авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук

На

правах рукописи

РЕПКИНА Наталья Сергеевна

ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ

К РАЗДЕЛЬНОМУ И СОВМЕСТНОМУ ДЕЙСТВИЮ

НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КАДМИЯ

03.02.08 – экология 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:

доктор биологических наук Таланова Вера Викторовна Петрозаводск – СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Влияние низких температур и кадмия на растительный организм 1.2. Механизмы адаптации растений к действию низких температур 1.3. Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Реакция растений пшеницы на раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия 3.1.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы 3.1.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на холодоустойчивость растений пшеницы 3.1.3. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на проницаемость мембран листьев растений пшеницы 3.2. Динамика накопления транскриптов генов в листьях пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия 3.2.1. Гены транскрипционных факторов 3.2.2. Гены COR/LEA белков 3.2.3. Гены протеолитических ферментов 3.3. Роль низкомолекулярных защитных соединений в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и сульфата кадмия 3.3.1 Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание непротеиновыхтиолов в листьях пшеницы 3.3.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание свободного пролина в листьях пшеницы ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Во многих регионах мира дефицит тепла, обусловлен ный низкими температурами воздуха и почвы, выступает главным фактором, лимитирующим рост, развитие и продуктивность растений (Туманов, 1979;

Дроздов и др., 1984;

Коровин, 1984;

Xin, Browse, 2000;

Sung et al., 2003;

Тру нова, 2007;

Колупаев, Карпец, 2010;

Войников, 2013). В последние годы к неблагоприятным природно-климатическим факторам добавляется возраста ющее техногенное воздействие на биосферу, которое обуславливает загряз нение окружающей среды тяжелыми металлами, в том числе и высокоток сичным для всех живых организмов кадмием (Титов и др., 2007;

Лукаткин, Башмаков, 2009). Поэтому сохранение жизнеспособности растений в этих условиях требует мобилизации всех имеющихся у них адаптивных механиз мов.

Как показывают исследования, растения обладают целым комплексом адаптационных механизмов, которые реализуются на разных уровнях орга низации – от молекулярного до организменного, в том числе связанных с ин дукцией экспрессии большого числа генов и синтеза соответствующих бел ков (Levitt, 1980;

Шакирова, 2001;

Чиркова, 2002;

Yamaguchi-Shinozaki, Shi nozaki, 2006;

Ouellet, 2007;

Guy et al., 2008;

Кошкин, 2010;

Theocharis et al., 2012). Некоторые из этих механизмов специфичны в отношении того или иного воздействующего фактора, в то время как другие являются общими (неспецифичными) для разных факторов. Последнее обуславливает способ ность растений при действии одного неблагоприятного фактора повышать устойчивость к факторам иной природы (явление кросс-адаптации) (Титов и др., 1983;

Кузнецов и др., 1990;

Gong et al., 2001;

Guang, Gong, 2011;

Радюки на и др., 2012). Однако, механизмы кросс-адаптации остаются все еще не яс ными.

Необходимо отметить, что в большинстве случаев исследователи изуча ют механизмы адаптации растений к действию одного конкретного неблаго приятного фактора, а работы, посвященные изучению комбинированного (совместного или последовательного) действия факторов разной природы на растения пока единичны (Гармаш, Головко, 2009;

Hu et al., 2010;

Iqbal, Ashraf, 2010;

Grigorova et al., 2011;

Al-Issawi et al., 2013). В природных же условиях неблагоприятные факторы действуют на растения, как правило, од новременно, а их ответные реакции на совместное действие факторов, в том числе низких температур и тяжелых металлов, могут заметно отличаться от эффектов, вызываемых действием каждого из них. Однако, работы, направ ленные на изучение механизмов их совместного действия на растения в из вестной нам литературе, отсутствуют.

Учитывая это, исследование механизмов адаптации растений (на орга низменном и клеточном уровне) не только к раздельному, но и совместному действию низкой температуры и тяжелых металлов является весьма актуаль ным.

Цель работы: исследование ряда эколого-физиологических механизмов адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить реакцию растений пшеницы на действие низкой температу ры, кадмия и их совместное действие по ряду физиолого-биохимических по казателей (биометрические показатели, холодоустойчивость, проницаемость мембран).

2. Охарактеризовать динамику накопления транскриптов генов тран скрипционных факторов в листьях растений пшеницы при раздельном и сов местном действии низкой температуры и кадмия.

3. Выявить особенности накопления транскриптов генов, кодирующих COR/LEA белки и протеолитические ферменты, в листьях растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и кадмия.

4. Оценить роль непротеиновых тиолов (глутатиона и фитохелатинов) в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному дей ствию низкой температуры и кадмия.

5. Исследовать роль низкомолекулярного осмопротектора и антиокси данта – свободного пролина – в процессах адаптации растений к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.

Новизна работы: Впервые показано, что повышение холодоустойчиво сти растений пшеницы происходит не только при низкой закаливающей тем пературе, но и под влиянием кадмия, хотя и в меньшей степени. Впервые об наружено, что накопление транскриптов генов транскрипционных факторов (CBF1, DREB1, MYB80), АТФ-зависимых протеолитических ферментов (Lon1, ClpP), LEA белков (WCOR15,WRAB15, WRAB18, WDHN13) происходит как при раздельном, так и совместном действии низкой температуры и кад мия. В отличие от этого, аккумуляция мРНК COR гена WCS120 более харак терна для реакции растений пшеницы на воздействие низкой температуры.

Впервые полученные данные о повышении содержания низкомолекулярных антиоксидантов (глутатиона и свободного пролина) и фитохелатинов, а также о накоплении транскриптов генов, кодирующих ферменты их синтеза (GS1, WP5CS, PCS1) не только при раздельном, но и совместном действии низкой температуры и кадмия в листьях растений пшеницы, указывают на их уча стие в механизмах адаптации к действию этих неблагоприятных факторов.

Практическая значимость работы. Полученные данные углубляют и расширяют имеющиеся в настоящее время представления об участии генов и белков транскрипционных факторов, COR/LEA белков, протеиназ, фермен тов синтеза пролина, глутатиона и его производных в механизмах адаптации растений к раздельному и совместному действию низких температур и кад мия. Полученные сведения могут быть использованы при организации даль нейших физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследова ний устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Результаты исследований могут быть использованы при чтении ряда спецкурсов для сту дентов экологических, физиологических, биохимических специальностей.

Полученные данные включены в учебное пособие "Устойчивость растений к действию тяжелых металлов и экспрессия генов".

Личный вклад автора в получении научных результатов. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в ста тистической обработке и интерпретации полученных результатов, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились с 2011 по 2013 гг. в соответствии с планом НИР ИБ КарНЦ РАН, являясь ча стью плановой темы "Физиолого-биохимические и молекулярно генетические механизмы реакции растений на действие неблагоприятных температур и тяжелых металлов" (№ гос. рег. 01201166444), при поддержке грантов РФФИ № 10-04-00650-а и ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг. № соглашений 8050 и 14.21.132.1321.

Благодарности. Автор выражает глубокую сердечную благодарность научному руководителю д.б.н. В.В. Талановой за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации. Самые теплые слова благодарности руково дителю и сотрудникам лаборатории экологической физиологии растений чл. корр. РАН, проф., д.б.н. А.Ф.Титову, к.б.н. Н.М. Казниной, к.б.н. Ю.В. Бато вой, к.б.н. Ю.В. Венжик, к.б.н. В.В.Лавровой, к.б.н. Е.Г. Шерудило за мето дическую помощь и рекомендации при обсуждении материалов, а также со труднику лаборатории генетики к.б.н. Л.В. Топичевой за помощь в постанов ке экспериментов.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Влияние низких температур и кадмия на растительный организм В естественных условиях обитания все живые организмы неотъемлемо связаны с окружающей средой. Свойства среды постоянно меняются и ее воздействие на растения воспринимается через экологические факторы, в том числе абиотические (совокупность факторов неорганической среды), биоти ческие (связанные с влиянием живых организмов) и антропогенные (влияние на окружающую среду деятельности человека) (Маглыш, 2001;

Чернова, Бе лова, 2004;

Тягунова, Ярошенко, 2005;

Коробкин, Передельский, 2007;

Бере зина, Афанасьева, 2009;

Дроздов, 2011).

Несмотря на многообразие экологических факторов и характера их воз действия на организм, выявлены некоторые общие закономерности. Для ор ганизма в целом или определенной стадии его развития существует диапазон наиболее благоприятных (оптимальных) значений действующего фактора, за пределами зоны оптимума находятся зоны толерантности, переходящие в критические точки, за которыми наступает гибель организма (Чернова, Бело ва, 2004;

Коробкин, Передельский, 2007). Представители разных видов рас тений отличаются друг от друга как по положению оптимума, так и по эколо гической толерантности (пределы выносливости, ограниченные критически ми точками) (Березина, Афанасьева, 2009).

Факторы, которые ограничивают развитие организмов из-за недостатка или избытка по сравнению с оптимальным значением относят к лимитирую щим или ограничивающим (Коробкин, Передельский, 2007). Одним из таких факторов, лимитирующих распределение и продуктивность растений являет ся низкая температура (Туманов, 1979;

Удовенко, 1979;

Дроздов и др., 1984;

Коровин, 1984;

Чернова, Белова, 2004;

Трунова, 2007;

Колупаев, Карпец, 2010;

Гончарова Э.А., 2011;

Войников, 2013;

Марковская и др., 2013).

Температура относится к абиотическим факторам среды физической природы. Колебания температуры среды могут быть значительными в зави симости как от времени суток, так и сезонна (Тягунова, Ярошенко, 2005;

Дроздов, 2011). Диапазон температур, пригодных для жизни, достаточно ши рок, около 150 °С (Озернюк, 2003). В частности, рост побегов растений уме ренной зоны происходит при температурах 1–25 °С, тогда как для растений тропиков и субтропиков более благоприятны температуры 30–40 °С. Прорас тание семян также зависит от температур, например, семена растений уме ренной зоны лучше прорастают при 8–20°С, а тропических растений – при 15–30 °С (Лархер, 1978).

В зависимости от широты экологической толерантности вида по отно шению к абиотическим факторам, в частности, к температурам, выделяют эвритермные виды, способные переносить значительные колебания темпера тур и стенотермные, характеризующиеся узким диапазоном толерантности (Лархер, 1978;

Дроздов, 2011). Адаптационный потенциал видов ограничен и некоторые из них не способны приспособиться к неблагоприятным темпера турам (Озернюк, 2003).

Растения относятся к пойкилотермным организмам, однако температура надземной части может значительно отличатся от температуры воздуха (Дроздов, 2011).

Температура, являясь одним из глобальных экологических факторов, влияет на численность, разнообразие и распределение видов в разных гео графических широтах и воздействует на все процессы жизнедеятельности растений (Лархер, 1978). В частности, низкие температуры вызывают тормо жение ростовых процессов растений, что связано с их влиянием на процессы деления и растяжения (Родченко и др., 1988;

Кошкин, 2010). Наряду с этим, установлено их отрицательное воздействие и на другие физиолого биохимические процессы, в том числе реакции фотосинтеза (Pocock et al., 2001;

Кошкин, 2010;

Theocharis et al., 2012). Показано, что уменьшение ин тенсивности фотосинтеза прямо пропорционально понижению температуры и продолжительности ее действия, что связано с отрицательным влиянием холода на активность ферментов цикла Кальвина, потерей тургора, уменьше нием внутриклеточной концентрации CO2, ингибированием флоэмного транспорта углеводов из листьев и нарушением биосинтеза хлорофилла (Чиркова, 2002;

Кошкин, 2010). В зависимости от интенсивности и продол жительности действия низких положительных температур может происхо дить как стимулирование, так и ингибирование интенсивности дыхания (Чиркова, 2002;

Кошкин, 2010). Действие холода также вызывает снижение активности дыхательных ферментов, нарушение электрон-транспортной це пи и активацию альтернативного пути дыхания. Низкие температуры оказы вают негативное действие на водный обмен растений, связанное с довольно быстрым снижением водного и осмотического потенциала, а также тургора клетки, что приводит к снижению поглощения воды (Кошкин, 2010). Отри цательное воздействие низкие температуры оказывают и на минеральное пи тание, ограничивая поступление и распределение ионов по растению. Низкие температуры, влияют и на ультраструктуру клеток (Климов и др., 1997, Тру нова, 2007) – вызывают структурные изменения плазмалеммы, цитоскелета хлоропластов и митохондрий (Трунова, 2007;

Solanke, Sharma, 2008;

Кошкин, 2010). Необходимо отметить, что действие холода приводит к изменению со стояния мембран, при этом происходит повышение их проницаемости, что связано с потерей ионов кальция и растворенных веществ, обратному по ступлению которых препятствует ограниченная эластичность плазмалеммы (Чиркова, 2002). Изменения происходят и в составе фосфолипидов и стеро лов, возрастает уровень свободных жирных кислот (Чиркова, 2002;

Трунова, 2007;

Кошкин, 2010). Влияние низких температур приводит к усилению накопления свободных радикалов, что может свидетельствовать об усилении перекисного окисления липидов (Чиркова, 2002).

Низкие температуры могут оказывать и стимулирующее действие на растения. Например, длительное воздействие холода в зимний период, явля ется пусковым фактором обновления фотосинтетического аппарата (Миро славов, 1994). Воздействие низких температур необходимо для прорастания семян некоторых растений и перехода ряда видов к стадии цветения и полно го завершения жизненного цикла (Березина, Афанасьева, 2009).

В связи с интенсивным развитием промышленности и автотранспорта, к воздействию климатических факторов на растительные организмы добавля ется и антропогенное загрязнение окружающей среды. Комплексная оценка экологической ситуации в России показала, что около 40% территории стра ны характеризуется высокой или средней экологической напряженностью, вызванной загрязнением окружающей среды (Гичев, 2002).

Существует достаточно много видов загрязняющих веществ, которые подразделяют на химические, физические и биологические (Коробкин, Пере дельский, 2007). Среди наиболее опасных загрязнителей окружающей среды, оказывающих негативное воздействие на все живые организмы выделяют:

диоксид серы, канцерогенные вещества, нефть и нефтепродукты, оксиды уг лерода и азота, радионуклеотиды и тяжелые металлы (в первую очередь сви нец, кадмий и ртуть) (Коробкин, Передельский, 2007). К последним относят ся химические элементы, имеющие плотность больше 5 г/см3 и атомную мас су более 40 Да (например, Co, Cd, Pb, Hg, Sb и др.) (Кузнецов, Дмитриева, 2013), которые могут приводить к загрязнению окружающей среды в гло бальном масштабе (период их полураспада составляет месяцы, года) (Манан ков, 2010).

Поступление тяжелых металлов в окружающую среду может происхо дить как естественным путем, так и в результате деятельности человека (Ка бата-Пендиас, Пендиас, 1989). К природным источникам поступления тяже лых металлов относятся горные породы, вулканы и др., к техногенным ис точникам – интенсивное развитие металлургической, химической промыш ленности, транспорта, сельскохозяйственной деятельности (Титов и др., 2007).

За последние годы, площадь загрязнненых тяжелыми металлами земель, в том числе сельскохозяйственного использования, значительно возрасла во многих странах, в том числе и в России. В частности, более 11% территорий жилых поселений опасно загрязнены различными соединениями тяжелых металлов (Яблоков, 2007). Тяжелые металлы являются высокотоксичными элементами для всех живых организмов, так как они способны проникать в клетки и образовывать прочные соединения, связываясь с SH-группами бел ков и как следствие приводить к инактивации ферментов (Титов и др., 2007).

Из окружающей среды, тяжелые металлы могут поглощаться растениями и далее по пищевым цепям поступать в организм животных и человека, где накапливаются и способны сохранять свое токсическое действие в течение длительного времени.

По способности накапливать тяжелые металлы растения подразделяются на аккумуляторы (накапливающие тяжелые металлы главным образом в надземных органах), индикаторы (содержание металла в них отражает его концентрацию в окружающей среде), исключители (накапливающие металл в корнях, ограничивая его поступление в надземную часть) (Baker, 1981). На уровне целого растения содержание металла от корня к соцветиям уменьша ется, что ограничивает их поступление в репродуктивные органы (Титов и др., 2007).

Необходимо отметить, что среди тяжелых металлов кадмий является од ним из наиболее токсичных элементов, оказывающих негативное воздей ствие на важнейшие физиологические и биохимические процессы жизнедея тельности растений (Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999;

Gallego et al., 2012). Кад мий является высоко мобильным элементом и характеризуется высоким сродством к сере, чем обуславливается его токсическое действие на живые организмы (Paralta-Videa et al., 2009;

Gallego et al., 2012). В повседневной жизни кадмий и его соединения широко используются как антикоррозийные покрытия, крепежные детали, при изготовлении батареек и производстве пластмасс, красок и др. При попадании в организм человека кадмий приво дит к необратимым нарушениям дыхательной, мочеполовой и других систем, при этом он медленно выводится из организма и соханяет свое токсическое действие в течение длительного времени (Титов и др., 2012).

Тяжелые металлы поступают в растения как из почвы, так и из воздуха (Виноградов, 1985;

Кошкин, 2010). Поступление металлов в корневую систе му растения может происходить как пассивно (по градиенту концентрации), так и активно (против градиента концентрации) (Costa, Morel, 1994). Погло щение ионов металлов листьями включает проникновение через кутикулу (неметаболический путь) и перенос ионов через плазматические мембраны и протопласт клеток (метаболический путь) (Kannan, 1980).

Как и любой другой неблагоприятный фактор среды, тяжелые металлы негативно влияют на физиологические процессы растений, включая, рост, фотосинтез, дыхание, водный обмен, минеральное питание и др. (Титов и др., 2007;

Кошкин, 2010;

Кузнецов, Дмитриева, 2013). Они напрямую ингибиру ют деление и растяжение клеток (Sandalio et al., 1999;

Sanita di Toppi, Gabbri elli, 1999;

Серегин, Иванов, 2001). Показано, что при действии металла в вы соких концентрациях увеличивается продолжительность митотического цик ла и замедляется интенсивность клеточных делений (Бессонова, 1991, Сере гин, Иванов, 2001;

Титов и др., 2007). Тяжелые металлы также влияют и на эластичность клеточных стенок, что приводит к нарушению роста растяже нием (Иванов и др., 2003;

Галибина, Теребова, 2008). Однако, в низких кон центрациях они могут стимулировать ростовые процессы растений (Титов и др., 2007). Действие тяжелых металлов на растения вызывает инактивацию многих ферментов, что приводит к нарушениям физиологических процессов (Кошкин, 2010). В частности, при действии тяжелых металлов происходит подавление биосинтеза хлорофилла (Molas,1997;

Souza, Rauser, 2003). Ионы тяжелых металлов оказывают влияние и на ультраструктуру хлоропластов, что может приводить к снижению содержания пигментов и уменьшению ин тенсивности фотосинтеза (Molas,1997). Отрицательное действие тяжелых ме таллов на фотосинтез связано с их негативным действием на световые и тем новые реакции фотосинтеза и структуру фотосистем (Siedleska, Krupa, 1996;

Krupa, Baszynski, 1995;

Sandalio et al., 2001). В высоких концентрациях тяже лые металлы отрицательно воздействуют на процессы дыхания растений, что связано с изменением активности дыхательных ферментов (Van Asscvhe, Clijsters, 1990), нарушением проницаемости мембран митохондрий (Prasad et al., 2001) и функционирования электрон-транспортной цепи (Miller et al., 1973). При высоких концентрациях происходит нарушение водного обмена, в частности, изменение относительного содержания воды в тканях, водного потенциала и транспирации, уменьшение количества и диаметра проводящих сосудов (Kastori et al., 1992;

Сазонова, 2007). Между тяжелыми металлами и другими минеральными элементами возможны как антагонистические, так и синергетические взаимодействия, что приводит к ингибированию поступле ния питательных веществ или повышению уровня того или иного элемента, что в целом приводит к дисбалансу минерального питания (Титов и др., 2007).

В целом, воздействие тяжелых металлов приводит к целому комплексу анатомических, морфологических и биохимических изменений в растениях (Кузнецова и др., 2008;

Нестеров и др., 2009;

Розенцвет и др., 2010;

Теребова, Галибина, 2010).

Как отмечалось выше, все факторы среды действуют на растения, как правило, комплексно. При этом один фактор может усиливать или ослаблять действие другого (Маглыш, 2001). В частности, климатические факторы мо гут влиять на распространение загрязнителей окружающей среды, например, при высоких температурах газовые выбросы в атмосферу распространяются на бльшие расстояния (Мананков, 2010). В настоящее время имеются лишь единичные работы, посвященные влиянию совместного или последователь ного действия разных факторов на растения. Установлено, что механические воздействия (порывы ветра, порез или касание растения и др.) способно по вышать устойчивость растений к разным абиотическим и биотическим фак торам (экстремальные температуры, засоление, засоление и др.) (Li, Gong, 2011). В частности, в культуре суспензии клеток растений табака оно приво дило к повышению их устойчивости к низким и высоким температурам (Li, Gong, 2008;

Li, Gong, 2013). Совместное неповреждающее действие высокой температуры и засухи способствовало выживанию растений кукурузы и пер ца в данных условиях (Liu et al., 2013;

Wang, et al., 2003). Показано, что пред посевная обработка семян низкой температурой приводила в дальнейшем к повышению солеустойчивости растений пшеницы (Iqbal, Ashraf, 2010).

Предварительное действие высокой температуры на проростки риса повыша ло их устойчивость к последующему действию хлорида кадмия (Chao, Kao, 2010), также как и предобработка проростков пшеницы микроволновым из лучением (Qiu et al., 2011). Воздействие низкой температуры на проростки пшеницы и арабидопсиса приводило к повышению их устойчивости к свинцу (Титов, Таланова, 2009;

Cao et al., 2010). Такой же эффект оказывали высокие закаливающие температуры на проростки пшеницы (Таланова и др., 1996;

Титов и др., 2003). Установлено, что действие УФ-радиации способствовало поддержанию жизнедеятельности растений огурца при высоких температу рах (Knigh, 2000). У ряда лекарственных растений (полыни, базилика, чер нушки) предварительная обработка УФ-радиацией снижала негативный эф фект засоления (Радюкина и др., 2012).

Предполагается, что в повышении устойчивости растений к последова тельному или совместному действию неблагоприятных факторов среды важ ную роль играет активация антиоксидантных ферментов, синтез белков шаперонов или накопление низкомолекулярных аминокислот (Hu et al., 2010;

Grigorova et al., 2011;

Радюкина и др., 2012;

Cvikrova et al., 2013;

Liu et al., 2013). Тем не менее, механизмы адаптации растений к комплексному дей ствию неблагоприятных факторов разной природы остаются малоизученны ми.

В связи с этим необходимы дальнейшие исследования механизмов кросс-адаптации растений (явления, когда воздействие одного фактора при водит к повышению устойчивости к фактору иной природы).

1.2. Механизмы адаптации растений к действию низких температур Низкая температура относится к факторам, ограничивающим распреде ление и продуктивность растений (Туманов, 1979;

Дроздов и др., 1984;

Коро вин, 1984;

Xin, Browse, 2000;

Трунова, 2007;

Колупаев, Карпец, 2010). Расте ния ведут прикрепленный образ жизни и являются пойкилотермными орга низмами, в связи с чем они не могут активно избегать действие неблагопри ятных температур. В ходе эволюции растения приобрели целый комплекс адаптивных реакций, проявляющихся на разных уровнях организации (Куз нецов, 2001), включая усиление экспрессии ряда генов, кодирующих протек торные белки (Sung et al., 2003;

Chinnusamy et al., 2006, 2007;

Gorsuch et al., 2010;

Erikson, Webb, 2011;

Heidarvand, Maali-Amiri, 2013), изменение уль траструктуры клеток (Мирославов, 1994;

Климов и др., 1997), а также пере стройку биохимических реакций (Chen, 1994;

Трунова, 2007;

Zhu et al., 2007;

Shulze et al., 2012), что в целом приводит и к изменениям на организменном уровне.

В настоящее время установлены адаптивные изменения ультраструкту ры клеток при низкотемпературном воздействии у морозостойких растений – уменьшение объема вакуоли, разрастание цитоплазмы, увеличение мембран ных элементов (Kratsch, Wise, 2000;

Трунова, 2007). Хлоропласты адаптиро ванных растений характеризуются большим количеством тилакоидов, отсут ствием крахмальных зерен и увеличением пластоглобул (Трунова, 2007).

Наблюдается и изменение формы митохондрий, образование гантелевидных, чашевидных, с чем может быть связана высокая степень энергетического об мена (Чиркова, 2002).

При действии низких температур происходят значительные биохимиче ские преобразования. Показано, что у морозостойких растений интенсив ность фотосинтеза при околонулевых температурах превышает интенсив ность дыхания (Климов и др., 2003;

Трунова, 2007), это приводит к накопле нию сахаров (Hurry et al., 1995;

Gusta, Whsniewski, 2012) и других криопро текторных соединений, таких как пролин, глицинбетаин, многоатомные спирты (Чиркова, 2002;

Smallwood, Bowler, 2002;

Schulze et al., 2012). У мо розоустойчивых растений усиливается синтез крахмала (Чиркова, 2002). Об наружено, что большая доля растворимых сахаров локализована в цитозоле, вакуоли и ряде органелл (Koster, Lynch, 1992;

Трунова, 2007). Сахара обла дают полифункциональным действием в клетке, в частности играют важную осморегуляторную, криопротекторную роль, обладают антифризными свой ствами (Трунова, 2007). Сахара участвуют в стабилизации клеточных мем бран разных органелл клетки, также как и в передаче низкотемпературного сигнала (Чиркова, 2002;

Климов и др., 2008).

При адаптации растений к низким температурам происходит общее по вышение мембранных липидов, в частности фосфатидилхолинов (Трунова, 2007). Обнаружено, что содержание фосфолипидов увеличивается по отно шению к белкам (Новицкая и др., 2000). Важную роль играет повышение концентрации ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов, что по вышает текучесть липидного бислоя (Трунова, 2007).

Как отмечалось ранее, воздействие низкой температуры может приво дить к накоплению активных форм кислорода, в ответ на это повышается ак тивность антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксид дисмутазы) и содержания глутатиона (Кошкин, 2010;

Xu et al., 2010;

Крес лавский и др., 2012).

Важную роль в механизмах адаптации растений к действию низких тем ператур играют антифризные белки, которые взаимодействуют с кристалами льда, влияя на их морфологию и размер, а также обладают термальным ги стерезисом, благодаря чему температуры замерзания и таяния не совпадают (Трунова, 2007). Наряду с повышением содержания антифризных белков наблюдается накопление дегидринов, аквапоринов и белков холодового от вета (Gilmour et al., 1998;

Houde et al., 1992;

Choi et al., 1999;

Аллагурова и др., 2004;

Бужко и др., 2004;

Hara, 2010). В частности, наблюдается накопле ние гидрофильных, осмопротекторных белков – дегидринов, принадлежащих к LEA (Late Embryogenesis Abundant) белкам (Hong-Bo et al., 2005;

Колесни ченко, Войников, 2003;

Войников, 2013). Они предотвращают агрегацию белков (Goyal et al., 2005) и препятствуют потере воды клеткой, стабилизируя клеточные мембраны при обезвоживании (Danyluk et al., 1998;

Колесниченко, Войников, 2003;

Tolleter et al., 2007;

Войников, 2013). При действии холода происходит также накопление гидрофильного белка холодового ответа – COR15 (Crosatti et al., 1999;

Thomashow, 1999;

Takumi et al., 2003;

Xin, Browse, 2006;

Трунова, 2007), который повышает криостабильность мембран (Колесниченко, Войников, 2003;

Трунова, 2007;

Кузнецов, Дмитриева, 2013), предотвращая переход из ламеллярной в гексагональную фазу (Колесничен ко, Войников, 2003;

Трунова, 2007).

В настоящее время активно исследуется экспрессия разных групп генов, продукты которых участвуют в адаптации растений к действию низкой тем пературы.

Установлено, что при низких температурах происходит повышение экс прессии генов, кодирующих многие транскрипционные факторы. Тран скрипционные факторы играют ключевую роль в сигнальных путях и адап тации растений к действию неблагоприятных факторов среды, за счет нали чия специфических ДНК-связывающих доменов они способны регулировать (активировать или подавлять) экспрессию генов (Saleh, Pages, 2003). На ос новании содержания специфических доменов, факторы транскрипции под разделяются на различные семейства.

Семейство ERF (Ethylene Responsive Factors) характеризуется наличием высококонсервативного домена AP2/ERF. При исследовании генома араби допсиса и риса было выделено и охарактеризовано 122 и 139 генов ERF, со ответственно (Nakano et al., 2006). Представители данного семейства обна ружены и у других видов растений, среди которых пшеница (Andeani et al., 2009), тополь (Zhuang et al., 2008), хлопок (Huang et al., 2008). ERF факторы транскрипции играют важную роль в развитии растений, а также в ответных реакциях растений на действие неблагоприятных факторов, в том числе низ ких температур (Gilmour et al., 1998;

Liu et al., 1998;

Park et al., 2001;

Haake et al., 2002;

Yang et a., 2005).

В частности, сверхэкспрессия гена DREB1A способствовала повышению устойчивости как при воздействии засухи, так и холода через активацию экс прессии гена RAB29A у трансгенных растений арабидопсиса (Sakuma et al., 2006). С использованием методов блот анализа и ДНК микрочипов было установлено, что транскрипционный фактор DREB2A способен активировать экспрессию генов, кодирующих белки холодового ответа, такие как RD29A, RD29B, COR17, KIN1, KIN2. Показано, что экспрессия гена DREB1A и его гомологов индуцируется воздействием низкой температуры, в то время как экспрессия гена DREB2A увеличивается при воздействии обезвоживания и засоления (Liu et al., 1998;

Andeani et al, 2009). Несмотря на то, что оба гена относятся к одному семейству и имеют сходную структуру, возможно суще ствование разных сигнальных путей для кодируемых ими транскрипционных факторов, поскольку, в отличие от DREB1A, DREB2A вовлечен в пост тран скрипционные модификации РНК (Shakuma et al., 2006).

Обнаружено, что 4 гена риса (DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB1D), также экспрессировались при действии низкой температуры (Dubouzet et al., 2003). Интересно, что транскрипционный фактор OsDREBL риса, индуциоро вался только воздействием холода, тогда как при засолении, обезвоживании и обработке АБК повышения его экспрессии не наблюдалось (Chen et al., 2003).

Воздействие холода также приводило к повышению экспрессии гена GmDREB3 растений сои (Chen et al., 2007). Стоит отметить, что низкая тем пература слабо изменяла экспрессию генов пшеницы TaDREB2 и TaDREB3, в то время как воздействие засухи заметно ее усиливало (Morran et al., 2011). C использованием нозерн-блот анализа было показано, что гены MfDREB1 и MfDREB1s растений люцерны также активировались воздействием холода (Niu et al., 2010).

Установлено, что у пшеницы экспрессия гена TaAIDFa, кодирующего транскрипционный фактор, содержащий DRE цис-элемент, активировалась воздействием низкой температуры. Кроме того, ген TaAIDFa, активировал экспрессию генов, содержащих в промоторной области CRT/DRE мотив, и при обычных условиях, что способствовало повышению засухоустойчивости растений (Xu et al., 2008). Ген GhDREB, кодирующий DRE связывающийся транскрипционный фактор, выделенный их растений хлопка способствовал повышению устойчивости к неблагоприятным факторам, в том числе к низ ким температурам (Gao et al., 2009). Сверхэкспрессия гена ятрофы (Jatropha curcas L) JcDREB, индуцируемая холодом, засолением и засухой, способ ствовала повышению устойчивости к действию холода и засухи (Tang et al., 2011).

С использованием методов, позволяющих анализировать геном в целом, у рапса были выделены гены DREB семейства (BrDREB1C1, BrDREB1C2, BrDREB1D, BrDREB1F3), которые активировались низкими температурами уже через 30 мин от начала воздействия (Lee et al., 2012). Экспрессия гена MsDREBA5, кодирующего DREB транскрипционный фактор у яблони инду цировалась холодом (Zhao et al., 2012).

Показано, что в условиях действия низких темпераур усиливается экс прессия генов транскрипционных факторов DREB, которые способны акти вировать гены, кодирующие белки RD/COR (responsive to dehydratation/cold responsive) (Zhao et al., 2012).

Наиболее исследованными представителями данного семейства AP2 яв ляются CBF транскрипционные факторы, которые характеризуются наличи ем CRT цис-элемента и за счет связывания со специфическими участками в промоторных областях генов способны как активировать, так и ингибировать их экспрессию. Представители данного семейства были выделены и охарак теризованы у растений арабидопсиса (Gilmour et al., 1998), ячменя (Xue, 2002), пшеницы, рапса (Shen et al., 2003), черники (Polashock et al., 2010), ви нограда (Takuhara et al., 2011), хлопка (Gou et al., 2011), овсяницы (Jurczyk et al., 2012) и др.

Из генома растений арабидопсиса выделено 3 гена (CBF1, CBF2, CBF3), кодирующих CBF транскрипционные факторы (Gilmour et al., 1998;

Medina et al., 1999). Транскрипционные факторы данного семейства играют важную роль в устойчивости растений к воздействию холода, за счет связывания с участками CRT/DRE расположенными в промоторной области COR генов (Saleh, Pages, 2003;

Galiba et al., 2009;

Medina et al., 2011). Обнаружено, что CBF транскрипционные факторы способны регулировать около 12 % всех ге нов арабидопсиса, индуцируемых холодом (Medina et al., 2011).

Обнаружено, что экспрессия генов CBF транскрипционных факторов, активируемых холодом, зависит от времени суток и длительности воздей ствия низких температур (Fowler et al., 2005). Показано, что активация экс прессии генов CBF у арабидопсиса происходит уже через 15 мин от начала действия низкой температуры (Thomashow, 2010). У проростков ячменя от мечено увеличение экспрессии генов HvCBF1 и HvCBF3 уже через 2 ч от начала действия низкой температуры (Xue, 2003). Кроме того, под влиянием низких температур активируется экспрессия генов транскрипционных факто ров CBF (VvCBF2, VvCBF4, VvCBFL) у винограда (Takuhara et al., 2011). Экс прессия гена CbCBF1 хлопка, усиливалась через 16 ч от начала воздействия низкой температуры и способствовала повышению холодоустойчивости (Guo et al., 2011).

Следует отметить, что экспрессия гена транскрипционного фактора CBF4 активировалась засухой и АБК, но не наблюдалась при действии холо да (Haake et al., 2002). Предполагается, что сверхэкспрессия генов CBF также способствует повышению устойчивости растений не только к обезвожива нию, но и к засолению (Liu et al., 1998;

Gilmour et al., 1998).

Транскрипционные факторы NAC типа были впервые обнаружены у растений петунии и названы NAM (no apical meristem) (Souer et al., 1996). В последующие годы представители семейства NAC – No apical meristem (NAM), Arabidopsis transcription activation factor (ATAF), Cup-shaped cotyle don (CUC) были выделены и охарактеризованы и у других видов растений, таких как арабидопсис, рис (Ooka et al., 2003), ячмень (Hao et al., 2011), соя (Le at al., 2011), пшеница (Mao et al., 2012), табак (Rushton et al., 2008), нут (Peng et al., 2009) и тополь (Hu et al., 2010).

NAC семейство – одно из самых многочисленных семейств транскрип ционных факторов, специфичных для растений (Shen et al., 2009;

Hao et al., 2011;

Puranik et al., 2012).

Повышение экспрессии генов NAC наблюдалось при действии низких температур, засухи, засоления, грибковой инфекции (Yoo et al., 2007;

Jensen et al., 2007;

Nakashima et al., 2007). Один из возможных путей регуляции экс прессии генов, кодирующих стрессовые белки, может осуществляться через активацию DREB/CBF-COR пути. Когда NAC активирует DREB/CBF тран скрипционные факторы, которые в свою очередь, активируют COR гены, ко дирующие COR белки, обеспечивающие холодоустойчивость растений при воздействии низких температур (Hao et al., 2011). В частности, было показа но, что сверхэкспрессия гена GmNAC20, выделенного из растений сои, при водила к повышению соле- и морозоустойчивости растений арабидопсиса (Hao et al., 2011). Обнаружено также, что уже через 2 ч от начала действия низких температур происходит увеличение экспрессии генов (ClNAC2 4,9,11,12,17,21,39,44) в листьях хризантемы (Huang et al.,2012).

Установлено, что LOV1 (for long vegetative phase 1) - транскрипционный фактор содержащий NAC домен, выделенный из растений арабидопсиса, контролирует время их цветения и активируется в ответ на воздействие хо лода (Peng et al., 2009). У арабидопсиса было выделено 4 NAC гена (1-4), принадлежащих ATAF подсемейству, включая ATAF2 ген, который индуци руется холодом (Christanson et al., 2010).

Транскрипционные факторы семейства WRKY содержат специфические WRKY-домены, в состав которых входит консервативная последователь ность аминокислот WRKYGQK на N-конце молекулы (Zhang, Wang, 2005).

Гены, кодирующие транскрипционные факторы WRKY, выделены и охарак теризованы для ряда видов растений – арабидопсиса (Eulgem et al., 2000), ри са (Wu et al., 2005;

Peng et al., 2011), ячменя (More et al., 2004), петрушки (Eulgem et al., 1999), пшеницы (Mingyu et al., 2012) и др.

Данный тип регуляторов транскрипции играет важную роль в регуляции развития растений, прорастании семян, а также в формировании устойчиво сти к абиотическим и биотическим воздействиям, в том числе к низким тем пературам (Eulgem et al., 2000;

Euglem, Somssich, 2007;

Таланова и др., 2008).

Обнаружено, что у арабидопсиса транскрипционый фактор AtWRKY63 спо собен напрямую или опосредованно, через связывание с последовательно стью W-box в промоторных областях генов ABF2, регулировать экспрессию гена COR47 (Mingyu et al., 2012). У растений пшеницы повышалась экспрес сия генов WRKY16 и WRKY34 при воздействии холода, при этом также уси ливалась экспрессия генов WCOR518, WCOR615, WCOR120, достигая макси мального значения через 1 сут от начала действия температуры 2С, что мо жет свидетельствовать об участии транскрипционных факторов WRKY в ре гуляции COR генов и холодоустойчивости растений (Gaudet et al., 2011). По казано, что экспрессия гена HvWRKY38 увеличивалась в листьях ячменя че рез 2 ч действия низкой температуры и возвращалась на исходный уровень спустя 2 сут действия холода (More et al., 2004). Обнаружено, что у растений ячменя происходило накопление транскриптов гена дегидрина DHN8 после пика увеличения экспрессии гена HvWRKY38, что свидетельствует о регуля ции экспрессии транскрипционными факторами WRKY генов дегидринов (More et al., 2004).

Важную роль в механизмах повышения устойчивости растений играют гены холодового шока, в том числе COR гены (сold responsive genes) (Thom ashow, 1998;

Rorat, 2001;

Jan et al., 2009). COR гены выделены и охарактери зованы для таких видов растений, как арабидопсис, люцерна, шпинат, томат, ячмень и пшеница (Wanner, Junttila, 1999;

Zalunskaite et al., 2008). Скорость изменения экспрессии COR генов может быть различна. В частности, суще ствуют гены, экспрессия которых в ответ на низкие положительные темпера туры изменяется быстро, но кратковременно. В основном продукты таких ге нов накапливаются в пределах нескольких часов с момента начала низкотем пературного воздействия и сохраняются на высоком уровне до того момента, когда растение возвращается в оптимальные для роста и развития условия (Wanner, Junttila, 1999;

Fowler, Thomashow, 2002;

Mine et al., 2003;

Zalunskaite et al., 2008).

С использованием microarray анализа в листьях растений пшеницы было идентифицировано около 200 генов, активируемых низкой температурой ( 5С) через 1 сут действия, и около 300 генов, активность которых возрастала через 3 сут (Kang et al., 2013). В этом случае индуцировалась экспрессия 19 ти COR генов, причем большинства из них – уже через 1 сут и еще более усиливалась через 3 сут воздействия. В частности, были идентифицированы гены, кодирующие COR белки: COR14b, COR719, WCOR14a, WCOR413, WCOR80 и др. (Kang et al.,2013).

Установлено, что экспрессия COR генов коррелирует с повышением мо розоустойчивости растений (Uemura et al., 1996).

Показано, что у проростков табака экспрессия гена COR15b в листьях, стебле и корнях увеличивается при краткосрочном воздействии температур 0С и -4С, и не усиливается при длительном действии низких положитель ных температур (12С и 4С). Через 1 сут от начала воздействия холода (4С) индукция экспрессии гена COR15b в корнях более низкая по сравнению с та ковой в листьях и стебле. Предполагается, что COR15b способствует стаби лизации мембран и поддержанию цитоплазматического гомеостаза, запуская комплекс физиолого-биохимических изменений (Wu et al., 2012).

Экспрессия COR генов обнаружена и у других видов растений, в частно сти, в листьях Celtis bungeana через 1 сут от начала воздействия температуры 2С происходило накопление транскриптов гена COR15, в то время как в корнях повышения экспрессии данного гена не наблюдалось (Si et al., 2009).

Экспрессия гена COR25 у рапса повышается через 3 ч холодового воздей ствия (4С), затем через 6 ч снижается, повышаясь вновь через 12 ч после воздействия (Сhen et al., 1994).

Установлено, что у пшеницы СОR белки WCOR15 и WCOR14, индуци рованные низкой температурой, транспортируются в хлоропласты и накап ливаются в строме. Однако отсутствует прямая корреляция между уровнем морозоустойчивости и накоплением белка WCOR15. На основании этого предполагается, что морозоустойчивость достигается только совместным действием и накопительным эффектом различных COR/LEA белков, у каж дого из которых в отдельности эффект действия ограничен (Shimamura et al., 2006).

У растений ячменя выделен белок COR14b, который является гомологом специфического белка листа арабидопсиса – COR15а. Однако в отличие от COR15a, COR14b – гидрофобный белок, его экспрессия наблюдалась также и при воздействии света (Crosatti et al.,1999). Показано, что у проростков ози мой пшеницы транскрипты гена WCOR14 накапливались быстро – в течение 3-6 часов после начала действия температуры 4С, а максимум достигался на 3 сут. Основываясь на полученных результатах, авторы заключают, что белок WCOR14 пшеницы является гомологом белка COR 14b ячменя (Tsvetanov et al., 2000). Экспрессия гена WCOR14 специфически индуцируется низкой температурой и сохраняется на высоком уровне в течение периода холодовой акклимации (Tsvetanov et al., 2000).

Установлено, что экспрессия гена WCOR15 специфически экспрессиру ется при действии низкой температуры и, вероятно, стимулируется светом (Ganeshan et al., 2008). В экспериментах с проростками пшеницы установлена корреляция между уровнем накопления транскриптов и уровнем морозо устойчивости растений. В частности, у озимой пшеницы отмечен более вы сокий уровень морозоустойчивости и более значительное и быстрое накоп ление транскриптов по сравнению с яровой пшеницей (Takumi et al., 2003).

Зависимость экспрессии генов COR белков от воздействия света наблю дались и у других видов. Например, показано, что экспрессия гена COR14b при воздействии холода также зависела от спектрального состава света. При воздействии низкой температуры экспрессия гена COR14b была ниже у этио лированных проростков ячменя, чем у растений, произрастающих при нор мальных условиях и фотопериоде (Crosatti et al.,1999).

Дегидрины - водорастворимые белки, которые относятся ко II группе класса LEA белков (Late Embryogenesis Abundant) (Close, 1996). Накопление дегидринов обнаружено в зародышах семян в период обезвоживания, однако увеличение экспрессии их генов наблюдается в растениях и при воздействии разных абиотических факторов, таких как засуха, засоление, низкая темпера тура (Close., 1997;

Аллагурова и др., 2004;

Kosova et al., 2013).

Все дегидрины характеризуются наличием как минимум одной копии консервативного мотива K-сегмента (последовательность богатого лейци ном), однако в структуре некоторых белков данного класса встречаются и другие мотивы (Kosova et al., 2007). Многие дегидрины, активируемые холо дом у пшеницы, принадлежат к семейству белков WCS120, которое включа ют как минимум 5 представителей (WCS200, WCS180, WCS66, WCS120), то гда как у ячменя дегидрины представлены белком DHN5 (Kosova et al., 2008).

Известно, что действие температуры 5С и 10С приводит к накоплению бел ков WCS120 и DHN5 у пшеницы и ячменя, соответственно (Kosova et al., 2013).

В настоящее время показано, что воздействие низкой температуры при водит к индукции генов, кодирующие белки дегидрины. Установлено, что в индукции экспрессии гена TaDHN у проростков пшеницы важную роль игра ет эндогенная АБК, что свидетельствует о том, что экспрессия гена дегидри на TaDHN пшеницы при гипотермии находится под контролем эндогенной АБК и холода (Шакирова и др., 2009). Экспрессия генов дегидринов WCS и DHN13 у проростков пшеницы и DHN5 у ячменя отмечена как у генотипов, характеризующихся повышенной холодоустойчивостью, так и чувствитель ных к холоду (Kosova et al., 2011). У растений сои был выделен и охарактери зован ген GmERD14, кодирующий белок, принадлежащий к группе дегидри нов, который также индуцировался холодом (Yamasaki et al., 2013). Индукция генов дегидринов при действии холода отмечена и у растений плевела (Gray et al., 1997). Холод приводил также к активации экспрессии генов дегидри нов, гомологов семейства пшеницы WCS120, обнаруженных у ячменя (Fowler et al., 2001). Следует особо подчеркнуть, что ген WCS120 у пшеницы специфически индуцируется воздействием низких температур, в то время как его экспрессия не наблюдалась при действии высоких температур, засухи и АБК (Houde et al., 1992).

Исходя из вышеизложеного, можно заключить, что в последние годы ак тивно исследуются механизмы адаптации растений к действию низких тем ператур на разных уровнях организации. Благодаря развитию современных методов, активно изучается экспрессия генов, кодирующих белки, которые играют важную роль в устойчивости растений к холоду. Однако подобного рода исследования преимущественно проводятся на растениях арабидопсиса, и в меньшей степени на других видах растений, в связи с чем результаты за частую трудносопоставимы между собой.

1.3. Механизмы адаптации растений к действию кадмия Тяжелые металлы, по значению для растений подразделяют на необхо димые для их жизнедеятельности в незначительных концентрациях, которые становятся токсичными в очень высоких концентрациях (Zn, Cu, Mo и др.), и не участвующие в метаболизме растений, токсичные даже в низких концен трациях (Cd, Pb, Hg и др.) (Титов и др., 2007, Кузнецов, Дмитриева, 2013).


В ответ на действие тяжелых металлов в токсичных для растений кон центрациях у них реализуется комплекс адаптивных механизмов на разных уровнях организации – от организменного до молекулярного (Титов и др., 2007).

Установлено, что на уровне целого растения проявляется ряд механиз мов, направленных на ограничение поступления тяжелых металлов, в том числе задержка их поглощения корнями и транспорта в надземную часть, функционирование барьеров на пути транспорта металлов, а также выведе ние ионов тяжелых металлов из клеток с участием трихом (Косицин, Алексе ева-Попова, 1983;

Clemens et al., 2002). В частности, в снижении проникно вения тяжелых металлов в растения из почвы важную роль играет выделяе мая клетками корня слизь, которая содержит соединения, связывающие ионы токсичных металлов (Marschner, 1995;

Manara, 2012). Однако данное ограни чение поступления ионов тяжелых металлов не всегда оказывается достаточ ным и они проникают в клетки растений (Чернобровкина и др., 2012;

Вет чинникова и др., 2013).

Первым барьером на пути поступления ионов тяжелых металлов в клет ки корня является клеточная стенка. Предотвращение поступления ионов ме таллов в растения достигается за счет их иммобилизации в клеточной стенке, торможения транспорта через плазмалемму и выделения в окружающую сре ду. Иммобилизация тяжелых металлов может достигаться двумя путями:

накоплением ионов в свободном пространстве и их связыванием с клеточной стенкой (Феник и др., 1995). Связывание ионов тяжелых металлов с клеточ ной стенкой корня препятствует их дальнейшему проникновению в цито плазму (Taylor, 1987;

Davies et al., 1991;

Серегин, Иванов, 2001). Однако, при высоких концентрациях ионов тяжелого металла может происходить "насы щение" клеточной стенки и она не обеспечивает полного блокирования их поступления (Ernst et al., 1992;

Manara, 2012). Следующим барьером на пути их поступления в цитоплазму выступает плазмалемма. Изменение функцио нирования ионтранспортных систем плазматической мембраны приводит к изменению ионного баланса клетки (Bonaly et al., 1980;

Hall, 2002). Предпо лагается, что транспортные белки плазматической мембраны могут участво вать в механизмах повышения металлоустойчивости, к ним, в частности, от носятся АТФазы, NRAMP (natural resistance associated macrophage proteins), ZIP (zinc iron proteins) (Guerinot, 2000;

Thomine et al., 2003;

Manara, 2012) и др. Важным механизмом повышения устойчивости растений к действию тя желых металлов выступает выведение ионов металлов из клетки (Hartley Whitaker et al., 2001).

Устойчивость растений к тяжелым металлам достигается за счет ограни чения проникновения тяжелых металлов в клетку и запуска внутриклеточных механизмов устойчивости (Чиркова, 2002;

Hall, 2002). Внутриклеточные ме ханизмы устойчивости к тяжелым металлам включают механизмы их деток сикации, а также механизмы, позволяющие клетке функционировать в при сутствии тяжелых металлов и механизмы репарации повреждений (Титов и др., 2007). Важным механизмом детоксикации является хелатирование (об разование комплексных соединений ионов тяжелых металлов с лигандами) в цитозоле (Rauser, 1999;

Clemens et al., 2002;

Manara 2012). В качестве лиган дов – соединений, образующих хелатные комплексы с тяжелыми металлами, могут выступать органические кислоты, аминокислоты, металлотионеины и фитохелатины (Rauser, 1999;

Cobbett, 2000;

Manara 2012). К органическим кислотам, образующим прочные комплексы с ионами металлов, относятся цитрат, малат и оксалат (Wagner, 1993;

Rauser, 1999;

Титов и др., 2007). В де токсикации тяжелых металлов также участвует гистидин (Hall, 2002;

Cobbett, 2007) и никотинамид (Mari et al., 2006;

Haydon, Cobbett, 2007).

Важную роль в детоксикации тяжелых металлов играют металлотионе ины – низкомолекулярные металлсвязывающие белки с высоким содержани ем цистеина (Robinson et al., 1993;

Capdevila et al., 2012;

Manara 2012). Они обнаружены у животных, растений и грибов (Kumar et al., 2012;

Ryvolova et al., 2012). По распределению цистеиновых остатков и количеству ароматиче ских аминокислот металлотионеины у растений подразделяются на 4 типа (МТ 1–4) (Kumar et al., 2012). Образование их комплексов с металлами осу ществляется за счет связывания с сульфгидрильными группами цистеина (Zenk, 1996).

Другими важными хелатирующими агентами являются низкомолеку лярные пептиды – фитохелатины (Cobbett, 2000;

Серегин, 2001;

Ogawa et al., 2009;

Pal, Rai, 2010). Наличие тиоловых (SH) групп позволяет фитохелатинам связываться с ионами тяжелых металлов и образовывать в цитозоле хелатные комплексы с молекулярным весом 2,5–3,6 кДа (Cobbett, 2000;

Серегин, 2009;

Gallego et al., 2012). Образовавшиеся низкомолекулярные комплексы транс портируются в вакуоль с помощью Cd/H+ антипортеров (Salt, Wagner, 1993) и АТФ-зависимых АВС-транспортеров тонопласта (Salt, Rauser, 1995), включая HMT1 транспортер, обнаруженный у дрожжей (Prvral et al., 2009). При этом фитохелатины участвуют не только в механизмах детоксикации тяже лых металлов (Clemens et al., 1999;

Серегин, 2001;

Gallego et al., 2012), но и в гомеостазе металлов, необходимых для нормального протекания физиологи ческих процессов, например, цинка и меди (Thumann et al., 1991).

Синтез фитохелатинов индуцируется многими тяжелыми металлами, в том числе Cu, Zn, Ag, Au, Hg и Pb, но в наибольшей степени Cd (Rauser, 1995;

Cobbett, 2000;

Pal, Rai, 2010).

Фитохелатины, в отличие от металлотионеинов, не являются первич ными генными продуктами, а синтезируются из глутатиона при участии фермента фитохелатинсинтазы (-глутамилцистеинтранспептидазы) (Robin son et al., 1993;

Rauser, 1995;

Clemens et al., 1999;

Cobbett, 2000;

Серегин, 2001;

Capdevila et al., 2012).

Глутатион также способен сам образовывать комплексы с тяжелыми металлами. Глутатион представляет собой трипептид ( глутамилцистеинилглицин), состоящий из остатков трех аминокислот: ци стеина, глицина и глутамина (Серегин, 2001;

Estrella-Gomez et al., 2012;

Gallego et al., 2012;

Anjum et al., 2012). Глутатион содержит тиоловые груп пы, посредством которых он способен связываться с ионами металлов и ме таллоидов (Серегин, 2001;

Anjum et al., 2012). Глутатион обнаружен у всех организмов, включая растения, однако он менее эффективно связывает тяже лые металлы, чем фитохелатины.

Железосодержащие белки ферритины связывают такие металлы как цинк, медь, кадмий, свинец у животных, тогда как у растений они способны запасать значительное количество железа (Price, Joshi, 1982;

Dedman et al., 1992;

Manara, 2012).

Важную роль в механизмах металлоустойчивости играет компартмен тация и детоксикация в вакуоли ионов тяжелых металлов (Hall, 2002). Транс порт хелатных комплексов в вакуоль происходит с участием белков транс портеров ABC (ATP-binding cassette) (Uraguchi, Fujiwara, 2012;

Krmer et al., 2007) и MRP (multidrug resistance associated proteins) (Klein et al., 2007).

Действие тяжелых металлов приводит к накоплению активных форм кислорода (DalCorso et al., 2010;

Gill, Tuteja, 2010). В связи с этим, важную роль в адаптации растений играют антиоксидантные ферменты (супероксид дисмутаза, пероксидаза, каталаза), активность которых значительно возрас тает в ответ на действие тяжелых металлов, что приводит к нейтрализации свободных радикалов (Шевякова и др., 2003;

Wu et al., 2003;

Холодова и др., 2005).

Как отмечалось ранее, к внутриклеточным механизмам устойчивости к тяжелым металлам относятся и механизмы репарации повреждений. В дан ном случае важную роль играет синтез белков шаперонов – БТШ (белков теплового шока) (Sanita di Toppi, Gabbrielli, 1999). В частности, при действии кадмия происходит активация синтеза БТШ с молекулярными массами 20– кДа, которые защищают белки плазмалеммы от токсического действия этого металла (Prasad, 1995;

Титов и др, 2007).

В настоящее время, благодаря развитию и широкому применению мо лекулярно-генетических методов, активно исследуется экспрессия генов, продукты которых участвуют в механизмах адаптации растений к действию тяжелых металлов.

В последние годы появляются сведения о роли транскрипционных фак торов в регуляции транскрипции генов, индуцируемых действием тяжелых металлов. Например, активация генов OsDREB1A и OsDREB1B транскрипци онных факторов в корнях риса происходила при действии хлорида кадмия (10 мкМ) (Ogawa et al., 2009). В отличие от этого, под влиянием CdCl2 и CuSO4 в более высокой концентрации (150 мкМ) снижалось содержание транскриптов гена LbDREB в листьях и корнях растения галофита Limonium bicolor (Ban et al., 2011).

Помимо этого, установлено, что кадмий и цинк повышают экспрессию генов MYB4, MYB10, MYB72 у растений A. thaliana (Van de Mortel et al., 2008).

Кроме того, кадмий способствовал значительному повышению экспрессии гена MYB28 у Thlaspi сaerulescens (Van de Mortel et al., 2008) и усиливал экс прессию генов MYB43, MYB48 и MYB124 в корнях A. thaliana, в то время как медь не вызывала активации их экспрессии (Weber et l., 2006).

Показано, что под влиянием кадмия и цинка в корнях и листьях A.

thaliana происходит накопление транскриптов гена bHLH100, относящегося к семейству генов, кодирующих транскрипционные факторы bHLH, тогда как у T. сaerulescens повышение экспрессии данного гена наблюдалось только под влиянием кадмия (Van de Mortel et al., 2008).


Установлено также, что кадмий индуцировал у T. сaerulescens экспрес сию гена WRKY53, кодирующего транскрипционный фактор WRKY (Wei et al., 2008). Представителями еще одного семейства генов факторов тран скрипции, экспрессия которых активировалась кадмием, являются гены bZIP (Liao et al., 2008;

Wang et al., 2010).

Как отмечалось выше, факторы транскрипции являются регуляторными белками и способны индуцировать экспрессию других генов, в частности, кодирующих белки, участвующие как во внутриклеточном, так и в дальнем транспорте тяжелых металлов по растению, а также их детоксикации.

В настоящее время выделены и охарактеризованы гены, кодирующие белки-транспортеры, которые обеспечивают как ближний, так и дальний транспорт ионов металлов по растению. Среди основных семейств данных белков, можно выделить: ZIP семейство (Zinc related transporter / Iron related transporter – like Protein), NRAMP (natural resistance associated macrophage pro tein), CTR (The Copper Transporter Family), АТФаза P1B –типа, АТФаза V типа, АВС (ATP-binding cassette), FRD (Ferric Reductase Defective), ОРТ (The Oligopeptide Transporters Family).

У A. thaliana выделено несколько генов, кодирующих ZIP транспортеры – AtZIP1–AtZIP5, AtZIP9–AtZIP12 и AtIRT3, содержание транскриптов кото рых возрастает при недостатке Zn (Hanikehne, Nouet, 2011). У гипераккуму ляторов Arabidopsis halleri и T. caerulescens экспрессия генов ZIP4, ZIP10, IRT3 по мере поступления цинка в растения снижается (Krmer et al., 2007). У арабидопсиса экспрессия гена AtIRT1 активировалась при воздействии нике ля, что говорит о возможном участии транспортера IRT1 в аккумуляции и транспорте этого металла (Verret et al., 2004).

У A. halleri и T. caerulescens ген NRAMP3, кодирующий белки, принад лежащие к семейству белков транспортеров NRAMP, экспрессировался пре имущественно в корнях, но у A. halleri экспрессия данного гена наблюдалась и в побегах. Кроме того, в корнях T. caerulescens экспрессировались гены NRAMP1 и NRAMP5 (Becher et al., 2004;

Talke et al., 2006;

Van de Mortel et al., 2006).

Показано, что у A. thaliana экспрессия гена COPT1, кодирующего белок транспортер COPT, локализованный на плазмалемме, играет ключевую роль в поглощении меди (Sancenn et al. 2004).

Белки-транспортеры семейства CDF / MTP (Metal Tolerance Protein) спо собны переносить ионы Zn, Cd, Co, Ni и Mn из цитозоля или в вакуоль через тонопласт, или из клетки через плазмалемму (Blaudez et al., 2003;

DalCorso et al., 2010). Экспрессия гена AhMTP1 у растений A. halleri повышалась в при сутствии цинка преимущественно в листьях (Krmer et al., 2007). Даже незна чительное увеличение экспрессии гена AhMTP1 у A. thaliana способствовало возрастанию устойчивости растений к повышенным концентрациям цинка (Krmer et al., 2007).

Белки-транспортеры АТФаз P1B –типа, принадлежащие к суперсемейству АТФаз P-типа, способны переносить катионы металлов через биологические мембраны из цитоплазмы в вакуоль или апопласт против электрохимическо го градиента за счет энергии гидролиза АТФ (Colangelo, Guerinot, 2006). Во семь АТФаз P1B -типа у A. thaliana и Oryza sativa были переименованы в HMA (heavy-metal ATPases) (Verret et al., 2004;

Gallego et al., 2012). Установ лено, что при действии высоких концентраций Zn и Cd повышалась экспрес сия гена AtHMA4 у арабидопсиса и T. caerulescens, а также генов (OsHMA5, OsHMA6, OsHMA9) у риса (Verret et al., 2004;

Verkleij et al., 2009). HMA бел ки отличаются бльшей селективностью, чем белки транспортеры других классов, в частности, белки HMA2, HMA3 и HMA4 способны транспортиро вать только катионы Zn и Cd (Krmer et al., 2007).

Белки АТФаз V-типа обеспечивают работу Cd2+ / H+-антипортера. В не давних исследованиях было показано, что кадмий и медь способствуют акти вации экспрессии генов, кодирующих АТФазы V-типа в корнях растения яч меня и огурца, соответственно (Kabaa et al., 2010;

Казнина и др., 2013). В частности, у проростков ячменя под влиянием кадмия наблюдалось усиление экспрессии генов двух субъединиц вакуолярной H+-АТФазы HvVHA c и HvHVA E (Казнина и др., 2013).

Белки АВС-типа принимают участие в транспорте ионов металлов в форме хелатов в вакуоль через тонопласт (Uraguchi, Fujiwara, 2012). В дан ном семействе выделяют подсемейство MRP (multidrug resistance associated proteins), характерное для млекопитающих, однако гены, кодирующие MRP белки, обнаружены и у растений, в частности арабидопсиса и риса (Klein et al., 2007). Увеличение содержания транскриптов гена AtPDR8, кодирующего белок AtPDR8 АВС-типа, локализованный в плазмалемме арабидопсиса, происходило в присутствии кадмия и свинца, а трансгенные растения со сверхэкспрессией гена AtPDR8 и повышенной металлоустойчивостью не ак кумулировали ионы этих металлов (Kim et al., 2007).

Белки-транспортеры FRD вовлечены в гомеостаз ионов Fe. Показано, что экспрессия гена, кодирующего транспортер FRD3, участвующего в за грузке ионов металлов в ксилему и их дальнем транспорте, возрастает в кор нях гипераккумуляторов A. halleri и T. caerulescens (Krmer et al., 2007). Кро ме того, уровень транскриптов гена FRD3 также повышается в листьях A. hal leri в отличие от A. thaliana (Becher et al., 2004;

Talke et al., 2006). Суперсе мейство ОРТ включает подсемейство YSL (Yellow Stripe-Like). У A. thaliana было выделено 8 YSL белков транспортеров (Colangelo, Guerinot 2006). По казано, что ген AtYSL1 экспрессируется в листьях и пыльце арабидопсиса (Le Jean et al., 2005;

Krmer et al., 2007), а ген AtYSL2 – в тканях ксилемы и фло эмы побега и корня (DiDonato et al., 2004).

В целом, белки-транспортеры играют важную роль в поглощении ионов металлов и их транспорте как внутри клетки, так и по растению. Однако наряду с необходимыми для нормальной жизнедеятельности растений метал лами растения способны поглощать и ионы токсичных тяжелых металлов. В этом случае запускаются внутриклеточные механизмы детоксикации, к кото рым прежде всего относится хелатирование металлов (образование хелатных комплексов за счет связывания ионом металлов с различными лигандами) (Rauser, 1999).

Как отмечалось выше, к семейству низкомолекулярных металл связывающих белков относятся металлотионеины (Robinson et al., 1993;

Capdevila et al., 2012). Показано, что CdCl2 (2 – 40 мкМ) активировал тран скрипцию гена BgMT2 в листьях проростков Bruguiera gymnorrhiza (Huang et al., 2011). В то же время содержание транскриптов гена AmMT2 в листьях Av icennia marina под влиянием ZnSO4 (80 – 1200 мкМ), CuSO4 (50 – 750 мкМ) и Pb(NO3)2 (5 – 100 мкМ) увеличивалось при более высоких концентрациях ме таллов (Huang, Wang, 2010).

В настоящее время роль металлотионеинов в детоксикации тяжелых ме таллов все еще изучена недостаточно, однако, имеются сведения о том, что экспрессия гена МТ2 в трансгенных растениях арабидопсиса вызывала по вышение их устойчивости к кадмию и меди (Zhigang et al., 2006).

Установлено, что регуляция синтеза фитохелатинов, играющих ключе вую роль во внутриклеточном связывании тяжелых металлов (Grill et al., 1987;

Rauser, 1995;

Cobbett, 2000;

Серегин, 2001;

Pal, Rai, 2010) осуществля ется на уровне экспрессии генов, кодирующих фитохелатинсинтазу, а также генов, кодирующих ферменты синтеза глутатиона. Впервые ген СAD1, коди рующий фитохелатинсинтазу, был выделен у cad1–мутантов арабидопсиса, способных синтезировать достаточное количество глутатиона, но низкое – фитохелатинов (Ha et al., 1999). В последние годы активно исследуется экс прессия генов PCS, кодирующих фитохелатинсинтазу у разных видов расте ний, в том числе арабидопсиса, риса, пшеницы, горчицы (DalCorso et al., 2010). В частности у Avicennia germinans экспрессия гена AgPCS активирова лась под влиянием не только кадмия, но и меди (Gonzalez-Mandoza et al., 2007). Уровень экспрессии гена SmPCS у гипераккумулятора свинца Salvinia minima при действии Pb возрастал в листьях, в то время как в корнях, наобо рот, снижался. Несмотря на то, что роль фитохелатинов в механизмах деток сикации тяжелых металлов очевидна, участие фитохелатинсинтазы и самих фитохелатинов в механизмах устойчивости к тяжелым металлам изучено не достаточно полно. Например, известно, что сверхэкспрессия гена AtPCS1 и повышенный уровень фитохелатинов у трансгенных растений арабидопсиса может повышать аккумуляцию кадмия без увеличения устойчивости расте ний, более того, даже приводит к их гиперчувствительности к кадмию. Отме тим, что экспрессия гена пшеницы TaPCS1 приводила к снижению чувстви тельности мутантов cad1-3 растений арабидопсиса к кадмию и кроме того способствовала дальнему транспорту кадмия, что, в свою очередь, приводило к снижению его накопления в корнях (Gong et al., 2003).

Как отмечалось выше, предшественником фитохелатинов является трипептид глутатион. Его синтез осуществляется в два этапа. Первый этап включает образование -глутамилцистеина из глутамата и цистеина. Данный этап катализируется ферментом -глутамилцистеинсинтетазой. Второй этап заключается в конъюгации -глутамилцистеина с глицином и катализируется ферментом глутатионсинтетазой (Серегин, 2001;

Estrella-Gomez et al., 2012).

Установлено, что экспрессия генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе глутатиона, способствует повышению металлоустойчивости рас тений. Показано, что не только кадмий, но и свинец способствует повыше нию экспресcии гена SmGS, активации глутатионсинтетазы и аккумуляции глутатиона как в листьях, так и в корнях растения гипераккумулятора Salvin ia minima, при этом экспрессия гена SmGS в листьях была выше, чем в кор нях (Estrella-Gomez et al., 2012).

Наряду с ферментами биосинтеза глутатиона, важным ферментом его метаболизма является глутатион-S-трансфераза, катализирующая конъюга цию глутатиона с алифатическими, ароматическими, эпоксидными и гетеро циклическими радикалами различных ксенобиотиков, действующих на рас тения (Estrella-Gomez et al., 2012;

Anjum et al., 2012). Суперсемейство глута тион-S-трансферазы подразделяется на 7 классов (F, U, L, Z, T, DHAR, TCHQD), из которых характерными для растений являются F и U классы (Moons, 2003;

Dixon et al., 2010;

Anjum et al., 2012). Известно, что у араби допсиса семейство генов gst кодирует глутатион-S-трансферазу U класса, представителями данного семейства у риса являются гены osgtu3 и osgtu4.

Показано, что цинк (30 мкМ) и кадмий (20 мкМ) индуцируют экспрессию osgtu3 и osgtu4 генов в корнях проростков риса уже через 2 часа от начала их действия (Moons, 2003).

Таким образом, анализ литературных источников показал, что в настоя щее время весьма актуальным остается изучение адаптации растений к воз действию абиотических факторов разной природы. Механизмы адаптации растений к неблагоприятным факторам среды исследуются на всех уровнях организации, однако полного понимания реализации защитных механизмов как при раздельном, а в особенности при совместном действии неблагопри ятных факторов пока нет. В литературе имеются данные по изменению экс прессии разных групп генов, как при действии низких температур, так и тя желых металлов. При этом исследования преимущественно выполнены на модельном генетическом объекте – арабидопсисе. Однако, несмотря на до статочно большое количество сведений, молекулярные механизмы устойчи вости растений к абиотическим факторам разной природы, остаются не яс ными. В настоящее время накопилось большое количество эксперименталь ных данных, подтверждающих функционирование в растениях общих систем (механизмов) устойчивости к двум или нескольким факторам различной при роды, т.е. явление кросс-адаптации, однако подобные работы, посвященные механизмам устойчивости растений к действию низких температур и тяже лых металлов, единичны. Наряду с этим, отсутствуют сведения о совместном влиянии низких температур и тяжелых металлов на физиолого биохимические и молекулярно-генетические процессы растений, включая экспрессию генов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве модельного объекта исследований использовали растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская 39. Данный сорт является среднеспелым, характеризуется высокой зимостойкостью и морозо устойчивостью, устойчив к ранневесенней засухе, твердой головне, снежной плесени и септориозу. Предназначен для получения продовольственного зер на в Центральных и Центрально-Черноземных районах России.

Растения выращивали в рулонах фильтровальной бумаги на питательном растворе (рН 6,2–6,4) с добавлением микроэлементов в климатических каме рах при температуре воздуха 22С, его относительной влажности 60–70%, освещенности 10 клк и 14-часовом фотопериоде. По достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергали действию низкой закаливающей температуры (4С) или сульфата кадмия (100 мкМ), а также их совместному действию, сохраняя прочие условия неизменными. Продолжительность воз действия составляла от 15 мин до 7 сут. В специальном опыте проростки пшеницы подвергали действию температур 4, 8, 12 С или сульфата кадмия (100–2000 мкМ) в течение 7 сут.

Для измерения биометрических показателей (высота растений, длина и площадь 1-го листа) использовались общепринятые методы.

Устойчивость растений к действию низких температур оценивали по ре акции клеток высечек из листьев (площадью около 0,3 см2) на 5-минутное те стирующее промораживание в термоэлектрическом микрохолодильнике ТЖР-02/-20 («Интерм», Россия) при последовательном изменении темпера туры с интервалом 0,4 (Балагурова и др., 1982). Заданную температуру под держивали с точностью ± 0,1С. Перед промораживанием высечек из листа на каждую из них наносили кристаллы льда для снятия переохлаждения. Для микроскопирования высечек применяли микроскоп Микмед 2 («ЛОМО», Россия), объектив 40х. В качестве критерия устойчивости использовали тем пературу гибели 50% паренхимных клеток (ЛТ50), определяемую по деструк ции хлоропластов и коагуляции цитоплазмы.

Проницаемость мембран клеток при воздействии низкой температуры, сульфата кадмия и их совместного воздействия определяли по выходу элек тролитов из высечек листьев пшеницы (длиной 0,5 см) кондуктометрическим методом с использованием кондуктометра («HANNA», Италия). Для этого брали 3 усредненные навески (по 0,5 г) высечек листьев, тщательно промы вали дистиллированной водой для удаления со срезов клеточного сока, об сушивали фильтровальной бумагой, заливали 50 мл дистиллированной воды и выдерживали при комнатной температуре 22С в течение 4 ч. Выход элек тролитов из тканей листа в дистиллированную воду определяли по измене нию электропроводности. Полный выход электролитов определяли по элек тропроводности той же вытяжки после разрушения мембран кипячением. Ре зультирующий выход электролитов рассчитывали в процентах от полного выхода (Гришенкова, Лукаткин, 2007).

Содержание кадмия в корнях и листьях растений определяли методом инверсионной вольтамперометрии с использованием полярографа АВС-1. (Вольта, Россия). Разложение растительных образцов проводили в смеси HNO3 и H2O2 в соотношении 4:1 с использованием микроволновой системы пробоподготовки МС-6 («Вольта», Россия).

Для определения содержания свободного пролина использовали метод Бейтса (Bates et al., 1973). Навеску листьев (0,5 г) гомогенизировали в ступке с 10 мл охлажденной 3%-сульфосалициловой кислоты и гомогенат центри фугировали в течение 5 мин при 5100 g. К 2 мл супернатанта добавляли 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл нингидринового реактива содержащего мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл 6М H3PO4 и 1,25 г нингидрина. Пробир ки, содержащие указанную смесь, помещали на 1 час в кипящую водяную баню. Затем пробы быстро охлаждали во льду. Интенсивность окрашивания комплекса пролина с нингидрином определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм на спектрофотометре СФ-2000. Количество пролина устанавливали по калибровочной кривой, используя стандартные растворы химически чистого L-пролина («Вектон», Россия). Содержание пролина вы ражали в мкМоль пролина / грамм сырой массы.

Количество глутатиона и фитохелатинов в листьях и корнях пшеницы определяли методом ВЭЖХ. После замораживания образцов корней и листь ев в жидком азоте, проводили экстракцию глутатиона и фитохелатинов. Для этого 20 мг материала гомогенизировали в 2 мл раствора 6.3 мМ ледяной ди этилтриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) («Sigma», США) и 0.1% три фторуксусной кислоты («Merck»). Гомогенат центрифугировали при 10 об./мин и температуре 4С. Полученные экстракты подвергали предколоноч ной дериватизации с монобромбинаме (mBBr) («Sigma», США). К 250 мкл экстракта добавляли 450 мкл 200 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 пропансульфоновой кислоты (НEPP) («Sigma», США) в буфере, рН 8.2, со держащего 6.3 мМ ДТПА, смешивали с 10 мкл 25 мМ mBBr. Готовую смесь инкубировали в темноте при 45С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 300 мкл 1М метансульфоновой кислоты (MСA, «Alfa Aesar»).

Образцы до анализа хранили при 4С в темноте. Разделение глутатиона и фи тохелатинов проводили в аналитической колонке Phenomenex Luna 5u С при температуре колонки 37С и скорости потока 0,5 мл/мин согласно мето дике Е. Снеллер с соавт. (Sneller et al., 2000). Количество глутатиона и фито хелатинов определяли по стандарту глутатиона («Sigma», США). Концентра цию фитохелатинов выражали в нмоль глутатиона эквивалентного г сырого веса. Расчет площадей пиков осуществляли с помощью компьютерной про граммы МультиХром (Версия 1,5Х). Общее содержание фитохелатинов (ФХ) представлено суммой: ФХ2+ ФХ 3+ ФХ 4.

Накопление транскриптов генов анализировали методом ПЦР в режиме реального времени. Для этого навеску листьев пшеницы (50 мг) растирали в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли с помощью набора РНК-Экстран («Синтол», Россия). Для удаления остатков ДНК препарат РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) («Синтол», Россия). кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции с М-MLV обратной транскриптазой и слу чайными (random) гексапраймерами («Синтол», Россия). Количество и каче ство выделенной РНК и синтезированой кДНК проверяли спектрофотомет рически (SmartSpecPlus, «Био-Рад»). Амплификацию образцов проводили в приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 («Био-Рад»), используя наборы для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green («Синтол», Россия). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 1 мкл кДНК (100 нг), мкл реакционной смеси, по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 мкМ) (табл. 1), 1 мкл MgCl2 и 17 мкл деионизованной воды, свободной от нуклеаз.

В качестве референсного гена использовали актин. Протокол ПЦР: 5 мин при 95С, далее 45 циклов 15 с при 95С, 30 с при 56С. Специфичность продук тов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов: 1 мин при 95С, 1 мин при 50С, 10 с при 60С (80 циклов, повышая в каждом цикле темпера туру на 0.5С). Накопление транскриптов генов вычисляли по формуле:

Накопление транскриптов генов = 2Ст(контрольный) – Ст(тестовый образец), где Ст – значения пороговых циклов. В качестве контрольных образцов были выбраны кДНК, выделенные из растений, не подвергнутых воздействию низ кой температуры или сульфата кадмия.

Повторности и математическая обработка результатов. Повторность в пределах одного варианта опыта при анализе холодоустойчивости – 6 кратная, при биометрических измерениях 40-кратная, при определении про ницаемости мембран – 20-кратная, содержания кадмия – 3–5-кратная, со держания непротеиновых тиолов и пролина – 2–3-кратная, ПЦР-анализе – 2– 3-кратная. Каждый опыт повторяли не менее трех раз.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.