авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
-- [ Страница 1 ] --

Федеральное бюджетное учреждение наук

и «Санкт-Петербургский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

На правах рукописи

ВОСКРЕСЕНСКАЯ Екатерина Александровна

Новые подходы к микробиологическому мониторингу популяций

Yersinia.pseudotuberculosis и лабораторной диагностике

псевдотуберкулеза

03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор Ценева Г.Я.

Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ........................................................... Актуальность темы исследования................................... Степень разработанности темы исследования.......................... Распространение псевдотуберкулеза в России и мире. Источники, пути и факторы передачи инфекции............................. Современные методы этиологической диагностики инфекций, обусловленных иерсиниями.................................. Методы типирования Y. pseudotuberculosis. Применение молекулярно-генетических методов для микробиологического мониторинга циркуляции возбудителя...... Цели и задачи.................................................... Научная новизна................................................. Теоретическая и практическая значимость работы..................... Методология и методы исследования................................ Положения, выносимые на защиту.................................. Степень достоверности и апробация результатов...................... Глава 1. Генетическая структура популяций Y. pseudotuberculosis различного географического происхождения. Выбор метода генотипирования Y. pseudotuberculosis для микробиологического мониторинга возбудителя................................................... Характеристика Y. pseudotuberculosis на основе изучения полиморфизма 1.1.

рибосомальной ДНК (рДНК) методом риботипирования................ 1.1.1. Риботипирование штаммов Y. pseudotuberculosis из различных стран мира...................................................... 1.1.2. Риботипирование штаммов Y. pseudotuberculosis из различных регионов России............................................ Оценка геномного полиморфизма Y. pseudotuberculosis по маркерам 1.2.

IS1541 и IS285 методом RFLP...................................... 1.2.1. Выбор зонда для гибридизации................................ 1.2.2. IS-RFLP-типирование штаммов Y. pseudotuberculosis из различных стран мира................................................. 1.2.3. IS-RFLP-типирование штаммов Y. pseudotuberculosis из различных регионов России............................................ Глава 2. Совершенствование подходов к микробиологическому мониторингу циркуляции Y..pseudotuberculosis на основе применения комплекса методов выявления и типирования возбудителя.................... Сравнительная эффективность лабораторных методов диагностики 2.1.

при установлении этиологии групповых заболеваний................. Применение ПЦР при плановом микробиологическом мониторинге 2.2.

циркуляции возбудителя......................................... Микробиологический мониторинг популяций Y. pseudotuberculosis 2.3.

с использованием методов генотипирования......................... 2.3.1. Определение детерминант патогенности у различных риботипов и IS-типов Y. pseudotuberculosis............................... 2.3.2. Оценка эффективности методов внутривидового типирования при микробиологическом мониторинге возбудителя............. Глава 3. Совершенствование серологической диагностики иерсиниозов....... Разработка и лабораторные испытания тест-систем на основе 3.1.

рекомбинантных аналогов белков наружной мембраны патогенных иерсиний для выявления иммуноглобулинов М, А и G методом ИФА... Оценка диагностической эффективности тест-систем 3.2.

«Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG»................................... Глава 4. Применение методов этиологической диагностики для выявления различных форм иерсиниозов................................... Лабораторное обследование больных с абдоминальной 4.1.

патологией..................................................... Этиологическая диагностика панкреатитов, обусловленных 4.2.

иерсиниями.................................................... Оценка эффективности методов этиологической диагностики 4.3.

поражения суставов у больных при псевдотуберкулезе............... ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................... Выводы........................................................ Практические рекомендации...................................... Перспективы дальнейшей разработки темы.......................... Список использованных сокращений.................................... Список использованной литературы..................................... Приложения......................................................... ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Псевдотуберкулез относят к числу неконтагиозных сапрозоонозных нетрансмиссивных природно-очаговых заболеваний, распространенных преимущественно в странах с умеренным и холодным климатом. Эта острая инфекционная болезнь характеризуется цикличностью течения, лихорадкой, интоксикацией, катаральными явлениями, экзантемой (чаще скарлатиноподобной), преимущественным поражением органов пищеварительной системы и опорно-двигательного аппарата [4, 36, 57, 64].

Псевдотуберкулез является эндемическим заболеванием для ряда стран, в том числе России, Финляндии и Японии, где регистрируют групповые и спорадические случаи заболевания. В России псевдотуберкулез встречается практически повсеместно, однако наблюдается неравномерное распределение заболеваемости по территории страны. По данным официальной статистики наиболее высокие показатели заболеваемости в течение многих лет характерны для ряда областей Сибирского, Северо-Западного, Дальневосточного, Уральского федеральных округов. В 2012 г. они составили 4,69;

3,03;

1,54;

5,41 % ооо, соответственно, превышая среднероссийский показатель 1,19 %ооо [21].

Спорадические случаи псевдотуберкулеза регистрируются в странах Европы, Азии, Северной и Южной Америки, в Австралии.

Возбудителем псевдотуберкулеза являются бактерии вида Yersinia рseudotuberculosis, обладающие выраженной адаптационной способностью, широким спектром антигенов, плазмидных и хромосомных детерминант вирулентности, что обуславливает выраженный полиморфизм клинических проявлений. Отдельные симптомы, синдромы псевдотуберкулеза характерны более чем для 35 нозологических форм инфекционных, соматических, аллергических заболеваний. Это обуславливает как гипо-, так и гипердиагностику инфекции и приводит к развитию рецидивов, хронизации заболевания, особенно при спорадических случаях, доля которых в структуре заболеваемости псевдотуберкулезом в настоящее время возросла [5, 6, 13, 45, 60, 74, 78].

Таким образом, псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения. Одним из направлений повышения эффективности микробиологического мониторинга возбудителя и диагностики инфекции является совершенствование методов и средств индикации, внутривидовой дифференциации Y. pseudotuberculosis и определения специфических антител.

В лабораторной диагностике инфекции традиционно используют бактериологический метод и серологическое исследование для выявления антител к ЛПС-комплексу Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 в сыворотке крови методом РНГА. Однако эти диагностические методы не полностью отвечают требованиям практики. Отмечается низкая частота выделения возбудителя бактериологическим методом из различных видов исследуемого материала и длительность проведения анализа [53, 74]. Чувствительность выпускаемых диагностикумов для РНГА варьирует, что ограничивает эффективность метода [11, 12, 29, 30, 46]. Вместе с тем, в отдельных регионах страны заболевание вызывают также представители Y..pseudotuberculosis других серотипов [69, 120, 122]. Кроме того, существует вероятность завозных случаев из стран (Западная Европа, Китай, Япония), где циркулируют штаммы, относящиеся к серотипам, имеющим значение в патологии человека, но нехарактерным для территории России.

Данные о генетических детерминантах патогенности иерсиний позволили расширить диагностические возможности и создать новые препараты для обнаружения специфических антител, обладающие высокой диагностической эффективностью. Так, показано, что плазмида вирулентности pYV, присутствующая у патогенных иерсиний видов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и отдельных представителей вида Y. enterocoliticа, кодирует несколько групп белков наружной мембраны (БНМ), действие которых при развитии патологического процесса направлено на нейтрализацию иммунного ответа макроорганизма [100, 245]. На основе БНМ патогенных иерсиний за рубежом созданы тест-системы для определения иммуноглобулинов методом ИФА, применяемые для этиологической диагностики при различных формах и стадиях иерсиниозов, независимо от вида и серологической принадлежности возбудителей. В нашей стране рядом исследователей разработаны экспериментальные варианты тест-систем для ИФА с использованием различных антигенов Y. pseudotuberculosis, однако промышленный выпуск препаратов не осуществлялся [46, 50, 61].

Расшифровка структуры генома отдельных представителей рода Yersinia способствовала использованию молекулярно-генетических методов выявления (ПЦР-диагностика) и внутривидового типирования для целей мониторинга циркулирующих штаммов иерсиний, а также для изучения популяционной структуры и филогенетического анализа, в основном, Y. pestis [43, 65, 68, 154, 184, 197, 214, 232, 234]. При этом показана возможность использования таких молекулярных маркеров как IS-элементы и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов нуклеотидных последовательностей оперона рибосомной РНК для генотипической характеристики штаммов Y. pseudotuberculosis [7, 185]. Однако в отношении как глобальной, так и локальной российской популяции Y..pseudotuberculosis подобные исследования не проводились. Между тем, молекулярно-генетические исследования циркулирующих штаммов необходимы для выявления характерных и новых для территории наблюдения генотипов возбудителя псевдотуберкулеза.

Изложенное обосновывает необходимость разработки и внедрения в практическое здравоохранение методологических подходов к микробиологическому мониторингу популяций и Y. pseudotuberculosis диагностике псевдотуберкулеза на основе новых данных о возбудителе и применении эффективных методов и средств, что определило цель и задачи настоящей работы.

Степень разработанности темы исследования Распространение псевдотуберкулеза в России и мире. Источники, пути и факторы передачи инфекции Псевдотуберкулез относится к числу широко распространенных в мире болезней, благодаря выраженной адаптационной способности возбудителя.

Заболевание наиболее характерно для стран с умеренным и холодным климатом, что связано с психрофильными свойствами Y. рseudotuberculosis.

Официальная регистрация псевдотуберкулеза системой здравоохранения нашей страны введена в 1988 году. В России заболеваемость проявляется в виде эпидемических вспышек и спорадических случаев. В настоящее время в структуре заболеваемости на Сибирь, где проживает около 16 % населения России, приходится большинство случаев - 67,2 %, на Европейскую часть - 25, %, на Дальний Восток - 7,4 %. При этом в Сибири самое неблагополучное положение по заболеваемости наблюдается в Кемеровской, Томской, Новосибирской, Тюменской областях, в Республике Хакасия и Ханты Мансийском АО. Основное число заболеваний в северо-западном регионе отмечается в Санкт-Петербурге, Архангельской и Мурманской областях. В дальневосточном регионе псевдотуберкулез наиболее часто регистрируется в Камчатской, Сахалинской областях и в Приморском крае [67].

Кроме России заболевание является эндемическим для Финляндии и Японии, где заболеваемость также носит групповой и спорадический характер [148, 149, 184, 198, 236, 227].

Спорадические случаи псевдотуберкулеза регистрируют в странах Европы – Польше, Бельгии, Франции, Ирландии, Германии, Италии, а также в Китае, Корее, США, Канаде, Бразилии, Колумбии, Нигерии, Новой Зеландии, Австралии [98, 111, 112, 122, 132, 135, 150, 151, 155, 162, 183, 186, 228, 233, 241, 246, 250].

На территории бывшего СССР случаи заболевания выявлены в Казахстане, Грузии, Украине, Республике Беларусь [20, 40, 226, 59].

Источники и резервуары инфекции многообразны: носительство Y..pseudotuberculosis обнаружено у 210 видов млекопитающих, 17 видов птиц, видов пресмыкающихся, 1 вида земноводных, 7 видов рыб, около 50 видов членистоногих [33]. Инфицированность псевдотуберкулезным микробом такого большого числа видов животных позволяет считать, что ни один из них не является специфическим хозяином этого возбудителя, и свидетельствует о том, что при убиквитарном распространении его в природе все виды животных вовлекаются в процесс циркуляции микроба и, в зависимости от видовой чувствительности к нему, служат более или менее длительными резервуарами Y..pseudotuberculosis [182]. Однако в формировании и поддержании природных очагов инфекции основная роль принадлежит диким мышевидным грызунам, более восприимчивых к псевдотуберкулезу [44, 77, 118, 119, 152, 174, 178].

Наряду с природными очагами при псевдотуберкулезе формируются антропургические очаги, представляющие основную опасность для человека. В антропургических очагах инфекция распространена как среди диких грызунов (обыкновенные полевки, полевые мыши), заселяющих окраины населенных пунктов, так и синантропных (серые и черные крысы, домовые мыши).

Заражение животных происходит с инфицированной пищей. Возбудитель, локализуясь в желудочно-кишечном тракте грызунов, выделяется, в основном, с фекалиями. Это обусловливает обсеменение почвы, мелких непроточных водоемов, кормов и пищевых продуктов, обеспечивая дальнейшее заражение домашних и сельскохозяйственных животных [75, 76, 182, 156, 199, 216].

Психрофильность способствует длительному Y. pseudotuberculosis существованию его в воде или почве, которые являются промежуточными факторами передачи возбудителя человеку. Непосредственно почва не участвует в заражении человека в связи с незначительной концентрации в ней Y..pseudotuberculosis. Однако предполагается, что с частицами почвы на корне- и клубнеплодах возбудитель переносится в складские помещения, где концентрируется в небольшом пространстве хранилищ, находя оптимальные условия для накопления Происходит постоянный переход [33].

из окружающей среды с сапрофитическим способом Y..pseudotuberculosis существования в организм теплокровных, в котором возбудитель проявляет свои паразитические свойства и снова возвращается к сапрофитизму при попадании в окружающую среду [14, 55]. В связи с этим, псевдотуберкулез можно отнести к сапрозоонозным нетрансмиссивным природно-очаговым инфекциям, а заболевания людей следует трактовать как эпидемические проявления эпизоотического процесса [3, 36, 57].

Овощехранилища становятся искусственно созданным длительно существующим резервуаром возбудителя псевдотуберкулеза. Здесь сохраняется в межсезонный период, интенсивно Y..pseudotuberculosis размножается в холодный период года, первично накапливается практически на всех овощах зимнего хранения. Наиболее высокая зараженность установлена для овощей - свежей капусты, репчатого лука, моркови. В период хранения овощей и корнеплодов, вплоть до полной их реализации, происходит длительное накопление на них возбудителя с контаминацией тары, стен и пола овощехранилищ [53, 55].

Фекально-оральный механизм передачи иерсиниозов реализуется пищевым прямым (с сырыми овощами) или опосредованным (через оборудование, инвентарь или посуду) попаданием возбудителя в готовую пищу;

вторичным накоплением возбудителя в готовых блюдах при нарушении технологии приготовления последних и увеличении сроков их хранения);

контактно бытовым при непосредственном контакте с домашними (кошки, собаки) или содержащимися в неволе животными (животные зоопарков, декоративные птицы, морские свинки и т.д.) путями передачи инфекции [31, 32, 74].

Кроме овощей, возбудитель псевдотуберкулеза может передаваться с фруктами, молоком и молочными продуктами, мясом (чаще свиным), хлебобулочными, кондитерскими изделиями, водой из открытых водоемов, которые нередко загрязняются выделениями грызунов [53, 56, 121, 179, 183, 184].

Указанные экологические и эпидемиологические особенности псевдотуберкулеза обосновывают необходимость проведения постоянного микробиологического мониторинга циркуляции штаммов Y. pseudotuberculosis в различных объектах окружающей среды с использованием современных знаний о биологических свойствах возбудителя и эффективных диагностических методов и средств в целях предупреждения инфицирования людей и своевременного выявления псевдотуберкулеза.

Современные методы этиологической диагностики инфекций, обусловленных иерсиниями Многообразие клинических проявлений псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, наличие значительного числа случаев с атипичным и стертым течением нередко затрудняют клиническую диагностику инфекций и делает необходимым лабораторное подтверждение диагноза. В то же время, диагностические исследования являются важной составляющей при организации и проведении мониторинга возбудителей.

Существующие методы лабораторной диагностики иерсиниозов включают прямые методы, направленные на выявление возбудителя, его антигенов или ДНК, и непрямые (серологические) методы, выявляющие специфические антитела.

При использовании прямых методов диагностики основным материалом для исследования являются испражнения больного. Исследуют также мочу, смывы из ротоглотки, кровь, операционный материал. При эпидемиологическом обследовании отбирают материал от животных и птиц, с других объектов окружающей среды (смывы с овощей, столового инвентаря и оборудования, готовые блюда из сырых овощей, почва, вода).

Учитывая выраженные инвазивные свойства Y. pseudotuberculosis и большинства патогенных традиционное применение Y. enterocolitica, бактериологического метода не эффективно после 5-7–го дня от начала заболевания. Также выделение иерсиний из нативного материала затруднено из-за невысокой их концентрации по сравнению с сопутствующей микрофлорой.

Вместе с тем, выделение чистой культуры возбудителя из организма больного является подтверждением диагноза, и бактериологические исследования не утратили своей актуальности, особенно при групповых заболеваниях. Для повышения эффективности метода используют этап накопления иерсиний при температуре 4-6 оС - «холодовое обогащение» [193]. Использование в качестве среды накопления пептонно-калиевой среды (ПК) сокращает традиционные сроки проведения исследования в два раза, позволяя получать максимальное число положительных ответов к 7-10 суткам [53, 74]. Эффективно применение щелочной обработки проб, особенно из внешней среды, которая позволяет ингибировать значительную часть сопутствующей микрофлоры вследствие относительной резистентности иерсиний к действию щелочи [41, 85]. В качестве плотной среды, в основном, применяют дифференциально-диагностическую среду для выделения иерсиний с бромтимоловым синим (СБТС), разработанную Г.Я. Ценевой и соавт. (1993) и выпускаемую ФБУН ГНЦ ПМБ [63]. В дальнейшем проводят идентификацию выделенных культур иерсиний с использованием комплекса морфологических, культуральных, биохимических свойств с применением соответствующих субстратно-индикаторных сред, серологическое типирование иерсиний в реакции агглютинации на стекле с использованием диагностических сывороток. Определяют также вирулентность культур (Y..enterocolitica) в агглютинационном тесте с сывороткой, содержащей антитела к белкам наружной мембраны вирулентных иерсиний (СВИ) (сыворотки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Таким образом, бактериологическое исследование является достаточно трудоемким, при этом получить результаты удается ретроспективно (не ранее седьмого дня исследования). Отмечается также низкая частота выделения возбудителя бактериологическим методом из различных видов исследуемого материала от больных и из внешней среды. При этом подтверждение диагноза во время вспышек составляет 2-85 % случаев, при обследовании спорадических больных – 6 % [53, 66, 74].

Более чувствительным и экспрессным методом ранней диагностики псевдотуберкулеза является ИФА. Возможность применения ИФА с диагностическими целями при псевдотуберкулезе показана В.Н. Багрянцевым и соавт. (1985) [2]. В НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера разработана промышленная технология тест-системы для ИФА на основе высокомолекулярной фракции липополисахарида для выявления антигенов Y..pseudotuberculosis серотипа О:1. Сравнительное изучение показало, что по частоте получения положительных результатов на первой-второй неделях заболевания ИФА превосходит бактериологическое исследование в 2-4 раза [34, 35].

В ходе дальнейших исследований для решения задач клинической и эпидемиологической практики при псевдотуберкулезе сотрудниками Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока апробирован метод ПЦР, обладающий высокой чувствительностью. Этиологическое подтверждение заболевания у спорадических больных методом ПЦР получали в 12 раз чаще, по сравнению с бактериологическим методом [10, 65, 74]. При расследовании групповых заболеваний положительные результаты бактериологическим методом и методом ПЦР получали при исследовании клинического материала в 47 и 82 % случаев, соответственно, при исследовании смывов с объектов окружающей среды эти показатели составили 1,7 и 8,5 % [66, 74].

При диагностике псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза ПЦР позволяет выявить специфические участки генов, локализованных на плазмиде вирулентности иерсиний pYV или хромосоме, кодирующих ряд факторов патогенности. До недавнего времени исследование проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «АмплиСенс Yersinia pseudotuberculosis-ЕРh» и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-ЕРh» с визуальным учетом результатов после электрофореза продуктов амплификации в агарозном геле. В последние годы используют наборы «АмплиСенс Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis-FL» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»

(производство ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора).

Главными преимуществами методов ИФА и ПЦР являются высокая чувствительность, специфичность, возможность подтверждения диагноза на ранней стадии заболевания, а также быстрота получения результата, т.к. пробы исследуются в нативном виде. Однако их широкое внедрение ограничено, с одной стороны, различным уровнем оснащения учреждений практического здравоохранения, с другой - отсутствием методических документов федерального уровня, регламентирующих использование указанных диагностических препаратов. Как следствие, этиологическая диагностика различных форм заболеваний остается проблемной. Ретроспективность получения результатов бактериологическим методом отражается также на эффективности мониторинговых исследований.

Антитела к возбудителям псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза появляются в крови уже на первой неделе болезни, а существенное повышение их уровней происходит к началу третьей недели [11, 12, 38, 200]. На этих сроках диагностика основывается на выявлении специфических антител к различным антигенам и При этом нередко Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica.

этиологическое подтверждение диагноза можно получить только серологическими методами, особенно у спорадических больных. Прежде всего это касается случаев, когда исследования в раннем периоде болезни с применением прямых методов дали отрицательный результат, но совокупность клинических признаков в сочетании с эпидемиологическими данными обуславливают необходимость проведения дальнейших лабораторных исследований для возможного подтверждения предварительного диагноза иерсиниозов. В равной степени определяющее значение серологические методы имеют при обследовании больных с затяжным и хроническим течением инфекций. Они также важны при обследовании групп профессионального «риска».

Основные факторы вирулентности возбудителей, играющие ключевую роль в патогенезе иерсиниозов, имеют полидетерминантную природу. Регуляция экспрессии патогенных свойств осуществляется как хромосомными, так и плазмидными генами. Известно, что плазмида вирулентности pYV, присутствующая у патогенных иерсиний видов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и отдельных представителей вида Y. enterocoliticа, кодирует систему секреции типа III (TTSS) и несколько групп белков наружной мембраны (БНМ, Yops). В результате функционирования TTSS при контакте патогена с эукатиотической клеткой происходит транслокация определенных Yops, являющихся белками эффекторами, в цитозоль клетки-мишени [88, 97, 245]. При развитии инфекционного процесса действие белков-эффекторов, имеющих различные функции, ингибирует фагоцитоз и в целом направлено на нейтрализацию иммунного ответа макроорганизма.

Установлено, что в ходе заболевания при развитии гуморального иммунного ответа происходит образование антител к спектру белков наружной мембраны [38, 101, 103, 136, 139, 177, 223]. При этом, по данным ряда авторов, несколько Yops являются иммунодоминантными антигенами, что позволяет использовать их с диагностическими целями [95, 100, 113, 172, 200]. Так как плазмида вирулентности иерсиний является родоспецифической, pYV последовательности генов, кодирующих Yops, и, соответственно, сами белки, характеризуются высоким уровнем гомологии [17, 100, 123, 133, 138, 203].

Поэтому выпускаемые диагностические препараты на основе Yops выявляют антитела одновременно к Y. pseudotuberculosis и патогенным Y. enterocolitica.

При конструировании диагностических препаратов для серологической диагностики иерсиниозов в качестве антигенов возможно использование природных Yops, секретируемых иерсиниями в культуральную жидкость. Однако получение белков таким способом представляет собой трудоемкий многоэтапный процесс, при котором достаточно сложно достичь высокой степени очистки отдельных Yops,, выделяемых из смеси антигенов. Альтернативой является применение генно-инженерного метода молекулярного клонирования для получения их рекомбинантных аналогов, являющихся высокоспецифичными антигенами. Принцип метода заключается в создании рекомбинантных молекул ДНК в результате встраивания фрагмента специфической последовательности ДНК гена определенного Yop в ДНК плазмидного вектора в условиях in vitro.

Далее осуществляется трансформация клеток штамма-продуцента E. сoli образовавшимися рекомбинантными молекулами ДНК. При культивировании in vitro трансформированных бактерий в определенных условиях происходит экспрессия клонированного гена, биосинтез рекомбинантного Yop, далее осуществляется его выделение и очистка методом аффинной хроматографии [192]. Рекомбинантная ДНК и клетки клона, несущие ее, могут длительное время храниться, что позволяет использовать их в технологии получения необходимого белка.

Для диагностики ряда инфекций, в том числе иерсиниозов (псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз), самым информативным в данный момент считается метод иммуноблота. Достоинствами метода являются высокая чувствительность и специфичность, достигающие 95 %, а также возможность раздельного выявления антител классов M, G, A [200]. Это позволяет дифференцировать острое и хроническое течение инфекции, часто сопровождающееся иммунопатологическими осложнениями [94, 95, 99, 101, 200, 223]. В настоящее время на российском рынке присутствуют наборы реагентов производства Германии для качественного определения антител к Yops Y..pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica. Наборы Yersinia ViraBlot® (Viramed Biotech AG), разработанные на основе природных антигенов (YopM, YopH, YopD, YopN, YopВ, YopE, LсrV), выявляют IgА, IgG, IgM, каждый набор рассчитан на 50 определений. В наборах «recomLine Yersinia» (MIKROGEN) используются рекомбинантные аналоги Yops (YopM, YopH, YopD, YopN, YopE, LсrV);

наборы выпускаются в двух вариантах – для выявления IgА и IgG (по определений). В нашей лаборатории осуществлена разработка диагностического набора, предназначенного для качественного определения специфических противоиерсиниозных атител G, M и A в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блот для лабораторной диагностики иерсиниозов с острым и хроническим течением [29]. Особенностями метода иммуноблота является относительная трудоемкость, связанная с использованием нитроцеллюлозных тестовых стрипов для инкубации с исследуемыми сыворотками, что требует тщательного соблюдения инструкции;

визуальная оценка результатов по количеству и интенсивности окраски полос, которые сравниваются с контрольными, а также необходимость определения антител всех трех классов и/или исследования сывороток в динамике при получении сомнительных результатов. Поэтому, несмотря на свою высокую диагностическую эффективность, с учетом этих характеристик, а также возможности проведения небольшого количества исследований при высокой стоимости набора, метод иммуноблота не может рассматриваться как рутинный и чаще используется как референс-метод при сравнительной оценке диагностической ценности существующих и новых препаратов или для подтверждения диагноза при сомнительных результатах других тестов.

Тест-системы для иммуноферментного анализа являются наиболее приемлемыми препаратами для широкого использования. Характеризуясь хорошей чувствительностью и специфичностью (95 и 82 %, соответственно), ИФА имеет также ряд чисто практических преимуществ [200]. Достоинством метода является возможность одновременного исследования большого количества проб (92 определения), т. к. не проводится титрование сывороток, исследуется одно разведение. Однако, благодаря использованию планшетов, состоящих из отдельных стрипов, при необходимости можно выполнять единичные исследования, и, таким образом, минимизировать расход реагентов.

Результаты ИФА регистрируются на спектрофотометре, что позволяет легко их интерпретировать. Оценка результатов проводится либо полуколичественно, с расчетом отношения оптической плотности в лунке с образцом пациента относительно оптической плотности в лунке с калибратором, либо количественно, с построением калибровочной кривой для определения концентрации антител (ОЕд/мл) в исследуемых сыворотках. Простой и стандартизованный протокол анализа позволяет автоматизировать его проведение.

Для выявления антител к иерсиниям предложены коммерческие иммуноферментные тест-системы «recomWell Yersinia IgА/IgM/IgG» (Германия, MIKROGEN), разработанные на основе рекомбинантных аналогов Yops, специфичных для рода Yersinia (YopM, YopH, YopD, YopN, YopE, LсrV). Они позволяют выявлять антитела трех классов к БНМ Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica. Однако эти тест-системы также являются дорогостоящими и достаточно редко применяются в практических лабораториях на территории нашей страны.

Рядом исследователей разработаны экспериментальные варианты отечественных тест-систем для ИФА, характеризующиеся высокой диагностической эффективностью, однако промышленный выпуск препаратов не осуществляется [46, 47, 50, 61].

Вследствие отмеченных причин как прикладного, так и финансового характера, в настоящее время у специалистов лабораторной службы практически нет возможности выбора препарата для серологической диагностики и мониторинга иерсиниозов. Немаловажным является также отсутствие методических документов, регламентирующих использование методов иммуноблота и ИФА. Поэтому единственными отечественными зарегистрированным препаратами, имеющими промышленный выпуск и доступными лабораториям различного уровня оснащения, остаются эритроцитарные диагностикумы для РНГА, выявляющие суммарные антитела к ЛПС Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 и Y. enterocolitica серотипов О:3, О: (ФГУП СПб НИИВС ФМБА России). Реакция проста в постановке, не требует дорогостоящего оборудования и специальной подготовки персонала. Однако использование эритроцитов в технологии производства препарата не всегда позволяет получать серии, обладающие достаточной чувствительностью, в связи с чем частота подтверждения диагноза составляет 46 – 61 % [11,12, 29, 30, 46].

Результаты РНГА также существенно зависят от правильности выполнения отдельных этапов при постановке, а их учет достаточно субъективен [25].

Существующие проблемы лабораторного обеспечения клинической и противоэпидемической практики послужили поводом к разработке отечественной тест-системы для выявления иммуноглобулинов А, М, G методом ИФА у больных с различной патологией, обусловленной иерсиниями.

Методы типирования Y. pseudotuberculosis.

Применение молекулярно-генетических методов для микробиологического мониторинга циркуляции возбудителя Одной из важных задач микробиологического мониторинга циркулирующих штаммов Y. pseudotuberculosis является определение их родства при установлении связи между источником инфекции, фактором передачи и заболеваниями людей. Результаты этих исследований в значительной степени определяются эффективностью методов, используемых для маркирования штаммов.

При изучении фенотипических признаков Y. pseudotuberculosis до недавнего времени считалось, что представители вида не различаются по биохимическим свойствам. Однако Н. Fukushima еt al. (2001) при исследовании штаммов различного географического распространения выявили их отличие по ферментации мелибиозы [122]. Показано, что европейские штаммы серотипа О:3, выделяемые от больных и домашнего скота, не ферментируют мелибиозу. По мнению авторов, они характеризуются низкой вирулентностью, вызывая гастроинтестинальные проявления псевдотуберкулеза, в отличие от высоковирулентных штаммов ряда серотипов из дальневосточного региона мира, которые ферментируют мелибиозу и обуславливают развитие генерализованной инфекции. На Дальнем Востоке обнаружены также не ферментирующие мелибиозу штаммы других серотипов, которые не связаны с заболеваниями людей, но циркулируют среди животных и объектов окружающей среды.

Долгое время внутривидовая дифференциация штаммов основывалась на определении серотипа в реакции Y..pseudotuberculosis агглютинации с использованием типовых специфических сывороток. В соответствии с дополнениями к классической схеме серотипирования по О антигену внутри вида Y. pseudotuberculosis различают 15 серотипов (O:1–O:15) и 10 подсеротипов (O:1a–c, O:2a–c, O:4a–b, O:5a–b), т.е. 21 антигенный вариант [231, 239]. Большинство европейских штаммов относится к серотипам O:1–O: (выделено только несколько штаммов подсеротипов О:4а и О:5а), в то время как серотипы O:4–O:15 регистрируют, в основном, в Азии [122]. Наибольшее разнообразие среди циркулирующих штаммов псевдотуберкулезного микроба характерно для Японии – 16 антигенных вариантов. На территории России встречаются штаммы шести подсеротипов (О:1а, О:1b, О:1с, О:3, О:4а, О:4b), но большинство из них гомогенны и относится к подсеротипу О:1b. Штаммы подсеротипа О:1с представлены единичными находками [69]. По данным T..Nagano et al. (1997), H. Fukushima et al. (2001) в патологии человека наибольшее значение имеют девять серотипов – О:1а, О:1b, О:2b, О:2с, О:3, О:4а, О:4b, О:5а,О:5b, в то время как О:6-О:15 никогда не выделяли от больных, но обнаруживали в объектах внешней среды (вода) и у мелких млекопитающих [122, 175].

В результате изучения полиморфизма кластеров хромосомных генов, кодирующих биосинтез О-антигена у штаммов различных серотипов, был предложен альтернативный серотипированию метод – О-гено(серо)типирование на основе мультиплексной ПЦР [86, 87, 190, 201]. О-генотип характеризуется ПЦР-профилем – сочетанием выявляемых специфических участков различных генов, входящих в кластер О-антигена, и соответствует определенному серотипу.

Данный метод является более специфичным, также он позволяет определить серотип штаммов, нетипируемых классическим методом и находящихся в R форме. Однако ни традиционный серологический метод типирования, наиболее приемлемый для практических целей, наряду с морфологическими, биохимическими исследованиями, фаготипированием, выявляющими фенотипические признаки Y. рseudotuberculosis, ни О-гено(серо)типирование не позволяют дифференцировать близкородственные штаммы одного серотипа.

«Золотым стандартом» среди фенотипических методов типирования микроорганизмов считается мультилокусный электрофорез метаболических энзимов (Multilocus Enzyme Electrophoresis, MLEE), с которого началось развитие популяционной генетики микроорганизмов [81]. Метод основан на определении электрофоретической подвижности достаточно широкого спектра бактериальных белков - метаболических ферментов, отражающей аллельные разновидности соответствующих генетических локусов [213]. MLEE позволяет охарактеризовать каждый штамм определенным электорфоретическим типом (ЭТ) и оценить генетические связи между различными штаммами. Р. Goullet, В. Picard (1988) впервые применили MLEE для дифференциации 192 штаммов иерсиний внутри рода [125]. Однако М. Dolina, R. Peduzzi (1993), анализируя ЭТ, полученные при изучении электрофоретической подвижности 18 ферментов у 238 штаммов девяти видов иерсиний различного происхождения, пришли к выводу о недостаточной эффективности этого метода для установления генетических связей между представителями рода Yersinia [107]. В то же время было показано, что ЭТ штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от людей и от крупного рогатого скота, сходны, и, следовательно, эти животные могут рассматриваться как потенциальные источники инфекции. Недостаточная воспроизводимость результатов MLEE, получаемых в разных лабораториях, может быть связана с их зависимостью от незначительных и трудно контролируемых изменений экспериментальных условий. Поэтому для получения четкого ЭТ для конкретного штамма необходимо одновременно исследовать большое число референтных штаммов [42].

В течение последних 20 лет для исследования популяций микроорганизмов стали успешно применять методы типирования, основанные на анализе геномного полиморфизма штаммов, что нашло отражение в ряде аналитических обобщающих работ [49, 70, 167, 187, 237, 240]. Эффективность методов оценивается по индексу дискриминации (индекс разнообразия Симпсона), который отражает вероятность отнесения несвязанных штаммов внутри популяции к разным генотипам [141]. Выбор того или иного метода определяется конкретными целями прикладных или фундаментальных исследованиий, а также преимуществами и ограничениями в применении каждого из них.

Анализ плазмидного профиля, позволяющий дифференцировать штаммы в зависимости от размеров плазмид и их числа в бактериальной клетке, был первым методом молекулярного типирования Y. рseudotuberculosis. Этот метод был использован Ф. Н. Шубиным (1993) для мониторинговых исследований при псевдотуберкулезе Было исследовано более 2,5 тыс. штаммов [74].

Y..рseudotuberculosis, выделенных в Сибири, на Дальнем Востоке и в г. Москва. В результате определено 34 плазмидных варианта. Среди штаммов серотипа О:1, играющего основную роль в патологии человека в России, определено пять доминирующих генетических вариантов и три популяции Y. рseudotuberculosis:

дальневосточная, западно-сибирская и московская. Позднее при исследовании штаммов серотипа О:1b показано, что вспышки псевдотуберкулеза можно дифференцировать на три типа в зависимости от плазмидной характеристики и наличия доминирующего варианта в гетерогенной популяции возбудителя [73].

По мнению автора, основной вариант характеризуется наличием двух плазмид – 82 и 48 МДа. Этот вывод не нашел подтверждения в работах других исследователей: было показано наличие плазмиды 82 МДа у штаммов, выделенных от спорадических больных. Вместе с тем, штаммы, вызвавшие групповые заболевания, не всегда содержали эту плазмиду [23]. В то же время, этот метод позволил установить многолетнюю стабильность популяций псевдотуберкулезного микроба, сформировавшихся на конкретных территориях и определить взаимосвязь между плазмидным спектром возбудителя и клиническими проявлениями заболевания [22, 74]. Был сделан вывод, что наличие плазмиды 82 МДа способствовало более тяжелому и длительному течению заболевания и, в том числе, с поражением суставов. Позднее влияние факторов патогенности плазмиды 82 МДа на тяжесть инфекционного процесса при псевдотуберкулезе было также изучено О. А. Бургасовой (2011) [13].

M. Rosso et al. (2006) при изучении антибиотикорезистентности штаммов Y..рseudotuberculosis, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке, выявили среди более 500 штаммов один, обладающий устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, традиционно применяемых для лечения псевдотуберкулеза [206].

Множественная лекарственная устойчивость была связана с присутствием в микробной клетке конъюгативной плазмиды 50 kb.

Таким образом, микробиологический мониторинг циркулирующих штаммов Y. рseudotuberculosis с учетом плазмидной характеристики позволяет определять доминирующие генотипы на конкретных территориях наблюдения, устанавливать эпидемиологические связи и учитывать влияние отдельных плазмид на течение болезни, что имеет важное значение для эпидемиологического надзора и клинической практики. Однако следует учитывать, что плазмиды являются мобильными внехромосомными элементами и могут быть утеряны микробной клеткой, особенно при длительном хранении.

Для молекулярного типирования иерсиний были также внедрены методы, основанные на исследовании полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) плазмидной и хромосомной ДНК, и их варианты.

Н. Fukushima et al. (1994) провели рестрикционный анализ ДНК плазмиды вирулентности иерсиний (Restriction Endonuclease Analysis of Plasmid DNA, REAP) для изучения вариабельности генома 687 штаммов Y. pseudotuberculosis серотипов, выделенных от разных источников в различных странах мира [120]. штаммов имели российское присхождение, но были выделены только в одном регионе - дальневосточном. Комбинирование для каждого штамма пяти различных профилей рестрикции позволило определить у изученных штаммов генетических вариантов. На основании сходства профилей рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК Y. pseudotuberculosis из России, Японии, Канады, и их отличия от западно-европейских штаммов, авторы выдвинули гипотезу о наличии двух основных очагов, откуда началось распространение возбудителя – Восточная Азия и Европа. При этом большинство штаммов, распространенных в Японии и Северной Америке, по-видимому, происходят из дальневосточного региона, т.к. острова Японии и северо-американский континент были связаны с континентом Евразия до ледникового периода. Основываясь на идентичности REAP-профилей европейских штаммов и изолированных в регионе Австралазии, авторы подтверждают предположение K. J. Slee, N. W. Skilbeck (1992) о завозе возбудителя псевдотуберкулеза в 17-18 в.в. колонистами из Европы на территорию Австралии и Новой Зеландии на торговых судах, перевозивших домашний скот [216]. В этом же исследовании были изучены 22 штамма Y..pseudotuberculosis О:4b, выделенных от больных, грызунов, из пищевых продуктов в ходе вспышки в г. Приморск. Профили рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК у всех штаммов были идентичны, что свидетельствовало о наличии эпидемиологической связи между источниками инфекции (грызунами) и факторами передачи (пищевыми продуктами). Методом REAP было также исследовано 157 штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от больных людей, диких животных и из речной воды в одной из префектур Японии [121].

Распределение штаммов в зависимости от серотипа и REAP-профиля свидетельствовало о передаче возбудителя человеку через воду, загрязненную фекалиями инфицированных диких животных.

Приведенные данные показывают, что REAP, с одной стороны, позволяет определить географическое распространение различных генетических вариантов возбудителя, выявленных при изучении большого количества штаммов, и с его помощью возможно также получение фундаментальных данных о происхождении распределении штаммов во времени и пространстве. С Y..pseudotuberculosis, другой стороны, внутри отдельных серотипов полиморфизм штаммов был выражен относительно слабо - определено от одного до семи генетических вариантов, что потребовало использования пяти эндонуклеаз. Этот метод непригоден для изучения штаммов, спонтанно утративших плазмиду вирулентности. Однако, несмотря на указанные недостатки, REAP остается полезным и эффективным методом, прежде всего при оценке штаммов, получаемых в ограниченный отрезок времени в определенном месте, например, во время вспышки псевдотуберкулеза [70].

При анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции хромосомной ДНК методом электрофореза в пульсирующем поле (Pulsed-Field Gel Electroforesis, PFGE) исследуют крупные фрагменты ДНК (10-800 kb), которые образуются после действия эндонуклеаз, имеющих редкие сайты узнавания на бактериальной хромосоме, и не могут быть четко разделены обычным электорофорезом. Учитывая то обстоятельство, что с помощью данного метода возможен анализ практически всего генома (около 90 % бактериальной хромосомы), PFGE до недавнего времени часто рассматривали как «золотой стандарт» среди методов молекулярного типирования бактерий [70, 140, 187, 237]. В публикациях F. C. Tenover et al. (1995, 1997) охарактеризованы размеры и количество рестрикционных фрагментов ДНК (в среднем, 12-15) в PFGE-анализе различных микроорганизмов при использовании широкого спектра эндонуклеаз и предложены критерии для интерпретации результатов, получаемых при изучении штаммов, выделенных в ходе вспышек [229, 230]. Однако авторы подчеркивают, что для установления связей между штаммами, циркулирующими в различных регионах и в течение длительного периода времени (более года), необходима модификация разработанных ими правил.

Эффективность использования метода PFGE для микробиологического мониторинга показана при типировании Y. pestis, а также Y. enterocolitica, обуславливающих вспышечную и спорадическую заболеваемость кишечным иерсиниозом в различных регионах мира [89, 110, 112, 117, 140, 147, 176]. В то же время, для типирования Y. pseudotuberculosis этот метод применялся ограниченно, в основном на территории Финляндии, для которой, наряду с Россией и Японией, псевдотуберкулез является эндемическим заболеванием. S. Hallanvuo et al. (2002) методом PFGE изучили 80 штаммов, выделенных во время пяти вспышек псевдотуберкулеза и в 11 спорадических случаях в период с 1997 по 2001 г. [74, 134]. Используя комбинации пульсотипов, полученных при применении двух эндонуклеаз, авторы показали, что вспышки, вызванные Y..pseudotuberculosis серотипа О:3, имели 2 разных источника. Штаммы, выделенные от спорадических больных, принадлежали к 5-ти различным генотипам, один из которых был идентичен генотипу возбудителя, вызвавшего две вспышки. В ряде работ по идентичности пульсотипов у штаммов, изолированных от больных людей и из продуктов питания, доказана роль свежих овощей (салат-латук, морковь) и свинины как факторов передачи инфекции [148, 149, 152, 156, 179, 181, 182, 184, 202]. S. Kangas еt al. (2008) показали роль грызунов (землеройки) в качестве источника инфекции [152]. Подобные результаты PFGE-анализа были также получены при расследовании вспышки в одном из районов Канады: Е. Nowgesic еt al. (1999) установлено, что заболевание 74 человек было вызвано употреблением в пищу контаминированного молока [183]. А. Е. Okwori еt al.

(2009) продемонстрировали идентичность генотипов у 20 штаммов, выделенных от людей, овец, свиней, из продуктов питания в Нигерии [186].

Ограничениями в применении PFGE прежде всего является необходимость использования при конкретном исследовании более одной эндонуклеазы для увеличесния дискриминирующей силы метода [115, 116]. Также возможны проблемы при интерпретации результатов, вызванные даже незначительными различиями в условиях проведения электрофореза, приводящие к изменению расположения отдельных фрагментов в геле [237]. Это затрудняет сравнение штаммов, полученных в разных лабораториях. Однако перечисленные ограничения не уменьшают ценность PFGE-анализа для внутривидового типирования штаммов при групповых заболеваниях.


Вариантом RFLP-анализа является его сочетание с Саузерн-блотом, позволяющее выявлять нуклеотидные последовательности, находящиеся на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Для этого используют различные зонды, представляющие собой специфическую нуклеотидную последовательность, гомологичную определяемой в рестрикционных фрагментах.

Часто в качестве зондов используют последовательности генов, входящих в опероны рибосомной РНК - 16S и 23S рРНК, отличающиеся высокой консервативностью. Метод, основанный на RFLP-анализе нуклеотидных последовательностей рРНК, назван риботипированием [127, 128, 158, 225]. В настоящее время риботипирование возможно проводить, в том числе, с использованием автоматизированных систем РибоПринтер (Oxoid), позволяющих идентифицировать широкий круг микроорганизмов, благодаря базе данных рибопрофилей [126].

N. Picard-Pasquier еt al. (1990), В. Picard еt al. (1991) при исследовании штаммов шести видов иерсиний впервые показали возможность применения метода риботипирования для их внутри- и межвидовой дифференциации [194, 195]. Полученные результаты коррелировали с данными фенотипического метода типирования МЕЕ. Был сделан вывод о целесообразности использования риботипирования для целей таксономии и эпидемиологии. В данной работе для сравнительного изучения было взято только 9 штаммов Y. pseudotuberculosis, у которых определено четыре и пять фингерпринтов после рестрикции ДНК двумя эндонуклеазами, соответственно. Позднее этот метод применили A. Guiyoule et al.

(1994) для типирования 70 штаммов Y. pestis, вида, также как и фенотипически очень гомогенного Авторы Y..pseudotuberculosis, [129].

определили риботип как сочетание фингерпринтов, полученных после рестрикции ДНК двумя эндонуклеазами c последующей гибридизацией с зондом 16S+23S рРНК. M. Odaert et al. (1996), как и N. Picard-Pasquier еt al. (1990), использовали риботипирование для изучения небольшого количества штаммов Y.

pseudotuberculosis различных серотипов: у 20 штаммов было выявлено риботипов, что свидетельствовало о высоком дискриминационном потенциале метода [185].

В целом, риботипирование, благодаря большей дискриминирующей силе, по сравнению с серотипированием, является эффективным методом внутривидового дифференцирования Y. pseudotuberculosis. Его преимуществом перед PFGE является использование менее сложных фингерпринтов и хорошая воспроизводимость. Это позволяет проводить сравнительный анализ большого количества штаммов, различающихся по ареалу распространения, и вне зависимости от времени их выделения. В тоже время, дискриминирующая сила может быть лимитирована малым количеством сравниваемых фрагментов (6-7) и иногда их недостаточными различиями по размеру в анализируемых рестрикционных профилях.

Другой разновидностью RFLP-Southern blotting является IS-RFLP метод, позволяющий изучать распределение мобильных генетических IS-элементов (Insertion Sequence) в геномах прокариот. IS200-like (IS1541-like) элементы, относящиеся к подгруппе IS200-IS1541 элементов энтеробактерий, обнаружены у Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и энтеропатогеных Y. enterocolitica [105, 215]. У Y..pestis и Y. pseudotuberculosis обнаружены IS100, IS285, IS1661, количество копий и локализация которых в геноме различных штаммов варьируют [1, 93, 104, 109, 173, 191, 217].

Показано, что метод может служить для IS-фингерпринтинга мониторинговых исследований, т.к. позволяет разделять штаммы Y. pestis в соответствии с их биотипом и географическим происхождением [7, 234].

Полученные данные свидетельствовали также, что с помощью IS285 можно дифференцировать штаммы Y. pestis и Y. pseudotuberculosis из разных очагов, тогда как IS100 позволяет разграничивать штаммы Y. pestis внутри очага [7]. При субтипировании штаммов Y. pestis, изолированных в одной стране (США), лучшие результаты получены методом IS100-RFLP, по сравнению с IS285-RFLP Высокая дискриминирующая сила метода была достигнута [140].

комбинированием трех IS-профилей (3IS-RFLP) – при изучении 61 штамма Y..pestis выявлено 59 генетических вариантов [234]. Сравнительное типирование 20 штаммов Y. pseudotuberculosis различных серотипов показало, что по разрешающей способности IS-фингерпринтинг превосходит риботипирование ( риботипов и 18 что обусловлено большим числом IS-фингерпринтов), исследуемых рестрикционных фрагментов [185]. Как отмечают некоторые авторы, результаты IS-RFLP метода сопоставимы с таковыми при PFGE, но анализируемые полосы при этом имеют лучшее разрешение, позволяя более четко дифференцировать штаммы [185, 234].

Для молекулярного типирования микроорганизмов достаточно широко применяются методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [167, 187, 237].

H. Fukushima et al. (2001) применили метод ПЦР для дифференциации штаммов Y. pseudotuberculosis, распространенных в различных регионах мира, по наличию детерминант вирулентности – «острова» высокой патогенности HPI и гена, кодирующего суперантигенный токсин Подавляющее YPM [122].

большинство клинических штаммов авторы разделили на две группы: первую группу, названную европейский гастроэнтеральный патогенный тип, составили HPI+YPM- штаммы, изолированные от больных с гастроинтестинальными проявлениями. Их выявляли в Европе, Австралии, и Северной Америке. Во вторую группу вошли HPI-YPM+ штаммы, выделенные на Дальнем Востоке России, Японии и Корее от больных генерализованной формой псевдотуберкулеза. Эта группа была названа «системный патогенный тип».

Позднее также было показано, что для российских штаммов характерно наличие плазмиды pVM82 [68, 109]. При этом у больных псевдотуберкулезом, от которых изолировали штаммы, содержащие одновременно плазмиду вирулентности иерсиний pYV и плазмиду pVM82, частота развития тяжелых форм, в том числе артритов, достоверно выше, чем у больных, возбудители заболеваний которых не имеют pVM82. Информация, полученная в ходе данных исследований, важна для понимания патогенеза псевдотуберкулеза - инфекции, характеризующейся многообразием клинических проявлений.

Вариантами классической ПЦР являются методы ПЦР-фингерпринтинга.

Метод основан на RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) амплификации «случайных» нуклеотидных повторов в разных областях бактериального генома при использовании в качестве праймеров произвольных коротких последовательностей. S. Makino et al. (1994), применили восемь праймеров, ранее использованных для исследования методом RAPD-PCR штаммов H. рylori, при анализе RAPD-фингерпринтов 30 клинических штаммов Y.. pseudotuberculosis серотипа О:5а, выделенных во время вспышки в Японии [166]. Показана, с одной стороны, их полная идентичность, с другой – отличие от типовых штаммов того же серотипа. Аналогичные результаты были получены исследователями НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока при изучении штаммов, выделенных из разных источников во время вспышки в Иркутской области [74].

Анализ профилей ампликонов показал идентичность штаммов, что подтверждает моноэтиологичность, характерную для вспышек пищевого происхождения.

Сравнительное изучение патогенных представителей вида Y. enterocolitica серотипов O:3 и О:9 методами PFGE и RAPD-PCR показало возможность применения последнего для типирования клинических штаммов, а также выявления источников и факторов передачи инфекции [114]. Приведенные данные свидетельствуют о целесообразности использования метода RAPD-PCR для микробиологического мониторинга. Серьезными ограничениями в применении этого метода являются проблемы воспроизводимости результатов и стандартизации протокола проведения реакции не только при межлабораторных, но и внутрилабораторных исследованиях Они обусловлены [167, 187].

прохождением амплификации в условиях нестрогого связывания праймеров, что ведет к сильной зависимости процесса даже от слабых изменений концентрации магния, температуры отжига, качества Taq–полимеразы, влияющих на четкость и количество полос в анализируемых фингерпринтах [37, 167].

J. Versalovic et al. (1991) предложили метод ПЦР-фингерпринтинга, Rep PCR, основанный на амплификации повторяющихся (repetitive) консервативных нуклеотидных последовательностей, рассеянных по бактериальному геному [244].

Для типирования используются две основные последовательности – повторяющиеся экстрагенные палиндромы (Repetitive Extragenic Palindromic elements, REP) и повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequences, ERIC).

Также применяют последовательности, первоначально обнаруженные В. Martin et в межгенных областях хромосомы S. pneumoniae и названные ВОХ al. (1992) элементами [168]. По данным ряда авторов, Rep-PCR обладает хорошей разрешающей способностью и может применяться при мониторинге циркуляции иерсиний [163, 208, 249]. В отношении штаммов Y. pseudotuberculosis такие исследования не проводились. Есть единичные публикации о применении этих методов для дифференциации различных видов внутри рода Yersinia и серотипов (n=17) внутри вида Y. pseudotuberculosis, при этом ERIC-PCR была более эффективна, по сравнению с REP-PCR и, особенно, с ВОХ-PCR [90, 153, 219, Авторы оценивают как быстрый, надежный, хорошо 220]. ERIC-PCR воспроизводимый метод, обладающий высокой дискриминирующей силой, который может быть использован для решения вопросов таксономии иерсиний и идентификации Y. pseudotuberculosis. Показано также, что результаты Rep-PCR с праймерами, комплементарными REP и ERIC последовательностям, сопоставимы с данными PFGE, но Rep-PCR позволяет быстрее исследовать большое число штаммов;

этот метод дешевле в применении и может быть стандартизован, что делает возможным сравнительный анализ штаммов при изучении в различных лабораториях [187, 237].


В последние годы, благодаря возможности пользоваться информацией о нуклеотидных последовательностях геномов микроорганизмов через электронные базы данных, получили развитие новые современные методы молекулярного типирования. В 1998 г. M.C. Maiden et al. предложили метод мультилокусного секвенирования (Multilocus Sequence Typing, MLST), работающий на тех же принципах, что и фенотипический метод MLEE, но при этом аллели нескольких генов, отвечающих за внутриклеточный метаболизм (housekeeping genes), определяются путем прямого секвенирования их нуклеотидных последовательностей, и каждая уникальная комбинация аллелей определяет сиквенс-тип (СТ) штамма [42, 81, 164, 165, 222]. Методом MLST также было изучено 58 штаммов всех известных на тот момент видов рода Yersinia, в том числе два штамма Y. pseudotuberculosis [154]. Был сделан вывод о преимуществе метода MLST, по сравнению с анализом, основанным на секвенировании одного гена 16S РНК, для определения генетических взаимосвязей между представителями рода Yersinia [142, 143]. Также было сделано предположение о существовании новых видов иерсиний. Неоднозначные результаты были получены при секвенировании локусов семи генов у штаммов Y..pseudotuberculosis животного происхождения из Бразилии [144]. Показана практически полная генетическая однородность популяции – 33 из 34 изученных штаммов характеризовались одним СТ, что, по мнению авторов, возможно, обусловлено низкой дискриминационной силой метода. С другой стороны, такие же СТ были найдены в базе данных для штаммов, выделенных от больных в других странах мира. Таким образом, животные могут рассматриваться как потенциальные источники инфекции, несмотря на отсутствие клинических штаммов в Бразилии. S.L. Ch'ng et al. (2011), по аналогии с исследованием H..Fukushima et al. (2001), изучили 83 штамма Y. pseudotuberculosis различного географического происхождения 19 серотипов шести генетических групп, но с использованием MLST [92]. При секвенировании семи генов «домашнего хозяйства» авторы получили 61 СТ, что позволило разделить штаммы на два кластера – повсеместно распространенные (главный кластер) и циркулирующие только на Дальнем Востоке. Каждому кластеру соответствовали штаммы с определенным вариантом суперантигенного токсина YPM, при этом плазмида pYV присутствовала у штаммов только одного кластера. Высокопатогенные варианты, обладающие одновременно «островом» высокой патогенности HPI, геном, кодирующим YPM, и плазмидой вирулентности pYV, отнесены к трем СТ.

Доступность полных нуклеотидных последовательностей геномов различных микроорганизмов, в том числе Y. pestis и других иерсиний, послужила толчком для развития новых современных молекулярно-генетических методов, характеризующихся хорошей воспроизводимостью в условиях разных лабораторий, высокой разрешающей способностью и возможностью использования полученных результатов для создания совместимых баз данных [93, 96, 109, 191]. В настоящее время такими методами генотипирования, используемыми для эпидемиологических исследований, изучения популяционной структуры и филогенетического анализа Y. pestis, являются многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов, MLVA (Multiple Loci Variable Number of Tandem Repeats Analysis), DFR-типирование – анализ отличающихся участков ДНК (Different Region), CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – кластеризованные короткие палиндромные повторы, разделенные спейсерами), SNP-типирование - анализ полиморфизма единичных нуклеотидов в определенных локусах хромосомы (Single Nucleotide Polymorphism) [18, 43, 82, 102, 160, 161, 196, 197, 209, 235, 242, 243].

Продемонстрирована высокая разрешающая способность MLVA и возможность его применения при мониторинговых исследованиях штаммов Y..enterocolitica ssp. palearctica биотипов 2 и 4 и Y. enterocolitica биотипа1А [124, 131]. Также при сравнительном изучении двумя методами 104 штаммов Y..enterocolitica, изолированных от спорадических больных и во время эпидемических ситуаций в Финляндии, показано, что дискриминирующая сила MLVA выше, чем PFGE с использованием одной эндонуклеазы [214]. Авторы подчеркивают также, что MLVA является более дешевым, менее трудоемким и менеее длительным методом исследования, позволяющим получать легко интерпретируемые результаты. Сделан вывод о целесообразности применения PFGE для мониторинга циркуляции штаммов Y. enterocolitica, вызывающих спорадические заболевания, в то время как MLVA, по мере накопления данных, возможно, станет рассматриваться как новый «золотой стандарт» среди методов молекулярного типирования, применяемых при анализе вспышек кишечного иерсиниоза.

Таким образом, перечисленные методы генотипирования иерсиний, в том числе Y. pseudotuberculosis, достаточно разнообразны и имеют перспективу в использовании, включая также развивающиеся новые методы. Предложены методы сравнительного изучения генетического разнообразия штаммов, циркулирующих в различных регионах мира, а также методы, позволяющие проводить филогенетический анализ представителей рода и Yersinia эпидемиологические исследования. Необходимость и возможность применения того или иного метода определяется его разрешающей способностью, технологическими преимуществами, целевыми задачами исследования, потенциалом лаборатории. Для эффективного использования, наряду с совершенствованием существующих методов и разработкой новых, необходимо также расширение базы данных секвенированных геномов штаммов иерсиний или их фрагментов.

Вместе с тем, следует отметить, что в настоящее время микробиологический мониторинг штаммов Y..pseudotuberculosis, циркулирующих на территории России, проводится фрагментарно и, как составляющая эпидемиологического надзора, только еще формируется. Сравнительное изучение структуры популяций Y..pseudotuberculosis выполнено однократно и только одним методом - при анализе плазмидного профиля [73, 74]. Другие молекулярно генетические методы внутривидовой дифференциации Y..pseudotuberculosis не применялись во время групповых заболеваний, равно как для проведения планового мониторинга, несмотря на их информативность. Не определены генетические связи между штаммами, выделенными в различных регионах России и других странах, что может влиять на эффективность контроля за их распространением. Генотипическая характеристика Y. pseudotuberculosis имеет важное значение для клинической дифференциации патологии, обусловленной возбудителями различных генотипов. В то же время, из-за ограниченного применения эффективных методов выяления и Y. pseudotuberculosis специфических антител ряд патологических процессов, обусловленных иерсиниями, остается нераспознанным, и, как следствие, не проводится поиск источников и факторов распространения возбудителей.

В связи с изложенным, представлялось актуальным проведение комплексных исследований, направленных на выбор оптимальных методов и средств для стандартизации лабораторного обеспечения микробиологического мониторинга возбудителя в целях повышения эффективности эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом.

Цели и задачи Цель исследования Обосновать целесообразность использования комплекса методов этиологической диагностики псевдотуберкулеза и внутривидовой дифференциации для лабораторного обеспечения Y. pseudotuberculosis микробиологического мониторинга возбудителя.

Задачи работы:

1. Изучить геномный полиморфизм штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных странах мира, методами риботипирования и IS оценить информативность использованных RFLP-типирования;

молекулярных маркеров.

2. Определить генетические связи между штаммами Y.. pseudotuberculosis – представителями глобальной и российской популяций.

3. Оценить диагностическую эффективность разработанной тест-системы на основе рекомбинантных аналогов белков наружной мембраны патогенных иерсиний для выявления иммуноглобулинов М, А и G методом ИФА.

4. Оценить эффективность использования комплекса молекулярно генетического (ПЦР) и серологических (ИФА-Ig, РНГА) методов для диагностики различных форм заболеваний, обусловленных Y..pseudotuberculosis и Y. еnterocolitica.

5. Усовершенствовать подходы к микробиологическому мониторингу циркулирующих штаммов Y..pseudotuberculosis на основе применения комплекса методов выявления (ИФА-Ag, ПЦР) и генотипирования (риботипирование, IS1541-RFLP-типирование, О-гено(серо)типирование) возбудителя.

Научная новизна Впервые методами риботипирования, IS285- и IS1541-RFLP-типирования проведен анализ геномного полиморфизма штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и географического распространения: изучены штаммы - представители глобальной и российской популяций. Получены новые знания о генетическом разнообразии вида Y. pseudotuberculosis. Дана сравнительная оценка дискриминирующих возможностей использованных методов генотипирования. В результате показана эффективность применения IS1541-RFLP-типирования для внутривидовой дифференциации штаммов и Y..pseudotuberculosis целесообразность использования данного метода при мониторинге циркуляции возбудителя на отдельных территориях.

Определены различия генетических характеристик зарубежных и российских штаммов Установлена выраженная Y. pseudotuberculosis.

гетерогенность штаммов – представителей глобальной популяции Y..pseudotuberculosis по локусам хромосомы, содержащим рРНК опероны, IS285 и IS1541. На основе полученных профилей риботипирования, IS285- и IS1541 дана генотипическая характеристика штаммов RFLP-профилей Y..pseudotuberculosis девяти изученных серотипов, выделенных из разных источников;

определены генетические связи между штаммами;

показано распространение штаммов охарактеризованных генотипов на территориях стран мира пяти континентов.

Определены генетические варианты (риботипы, IS285- и IS1541-RFLP типы) российских штаммов и установлена относительная генетическая однородность популяции на территории России.

Y. pseudotuberculosis Подавляющее большинство штаммов (93 %) различного происхождения, выделенных на территориях Северо-Западного, Сибирского и Дальневосточного ФО, относится к серотипу О:1b и характеризуется генотипами, которые не обнаружены у штаммов в других странах мира и являются специфическими для российских штаммов. Они представлены как доминирующими в указанных ФО генетическими вариантами, так и локальными, характерными для штаммов на определенных территориях. 7 % изученных российских штаммов обладает генетическим родством со штаммами из других стран мира, они отнесены к редким для нашей страны генотипам. Использование полученных новых сведений о структуре популяции Y. pseudotuberculosis в России и предложенные методы внутривидовой дифференциации определяют перспективу повышения эффективности контроля за циркуляцией возбудителя.

Теоретическая и практическая значимость работы Учреждениям Роспотребнадзора и ЛПО предложен алгоритм диагностических исследований, для повышения эффективности микробиологического мониторинга циркулирующих штаммов Y..pseudotuberculosis на основе применения комплекса методов выявления, идентификации, внутривидовой дифференциации возбудителя (ИФА-Ag, ПЦР, риботипирование, О-гено(серо)типирование) и IS1541-RFLP-типирование, обнаружения специфических антител (РНГА, ИФА-Ig). Использованные методы и средства регламентированы документами федерального уровня.

Изученные методами генотипирования российские штаммы Y..pseudotuberculosis, их полные паспортные данные, включающие профили риботипирования, IS285-, IS1541-RFLP-профили представлены в коллекции референс-центра по мониторингу за иерсиниозами на базе лаборатории бактериальных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург. Полученные генотипические характеристики штаммов из различных регионов России и других стран мира предназначены для проведения филогенетических исследований и мониторинга циркулирующих штаммов Y. pseudotuberculosis (выявления возбудителей известных генетических вариантов и новых, не типичных для территории наблюдения).

Обоснованы показания к использованию тест-системы, разработанной на основе рекомбинантных аналогов белков наружной мембраны патогенных иерсиний, для выявления антител классов A, M, G методом ИФА при различном течении иерсиниозов.

Для повышения эффективности выявления иерсиниозов без типичных проявлений обоснованы показания к обследованию методами этиологической диагностики больных с поражениями суставов, больных с длительными абдоминальными болями, больных с симптомами острого аппендицита, острого панкреатита, обострения хронического панкреатита.

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Справки о депонировании в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского НИПЧИ «Микроб» семи охраноспособных штаммов Y..pseudotuberculosis КМ 175, КМ 176, КМ 177, КМ 178, КМ 179, КМ 180, КМ 181 в качестве тест-штаммов при определении риботипов Y..pseudotuberculosis (2003 г.). Авторы: Воскресенская Е.А., Ценева Г.Я., Сварваль А.В., Климов В.Т., Чеснокова М.В.

2. Справка о депонировании в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского НИПЧИ «Микроб» охраноспособного штамма Y..enterocolitica КМ 174, обладающего комплексом факторов патогенности, в качестве тест-штамма с выраженной вирулентностью (2003 г.). Авторы: Ценева Г.Я., Воскресенская Е.А., Сварваль А.В., Климов В.Т., Чеснокова М.В.

3. Методические рекомендации для эпидемиологов, инфекционистов, педиатров и микробиологов «Псевдотуберкулез и иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия)». СПб., 2005. 49 с.

4. Материалы диссертации представлены в двух главах монографии «Иерсинии и иерсиниозы» под ред. проф. Г.Я. Ценевой. СПб., 2006. 168 с.

5. Методические указания «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза», МУ 3.1.1.2438-09. М., 2010. 53 с.

6. Регистрационные удостоверения № ФСР 2010/06877, № ФСР 2010/ на Наборы реагентов Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса М и G к возбудителям иерсиниозов «Иерсиниоз-ИФА-IgM»/«Иерсиниоз ИФА-IgG», Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса А к возбудителям иерсиниозов «Иерсиниоз-ИФА-IgA». Приказом Росздравнадзора №.1395-Пр/10 препараты разрешены к производству, продаже и применению на территории РФ.

7. Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика иерсиниоза», СП 3.1.7.2615-10. М., 2010. 21 с.

8. Патент на изобретение № 2465317 от 16.09.2011 «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II». Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Чеснокова М.В.

9. Патент на изобретение № 2465318 от 16.09.2011 «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы IIА». Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Климов В.Т.

10. Материалы диссертации представлены в «Национальном руководстве по клинической лабораторной диагностике» в 2-х т. М., ГЭОТАР-Медиа, 2012. Т. 2, гл. 21 «Иерсинии».

11. Методические указания «Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях», МУК 4.2.3019-12. М., 2012. 61 с.

12. Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Штаммы Yersinia pseudotuberculosis, изолированные в Сибири и на Дальнем Востоке (PSEUDOTUBERCULOSIS)». Зарегистрировано в Гос. реестре баз данных апреля 2012 г., № 2012620381. Авторы: Тирских К.А., Климов В.Т., Чеснокова М.В., Афанасьев М.В., Каримова Т.В., Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А.

Методология и методы исследования Материал для исследования и использованные методы представлены в таблице 1.

Таблица 1. Объем исследований, проведенных различными методами Методы Объем исследований 1. Бактериологический:

1.1. Выделение Y. pseudotuberculosis из материала от больных, грызунов, смывов из внешней среды 978 проб 1.2. Культивирование штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica на питательных средах 318 штаммов 2. Молекулярно-генетические:

2.1. ПЦР О-гено(серо)типирование 268 штаммов 2.2. Риботипирование - выделение тотальной ДНК методом фенол хлороформной экстракции 273 штамма - рестрикция ДНК каждого штамма двумя эндонуклеазами 550 реакций - электрофорез фрагментов рестрикции 78 гелей - перенос фрагментов рестрикции на мембрану 78 мембран - гибридизация фрагментов рестрикции с зондом 78 мембран 2.3. IS-RFLP-типирование - дегибридизация зонда 72 мембраны - гибридизация фрагментов рестрикции с зондами 70 мембран 2.4. ПЦР для исследования материала от больных, из внешней среды, штаммов 1098 проб Продолжение таблицы 1.

Методы Объем исследований 3. Иммунологические:

3.1. Выявление антигенов Y. pseudotuberculosis методом ИФА-Ag в материале от больных, из внешней среды 279 проб 3.2. Определение уровня антител в образцах сыворотки крови (ОСК) людей методами РНГА, ИФА-Ig 1257 ОСК 4. Экспериментальный:

Оценка вирулентных свойств штаммов иерсиний на модели in vitro 6 штаммов 5. Биоинформатический:

5.1. Построение дендрограмм кластеризации штаммов 1092 профиля гибри по алгоритму UPGMA дизации 5.2. Определение дискриминирующей силы методов генотипирования (D) 12 денрограмм Бактериологический метод Изучали свежевыделенные штаммы иерсиний. Их получали из материала от больных, грызунов, смывов из внешней среды. Бактериологическое исследование материала включало «холодовое обогащение» в жидкой пептонно-калиевой среде, щелочную обработку для ингибирования роста посторонней флоры, высев на плотную дифференциально-диагностическую среду с бромтимоловым синим (СБТС), идентификацию выделенных культур по комплексу морфологических, культуральных, биохимических признаков, серологическое типирование иерсиний. Правила взятия, подготовки исследуемого материала, проведения этапов бактериологического исследования и культивирования микроорганизмов представлены в методических рекомендациях МР 11-3/8-09 «Псевдотуберкулез и иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия)» [48].

Использовали также коллекционные штаммы иерсиний: лиофильно высушенные в защитной среде (1 % желатины, 10 % сахарозы, дистиллированная вода);

штаммы, хранящиеся при 4 0С в полужидком агаре Хоттингера и в замороженном состоянии при низкой температуре (-80 0С) в среде, содержащей в равных частях физиологический раствор, сыворотку плодов крупного рогатого скота, криопротектор глицерин. Для исследования штаммы со среды хранения высевали в пробирки с бульоном Хоттингера, рН 7,1 ± 0,1, инкубировали при температуре 26 ± 2 0С в течение 18-24 ч. Бульонные культуры высевали на агар инкубировали при 26 ± 2 0С в течение 24-48 ч.

Хоттингера, рН 7,1 ± 0,1, Полученные агаровые культуры хранили при 4 0С не более 15 суток.

Молекулярно-генентические методы Для внутривидовой дифференциации возбудителя псевдотуберкулеза изучено 273 штамма различного географического происхождения: 80 штаммов – представителей глобальной популяции, отнесенных к шести классическим серотипам О:1 - О:6, выделенных в период с 1960 по 2003 год, в основном, от людей и животных в 24 странах мира (все континенты, кроме Антарктиды) (коллекция Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера) (Приложение А). Для сравнения изучено штамма Y. pseudotuberculosis серотипа О:1, выделенных в период с 1960 по год из различных источников в Северо-Западном, Сибирском, Дальневосточном ФО России (коллекция референс-центра по мониторингу за иерсиниозами, ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) (Приложение А1).

Определение подсеротипов исследуемых штаммов выполняли методом О гено(серо)типирования с применением мультиплексной ПЦР [87].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.