авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук На ...»

-- [ Страница 2 ] --

Таблица Нуклеотидная последовательность праймеров для проведения ПЦР в режиме реального времени Прямой (F) Нуклеотидная последовательность праймера и Ген обратный (R) 5… праймер F GGG ACC TCAC GGAT A ATCTAATG Actin R AACCTCCACTGAGAACAACATTAC F AAG CGG CTC CAT GAA CAA CT CG MYB80 R CTA AGG TAG GTG GTG AAT GTG AAA F CGG CAG GGC GGA CCA AGT TCA CBF1 R AGC CAG AGC CTG TAC CCT TGC F GAT AAG GGA GAG GCG GCG AGG GG DREB1 R ATG GAG CGA GAA GAG GGA CGA GA F CTC GCT GGA GAA TG CCG TGG TC CBF4 R GCA GCA TGT AGA GG CGT CGT TG F GGG AGC AAC CTC TTC CATAGTGT WCOR15 R CCAACCCTCACAACCCTTCACTA F ATT TGC TTC CTT TAC TCG TTT GG WRAB18 R TTT TTT GTC CTC GTT ATC CAT TT F GAA GGA ACC GCA ACG CCG ACG CC WRAB 15 R CTT ACG ACA GAT ACA AGA TAC AC F CAA GAT GGA GCA CCA GGG GCA DHN13 R CGC TCA TTC CAG TGG TGT GTC F CAC GGC ACT GGC GAG AAG AAA GG WCS120 R TGA TGT TCT CCA TGA CGC CCT TC F GTG GCT AAT CTC AGG AA ClpP R GCC CGA TAA TAA GCA CAT A F TCG CCA TAC TGC CGT TCC Lon1 R CCT GAA TCA CTG CCC AC F TTG CGT CTC CTC CTC CCA TCA CC GS1 R ACG AGT CGG CTG CGG CGA GGT GC F CCT CGC CTC CCT CTC CGT CGT GC PCS1 R AGT CGT GGA TGG TGG TCT GGT CG F GGA GAC AAG TCC CGT GTT GGT AG WP5CS R GCA GCA ACA GCC ATT TCA CGG AC Во всех случаях результаты экспериментов обработаны с использовани ем общепринятых статистических методов. На рисунках и в таблицах пред ставлены средние арифметические значения по нескольким независимым опытам и их стандартные ошибки. Достоверность различий между варианта ми опытов оценивали с помощью критерия Стьюдента (при P 0,05).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Реакция растений пшеницы на раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия 3.1.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы Одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, ли митирующих рост, развитие и продуктивность растений, является низкая температура (Туманов, 1979;

Дроздов и др., 1984;

Коровин, 1984;

Xin, Browse, 2000;

Sung et al., 2003;

Войников, 2013). Тяжелые металлы, также как низкая температура и другие экстремальные факторы, могут приводить к торможению роста растений, что рассматривают как их неспецифическую ответную реакцию на изменение внешних условий (Чиркова, 2002;

Кошкин, 2010). Нами были изучены закономерности изменения роста пшеницы не только при раздельном, но и совместном действии низкой закаливающей температуры и сульфата кадмия.

Проведенное изучение динамики изменения биометрических показате лей растений пшеницы (высота, длина и площадь 1-го листа) при действии ряда пониженных температур (4, 8 и 12С) показало, что чем ниже темпера тура, тем больше замедляются ростовые процессы (табл. 2). Так, например, у растений пшеницы контрольного варианта (при 22С) высота побега за 7 сут опыта увеличилась примерно на 70% по сравнению с исходным уровнем (табл. 3). В отличие от этого, уже в начальный период действия (1 сут) тем пературы 4С происходило практически полное прекращение роста побега пшеницы, через 2–3 сут начиналось частичное его восстановление, в резуль тате к концу эксперимента (на 7-е сут) высота побега превышала исходный уровень лишь примерно на 20%.

При действии температур 8 и 12С также наблюдалось торможение ро ста проростков пшеницы, однако в меньшей степени, чем при температуре 4С, в результате к концу опыта высота побега увеличивалась по сравнению с исходным уровнем на 25 и 35%, соответственно.

Сходный эффект температур 4, 8 и 12С отмечен и в отношении роста 1-го листа пшеницы. Установлено, что воздействие наиболее низкой темпе ратуры (4С) оказывало самое сильное отрицательное влияние на линейные размеры 1-го листа (табл. 2, 3). В этом случае длина листа за 7 сут опыта уве личилась лишь на 24%, в то время как при температуре 22С за такой же промежуток времени – на 47% (табл. 3). Замедление роста 1-го листа наблю дали и при температурах 8 и 12С, однако в меньшей степени, чем при тем пературе 4С (табл. 2, 3). Так, за 7 сут воздействия температуры 8С прирост составил около 30%, а при 12С – 40% (табл. 3).

Аналогичные результаты получены и при изучении изменения площади 1-го листа растений пшеницы при воздействии низких температур. Наиболь шее негативное влияние на площадь 1-го листа оказывала температура 4С (табл. 4). Прирост площади листа в этом случае за 7 сут опыта составил око ло 30%, в то время как в контроле – 53%. Меньшее отрицательное воздей ствие на площадь листа проявлялось при температурах 8 и 12С: ее прирост по отношению к исходному уровню составил 38 и 45%, соответственно.

Таким образом, выявлена прямая зависимость изменения роста растений пшеницы от воздействия на них температуры: чем ниже температура, тем более выражено ее негативное влияние на ростовые процессы. Полученные данные также показали, что хотя при действии температур 4, 8 и 12С проис ходит торможение роста пшеницы, однако полного его ингибирования не об наружено. Это свидетельствует о способности растений пшеницы поддержи вать процессы жизнедеятельности в изменившихся условиях и адаптировать ся к ним.

Таблица Влияние низких температур на ростовые показатели растений пшеницы Экспозиция, Вариант сут 22°С 4°С 8°С 12°С Высота растений, см 17,5±0,1 15,5±0,3 17,8±0,3 18,3±0, 19,8±0,2 15,9±0,3 18,4±0,3 19,8±0, 22,2±0,1 16,3±0,3 19,2±0,3 21,2±0, 23,3±0,1 16,8±0,3 19,9±0,3 22,5±0, 27,9±0,3 17,8±0,3 21,6±0,3 24,3±0, 30,0±0,3 18,5±0,3 22,2±0,3 24,7±0, Длина 1-го листа, см 13,6±0,2 12,0±0,3 14,0±0,3 14,9±0, 16,1±0,2 12,3±0,3 14,7±0,3 16,1±0, 18,7±0,1 12,8±0,3 15,4±0,3 17,5±0, 19,7±0,1 13,2±0,3 16,1±0,3 18,8±0, 20,0±0,1 14,3±0,3 17,8±0,3 20,5±0, 20,1±0,1 14,8±0,3 18,3±0,3 20,6±0, Таблица Относительная величина изменений показателей роста пшеницы в зависимости от интенсивности и продолжительности действия низких температур Значение показателя по отношению к исходному уровню, % Экспозиция, сут вариант 22°С 4°С 8°С 12°С Высота растений 0 100 100 100 113* 108* 1 102 127* 105* 107* 116* 133* 108* 111* 123* 159* 115* 121* 132* 171* 119* 125* 135* Длина 1-го листа 0 100 100 100 118* 105* 108* 1 137* 107* 110* 118* 145* 110* 115* 127* 147* 119* 127* 138* 147* 124* 131* 139* *Здесь и в последующих таблицах отличия от исходного уровня (22С) достоверны при Р0.05.

Таблица Влияние низких температур на площадь 1-го листа растений пшеницы Площадь листа, % к исходному уровню Исходный Температура, уровень, экспозиция, сут °С см 0 1 2 3 6 121* 144* 150* 153* 153* 3,4±0, 22 113* 123* 128* 2,9±0, 4 100 104 114* 120* 133* 138* 3,4±0, 8 100 109* 119* 129* 144* 145* 3,8±0, 12 Отрицательное воздействие низких температур на ростовые процессы растений связано с их влиянием на процессы деления и растяжения клеток (Родченко и др., 1988;

Кошкин, 2010). Для ряда видов растений были уста новлены пороговые температуры, при которых возможно медленное митоти ческое деление или происходит полное его прекращение (Гриф, 1981). Одна ко отмечено, что низкая температура вызывает не столько торможение, сколько изменение характера роста у растений пшеницы, что может быть обусловлено сокращением числа делений, и одновременной стимуляцией об разования митохондрий в клетках (Кислюк, 1985). Наряду с влиянием низких температур на деление клеток, воздействие на рост растений связано с изме нением ряда физиолого-биохимических процессов, в том числе реакций фо тосинтеза (Pocock et al., 2001;

Theocharis et al., 2012), а также ультраструкту ры клеток (Климов и др., 1997;

Трунова, 2007).

В ходе нашей работы полное прекращение роста листа проростков ози мой пшеницы наблюдали только в течение первых суток действия темпера тур 4 и 8С. В дальнейшем отмечен медленный рост листа, и в результате к концу опыта (через 7 сут) его линейные размеры превышали исходный уро вень в зависимости от температуры примерно на 25 – 40%. Эти данные под тверждают точку зрения, согласно которой поддержание активной работы фотосинтетического аппарата у озимых злаков и повышение их устойчивости в период действия пониженных температур осуществляется на фоне тормо жения ростовых процессов (Hurry et al., 1995;

Климов, 2003;

Венжик и др., 2012). Такое торможение роста можно рассматривать как защитно приспособительную реакцию растений, поскольку при действии низких тем ператур происходит перестройка метаболизма в целом и сдвиг энергетиче ского баланса в сторону усиления синтеза резервных, энергетических и про текторных соединений, таких как углеводы, необходимых растению для уве личения устойчивости к холоду (Чиркова, 2002;

Smallwood, Bowles, 2002;

Климов, 2009;

Wenifield et al., 2010).

Результатом подобного рода изменения является преобладание донор ной функции (фотосинтеза) над акцепторной (рост) (Климов и др., 1997;

Трунова, 2007;

Климов, 2008). Более того, считается, что торможение роста является необходимым условием повышения морозоустойчивости растений, однако только этого не достаточно, необходимы и перестройки метаболизма в целом (Туманов, 1979;

Родченко и др., 1988;

Войников, 2011).

Как отмечалось ранее, торможение роста является общим проявлением ответной реакции растений и на токсическое действие тяжелых металлов (Нестерова, 1989;

Гуральчук, 1994;

Vassilev, Iordanov, 1997;

Чиркова, 2002;

Титов и др., 2007 и др.). Установлено, что существует достаточно хорошо выраженная дозовая зависимость между концентрацией тяжелого металла, продолжительностью его воздействия и ростовыми показателями (Алексеева Попова, 1991;

Maksymiec, 1997;

Таланова и др., 2001а;

Shi, Cai, 2009;

Клаус и др., 2013).

В нашей работе было проведено изучение влияния сульфата кадмия в широком диапазоне концентраций (100 – 2000 мкМ) на ростовые показатели растений пшеницы, в результате которого установлено, что он во всех ука занных концентрациях приводит к торможению роста (табл. 5).

Таблица Влияние сульфата кадмия на ростовые показатели растений пшеницы Концентрация сульфата кадмия, мкМ Экспозиция, сут 0 100 200 500 700 1000 Высота растений, см 16,6±0,2 16,4±0,3 16,5±0,3 16,5±0,1 15,4±0,4 16,3±0,2 15,7±0, 19,5±0,2 18,3±0,7 18,4±0,3 17,4±0,4 16,7±0,4 16,6±0,1 16,1±0, 22,0±0,2 20,7±0,4 19,9±0,3 18,3±0,4 17,6±0,3 17,5±0,3 16,6±0, 22,9±0,1 21,5±0,5 20,7±0,3 18,9±0,4 18,2±0,3 18,2±0,3 17,0±0, 26,5±0,2 22,0±0,3 21,6±0,2 19,3±0,2 18,6±0,3 18,6±0,3 17,8±0, 28,3±0,2 22,2±0,3 21,8±0,1 19,5±0,2 18,7±0,3 18,6±0,3 17,8±0, Длина 1-го листа, см 13,4±0,2 12,9±0,3 12,9±0,2 12,7±0,3 12,2±0,4 13,0±0,3 13,0±0, 15,9±0,2 15,2±0,3 14,9±0,2 14,0±0,3 13,3±0,4 13,4±0,1 13,3±0, 18,0±0,2 17,0±0,3 16,3±0,3 14,9±0,3 14,3±0,4 14,0±0,1 13,6±0, 18,7±0,2 17,8±0,4 17,1±0,3 15,5±0,3 14,8±0,3 14,7±0,1 14,1±0, 19,3±0,3 18,5±0,3 17,9±0,1 15,9±0,2 15,3±0,3 15,1±0,9 14,5±0, 20,1±0,2 18,7±0,3 18,1±0,1 16,0±0,2 15,3±0,3 15,1±0,9 14,5±0, Таблица Относительная величина изменений ростовых показателей растений пшеницы в зависимости от концентрации и продолжительности действия сульфата кадмия Значение показателей по отношению к исходному уровню, % Экспозиция, концентрация сульфата кадмия, мкМ сут 0 100 200 500 700 1000 Высота растений 0 100 100 100 100 100 100 1 118* 112* 116* 106* 108* 102 2 133* 121* 126* 111* 114* 107* 106* 3 138* 126* 133* 115* 118* 112* 108* 6 160* 131* 139* 117* 121* 114* 113* 7 171* 132* 140* 118* 121* 114* 113* Длина 1-го листа 0 100 100 100 100 100 100 1 119* 118* 116* 110* 109* 103 2 134* 132* 126* 117* 117* 108* 3 140* 138* 133* 122* 121* 113* 6 144* 144* 139* 125* 125* 116* 112* 7 150* 145* 140* 126* 125* 116* 112* В частности, высота растений за 7 сут в контрольном варианте увеличи лась на 71%, в то время как под влиянием сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ ее прирост составил 32, 40, 18, 21, 14 и 13%, соответственно (табл. 5, 6). Аналогичное действие кадмий в исследуе мом диапазоне концентраций оказывал и на размеры 1-го листа (табл. 6). В частности, в контроле длина 1-го листа увеличилась на 50%, в то время как при воздействии сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ – на 45, 40, 26, 25, 16 и 12%, соответственно (табл. 6).

Сходное действие кадмия проявлялось при оценке его влияния на пло щадь 1-го листа. Так, ее прирост по отношению к исходному уровню в кон троле составил около 75%, а при действии сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ – 51, 41, 27, 36, 14 и 9%, соответственно (табл. 7).

Таблица Влияние сульфата кадмия на площадь 1-го листа растений пшеницы Площадь листа, % к исходному уровню Концентрация Исходный сульфата уровень, экспозиция, сут кадмия, см мкМ 0 1 2 3 6 3,2±0, 0 100 125* 134* 147* 163* 175* 3,3±0, 100 100 115* 127* 139* 149* 151* 3,4±0, 200 100 115* 127* 129* 135* 141* 3,3±0, 500 100 109 115* 121* 124* 127* 3,1±0, 700 100 107 116* 129* 136* 136* 3,6±0, 1000 100 103 108 114* 114* 114* 3,3±0, 2000 100 100 103 106 109 Следует отметить, что торможение роста растений пшеницы проявля лось уже через 1 сут от начала действия кадмия, а с увеличением его про должительности этот процесс заметно усиливался (табл. 5–7).

Известно, что отрицательное воздействие тяжелых металлов на рост растений обусловлено их влиянием на деление и растяжение клеток, с одной стороны, и нарушением метаболизма, с другой стороны (Ваулина и др., 1978;

Бессонова, 1991;

Кошкин, 2010). Установлено, что изменение скорости деле ния и растяжения клеток при действии тяжелых металлов обусловлено их способностью напрямую связываться с ДНК, влиянием на продолжитель ность митотического цикла, нарушением формирования микротрубочек и снижением пластичности клеточных стенок (Кошкин, 2010). Известно также, что тяжелые металлы оказывают неблагоприятное воздействие на рост опо средованно через другие физиологические процессы, в том числе фотосинтез, дыхание и минеральное питание (Титов и др., 2007).

На основании полученных данных можно заключить, что кадмий оказы вает негативное воздействие на рост растений пшеницы, однако полностью его ингибирует только при высоких концентрациях. Нами не выявлено зна чительной разницы в степени воздействия сульфата кадмия в концентрациях 100 – 200 мкМ на рост растений. Несмотря на большее торможение роста, при действии сульфата кадмия в концентрациях 500 – 700 мкМ высота расте ний и размеры 1-го листа продолжают увеличиваться. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что сульфат кадмия в концентрациях 100 – 700 мкМ оказывает негативное воздействие на рост, полностью его не инги бируя, на основании чего можно заключить, что повреждения растений в данном случае не происходит.

Однако при действии сульфата кадмия в концентрациях 1000 – мкМ наблюдалось резкое торможение и даже остановка роста, что может свидетельствовать о повреждающем эффекте этих концентраций на рост пшеницы.

На основании результатов этих исследований с использованием широко го диапазона концентраций сульфата кадмия (100 – 2000 мкМ) и пониженных температур (4, 8 и 12С) для дальнейших экспериментов нами были выбраны температура 4С и сульфат кадмия в концентрации 100 мкМ, при которых происходило заметное замедление роста, однако полного его ингибирования не обнаружено.

В наших опытах низкая температура (4С) действует на все растение, в том числе на надземную часть, а кадмий первоначально поступает в корне вую систему и только по истечении некоторого времени транспортируется в побег. В связи с этим нами было исследовано поступление кадмия в корни растений пшеницы.

Экспозиция, ч Рис. 1. Динамика содержания кадмия в корнях растений пшеницы при действии сульфта кадмия (100 мкМ) (а) и совместном действии сульфата кадмия и температуры 4С (б) Установлено, что уже через 1 час от начала действия сульфата кадмия наблюдалось его поступление в корни пшеницы (рис. 1а). По мере увеличе ния продолжительности воздействия кадмия, его содержание продолжало повышаться. Значительное накопление ионов кадмия в корнях проростков пшеницы также наблюдалось на 7-е сут эксперимента (32,46 мкг/г сырой массы). При совместном действии кадмия и низкой температуры накопление кадмия в корнях пшеницы наблюдалось через 1 ч от его начала, однако его уровень в данном случае был ниже, чем при действии только кадмия (рис.

1б). При более длительном совместном действии кадмия и низкой темпера туры его содержание продолжало увеличиваться, достигая максимума (6, мкг/г сырой массы) на 7-е сут опыта, однако и в данном случае оно было меньшим, чем действие только кадмия.

Таким образом, выявлено, что накопление кадмия в корнях растений пшеницы находится в прямой зависимости от продолжительности действия сульфата кадмия как при его раздельном, так и совместном действии с низ кой температурой. Отметим, что в случае совместного действия двух факто ров содержание кадмия в корнях пшеницы было значительно меньше, чем при обработке сульфатом кадмия в условиях обычной температуры. По скольку низкие температуры негативно влияют на поглощение и транспорт воды и ионов в растении (Трунова, 2007;

Медведев, 2013), то совместное действие двух факторов приводит к меньшему поглощению тяжелого метал ла и его накоплению в побеге пшеницы.

Учитывая, что в последующих опытах все изменения физиолого биохимических показателей проводились на 1-ом листе, нами было изучено содержание кадмия в листьях проростков пшеницы. Установлено, что через сут от начала действия сульфата кадмия на корни пшеницы происходит зна чительное поступление и накопление ионов кадмия в листьях (0,67 мкг/г сы рой массы) (рис. 2а). С увеличением продолжительности воздействия (2 – сут) его содержание продолжало нарастать, достигая максимума (4,05 мкг/г сырой массы) на 7-е сут (рис. 2а).

В случае совместного действия низкой температуры и кадмия его накопление в надземной части отмечено лишь через 2 сут, причем в меньшей степени, чем при действии только сульфата кадмия (рис. 2б). При более дли тельных экспозициях (2 – 7 сут) его уровень в листьях повышался, достигая максимума (0,6 мкг/г сырой массы) на 7-е сут эксперимента.

Экспозиция, ч Рис. 2. Динамика содержания кадмия в листьях растений пшеницы при действии сульфата кадмия (100 мкМ) (а) и совместном действии сульфата кадмия и температуры 4С (б) Как и при исследовании содержания кадмия в корнях пшеницы, в ходе изучения его накопления в листьях установлена линейная зависимость со держания этого металла от продолжительности воздействия сульфата кадмия на растения. Необходимо отметить, что как при действии только кадмия, так и его совместном действии с низкой температурой его накопление в листьях растений пшеницы было значительно меньше, чем в корнях.

Известно, что злаки, в том числе и пшеница, относятся к растениям ис ключателям – видам, у которых большая доля тяжелых металлов удержива ется в корневой системе, предотвращая тем самым их поступление в надзем ную часть. В связи с этим, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при поступлении кадмия в корни растений пшеницы в начальный период его действия (1 ч) активируются защитные механизмы, направленные на предотвращение поступления тяжелого металла в надземную часть.

Следует отметить, что на скорость поглощение кадмия растениями ока зывают влияние и другие факторы среды, в том числе низкая температура (Прасад, 2003). В частности, установлено, что у растений сафлора (Carthamus ssp.) поступление кадмия находится в прямой зависимости от температуры, на основании чего высказано предположение, что изменение температуры может способствовать повышению устойчивости растений к действию кад мия за счет влияния на его поглощение и транспорт по растению (Pourghasemian et al., 2013).

В дальнейшем нами было изучено влияние не только раздельного, но и совместного действия низкой температуры и кадмия на рост растений пше ницы на ранних этапах развития.

Установлено, что как раздельное, так и совместное действие низкой температуры (4С) и кадмия (100 мкМ) приводит к торможению роста пше ницы (табл. 8, 9). При этом ингибирование роста наблюдалось в большей степени под влиянием температуры 4С. Так, например, высота растений пшеницы по отношению к исходному уровню за 7 сут в контроле увеличива лась примерно вдвое, тогда как при 4С – всего на 19%, а при действии кад мия – на 33% (табл. 8, 9). Следует отметить, что в начальный период (1– сут) совместного действия двух факторов не происходило усиления тормо жения роста по сравнению с действием только низкой температуры. Более длительное совместное действие температуры 4С и кадмия приводило к большему снижению линейных размеров, чем их раздельное действие.

Таблица Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры (4С) и сульфата кадмия (100 мкМ) на ростовые показатели растений пшеницы Экспозиция, Вариант сут Контроль 4°С 4°С + Cd Cd Высота растений, см 16,0±0,1 15,5±0,3 16,7±0,2 17,0±0, 19,1±0,1 15,9±0,3 18,5±0,2 17,4±0, 21,8±0,1 16,3±0,3 17,7±0, 2 19,8±0, 23,6±0,1 16,8±03 20,9±0,2 17,9±0, 28,7±0,3 17,8±0,3 22,0±0,2 18,5±0, 31,0±0,4 18,5±0,3 22,1±0,2 19,0±0, Длина 1-го листа, см 12,5±0,1 12,0±0,3 12,8±0,2 13,5±0, 12,3±0,3 14,9±0,2 14,0±0, 1 15,3±0, 18,1±0,1 12,8±0,3 14,2±0, 2 16,1±0, 19,9±0,1 13,2±0,3 17,2±0,2 14,5±0, 20,4±0,1 14,3±0,3 18,3±0,2 15,0±0, 20,7±0,1 14,8±0,3 18,4±0,3 15,6±0, Таблица Относительная величина изменений ростовых показателей растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры (4С) и сульфата кадмия (100 мкМ) Значение показателя по отношению к исходному уровню, % Экспозиция, сут вариант Контроль 4°С 4°С + Cd Cd Высота растений 0 100 100 100 119* 1 102 111 136* 105* 119* 104* 148* 108* 126* 106* 180* 115* 132* 109* 194* 119* 133* 112* Длина 1-го листа 0 100 100 100 122* 116* 1 103 145* 107* 126* 105* 159* 110* 134* 108* 162* 119* 143* 111* 165* 124* 143* 115* Так, за 7 сут высота растений увеличилась лишь на 12 % (табл. 9), что свидетельствует о частичном суммировании негативных эффектов этих фак торов на ростовые процессы. Однако, как при раздельном, так и при сов местном действии температуры 4С и кадмия полного ингибирования роста не происходит.

Аналогичное действие низкая температура и кадмий оказывали на рост 1-го листа растений пшеницы (табл. 8, 9). Его длина за 7 сут в контроле уве личилась на 65%, тогда как при 4С – всего на 24%, а при действии кадмия – на 43%. При совместном действии этих факторов прирост длины 1-го листа составил только 15% (табл. 9).

Сходным образом изменялась и площадь 1-го листа (табл. 10). В контро ле площадь листа за 7 сут опыта увеличилась по отношению к исходному значению примерно на 80%, под влиянием низкой температуры – на 28%, а при действии кадмия – на 59%. Совместное действие низкой температуры и кадмия не оказывало дополнительного ингибирующего влияния на величину площади листа по сравнению с действием низкой температуры.

Таблица Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры (4С) и кадмия (100 мкМ) на площадь 1-го листа растений пшеницы Площадь листа, % к исходному уровню Исходный Вариант уровень, экспозиция, сут см 0 1 2 3 6 125* 154* 170* 176* 182* Контроль 3,1±0,1 113* 123* 128* 4С 2,9±0,1 100 104 117* 128* 140* 152* 159* 3,0±0, Cd 109* 113* 116* 121* 128* 4С + Cd 3,3±0,1 Следует отметить, что подобного рода данные о влиянии комбиниро ванного действия неблагоприятных температур и тяжелых металлов на ро стовые процессы растений в литературе единичны и противоречивы. В част ности, показано, что при пониженной температуре происходит усиление ток сического действия ионов кадмия на проростки ячменя (Гармаш, Головко, 2009). В отличие от этого, отмечена стимуляция роста растений фасоли при действии ионов меди и ртути в условиях пониженных температур (Jadallah, 1994). Наряду с этим, предварительная обработка низкой или высокой тем пературой проростков ячменя снижала ингибирующий эффект ионов свинца на накопление биомассы (Таланова и др., 1996;

Таланова и др., 2001б). По следовательное действие низкой температуры и свинца также приводило к торможению роста пшеницы и гречихи, однако, несмотря на это, полного его ингибирования и повреждения растений не отмечено (Мазей, Медная, 2011).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что заметное тормо жение роста происходит при воздействии низкой температуры 4С, тогда как кадмий в концентрации 100 мкМ оказывает меньшее негативное воздействие.

При совместном действии низкой температуры и кадмия наблюдалось сум мирование их эффектов на линейные размеры растений пшеницы, в резуль тате чего отрицательное воздействие на рост было более выражено, чем при раздельном действии этих двух факторов. Однако как при раздельном, так и при совместном действии полного ингибирования роста не происходит, что указывает на отсутствие их повреждающего воздействия на растения пшени цы.

Наряду с этим, полученные нами результаты показали, что в начальный период совместного действия сульфата кадмия и температуры замедление роста листа происходит в меньшей степени, чем при действии только низкой температуры, что может свидетельствовать о повышении устойчивости к не благоприятному фактору (низкой температуре) при действии фактора иной природы (ионы кадмия).

3.1.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на холодоустойчивость растений пшеницы Как известно, величина и скорость изменения холодоустойчивости рас тений зависят от закаливающей температуры и продолжительности ее воз действия (Дроздов и др., 1984;

Титов и др., 2006). Исследование процесса по вышения холодоустойчивости, проведенное на разных видах растений, в том числе томате (Дроздов и др., 1982), клевере (Холопцева, 2001), огурце (Титов и др., 1984), пшенице (Аюпова, 2000;

Титов и др., 2006), выявило также зна чительные их видовые и сортовые различия по устойчивости к низким тем пературам и способности закаливанию.

Нами была изучена динамика холодоустойчивости растений пшеницы при действии температуры 4С. В ходе исследований установлено, что уже через 0,5–5 ч от начала действия температуры 4С устойчивость листьев рас тений пшеницы к промораживанию достоверно возрастает, затем в течение 1–7 сут она продолжает увеличиваться, достигая максимума на 6–7-е сут (рис. 3). Ранее было показано, что при действии низкой закаливающей тем пературы достоверное повышение холодоустойчивости растений происходит уже через несколько часов после его начала, в частности у ячменя, капусты и озимой пшеницы сорта Мироновская 808 – примерно через 8 ч (Титов и др., 1989), тогда как у яровой пшеницы сорта Ленинградская 97 – через 1 сут от начала воздействия (Таланова и др., 2011). В ходе наших исследований было установлено, что под влиянием температуры 4С первоначальное повышение холодоустойчивости пшеницы сорта Московская 39 происходит уже через 0,5–1 ч.

Таким образом, растения озимой пшеницы сорта Московская 39 харак теризуются способностью быстро адаптироваться к действию низких темпе ратур.

Экспозиция, ч Рис. 3. Динамика холодоустойчивости растений пшеницы при действии температуры 4С (а), сульфата кадмия (б) и их совместного действия (в) Под влиянием кадмия также происходило быстрое, но меньшее по вели чине повышение устойчивости листьев к промораживанию, которое достига ло максимума на 3-и сут воздействия металла (рис. 3). Необходимо отметить, что совместное действие низкой температуры и кадмия также приводило к повышению холодоустойчивости проростков пшеницы через 5 ч от начала воздействия, а достигнутый при этом уровень практически не изменялся до конца эксперимента (рис. 3).

Отметим, что сведения относительно влияния тяжелых металлов на хо лодоустойчивость растений в настоящее время единичны. В частности, у проростков пшеницы сорта Мироновская 808 в начальный период действия низкой закаливающей температуры (2С) наряду с повышением холодо устойчивости наблюдали рост устойчивости к свинцу (Титов, Таланова, 2009). Подобного рода данные известны и в отношении арабидопсиса: низкая температура (4С) способствовала повышению устойчивости растений к свинцу (Cao et al., 2010). Показано также, что и высокие закаливающие тем пературы (38–40С) приводят к повышению устойчивости проростков пше ницы к свинцу в начальный период их действия (Таланова и др., 1996;

Титов и др., 2003). В опытах с огурцом также было установлено, что предваритель ная обработка проростков при 38С способствует снижению повреждающего действия свинца (Таланова и др., 1996). Таким образом, приведенные данные касаются только влияния свинца на устойчивость растений к экстремальным температурам. В связи с этим, подчеркнем, что нами впервые была выявлена способность растений пшеницы к увеличению холодоустойчивости при дей ствии кадмия и его совместном действии с низкой температурой.

В целом, совокупность полученных нами результатов свидетельствует о способности тяжелых металлов повышать холодоустойчивость, что может рассматриваться как подтверждение функционирования неспецифических ответных реакций и кросс-адаптации растений к действию абиотических факторов разной природы.

3.1.3. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и кадмия на проницаемость мембран клеток листьев растений пшеницы Воздействие разных экстремальных факторов, в том числе низкой тем пературы и тяжелых металлов, оказывает негативное влияние на структуру и проницаемость мембран клеток растений (Титов и др., 2007;

Трунова, 2007).

Неблагоприятные факторы среды разной природы вызывают повышение утечки электролитов из тканей, что свидетельствует о нарушении проницае мости мембран (Приходько, 1977). Одним из наиболее эффективных методов оценки степени повреждения мембран и устойчивости растений к действию абиотических факторов является кондуктометрический метод (Гришенкова, Лукаткин, 2005).

В ходе нашей работы было проанализировано изменение проницаемости мембран клеток листа при воздействии сульфата кадмия в широком диапа зоне концентраций (100–2000 мкМ). Установлено, что воздействие сульфата кадмия в концентрациях 1000–2000 мкМ в течение 7 сут вызывает достовер ное повышение выхода электролитов из тканей листа, указывающее на по вреждение растений. В отличие от этого, использование концентраций кад мия 100–500 мкМ не приводило к значительному повышению проницаемости мембран (рис. 4).

Полученные данные согласуются с результатами, представленными в разделе 3.1.1. В частности, нами было показано, что воздействие кадмия в концентрациях 100 – 700 мкМ не приводит к полному ингибированию роста проростков пшеницы, а значительной разницы в характере воздействия сульфата кадмия в указанных концентрациях не наблюдается. В отличие от этого, сульфат кадмия в высоких концентрациях (1000 – 2000 мкМ) заметно тормозит рост пшеницы, что в совокупности с полученными результатами по выходу электролитов из клеток листа, позволяет сделать заключение о про исходящем в данном случае повреждении растений.

Рис. 4. Зависимость выхода электролитов из листьев пшеницы от концентрации сульфата кадмия Продолжительность действия сульфата кадмия – 7 сут.

В целом, результаты изучения роста и проницаемости мембран клуток листьев свидетельствуют о том, что кадмий в диапазоне концентраций от 100 до 700 мкМ не оказывает повреждающего действия на проростки пшени цы.

В последующих экспериментах нами проанализирована динамика выхо да электролитов из листьев растений пшеницы при совместном и раздельном действии низкой температуры и кадмия. В этих исследованиях при действии низкой температуры (4С) на растения пшеницы не наблюдалось сколько нибудь заметных изменений выхода электролитов из листьев как в началь ный его период (1 ч – 1 сут), так и при более длительных экспозициях (2 – сут) (рис. 5).

Действие кадмия (100 мкМ) в начальный его период (1 ч – 1 сут) приво дило к некоторому повышению выхода электролитов из листьев пшеницы.

Однако при более длительном воздействии (2 – 7 сут) выход электролитов снижался и на 7-е сут не отличался от исходного уровня контроля, что согла суется с ранее полученными результатами (рис. 4).

В начальный период (1–5 ч) совместного действия низкой температуры (4С) и сульфата кадмия (100 мкМ), также как и при действии только кадмия наблюдалось некоторое повышение выхода электролитов, однако к концу эксперимента его значения были близки к контрольным (рис. 5). Повышение проницаемости мембран в начальный период действия кадмия и низкой тем пературы вполне согласуется с известными из литературы данными и являет ся одной из первых неспецифических реакций растений в ответ на действие абиотических факторов (Чиркова, 2002).

Рис. 5. Динамика выхода электролитов из листьев проростков пшеницы при действии низкой температуры (4°С) (1), сульфата кадмия (100 мкМ) (2) и их совместном действии (3) Ранее было показано, что воздействие тяжелых металлов на растения кукурузы вызывает неоднозначные изменения проницаемости мембран кле ток, в то время как при действии холода, приводящего к повреждению этого теплолюбивого вида, значения выхода электролитов из клеток листьев воз растают пропорционально длительности охлаждения (Гришенкова, Лукат кин, 2005). Значительное повышение проницаемости мембран у нескольких сортов пшеницы также наблюдали через 3 сут от начала действия низкой по вреждающей температуры (–5°С) (Kang et al., 2013). Слабое изменение выхо да электролитов при действии низкой температуры (4°С) и кадмия в концен трации 100 мкМ, обнаруженное в наших опытах, может свидетельствовать о том, что в этом случае не происходит нарушения проницаемости мембран клеток листьев пшеницы, а следовательно их повреждения. На основании по лученных данных можно заключить, что растения пшеницы адаптируются к использованным в наших экспериментах воздействиям низкой температуры и кадмия.

Результаты проведенного исследования биометрических показателей и устойчивости пшеницы к гипотермии и действию сульфата кадмия, характе ризуют реакцию целого растения на действие этих факторов. Необходимо отметить, что воздействие абиотических факторов разной природы приводит к общей перестройкой метаболизма растений, которая, в свою очередь, направлена на поддержание жизнеспособности организма в изменившихся условиях (Шакирова, 2001;

Чиркова, 2002). Выше было отмечено, что нега тивное воздействие низкой температуры и кадмия на ростовые процессы, в первую очередь, связано с их влиянием на рост делением и растяжением.

Помимо непосредственного влияния низкой температуры и тяжелых метал лов на деление и растяжение клеток необходимо отметить их опосредованное действие на рост, вызванное ингибированием фотосинтеза (Кошкин, 2010), дыхания (Лукаткин, 2009), нарушения гормонального баланса (Титов, Тала нова, 2009) и минерального питания (Титов и др., 2007). Совокупность всех этих изменений приводит к замедлению ростовых процессов и снижению накопления биомассы (Серегин, Иванов, 2001;

Stolt et al., 2003;

Chen et al., 2008;

Shi, Cai, 2009;

Molnarava, Fargasova, 2012;

Клаус и др., 2013).

Таким образом, судя по характеру изменения роста – интегрального по казателя, отражающего реакцию растений на изменение условий среды, низ кая температура 4С и сульфат кадмия в концентрации 100 мкМ не оказыва ют повреждающего действия на растения пшеницы.

Более того, даже их совместное действие не приводит к полному инги бированию роста проростков пшеницы. Еще более важен тот факт, что по вышение холодоустойчивости происходит не только под влиянием темпера туры 4°С, но и при воздействии кадмия, хотя и в меньшей степени. Подобно го рода данные могут рассматриваться как подтверждение функционирова ния неспецифических ответных реакций и кросс-адаптации (когда воздей ствие одного фактора способствует повышению устойчивости к другому фактору) растений к действию абиотических факторов разной природы.

В целом, совокупность полученных результатов свидетельствует об ак тивации под влиянием низких температур и кадмия механизмов адаптации растений пшеницы, что позволяет им сохранять жизнедеятельность даже при довольно длительном воздействии этих абиотических факторов.

3.2. Динамика накопления транскриптов генов в листьях пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия 3.2.1. Гены транскрипционных факторов В ответ на внешнее воздействие в клетке запускается каскадный меха низм передачи сигнала, в котором ключевую роль играют ДНК-связывающие белки – транскрипционные факторы (Udvardi et al., 2007). Транскрипционные факторы, как правило, характеризуются наличием специфического ДНК связывающего домена, сайта олигомеризации, домена регуляции транскрип ции и сигнал-распознающего домена, однако в структуре некоторых из них отсутствует специфический ДНК-связывающий домен или домен регуляции транскрипции (Goff et al., 1992;

Doebley, Lukens, 1998). За счет наличия спе цифических ДНК-связывающих доменов они способны регулировать (акти вировать или подавлять) экспрессию различных групп генов, в том числе ко дирующих белки, индуцируемые неблагоприятными воздействиями (Saleh, Pages, 2003). По содержанию специфических ДНК-связывающих доменов транскрипционные факторы подразделяются на различные семейства, такие как AP2/ERF (APETALA2/ethylene response factor), WRKY, NAC (NAM, ATAF1,2, CUP2), bHLH (basic helix-loop-helix), bZIP (basic leucine zipper), MYB (Myeloblastosis) (Yamaguchi-Shinozaki, Yamaguchi., 2006;

Медведев, Шарова, 2010;

Martin et al., 2010;

Wenfield et al., 2010;

Medina et al., 2011;

Licausi et al., 2013). Отметим, что в настоящее время идентифицировано до вольно много транскрипционных факторов, в частности 29 классов у араби допсиса, 16 из которых специфичны для растений (Riechmann et al., 2000).

Транскрипционные факторы являются важными регуляторными белка ми, контролирующими процессы роста и развития растений, и участвующи ми в процессах их адаптации к неблагоприятным факторам среды, играя ключевую роль в сигнальных путях (Медведев, Шарова, 2010). Усиление экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы, отмечено при воздействии на растения разных абиотических факторов, таких как обезво живание, засоление, низкие и высокие температуры и др. (Saleh, Pages, 2003;

Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 2006;

Mishra et al., 2009;

Morran et al., 2011;

Licausi et al., 2013).

В связи с этим представляет интерес изучение экспрессии генов, коди рующих различные транскрипционные факторы, для выяснения их роли в механизмах устойчивости растений к абиотическим факторам.

Одним из самых многочисленных семейств транскрипционных факторов у растений являются MYB, обнаруженные у всех эукариот (Медведев, Шаро ва, 2010;

Du et al., 2012;

Ambawat et al., 2013). Представители этого семейства содержат консервативный ДНК-связывающий домен – MYB (Feller et al., 2011;

Prouse, Campbell, 2013). Основываясь на количестве MYB доменов, се мейство подразделяется на 4 класса 1R-, R2R3-, 3R и 4R MYB белков (Feller et al., 2011;

Ambawat et al., 2013, Liu et al., 2013). В отличие от животных рас тения преимущественно содержат R2R3-тип MYB белков (Ambawat et al., 2013). Эти факторы транскрипции мультифункциональны и контролируют процессы роста, развития, включая пролиферацию клеток, развитие корня, образование корневых волосков и трихом, регуляцию клеточного цикла и циркадные ритмы, передачу фитохромного сигнала, метаболизма фенилпро паноида и биосинтез антоцианина, участвуют в гормональном сигналинге и в ответных реакциях растений на действие абиотических и биотических фак торов (Martin, Paz-Ares, 1997;

Медведев, Шарова, 2010;

Dubos et al., 2010;

Feller et al., 2011;

Mao et al., 2011;

Zhang et al., 2012;

Prouse, Campbell, 2013).

Белки MYB обнаружены и охарактеризованы у многих видов растений, в том числе и пшеницы (Chen et al., 2005;

Rahaie et al., 2010;

Zhang et al., 2012).

Нами было проанализировано накопление транскриптов гена MYB80, кодирующего транскрипционные факторы MYB, в листьях пшеницы.

Установлено, что накопление мРНК гена MYB80 происходит уже в начальный период (15 мин –1 ч) действия низкой температуры (рис. 6). При более длительных экспозициях (1–3 сут) содержание транскриптов этого гена снижалось, однако на 5 сут вновь возрастало и сохранялось на достигнутом уровне до конца эксперимента. Под влиянием сульфата кадмия значительное накопление мРНК также происходило через 15 мин от начала его воздей ствия, в дальнейшем содержание транскриптов поддерживалось на высоком уровне в течение 2 сут, а затем снижалось, но даже на 6–7 сут превышало ис ходные значения. Совместное действие низкой температуры и сульфата кад мия также приводило к быстрой индукции накопления транскриптов гена MYB80 в начальный его период (15 мин – 5 ч). На 1–3 сут отмечено некото рое снижение содержания мРНК MYB80, однако при более длительных экс позициях (5–7 сут) – вновь значительное его повышение.

В настоящее время известно, что гены, кодирующие транскрипционные факторы MYB, участвуют в повышении устойчивости растений к различным абиотическим факторам. В частности, засоление индуцировало повышение экспрессии гена AtMYB73 у арабидопсиса (Kim et al., 2012) и гена TaMYB1 у пшеницы (Lee et al., 2007). Повышение устойчивости растений к засухе наблюдалось при сверхэкспрессии гена AtMYB15 у арабидопсиса (Zhang et al., 2012), OsMYB55 у риса (Ambawat et al., 2013) и StMYB1R1 у картофеля (Shin et al., 2010). Кроме того, экспрессия гена TaMYB33 и TaMYB2a пшени цы у трансгенных растений арабидопсиса (Mao et al., 2011;

Qin et al., 2012) и гена AtMYB44 арабидопсиса у сои (Seo et al., 2012) приводила к повышению их устойчивости к засухе и засолению.

Экспозиция, ч Рис. 6. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена MYB в листьях пшеницы Относительно влияния тяжелых металлов и низкой температуры на экс прессию генов транскрипционных факторов MYB имеются лишь фрагмен тарные данные. Например, установлено, что кадмий и цинк повышают экс прессию генов MYB4, MYB10, MYB72, MYB43, MYB48 и MYB124 у растений арабидопсиса (Van de Mortel et al., 2008). Кроме того, показано, что в присут ствии кадмия значительно возрастает экспрессия гена MYB28 у растений ярутки (Weber et al., 2006).

Под влиянием низких температур повышение устойчивости растений к холоду сопровождалось индукцией экспрессии генов OsMYB3R-2 у риса и арабидопсиса (Dai et al., 2007;

Mao et al., 2011;

Zhang et al., 2012), OsMYB4 и TaMYB2a – у арабидопсиса (Mao et al., 2011;

Ambawat et al., 2013), OsMYB и OsMYB3R-2 – у риса (Dai et al., 2007;

El-Kereamy et al., 2012), TaMYB56-В – у пшеницы (Zhang et al., 2012). В то же время сведения об экспрессии генов транскрипционных факторов MYB при совместном действии низких темпе ратур и тяжелых металлов в известной нам литературе отсутствуют.

В целом, совокупность имеющихся в литературе и полученных в наших экспериментах данных свидетельствует об участии генов транскрипционных факторов семейства MYB в механизмах адаптации растений к абиотическим факторам разной природы.

Известно, что важную роль в регуляции экспрессии генов, в том числе генов, кодирующих белки холодового ответа, играет фитогормон абсцизовая кислота (АБК) (Knight et al., 2004;

Gusta et al., 2005;

Sun et al., 2009;

Таланова и др., 2011). Однако установлено, что в клетках функционируют как АБК зависимые, так и АБК-независимые пути передачи сигнала при действии не благоприятных факторов среды. В частности, транскрипционные факторы MYB участвуют в АБК-зависимом пути передачи сигнала, тогда как тран скрипционные факторы CBF и DREB – в АБК-независимых (Agarwal, Jha, 2010;

Hu et al., 2010;

Roychoudhury et al., 2013). В том и другом случае тран скрипционные факторы активируют экспрессию генов, кодирующих COR белки, что приводит к повышению холодоустойчивости растений.

В настоящее время предполагается, что участие транскрипционных фак торов MYB в повышении устойчивости растений к холоду может быть также связано и с их способностью активировать экспрессию генов транскрипци онных факторов CBF, которые, в свою очередь, играют ключевую роль в пе редаче сигнала в клетке при действии низких температур и способны активи ровать экспрессию генов белков холодового ответа (Chen et al., 2013).

В связи с этим нами в дальнейшем была исследована динамика накопле ния транскриптов генов CBF1 (CRT (C-repeat)-binding transcription factor) и DREB1 (DRE (dehydration-responsive element)-binding transcription factor) как при раздельном, так и совместном действии низкой температуры и кадмия.

Данные факторы транскрипции относятся к семейству AP2 и содержат специфические цис-элементы: DRE элемент (dehydration responsive element), представленный нуклеотидной последовательностью 5'-TACCGACAT-3' и CRT (C-repeat) – 5'-TGGCCGAC-3'. DRE цис-элемент играет важную роль в регуляции экспрессии генов при воздействии засухи. Впервые данный эле мент был обнаружен в промоторной области гена RD29A (Responsive to Des iccation 29A) арабидопсиса. Показано, что DRE элемент способен индуциро вать экспрессию гена RD29A не только при засухе и засолении, но также и при действии низких температур (Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994). CRT цис-элемент содержит коровый мотив 5'-CCGAC-3', который был обнаружен в промоторной области генов холодового ответа, в частности COR15а араби допсиса, BN115 рапса, WCS120 пшеницы, экспрессия которых индуцируется воздействием холода (Oullet et al., 1998;

Saleh, Pages, 2003;

Mishra et al., 2009).

В ходе нашей работы было установлено, что низкая температура инду цирует накопление транскриптов гена CBF1 уже в начальный период ее дей ствия (15–30 мин) (рис. 7). При более длительном воздействии наблюдалось снижение содержания мРНК гена CBF1, однако, в конце эксперимента (3– сут) оно вновь повышалось. На 7 сут содержание транскриптов было близ ким к исходным значениям.

Экспозиция, ч Рис. 7. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена CBF в листьях пшеницы Отметим, что воздействие кадмия также приводило к быстрой индукции накопления транскриптов гена CBF1 в начальный период его действия ( мин – 1 ч). Снижение содержания транскриптов гена CBF1 наблюдалось че рез 5 ч – 1 сут, однако при более длительном воздействии сульфата кадмия (2–6 сут) происходило накопление мРНК, которое и на 7 сут превышало ис ходные значения. Совместное действие низкой температуры и соли кадмия индуцировало накопление транскриптов гена CBF1 уже через 30 мин от начала его действия, которое поддерживалось на повышенном уровне в тече ние всего эксперимента.

Нами также была изучена динамика накопления транскриптов еще одно го гена – DREB1, кодирующего транскрипционный фактор DREB1. Показа но, что низкая температура индуцирует накопление транскриптов гена DREB1 уже через 15 мин от начала воздействия. В дальнейшем содержание мРНК гена DREB1 сохраняется на повышенном уровне до конца эксперимен та (в течение 7 суток) (рис. 8). Накопление транскриптов гена DREB1 также наблюдалось и под влиянием сульфата кадмия, уже через 30 мин от начала его действия. Достигнутый уровень мРНК сохранялся и при более длитель ных экспозициях (часы, сутки). Совместное действие двух исследуемых фак торов индуцировало накопление мРНК гена DREB1 в начальный период дей ствия (1–5 ч). Через 1 сут происходило повышение накопления транскриптов, тогда как на 2–3 сут отмечено снижение содержания мРНК, однако в даль нейшем (5–7 сут) уровень транскриптов гена DREB1 увеличивался, достигая максимума на 7 сут эксперимента.

Полученные данные относительно повышения экспрессии генов CBF1 и DREB1 уже в начальный период воздействия низкой положительной темпе ратуры согласуются с литературными сведениями. В частности, нами уста новлено, что активация этих генов у пшеницы происходит уже в первые ми нуты (15 мин) действия холода. У арабидопсиса активация экспрессии генов CBF также отмечена через 15 мин от начала действия низкой температуры (Thomashow, 2010). У проростков ячменя увеличение экспрессии генов HvCBF1 и HvCBF3 наблюдалась через 2 ч от начала холодового воздействия (Chei et al., 2002;

Xue, 2003). При исследовании генома рапса были выделены гены DREB семейства (BrDREB1C1, BrDREB1C2, BrDREB1D, BrDREB1F3), которые активировались низкими температурами уже через 30 мин от начала их воздействия (Lee et al., 2012).

Транскрипционные факторы семейства АР2, как предполагается, играют важную роль в устойчивости растений к воздействию холода. Известно, что CBF факторы транскрипции способны связываться с участками CRT/DRE, расположенными в промоторной области COR генов (Saleh, Pages, 2003;

Galiba et al., 2009;

Medina et al., 2010), также как и DREB, которые способны активировать RD/COR (responsive to dehydratation/cold-responsive) гены (Hobo et al., 1999;

Zhao et al., 2012).

Следует отметить, что в настоящее время довольно много работ посвя щено исследованию экспрессии генов CBF1 и DREB1 при воздействии низ кой температуры, однако сведения о влиянии тяжелых металлов на их экс прессию единичны. При этом зачастую данные литературы противоречивы, так как эксперименты проводились на разных объектах и при действии тяже лых металлов в различных концентрациях. Например, в экспериментах с проростками риса наблюдалась активация генов OsDREB1A и OsDREB1B в корнях под влиянием кадмия (Ogawa et al., 2009). В отличие от этого, у рас тений Limonium bicolor действие кадмия и меди в высоких концентрациях приводило к снижению содержания транскриптов гена LbDREB в листьях и корнях (Ban et al., 2011).


Необходимо подчеркнуть, что данных об экспрессии генов CBF1 и DREB1 при совместном действии низкой температуры и кадмия в известной нам литературе нет. На основании полученных результатов и анализа литера туры можно заключить, что гены транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 участвуют в неспецифических защитных реакциях растений на воз действие факторов среды разной природы.

Экспозиция, ч Рис. 8. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена DREB в листьях пшеницы 3.2.2. Гены COR/LEA белков Известно, что важную роль в механизмах повышения устойчивости рас тений к низким температурам играют гены холодового ответа, в том числе гены, кодирующие COR/LEA белки (Thomashow, 1998;

Rorat, 2001;

Jan et al., 2009). Воздействие низкой температуры приводит к повышению содержания транскриптов COR генов у ряда видов растений, в том числе у ячменя (Crosatti et al., 1995;

1999), табака (Shimamura et al., 2006), пшеницы (Zalun skaite et al., 2008) и др. В частности, у растений пшеницы обнаружено до вольно много COR генов (COR14b, COR719, WCOR14a, WCOR413, WCOR и др.), которые индуцируются низкой температурой (Kang et al., 2013).

В нашей работе проведено исследование накопления транскриптов гена WCOR15 в листьях проростков пшеницы как при действии низкой темпера туры, так и под влиянием кадмия и их совместного действия (рис. 9). Показа но, что уже через 15 мин от начала действия низкой температуры происходит повышение содержания мРНК гена WCOR15, в дальнейшем содержание транскриптов гена WCOR15 постепенно увеличивается на протяжении всего эксперимента (и в его конце в несколько раз превышает исходный уровень).

В присутствии сульфата кадмия повышение содержания мРНК гена WCOR15 наблюдалось также в начальный период его воздействия (минуты, часы), однако накопление транскриптов этого гена происходило менее ин тенсивно, чем под влиянием низкой температуры. На 6–7 сут от начала дей ствия соли кадмия содержание мРНК WCOR15 снижалось, в отличие от хо лодового воздействия, и сохранялось на слабо повышенном уровне на 7 сут эксперимента.

При совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия отме чено некоторое повышение содержания транскриптов гена WCOR15 в начальный период воздействия (15–30 мин), однако в дальнейшем уровень транскриптов снижался и сохранялся на достигнутом уровне. На 3–5 сут экс перимента наблюдалось повышение транскриптов гена WCOR15, однако на 6–7 сут содержание мРНК было близким к исходному.

Необходимо отметить, что в наших экспериментах в начальный период действия низкой температуры 4°С происходит повышение экспрессии генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 (рис. 7, 8), которые способны связываться со специфическими участками промоторных областей COR ге нов, тем самым индуцируя их экспрессию и, как следствие, синтез COR бел ков (Thomashow, 2010). Полученные нами данные также свидетельствуют о быстрой активации этих транскрипционных факторов в листьях проростков пшеницы под влиянием низкой температуры и повышении накопления тран скриптов гена WCOR15. COR белки и их гомологи идентифицированы у раз ных видов растений, в том числе у арабидопсиса (Thomashow, 1999;

Колес ниченко, Войников, 2003), рапса (Chen et al., 2011), ячменя (Crosatti et al., 1999), пшеницы (Shimamura et al., 2006) и др. В настоящее время наиболее изучен белок арабидопсиса COR15 (Колесниченко, Войников, 2003;

Кузне цов, Дмитриева, 2013). Данный белок синтезируется в цитоплазме, затем транспортируется и локализуется в строме хлоропластов (Crosatti et al., 1999;

Thomashow, 1999;

Takumi et al., 2003;

Xin, Browse, 2006;

Трунова, 2007).

COR15 – гидрофильный белок, при действии низких температур он повыша ет криостабильность мембран (Колесниченко, Войников, 2003;

Трунова, 2007;

Кузнецов, Дмитриева, 2013), предотвращая переход из ламеллярной в гексагональную фазу (Колесниченко, Войников, 2003;

Трунова, 2007) и как следствие, обеспечивает защиту хлоропластов при действии низких темпера тур на растения (Wu et al., 2012).

Экспозиция, ч Рис. 9. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена WCOR15 в листьях пшеницы В наших экспериментах показано, что к индукции экспрессии гена WCOR15 в листьях пшеницы приводит не только низкая температура, но также кадмий и их совместное действие. Подчеркнем, что подобные данные в известной нам литературе не известны. Считается, что экспрессия гена и последующий синтез белка COR15 индуцируется низкой температурой. В связи с этим можно предположить, что активация гена WCOR15 при дей ствии кадмия происходит опосредованно, так как обнаруженное нами накоп ление транскриптов факторов транскрипции CBF1 и DREB1 происходит как при действии низкой температуры, так и кадмия. Учитывая это, возможно, что накопление транскриптов гена WCOR15 при действии кадмия и его сов местном воздействии с низкой температурой связано с предшествующей ак тивацией экспрессии генов транскрипционных факторов (CBF1 и DREB1), и как следствие индукцией ими экспрессии этого гена. По нашему мнению, при воздействии кадмия происходит неспецифическое накопление тран скриптов гена WCOR15 (рис. 9), однако это не является достаточным доказа тельством его участия в отмеченном выше повышении устойчивости про ростков пшеницы к действию этого металла.

Другим не менее важным семейством генов, кодирующих LEA-белки, участвующие в процессах холодовой адаптации растений является семейство RAB (responsive to abscisic acid). LEA белки – водорастворимые низкомоле кулярные белки (Hong-Bo et al., 2005;

Колесниченко, Войников, 2003;

Вой ников, 2013), локализованные в различных компартментах клетки (Heyen et al., 2002;

Grelet et al., 2005). Экспрессия кодирующих их генов тканенеспе цифична (Hong-Bo et al., 2005). LEA-белки, включая RAB, играют важую роль в адаптации растений к действию абиотических факторов. Функциони руя как шапероны, они предотвращают агрегацию белков (Goyal et al., 2005) и препятствуют потере воды клеткой, стабилизируя клеточные мембраны при обезвоживании (Danyluk et al., 1998;

Колесниченко, Войников, 2003;

Toller et al., 2007;

Войников, 2013).

В нашей работе исследована экспрессия генов WRAB18 и WRAB15 при действии низкой температуры, кадмия и их совместном действии. В частно сти, показано, что через 1 сут от начала действия низкой температуры 4°С повышается накопление транскриптов гена WRAB18, сохраняющееся и при длительном действии (2 – 6 сут) холода (рис. 10). Через 7 сут отмечено неко торое снижение содержания транскриптов этого гена, хотя и в этом случае оно примерно в 3 раза превышало исходный уровень. При действии кадмия наблюдалось увеличение накопления мРНК гена WRAB18 уже в начальный его период (15 мин – 1 ч), в дальнейшем (5 ч – 7 сут) оно заметно усилива лось и сохранялось на повышенном уровне в течение всего эксперимента.

Совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия приводило к слабому повышению содержания транскриптов гена WRAB18 через 30 мин от начала действия, однако с увеличением его продолжительности до 1 сут и более накопление мРНК данного гена заметно усиливалось.

Установлено, что через 1 сут от начала действия температуры 4°С в ли стьях проростков пшеницы происходит резкое увеличение содержания тран скриптов гена WRAB15, которое сохранялось и при дальнейшем действии хо лода (рис. 11).

Воздействие сульфата кадмия на проростки пшеницы в течение первых суток практически не сказывалось на экспрессии гена WRAB15 в листьях, од нако при более длительных экспозициях (3–7 сут) происходило усиление накопления транскриптов этого гена, хотя и менее значительное, чем при низкой температуре. При совместном действии кадмия и низкой температуры на проростки пшеницы накопление транскриптов гена WRAB15 наблюдалось через 1 сут от начала и сохранялось на повышенном уровне до конца экспе римента.

Экспозиция, ч Рис. 10. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена WRAB18 в листьях пшеницы Экспозиция, ч Рис. 11. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена WRAB15 в листьях пшеницы Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что накопление транскриптов генов WRAB18 и WRAB15 значительно возрас тает в листьях пшеницы не только под влиянием низкой закаливающей тем пературы, но и кадмия, хотя и в меньшей степени. Поскольку в обоих случа ях происходит повышение холодоустойчивости проростков пшеницы, можно предполагать, что кодируемые этими генами белки семейства LEA непосред ственно участвуют в защитно-приспособительных реакциях, способствую щих формированию устойчивости к низким температурам и, соответственно, сохранению жизнеспособности растений в этих условиях.

Ранее было установлено, что низкие температуры активируют накопле ние гидрофильных осмопротекторных белков – дегидринов, также принад лежащих к LEA белкам (Колесниченко, Войников, 2003;

Войников, 2013).

Накопление дегидринов и увеличение экспрессии кодирующих их генов наблюдается в растениях и при воздействии разных неблагоприятных факто ров среды, таких как засуха, засоление, низкая температура (Shinozaki, Ya maguchi-Shinozaki, 2007;

Dalal et al., 2009;

Wenfield et al., 2010;

Kosova et al., 2012).


В нашей работе исследовалась экспрессия двух генов дегидринов – WDHN13 и WCS120.

В экспериментах зафиксировано значительное повышение уровня экс прессии гена WDHN13 дегидрина, которое наблюдалось в начальный период действия (15 мин –1 ч) закаливающей температуры 4°С (рис. 12). При более продолжительном действии холода (1–6 сут) уровень экспрессии гена WDHN13 увеличивался, а через 7 сут несколько снижался, но и в этом случае превышал исходные значения. Под влиянием ионов кадмия усиление экс прессии гена WDHN13 дегидрина в листьях пшеницы отмечено уже через мин, в дальнейшем повышенный уровень накопления транскриптов гена со хранялся в течение 6 сут и лишь на 7 сут происходило его снижение.

Экспозиция, ч Рис. 12. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена WDHN13 в листьях пшеницы При совместном действии двух факторов происходило повышение со держания мРНК гена WDHN13 через 30 мин от его начала, однако более зна чительное повышение отмечено через 1 сут, которое сохранялось до конца эксперимента.

К дегидринам, активируемым холодом у пшеницы, принадлежат белки семейства WCS120 (Колесниченко, Войников, 2003). В нашей работе прове дено изучение экспрессии гена дегидринов WCS120, относящегося к семей ству генов WCS (wheat cold-specific), специфичному для злаковых растений (Fowler et al., 2001;

Wenifield et al., 2010). В ходе исследований было уста новлено, что в начальный период (15 мин – 5 ч) действия температуры 4С происходит незначительное повышение содержания транскриптов гена WCS120, в то время как при более длительных экспозициях (1 – 7 сут) отме чено резкое увеличение содержания мРНК гена WCS120, сохраняющееся на повышенном уровне до конца эксперимента (рис. 13). Напротив, сульфат кадмия не оказывал существенного влияния на содержание транскриптов ге на WCS120: в этом случае в течение всего эксперимента содержание мРНК практически не превышало исходные значения. Совместное действие низкой темперауры и кадмия приводило к повышению мРНК гена WCS120 в началь ный его период (30 мин – 5 ч), через 1 сут происходило еще более значитель ное его увеличение, которое сохранялось на достигнутом уровне до конца эксперимента.

Экспозиция,ч Рис. 13. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена WCS в листьях пшеницы Необходимо отметить, что повышение экспрессии гена WCS120 в ли стьях проростков пшеницы при действии низкой температуры согласуется с литературными данными, в частности обнаружено повышение экспрессии гена WCS120 у пшеницы при 5С (Kosova et al., 2011, 2013) и его гомологов у ячменя при 10 С (Fowler et al., 2001). Считается, что данный ген специфиче ски индуцируется у растений пшеницы при действии низкой температуры, поскольку при других неблагоприятных воздействиях – высокой температуре и засухе, повышения экспрессии гена WCS120 не наблюдалось (Houde et al., 1992). Отметим, что подобные данные о влиянии тяжелых металлов на экс прессию гена WCS120 у пшеницы к настоящему моменту не известны. Одна ко, полученные нами результаты изучения его экспрессии под влиянием кад мия также могут свидетельствовать в пользу предположения о специфично сти экспрессии гена WCS120 и, соответственно, синтеза белка WCS120 толь ко при гипотермии. Обнаруженное повышение накопления транскриптов ге на WCS120 при совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия также, по-видимому, связано с реакцией растений на низкую температуру, а не на действие кадмия. Возможно, что при одновременном действии двух факторов низкая температура оказывает превалирующее влияние на расте ния, поскольку накопление мРНК гена WCS120 и при низкой температуре, и при ее совместном действии с кадмием происходит преимущественно при длительных экспозициях (1–7 сут).

3.2.3. Гены протеолитических ферментов Как известно, одной из ранних неспецифических реакций растений на действие неблагоприятных факторов среды разной природы выступает уси ление процессов биодеградации, среди которых особое место занимает про теолиз – ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируемый про теолитическими ферментами (Блехман, Шеламова, 1992;

Huesgen, Overall, 2012;

Petzold et al., 2012). В этом случае протеолитические ферменты, кон тролируя процессы деградации и модификации белков, препятствуют накоп лению неактивных ферментов или поврежденных белков и пептидов в клет ках растений (Мосолов и др., 2001). Помимо этого, протеолитические фер менты участвуют в регуляции многих физиолого-биохимических процессов посредством реакций ограниченного протеолиза (Валуева, Мосолов, 2002;

Kwasniak, 2012;

Chichkova et al., 2012;

Petzold et al., 2012;

Resquet,2012;

Wag ner, Funk, 2012). Исходя из этого, исследование системы внутриклеточного протеолиза в адаптации организмов является одной из важных задач эколо гической биохимии.

Особый интерес представляет изучение АТФ-зависимых протеиназ – Lon или Pim1 (proteolysis in mitochondria) и ClpP (caseinolytic protease), лока лизованных в хлоропластах и митохондриях (Olinares et al., 2011;

Ambro et al., 2012;

Clarke et al., 2012;

Fischer et al., 2012;

Petzold et al., 2012;

Rigas et al., 2012;

Voos, 2013), так как в указанных органеллах протекают жизненно важ ные энергозависимые процессы фотосинтеза и дыхания. Протеолитические ферменты Lon и ClpP принадлежат к семейству протеиназ FtsH (filament forming temperature-sensitive) (Tsiatsiani et al., 2012;

Voos, 2013). Известно, что внешние факторы, такие как температура и тяжелые металлы, могут вли ять на структуру и функцию ферментов, в том числе и протеиназ (Немова, Бондарева, 2005;

Лысенко и др., 2011;

Кошкин, 2010). Ранее было установле но, что влиянием низкой закаливающей температуры у пшеницы происходит усиление экспрессии генов сериновых и цистеиновых протеиназ (Фролова, 2008;

Фролова и др., 2011;

Таланова и др., 2012). Усиление экспрессии генов цистеиновых протеиназ отмечено под влиянием низкой температуры у тома та (Schaffer, Fisher, 1988), в условиях засухи – у арабидопсиса (Koizumi et al., 1993), при засолении – у гороха (Jones et al., 1995), при аноксии – у кукурузы (Subbaiah et al., 2000).

В наших исследованиях была проанализирована динамика накопления транскриптов генов ClpP и Lon1, кодирующих хлоропластные протеолитиче ские ферменты, при действии низкой температуры и кадмия, а также их сов местном действии. В частности, при действии температуры 4С отмечено слабое повышение содержания мРНК генов ClpP и Lon1 уже через 15 мин от его начала, которое сохранялось до конца эксперимента (рис. 14, 15). Под влиянием кадмия происходило более значительное накопление транскриптов генов ClpP и Lon1, чем при действии низкой температуры, уже через 15 мин от начала воздействия. Через 30 мин и 1 ч наблюдалось некоторое снижение накопления транскриптов генов ClpP и Lon, соответственно, однако содер жание мРНК оставалось на повышенном уровне относительно исходного значения. Совместное действие этих факторов через 15 мин от его начала также приводило к повышению накопления транскриптов генов ClpP и Lon1, которое сохранялось и при более длительном воздействии. Однако при сов местном действии двух факторов содержание транскриптов гена ClpP не сколько снижалось через 2 сут от его начала, хотя достигнутое значение пре вышало исходное, в то время как через 2 сут накопление транскриптов гена Lon1, вновь увеличивалось и сохранялось на повышенном уровне до конца эксперимента.

Содержание транскриптов, отн. ед.

Экспозиция, ч Рис. 14. Влияние температуры 4С (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена ClpP в листьях пшеницы Содержание транскриптов, отн. ед.

Экспозиция, ч Рис. 15. Влияние температуры (4°С) (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена Lon в листьях пшеницы Известно, что повышение экспрессии генов различных протеолитиче ских ферментов происходит при действии неблагоприятных факторов среды на растения, в частности низкой температуры (Schaffer, Fisher, 1998;

Фролова и др., 2011), засухи (Koizumi et al., 1993), засоления (Pernas et al., 2000) и др.

Однако сведения о влиянии совместного воздействия двух абиотических факторов разной природы на экспрессию генов протеолитических ферментов к настоящему времени нет. Полученные нами результаты могут свидетель ствовать об участии данных ферментов в неспецифических защитных реак циях уже в начальный период действия неблагоприятных факторов.

В целом, на основании полученных данных можно сделать вывод об участии ряда генов (WRAB15, WRAB18, WCOR15, WDHN13) COR/LEA белков и хлоропластных протеиназ (Lon1, ClpP) в неспецифических адаптивных ре акциях растений в ответ на действие абиотических факторов разной приро ды. Вместе с тем накопление транскриптов гена WCS120 семейства COR/LEA, указывает на его участие в большей степени в защитных реакциях на действие низких температур, чем на действие тяжелых металлов.

3.3. Роль низкомолекулярных защитных соединений в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и сульфата кадмия 3.3.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание непротеиновых тиолов в листьях пшеницы Различные неблагоприятные факторы среды напрямую или опосредо ванно могут приводить к усилению накопления свободных форм кислорода и соответственно активации антиоксидантных систем, включающих и низко молекулярные антиоксиданты (Чиркова, 2002;

Кошкин, 2010;

Колупаев, Кар пец, 2010). Одним из важнейших антиоксидантных низкомолекулярных со единений, характерных для всех живых организмов, является глутатион (Foyer, Noctor, 2005;

Noctor et al., 2012;

Seth et al., 2012). Как отмечалось вы ше, он представляет собой трипептид, состоящий из остатков трех аминокис лот: цистеина, глицина и глутамина (-глутамилцистеинилглицин) (Серегин, 2001;

Estrella-Gomez et al., 2012;

Gallego et al., 2012;

Anjum et al., 2012). Ан тиоксидантное действие глутатиона показано как у растений, так и у живот ных при различных неблагоприятных факторах (Noctor et al., 2012), в том числе низких температурах (Wu et al., 2008). Кроме того, глутатион и его производные фитохелатины, являются ключевыми хелатирующими агента ми, участвующими в механизмах детоксикацции тяжелых металлов (Феник и др., 1995;

Серегин, 2001;

Pal, Rai, 2010;

Anjum et al., 2012).

Исходя из этого, нами было проанализировано содержание глутатиона, как одного из важных низкомолекулярных антиоксидантов, в корнях и ли стьях растений пшеницы на ранних этапах развития.

Рис. 16. Влияние сульфата кадмия (100 мкМ) на содержание глутатиона в корнях пшеницы Согласно представленным в главе 3.1 данным (рис. 1а), через 1 ч от начала воздействия сульфата кадмия, наблюдалось его поступление в корни растений пшеницы. Содержание глутатиона в корнях пшеницы, также значи тельно возрастало через 1 ч от начала действия сульфата кадмия (что совпа дает по времени с поступлением ионов кадмия в корни), достигая максимума через 5 ч (рис. 16). При увеличении продолжительности его действия (1 – сут) на растения пшеницы отмечено некоторое снижение содержания глута тиона, однако даже в конце эксперимента (6–7 сут) оно сохранялось на по вышенном уровне.

Полученные данные свидетельствуют о том, что уже в начальный пери од действия сульфата кадмия, в корнях растений пшеницы происходит акти вация защитных механизмов, направленных на предотвращение поступления ионов кадмия в надземную часть, важную роль среди которых играет повы шение содержания глутатиона, являющегося хелатирующим агентом.

В дальнейшем, нами было проанализировано содержание глутатиона и в листьях растений пшеницы на ранних этапах развития.

В ходе исследований обнаружено, что при действии низкой температуры содержание глутатиона в листьях проростков пшеницы поддерживается на повышенном уровне в начальныйего период, а в дальнейшем – постепенно снижается (рис. 17). Тем не менее, даже на 7-е сут опыта его содержание в листьях было довольно высоким.

В начальный период действия сульфата кадмия (15 мин – 1 сут) наблю далось повышение содержания глутатиона, тогда как в дальнейшем происхо дило его снижение. Значительное уменьшение (примерно в 2 раза) содержа ния глутатиона отмечено на 7-е сут. Совместное действие низкой темпера туры и сульфата кадмия в начальный его период (30 мин – 1 сут) вызывало повышение содержание глутатиона, а затем также наблюдалось снижение его уровня в листьях пшеницы, причем характер его изменения был сходен с та ковым при действии только низкой температуры: уменьшение содержания через 5 ч от начала опыта, и сохранение достаточно высокого уровня даже в его конце (на 7-е сут).

Необходимо отметить, что увеличение содержания глутатиона в листьях пшеницы коррелирует с повышением холодоустойчивости. Наибольшее воз растание устойчивости растений наблюдалось при действии низкой темпера туры, тогда как меньшее по величине повышение устойчивости к холоду происходило при действии сульфата кадмия. Это согласуется с полученными данными по содержанию глутатиона, когда большее повышение его содер жания зафиксировано в начальный период действия низкой температуры.

Как отмечалось выше, повышение содержания глутатиона в корнях может свидетельствовать об активации механизмов, направленных на предотвраще ние поступление кадмия в надземную часть, о чем также может свидетель ствовать повышение содержания глутатиона в листьях в начальный период сульфата кадмия и его совместного действия с низкой температурой, когда происходит поступление металла в корневую систему, однако накопление кадмия в листьях еще не обнаруживается (раздел 3.1, рис. 2а). Совокупность полученных данных может свидетельствовать об участии глутатиона в меха низмах адаптации растений к абиотическим факторам, связанное с его поли функциональным действием.

Экспозиция, ч Рис. 17. Влияние температуры (4°С) (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание глутатиона в листьях пшеницы Наряду с изучением содержания глутатиона, нами была проанализиро вана динамика накопления транскриптов гена GS1, кодирующего фермент глутатионсинтетазу. Необходимо отметить, что данный фермент катализиру ет второй этап синтеза глутатиона (Серегин, 2001;

Estrella-Gomez et al., 2012).

При всех видах воздействия (раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия), наблюдалось повышение содержания мРНК гена GS1 (рис. 18). В частности, при действии температуры 4С накоп ление транскриптов гена глутатионсинтетазы происходило уже в начальный период ее действия (15 мин–1 ч), по мере увеличения продолжительности воздействия (5 ч–6 сут) накопление мРНК сохранялось на слабоповышенном уровне, снижаясь на 7-е сут эксперимента. В начальный период действия сульфата кадмия наблюдалось слабое повышение содержания транскриптов гена GS1, которое затем значительно повышалось через 2 сут. При более дли тельном воздействии отмечено снижение уровня транскриптов данного гена.

Совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия приводило к накоплению транскриптов гена GS1 в начальный период действия (30 мин– ч), которое немного снижалось при более длительных экспозициях, однако в течение всего эксперимента сохранялось на повышенном уровне.

Низкомолекулярные антиоксиданты, в том числе глутатион, играют важную роль в механизмах адаптации растений. Наряду с аскорбиновой кислотой, глутатион относится к водорастворимым антиоксидантам (Noctor, Foyer, 1998). Защитное действие глутатиона обусловлено его димеризацией в дисульфид, за счет окисления его SH-группы. Глутатион участвует в работе ферментативных антиоксидантов, восстановлении других низкомолекуляр ных антиоксидантов и способен непосредственно ингибировать активные формы кислорода (Меньщикова, Зенков, 1993;

Horemans et al., 2000, Лукат кин, 2002). Кроме непосредственного антиоксидантного действия, он участ вует в метаболизме растений – в поддержании окислительно восстановительного потенциала (Finkel, 2000;

Schafer, Buetter, 2001).

Экспозиция, ч Рис. 18. Влияние температуры (4°С) (а), сульфата кадмия (100 мкМ) (б) и их совместного действия (в) на содержание транскриптов гена GS в листьях пшеницы Необходимо отметить и его важную роль в механизмах детоксикации тяжелых металлов, за счет наличия SH групп, глутатион, а также его произ водные способны образовывать стабильные комплексы с ионами металлов и последующей компартментацией в вакуоли (Estrella-Gomez et al., 2012;

Gallego et al., 2012).

Одними из производных глутатиона являются фитохелатины, которые играют важную роль в механизмах детоксикации тяжелых металлов, в том числе кадмия. Как известно, фитохелатины не являются генными продукта ми, а синтезируются из глутатиона (Rauser, 1995;

Серегин, 2001;

Capdevila et al., 2012). Считается, что синтез фитохелатинов это специфическая защитная реакция растений в ответ на действие тяжелых металлов. Существует до вольно много данных, свидетельствующих о роли фитохелатинов в механиз мах устойчивости растений к действию различных тяжелых металлов (Clem ens et al., 1999;

Gupta et al., 2002;

Sun et al., 2007;

Estrella-Gomez et al., 2009, 2012;

Pal, Rai, 2010;

Gallego et al., 2012).

В связи с этим нами было изучено содержание фитохелатинов в корнях и листьях пшеницы на ранних этапах развития.

Рис. 19. Влияние сульфата кадмия (100 мкМ) на содержание фитохелатинов в корнях пшеницы Показано, что значительное повышение содержание фитохелатинов наблюдалось в начальный период действия сульфата кадмия (1 – 5 ч), когда происходило поступление и накопление ионов кадмия в корнях растений пшеницы. При более длительном воздействии наблюдалось уменьшение со держания фитохелатинов в корнях пшеницы, однако на 6 – 7 сут оно значи тельно превышало исходный уровень (рис. 19).

При изучении содержания фитохелатинов в листьях проростков пшени цы установлено, что уже через 15 мин от начала действия сульфата кадмия оно возрастало и продолжало увеличиваться при более длительных экспози циях (часы – сутки) (рис. 20б). Необходимо подчеркнуть, что повышение уровня фитохелатинов происходило на фоне снижения содержания глутатио на (рис. 17).

Более значительное накопление фитохелатинов в корнях растений пше ницы, может также свидетельстовать в пользу предположения об активации защитных механизмов в начальный период действия ионов кадмия. Как от мечалось ранее, фитохелатины участвуют в механизмах детоксикации тяже лых металлов, за счет образования хелатных комплексов. Можно предполо жить, что значительное накопление фитохелатинов в корнях растений приво дит к связыванию ионов кадмия в корневой системе и локализации образо вавшихся комплексов в вакуоли, что снижает поступление кадмия в листья.

Активизация защитных механизмов уже в начальный период действия суль фата кадмия направлена на предотвращение его поступления в надземную часть растений пшеницы. Полученные нами данные согласуются с извест ными сведениями о большем накоплении фитохелатинов в корнях растений ячменя (Akhter et al., 2013).

Считается, что синтез фитохелатинов является специфической защитной реакцией растений в ответ на действие тяжелых металлов (Clemens et al., 1999;

Cobbett, 2000;

Pal, Rai, 2010). Однако, данные о синтезе фитохелатинов при действии низкой температуре в известной нами литературе отсутствуют.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.