авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» ...»

-- [ Страница 2 ] --

Однако пробиотические культуры способны защищать и от деструктивного действия физических агентов. Так, в работе M. Matsuu с соавторами (2003) сравнивали интенсивность апоптоза после облучения гамма лучами крыс получавших воду и кефир. Эксперименты показали, что этот пробиотический продукт статистически значимо (р0,05) снижает апоптозный индекс и уровень каспазы-3 в клетках крипт толстого кишечника.

Максимальный протекторный эффект (снижение уровня апоптоза более чем в два раза) отмечен после действия дозы в 1 Гр. При увеличении дозы параметры апоптоза снижались меньше. При действии 4 Гр протекторный эффект не наблюдался. Авторы объясняют наблюдаемые феномены подавлением активности каспазы-3. Однако эта интерпретации противоречит многочисленным экспериментальным данным об антиканцерогенной активности кефира (Lopitz-Otsoa, 2006). По-видимому, вещества, выделяемые микроорганизмами-продуцентами этого пробиотического продукта способны либо стабилизировать ДНК, либо активировать систему репарации ДНК.

Отметим, что многие уже имеющиеся в продаже и активно применяющиеся пробиотические и симбиотические препараты совершенно не исследованы с этой точки зрения.

Крайне поверхностно изучен вопрос о связи антимутагенной активности пробиотических бактерий с выработкой антиоксидантов. Тем не менее, способность лакто и бифидобактерий вырабатывать вещества, инактивирующие АФК, надежно подтверждена экспериментами (Gotteland, 2006;

Shen, 2011;

Achuthan, 2012).

Авторы аналитического обзора (Su, 2011) выдвинули предположение о том, что пробиотические микроорганизмы способны вырабатывать вещества, активирующие естественные механизмы антиоксидантной защиты клеток хозяина. Отметим также, что пробиотические и симбиотические препараты, независимо от своих антиоксидантных свойств, являются одним из эффективных и, что важно, безопасных «инструментов» для профилактики и коррекции патобиохимических последствий аллергических заболеваний (Prescott, 2011).

Существуют данные, свидетельствующие о том, что смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую УФ-протекторную активность, чем отдельные антиоксиданты, т.е. для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Allemann, 2008;

Lin, 2003;

Greul, 2002). Данные об антиоксидантной активности пробиотиков позволяют предположить, что таковые свойства обеспечиваются комплексом как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных антиоксидантов (Hathouta, 2011;

Kodali, 2011;

Kullisar, 2002;

Lavy, 2005;

Saide, 2005).

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы исследования 2. Культура Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была получена из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Питательные среды.

Для выращивания Deinococcus radiodurans были использованы жидкие и плотные питательные среды. Состав сред указан в таблице 2.

Таблица 2 – Состав питательных сред, используемых для выращивания Deinococcus radiodurans Название среды Состав среды, г/л* дрожжевой экстракт 5, LB пептон 15, NaCl 5, дистиллированная вода до 1 л триптон 5, TGY глюкоза 1, tryptone/glucose/yeast extract дрожжевой экстракт 3, дистиллированная вода до 1 л Питательный бульон на основе сухого Панкреатический питательного агара (пр-ва ФГУП «НПО гидролизат кильки 10, «Микроген» МЗ РФ) рН 7,2 ± 0,2 Натрия хлорид 4, Соевая среда соевая мука 1-50, дистиллированная вода до 1 л Соевая среда с глюкозой соевая мука 11, глюкоза 1, дистиллированная вода до 1 л Соевая среда с глюкозой и солями соевая мука 50, глюкоза 1- - MgSO4. 7H2O510 - 510-3 -500 µМ MnCl дистиллированная вода до 1 л *В случае приготовления варианта плотной среды на 1 л добавляли 20 г агара микробиологического 2.1.1. Биосенсорные штаммы В работе использовались следующие штаммы:

Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux), E. coli MG1655 (pKatG-lux), E. coli AB1157 (pRecA-lux), E.coli MG1655 (pRecA-lux) Е. coliС600 (pPLS-1), Е. coliС600 (pPBA-5), E.coli MG1655 pColD-lux, E.coli MG1655 pXen7.

В работе использовались генетически модифицированные штаммы E.

coli, содержащие плазмиды, несущие оперон luxCDABE морской фотобактерии поставленный под контроль Photorhabdus luminescens, соответствующихпромоторов - katG, SoxS, RecA и т.д. (рис.1).

Рисунок 1 – Схема строения гибридной плазмиды, введенной в биосенсорные штаммы.

Данный оперон отвечает за работу люцифераз и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Бактериальные люциферазы – гетеродимеры, состоящие из - и субъединиц, которые катализируют окисление длинноцепочечного альдегида RCHO (природный субстрат – тетрадеканаль) кислородом воздуха с помощью восстановленного флавин-мононуклеотида:

FMNH2 + RCHO + O2 = FMN + H2O + RCOOH + h (490 нм) (19) Реакция сопровождается высвечиванием кванта сине-зеленого света ( нм) (Meighen E.A. 1991).

В геномах биолюминесцирующих бактерий гены, кодирующие люциферазу, расположены в составе оперона luxCDABE. Гены luxAB определяют синтез субъединиц люциферазы, а гены luxCDE определяют синтез фермента редуктазы, ответственной за формирование субстрата люциферазы – тетрадеканаля в результате восстановления жирной кислоты (Манухов и др.,1996).

Субстратом для создания генетических конструкций служила плазмида pDEW201. ДНК-фрагменты, содержащие промоторы katG, SoxS и RecA были получены путем ПЦР-амплификации соответствующих нуклеотидных последовательностей из генома E. coli K12 MG1655. Создание конструкций, содержащих данные фрагменты ДНК, транскрипционно слитых с генами – репортерами luxCDABE Ph. luminescens, было проведено в беспромотороном мультикопийном векторе с oricolE и геном - маркером bla (резистентность к ампициллину). Сконструированные гибридные плазмиды вводили в клетки штамма E. coli K12 MG1655.

Биосенсоры с промоторами PkatG и PsoxS фиксируют наличие в среде окислителей, образующих в клетке гидроперекиси и супероксид-анион радикал. Характерным признаком окислительного стресса у Е. coli является индукция генов антиоксидантной системы и повышение активности антиоксидантных ферментов, кодируемых этими генами (Farr, 1991). Поэтому в генетических конструкциях, составляющих основу биосенсоров, реагирующих на окислительный стресс, были использованы промоторы именно этих генов.

Ген katG определяет синтез каталазы;

его промотор PkatG (белок-активатор OxyR) специфически реагирует на перекись водорода и органические пероксиды. Промотор PsoxS (белок-активатор SoxR) специфически реагирует на супероксид-анион-радикалы.

Биосенсоры с плазмидами pRecA и pColD оба фиксируют наличие в клетке факторов, вызывающих повреждение ДНК, однако механизмыих действия существенно различаются. В гибридной плазмиде pColD транскрипция генов люминесценции находится под контролем SOS-промотора гена cda (получен из плазмидыpColD-CA23, содержащей ген colD, кодирующий синтез колицина), в плазмиде pRecA - под контролем промотора PrecA. В опытах с митомицином С амплитуда ответа (АО) ColD-биосенсора составляла 1000, тогда как для RecA-биосенсора данный параметр не превышал 30. Кроме того, ColD-биосенсор демонстрирует более высокую чувствительность к ряду других индукторов, таких, как цис-платина, 4-HXO, перекись водорода, демонстрируя высокую антиоксидантную активность и определяя индуктор в меньших дозах, чем RecA-биосенсор.

Основным отличием в работе промоторов PrecA и Pcda является наличие фоновой активности PrecA при нормальном метаболизме, без SOS-индукции, поскольку продукт регулируемого им гена - белок RecA – необходим для нормального протекания процесса репликации хромосомы. Продукт же гена ColD, колицин, необходим клеткам только в стрессовых условиях, выделяясь во внешнюю среду в качестве киллера. «Закрытость» промотора Pcda при нормальных условиях обеспечивается наличием в его регуляторном элементе двух операторных участков.

Поскольку ColD-биосенсор более чувствителен, его можно использовать для первичной детекции в среде генотоксических агентов и для определения их концентрационной зависимости. RecA-биосенсор имеет меньшую пороговую чувствительность и характеризуется более быстрым развитием ответа, что дает ему преимущество при использовании для быстрого анализа (Котова, 2010).

Штаммы E. coli AB1157 (pRecA-lux) и E.coli MG1655 (pRecA-lux) идентичны по своих характеристикам в Lux-тесте. Штамм E. coliAB (pRecA-lux) был разработан раньше и впоследствии заменен на E.coli MG (pRecA-lux), чтобы система биосенсоров отвечала требованию изогенности штаммов.

Штаммы, несущие промоторы pXen7+ и pBA+ содержат конститутивные промоторы, позволяющие параллельно основным опытам оценить влияние изучаемых факторов на работу люциферазной системы, чтобы исключить ложно-положительные и ложно-отрицательные результаты.

Чувствительность этих биосенсоров составляет: около 10 -8 М для soxS биосенсора (пороговая концентрация метилвиологена, используемого в качестве контрольного вещества, вызывающего продукцию супероксид анион радикалов с помощью дыхательной цепи клетки) и для recA-биосенсора (пороговая концентрация митомицина С, способного вызывать индукциюrecA промотора), и около 5·10-6 М для katG-биосенсора (пороговая концентрация перекиси водорода, вызывающая индукцию katG промотора) (Zavilgelsky etal., 2005).

Штаммы были любезно предоставлены сотрудниками ФГУП ГосНИИ Генетика, Москва.

Индукторы окислительного стресса 2.1. Источники ультрафиолетового излучения:

1) Cl2-эксилампа высокой интенсивности (бактерицидная), излучающая УФ с длиной волны 258 нм, доза при облучении составляет 2,7 Дж/м 2 в секунду;

2) Cl2-эксилампа низкой интенсивности (терапевтическая), излучающая УФ с длиной волны 311 нм доза при облучении составляет 12,2·10-7 Дж/м2 в секунду.

3) Ртутная лампа низкого давления (HG-125), излучающая УФ с длиной волны 300-400 нм. Доза при облучении составляла 10 Дж/м2 в секунду.

Облучение производилось в течение разных промежутков времени (1, 10, 15, минут). Лампа помещена в фокусе параболического отражающего зеркала и УФ-поток, с целью снижения угла рассеяния, передавался к облучаемому объекту через алюминиевую направляющую систему. Это позволило сформировать осесимметричный и равномерный поток излучения на расстояниях от 20 см до 2 м, в котором минимальная площадь облучаемой поверхности составляет 80 х 80 мм, а неравномерность (при отклонении от оси на 50 мм) не превышала 20 %.

Дозы для облучения (см. таблица 3) были выбраны, исходя из калибровочной кривой для каждого источника УФ, согласно следующим критериям:

минимальная доза, при которой наблюдается статистически 1) достоверный эффект;

доза, при которой наблюдается максимальный эффект;

2) Максимальная доза, при которой еще наблюдается статистически 3) достоверный эффект, и не происходит 100% гибели клеток.

Таблица 3 – Время облучения и дозы УФ Время облучения, мин Доза УФ, Дж/м УФ 300-400 нм 1 5 10 УФ 258 нм 1 162, 5 810, 10 1621, 61*10- УФ 311 нм 146,4*10- 244*10- Гипербарическая оксигенация. При опытах с ГБО планшет помещали в барокамеру и обрабатывали кислородом в течение 60 минут при 2, 4 и 6 ати (0,1;

0,3 и 0,5 Мпа соответственно).

Химические индукторы. N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин получен от «SigmaChemicalCo»

Для активации промотора pKatG использовали перекись водорода (Ferrain).

Для активации промотора PsoxS использовали паракват (1,1’-диметил 4,4’-дипиридилий дихлорид) (Sigma) в концентрации 10-3 М. Известна способность этого вещества к генерации супероксид-анион-радикала (Rzezniczak, 2011).

Для активации pRecA и pColD-промоторов использовался 1,4-диоксид 2,3-хиноксалиндиметанол (диоксидин) («Биосинтез», Россия) в концентрации 2,2510-5 М, т.к. было установлено, что эта концентрация является оптимальной для индукции RecА- и ColD- оперонов биосенсорных штаммов.

2,3-хиноксалиндиметанол (диоксидин) является 1,4-диоксид антимикробным препаратом широкого спектра действия, в основе которого лежит повреждение биосинтеза ДНК микробной клетки с глубокими нарушениями структуры нуклеоида уже при действии субингибирующих концентраций (Падейская, 2001). Был разрешен для медицинского применения в 1976 г. Препарат активен в отношении Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella dysenteria, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella asonnei, Salmonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium perfringens. Действует на штаммы бактерий, устойчивых к другим антибактериальным лекарственным средствам, включая антибиотики. В экспериментальных исследованиях продемонстрировано наличие тератогенного, эмбриотоксического и мутагенного действия. Показано, что диоксидин индуцирует мутации в клетках бактерий, хромосомные аберрации и микроядра в клетках костного мозга мышей, а также доминантные летальные мутации в половых клетках самцов мышей (Фонштейн, 1985;

Сычева, 2004). В недавних опытах продемонстрирована ДНК-повреждающая активность диоксидина в клетках ряда органов: печени, легких и селезенки (Орджоникидзе, 2011). В условиях анаэробиоза, в том числе и в инфицированном организме, диоксидин (как и другие производные ди-N-окиси хиноксалина) активирует свободнорадикальные процессы, индуцируя образование активных форм кислорода (Падейская, 2001;

Большаков, 1986;

Фонштейн, 1978).

Потенциальные протекторы.

2.1. Экранированные фенолы, использованные в данной работы, были синтезированы сотрудниками Института органической и физической химии им.

А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН (Казань).

На этапе первичного скрининга была изучена антиоксидантная и ДНК протекторная активность 14 соединений, структурные формулы которых приведены ниже (формулы 2.1 – 2.14):

t-Bu OH S CH=NNHCNH 1 - t-Bu (2.1), 2 - (2.2), t-Bu OH S CH=NNHCNH2 + CuCl2 2H2O 3 - t-Bu (2.3), t-Bu OH t-Bu HO OH t-Bu O OH CH=NNHCCH2CH t-Bu OH S t-Bu CH=NNHCNH2 + CoCl t-Bu t-Bu 4 - t-Bu (2.4),5 - (2.5), OH OH HO OH t-Bu t-Bu t-Bu O + NiCl2 6H2O + OH CH=NNHCCH2CH CH2NH 6- (2.6), t-Bu HO OH t-Bu O OH CH=NNHCCH2CH 7- (2.7), 8 - (2.8), t-Bu OH t-Bu t-Bu OH O t-Bu t-Bu + NiCl2 6H2O + OH CH=NNHCCH2CH 9 - t-Bu (2.9), t-Bu CH2NH t-Bu t-Bu OH O OH CH=NNHCCH2CH 10 - t-Bu (2.10), t-Bu t-Bu t-Bu OH O + CoCl OH CH=NNHCCH2CH 11 - t-Bu (2.11), t-Bu t-Bu t-Bu OH O + CuCl2 2H2O OH CH=NNHCCH2CH 12 - t-Bu (2.12), t-Bu HO OH S 13 - (2.13), CH=NNHCNH OH t-Bu t-Bu HO OH S NiCl2 6H2O + + CH=NNHCNH 14 - (2.14) CH2NH Вещества были разведены в ДМСО до концентрации 10 -2 М, из которой был сделан ряд дальнейших разведений в ацетоне. Из ряда синтезированных соединений по результатам предварительных исследований были отобраны два вещества:

4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромид (далее - соединение 1) (формула 2.2);

3-бис(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодид (далее - соединение 2) (формула 2.7).

Производное пластохинонилдецилтрифенилфосфония было SkQ любезно предоставлено сотрудником НИИ Митоинженерии МГУ, Скулачевым М.В.

Токоферола ацетат произведен ООО «Люми».

Олигопептиды предоставлены Арутюняном А.В., НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто РАМН.

Были использованы соединения следующего состава и молярной массы:

Панкраген – Lys-Glu-Asp-Trp – 628,68 г/моль.

Пинеалон - Glu-Asp-Arg – 452,47 г/моль.

Везуген - Lys-Glu-Asp – 424,46 г/моль.

Изовилон (АВ-А) Lys-Glu – 292,34 г/моль.

Тролокс был получен от компании «Sigma». Тролокс, или 6-гидрокси кислота – водорастворимый 2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая синтетический аналог токоферола. В настоящее время он принят за стандарт для оценки антиоксидантной активности - его активность принимается за единицу, и антиоксидантная активность исследуемого вещества выражается в эквивалентных молях тролокса на массу образца (мкмоль/мг) (Georgetti, 2003, Uotila, 1994).

Были использованы следующие пробиотические препараты:

Хилак форте («Ratiopharm») 1) Нормазе(«Molteni») 2) Споробактерин («Бакорен») 3) Линекс(«Lec») 4) Бифиформ («Ferrosan») 5) Натто (Yuzo Takahashi Laboratory) 6) Состав препаратов:

В 100мл:

1) беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ Escherichia coli DSM 4087 (24,9481 г) беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ Streptococcus faecalis DSM 4086 (12,4741 г) беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ Lactobacillus acidophilus DSM 4149 (12,4741 г) беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ Lactobacillus helveticus DSM 4183 (49,896 г) Вспомогательные вещества: натрия фосфат гептагидрат, калия фосфат, молочная кислота, фосфорная кислота концентрированная, калия сорбат, лимонной кислоты моногидрат.

В 100мл:

2) Лактулоза (66,7 г) Вспомогательные вещества: лимонная кислота, ароматизатор (№7 бис).

Состав ароматизатора: пропиленгликоль, дигидрокумарин, ванилин.

в 1мл:

3) биомасса живых бацилл Bacillus subtilis 534 (не менее 1109 КОЕ) Вспомогательные вещества: натрия хлорид 70 мг/мл, вода очищенная до 1 мл.

В 1 г:

4) Lactobacillus acidophilus (0,3 г), Bifidobacterium infantis (0,3 г), Enterococcus faecium (0,3 г), вспомогательные вещества - лактоза, крахмал картофельный, магния стеарат.

В капсуле (0, 194г):

5) Bifidobacterium longum (не менее 1107 КОЕ) Enterococcus faecium (не менее 1107 КОЕ) вспомогательные вещества: молочнокислая закваска;

камедь;

магния стеарат;

лактулоза;

декстроза безводная стартер Bacillus subtilis natto (Takahashi strain).

6) 2.1.4 Экспериментальные животные Эксперимент проводился на молодых самцах мышей аутбредного стока CD-1, полученных из «Питомника лабораторных животных» ФИБХ им.

академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Работа выполнена с соблюдением принципов Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Животные разведены специально и ранее не участвовали в исследованиях. Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату на период адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных контролировали проявление признаков отклонения в состоянии здоровья. Перед формированием групп проводили клинический осмотр. В течение всего эксперимента животные находились в индивидуальных клетках в комнате содержания животных (рис.

2).

Рисунок 2 – Индивидуальные клетки для содержания животных Животных распределяли по группам, используя в качестве критерия массу тела. Начальная средняя масса тела была одинаковой в каждой группе, составляла 30-40 г., индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 10% от средней массы животных в группе. К началу введения веществ возраст животных составлял 10-11 недель.

Методы исследования 2. 2.2.1 Энзимологические исследования и тесты in vitro Определение супероксидустраняющей активности.

Супероксидустраняющую активность SkQ1 in vitro определяли при помощи стандартной тест-системы (SOD determination kit 19160, Sigma).

Измерения оптической плотности проводили на планшетном ридере автоматического анализатора Alisei (Radim). Для калибровки использовали супероксиддисмутазу в концентрациях ед/мл 1-200 (Sigma).

Супероксидустраняющую активность рассчитывали по Фридовичу (1979).

Определение активности каталазы.

Активность каталазы определяли по методу Королюка (1988). Метод основан на способности перекиси водорода, которая остается после проведения реакции, образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс желтого цвета. Интенсивность окраски пробы обратно пропорциональна активности фермента.

В методе используется 0,03 % перекись водорода и 4% молибдат аммония. К определенному объему биосубстрата (от 0,2 до 0,5 мл в зависимости от содержания белка в пробе) добавляли 2 мл перекиси водорода и инкубировали 10 мин при +37оС. Реакцию останавливали добавлением 1 мл молибдата аммония.

После этого измеряли оптическую плотность на спектрофотометре BeckmanDU 800 при длине волны 410 нм в кювете с длиной пути 1 см против дистиллированной воды. Контрольную (бланковую) пробу готовили так же, как опытную, но реакцию останавливали до внесения биосубстрата.

Активность каталазы выражали в мМЕ на мг белка в минуту, что соответствует нМоль в минуту на мг белка.

Активность рассчитывали по формуле Dк-Dоп хV пробы Е х l х VбиоSх C (2.15), где Dк — оптическая плотность контрольной (бланковой) пробы, Dоп — оптическая плотность контрольной пробы, V пробы — конечный объм пробы, л, Е0 — коэффициент молярной экстинции, (моль/л) -1 х см-1, l — длина светового пути (толщина кюветы), см, t — время инкубации, мин, VбиоS — объем биосубстрата, мл, С — концентрация белка в биосубстрате, мг/мл.

Определение концентрации белка Для определения концентрации белка использовался метод Эрисманна (Ehresmann, 1973). Это дифференциальный спектрофотометрический метод, основанный на колориметрии при = 228,5 и 234,5 нм. Мерой концентрации служит разница между оптической плотностью раствора на этих длинах волн.

Расчет коэффициента осуществляли по калибровке, построенной по бычьему сывороточному альбумину (Sigma) в диапазоне концентраций 10 — 500 мкг/мл (рис.3). В данной работе он составил 1,727239.

количество белка расчетное, мкг/мл 0 100 200 300 400 500 количество белка в пробе, мкг/мл Рисунок 3 – Калибровочная кривая по БСА, использовавшаяся для расчета коэффициента.

Концентрация белка в мг/мл рассчитывалась по формуле:

С=К·Р (D228,5-D234,5) (2), где Р – разведение, К - коэффициент, полученный путем калибровки метода по растворам с известной концентрацией белка.

2.2.2. Биолюминесцентный тест Культуры клеток E. coli растили на полноценной среде Луриа-Бертани (LB) (Маниатис и др., 1984). Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при постоянной аэрации на круговой качалке при 30 оС. Для выращивания на твёрдой среде использовали LB-агар (LB + 20 г/литр микробиологического агара). Как в жидкую, так и твердую среду добавляли антибиотик ампициллин (100 мкг/мл).

Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37оС до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01 - 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3·107- 3·106 клеток/мл) в соответствии с таблицей 1 (см. раздел 3.1) Измерения проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan»).

Затем суспензию подращивали в течение 2 до ранней логарифмической фазы.

Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносили в стерильные ячейки (находящиеся в стрипах планшета) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого препарата и по 10 мкл диоксидина (кроме контрольных ячеек). В контрольные ячейки добавляли 10 мкл деионизированной воды. Для тестов с физическими мутагенами в ячейки вносили по 45 мкл культуры и 5 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. В контрольные ячейки добавляли 5 мкл дистиллированной воды.

При изучении возможного протекторного действия препаратов, их вносили в ячейки за 30 минут перед УФ-облучением.

Суспензии жидких пробиотических препаратов разбавлялись деионизированной водой. Конечные концентрации препаратов в ячейках планшета люминометра рассчитывали как объемные доли, которые составляли 10-10-10-1 относительно неразбавленных препаратов.

Сухие пробиотические препараты:

а) регидратировали в физрастворе (0,9% р-р NaCl) б) культивировали в молоке.

При внесении сухих препаратов в жидкую среду суспензия доводилась до оптической плотности (D), равной: при разведении в физрастворе - 1ед. Мак Фарланда (что соответствует концентрации 3·108 клеток/мл), при посеве в молоко – 0, 1 ед. Измерения проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan») Измерение люминесценции.

После обработки планшет с пробами помещали в люминометр и инкубировали при 300С. Интенсивность биолюминесценции измерялась каждые 10 - 15 мин.

Для измерений люминесценции использовался микропланшетный люминометр ЛМ-01A (Immunotechco.).

Фактор индукции SOS ответа (Is) вычисляли по формуле:

Le IS 1 (2.16) Lk где: Lk – интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах);

Le– интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).

Признаком достоверности эффекта SOS-индукции считали статистически достоверное превышение Leнад Lk, оцениваемое по t-критерию.

Показатель антимутагенного потенциала, или протекторной активности (А, %) вычисляли по формуле:

Ia A (1 (2.17) )100% Ip где: Ia – фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствие протектора.

Ip- фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием.

Все эксперименты проводили в трех независимых повторностях.

В качестве характеристики протекторной активности исследуемой концентрации вещества использовали среднюю величину А в течение всего времени измерений.

2.2.3 Культивирование Deinococcus radiodurans Для получения каротиноидов был использован штамм Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209. На плотных агаризованных средах культуру выращивали при 37оС в течение 48 часов в чашках Петри.

В жидких средах штамм Deinococcus radiodurans ВКПМ В- выращивали в 50 мл колбах Эрленмейера с 25 мл среды, в которые вносили мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали в шейкере инкубаторе («Biosan ES-20») при 37оС и 170 об/мин в течение 144 часов.

Оптическую плотность культуры измеряли раз в сутки при помощи денситометра DEN-1B. Пробы культуры в неразбавленной соевой среде для измерения разбавлялись в 100 раз дистиллированной водой.

Из 6-дневной культуры делали посев на чашки с соевым агаром из разведения культуры в физиологическом растворе.

Ряд значений pH среды достигался добавлением 0,1 М раствора HCl и раствора NaOH в концентрации 100г/литр. Исходный pН среды равнялся 6.

Были получены следующие значения РН: 4;

5;

6;

6,5;

7;

7,5;

8;

9.

Для подбора прочих параметров использовалась среда «соевое молоко» с cодержанием сои 11 г/л., разбавленная 1/10 дистиллированной водой Для приготовления сред с разным содержанием глюкозы и солей магния использовали исходные растворы с концентрацией 100 г/литр глюкозы, 100г/литр MgSO47 H2O.

Конечные концентрации составляли:

1, 5, 10, 15 г/л глюкозы;

510-4, 510-3, 510-2, 510-1, 5, 50 г/литр MgSO47 H2O.

Для подбора оптимального температурного режима культивирование производилось при 37 и 25оС.

Оценка интенсивности роста Deinococcus radiodurans на разных питательных средах проводилась с использованием стандартной методики параллельных разведений в физиологическом растворе, глубинного посева на плотные агаризованные среды и учету количества КОЕ/мл (колониеобразующих единиц).

Для количественного контроля питательной среды по биологическим показателям готовили суспензию тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд.) и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно).

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делали по три таких посева. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 30оС в течение 24-48 часов. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний, выросших на трех чашках.

Согласно методическим рекомендациям «Контроль качества (МР питательных сред», 2003), среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма из шестого разведения, должно составлять около 100 КОЕ (колониеобразующих единиц), а соотношение средних значений при посеве из шестого в седьмое разведение должно быть близко 10:1.

Качественный контроль питательной среды по биологическим показателям выполняли путем посева односуточного тестового штамма в предлагаемую жидкую и плотную (агаризованную) питательную среду.

Чашки с посевами на плотной соевой среде инкубировали в термостате при 30оС в течение 48 часов.

Определение концентрации каротиноидов 2.2.4 Deinococcus radiodurans Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл среды TGY следующего состава (г/л): триптон – 5.0;

глюкоза – 1,0;

дрожжевой экстракт – 3.0;

вода дистиллированная – 1.0 л. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов.

Полученную суспензию бактерий центрифугировали 10 мин при 2000 g, осадок экстрагировали смесью ацетона (перегнанный, o.c.ч.) и метанола 1:1 – 10 мл на 1 г сырой массы бактерий. Центрифугирование производилось при помощи микроцентрифуги MiniSpinPlus (Eppendorf).

Для оценки биомассы использовали центрифугирование культуры на 14500 об/мин с последующей сушкой. Центрифугирование производилось при помощи микроцентрифуги MiniSpinPlus (Eppendorf). Сушка производилась в пробирках «Эппендорф» объема 1,5 мл при 70С. Объем проб составлял 1 мл.

Количественная оценка выхода каротиноидов производилась спектрофотометрически (Lichtenshaller, 1987). Поглощение раствором (A) измерялось на длинах волн 661,6 нм, 644,8 нм, 470 нм. Концентрация каротиноидов рассчитывалась по формуле:

Сk = (1000 A470-1.90 Ca-63,14 Cb) (2.18), где Ca= 11,24 A661,6 - 2,04 A644, Cb= 20,13 A644,8 – 4,19 A661, 2.2.5 Тест на антимутагенную активность.

Для изучения антимутагенной активности использовали определение частоты устойчивых к рифампицину мутантов в присутствии потенциальных протекторов и без них. Индуктором мутагенеза служил диоксидин. Суспензию штамма E.coli MG 1655 pColD-lux культивировали в течение 14 часов при 37оС.

Протектор и/или индуктор вносились заранее. Для определения действующей концентрации диоксидина исследовали частоту индуцированного мутагенеза в сравнении со спонтанным. В итоге была выбрана концентрация 2,25·10 -5 М.

Для определения количества мутантов 50 мкл культуры высевали на чашки со средой LB c добавлением 100 мг/л рифампицина, согласно стандартной методике (Патон, 1984). Плотность исходной культуры составляла 1 ед. Мак Фарланда (3·108 клеток).

2.2.6 Работа с экспериментальными животными Моделирование стрептозоцинового диабета I типа у мышей.

Диабет вызывали у 10-11 недельных самцов мышей аутбредного стока CD-1 путем внутрибрюшинного введения стрептозоцина (Sigma) в дозе 43 мг на кг веса, разведенного в 0,05М Na-цитратном буфере (рН=4,5) ежедневно в течение 5 дней (Kunjathoor, 1996). Спустя 3 дня после последней инъекции измеряли уровень глюкозы с помощью глюкометра AccuChekActiveglucometer (Roche, USA). Мыши с уровнем глюкозы 250 mg/dl (14 ммоль/л) и полиуремией, которая оценивалась по более влажной подстилке, считались страдающими диабетом 1 типа. В контроле уровень глюкозы был в среднем mg/dl (7 ммоль/л). Через 3-4 недели наносили полнослойную кожную рану.

Дополнительно проводили измерение уровня глюкозы каждые 2 суток при пероральном введение каротиноидов (группы 4 (А-Е), 5 (А-Е), 7 (А-Е), (А-С) – табл.4).

Моделирование полнослойной кожно-мышечной резаной раны Непосредственно перед моделированием раны удалялся шерстный покров в межлопаточной области путем выстригания. Поверхность кожи обрабатывалась 40% спиртом.

Резаная рана наносилась в межлопаточной области. Рана моделировалась путем вырезания лоскута кожи диаметром 7-12 мм с занимаемой площадью 1,5% относительно площади поверхности тела мыши. Процедура осуществлялась в наркотизированном состоянии животных с применением тиопентала натрия в дозе 1,2 мл 1% раствора тиопентала на 100 г массы тела животного. Каротиноидную фракцию растворенную в D. radiodurans, оливковом масле наносили на поверхность раны один раз в день. Препарат наносили утром, начиная с 10:00. Объем нанесения составлял 50 мкл препарата, содержащего 0,5 или 0,05 мкг смеси каротиноидов в сутки. Контрольным животным на поверхность раны наносили оливковое масло, прошедшее все этапы обработки, которые использовались для получения фракции каротиноидов D. radiodurans.

Пероральное введение каротиноидов проводили через зонд.

Каротиноидную фракцию D. radiodurans, растворенную в оливковом масле вводили per os один раз в день, утром, начиная с 10:00 в объеме 300 мкл, содержание каротиноидов в одной порции составляло 125 или 250 мкг/кг в сутки.

Таблица 4 – Экспериментальные группы животных. Условия и сроки эксперимента.

№ Группа Числ Доза Способ Общее День о препарата введения кол-во эвтаназии живо введени после тных й введения Контроль, 3 50 мкл Накожно 1 3 2 A суток, накожно обработанно го масла Каротиноиды 0,05 мкг Накожно 1 3 2 каротиноидо B D.radiodurans 0,05 мкг, 3 в в 50 мкл суток масла 1 Каротиноиды 0,5 мкг Накожно 3 2 каротиноидо C D.radiodurans 0,5 мкг, 3 суток в в 50 мкл масла Контроль, 7 50 мкл Накожно 2 3 6 A суток, накожно обработанно го масла Каротиноиды 0,05 мкг Накожно 2 3 6 каротиноидо B D.radiodurans 0,05 мкг, 7 в в 50 мкл суток масла Каротиноиды 0,5 мкг Накожно 2 3 6 каротиноидо C D.radiodurans № Группа Числ Доза Способ Общее День о препарата введения кол-во эвтаназии живо введени после тных й введения 0,5 мкг, 7 суток в в 50 мкл масла 3 Контроль, 14 50 мкл Накожно 3 13 A суток, накожно обработанно го масла Каротиноиды 0,05 мкг Накожно 3 3 13 каротиноидо B D.radiodurans 0,05 мкг, 14 в в 50 мкл суток масла Каротиноиды 0,5 мкг Накожно 3 3 13 каротиноидо C D.radiodurans 0,5 мкг, 14 в в 50 мкл суток масла Ликопин 0,05 мкг Накожно 3 3 13 0,05 мкг, 14 ликопина в D суток 50 мкл масла Ликопин 0,5 мкг Накожно 3 3 13 0,5 мкг, 14 ликопина в E суток 50 мкл масла Контроль, 14 300 мкл Перорально 4 3 13 суток, per os обработанно A го масла Каротиноиды Перорально 4 3 125 13 мкг/кг/сут B D.radioduransp каротиноидо er os мкг/кг/сут, 14 в в 300 мкл суток масла 4 Каротиноиды Перорально 3 250 13 мкг/кг/сут C D.radiodurans каротиноидо per os мкг/кг/сут, 14 в в 300 мкл суток масла 4 Ликопин per os Перорально 3 125 13 D 125 мкг/кг/сут, мкг/кг/сут 14 суток ликопина в 300 мкл масла Ликопин per os Перорально 3 250 13 250 мкг/кг/сут, мкг/кг/сут № Группа Числ Доза Способ Общее День о препарата введения кол-во эвтаназии живо введени после тных й введения 14 суток ликопина в E 300 мкл масла 50 мкл Накожно Контроль, 14 обработанно суток, го масла 5 3 13 A накожно+per os 300 мкл Перорально обработанно го масла 0,05 мкг Накожно Каротиноиды каротиноидо в в 50 мкл 5 D.radiodurans 3 13 сочетанное масла B введение, 14 Перорально суток мкг/кг/сут каротиноидо в в 300 мкл масла 0,5 мкг Накожно Каротиноиды каротиноидо в в 50 мкл 5 D.radiodurans 3 13 сочетанное масла C введение, 14 Перорально суток мкг/кг/сут каротиноидо в в 300 мкл масла 0,05 мкг Накожно Ликопин ликопина в сочетанное 50 мкл масла D 3 13 введение, 14 Перорально суток мкг/кг/сут ликопина в 300 мкл масла 0,5 мкг Накожно Ликопин ликопина в сочетанное 50 мкл масла E 3 13 введение, № Группа Числ Доза Способ Общее День о препарата введения кол-во эвтаназии живо введени после тных й введения суток Перорально мкг/кг/сут Ликопина в 300 мкл масла 6 Контроль, 21 50 мкл Накожно 3 20 A сутки, накожно обработанно го масла Каротиноиды 0,05 мкг Накожно 6 3 20 каротиноидо B D.radiodurans 0,05 мкг, 21 в в 50 мкл сутки масла Каротиноиды 0,5 мкг Накожно 6 3 20 каротиноидо C D.radiodurans 0,5 мкг/сут, 21 в в 50 мкл сутки масла Ликопин 0,05 мкг Накожно 6 3 20 0,05 мкг, 21 ликопина в D сутки 50 мкл масла Ликопин 0,5 мкг Накожно 6 3 20 0,5 мкг, 21 ликопина в E сутки 50 мкл масла Контроль, 21 300 мкл Перорально 7 3 20 сутки, per os обработанно A го масла Каротиноиды Перорально 7 3 125 20 мкг/кг/сут B D.radiodurans каротиноидо per os мкг/кг/сут, 21 в в 300 мкл сутки масла 7 Каротиноиды Перорально 3 250 20 мкг/кг/сут C D.radioduransp каротиноидо er os мкг/кг/сут, 21 в в 300 мкл сутки масла 7 Ликопин per os Перорально 3 125 20 D 125 мкг/кг/сут, мкг/кг/сут 21 сутки ликопина в № Группа Числ Доза Способ Общее День о препарата введения кол-во эвтаназии живо введени после тных й введения 300 мкл масла Ликопин per os Перорально 7 3 250 20 250 мкг/кг/сут, мкг/кг/сут E 21 сутки ликопина в 300 мкл масла 50 мкл Накожно Контроль, 21 обработанно сутки, го масла 8 3 20 A накожно+per os 300 мкл Перорально обработанно го масла 0,05 мкг Накожно Каротиноиды каротиноидо в в 50 мкл 8 D.radiodurans 3 20 сочетанное масла B введение, 21 Перорально сутки мкг/кг/сут каротиноидо в в 300 мкл масла 0,5 мкг Накожно Каротиноиды каротиноидо в в 50 мкл 8 D.radiodurans 3 20 сочетанное масла C введение, 21 Перорально сутки мкг/кг/сут каротиноидо в в 300 мкл масла Планиметрическое исследование раневой поверхности Измерение площади раневой поверхности (планиметрическое исследование) в процессе заживления ран проводили с помощью цифровой макрофотосъёмки в 1, 3, 7, 14 и 21 сутки после нанесения раны. Площадь измеряли на фотографиях с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health (NIH) http:/rsb.info.nih.gov/ij/)). Делали несколько снимков (n=3-5), площадь рассчитывали в мм2 (M±SD), периметр в мм (M±SD) Оценивали динамику изменения площади раневой поверхности как с определением скорости и индекса ускорения заживления по формуле 6:

(2.19) где: S1 - величина площади при предшествующем измерении;

S2 - величина площади раны в настоящий момент;

t - число дней между первым и последующим измерениями;

V - скорость изменения параметров раны за сутки к ее первоначальному размеру в процентах.

Для оценки динамики заживления ран на фоне сахарного диабета, вычисляли общий процент снижения площади раны между последовательными измерениями, как описано в работе (Cardinal, 2008).

Процент снижения площади раны рассчитывали по формуле 7:

1 (2.20) Процент снижения площади раны вычисляли как средний процент уменьшения площади раны за неделю (время наблюдения – 3 недели).

Все вычисления проводили с помощью программы для выполнения и документирования инженерных и научных расчётов - MathCad 2001 (рис 4).

S 72.11 S 29.58 t 1 S1 S2 V tS V 8. n 3 S ( 118.32 81.43 27.05 9.1) n S0 i1 S0 i S 0 i i 1 PAR n PAR 54. Рисунок 4 – Алгоритм расчета данных планиметрии в программе MathCad Определение окислительной деструкции белков плазмы крови мышей по уровню карбонильных производных Забор крови у экспериментальных животных проводили после декапитации в группах, получавших каротиноиды per os в течение 14 и 21 суток (группы 4 (А-Е), 5 (А-Е), 7 (А-Е), 8 (А-С) – табл.1). В сыворотке крови определяли степень спонтанного и металл-катализируемого окисления белков по методу Левина (Levine et al, 1990) в модификации Дубининой (Дубинина и др., 1995). Для инициации окислительной модификации белков использовали среду Фентона: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), Fe +2 (4мМ), ЭДТА (1мМ) и Н2О2 (0,3мМ) (Halliwell, 1990). Для регистрации окислительной модификации белков проводили предварительно их осаждение с помощью 20% раствора ТХУ.

К денатурированным белкам приливали 1,0 мл 0,1 М 2,4-ДНФГ, растворенного в 2 М НСl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа, затем пробы центрифугировали при 3000 g в течение 20 минут. Осадок промывали 3 раза смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок высушивали для удаления растворителей и затем растворяли в 8 М мочевине. Мочевину приливали к осадку в объеме 3,0 мл. Для лучшего растворения осадка добавляли одну каплю 2 М НСl. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре Beckman DU 800 при длине волны нм. Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 мл сыворотки крови.

Статистическая обработка данных и достоверность 2. результатов Все полученные результаты обработаны методами математической статистики. При этом были использованы утвержденные методы и компьютерные программы статистического анализа.

Исследования проведены с соблюдением требований инструкций (с постановкой контрольных экспериментов, стандартной шкалы, внутреннего контроля качества). Достоверность полученных результатов контролировалась путем регулярного проведения внутрилабораторного контроля качества.

Результаты, полученные в разделе обработаны методами 3.5, математической статистики с помощью программы STATISTICA 5,5. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стъюдента для независимых выборок. Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.

Оборудование для проведения исследований было подвергнуто поверке в органах Госстандарта РФ.

Работа с микроорганизмами проводилась в соответствии с СП 1.2.731- и ГОСТ Р 51446-99 (ИСО7218-96).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности известных 3. адаптогенов в биолюминесцентном тесте Подбор эффективных нелетальных доз прооксидантов и 3.1. оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров Были подобраны эффективные нелетальные дозы прооксидантов для системы биосенсоров. Результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5 – Эффективные нелетальные дозы проооксидантов.

Биосенсорный штамм Контроль (конечная Максимальный концентрация) фактор индукции MNNG10-5М E. coli С 600 (pPLS-1) 6, Диоксидин 2,25·10-5М E. coli AB1157 (pRecA-lux), 21, Ультрафиолет 258 нм E. coli MG1655 (pRecA-lux) 3, (в дозе 810,9 Дж/м2) Диоксидин 2,25·10-5М E. coli MG1655 (pColD-lux) 127, Перекись водорода 10-3 М E. coli MG1655(pKatG-lux) 106, Ультрафиолет 258 нм 3, (в дозе 810,9 Дж/м2) Паракват 10-3М E. coli MG1655 (pSoxS-lux) 179, Гипербарическая 19, оксигенация (4 ати) Таблица 6 – Оптимальная плотность культуры для биосенсорных штаммов.

Биосенсорный штамм Оптимальная оптическая плотность (D), единицы Мак Фарланда E. coli С 600 (pPLS-1) E. coli AB1157 (pRecA-lux), 0, E. coli MG1655 (pRecA-lux) E. coli MG1655 (pColD-lux) 0, E. coli MG1655(pKatG-lux) 0, E. coli MG1655 (pSoxS-lux) 0, E. coli MG1655 (pXen7-lux) E. coliС 600 (pBa5) Для штаммов с конститутивными промоторами в качестве «индукторов»

использовались потенциальные протекторы. Эти штаммы применялись для подбора концентраций, не токсичных для биосенсоров и не влияющих на работу генноинженерного Lux-оперона. В дальнейших тестах использовались именно эти концентрации потенциальных протекторов.

Сопоставление результатов биохимического теста на 3.1. активность каталазы и оценки уровня экспресии Kat-оперона в клетках биосенсорного штамма E.coli MG 1655 (pKatG-lux) Чтобы оценить правомерность экстраполяции данных, полученных на генно-модифицированных биосенсорах, на природные системы, был проведен ряд экспериментов по сопоставлению индукции биосенсорного штамма пероксидом водорода и увеличения активности каталазы в его клетках. На рисунках 5-6 представлены результаты данного эксперимента.

активность каталазы, мкМ/мин контроль 10 5·10 10 5·10 10 5·10 концентрация перекиси, М Рисунок 5 – Уровень активности каталазы в культуре E.coli MG (pKatG-lux), активированной рядом концентраций пероксида водорода коэффициент индукции 5·10 10 5·10 10 5·10 10 5·10 концентрация, М Рисунок 6 – Индукция люминесценции штамма E.coli MG 1655 (pKatG lux) рядом концентраций пероксида водорода Как можно видеть из представленных данных, максимальная экспрессия генноинженерной конструкции с промотором pkatG вызывается концентрацией перекиси водорода, в десять раз превышающей концентрацию, вызывающую максимальную индукцию каталазы, измеряемую при помощи биохимической методики (5·10-3 и 5·10-4 М соответственно).

Степень увеличения активности каталазы в обоих случаях значительно различается: если измеренная в биохимическом тесте активность фермента увеличивается в 3,08 раза, то в биолюминесцентном тесте наблюдается усиление экспрессии в 62,7 раз по сравнению с контролем. Для концентрации перекиси, давшей максимальную индукцию в традиционном биохимическом тесте, биолюминесцентный тест выявляет пятнадцатикратное усиление экспрессии. Данные различия определяют большую чувствительность теста, основанного на детекции активности кодирумой плазмидой люциферазы, поставленной под контроль katG промотора, к изменениям внутриклеточной концентрации пероксида водорода. Причины различий чувствительности анализируются в разделе 4.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3.1. контрольных соединений: тролокс, аскорбат, -токоферол На первом этапе исследования была проведена оценка антиоксидантного и антигенотоксического потенциала ряда веществ с известной антиоксидантной активностью, таких, как тролокс, аскорбат, -токоферол, с целью проверки адекватности использованных в работе подходов данной задаче.Была изучена способность тролокса инактивировать суперксид-анион при действии параквата и диоксидина на биосенсорный штамм E. coli MG1655 (pSoxS-lux) (рис. 7-8), способность аскорбата защищать от повреждений ДНК штамма E. coli MG (pRecA-lux) (рис.9), способность токоферола защищать от повреждений ДНК штаммов E.coli MG1655 (pRecA-lux) и E. coli MG1655 (pColD-lux) при действии диоксидина и пероксида водорода (рис.10-12).

14,80* протекторная активность, % 6, 8 6, 0, 10 10 10 концентрация, М Рисунок 7 – Протекторная активность тролокса в концентрациях 10-6 – 10-3 М при действии параквата 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pSoxS-lux). * р0,05 (t-критерий) 22,36 * протекторная активность, % 6, 0,00 0, 10 10 10 концентрация, М Рисунок 8 – Протекторная активность тролокса в концентрациях 10 -6 – 10-3 М при действии диоксидина 2,25·10 -3 М на штамм E. coli MG1655 (pSoxS-lux).* р0,05 (t-критерий) 40, 38, 40 37, 33, протекторная активность, % 26, 23, 25 22, 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 9 – Протекторная активность аскорбата при действии диоксидина в концентрации 2,25·10-5 М на биосенсорный штамм E.coli MG1655 (pRecA lux).р0,05 (t-критерий) Дозы аскорбата выше 10 -3 М значительно подавляют свечение штамма, поэтому на диаграмме не приведены.

50 46, 44,03 44, протекторная активность, % 40, 32, 29,82 29, 28, 28, 30 25, 24,54 23, 13, 0, 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 10 – Протекторная активность токоферола в концентрациях 10 -15 – 10 М при действии диоксидина 2,25·10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pColD lux). Для значений в диапазоне 10-15-10-4 р0,05 (t-критерий) 80 70,44 * протекторная активность, % 70 59,75 * 36,25 * 20,56 * 17, 16, 12, 0, 10 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 11 – Протекторная активность токоферола в концентрациях 10 -9 – 10- М при действии диоксидина 2,25·10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pRecA lux). * - р0,05 (t-критерий) 49, 42, протекторная активность, % 36, 10 10 10 концентрация, М Рисунок 12 – Протекторная активность токоферола в концентрациях 10 -9– 10- М при действии пероксида водорода 5·10-4 М на штамм E. coli MG (pRecA-lux). Для значений в диапазоне 10-9-10-5р0,05 (t-критерий) Как видно из представленных данных, тролокс проявляет в основном низкую антиоксидантную активность в данных модельных системах, при этом эффекты его проявляются в относительно высоких концентрациях – порядка 10-3 М;

эффекты аскорбата лежат в области средних значений, а эффекты токоферола – в области средних и высоких значений протекторной активности, причем проявляются они в гораздо более низких концентрациях (10 -13 для максимальной протекторной активности токоферола, 10 -9 для аскорбата).

3.1.4 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности липофильных катионов Был изучен антиоксидантный и ДНК-протекторный потенциал производного пластохинонилдецилтрифенилфосфония Антимутагенная активность (SkQ1).

данного соединения была показана в биолюминесцентом тесте на штамме E. coli pPLs-1. Для концентрации 10-8 М показана крайне высокая протекторная активность (рис. 13).

94,68 * протекторная активность, % 37,55 * 18,82 * 10 10 концентрация, М Рисунок 13 – Протекторная активность SkQ1 при действии диоксидина в концентрации 2,25·10-3 М на штамм E.coli pPLs-1. * - р0,05 (t-критерий) В экспериментах на Kat-штамме статистически значимой протекторной активности обнаружено не было (рис.14).

коэффициент индукции 5·10 10 5·10 10 5· концентрация, М контроль при добавлении SkQ1 в концентрации 10 М Рисунок 14 – Индукция биолюминесценции штамма E.coli MG (pKatG-lux) перекисью водорода в концентрации 10 -3 М в контроле и в присутствии SkQ1 в концентрации 10-8 М Известно, что обработка бактерий кислородом под давлением вызывает сильную индукцию Это считается следствием роста Sox-оперона.

внутриклеточного уровня супероксид-анион радикала (Фридович, 1979). В экспериментах на штамме, несущем SoxS-промотор, была обнаружена высокая супероксидустраняющая активность, поэтому в дальнейшем эксперименты проводились на этом штамме (рис.15-16).

Было показано, что введение SkQ1 в концентрации 10–5существенно (в среднем на 61,3 %) снижает Sox-индукцию. Статистически значимые эффекты отмечаются и для меньших концентраций, вплоть до 10 –14 М (рис. 17).

интенсивность биолюминесценции, усл.ед.

контроль SkQ ГБО ГБО+SkQ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 время, мин Рисунок 15 – Биолюминесценция штамма E.coli MG1655 (pSoxS-lux) при действии ГБО 0,3 МПа в присутствии SKQ в концентрации 10-5 М интенсивность биолюминесценции, усл.ед. контроль SkQ ГБО ГБО+SkQ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 время, мин Рисунок 16 – Биолюминесценция штамма E. coli MG1655 (pSoxS-lux) при действии ГБО 0,3 МПа в присутствии SKQ в концентрации 10-14 М 70 61,26 * протекторная активность, % 42,03 * 34,92 * 29,87 * 28,35 * 26,10 *26,97 * 18,17 * 13, 13,68 12, 12, 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 концентрация SkQ1, М Рисунок 17 – Протекторный эффект ряда доз SKQ-1 при действии гипербарической оксигенации 0,3 МПа на штамм E.coli MG1655 (pSoxS-lux). * - р0,05 (t-критерий) Короме того, была изучена супероксидустраняющая активность SkQ in vitro (рис.18). Данные теста приведены в условных единицах относительно активности 1 единицы супероксиддисмутазы.


0, 0, 0, 0, СУА, усл.ед.

0, 0, 0, 0, 0, 10 10 концентрация SkQ1, М Рисунок 18 – Супероксид-устраняющая активность SkQinvitro в концентрациях 10-6-10-4 М Таким образом, показано, что SkQ1 в концентрациях 10–4 и 10–5 М проявляет супероксид-устраняющую активность (0,29;

0,46 усл. ед).

Необходимо отметить, что лежащий в основе тест-системы метод определения основан на регистрации «перехвата» супероксид-анион радикала, генерируемого в системе ксантиноксидаза/ксантин. Данная система генерации является одной из широко используемых, однако она рассчитана на детекцию высокой активности, характерной для фермента супероксиддисмутазы.

Чувствительности теста оказалось недостаточно для детекции супероксидустраняющей активности аскорбиновой кислоты (данные не приводятся), которая надежно регистрируется более чувствительными, резонансными методами (Wagner, Таким образом, 2008).

супероксидустраняющую активность SkQ1 по данным теста in vitro можно охарактеризовать как высокую.

В качестве контрольного соединения в данной системе была проверена также активность аскорбиновой кислоты (рис.19).

30,19* 28,44* 27,25* 25,33* протекторная активность, % 17,95* 16,01* 13,78* 5, 10 10 10 10 10 10 10 концентрация аскорбата, М Рисунок 19 – Протекторная активность аскорбата при действии ГБО 0,3 МПа.

* - статистически значимые эффекты (p0,05) Из представленных данных видно, что для SkQ1 характерна более высокая супероксидустраняющая активность как in vitro, так и in vivo.

Минимальная действующая концентрация SkQ1 – 10–14 М, аскорбата–10–11 М.

Максимальный протекторный эффект, достигаемый при помощи SkQ1 – 61,26%, при помощи аскорбата –30,19 %.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3.1. олигопептидов Была изучена протекторная активность четырех олигопептидов, адаптогенные свойства которых показаны в ряде работ Хавинсона В.Х. (2003).

ДНК-протекторный эффект изучался с помощью штамма E.coli (RecA-lux) (рис.20 и 21).

31,65* протекторная активность, % 19, 8, 6, 0,00 0,00 0,00 0, панкраген пинеалон везуген изовилон Рисунок 20 – Протекторная активность пептидов в низких концентрациях при действии УФ311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штамм E. coli MG1655 (RecA lux).* - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 72,93* 67,33* 70 62,74* протекторная активность, % 51,45* 49,56* 50 40 34,03* 26,78* 23, 21,47* 11,39 10, 0, Панкраген Пинеалон Везуген Изовилон Рисунок 21 – Протекторная активность пептидов в низких концентрациях при действии диоксидина в концентрации 2,25·10-5 М на штамм E.coli MG (RecA-lux). * - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) При изучении возможной защиты от УФ-излучения для высоких (10-5-10-3) концентраций протекторного эффекта не наблюдается. В концентрации 10-7 наблюдается незначительный протекторный эффект для нескольких веществ, в концентрации 10-6 – только для изовилон.

При изучении защиты ДНК от действия диоксидина наблюдаются протекторные эффекты для всех пептидов. Для изовилона в концентрации 10- М наблюдается высокая протекторная активность – 72,93%.

Способность олигопептидов инактивировать пероксид водорода, добавленный в среду или генерирующийся под действием УФ-облучения, изучалась при помощи штамма E. coli MG 1655 (KatG-lux) (рис.22 - 24).

19,70 * протекторная активность, % 14, 9, 5 3, панкраген пинеалон везуген Рисунок 22 – Протекторная активность пептидов при действии УФ 311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штаммE.coli MG 1655 (KatG-lux).

* - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 10-4-10- Для концентраций наблюдаются весьма незначительные протекторные эффекты. Для концентрации 10-3 протекторных эффектов нет. Для изовилона эффектов не наблюдалось.

90,18* протекторная активность, % 42,85* 25,00* 23, 9, 8, панкраген пинеалон везуген изовилон Рисунок 23 – Протекторная активность олигопептидов в концентрациях 10-8 10-6 М при действии пероксида водорода в концентрации 10-3 М на штамм E.

coli MG 1655 (KatG-lux). * - р0,05 (t-критерий) 33, протекторная активность, % 19, 20 16, 0, панкраген пинеалон везуген изовилон Рисунок 24 – Протекторная активность олигопептидов в концентрации 10 М при действии пероксида водорода в концентрации 10 -3 М на штамм E. coli MG 1655 (KatG-lux). Все эффекты 0 статистически значимы, р0,05 (t критерий) Для концентраций 10-8-10-6 протекторная активность наблюдается для некоторых веществ, наиболее сильная – для панкрагена в концентрации 10-8 М.

Для концентраций 10-5-10-4 протекторных эффектов не наблюдается.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3.1. бактериальных пробиотических препаратов Была изучена антиоксидантная активность ряда пробиотических препаратов, находящихся в розничной продаже в настоящее время.

Данные по сравнительной эффективности препаратов представлены в таблице 7 и на рисунках 25-27.

Таблица 7 – Сравнительная протекторная активность пробиотиков Максимально Максимальный Препарат Штамм эффективная протекторный концентрация эффект, % E. coli MG1655 pRecA-lux - «Хилак форте»

10- E. coli MG1655 pColD-lux 40, 10- E. coli MG1655 pRecA-lux 9, «Нормазе»

10- E. coli MG1655 pColD-lux 54, 10- E. coli MG1655 pRecA-lux 32, «Споробактерин»

10- E. coli MG1655 pColD-lux 51, 10- «Линекс» E. coli MG1655 pRecA-lux 30, регидратированный 10- E. coli MG1655 pColD-lux 75, в физрастворе 10- «Линекс» E. coli MG1655 pRecA-lux 16, после культивации 10- E. coli MG1655 pColD-lux 84, в среде 10- «Бифиформ» E. coli MG1655 pRecA-lux 48, регидратированный 10- E. coli MG1655 pColD-lux 64, в физрастворе 10- «Бифиформ» E. coli MG1655 pRecA-lux 10, после культивации 10- E. coli MG1655 pColD-lux 66, в среде 10- E. coli MG1655 pRecA-lux 29, «Натто»

10- E. coli MG1655 pColD-lux 78, 48,08* протекторная активность, % 37,35* 35,24* 32,44* 30,55* 29,02* 9, 1 2 3 4 5 6 7 Рисунок 25 – Сравнительная эффективность препаратов при защите от действия диоксидина штамма E. coli MG1655 pRecA-lux. 1-8 – пробиотические препараты (состав указан в разделе «Материалы и методы»). * - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 84, 90 78, 80 68, 67, протекторная активность, % 66, 54, 51, 40, 1 2 3 4 5 6 7 Рисунок 26 – Сравнительная эффективность препаратов при защите от действия диоксидина штамма E. coli MG1655 pColD. 1-8 – пробиотические препараты (состав указан в разделе «Материалы и методы»). Все эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий) Как можно видеть из представленных данных, изученные препараты в широком диапазоне концентраций проявляют в основном слабую либо среднюю протекторную активность в разных участках диапазона доз: от 10 -11 до 10-1.

Препараты, представленные в аптечной форме в сухой порошкообразной форме («Линекс» и «Бифиформ), демонстрируют разную протекторную активность при регидратации в физрастворе и культивировании в среде в течение суток.

В опытах на оба препарата проявляют большую Rec-штамме эффективность при регидратации в физрастворе по сравнению с суточной культурой. В опытах на ColD-штамме оба препарата эффективнее при предварительном культивировании.

Из двух использованных биосенсорных штаммов протекторные эффекты более выражены в экспериментах с E. coli MG1655 pColD. Препарат «Линекс»

проявляет, кроме протекторной, промутагенную активность, стимулируя индукцию свечения биосенсорных штаммов диоксидином.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3. потенциальных адаптогенов в биолюминесцентном тесте Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3.2. экранированных фенолов Была изучена протекторная активность ряда недавно синтезированных соединений из группы экранированных фенолов (рис.27).

* протекторная активность, % * * * 50 * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ионол 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Номер вещества, эффективная концентрация Рисунок 27 – Максимальный протекторный эффект исследованных веществ при действии перекиси водорода (10-3 М) на штамм E. coli MG1655(pKatG-lux). 1 – 14 – соединения из группы экранированных фенолов (структурные формулы приведены в разделе «Материалы и методы»). * р0,05.

Для дальнейших исследований были отобраны два соединения (номера и 7 на рис. 27). Данные о протекторной активности (3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромида (далее - соединение 1) представлены на рис. 28-34. Данные о протекторной активности 3-бис(3',5' дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида (далее – соединение 2) – на рис. 35-41, ионола (в качестве контрольного соединения) - на рис. 42-45.

56, 47, 46, протекторная активность, % 35, 0, 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 28 – Протекторный эффект ряда доз 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии параквата в концентрации 10-3 М на штамм E.coli MG1655 (pSoxS-lux). Все эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

40, 33,39 33, 35, 28, протекторная активность, % 30, 25, 25, 16, 20, 15, 10, 5, 0, 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 29 – Протекторный эффект ряда концентраций 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии перекиси водорода в концентрации 10-3 М на штамм E.coli MG1655 (KatG-lux). Все эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий) 52, протекторная активность, % 32, 27, 23, 18, 16, 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 30 – Протекторный эффект ряда концентраций 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии УФ с длиной волны 258 нм в дозе 810 Дж/м2на штамм E.coli MG1655 (KatG-lux).

Все эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).


65, 61, протекторная активность, % 46, 39, 0,00 0,00 0, 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 31 – Протекторный эффект ряда концентраций 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии диоксидина в концентрации2,25·10 -5 М на штамм E.coli MG1655 (RecA-lux).

Все эффекты 0 статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

32,23 * протекторная активность, % 25 20,31 * 14,56 * 12,93 13,06 * 15 11, 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 32 – Протекторный эффект ряда концентраций 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии УФ с длиной волны 258 нм в дозе 810 Дж/м2на штамм E.coli MG 1655(RecA-lux). * статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий).

50, 48,16 46, 45, протекторная активность, % 10 10 10 концентрация, М Рисунок 33 – Протекторный эффект ряда доз 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии УФ с длиной волны 311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штамм E. coli AB1157 (pRecA lux). Эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0, Как можно видеть из представленных данных, в диапазоне концентраций 10-10-10-7 протекторная активность соединения 1 варьирует в пределах 46-50%, максимальный эффект наблюдается для концентрации 10-7 М и составляет 50, %. Для более высоких концентраций эффекта не наблюдается.

35 30, 26, 25, протекторная активность, % 17, 6, 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 34 - Протекторная активность ряда доз 4(3',5'-дитретбутил-4' гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфония бромида при действии УФ с длиной волны 311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штамм E.coli MG1655 (pKatG lux). В ряду концентраций 10 -8-10-5 эффекты статистически значимы по t критерию, р 0, Как можно видеть из представленных данных, протекторная активность соединения для концентраций 10-9-10-5 в зависимости от концентрации варьирует в пределах 6-31%. Для более низких концентраций эффекта не наблюдается. Для концентрации 10 -8 М наблюдается максимальный эффект, составляющий 30,94 %.

30, 25,58 * протекторная активность, % 25, 20, 15, 10, 5,00 3,03 2, 0,00 0, 0, 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 35 – Протекторная активность ряда доз 3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии пероксида водорода в концентрации 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pKatG lux). * - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 70 60,14 * протекторная активность, % 60 50,56 * 47,15 * 30 23,31 * 21,72 * 5, 0, 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 36 – Протекторная активность ряда доз 3-бис(3',5'-дитретбутил 4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии диоксидина в концентрации 2,25·10-5 М на штамм E.coli AB1157 (pRecA-lux).

* - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 46, 45, протекторная активность, % 34, 29, 0, 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 37 – Протекторная активность ряда доз 3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии параквата в концентрации 10-3 М на штамм E.coli MG1655 (pSoxS-lux). Все эффекты 0 статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

42,52 * протекторная активность, % 19,69 * 14,58 * 9,01 8, 5, 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 38 – Протекторная активность 3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии УФ с длиной волны 258 нм в дозе 810,9 Дж/м2 на штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux).

* - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий).

Как можно видеть из представленных данных, протекторная активность соединения 2 для концентраций 10-10-10-6 в зависимости от концентрации варьирует в пределах 50-20%, для концентрации 10 -5 М наблюдается максимальный эффект, составляющий 42,52 %.

52, протекторная активность, % 33, 31, 29, 18, 20 17, 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 39 – Протекторная активность 3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии УФ с длиной волны 258 нм в дозе 810,9 Дж/м2на штамм Е.coli MG1655 (pKatG-lux).

Эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0,05.

Как можно видеть из представленных данных, протекторная активность соединения 2 растет с увеличением концентрации, с небольшим пиком на 10 -8.

Максимальный эффект наблюдается для концентрации 10 -5 М и составляет 52,22 %.

54, 48, протекторная активность, % 41, 33, 10 10 10 концентрация, М Рисунок 40 – Протекторная активность 3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии УФ с длиной волны 311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штамм E. coli AB1157 (pRecA lux). Эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0,05.

50 43, 35, протекторная активность, % 30, 22, 10 10 10 концентрация, М Рисунок 41 – Протекторная активность3-бис(3',5'-дитретбутил-4' гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида при действии УФ с длиной волны 311 нм в дозе 146,4·10-7 Дж/м2 на штамм Е.coli MG1655 (pKatG lux). Эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0,05.

Как можно видеть из представленных данных, в опытах с Rec-штаммом в диапазоне концентраций 10 -10-10-7 протекторная активность соединения варьирует в пределах 33-55%, максимальный эффект наблюдается для концентрации 10-8 М и составляет 55,74 %. Для более высоких концентраций эффекта не наблюдается. В обпытах с Kat-биосенсором протекторная активность соединения 2 для концентраций 10-8-10-5 в зависимости от концентрации варьирует в пределах 22-43%, для более низких концентраций эффекта не наблюдается. Для концентрации 10-5 М наблюдается максимальный эффект, составляющий 43,15 %.

10-10-10- Изученные вещества в диапазоне концентраций обладают протекторным эффектом, защищая клетки от воздействия как коротковолнового ультрафиолета с длиной волны 258 нм, так и УФ-В с длиной волны 311 нм. Эффект наблюдается как на штамме E. coli AB1157 (pRecA-lux) - индикаторе повреждения ДНК, так и на штамме Е.coli MG1655 (pKatG-lux), реагирующем на перекисные соединения.

Поскольку ионол является простейшим соединением в гомологическом ряду экранированных фенолов, была произведена проверка его протекторных свойств в аналогичной системе биосенсоров и индукторов. Результаты исследования протекторных свойств ионола при действии УФ представлены на рисунках 42-45.

16 13,62 * протекторная активность, % 9, 3, 0,00 0,00 0, 10 10 10 10 10 концентрация ионола, М Рисунок 42 – Протекторная активность ионола при действии УФ с длиной волны 258 нм на штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux). * - статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) 25 21, 19, 18, протекторная активность, % 14, 15 11, 0, 10 10 10 10 10 концентрация ионола, М Рисунок 43 – Протекторная активность ионола при действии УФ с длиной волны 258 нм на штамм Е.coliMG1655 (pKatG-lux). В ряду концентраций 10-8 10-5 эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0, 15, протекторная активность, % 8 6, 3, 0,58 0, 0, 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 44. Протекторная активность ионола при действии УФ с длиной волны 311 нм на штамм Е.coli MG1655 (pKatG-lux). Для концентрации 10- эффекты статистически значимы по t-критерию, р 0,05.

При действии УФ с длиной волны 311 нм на штамм E. coli AB1157 (pRecA lux) протекторной активности ионола не обнаружено. Как можно видеть из представленных данных, протекторная активность ионола относительно УФ значительно ниже протекторной активности соединений 1 и 2 (максимальное значение 21,73% против 55,82% и 60,49% соответственно). Этот эффект согласуется с данными литературы (см. раздел 1.2.2.), согласно которым увеличение количества фенольных остатков усиливает делокализацию электронов в активном центре молекулы, усиливая ее антиоксидантный потенциал.

Кроме того, была исследована активность ионола при действии химических индукторов. Данные (в сравнении с аналогичными для экранированных фенолов) приведены на рисунке 45 и в таблице 8.

93, протекторная активность, % 80, 71, 49, 34, 0,00 0, 10 10 10 10 10 10 концентрация, М Рисунок 45 – Протекторная активность ионола при действии пероксида водорода в концентрации 10-3 М на штамм Е.coli MG1655 (pKatG-lux). Все эффекты 0 статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

При действии диокисидина на Rеc-штамм была обнаружена протекторная активность всего для одной концентрации, однако значение ее является достаточно высоким (см. табл. 8). При действии параквата на Sox-штамм протекторной активности обнаружено не было.

Таблица 8 - Сравнительная активность ионола и экранированных фенолов при действии химических индукторов.

Вещество Индуктор Тип Эффективная Максимальный промотора концентрация, эффект, % штамма М Ионол Паракват Sox - 10- Перекись Kat 93, 10- Диоксидин Rec 67, 10- Соединение 1 Паракват Sox 56, 10- Перекись Kat 33, 10- Диоксидин Rec 65, 10- Соединение 2 Паракват Sox 46, 10- Перекись Kat 25, 10- Диоксидин Rec 60, Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности 3.2. Deinococcus radiodurans Протекторная активность каротиноидной фракции D.radioduransбыла изучена при помощи трех биосенсорных штаммов. Поскольку содержание основного пигмента данного микроорганизма – деиноксантина – не равно 100%, и следует учитывать также влияние других возможных компонентов каротиноидной фракции, концентрации приведены в мкг/мл каротиноидов.

Под действием параквата в концентрации 1х10 -3 М наблюдалась статистически достоверная индукция В присутствии Sox-оперона.

каротиноидов D. radiodurans в концентрациях 0,001-0,1 мкг/мл наблюдалась аналогичная индукция, следовательно, можно сказать, что протекторный эффект каротиноидов D. radiodurans в данном опыте не наблюдался (данные не приведены).

По-видимому, каротиноидная фракция D. radiodurans не обладает супероксид-устраняющей активностью при действии столь активного генератора супероксида, как паракват. В дальнейшем мы прибегли к непрямым методам повышения внутриклеточной генерации супероксида, а именно – к моделированию окислительного стресса на штамме E.сoli MG1655 (pSoxS-lux) путем добавления пероксида водорода и диоксидина.

Протекторная активность при действии на штамм E. coli MG1655 (pSoxS lux) пероксида водорода в концентрации 10-3 М приведена на рисунке 46.

Антиоксидантная активность в данном случае находилась в пределах 24 %.

23,92 * протекторная акитвность, % 14,77 * 8,52 * 5, 0,001 0,01 0,1 концентрация, мкг/мл Рисунок 46 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии пероксида водорода 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pSoxS-lux). * статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий) Данные по протекторной активности при действии на штамм E. coli MG (pSoxS-lux) диоксидина в концентрации 2,25·10-5 М приведены на рисунке 47.

Антиоксидантная активность в данном случае находилась в пределах 64,9 %.

64, протекторная акитвность, % 58, 1 концентрация, мкг/мл Рисунок 47 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии диоксидина в концентрации 2, 25·10 -5 М на штамм E.coli MG (pSoxS-lux)Все эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

При действии параквата на штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux) для оценки антигенотоксической (ДНК-протекторной) активности каротиноидов D.

radiodurans была обнаружена слабая (максимальное значение 28, 14%) активность (рис.48).

28, протекторная акитвность, % 24, 21, 0,1 1 концентрация, мкг/мл Рисунок 48 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии параквата на штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux). Эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

При действии перекиси водорода на штамм E. coli MG1655 (pRecA-lux) для оценки антигенотоксической (ДНК-протекторной) активности каротиноидов D. radiodurans была обнаружена средняя (54,76 %) протекторная активность (рис. 49).

54, протекторная акитвность, % 33, 27, 20, 0,001 0,01 0,1 концентрация, мкг/мл Рисунок 49 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии пероксида водорода 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pRecA-lux).

Эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

При действии на данный штамм диоксидина была обнаружена относительно слабая протекторная активность –35, 97 % (рис.50).

Под действием перекиси водорода в концентрации 1·10 -3 М и параквата в той же концентрации наблюдалась статистически достоверная индукция Kat оперона. В присутствии каротиноидов D. radiodurans в концентрациях 0,001 0,1 мкг/мл достоверной индукции под действием перекиси не наблюдалось, следовательно, можно говорить о 100%-ном подавлении индукции.

Концентрации каротиноидов D. radiodurans 1-10 мкг/мл обладают слабым протекторным эффектом в пределах 20%, что отражено на рисунке 51.

Протекторный эффект при действии параквата достигал 37,18 % (рис. 52).

35, протекторная акитвность, % 28, 25, 25 20, 0,001 0,01 0,1 концентрация, мкг/мл Рисунок 50 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии диоксидина на штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux). Эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

19, протекторная акитвность, % 15, 1 концентрация, мкг/мл Рисунок 51 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии пероксида водорода 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pKatG-lux).

Эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

37,18 * протекторная акитвность, % 7, 1 концентрация, мкг/мл Рисунок 52 - Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии параквата 10-3 М на штамм E. coli MG1655 (pKatG-lux). * статистически значимые эффекты, р0,05 (t-критерий).

Под действием каротиноидов D. radiodurans в концентрациях 1-10 мкг/мл также наблюдалось подавление индукции люминесценции штамма E. coli C (pPls-1) n-метилнитрозогуанидином в концентрации 1х10-5 М. Максимальное значение протекторной активности достигало 38,7% для концентрации 10 мкг/мл (рис.53).

45 38, протекторная акитвность, % 30 24, 1 концентрация, мкг/мл Рисунок 53 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии n-метилнитрозогуанидина в концентрации 1х10-5 М на штамм E.

coliC 600 (pPls-1). Эффекты статистически значимы, р0,05 (t-критерий).

Кроме того, была изучена способность каротиноидной фракции D.

radiodurans защищать клетки от генотоксических эффектов УФ-излучения (рис.54), а также от окислительного стресса, и генерации пероксида водорода (рис. 55), являющегося, согласно ранее полученным данным (Празднова, 2012), основным интермедиатом этих эффектов при действии УФ с длиной волны 300 400 нм.

55, протекторная активность, % 31,03 30, 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл концентрация Рисунок 54 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии УФ 300-400 нм в дозе 3000 Дж/м2 (доза поверхностная)на штамм E. сoli AB 1157 (pRecA-lux). Эффекты статистически значимы, р0, (t-критерий) 64, протекторная активность, % 50 41, 11, 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл Рисунок 55 – Протекторная активность каротиноидов D. radiodurans при действии УФ 300-400 нм в дозе 3000 Дж/м2 (доза поверхностная) на штамм E.

coliMG 1655 (pKatG-lux). Эффекты статистически значимы, р0,05 (t критерий) Как видно из представленных данных, для концентрации 10 мкг/мл в обоих тестах наблюдается средняя протекторная активность.

Оптимизация параметров культивирования 3.3 Deinococcus radiodurans для экстракции каротиноидов На рисунке представлены результаты опыта по экстракции каротиноидов из жидкой культуры Deinococcus radiodurans.

В таблице 9 представлены результаты сравнительного анализа выхода каротиноидов на единицу биомассы. Как можно видеть из представленных данных, применение оптимизированных параметров культивирования повышает прирост биомассы и выход каротиноидов по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде МПА.

2, 1, 1,85 1, 1, 1, г/л биомасса, г/л 1,0 0, 0, 0,8 каротиноиды, г/л 0, 0, 0, Соевая среда, Соевая среда, Соевая среда, Mg Соевая среда, МПА, 37°С рН=6,5 глюкоза 5 г/л 5·10-2 г/л 25°С Рисунок 56 – Прирост биомассы и выход каротиноидов при культивировании Deinococcus radiodurans в среде с оптимизированными параметрами.

Таблица 9 – Количество каротиноидов на единицу биомассы при культивировании Deinococcus radiodurans в среде с оптимизированными параметрами.

Соевая Соевая Соевая Соевая Условия среда, МПА, среда, среда, Mg среда, культивирования глюкоза 5 37°С 5·10-2 г/л рН=6,5 25°С г/л Выход каротиноидов на 0,44 0,51 0,52 0,36 0, 1 г биомассы, г Максимальное содержание каротиноидов на 1 мл культуры наблюдается при добавлении 5 г/л глюкозы и равняется 1,0 г/л. Максимальное содержание каротиноидов на 1 г биомассы наблюдается при добавлении Mg в концентрации 5·10-2 г/л и составляет 0,52 г. Таким образом, для повышения эффективности выхода каротиноидов можно рекомендовать применять вышеуказанные параметры.

Изучение антимутагенной активности каротиноидов 3. D.radiodurans Эксперименты показали, что диоксидин является мощным индуктором мутаций устойчивости к рифампицину у Е. coli. Максимальный мутагенный эффект зарегистрирован для концентрации 2,25·10-5 М, дающий максимальный Rec-ответ в тесте на биосенсорах. Для этой концентрации наблюдалось повышение частоты мутаций в 12,5 раз по сравнению с контролем.

Концентрации 1,125·10-5 М, 2,25·10-6 М, 1,125·10-6 М при анализе частоты рифампицин-резистентных мутантов статистически достоверных отличий от контроля не демонстрировали.

Данные по антимутагенной активности каротиноидов D.radiodurans представлены на рис. 57.

70 63, КОЕ/мл 30, 9, 10 4, 3, 1 2 3 4 Рисунок 57 – Количество Rifr мутантов на мл культуры (108 клеток) в присутствии диоксидина и каротиноидов D. radiodurans. 1- контроль, 2 – в присутствии 15,5 мг/л каротиноидов D. radiodurans;

3 – в присутствии диоксидина 2,25·10-5 М;

4 – в присутствии диоксидина и каротиноидов D.radiodurans 1,55 мг/л;

5 - в присутствии диоксидина и каротиноидов D.radiodurans 15,5 мг/л.

Было показано, что экстракт каротиноидов D. radiodurans статистически значимо снижает как частоту спонтанного мутагенеза, так и частоту мутаций, индуцированных диоксидином - на 85,9 % по сравнению с контролем для концентрации 15,5 мг/л и на 53,2 % для концентрации 1,55 мг/л.

Изучение влияния каротиноидов Deinococcus radiodurans на 3. динамику заживления ран у млекопитающих Динамика уровня глюкозы в крови мышей CD-I при 3.5. моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне перорального введения каротиноидов Основным показателем при оценке сахарного диабета является гликемия.

Исходный уровень глюкозы во всех экспериментальных группах составил 6,2±1,3 мМ/л (n=80).

В ходе эксперимента установлено, что уже на 5 сутки при стрептозоцин индуцированном диабете наблюдается некоторое повышение уровня глюкозы (на 30%, р0,05). Максимально высокий средний уровень глюкозы в крови животных наблюдался через 10 дней после курсового введения стрептозоцина – 17,2±2,8 мМ/л, что почти в 2,8 раза (р0,001) превышало концентрацию глюкозы в крови мышей из контрольной группы. В последующем, наблюдается некоторое снижение уровня гликемии, к 20 суткам до 16,1±2,2 (р0,001), что тем не менее почти в 2,6 раза выше показателей контрольной группы (рис. 58).

мМ/л Исх. уровень 5 сут. после 10 сут. после 20 сут. после введения введения введения стрептозоцина стрептозоцина стрептозоцина Стрептозоцин Контроль Рисунок 58 – Динамика изменения уровня глюкозы в ходе выработки стрептозоцинового сахарного диабета (n=80) Также было проведено исследование изменения содержания глюкозы в крови животных с стрептозоцин-индуцированным СД при пероральном введение каротиноидной фракции D. radiodurans и ликопина в дозах 125 и мкг/кг в сутки. В результате не обнаружено статистически значимых различий между уровнем глюкозы в крови животных, получавших перорально оливковое масло (группа контроля) и в крови животных, которым peros вводили каротиноиды D. radiodurans (р0,05;



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.