).

Помимо вышеописанной реакции дисмутации, источниками пероксида водорода в клетке могут служить ферментативные реакции с участием оксидаз, переносящих два электрона на молекулу кислорода (ксантиноксидаза, оксидазы L-аминокислот и ряд других) (Sohal et al., 1990).

Синглетный кислород – это молекулярный кислород, неспаренные электроны которого имеют противоположные спины. Это общее название для двух метастабильных состояний молекулярного кислорода с более высокой энергией, чем в основном, триплетном состоянии (Schweitzer, 2003).

Синглетный кислород генерируется в клетке в результате спонтанной дисмутации супероксид радикалов (уравнение 4) и в результате реакции Габера-Вейса (см.уравнение 2), и обладает выраженным мутагенным эффектом (Ефуни, 1986;

Decuyper-Debergh, 1986). Так, показано, что обработка синглетным кислородом однонитевой ДНК гибридного фага M13 mp19 ведет к 25 кратной индукции мутаций, во встроенном фаг LAC опероне (Decuyper Debergh et al., 1986).

Оксид азота – парамагнитный газ, молекулы которого имеют неспаренный электрон на внешней орбитали. Он хорошо растворим в воде, его молекулы легко перемещаются во внутриклеточных структурах путем диффузии. Среднее время существования его молекул в биологических средах составляет 5,6 с (Kikuchi et al., 1993). Образование оксида азота в клетке происходит при ферментативном 5-электронном окислении L-аргинина с образованием L-цитруллина и NO. Этот процесс осуществляют ферменты NO синтазы (Hevel et al., 1992).

Липоперекиси LOOH, образовавшиеся под действием гидроксил радикала, относительно устойчивы, и они мигрируют по организму, достигая мест, где содержатся ионы железа. Здесь они подвергаются одноэлектронному восстановлению и последующей оксидации с образованием пероксильных радикалов OLOO•, которые инициируют цепную реакцию своего собственного образования, т.е. происходит локальное лавинообразное нарастание количества липоперекисей. Весь этот процесс называют перекисным окислением липидов (ПОЛ).

Как и любую цепную реакцию, его можно подразделить на три фазы:

зарождение цепи;

развитие (разветвление) цепи;

обрыв цепи.

На первой стадии происходит атака АФК сопряженных двойных связей ненасыщенных жирных кислот, что приводит к появлению липидных радикалов R*:

RH + НО* H2O + R* (5) На второй стадии происходит их взаимодействие с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов, в результате чего образуется пероксильный радикал RO2 который, в свою очередь, взаимодействует с новыми молекулами ненасыщенных жирных кислот и приводит к появлению липидных пероксидов, которые достаточно стабильны при температуре тела:

R* + O2 RO2* (6) RO2* + RH ROOH + R* (7) При взаимодействии с комплексами железа гидроперекиси липидов превращаются в активные радикалы, продолжающие цепь окисления липидов:

ROOH + Fe2+ RO* + OH- + Fe3+ (8) Часть радикалов при этом рекомбинирует с образованием неактивных продуктов, что приводит к третьей стадии – обрыву цепи:

R*+ R* RR (9) RO2* + R* ROOR (10) Взаимодействие радикалов с антиоксидантами также приводит к терминации цепных реакций (Vladimirov, 1996;

Aruoma, 1998) Образующиеся липидные радикалы, а также 4-гидроксиноненаль и МДА, могут атаковать молекулы белков и нуклеиновых кислот. Альдегидные группы этих соединений образуют межмолекулярные сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизует их.

Идентифицируя липоперекиси или другие вторичные и конечные продукты ПОЛ, например, малоновый диальдегид (МДА), диеновые и триеновые конъюгаты, Шиффовы основания, в биоматериале, судят о наличии окислительного стресса, а по их количеству – о его интенсивности (Терешина, 2005).

Определенный уровень процессов ПОЛ существует в клетке и в норме – данные процессы играют важную роль в обновлении мембран. Однако, избыток продуктов ПОЛ вызывает и деструктивные эффекты.

Уровень АФК, превышающий защитные возможности клетки, вызывает серьёзные нарушения и может привести к гибели клетки.

Так, окисление липидов приводит к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя, что может вызвать повреждение мембрано-связанных белков (Richter et al., 1987). Например, ПОЛ может приводить к инактивации мембранных рецепторов, а также таких ферментов, как глюкозо-6-фосфатаза и Na/K-АТФаза, принимающая непосредственное участие в поддержании ионного гомеостаза клетки (Болдырев и др., 2001). В митохондриях могут повреждаться как ферменты матрикса, так и компоненты дыхательной цепи.

Поврежденные мембраны утрачивают энергетический потенциал, электровозбудимую функцию, контроль за ионными потоками и медиаторными системами, возникают патологические (воспалительные, нейродегенеративные, злокачественные) изменения в тканях, что, в конце концов, приводит организм к гибели.

В условиях окислительного стресса процессы нерегулируемой модификации белков достигают значительного уровня и приводят, в конечном счете, к утрате их биологической активности – ферментативной, транспортной, рецепторной и др. функций. Это в свою очередь, приводит к последующему повреждению других биомолекул, например ферментов антиоксидантной защиты и репарации. При этом в результате изменения структуры белков могут возникать новые антигены, что провоцирует иммунный ответ (Aruoma, 1989).

Не подвергается сомнению также деструктивное действие АФК на молекулу ДНК.

Одним из самых очевидных результатов такого действия являются хромосомные аберрации - нарушения структуры хромосом (Дурнев, 1999).

Молекула ДНК может повреждаться напрямую, в основном - гидроксид радикалом и (в меньшей степени) супероксид-анионом кислорода. Гидроксид радикал ОН* может действовать на пуриновые и пиримидиновые основания, а также на остатки рибозы и дезоксирибозы. Из основных компонентов ДНК наиболее чувствительны к воздействию АФК тимин и цитозин, затем аденин, гуанин и остаток деоксирибозы.

Супероксид-анион обладает избирательным действием, взаимодействуя с гуаниновыми основаниями, в результате чего образуются их разнообразные окисленные производные, в том числе и конечный продукт окисления гуаниновых оснований, 7,8-дигидро-8-гидроксигуанозин.

Показано, что действие гидроксильного радикала (•OH), генерируемого в ходе реакции Фентона, нарушает структуру суперспирализованной плазмидной ДНК с образованием трёх форм: суперспирали, открытой кольцевой, и линейной ДНК (Tian et al., 2007).

Как было показано в ряде экспериментов, митохондриальная ДНК подвержена воздействию АФК в большей степени, чем ядерная, т.к.

митохондрия является основным источником свободных радикалов и производных кислорода и плохо обеспечена механизмами репарации ДНК, к тому же, митохондриальная ДНК не защищена гистонами (Finkel, 2000;

Barja, 2000).

Необходимо также отметить, что чувствительность ДНК к окислительному повреждению зависит от того, входит ли ДНК в комплекс или является индивидуальной молекулой. Двойная спираль ДНК более устойчива к окислению, чем изолированная ДНК (Dizdaroglu, 1985).

АФК способны повреждать ДНК не только за счет непосредственного взаимодействия, но и за счет генотоксичных продуктов перекисного окисления липидов и белков, реагирующих с ДНК, вызывая мутации и апоптоз (Ames, 1995). Образующийся в результате процессов 1989;

Rodriguezetal., окислительного стресса МДА способен образовывать аддукты с гуанином, аденином и цитозином, и показано, что МДА-ДНК-аддукты могут быть причиной транзиций и трансверсий у E. сoli (Dedon et al., 1998). Кроме того, известно, что избыточная генерация АФК и накопление продуктов ПОЛ могут не только вызывать мутации, но усиливать эффект других мутагенов, в частности, химических (Blohkina et al., 2003;

Guetens et al., 2002).

Повреждение ДНК при окислительном стрессе происходит также в результате действия эндонуклеаз, которые активируются при повышении концентрации внутриклеточного Ca2+, наблюдаемом в ходе окислительного стресса (Cadenas, 2000).

Роль окислительного стресса в развитии воспалительных, 1.1. патологических процессов и старения У человека оксидативный стресс является причиной или важной составляющей многих серьёзных заболеваний, а также является одной из составляющих процесса старения. Было показано, что генерация АФК значительно усиливается в условиях патологии, при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Окислительный стресс развивается, в частности, и при воспалении, сопровождающем заболевания ЖКТ. Кроме того, в условиях окислительного стресса на образование АФК может расходоваться до 20-30 % кислорода, поступающего в клетки, что само по себе усугубляет кислородное голодание тканей.

Установлено, что более 200 различных патологий и многие экстремальные состояния протекают на фоне повышенной генерации свободных радикалов.

К настоящему времени накопились доказательства того, что окислительное повреждение ДНК является неспецифическим побочным эффектом воспаления, в том числе и вызванного аллергическими процессами.

Эндогенные факторы, повреждающие ДНК, наиболее интенсивно вырабатываются при развитии патологических процессов, особенно хронического воспаления, которое имеет место при аллергических заболеваниях (Новик, 2009). В результате развиваются злокачественные заболевания, диабет, патологии органов зрения, ослабевает способность к регенерации (Khansari, 2009;

Sirisinha, 2011).

Одной из актуальных проблем современной медицины является лечение раневых процессов, которые независимо от этиологии характеризуются наличием болевого синдрома, патогенной микрофлоры, гнойного экссудата, избыточной гидратации и т.д. (Кузин, 1990). Раневой процесс, как и любое патологическое состояние, сопровождающееся повреждением ткани, приводит к активации свободно-радикальных процессов. Активация нейтрофилов и тканевых макрофагов способствует накоплению в области раны АФК, что, с одной стороны, приводит к поражению клеточных мембран патогенных микроорганизмов, а с другой вызывает развитие эндотоксикоза. В раневой области система антиоксидантной защиты нарушается, что может привести к повреждению клеток, не только в зоне раневого дефекта, но и в перифокальной области, что в свою очередь задерживает протекание раневого процесса (Menke, 2007;

James, 2003). Одной из неизбежных сторон этого процесса является повреждение ДНК. Феномены усиления окислительного повреждения ДНК при воспалительных процессах описаны многими исследователями. Так, было обнаружено девятикратное превышение уровня окисленных оснований ДНК в опухоли по сравнению с окружающими нормальными тканями (Malins, 1991). Позже появились сообщения об аналогичных эффектах для печени, пораженной гепатитом и циррозом (Shimoda, 1994), печени трансгенных мышей, трансформированных геном одного из белков вируса гепатита В, тканей желудка у больного желудочной инфекцией, вызванной Helicobacter pylori и т.д. (Farinati, 1998). Трехкратное увеличение содержания окисленных оснований в ДНК печени отмечено для больных болезнью Вильсона, у которых гипернакопление меди ведет к развитию окислительного стресса. Содержание вышеназванных аддуктов проявляет обратную корреляцию с концентрацией антиоксидантов.

При заболеваниях, сопровождающихся таким клиническим симптомом, как гипергликемия (при сахарном диабете), окислительный стресс играет значительную роль в развитии заболевания. Гипергликемия способствует возникновению окислительного стресса многочисленными путями: дисбаланс окислительно-восстановительного потенциала клеток, опосредованный повышением активности редуктазы альдозы (Yagihashi et al., 2001) повышение уровня продуктов гликозилирования (Brownlee, 1988), изменение активности протеинкиназы С (PKC), особенно -изоформ (Cameron, 1999), дисбаланс простагландинов (Pop-Busui, 2002;

Kellogg, 2005) и повышение синтеза перекиси водорода митохондриями (Nishikawa, 2000;

Brownlee, 2003).

Пероксид водорода ослабляет инсулиновый сигналинг (Rudich, 1997) и снижает транспорт глюкозы (Rudich, 1998), что может являться одной из причин возникновения инсулин-резистентности. В свою очередь, инсулин поддерживает продукцию пероксида в липоцитах (Krieger-Brauer, 1992).

Окислительный стресс на фоне гипергликемии приводит к микроваскуляторной дисфункции. Сосудистая недостаточность вызывает ишемизацию раны, что в свою очередь, способствует накоплению и активации нейтрофилов и др. клеток воспаления, синтезирующих АФК (Moseley, 2004).

Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что генерация АФК является следствием гипергликемии. Наблюдается положительная корреляция между уровнем окислительного стресса метаболическим синдромом, ожирением и инсулин-резистентностью (Vincent, 2004;

Keaney, 2003). Известно, что клетки сосудов и особенно клетки эндотелия – основные источники АФК при гликемии даже в случае умеренного повышения уровня глюкозы (Rosen, 2001;

Pagano, 1995;

Bouloumie, 1997;

Suzuki, 1995).

Таким образом, очевидно, что рост генерации АФК является одним из ведущих факторов в возникновении и развитии диабета и его осложнений (катаракта, нефропатия, невропатия и др.).

Основным источником экзогенных АФК при воспалении в ранах является NADPH-оксидаза фагоцитов (Babior, 2004). В тканях раневой области происходит активное образование АФК, которые выполняют как бактерицидную, так и регуляторную функцию (Ojha, 2008). Концентрация пероксида водорода в раневом экссудате на фазе воспаления достигает сотен микромолей на 1 л и затем постепенно снижается.

В фазе регенерации АФК в низких концентрациях стимулируют новообразование грануляционной ткани и ангиогенез. При хроническом воспалении снижения АФК в ранах не происходит, что является одной из основных причин нарушения процесса ранозаживления у больных диабетом, атеросклерозом, а также у пожилых людей. Возникающие в результате различных патологий длительно незаживающие или хронические раны остаются одной из существенных медицинских проблем. Антиоксиданты в ряде случаев (в частности, при диабете) способствуют заживлению таких ран (Sen, что однозначно указывает на важную роль АФК в данном 2010), патологическом процессе.

Роль АФК в процессе старения была отмечена еще в 60-е гг. ХХ века, когда была сформулирована свободнорадикальная теория старения (Harman, 1956). Механизм старения и широкий спектр связанных с ним патологических процессов - сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессия и дисфункция мозга, катаракта, рак и др. - объясняются в рамках этой теории накоплением окислительные повреждений макромолекул. Теория получила косвенные подтверждения в дальнейших исследованиях – так, с ней вполне согласуется тот факт, что, согласно ряду данных, видовая продолжительность жизни прямо коррелирует с активностью антиоксидантных ферментов и содержанием в сыворотке крови неферментативных антиоксидантов после воздействия факторов, вызывающих окислительное повреждение ДНК (пируват, перекись водорода, трет-бутилгидропироксид, арсенит Na и др.) (Анисимов,2000).

Существует также теория, объясняющая старение усилением гликирования (Monnier, 1981). Комплекс реакций гликирования, известный как "реакция Майяра", начинается с образования соединений глюкозы с аминогруппами аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот. Когда было обнаружено, что многие продукты этой реакции генерируют активные формы кислорода, возникло закономерное заключение, что генерация АФК и гликирование – лишь отдельные элементы единой многокомпонентной биохимической сети (Kristal, 1992, Воейков, 2002).

Антиоксиданты с потенциальным системным эффектом 1. В процессе эволюции аэробные организмы, обитающие в кислородной среде, были вынуждены сформировать многоуровневую систему контроля интенсивности процессов, сопровождающих окислительный стресс, и их поддержания на физиологически приемлемом уровне – систему антиоксидантов.

Согласно распространенному в настоящее время определению, антиоксиданты – это вещество, которое, присутствуя в относительно низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, способно существенно подавить или замедлить его окисление (Меньщикова, 2006).

Существует множество подходов к классификации антиоксидантов. В рамках данной работы и сообразно с ее целями, имеет смысл придерживаться тех подходов, что опираются в первую очередь на функциональную активность рассматриваемых соединений, например, подразделение на антиоксиданты прямого и опосредованного действия.

В клетке существует сложная антиоксидантная система, обеспечивающая ингибирование реакций окислительного стресса. В ее состав входят следующие основные компоненты:

низкомолекулярные антиоксиданты;

система антиоксидантных ферментов;

«ловушки» АФК (в электронно-транспортной цепи митохондрий).

Низкомолекулярные (неферментативные) антиоксиданты – это вещества, способные обрывать или замедлять свободнорадикальную цепную реакцию. К низкомолекулярным антиоксидантам относят: витамины групп E, A,B,K и P;

стероидные гормоны;

восстановленные формы аминокислот, содержащих SH– группы (глутатион, цистеин, цистамин);

аскорбиновую кислоту, убихиноны, мочевину, мочевую кислоту, каротиноиды, спирты, альбумин и т.д.

(Меньщикова и др., 2006).

Наиболее активным биоантиоксидантом является -токоферол (Кулинский, 1999, Болдырев, 2001).

Данные соединения проявляют способность реагировать с перекисными радикалами липидов, инактивируя их. Существуют и непрямые механизмы действия низкомолекулярных антиоксидантов – так, например, -токоферол, кроме того, способен увеличивать плотность упаковки фосфолипидов в мембранах, что повышает их устойчивость к окислению (Руководство по гипербарической оксигенации, 1986).

В соответствии с механизмом действия можно выделить следующие группы неферментативных антиоксидантов:

Фенольные соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами :

токоферол, витамин К, каротины, убихиноны, триптофан, фенилаланин, билирубин (Wagner et al., 2004);

Соединения содержащие OH-группу, например, аскорбиновая кислота (Меньщикова и др., 2006);

Соединения, содержащие SH-группу: цистеин, метионин, цистин и глутатион (Van der Meide et al., 1993).

Для ферментативных антиоксидантов характерна более узкая специфичность действия.

В системе антиоксидантных ферментов выделяют три линии защиты:

1) супероксиддисмутаза, 2) селеновая глутатионпероксидаза (ГПО) и каталаза, 3) глутатионтрансферазы и фосфолипидгидропероксид-ГПО.

Супероксиддисмутаза - фермент, восстанавливающий супероксид (см.уравнение 4). Имеет 4 изоформы с различным строением активного центра и клеточной локализацией: медь-цинковая (Cu/Zn-СОД;

СОД-1), которая локализована в цитоплазме эукариот;

марганцевая (Mn-СОД, СОД-2), найдена у прокариот и в митохондриях эукариот;

экстрацеллюлярная, или внеклеточная (Э-СОД, СОД-3) (Меньщикова, 2006). Fe-СОД и Ni-СОД – относительно примитивные формы, встречаются у некоторых бактерий (Карапетян, 1996).

Каталаза – фермент, восстанавливающий перекись:

каталаза 2Н2О2 2Н2О + О2 (11);

Это гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250 кДа, являющийся тетрамером. Кроме каталазной активности, при низких концентрациях пероксида водорода фермент может проявлять пероксидазную активность (Фридович, 1979).

Глутатионпероксидаза (ГПО, GSH) инактивирует пероксид водорода и органические гидропероксиды свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и белков (ROOH):

2 Н2О2+ 2GSH 2Н2О + GSSG (12) ROOH + 2GSHROH + H2O + GSSG (13) Глутатионтрансферазы восстанавливают только ROOH, но важно, что один из изоферментов находится прямо в хроматине и восстанавливает радикалы ROOH ДНК в ядре. Фосфолипидгидропероксид-ГПО восстанавливает ROOH жирных кислот в составе фосфолипидов. Вспомогательным ферментом является глутатионредуктаза, регенерирующая GSH из GSSG путем НАДФН зависимого восстановления:

GSSG + НАДФН + Н+2GSH + НАДФ (14).

Это уменьшает или даже предупреждает прогрессирование ПОЛ и повреждений нуклеиновых кислот и белков. Однако необходимо обезвреживание вторичных метаболитов окислительного стресса – это четвертая линия защиты. Ее обеспечивают глутатионтрансферазы, формальдегиддегидрогеназа и глиоксалаза, использующие GSH в качестве кофермента, альдегиддегидрогеназа (окисляет малоновый диальдегид), хинонредуктаза, эпоксидгидролаза (Кулинский, 1990;

1993;

1999).

«Ловушками» АФК, встроенными в электронно-транспортную цепь митохондрий, могут быть некоторые низкомолекулярные антиоксиданты, такие как аскорбат и тиолы (Руководство по гипербарической оксигенации, 1986).

Поддержание баланса между про- и антиоксидантами в клетке находится под гененетическим контролем. Воздействия, приводящие к усилению наработки супероксид-аниона и пероксида водорода, индуцируют синтез ферментативных антиоксидантов, которые являются ингибиторами для факторов транскрипции, поэтому при увеличении их количества синтез протекторных белков прекращается. То есть, синтез ферментов продолжается лишь до тех пор, пока не будет достигнут уровень, необходимый для «сигнального» окислительного повреждения (Zhang et al., 1991;

Sazontova et al., 2002).

1.2.1 Каротиноиды Впервые каротин был выделен в 1831 году Вакенродером из желтой репы и моркови. В настоящее время из натуральных продуктов выделено и охарактеризовано более 600 различных каротиноидов: 50 из них входят в состав диеты человека (Krinsky, 1993;

Crews, 2001), около 12 найдены в измеримых концентрациях в крови и тканях человека (Stahl, 1996).Среди них наиболее значимыми и часто встречающими являются ликопин, лютеин, криптоксантин, зеаксантин, -, - и -каротин. Каротиноиды относятся к группе жирорастворимых растительных пигментов, которые придают характерную окраску (желтый, оранжевый, красный цвет) овощам и фруктам, они синтезируются растениями, морскими водорослями, грибами и некоторыми микроорганизмами.

Организм человека не способен синтезировать каротиноиды denovo.

Основными источниками каротиноидов для человека являются овощи и фрукты. Кроме того, каротиноиды в меньших количествах могут присутствовать в яйцах в мясе животных обычно питающихся растениями.

Обширная группа каротиноидов по современной классификации подразделяется на 2 подкласса: каротины и ксантофиллы. Первые содержат исключительно углерод и водород (соединения с 40 углеродными атомами в молекуле и соединения с числом атомов углерода в молекуле меньшим 40), наиболее известные из них: каротин, его изомеры, ликопин.

В состав ксантофиллов входят также атомы кислорода (спирты, кетоны, альдегиды, окиси, простые и сложные эфиры). Кроме того, обнаружено еще несколько специфических каротиноидов, выделенных из органов животных.


Число углеродных атомов в их молекуле достигает 80 (афаницин). Все молекулы каротиноидов имеют в своей структуре полиеновую цепь с чередующимися двойными связями. В такой цепи (так же, как в бензольном кольце) наблюдается обобщение -электронов, что определяет оптические (поглощение в видимой области спектра) и антиоксидантные свойства данных соединений. Молекулы каротиноидов построены по аналогичному с каротином структурному принципу - циклы или псевдоциклы соединены алифатической группировкой из изопреновых остатков (Бриттон, 1986).

Некоторые растительные продукты накапливают в себе, наряду с каротином, преимущественные количества какого-либо или нескольких каротиноидов. В частности, ликопин является основным красным пигментом томатов, кожуры красного винограда, розовых грейпфрутов, мякоти арбуза и др. Томаты и продукты из томатов являются основным источником поступления ликопина для жителей европейских стран (среднее содержание в плазме крови – 0,5 мкмоль/л (Stahl, 1996). По своей структуре он отличается от каротина наличием на концах молекулы не иононовых циклов, а псевдоиононов. Хотя ликопин и принято относить к каротиноидам, но он фактически является алифатическим изомером каротина, так же как и последний, углеводородом с эмпирической формулой С40Н56.

Ксантофиллы образуют отдельную группу каротиноидов, составляющих ряд ненасыщенных спиртовых производных каротина. Из ксантофиллов наиболее близок к каротину -криптоксантин (пигмент кукурузы), имеющий эмпирическую формулу С40Н56О – желтый пигмент, часто используемый для подкрашивания животных масел;

содержится в плодах манго, апельсинов, персиков, папайи, а также кабачках и мускатной дыне.

Другой представитель подгруппы ксантофиллов с эмпирической формулой С40Н56О рубиксантин. У него имеется также один гидроксилированный атом иононовый цикл, второй же раскрытый (псевдоионон): Каротиноид-ксантофилл с двумя гидроксилированными иононовыми циклами и эмпирической формулой С 40Н56О2 (пигмент яичного желтка) носит название зеаксантин. Изомером зеаксантина является ксантофилл желтых листьев (лютеин). Зерновые культуры (пшеница, кукуруза), овощи (капуста), а также специи (перец, горчица) служат источником поступления лютеина и зеаксантина.

Далее в списке каротиноидов подгруппы ксантофиллов следует флавоксантин (пигмент лютика) с эмпирической формулой С 40Н56О3, два изомера - виолаксантин (пигмент анютиных глазок) и тараксантин (пигмент одуванчика) с эмпирической формулой С 40Н56О4. Строение этих оксипроизводных каротина еще недостаточно выяснено.

К ксантофиллам относится также фукоксантин (пигмент бурых водорослей) с эмпирической формулой С40Н60О6. Капсантин С40Н58О3 - главный пигмент кожицы плодов паприки - подобно криптоксантину имеет в своей молекуле один гидроксилированный иононовый цикл. На другом же конце молекулы капсантина - псевдоцикл. Следующая подгруппа каротиноидов принадлежит к оксосоединениям.

Из них наиболее изучен родоксантин С 40Н50О2. В свое время родоксантин считался единственным кетопроизводным каротина. Однако теперь известны также афанин С40Н54О, являющийся монокетопроизводным каротина и миксоксантин С40Н54О - аналогичное производное каротина. К монокетонам относится также, и каротиноид животного происхождения эхиненон С40Н58О + Н2. Из каротиноидов с числом углеродных атомов, меньшим 40, наиболее известны кроцетин и биксин (карбоновые кислоты) и азафрин (оксикислота).

Кроцетин С20Н24О4 является желтым пигментом шафрана. В нем четыре кислородных атома находятся в двух карбоксильных группах. Популярный краситель для пищевых жиров биксин С 24Н30О - красный пигмент семян Bixa orellana - представляет собой метиловый эфир дикарбоновой кислоты норбиксина С24Н28О4(Бриттон, 1986).

Другой краситель для жиров - азафрин С27Н38О4, получаемый из тропических растений видов является оксикислотой.

Scrophulariacea, Представители этой группы каротиноидов гораздо реже встречаются в природе и накапливаются только в растениях. Среди них не найдено углеводородов.

Предшественником каротиноидов в растениях является фитоен, который образуется в результате соединения с помощью фитоенсинтазы двух молекул геранилпирофосфата. В дальнейшем концевые участки каротиноидов, как правило, замыкаются, что обусловливает разнообразие данных соединений и создает определенные трудности их номенклатуризации.

Так, один конец молекулы фукоксантина (бурый пигмент диатомовых водорослей) содержит эпоксид, другой конец несет редко встречающуюся в природе структуру – аллен. К образованию - или -каротина приводит замыкание концов молекулы ликопина с помощью фермента ликопинциклазы, что сопровождается потерей того или иного атома водорода, причем в процессе этих реакций возможно гидроксилирование, метилирование и другие модификации молекул (Бриттон, 1986).

Функции каротиноидов многообразны. В клетках микроорганизмов и растений каротиноиды участвуют в фотосинтезе и процессах, связанных с поглощением света (фототаксис, фототропизм и др.). В качестве вспомогательных фотосинтетических пигментов каротиноиды поглощают кванты света в коротковолновой области спектра, которые затем передаются на хлорофилл. У цианобактерий энергия света, поглощенная каротиноидами, поступает в основном в фотосистему I. Особенно возрастает значение каротиноидов как светоулавливающих систем в сине-фиолетовой и синей частях спектра в затененных местах, когда преобладает рассеянная радиация.

Эффективность передачи энергии для разных каротиноидов колеблется от 30 до 90% (Ладыгин, 2006).

При экспериментальном нарушении образования каротиноидов, а также у дефектных по каротиноидам мутантов кукурузы и подсолнечника наблюдается быстрое фотоокисление хлорофилла. Кроме того, высказывается предположение о прямом участии каротиноидов в расщеплении воды и кислородном обмене при фотосинтезе.

В верхушках побегов растений каротиноиды обеспечивают определение направления света и их ориентацию к световому потоку за счет фототропизма.

В организме млекопитающих каротиноиды выполняют ряд важнейших функций: предотвращают нестабильность хромосом;

тормозят избыточное деление клеток;

подавляют работу онкогенов;

регулируют генетические программы уничтожения опухолевых клеток;

активируют ферменты, разрушающие вредные вещества;

тормозят воспалительные реакции;

поддерживают функцию зрения.

Часто они действуют как фотопротекторы и антиоксиданты, на молекулярном и клеточном уровне предотвращают трансформации, индуцированные окислителями, генотоксическими веществами, рентгеновским и УФ-излучением. Увеличивают иммунокомпетентность и контактное взаимодействие клеток, участвуют в регуляции экспрессии гена коннексина- (Zhang, 1992). Способствуют экономному расходованию антиоксидантных витаминов и ферментов, проявляют антистрессорные свойства (Dogukan, 2011).

Помимо антиоксидантных свойств каротиноиды участвуют в межклеточной передаче сигналов и экспрессии генов (Sies, 2005). Исследование клеточных культур показало, что каротиноиды участвуют в пролиферации клеток, связанной с прогрессией клеточного цикла, а также в регуляции системы, связанной с инсулиноподобным фактором роста или эффектами на «щелевидные соединения» атриовентрикулярной межклеточной коммуникации (GJIC) (Bertram, 2004;

Sharoni, 2004).

Ряд исследований свидетельствуют о положительном действие перорального введения каротиноидов в моделях сахарного диабета у животных и больных СД. Показана способность астаксантина снижать кровяное давление у крыс, получавших высокие концентрации сахарозы, не внося каких-либо изменений в систему глюкоза-инсулин (Preuss, 2011).

Обладая антиоксидантными свойствами, каротиноиды предотвращают окислительное повреждение белков и структуры ДНК, тем самым внося вклад в резистентность клеток к окислительному стрессу.

Развитие ассоциированной с пигментами радиорезистентности бактерии Deinococcus radiodurans связывают, в основном, с каротиноидами и, в частности, со специфическим для этих бактерий каротиноидом деиноксантином (Лысенко и др., 2010). Известно, что D. radiodurans в 30 раз более устойчив к действию ионизирующей радиации, чем E. coli и в 1000 раз более устойчив, чем человек (Battista, 1997).

Впервые деиноксантин был получен и идентифицирован Lemee с соавт.

(1997), предложившими следующую его структуру;

(5R)-5-hydroxy-3-[(1E, 3E, 5E, 7E, 9E, 11E, 13E, 15E, 17E, 19E, 21E)-24-hydroxy-3, 7, 12, 16, 20, 24 hexamethylpentacosa-1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21-undecaenyl]-2,4,4 trimethylcyclohex-2-en-1-one (формула 1):

(1) Предполагается, что механизм его действия опосредован электрон акцепторными свойствами каротиноидов. Данная биохимическая особенность каротиноидов делает их эффективными перехватчиками свободных радикалов кислорода, защищающими ДНК от окислительного повреждения, белки от карбонилирования, мембраны от перекисного окисления липидов. Наличие обобщенной системы -электронов в молекулах каротиноидов и связанное с этим низкие значения электронно-возбужденных состояний молекул, служит причиной того, что данные соединения могут легко окисляться и восстанавливаться с образованием радикалов. Показано, что каротиноиды – природные антиоксиданты, действующие в отношении синглетного кислорада, алкоксильных и перекисных радикалов (Yu, 2005;

Young, 2001;

Palozza, 1992), и пероксинитрита (Kikugawa, 1997). Эффективность NO-радикалов ингибирования О2 каротиноидами возрастает с увеличением количества сопряженных двойных С-С связей, а также в зависимости от наличия эпоксидной, карбонильной или гидроксильной групп (Tian, 2009).

Особенности химического строения деиноксантина (наличие и относительная стабильность кетогруппы в С-4' положении, дополнительная двойная связь в С-3',4' положении) обусловливает его высокую антиоксидантную активность. Наличие гидроксильной группы в С-1' положении может способствовать увеличению Н2О2–нейтрализующей активности. Кроме того, более длинная полиеновая цепь моноциклического деиноксантина может способствовать встраиванию каротиноида в двойной слой липидной мембраны, проявляя там свои антиоксидантные свойства (Zhang, 2000).


In vitro деиноксантин проявляет гораздо более высокую по сравнению с -каротином) наиболее распространенными каротинами (ликопином, и ксантофиллами (лютеином и зеаксантином) способность к утилизации H2O2 и синглетного кислорода. Кроме того, показана способность деиноксантина in vitro защищать от гидроксильных радикалов плазмидную ДНК. Было показано, что деиноксантин перехватывает АФК до 58,87% и 69,65% в концентрации 0, мM и 0,125 мM соответственно, и демонстрирует значительно более высокую активность перехвата АФК, чем другие каротиноиды во всех исследованных концентрациях (p0.05). Антиоксидантная активность падает в ряду:

деиноксантинликопенлютеинзеаксантин-каротин (Tian, 2007).Влияние деиноксантина на ДНК исследовали с использованием системы, индуцирующей повреждения ДНК гидроксильным радикалом invitro. Атака гидроксильного радикала (•OH), генерируемого в ходе реакции Фентона, нарушает структуру суперспирализованной плазмидной ДНК с образованием трёх форм:

суперспирали (SC), открытой кольцевой (OC), и линейной ДНК (Linear).

Степень нативности ДНК была представлена процентом суперспирализованных форм ДНК, а антиоксидантный эффект оценивали, сравнивая процент SC в тестируемых образцах и в контроле. В контроле суперспирализованная структура ДНК полностью (96,84%,) разрушалась под действием гидроксильного радикала (•OH), генерируемого в ходе реакции Фентона, с образованием кольцевой и линейной форм. Более высокий процент (20,64%) восстановления суперспиральных форм ДНК по сравнению со степенью повреждения ДНК в позитивном контроле говорит о ДНК-протекторном эффекте деиноксантина. Ликопен и -каротин также показали некоторый ДНК защитный эффект (12,64% и 4,31% восстановления суперспиральных форм соответственно). Защитный эффект деиноксантина был значительно выше, чем у ликопена или -каротина. Эти результаты полностью соответствовали данным по АФК-перехватывающей активности, полученным по ХЛ. ДНК протекторный эффект деиноксантина in vitro объясняется его более сильной АФК-перехватывающей активностью (Tian, 2007).

Деиноксантин является единственным идентифицированным и масс спектрометрически охарактеризованным соединением из более 10 красных пигментов, выявляемых в экстрактах D. radiodurans. Кроме деиноксантина, единственного ранее идентифицированного у Deinococcus radiodurans каротиноида, в бактериальных экстрактах выявлены соединения, молекулярная масса которых соответствует фитоину и астаксантину. Выявлены также три других каротиноида, характеризующихся m/z протонированных молекулярных ионов 521, 553 и 569 a.e.м, идентификация которых требует уточнения (Лысенко и др., 2010).

Протекторные свойства деиноксантина представляют особый интерес с точки зрения разработки новых антиоксидантных и радиозащитных препаратов.

-каротин – это основной коммерчески доступный препарат, применяемый для системной фотозащиты кожи. Длительное потребление каротина (15-30 мг в день в течение 10-12 недель) способствовало защите кожи против УФ-вызванной эритемы у человека. Сходный эффект продемонстрирован и для смеси каротиноидов и после диеты, обогащенной каротином. Однако, исследования свидетельствуют о том, что при такой форме введения в организм каротиноиды участвуют в общей защите кожи, но не обладают протекторным эффектом в отношении тяжелого УФ-облучения (Stahl, 2006). Проведенное исследование влияния -каротина на реакцию кожи человека после облучения индивидуальной минимальной кожно-эритемной дозой ультрафиолета во время пика интенсивности реакции (через 24 часа после воздействия) показало, что введение per os. -каротина в дозе 120 мг не изменяло клинически значимо состояние кожи после фотоповреждения (Garmyn, 1995). По данным других исследователей, 10-12 недельная диета, обогащенная -каротином, ликопином и флавоноидами снижала чувствительность кожи к УФ-вызванной эритеме у людей (Stahl, 2007).

1.2.2 Экранированные фенолы Фенольными антиоксидантами принято называть любые соединения вида Ar(OH)n, в которых одна или несколько гидроксильных групп соединены с ароматическим ядром (Ar), при этом молекулы могут содержать несколько фрагментов Ar(OH)n (Меньщикова, 2006).

Изученные нами в рамках данной работы соединения 2 и 3 (см. раздел относятся к липофильным (гидрофобным) пространственно 2.1.3) затрудненным, или экранированным фенолам (фенолятам), в которых OH группа экранирована трет-бутильными группами. Простейшим в гомологическом ряду таких соединений является ионол (4-метил-2,6-ди-трет бутил-фенол). Соединение 2 содержит 1, а соединение 3 – 2 фенольных остатка, экранированных трет-бутильными группами.

Химические свойства пространственно-затрудненных фенолов во многом обусловлены пространственным экранированием гидроксильной группы.

Вследствие особенностей распределения спиновой плотности кинетически устойчивыми являются соединения, имеющие алкильные заместители в орто- и пара-положениях фенольного кольца. При этом, с увеличением пространственного объема заместителей (особенно в орто-положениях) кинетическая устойчивость соединений возрастает (Меньщикова, 2006).

Известно также, что эффективность действия фенольных антиоксидантов увеличивается при алкилировании в молекуле одного или двух opтo-положений по отношению к гидроксильной группе. Наиболее сильное влияние оказывают третичные алкильные группы в орто-положениях (Горбунов, 1981). Обычно под понятием «пространственно-затрудненные фенолы» подразумевают 2,6 диалкилфенолы и их производные.

Показано, что по своим антиоксидантным свойствам экранированные фенолы зачастую превосходят природные антиоксиданты (Жданкина, 2010).

Они широко применяются в топливной промышленности, в производстве горюче-смазочных материалов и пищевых жиров.

Антиоксидантные свойства фенолятов связаны с их способностью реагировать с радикалами ROO•, прерывая цепь окисления (уравнения 15-17).

(15) (16) (17) Благодаря наличию в структуре ароматического кольца обобщенной системы -электронов происходит смещения отрицательного заряда на кислород, результатом чего становится достаточно легкий отрыв атома водорода от гидроксила (Меньщикова, 2006).

Образующиеся в результате феноксильные радикалы малоактивны, в результате чего радикально-цепное окисление ингибируется (Ершов, 1972).

Высокая стабильность радикалов, образуемых молекулами фенольных антиоксидантов, обусловлена комплексом термодинамических и кинетических факторов. Термодинамическая устойчивость подразумевает низкую энергию образования фенольных радикалов и связана с делокализацией спиновой (электронной) плотности неспаренного электрона. При этом, чем больше степень делокалицазии, тем стабильнее радикал и меньше энергия его образования (Меньщикова, 2006).

Эффективность пространственно-затрудненных фенолов как ингибиторов окисления существенно зависит от их структуры. Определяющим фактором в этом случае является строение алкильных групп и характер пара-заместителя.

При изучении кинетики реакций с натриевыми солями 2,6-ди-трет бутилфенолов, содержащими в пара-положении различные заместители, обнаружено, что с увеличением электрон-акцепторных свойств заместителей растет энергия активации и уменьшается констант скорости реакции (Ершов, 1973). То есть, введение в пара-положение молекулы пространственно затрудненного фенола электрон-донорных заместителей увеличивает его антиокислительную активность, а электрон-акцепторных – уменьшает (см.

табл. 1).

Таблица 1 – Относительная эффективность пара-заместителей в молекулах пространственно-затрудненных фенолов.

Относительная Пара-заместитель: эффективность, %:

- CH3 - C2H5 н-C4 H9 - CH(CH3)C2H5 - C(CH3)3 Эта закономерность, по-видимому, связана с уменьшением эффективного отрицательного заряда на кислороде в фенолят-ионе (Ершов, 1973).

Эффективность большинства антиоксидантов класса пространственно затрудненных фенолов значительно повышается в композиции с веществами, разрушающими гидроперекиси и предотвращающими возможность вырожденного разветвления цепи окисления сульфидами, фосфитами, аминами, тиолами (Ершов, 1972).

В классе фенольных антиоксидантов различают монофункциональные (антирадикальные) и бифунцкиональные антиоксиданты (ингибиторы комбинированного действия). Вторые, помимо прямой инактивации свободных радикалов, способны уменьшать скорость образования радикалов в реакциях разветвления цепей за счет реагирования с гидроперекисями или связывающие каталитически активные ионы металлов. По такому механизму, в частности, ингибируют свободнорадикальное окисление диалкилсульфиды R’-S-R’’ (Меньщикова, 2006;

Жданкина, 2010). Соединение 1, являясь одновременно фенольным и серосодержащим соединением (диалкилсульфидом), не только устраняет свободные радикалы, но и нейтрализует гидроперекиси, что позволяет ожидать его повышенной эффективности, выделяющей его из ряда других фенольных антиоксидантов.

Соединения 1 и 2 относятся к полиядерным фенолам, т.к. имеют в структуре более одного PhOH-радикала, и представлены в виде солей брома (1) и йода (2) (в растворе – в виде катионов).

Антиоксидантные свойства фенольных соединений, помимо структуры, во многом зависит и от соотношения в среде окислителей и восстановителей.

При определенных условиях они могут оказывать прооксидантный эффект, в частности, в присутствии ионов металлов с переменной валентностью. Кроме того, взаимодействие фенольных антиоксидантов с перекисями приводит к образованию алкоксильных радикалов, способных инициировать окислительные реакции (Меньщикова, 2006):

ArOH+ROOHRO+H2O+ ArO (18) 1.2.3 Липофильные органические катионы Известно, что липофильные органические катионы, т.н. проникающие ионы, способны адресно аккумулироваться в мембранных структурах, несущих положительный заряд, в частности, в митохондриях и клетках бактерий.

Проникающая способность подобных соединений основана на использовании трансмембранной разницы потенциалов, создаваемой в результате реализации основной биоэнергетической функции клеточного дыхания. К проникающему иону присоединяется антиоксидантная часть, способная восстанавливаться, реагируя с компонентами дыхательной цепи. Методология конструирования липофильных органических катионов была разработана Скулачевым, Либерманом и соавторами еще в конце 60-х годов прошлого века. Позже, по предложению американского биохимика Д. Грина, такие молекулы были названы ионами Скулачева (Skulachev, 2007;

2012;

Antonenko et al., 2008).

Типичным представителем таких ионов является трифенилметилфосфоний, у которого положительный заряд на атоме фосфора сильно делокализован за счет присутствия трех фенильных остатков. Диполи воды не в состоянии удерживаться на катионе и не образуют водную капсулу, которая могла бы помешать его проникновению в гидрофобные участки мембраны.

Производные трифенилметилфосфония, в частности, пластохинонилдецилтрифенилфосфоний демонстрируют высокую (SkQ1), антиоксидантную активность в низких дозах (10-5-10-10 М), что объясняется эффективностью их проникновения сквозь мембрану. В более высоких дозах эти соединения демонстрируют прооксидантный (токсический) эффект (Skulachev, 2005;

Скулачев, 2007).

SkQ1 - самое эффективное в качестве протектора от АФК соединение в ряду множества подобных. Оно представляет собой трифенилфосфоний, к которому при помощи углеводородного линкера присоединен растительный антиоксидант пластохинон.

Существует еще одно свойство липофильных катионов, которое может быть основой ряда адаптогенных эффектов, не связанных с адресной доставкой антиоксидантов в митохондрии. и ТРР SkQ1, SkQR (трифенилдодецилфосфоний аналог SkQ без хинона) способны транспортировать через мембрану протонированные жирные кислоты, осуществляя мягкое разобщение дыхания и синтеза АТФ (Severin et al., 2010). В результате этого снижается трансмембранный потенциал и, как следствие, уровень генерации АФК, что было продемонстрировано на изолированных митохондриях и клеточных моделях (Скулачев, 2007).

Геропротекторная активность SkQ1 и, в меньшей степени, SkQR проверена в ряде независимых исследований. В частности, у животных получавших SkQ, не наблюдаются либо незначительно выражены такие признаки старения, как инволюция тимуса, остеопороз и горбатость, поседение, облысение, потеря вибрисс, замедление заживления ран, саркопения, увеличение левого желудочка сердца, исчезновение эстральных циклов у самок и полового влечения, равно как и исследовательского рефлекса у самцов. Отмечено повышение продолжительности жизни гриба подоспоры, ракообразного цериодафнии, насекомого дрозофилы, рыбы N. furzeri, а также млекопитающих: мышей, слепушонок и хомячков (Anisimov et al., 2011).

Ширина спектра регистрируемых эффектов позволяет сделать заключение о том, что соединения группы SkQ это первый химический геропротектор системного действия (Skulachev, 2011;

2012).

Соединение 1 из экранированных фенолов также содержит остаток трифенилметилфосфония, что позволяет ожидать его эффективности в субмикромолярных дозах.

1.2.4 Олигопептиды В живой клетке в норме присутствует широкий спектр низкомолекулярных олигопептидов. Одной из основных функций эндогенных пептидов является регуляция интенсивности процессов свободнорадикального окисления, в том числе ПОЛ. Эта функция осуществляется за счет изменения уровня потребления кислорода, интенсивности образования свободных радикалов и продуктов окисления (Лысенко, Регулируя 2005).

антиоксидантный баланс, олигопептиды принимают значительное участие в противодействии организма окислительному стрессу, возникающему при патологических процессах и стрессовых состояниях (Болдырев, 1998;

Хавинсон 2003).

Выделенные к настоящему моменту из тканей животных олигопептиды, обладающие доказанным геропротекторным и адаптогенным эффектом, представляют собой низкомолекулярные соединения пара- и аутокринной природы, обеспечивающие перенос информации как внутри клеток, так и между группами клеток. Широкий спектр функциональной активности этих соединений объясняется их влиянием на фундаментальные механизмы, составляющие основу разнообразных патологических процессов. Так, установлено, что они способны увеличивать продолжительности жизни у млекопитающих, замедлять развитие опухолей, а также обладают иммуномодулирующим действием – способны к усилению клеточного и гуморального иммунитета, к улучшению коагулогических показателей, повышению нейрональной активности, оптимизации когнитивных функций (Анисимов, 2003;

Лысенко, 2005).

Для ряда низкомолекулярных олигопептидов (эпиталона, вилона и кортагена) экспериментально показано влияние на свободнорадикальные процессы и основные системы антиоксидантной защиты в крови, печени и мозге лабораторных животных. Особенно высокую эффективность данные соединения демонстрировали в качестве геропротекторов. При этом показано, что короткие пептиды (эпиталон, кортаген, вилон, пинеалон и везуген) обладают антиоксидантными свойствами в экспериментах in vivo и in vitro (Козина, 2008).

Пептидная регуляция существует на всех уровнях функционирования организма (Гомазков, 1995;

Шерстнев, 1999). Существует мнение, что пептиды могут включаться в контроль экспрессии генов, осуществляя регуляцию еще и на этом уровне (Хавинсон, 2003;

Пальцев, 2008). Показано, что пептиды, обладающие антиоксидантной активностью, способны корректировать нарушения взаимодействия генов в условиях окислительного стресса, возникающего при старении вследствие развития ряда патологических процессов (сердечно-сосудистые патологии, нарушение мозгового кровообращения, онкологические заболевания, нейродегенеративные болезни и т.д.) (Козина, 2008). В частности, существует гипотеза о вызываемой пептидными регуляторами модификации характера экспрессии генов, кодирующих белки, являющиеся структурными компонентами митохондриальных мембран. Благодаря таковой регуляции пептиды, ингибируя свободнорадикальные процессы в мембране, способствуют сохранению ее целостности и обеспечивают нормальное функционирование клетки (Khavinson et al., 2002, 2007).

Механизмы действия регуляторных пептидов объясняют, с одной стороны, с точки зрения существования так называемого пептидного каскада.

Суть данной гипотезы в том, что каждый пептид, помимосвоей непосредственной биологической активности, обладает также способностью индуцировать выход иных эндогенных регуляторных пептидов. Те, в свою очередь, также могут служить индукторами выхода других регуляторов, благодаря чему возникает сложный каскадный процесс, продолжающийся в течение промежутков времени, значительно превышающих время существования в организме отдельных молекул пептидов (Ашмарин, 1986;

Козина, 2008).

В качестве иного механизма действия регуляторных пептидов называют их процессинг. В короткие сроки путем активации определенных протеолитических ферментов в нужном компартменте образуется необходимое количество требуемых пептидов. При этом образующиеся короткие фрагменты длиной в 3-4 аминокислотных остатка могут оказаться значительно более эффективными, чем исходные соединения (Гомазков, 1995).

1.2.5 Бактериальные пробиотические препараты Применение пробиотических препаратов является сейчас одной из наиболее эффективных и безопасных технологий, применяемых при лечении и профилактике заболеваний желудочно-кишечного тракта. Они используются также для нормализации микрофлоры после приема антибиотиков и иммуномодуляции (Бондаренко, 2005;

Isolauri, 2002;

Matsuu, 2003).

Многочисленные исследования подтвердили эффективность использования пробиотиков в акушерстве, гинекологии, стоматологии, дерматологии, ревматологии, при заболеваниях опорно-двигательного аппарата, туберкулезе, сахарном диабете и т.д. (Воробьев и др., 2004). Пробиотические и синбиотические препараты широко используются для профилактики илечения аллергических заболеваний, обладают противовоспалительной активностью (Khansari, 2009;

Снарская, 2011). Столь широкий спектр терапевтической активности пробиотических препаратов можно объяснить действием ряда механизмов: укрепление цитоскелета клеток кишечного эпителия (усиливается экспрессия гена тропомиозина ТМ-5, синтез актина и окклюзина);

снижение проницаемости слизистой кишечника за счет повышения фосфорилирования белка межклеточных соединений;

повышение синтеза муцина (стимуляция гена МUC-3) и др. (Урсова, 2006;

Vonk, 2002), а также содержанием в них веществ, способных противостоять окислительному стрессу, за счет которого реализуется множество патогенных эффектов на клеточном и организменном уровнях.

Существуют данные о наличии у пробиотических препаратов (в частности, на основе лактобактерий, бифидобактерий и спорообразующих бацилл) антигенотоксической и антимутагенной активности. Способность пробиотических лактобактерий вырабатывать соединения, обладающие антигенотоксической активностью, отмечается в литературе с 90-х годов прошлого века (Renner, 1991). Позже была выявлена высокая антимутагенная активность бифидобактерий и спорообразующих бацилл. В этих экспериментах пробиотические микроорганизмы снижали генотоксичность таких соединений как 4-нитрохинолин-1-оксид, N-метил-N-нитро-нитрозогуанидин, 2-амино-3,4 диметилимидазо[4,5-f]хинолин, полиароматические углеводороды, афлатоксины и др.(McBain, 2001;

Lo, 2004;

Cenci, 2008). Большинство обнаруженных эффектов основано на разрушении генотоксинов ферментами бактерий либо низкомолекулярными вторичными метаболитами.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.