авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

«Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» ...»

-- [ Страница 3 ] --

Однако, при рассмотрении соотношений IS-типов с географическим происхождением штаммов и источником их выделения, методы IS1541- и 2IS RFLP дают сходные результаты, не выявляя четкой корреляции (см. Таблица 1.8, 1.9), но из 73 2IS-типов 71 характеризует штаммы в соответствии с регионом и источником, что отличает полученные данные от результатов риботипирования Степень сходства, % Штамм Серотип Страна Источник 2IS-RFLP ST профиль 20 40 60 80 Англия Овца IP 31833 4 58 Дания Заяц IP 31411 4 57 d2 Чехословакия Человек IP 31524 1a 20 Тунис Мышь IP 30642 1a 9 Франция Человек IP 32954 1a Япония Заяц IP 32816 5b 64 Югославия Заяц IP 32651 1b 21 D2 Англия Птица IP 32709 1b 17 Румыния Почва IP 32939 1a 13 Югославия Заяц IP 32614 1a 24 Франция Заяц IP 33291 1a 16 Норвегия Вода IP 32323 2 33 Югославия Заяц IP 32665 1a 12 Швейцария Человек IP 32590 1a 23 Германия Обезьяна IP 33005 1a 14 Италия Свинья IP 32790 1a 2 Италия Человек IP 32745 1a 22 Тунис Грызун IP 31878 1a 10 Голубь Италия IP 30284 1a 7 Канада Бобр IP 30437 1b 8 Франция Человек IP 32953 1b 1 Франция Человек IP 32950 1b Человек Франция IP 33109 1b 5 Заяц Франция IP 32921 2b 30 Швейцария Обезьяна IP 32881 2b 30 Франция Обезьяна IP 32934 2b 28 Германия Обезьяна IP 33061 5a 67 D1 Франция Человек IP 32821 5a 63 Франция Заяц IP 32929 2b Швейцария Морская свинка IP 32463 5a 66 Франция Дикое животное IP 32699 5a 68 Франция Заяц IP 33098 2b 42 Человек Франция IP 32952 5a 65 Морская свинка Дания IP 30215 2b 31 Голландия Заяц IP 30911 2b 32 Франция Коза IP 33051 3 54 Аргентина Олень IP 33097 3 54 Болгария Человек IP 33108 3 56 С Аргентина КРС IP 33105 3 55 КРС Австралия IP 32992 3 53 Бельгия Человек IP 32564 3 45 Аргентина КРС IP 32887 3 45 Аргентина КРС IP 32938 3 49 Италия Свинья IP 32802 3 51 Южная Африка Свинья IP 32544 3 47 Плод овцы Англия IP 31829 3 48 Франция Человек IP 33088 2a 43 Франция Человек IP 33293 2a Германия Обезьяна IP 33012 2a 39 Антилопа Франция IP 32585 2a 38 Испания Свинья IP 32584 2a 37 В1 Франция Человек IP 32951 2a 29 Новая Зеландия Человек IP 32589 2a 44 Швейцария Обезьяна IP 33023 2a 40 Испания Человек IP 33054 2a 41 Швейцария Птица IP 32879 1b 25 Италия Заяц IP 32721 2a 35 Бельгия Человек IP 32581 2a 34 Россия Человек IP 33157 1b Россия Человек IP 33158 1b Россия Человек IP 33156 1b Япония Морская свинка IP 31554 6 70 Япония Морская свинка IP 31553 6 69 Япония Заяц IP 32817 5b Испания Неизвестен IP 32889 3 50 Испания Человек IP 32984 3 Испания Человек IP 32666 3 Франция Дикое животное IP 32687 4 61 Англия Человек IP 31830 4 60 Человек Франция IP 32777 1b 6 В2 Человек Франция IP 32949 1b Новая Зеландия Олень IP 32533 1b 11 Англия Свинья IP 32670 1b 18 Австралия Сумчатое IP 33038 1b 15 Голландия Человек IP 32524 1b 26 Франция Неизвестен IP 32637 1b Франция Человек IP 33285 1b Украина Грызун IP 33161 1b 73 Украина Человек IP 33162 1b 73 Швеция Выдра IP 30151 4 59 Рисунок 1.14. 2IS-RFLP дендрограмма штаммов Y. pseudotuberculosis (n=80), выделенных в различных странах мира.

(см. Таблица 1.2, 1.3). Внутрикластерная дифференциация одноименных EcoRI- и EcoRV-рибопрофилей кластеров B и D на разные IS285- и IS1541-профили, приводит к разделению риботипов, формирующих эти кластеры, на разные 2IS типы. Всего из 12 не индивидуальных риботипов дифференцируется 11.

Риботипам 14, 17, 18 соответствует по 8 2IS-типов, остальным восьми - от двух до шести.

В четырех из семи пар штаммов, имеющих один 2IS-тип (5, 6, 72, 73), одна пара характеризовалась одним риботипом, 2IS-типом, серотипом, местом выделения. Штаммы в других трех парах (30, 45, 54) были изолированы в разных странах и на разных континентах (см. Приложение А).

Интерес представляют штаммы, выделенные от людей и от сельскохозяйственных животных на различных континентах, формирующие на всех дендрограммах кластер С. В соответствии с данными мультилокусного секвенирования (MLST), проведенного сотрудниками университета Хельсинки в рамках совместного проекта, эти не ферментирующие мелибиозу штаммы Y..pseudotuberculosis серотипа О:3 глобального распространения характеризуются одним ST 19 (см. Рисунки 1.13, 1.14). Вероятно, их можно отнести к не ферментирующим мелибиозу штаммам Y..pseudotuberculosis серотипа О:3, вызывающим диареи у домашнего скота во многих европейских странах и в Японии [179, 188, 189, 238]. Предшествующими исследованиями показано, что такие штаммы Y. pseudotuberculosis обладают плазмидой вирулентности иерсиний и хромосомным геном, кодирующим белок инвазин, inv способствующий адгезии и инвазии микроба в клетки эпителия кишечника [122, 174]. Эти возбудители вызывают инфекционные аборты и тяжелые, часто летальные, диареи у домашнего скота [169, 248]. Также их выделяют от пациентов с симптомами энтерита [83, 238]. В соответствии с мнением K. J. Slee и N. W. Skilbeck (1992), полагают, что распространение не ферментирующих мелибиозу штаммов серотипа О:3 из Европы в другие регионы произошло во время транспортировки скота, а также при экспорте мяса, т.к. их не изолируют от диких животных [122, 216]. По результатам настоящего исследования можно предположить, что штаммы, формирующие кластер С, вероятно, являются монофилетической группой и были завезены из Европы относительно недавно, т.к. с одной стороны, они характеризуются вариабельными IS1541-профилями с большим количеством полос (20-16), но при этом имеют много общих фрагментов, с другой - содержат в геноме только одну, но более консервативную вставку IS285, а также характеризуются одним риботипом 14.

Также можно выделить еще одну группу близкородственных штаммов, формирующих на всех IS-RFLP дендрограммах кластер D1, отнесенных к ST 16.

Это европейские штаммы серотипов 2b и 5а, изолированные, главным образом, от диких животных (только два штамма из 12 выделены от людей). По данным MLST в эту группу входят штаммы с такими же характеристиками, выделенные Н. Fukushima et al. (2001) по наличию детерминант вирулентности в генетическую группу G6, представители которой не обладали «островом» высокой патогенности HPI и геном, кодирующим суперантигенный токсин YPM [122]. На момент исследования у представителей данной генетической группы была выявлена только плазмида вирулентности pYV, обуславливающая их патогенные свойства.

92 % таких штаммов выделяли от диких животных и из объектов окружающей среды, 8 % - от людей. Необходимы дальнейшие углубленные исследования для изучения патогенных свойств штаммов Y. pseudotuberculosis, характеризуюшихся ST 16, в сравнении со штаммами других генотипов, обладающих высоким патогенным потенциалом в отношении человека и домашних животных.

Особое место занимает штамм IP 30151, выделенный при биопсии от выдры в Швеции. Он характеризуется наименьшим количеством копий IS-элементов в геноме (одна копия IS285 и 2 копии IS1541) и формирует внешнюю ветвь на всех дендрограммах. Ранее было показано, что этот штамм является единственным из 23 изученных штаммов глобального распространения (но не из России), имеющем в геноме 10 из 12 генов, специфичных для определенных российских штаммов, вызывающих тяжелые клинические проявления псевдотуберкулезной инфекции, называемой «Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка», ДСЛ [109]. В результате проведенного MLST, данный штамм характеризовался ST 23 и был отнесен к отдельной группе штаммов, изолированных также в Корее и Японии от человека и из воды. Это, так называемая, Корейская группа штаммов, которая ранее не была известна. В дальнейшем необходимо выяснить, являются ли эти штаммы новым видом, подобно Y. similis, выделенному L.D. Sprague et al. (2008) из Y..pseudotuberculosis [221].

В целом, показана корреляция результатов, полученных методами IS RFLPs и MLST, как признанного метода изучения генетической структуры популяций бактерий. На IS1541- и 2IS-RFLP–дендрограммах (см. Рисунки 1.13, 1.14) группы подветвей, формирующих отдельные кластеры, как правило, характеризуются одним ST. В тоже время, отмечено, что IS-RFLP занимает промежуточное положение между риботипированием и PFGE, т.к. позволяет анализировать большее число фрагментов, по сравнению с риботипированием, и полосы имеют лучшее разрешение, чем при PFGE, позволяя точнее проводить сравнение штаммов [185, 234].

1.2.3. IS-RFLP-типирование штаммов Y. pseudotuberculosis из различных регионов России а) IS285-RFLP-профили.

Представители российской популяции более Y. pseudotuberculosis гомогенны по содержанию в геноме IS285, в отличие от зарубежных штаммов. В результате гибридизации мембран с зондом IS285 у 193 штаммов, изолированных в трех регионах России, выявлено девять профилей, D=0,13 (Рисунок 1.15). Такое низкое значение индекса дискриминации обусловлено как ограниченным разнообразием профилей, так и выраженным доминированием штаммов, характеризующихся одним из этих фингерпринтов. Это штаммы, относящиеся к основному кластеру R1 (n=180) из всех изученных регионов страны, имеющие профиль 1 и содержащие три копии IS285 в геноме. IS285-профиль 1 также Рисунок 1.15. Дендрограмма штаммов IS285-RFLP-профилей Y..pseudotuberculosis (n=193), выделенных в трех ФО России. а, b – наиболее распространенные гибридизационные фрагменты, выявленные в профилях российских и зарубежных штаммов.

является одним из преобладающих у европейских штаммов. Еще два профиля (6, 20) по размеру гибридизационных фрагментов и количеству копий идентичны профилям зарубежных штаммов. Шесть профилей (44-49) IS285-RFLP специфичны для штаммов из России. Эти восемь профилей (6, 20, 44-49) выявлены у 13 штаммов кластера R2. У них на хромосоме присутствует от пяти до семи копий IS285. У всех российских штаммов присутствуют две вставки наиболее часто встречающиеся в геноме IS285, Y. pseudotuberculosis, циркулирующих в различных регионах мира.

Сравнительный анализ фингерпринтов, полученных в результате использования одной эндонуклеазы EcoRI и двух зондов, выявляющих, соответственно, последовательности генов 16S и 23S рРНК и IS285, показал, что метод IS285-RFLP позволяет провести внутрикластерную дифференциацию EcoRI-рибопрофилей только штаммов кластера R2. У этих штаммов два из четырех выявленных EcoRI-рибопрофиля (3 и 9) разделяются на два и четыре IS285-профиля, соответственно. При этом у российских штаммов также наблюдается корреляция IS285-профилей с риботипами, но сочетания IS285 профиль - риботип, выявленные для штаммов из других стран мира, не отмечены (см. Приложение А, А1). Так, например, риботипу 2 у этих штаммов соответствовал IS285-профиль 26, у российских штаммов – 44;

риботипу соответствовали IS285-профили 18-й и 20-й, у российских штаммов – 49-й и т.д.

Таким образом, у некоторых российских штаммов (из кластера R2), по сравнению с зарубежным, при отсутствии модификаций в регионах расположения рРНК оперонов, на хромосоме меняется локализация и число встраивающихся IS285 элементов, и происходят мутации в EcoRI-сайтах рестрикции в данных регионах.

Однако два хромосомных региона не подвержнены мутациям и несут консервативные вставки, одна из которых (а, см. Рисунок 3.16), как показали анализ сиквенса хромосомных генов штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 (№ в базе NCBI NC 006155) и сравнение молекулярной массы фрагментов рестрикции, соответствует единственному расположеному IS285 (YPTB0012), непосредственно за рРНК опероном [93].

Выявлена и обратная зависимость: IS285-профилям, характеризующим зарубежные штаммы, у российских штаммов соответствуют риботипы, не встречающиеся у штаммов из других стран, специфические для территории России. Например, IS285-профиль 1 у зарубежных штаммов взаимосвязан с риботипами 1, 10, 14, 15, 24. У штаммов российской популяции ему соответствуют специфические риботипы 27, 29, 30 и 32. Профиль 20 связан с риботипами 9 и 31, соответственно, у зарубежных и российских штаммов и т.д.

Вероятно, для штаммов, циркулирующих на территории нашей страны, в сравнении с штаммами из других стран мира, эти данные свидетельствуют о модификациях в регионе, фланкирующем 3’-конец рРНК локуса, при их отсутствии в регионах, несущих IS285.

Помимо убиквитарного IS285-RFLP профиля 1, для штаммов каждого из трех регионов определены характерные профили (см. Приложение А1).

Восемь профилей из девяти позволяют субтипировать штаммы внутри двух серотипов. При этом, как у зарубежных штаммов, профили 6 и 20 характеризуют штаммы серотипа 1а, профиль 1 – 1b. Исключение составляет профиль 49.

Как и при определени EcoRI-рибопрофилей, при построении дендрограммы IS285-профилей всех изученных 273 штаммов (Рисунок 1.16), штаммы из России и других стран, соответственно, в кластерах R1 и В1 (см. Рисунки 1.15, 1.11), которые характеризуются профилем 1, объединяются в один общий кластер.

Штаммы кластера R2 имеют редко встречающиеся профили, идентичные или близкородственные найденным у зарубежных штаммов. Они кластеризуются с штаммами кластера D2 из Европы, Туниса, Канады.

б) IS1541- RFLP-профили.

IS1541-RFLP-типирование 193 российских штаммов показало наличие гибридизационных профилей, восемь из которых индивидуальны (D=0,58) (Рисунок 1.17). В составе главного кластера R1 преобладающими являются штаммы, характеризующиеся двумя специфическими для России профилями (24 %) и 66 (60 %). У них выявлено четыре и шесть копий IS1541, соответственно.

Профиль 62 характеризует штаммы, выделяемые в сибирском и дальневосточном Рисунок 1.16. Дендрограмма IS285-RFLP-профилей изученных штаммов Y. pseudotuberculosis (n=273).

регионах, профиль 66 - в сибирском и северо-западном. Еще восемь специфических профилей, относящихся к 9 % штаммов данного кластера, имеют 6–8 рестрикционных фрагментов. Для 13 штаммов, формирующих кластер R2, идентифицировано шесть профилей, из которых один (4-ый) является Рисунок Дендрограмма штаммов 1.17. IS1541-RFLP-профилей Y..pseudotuberculosis (n=193), выделенных в трех ФО России. b – наиболее распространенный гибридизационный фрагмент, выявленный в профилях российских и зарубежных штаммов.

идентичным для зарубежных штаммов. При этом три профиля имеют наибольшее количество рестрикционных фрагментов, несущих IS1541: 64-й – восемь, 70-й – девять, 72-й – 15, и три профиля (4, 63, 65) представлены малым числом копий IS1541 – от 2-х до 4-х. Соответственно, штаммы разделены на два небольших подкластера и, по сравнению с IS285-RFLP-типированием, более четко группируются в них в зависимости от региона изоляции, как и в кластере R1: одну группу ветвей формируют штаммы, циркулирующие на Северо-Западе и в Сибири, другую – в Сибири и на Дальнем Востоке. В отличие от двух высококонсервативных вставок IS285, присутствующих в геноме всех российских и большинства зарубежных штаммов, только один IS1541 элемент (b), являющийся самым распространенным у зарубежных штаммов (55 %), характерен также для 75 % российских.

Таким образом, при изучении распределения IS285 и IS1541 в геноме Y..pseudotuberculosis установлено, что у российских штаммов присутствуют две и одна консервативные вставки, соответственно, IS285 и IS1541, наиболее часто встречающиеся у штаммов, циркулирующих в других странах. Наличие общих IS-элементов в геномах различных штаммов свидетельствует об их общем происхождении [7, 171]. Вероятно, указанные IS-элементы находились в геноме эволюционного предшественника современной глобальной популяции Y..pseudotuberculosis.

Выявлена особенность российских штаммов: 10 IS1541-профилей, в отличие от позволяют провести внутрикластерную IS285-профилей, дифференциацию штаммов кластера R1, но не R2, разделяя два EcoRV рибопрофиля. Только один из четырех EcoRV-рибопрофилей кластера R2 (3-й) подразделяется на два IS1541-профиля (64-й и 72-й). Отмечается корреляция IS1541-профилей с риботипами (см. Приложение А1). При этом сохраняются только два сочетания IS1541-профиль – риботип, определенные для штаммов из других стран мира: профилю 4 соответствуют риботипы 4 и 12. Остальные риботипы взаимосвязаны только со специфическими для российских штаммов IS1541-профилями. Очевидно, как и при миграциях IS285, это обусловлено выраженными модификациями, с одной стороны, связанными с числом и расположением IS1541, отличающимися у российских штаммов, с другой вызывающими изменения в EcoRV-сайтах рестрикции, как в регионах, фланкирующих 3’-конец рРНК локуса, так и в регионах, несущих IS1541.

Показано, что в большинстве случаев штаммы, циркулирующие в различных регионах России, отличаются IS1541-профилями (см. Приложение А1). Обнаружены также общие профили: 4-й и 66 –й характеризуют штаммы, изолированные на Северо-Западе и в Сибири, 62-й – в Сибири и на Дальнем Востоке.

Серотипу 1а, как и у европейских штаммов, соответствует профиль 4, а также 70. 13 IS1541-профилей (58, 59, 62, 63, 65-69, 71-74) дифференцируют серотип 1b. Таким образом, за исключением профиля 64, для 15 из 16 IS1541 профилей установлена корреляция с серотипами.

На дендрограмме всех изученных 273 штаммов IS1541-профилей сохраняется самостоятельность кластера R1, включающего только специфические для российских штаммов профили (Рисунок 1.18). Штаммы кластера R2 с редко встречающимися профилями разделены на две группы в соответствии с количеством рестрикционных фрагментов в профилях: штаммы, имеющие малое число копий IS1541 (профили 4, 63, 65), входят со штаммами из Европы, Туниса, Канады в кластер (D2), штаммы с многофрагментными профилями 64, 70, 72 – в кластер d2 cо штаммами из Европы и Туниса.

Таким образом, применение нескольких независимых генетических маркеров позволило более детально дифференцировать изученные штаммы, циркулирующие в различных регионах России. Можно предположить, что штаммы, относящиеся к этим двум группам, представляют две филогенетические линии, различающиеся по структуре локусов, содержащих рРНК опероны, маркерам IS285 и IS1541, имеющие общего предка. При этом, российские штаммы редких генетических вариантов (кластер R2), в отличие от штаммов, имеющих специфичные для нашей страны генетические характеристики (кластер R1), обладают единством происхождения со штаммами из других стран мира и, Рисунок 1.18. Дендрограмма IS1541-RFLP-профилей изученных штаммов Y..pseudotuberculosis (n=273).

вероятно, являются эволюционно более молодыми, учитывая характеризующие их многофрагментные профили с несколькими общими IS1541-RFLP фрагментами при наличии двух высококонсервативных локусов, содержащих рРНК опероны и инсерции IS285.

в) Сочетание IS285- и IS1541- RFLP-профилей (2IS-RFLP).

На дендрограмме, полученной при комбинировании девяти IS285- и IS1541-RFLP профилей у 193 исследованных штаммов из различных регионов России, определено 18 2IS-типов, 11 из них являются индивидуальными (D=0,58) (Рисунок 1.19). 17 2IS-типов встречаются только у штаммов из России (71, 72, 74 88). Главный кластер R1 составляют штаммы 10-ти 2IS-типов, среди которых доминантным является 88-й (60 % всех штаммов). Это отражает внутрикластерную дифференциацию штаммов двух из четырех специфических риботипов – 27-го и 32-го, в результате которой они разделяются на 10 и два 2IS типа, соответственно, что согласуется с результатами определения IS285- и IS1541-RFLP профилей. Восемь 2IS-типов характеризуют 13 штаммов кластера R2, один из них (12-й) встречается у зарубежных штаммов. При этом на 2IS-типы дифференцируется только один редкий риботип из четырех – риботипу соответствуют 2IS-типы 12 и 81. Таким образом, при сопоставлении соотношения риботип – 2IS-тип выявлен единственный штамм, обладающий генотипической характеристикой, свойственной зарубежным штаммам: риботип 12, 2IS-тип 12.

2IS-тип 87 выявлен у штаммов, циркулирующих в Сибири и на Дальнем Востоке. Для штаммов, изолированных на Северо-Западе и в Сибири также определен общий 2IS-тип – 88-й. В тоже время, среди остальных 2IS-типов определены характерные для штаммов из каждого региона.

17 2IS-типов позволяют дифференцировать изученные штаммы двух серотипов, выявленный 18-й тип (80-й) – исключение, т.к. относится в двум серотипам.

На 2IS-RFLP дендрограмме, объединяющей все изученные 273 штамма (Рисунок 1.20), также выделяется кластер Y..pseudotuberculosis R1, сформированный российскими штаммами 10-ти специфических 2IS-типов, в то время как штаммы кластера R2 восьми редких для России 2IS-типов, в соответствии с определением IS1541-профилей, распределены между двумя подкластерами D2 и d2 (п. 1.2.2), включающими штаммы, изолированные в европейских странах, Тунисе, Канаде, главным образом, от диких животных и из окружающей среды.

В результате проведенного исследования полиморфизма длин фрагментов рестрикции генов IS285 и IS1541 для штаммов Y..pseudotuberculosis глобального Рисунок 1.19. 2IS-RFLP дендрограмма штаммов Y. pseudotuberculosis (n=193), выделенных в трех ФО России.

Рисунок дендрограмма изученных штаммов 1.20. 2IS-RFLP Y.Y..pseudotuberculosis (n=273).

распространения (n=273) выявлена выраженная дифференциацию кластеризованных штаммов, характеризующихся определенными EcoRI-, EcoRV рибопрофилями и риботипами, на IS-, 2IS-типы. Таким образом, штаммы, идентичные по рРНК локусам были, неоднородны по содержанию IS285 и IS в геноме, что подтверждает целесообразность использования независимых генетических маркеров для изучения разнообразия популяции. Однако сравнительный анализ эффективности трех использованных IS-RFLP методов показал, что метод обладает наименьшей разрешающей IS285-RFLP способностью, что объясняется преобладанием единичных рестрикционных профилей, характеризующих большинство штаммов. Так, у 80 штаммов из различных стран мира идентифицировано 43 профиля, три из них выявлены почти у половины штаммов (42,5 %) (D=0,94) (Таблица 1.10). У 193 российских Таблица 1.10. Дискриминирующая сила методов генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis из различных стран мира (n=80) Кол-во общих типов Метод Кол-во для штаммов, различающихся D источ- страной серо типов индиви- штаммов ником выделе- типом всего дуальных (%) ния / домини- домини рующих рующих типов типов Риботипирование 18 6/5 64 8 5 8 0, EcoRI Риботипирование 17 6/5 67 6 6 4 0, EcoRV Риботипирование 27 13/4 42,5 8 6 6 0, EcoRI+EcoRV IS285-RFLP 43 34/3 42,5 6 3 3 0, IS1541-RFLP 61 51/1 13,8 3 3 0 0, 2IS-RFLP 73 66/0 0 2 2 0 0, штаммов определено девять IS285-профилей, из которых только один является доминирующим и относится к 93 % штаммов (D=0,13) (Таблица 1.11).

Таблица 1.11. Дискриминирующая сила методов генотипирования российских штаммов Y. pseudotuberculosis (n=193) Кол-во общих типов для штаммов, Кол-во Метод различающихся D типов индиви- штаммов регио источ- серо дуальных (%) ном всего ником типом / домини- домини выделе рующих рующих ния типов типов Риботипирование 79 3 6 0/1 4 0, EcoRI Риботипирование 72 2 7 1/1 5 0, EcoRV Риботипирование 71 11 3/1 5 3 0, EcoRI+EcoRV IS285-RFLP 93 9 5/1 2 1 0, IS1541-RFLP 60 16 8/1 3 3 0, 2IS-RFLP 60 18 11/1 3 2 0, Дискримиинирующая способность метода IS1541-RFLP выше, чем методов IS285-RFLP и риботипирования, благодаря большему разнообразию исследуемых рестрикционных профилей, в том числе индивидуальных. При этом, у зарубежных и российских штаммов определены 61 (D=0,98) и 16 (D=0,58) IS1541 профилей, соответственно.

Установлено, что при исследовании зарубежных штаммов дискриминирующая возможность 2IS-RFLP метода была наибольшей – выявлено 73 2IS-типа (D=0,99). Для российских штаммов определено 18 2IS-типов, при этом индексы дискриминации методов IS1541- и 2IS-RFLP-типирования не различались (D=0,58).

Анализ дендрограмм IS1541- и 2IS-RFLP типирования показал, при использовании этих методов происходит однотипное распределение штаммов по кластерам и подкластерам. Поэтому с учетом близких значений индекса разнообразия для этих двух методов применение одного IS1541-RFLP метода без сочетания с IS285-RFLP целесообразно для скринингового анализа штаммов Y..pseudotuberculosis при мониторинге циркуляции возбудителя на отдельных территориях.

Результаты, полученные IS-RFLP методами согласуются с данными риботипирования и демонстрируют однородность российских штаммов в сравнении со штаммами из других стран мира по локусам хромосомы, содержащим рРНК опероны, маркерам IS285 и IS1541. При этом на всех дендрограммах, полученных как для индивидуальных профилей, так и их сочетаний установлена характерная особенность представителей российской популяции Y. pseudotuberculosis – циркулирующие штаммы формируют два стабильных кластера. Большинство штаммов (93 %), образуют кластер R1. Они характеризуются специфическими генотипами, нехарактерными для штаммов из других регионов мира, один из которых является доминирующим. В кластер R входит только 7 % изученных штаммов, которые относятся к редким генетическим вариантам, идентичным или близкородственным генетическим вариантам штаммов из других стран мира.

Применение полученных новых данных о структуре популяции Y..pseudotuberculosis в России и метода внутривидовой дифференциации штаммов рекомендуется для повышения эффективности IS1541-RFLP микробиологического мониторинга циркулирующих на территории наблюдения штаммов.

Глава 2. Совершенствование подходов к микробиологическому мониторингу циркуляции Y..pseudotuberculosis на основе применения комплекса методов выявления и типирования возбудителя Сравнительная эффективность лабораторных методов диагностики 2.1.

при установлении этиологии групповых заболеваний При микробиологическом мониторинге циркулирующих штаммов Y..pseudotuberculosis, особенно по эпидемическим показаниям, основной задачей является установление в короткие сроки этиологии заболевания, источников и факторов заражения. Классическое бактериологическое исследование требует не менее семи дней для выделения культуры Y. pseudotuberculosis, серологическая диагностика, свою очередь, наиболее эффективна, начиная со второй недели болезни. В этой связи, при обследовании очагов для подтверждения этиологии групповых заболеваний необходимо применение высокочувствительных и экспрессных методов.

В последние годы, благодаря активной этиологической расшифровке многообразия клинических форм заболеваний, обусловленных Y..pseudotuberculosis и патогенными Y. enterocolitica, а также развитию новых технологий, стало возможным решать указанные проблемы.

Для выявления антигенов Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 ранее разработана промышленная технология ИФА тест-системы [34, 35]. Метод ИФА Ag использован нами для исследования различных видов материала во время группового заболевания псевдотуберкулезом, зарегистрированного в г. Санкт Петербург среди учащихся военного заведения в 2001 г.

Анализ заболеваемости псевдотуберкулезом позволил установить характерную особенность динамики вспышки – наличие двух выраженных подъемов на фоне спорадических заболеваний с ноября 1999 г. по март 2000 г. С предварительным диагнозом «псевдотуберкулез» было госпитализировано человек. Заболевания начались остро, протекали, преимущественно, в среднетяжелой форме и характеризовались температурой тела 38,7-40 Сс выраженными симптомами интоксикации, гиперемией зева, экзантемой, болями в животе, лимфаденопатией, гепато-спленомегалиями. Шесть больных поступали в стационар дважды с рецидивами после первого подъема заболеваемости.

Таким образом, клиническая картина позволяла заподозрить псевдотуберкулез, но требовалось лабораторное подтверждение. При исследовании проб испражнений методом ИФА-Ag положительные результаты получены в 36,9 % случаев. У семи больных (6,3 %) диагноз был также подтвержден выделением культуры Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 (р0,01) (Таблица 2.1).

Таблица 2.1. Результаты исследования материала от больных и из внешней среды на псевдотуберкулез во время вспышки в г. Санкт-Петербург Объект исследования Количество положительных результатов (кол-во проб) абс./% (M±m) Бактериол.

ИФА-Ag РНГА метод Испражнения (111) 41/36,9±4,6 7/6,3±2,3 Сыворотка крови (111) 76/68,5±4, - Смывы (168) 11/6,5±1,9 3/1,8±1,1 В последующем у 76 (68,5 %) обследованных больных диагноз был подтвержден выявлением антител к Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 в РНГА в титрах 1:100 1:800 на 10-14 сутки от начала заболевания при отсутствии антител к Y..enterocolitica серотипов О:3 и О:9. У 18 % больных отмечено достоверное увеличение титров в динамике исследования (на 28-30 сутки).

Для выявления факторов передачи возбудителя псевдотуберкулеза в очаге методом ИФА-Ag отобрано168 смывов с сырых овощей и оборудования пищеблоков. При их исследовании в нативном виде 11 проб (6,5 %) дали положительные результаты, подтвержденные в дальнейшем бактериологическим методом с выделением трех культур Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 (р0,05).

Таким образом, была выявлена инфицированность овощей на местах хранения и оборудования пищеблоков на местах обработки овощей. На основании полученных данных установлена причина возникновения первого подъема заболеваемости псевдотуберкулезом учащихся - употребление ими сырых овощей во время проведения работ в овощехранилищах и наряде по столовой.

Установлено также, что основной причиной заражения личного состава в период второго подъема явилось употребление салатов, приготовленных из инфицированных Y. pseudotuberculosis капусты, моркови и лука. Таким образом, использование инфицированных овощей длительного хранения привело, надо полагать, к формированию резервуара инфекции, что вызвало повторный подъем заболеваемости. Данный вывод подтвержден также выявлением в период между двумя подъемами заболеваемости единичных случаев псевдотуберкулеза, подтвержденных серологическими методами.

Следует отметить, что методом ИФА-Ag положительные ответы получены в первые дни от момента регистрации группового заболевания в данном организованном коллективе, в то время как выделение культур стало возможным после этапа «холодового обогащения» смывов и материала от больных не ранее 10 суток. Полученные данные подтверждают диагностическую эффективность ИФА-Ag при исследовании полевого материала.

В ходе дальнейших исследований для решения прикладных задач микробиологического мониторинга циркулирующих штаммов был апробирован метод ПЦР, обладающий высокой Y..pseudotuberculosis разрешающей способностью [10, 65, 66]. Он использован нами для установления псевдотуберкулезной этиологии вспышки в школьном коллективе г. Новый Уренгой (Ямало-Ненецкий автономный округ, ЯНАО). Вспышка носила острый характер, возникла в сентябре-октябре 2007 г., заболел 141 школьник в возрасте от 6 до 15 лет. 41 человек был госпитализирован с предварительными диагнозами «ОКИ», «кишечный иерсиниоз», «псевдотуберкулез». Заболевания протекали в легкой и среднетяжелой формах с, катаральными явлениями, сыпью.

Субфебрильная температура тела отмечалась у 60 % больных, повышение температуры до 38-400C – у 36 % больных. Симптомы поражения желудочно кишечного тракта (тошнота, рвота, боли в животе, жидкий стул) отмечены в 11,5 28,1 % случаев, артралгии зафиксированы у 9 % больных. В последующем рецидивов и осложнений не наблюдали.

С учетом клинической картины проведены целенаправленные диагностические исследования на выявление псевдотуберкулезной этиологии данного группового заболевания. В первые 3 дня от момента регистрации вспышки отобраны пробы материала от больных (испражнения, моча, смывы из зева), смывы с овощей, тары и оборудования в помещениях пищеблока школы и овощехранилища. Материал исследовали как в нативном виде, так и после «холодового обогащения». Одновременно с использованием ПЦР исследования прововдили бактериологическим методом. Испражнения исследовали также на наличие ротавирусов и патогенных энтеробактерий, ОСК дополнительно исследовали в РНГА с сальмонеллезным и дизентерийным диагностикумами.

Результаты представлены в таблице 2.2. В ПЦР специфические фрагменты ДНК псевдотуберкулезного микроба выявлены в семи нативных пробах от больных (22,6 %) и двух смывах (6,9 %) после «холодового обогащения» на 10 и 21 сутки. Факторами передачи инфекции оказались свежие овощи (морковь и капуста), которые дети получали в виде салатов. Бактериологическим методом от больных изолировано 28 культур Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 (р0,05) на день после начала вспышки. Наиболее информативным видом клинического материала явились испражнения. Бактериологические посевы материала из внешней среды были отрицательными на всех сроках исследования. Таким образом, в результате применения ПЦР этиология группового заболевания установлена на 7 дней раньше по сравнению с бактериологическим методом.

Важно, что в ходе данной вспышки установить фактор передачи инфекции удалось в короткие сроки и только при использовании ПЦР, что обеспечило своевременное проведение противоэпидемических мероприятий.

Также для серологического подтверждения диагноза на 10-11 дни от Таблица 2.2. Результаты исследования материала от больных и из внешней среды на псевдотуберкулез при групповом заболевании на территории ЯНАО Количество проб Вид материала всего /с положительным результатом ПЦР Бак. метод Пробы от больных: испражнения 12/6 122/ моча 12/0 117/ мазки из зева 7/1 114/ всего 31/7 (22,6±7,5 %) 353/28 (7,9±1,4 %) Смывы 29/2 (6,9±4,7 %) 155/ начала заболевания исследовано 65 ОСК, в 17 из них (26,2 %) в РНГА с псевдотуберкулезным эритроцитарным диагностикумом выявлены диагностические титры антител 1:100-1:200. 79 ОСК исследованы на 15-20 дни, положительные результаты (1:100-1:800) зарегистрированы в 38 образцах (48,1 % случаев).

При данной эпидемической ситуации нами впервые апробированы лабораторные серии разработанных тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgM/IgA/IgG»

(глава 3.1). При исследовании ОСК, полученных на 10-11 дни болезни, в образцах (35,4 %) выявлены специфические антитела всех трех классов при суммарном учете положительных реакций (Таблица Показатели 2.3).

коэффициента серопозитивности (КС) находились в пределах минимального диагностического значения 1,1 (Таблица 2.4). На 15-20 дни заболевания положительные результаты зарегистрированы у 52 больных (65,8 %). Таким образом, частота обнаружения специфических антител в ИФА на этом сроке исследования была достоверно выше, в сравнении с РНГА (р0,05). Отмечалось выраженное увеличение содержания антител всех классов (р0,01). Важно Таблица 2.3. Результаты исследования ОСК больных на псевдотуберкулез серологическими методами при групповом заболевании на территории ЯНАО Кол-во положительных результатов, абс. /% (M±m) День Кол-во ИФА болезни больных РНГА ИФА IgА IgМ IgG суммарно 23/ 15/ 22/ 18/ 17/ 10-11 35,4±5,9 23,1±5,2 33,8±5,9 27,7±5,6 26,2±5, 52/ 47/ 52/ 51/ 38/ 15-20 65,8±5,3 59,5±5,5 65,8±5,3 64,6±5,4 48,1±5, Таблица 2.4. Результаты определения антител в ОСК больных при групповом заболевании на территории ЯНАО с применением тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG»

День Коэффициент серопозитивности (М+m) болезни IgА IgМ IgG 1,5±0,05 2,0±0,1 1,7±0, 10- 6,3±0,4 7,2±0,6 5,8±0, 15- отметить, что у 14 из этих 52 пациентов, у которых методом РНГА не выявлены антитела, отсутствовали четкие патогномоничные симптомы псевдотуберкулеза отмечали субфебрилитет и катаральные явления.

Таким образом, при групповых заболеваниях применение ИФА для выявления антигенов возбудителя псевдотуберкулеза и ПЦР позволило повысить эффективность лабораторной диагностики и значительно ускорить установление этиологии заболеваний. Положительные результаты ИФА и ПЦР при исследовании внешней среды способствовали целенаправленному проведению бактериологического исследования проб для дальнейшего изучения выделенных культур.

Полученные результаты исследования сывороток от больных на третьей неделе заболевания показали, что чувствительность тест-систем «Иерсиниоз ИФА-IgM/IgA/IgG» выше, чем диагностикума для РНГА, на 18 % (р0,05).

Применение ПЦР при плановом микробиологическом мониторинге 2.2.

циркуляции возбудителя Одним из направлений микробиологического мониторинга популяций Y..pseudotuberculosis является слежение за циркуляцией возбудителя в объектах окружающей среды и среди мелких млекопитающих. Опыт нашей работы, проведенной на территориях одной из областей СЗФО и Якутии подтверждает целесообразность использования ПЦР при проведении планового мониторинга возбудителя псевдотуберкулеза для лабораторного контроля объектов окружающей среды и эпизоотологического обследования.

В рамках совместных исследований с ЦГЭ в Вологодской области бактериологическим методом и методом ПЦР исследовано 129 смывов с продуктов растительного происхождения и тары в овощехранилищах. Результаты представлены в Таблице 2.5. Проведенное исследование позволило получить положительные результаты методом ПЦР в 8 (6,2 %) исследованных пробах. При этом в трех смывах с овощей (капуста, морковь) ДНК Y. pseudotuberculosis обнаружена сразу при исследовании нативного материала;

на 3-и сутки после «холодового обогащения» выявлено еще пять контаминированных проб (смывы с тары, овощей). Из этих проб при дальнейшем бактериологическом исследовании на 10-е сутки после подращивания выделено две культуры Y..pseudotuberculosis (1,6 % проб) (р0,05). Таким образом, применение метода ПЦР способствовало более раннему выявлению инфицированных овощей в большем количестве и предотвращению их дальнейшего использования.

Таблица 2.5. Результаты выявления Y..pseudotuberculosis при исследовании смывов с объектов окружающей среды Вид Кол-во Число положительных результатов, абс./% материала проб ПЦР Бактер. метод нативный после материал «холодового обогащения»

Смыв с 22 0 1/4,5 тары Смыв с 73 3/4,1 4/5,5 2/1, овощей Смыв с 34 0 0 фруктов Всего 8/6,2±2,1 2/1,6±1, При выполнении совместной научно-исследовательской работы с ЦГЭ в Республике Саха (Якутия) проведено эпизоотологическое обследование с целью выявления уровня инфицированности диких и синантропных грызунов в качестве езервуаров Y. pseudotuberculosis. Бактериологическим методом и методом ПЦР исследованы гомогенаты тонких кишечников мелких грызунов, отловленных в местах естественного обитания в окрестностях г. Якутск и трех соседних с ним районах (Мегино-Кангаласском, Намском, Горном). Видовой состав исследуемых животных составляли полевки различных видов, бурозубка, домовая мышь.

Также изучены гомогенаты кишечников серых крыс, обитающих в птицеводческом хозяйстве г. Якутск. Результаты представлены в таблице 2.6.

Методом ПЦР в шести пробах (3,7 %) от диких грызунов (красная полевка, бурозубка), исследованных в нативном виде, выявлена ДНК Y. pseudotuberculosis.

Бактериологическим методом культуры выделить не удалось. При исследовании гомогенатов кишечников серых крыс, отловленных на территории Таблица 2.6. Результаты выявления Y..pseudotuberculosis при исследовании материала от грызунов Число положительных результатов, абс./% Кол-во Грызуны Бактериол. метод проб ПЦР (после «холодового (нативный материал) обогащения») Дикие 163 6/3,7 Синантропные 32 3/9,4 3/9, птицеводческого хозяйства, методом ПЦР положительные результаты получены в трех пробах нативного материала (9,4 %), подтвержденные бактериологическим методом на 5-е сутки после «холодового обогащения». Таким образом, метод ПЦР можно также рассматривать как эффективный метод контроля инфицированности грызунов. Применение ПЦР позволило впервые выявить в регионе наблюдения основные резервуары Y..pseudotuberculosis Полученные данные показали, что применение методов ИФА-Ag и ПЦР повышает эффективность индикации Y. pseudotuberculosis при слежении за циркуляцией возбудителя, благодаря получению положительных результатов в первые дни исследования и выявлению значительно большего числа инфицированных проб. В настоящее время их использование для мониторинговых исследований регламентировано методическими документами федерального уровня.

Микробиологический мониторинг популяций Y. pseudotuberculosis с 2.3.

использованием методов генотипирования 2.3.1. Определение детерминант патогенности у различных риботипов и IS-типов Y. pseudotuberculosis Как было показано в исследовании Н. Fukushima et al. (2001), глобальная популяция Y. pseudotuberculosis гетерогенна по наличию факторов патогенности, детерминирующих различные клинические проявления псевдотуберкулеза [122].

При этом установлена циркуляция двух основных клонов, отличающихся географическим распространением. Так, штаммы генотипа YPM-HPI+ из Европы и других регионов относятся к генетической группе G2 и вызывают псевдотуберкулез, характеризующийся, главным образом, гастроинтестинальными симптомами. В отличие от этих штаммов, штаммы, преобладающие в Дальневосточном регионе (Россия, Китай, Корея, Япония) имеют генотип YPM+HPI- и относятся к генетической группе G3. Заражение такими возбудителями преимущественно приводит к развитию генерализованной инфекции. В этом же регионе встречаются штаммы генетической группы G (генотип YPM+HPI+). Характерные симптомы заболевания, вызываемого такими штаммами, на момент исследования авторами не были определены.

В ходе проведенных нами исследований установлено отличие подавляющего большинства штаммов, циркулирующих на территории трех регионов России, от штаммов из других стран мира по локусам хромосомы, содержащим рРНК опероны, маркерам IS285 и IS1541. Представлялось важным определить наличие указанных генов вирулентности у представителей российской популяции Y. pseudotuberculosis для характеристики патогенного потенциала различных генетических вариантов. Как было показано в Главе 1, при сравнении дискриминирующей силы методов генотипирования российских штаммов (см. Таблица 1.11), для метода IS285-RFLP выявлено самое низкое значение индекса дискриминации. Поэтому присутствие генов вирулентности было изучено у штаммов, характеризующихся различными риботипами, IS1541- и 2IS-типами.

Полученные результаты представлены в таблице 2.7. Из таблицы видно, что Таблица 2.7. Результаты определения детерминант патогенности у штаммов Y. pseudotuberculosis (n=193) различных генетических вариантов Наличие генов Генети- Кол-во Генетические варианты ческая штаммов** группа, YPM HPI Рибо- Абс.

IS1541- 2IS- % G* тип тип тип 58 59 68 67 Специфичные 27 69 79 + - 3 137 71, для России 73 74 71 62 66 29 62 87 + - 3 2 1, 30 62 87 + - 3 25 13, 32 62 87 + - 3 16 8, 66 2 63 76 - + 2 2 1, 1** 3 72 84 + - 3 1 0, 1** 4 4 74 - + 2 1 0, 3** для России Редкие 9 64 80 + + 1 2 1, + - 3 1 0, 5** 12 4 12 - + 2 1 0, 4 81 + + 1 1 0, 1** 28 65 75 - + 2 1 0, 31 70 83 - + 2 3 1, * Генетическая группа определена аналогично данным Н. Fukushima et al.

(2001):

** Отмечено кол-во штаммов из других стран, % указан только для российских штаммов.

для нашей страны превалирующими являются представители генетической группы G3, составляющие 94,3 % из числа циркулирующих штаммов. Эти штаммы принадлежат ко всем специфичным для России генетическим вариантам (риботипам, IS-типам), а также двум редким риботипам и IS-типам. Остальные штаммы ркдких генетических вариантов относятся к генетическим группам G (4,1 %) и G1 (1,5 %). Присутствие штаммов геногруппы G2, вызывающих течение заболевания без типичных проявлений, аргументирует показания к проведению обследований больных с диагнозом «острая кишечная инфекция неустановленной этиологии» на наличие псевдотуберкулезной инфекции.

2.3.2. Оценка эффективности методов внутривидового типирования при микробиологическом мониторинге возбудителя Одной из задач настоящего исследования являлось изучение возможности применения различных генетических маркеров для анализа структуры популяций Y. pseudotuberculosis в России при слежении за циркуляцией возбудителя на территориях отдельных регионов.

Сравнительные данные распределения штаммов выявленных генетических вариантов по трем регионам России представлены в таблице 2.8. Использованные методы молекулярного типирования позволили определить в фенотипически гомогенной популяция Y. pseudotuberculosis как повсеместно встречающиеся генетические варианты, так и распространенные только в определенном регионе.

При этом, методом 2IS-RFLP, обладающим наибольшей дискриминирующей силой (D=0,70), определено максимальное число генетических типов, характерных для штаммов каждого региона, в том числе, индивидуальных.

При сопоставлении генетических характеристик изученных штаммов, установлено, что регион-специфичным риботипам 29 (Дальний Восток) и (Сибирь) и убиквитарным риботипам 27 и 32, соответствуют единые IS1541-тип 62 и 2IS-тип 87. В то же время, у штаммов, изолированных на Северо-Западе и в Сибири эти же риботипы 27 и 32 связаны с IS1541-типом 66 и 2IS-типом 88.

Таким образом, в результате внутрикластерной дифференциации становится Таблица 2.8. Данные распределения штаммов Y. pseudotuberculosis (n=193) различных генетических вариантов по регионам России Регион Число С ер о - Генетический вариант Кол-во штаммов тип штаммов каждого Риботип 2IS-тип IS ген. вар.

2* 63 О:1b 28 65 О:1b 4* О:1а 4* Северо- 12* О:1а 38 12* 4* Запад 59 О:1b 27 68 О:1b 27 67 О:1b 27 69 О:1b 27 О:1b 27 66 88 О:1b 32 66 88 9* 64 О:1а 9* 64 О:1b О:1b 62 87 Сибирь О:1b 146 27 62 87 О:1b 32 62 87 71 О:1b 27 О:1а 12* 4* 73 О:1b 27 74 О:1b 27 О:1b 27 66 88 О:1b 32 66 88 31 70 О:1а Дальний 3* 72 О:1b 9 Восток 58 О:1b 27 О:1b 27 62 87 О:1b 62 87 О:1b 32 62 87 - характерны для данного региона России * - встречается в Западной Европе и Тунисе, редкий для России возможным детальнее подразделить, в соответствии с регионом выделения штамма, доминирующие риботипы 27 и 32, характеризующие повсеместно распространенные штаммы кластера В целом, дифференциация R1.

наспецифические для отдельных регионов IS1541- и 2IS-типы наиболее выражена у доминирующих штаммов риботипа 27. Штаммы риботипа 4, специфического для Cеверо-Запада, имеют общий IS1541-профиль 4 со штаммами риботипа 12, выделяемыми также в Сибири, но различаются 2IS-типами. Для остальных штаммов, в зависимости от региона, выявлены характерные риботипы 2, 3, 9, 28, 31 и соответствующие им IS1541-, 2IS-типы.

Как было показано в Главе 1, российские штаммы редких генетических вариантов кластера R2 делятся на два подкластера, в зависимости от количества копий IS1541 в геноме, при этом одну группу ветвей формируют штаммы, распространенные на Северо-Западе и в Сибири, другую – в Сибири и на Дальнем Востоке. В соответствии с этим, на дендрограммах профилей (типов) всех изученных штаммов, штаммы кластера R2 всегда распределяются между ветвями различных кластеров D2, d2 (см. Рисунок 1.18).

Таким образом, по результатам IS1541- и 2IS-RFLP–типирования, штаммы, распространенные на территории Сибири, относятся к двум субпопуляциям и отличаются родством со штаммами из различных регионов: в кластере R большая часть штаммов (65,1 %) относится к такому же специфическому для России генетическому варианту, который преобладает у штаммов, распространенных на Северо-Западе;

29,5 % штаммов по указанным генетическим маркерам сходны со штаммами из дальневосточного региона.

Подобная закономерность выявляется и в отношении штаммов кластера R2 с редкими для России генетическими характеристиками. Как следствие, не определено IS1541- и 2IS-типов, характерных для всех трех регионов. В отличие от методов IS-RFLPs, методом риботипирования выявлено два генетических варианта (риботипы 27, 32), общих для штаммов из трех регионов. Учитывая, что в исследование вошло только девять штаммов Y. pseudotuberculosis, изолированных на территории дальневосточного региона, полученные данные позволяют также предположить, что там могут присутствовать штаммы риботипа 30, в данное время выделенные только на территории Сибири, но по IS-маркерам идентичные штаммам с Дальнего Востока.

Показано, что штаммы убиквитарных риботипов 27-го и 32-го выделяются постоянно и отличаются разнообразием происхождения – это штаммы, изолированные из разных источников во время вспышек (от больных, от грызунов, из смывов с овощей), при спорадических случаях, при плановом мониторинге (Таблица 2.9). Аналогичные сведения получены для штаммов риботипа 30, циркулирующих в Сибири. Штаммы риботипа 27 превалируют среди штаммов других генетических вариантов, с ними связана основная доля групповых (71,6 %) и спорадических (85,7 %) заболеваний. Между тем, неожиданным оказался факт отсутствия в исследуемом материале штаммов этого риботипа при плановом мониторинге в сибирском регионе. Такая же ситуация наблюдается со штаммами риботипа 32 во всех трех регионах. В целом, доля штаммов, изолированных в ходе планового мониторинга возбудителя, полученных нами при исследовании, невелика, по сравнению со штаммами, выделенными при эпидемических ситуациях. При относительно высоком уровне заболеваемости в данных регионах России это может свидетельствовать о недостаточном использовании современных методов индикации иерсиний.

Выявленное соответствие определенных риботипов и IS-типов также позволяет рассматривать штаммы IS1541-типов 62, 66 и 2IS-типов 87, 88, связанные с риботипами 27, 30, 32, как наиболее значимые для распространения инфекции.

Штаммы риботипов 9, 29 выделенны только от больных, при этом штаммы 9-го риботипа были изолированы в ходе эпидемической ситуации, в то время как штаммы 29-го риботипа - при спорадических случаях. Очевидно, в ходе нашего исследования среди российских штаммов также не удалось выделить штаммы риботипов 9 и 29, связанные с источниками и/или факторами передачи инфекции, в то время, как штаммы риботипа 9, циркулирующие на территории Туниса и Украины (см. Рисунок 1.10), были изолированы также и от грызунов. Штаммы Таблица 2.9. Характеристика штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов, выделенных при мониторинге возбудителя (n=193) Кол-во штаммов Выделение Рибо- каждого выделения IS1541-тип 2IS-тип Источник штаммов тип штамма Рибо при:


IS-типа типа 2* 63* 76* 1 Человек 9 64 80 3 27* 71, 62*, 66* 86, 87*, 88* 73 1, 2, 30* 62* 87* 13 32* 62*, 66* 87*, 88* 12 7, групповых заболеваниях 12* 4* 81 1 Грызуны 27* 66* 88* 4 30* 62* 87* 2 32* 62* 87* 1 Смывы с 27* 66* 88* 4 n = овощей 30* 62* 87* 2 32* 62* 87* 1 27* 58, 59, 68, 67, 69, 71, 72, 77, 78, 79, 54 1, 9, 1, 1, 1, Человек 73, 74 82, 85 2, спорадических заболеваниях 62*, 66* 87*, 88* 7, 29 62* 87* 2 n = 30* 62* 87* 5 32* 62* 87* 2 3 72 84 1 Грызуны 4 4* 74 1 28 65 75 1 плановом мониторинге 30* 62* 87* 1 31 70 83 3 Смывы с 30* 62* 87* 2 овощей Неиз- 2* 63* 76* 1 n = вестен 12* 4* 12 1 27* 66* 88* 2 *генетические варианты, характеризующие штаммы, выделенные при плановом и оперативном мониторинге вне зависимости от источника риботипа не встречаются за пределами России, по расположению на дендрограмме им наиболее близки штаммы 27 и 32 риботипов, выделяемые из разных источников (коэффициент сходства 92 %). Сопоставление риботипов и IS типов показывает, что штаммы этих трех риботипов (27, 29, 32), выделяемые в Сибири и на Дальнем Востоке, связаны с одним IS1541-типом 62 и одним 2IS типом 87 (Таблица 2.8.). Учитывая, что в исследование вошло только два штамма риботипа 29, можно предположить о возможности циркуляции штаммов этого генетического варианта среди более широкого круга источников.

Важно отметить, что разделение штаммов риботипа 27 на различные IS типы позволило выявить генетические варианты, связанные с заболеваниями людей только при эпидемических ситуациях или только при спорадических случаях (см. Таблицу 2.9). При этом для IS-типов, относящихся к штаммам от спорадических больных, характерно большее разнообразие и локальная специфичность. Наряду с этим, основная доля заболеваний связана со штаммами IS1541-типов 62, 66 и 2IS-типов 87, 88.

Российские штаммы риботипа 2 были выделены как от больного во время вспышки, так и в ходе планового мониторинга. Следует заметить, что один штамм риботипа 2 был выделен в Европе и источником также являлся человек.

Эти штаммы имеют сходные IS1541-профили и на IS-RFLP дендрограммах (см.

Рисунок 1.18, профили 63, 1;

Рисунок 1.20, типы 76, 1) характеризуются близостью расположения в кластере D2.

Таким образом, от больных псевдотуберкулезом всегда выделяют штаммы определенных генетических вариантов. Это штаммы всех специфических для России риботипов и IS-типов, входящие в генетическую группу G3 (см. Таблица 2.7), а также редких риботипов 2, 9 и соответствующих им IS-типов, являющиеся представителями всех трех выявленных генетических групп.

Особый интерес представляют штаммы других редких для нашей страны генетических вариантов из кластера R2, для которых не установлено связи с заболеваниями человека. Однако необходимо учесть, что штаммы редких генотипов малочисленны в изучаемой популяции (исследовано 7 штаммов). Так, из трех штаммов риботипа 12 подсеротипа 1а один был изолирован во время вспышки при эпизоотологическом исследовании от крысы, другой – из неизвестного источника при проведении планового мониторинга возбудителя.

Третий, европейский штамм этого риботипа, выделен из почвы, которая, как известно, является фактором сохранения и распространения возбудителя инфекции. Как было упомянуто в обзоре литературы, для перехода из окружающей среды с сапрофитическим способом Y..pseudotuberculosis существования к эпидемическому варианту возбудителя, способного вызывать инфекцию, необходима его реверсия в исходную форму и размножение до инфицирующей дозы. Это происходит при последовательных пассажах через организм неимунных теплокровных животных (чаще молодняк, ослабленные особи), что приводит к становлению штамма, способного вызывать эпизоотии среди животных, и, как следствие, последние становятся источниками возбудителя для человека [74]. Для штаммов Y..pseudotuberculosis риботипа подсеротипа 1а, выделяемых из объектов окружающей среды и от грызунов, также нельзя исключить возможность существования таких адаптационных механизмов. Как показывает дендрограмма риботипов всех исследованных штаммов (см. Рисунок 1.10), штаммы риботипа 12 характеризуются выраженным родством (коэффициент сходства 91 %) со штаммами риботипа 4, среди которых российский штамм был выделен от грызуна при проведении планового мониторинга, источниками выделения трех европейских штаммов явились люди и сельскохозяйственное животное (свинья). При построении IS1541- и 2IS дендрограмм рассматриваемые штаммы риботипов 4 и 12 входят в состав кластера D2 и имеют один IS1541-профиль 4. Результаты молекулярного типирования указанных штаммов согласуются также с данными Н. Fukushima et al. (2001), показавшими, что штаммы подсеротипа 1а, редкого для нашей страны, наряду с представителями других подсеротипов, по наличию факторов патогенности входят в генетическую группу G2 и выделяются как от диких животных, так и от людей [122]. Из исследованных нами штаммов риботипа подсеротипа 1а два штамма (европейский штамм и выделенный в ходе мониторинга на Северо-Западе России) относятся к этой группе, один (изолированный от крысы в ходе вспышки в Сибири) – к группе G1. При этом, штамм, изолированный при плановом мониторинге в Северо-Западном регионе России (IP33122), является единственным из изученных российских штаммов, обладающим генотипической характеристикой, идентичной зарубежным штаммам: риботип 12, 2IS-тип 12.

Российский штамм риботипа 3 выделен при проведении планового мониторинга от грызуна (см. Таблица 2.9). В то же время, в Европе штамм риботипа 3 был изолирован от сельскохозяйственного животного (овцы) (см.

Рисунок 1.10). Эти штаммы характеризуются сходными многофрагментными IS1541-профилями (72, 29, соответственно) и близким расположением в кластере d2 на IS1541-, 2IS-RFLP дендрограммах (2IS-типы 84, 58, соответственно) (см.

Рисунок 1.18, 1.20). Следовательно, несмотря на то, что для России не характерны заболевания псевдотуберкулезом, вызванные употреблением мясопродуктов, на основании полученных данных необходимо рассматривать возможность такого пути передачи возбудителя инфекции, учитывая изоляцию штаммов Y..pseudotuberculosis риботипов 3, 4 от сельскохозяйственных животных за рубежом.

Штаммы риботипов 28, 31 и соответствующих им IS1541- (65, 70) и 2IS профилей (75, 83) также выделенные от грызунов, специфичны для территории России. Дендрограмма риботипов российских штаммов (см. Рисунок 1.10) показывает, что штамму риботипа 28 родственны два штамма риботипа (коэффициент сходства 86 %), один из которых, как уже упоминалось, был изолирован от больного в ходе вспышки. На IS-RFLP дендрограммах российских штаммов они тоже сгруппированы (см. Рисунок 1.17, профили 65, 63;

Рисунок 1.19, типы 75, 76), на IS-RFLP дендрограммах всех изученных штаммов эта группа ветвей включает европейский штамм, также выделенный от человека (см.

Рисунок 1.18, профиль 1;

Рисунок 1.20, тип 1, кластер D2). Для штаммов риботипа 31 на дендрограмме не выявлено четкой взаимосвязи со штаммами, изолированными от людей (см. Рисунок 1.10, кластер D). В то же время, на всех IS-RFLP дендрограммах эти штаммы, выделенные при плановом мониторинге, всегда сгруппированы с российскими штаммами, выделенными от больных при расследовании эпидемической ситуации, и двумя европейскими штаммами от людей (см. Рисунок 1.18, профили 70, 64, 22, 18;

Рисунок 1.20, типы 83, 80, 20, 3, кластер d2).

Определение факторов патогенности показало, что штаммы риботипов 4, (один штамм), 28, 31 имеют генотип YPM-HPI+ и, таким образом, относятся к генетической группе G2 (см. Таблица 2.7). Российский и европейский штаммы риботипа 3 характеризовались генотипом YPM+HPI- и принадлежали к генетической группе G3. Ранее показано также, что от пациентов с хирургической патологией, наряду с превалирующими для России генетическими вариантами YPM+HPI-, выделяют возбудителей псевдотуберкулеза Y..pseudotuberculosis YPM-HPI+, распространенных на европейских территориях. При этом диагноз иерсиниозов не редко остается нераспознанным из-за отсутствия классической симптоматики заболевания [26, 28].

Таким образом, штаммы редких для России генетических вариантов, которые не были изолированы от больных псевдотуберкулезом, но циркулируют среди мелких млекопитающих, могут представлять потенциальную опасность для территории нашей страны.

Проведена также оценка эффективности использованных генетических маркеров при групповых заболеваниях псевдотуберкулезом.

Важно отметить, что при генотипировании штаммов, выделенных во время шести из 20-ти изученных вспышек, одновременно в каждой из них были выделены возбудители разных риботипов, при этом в двух из шести вспышек присутствовали Y. рseudotuberculosis разных подсеротипов О:1а и О:1b (Таблица 2.10). Сопоставление генетических вариантов возбудителя показывает, что в трех вспышках (№№ 1, 14, 15) были выделены штаммы риботипов 27 и 32, специфических для России. Они характеризуются EcoRI-профилем 1 и cходными EcoRV-профилями 17 и 18, соответственно, отличающимися размером одного гибридизационного фрагмента, вероятно, вследствие короткой делеции или инсерции фрагмента ДНК, не содержащего рестрикционный сайт. Подобные Таблица 2.10. Результаты генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных при групповых заболеваниях Характеристика изолированных Источник штамма вспышки штаммов № С/т Рибо- IS1541- 2IS- n тип тип тип человек 1 O:1b 27 66 88 человек O:1b 32 66 88 человек 2 O:1b 2 63 76 смыв с картофеля, человек 3 O:1b 27 66 88 О:1а человек 4 9 64 80 человек O:1b 9 64 80 крыса, человек O:1b 30 62 87 мышь, смыв с капусты, человек O:1b 32 62 87 мышь, человек 5-13 O:1b 27 66 88 человек 14 O:1b 27 66 88 человек O:1b 32 66 88 О:1а крыса 15 12 4 81 крыса, смыв с капусты, человек O:1b 27 66 88 человек O:1b 32 66 88 мышь, смыв с лука, человек 16 O:1b 30 62 87 человек O:1b 32 62 87 человек 17 O:1b 30 62 87 человек O:1b 32 66 88 человек 18, 19 O:1b 30 62 87 человек 20 O:1b 27 71 86 человек O:1b 27 62 87 человек O:1b 27 66 88 изменения могут отражать также различия в геноме штаммов риботипов 30 и 32, изолированных при расследовании трех других вспышек (№№ 4, 16, 17). Данные риботипы имеют близкородственные EcoRI-профили 1 и 19 и EcoRV-профиль 18.


В двух из этих шести вспышек (№№ 4, 15) присутствовали Y. рseudotuberculosis также редких риботипов 9 и 12, отличающихся от специфических более выраженными изменениями рестрикционных профилей: EcoRI-профиль отличается от профилей 1 и 19 размерами двух гибридизационных фрагментов, EcoRV-профили 3 и 7 от профилей 17 и 18 – трех.

В наших исследованиях сравнение результатов риботипирования и IS RFLPs типирования показало, что из шести вспышек, в ходе каждой из которых были изолированы возбудители разных риботипов, три вспышки (№№ 4, 15, 17) также характеризовались одновременным выделением штаммов разных IS-типов, но только в одной (№ 17) количество разных риботипов и соответствующих IS типов было одинаковым.

Во вспышке № 17 выделены Y. pseudotuberculosis, имеющие IS1541 профили 62 и 66, различающиеся двумя рестрикционными фрагментами вследствие транспозиций данного IS элемента. Эти IS-типы, как и риботипы 30, 32 специфичны для российских штаммов. Во время вспышек № 4 и № выявлены также штаммы редких IS-типов, их отличия от специфических более выражены: 64 и 62 характеризуют восемь и четыре IS1541-профили гибридизационных полосы, соответственно, IS1541-профили 4 и 66 – две и шесть.

С редкими IS-типами связаны определенные риботипы. Напротив, выделенные во время вспышек № 4 и № 15 штаммы разных специфических риботипов не различаются IS-типами, что может свидетельствовать о преимуществе метода риботипирования для эпидемиологического обследования очагов. Так, в ходе вспышки № 4 (см. Таблица 2.10) штаммы риботипа 32 изолированы от грызуна (источник инфекции), из смыва с капусты (фактор передачи), используемой для приготовления салата, и больного человека. Штаммы риботипа 30 выделены от крысы и человека, но не установлен фактор передачи, связанный с этим генотипным вариантом. В то же время, штаммы риботипа 30 выделены из пищевых продуктов при микробиологическом исследовании проб во время вспышки № 16 (смыв с лука) и при проведении планового мониторинга (смывы с яблок, моркови). Таким образом, вероятное инфицирование овощей в ходе вспышки № 4 могло произойти как в месте их хранения, так и непосредственно в месте возникновения данного группового заболевания (школа-интернат).

Риботипам 30, встречающемуся только у штаммов в сибирском регионе, и 32, циркулирующему повсеместно, в этих случаях соответствует один IS-тип 62.

Сходная ситуация наблюдается со штаммами, выделенными во время вспышки № 15: эпидемиологические связи установлены для штаммов риботипа 27, проследить их для штаммов риботипов 32 и 12 не удалось, т.к. выделено только по одному штамму каждого. При этом, риботипам 27 и 32 соответствеут IS-тип 66.

Три других вспышки (№№ 1, 14, 16) также были вызваны Y..pseudotuberculosis различных риботипов, но одного генотипного IS-варианта. В то же время, штаммы еще одной вспышки (№ 20), выделенные от людей, имели единый риботип 27, но три разных IS-типа, что, по аналогии со вспышками №№ 4, 15, 16, предполагает наличие источников и факторов передачи инфекции, связанных со штаммами выявленных IS1541-типов. Как было отмечено выше, методом IS1541-RFLP в популяции Y. pseudotuberculosis на территории сибирского региона выявлено две субпопуляции, в одной из которых штаммы риботипов 27, 32 взаимосвязаны с одним IS1541-типом 62, в другой – с IS1541 типом 66. Соответственно, по аналогии со вспышкой 20, существует вероятность выделения также возбудителей одного риботипа 32, но разных IS1541-типов, которые могут циркулировать в очагах среди грызунов и накапливаться на овощах в период длительного хранения. Таким образом, для маркирования штаммов при групповых заболеваниях более информативным является сочетание методов риботипирования и IS1541-RFLP-типирования. В то же время, учитывая высокую эффективность метода PFGE, рассматриваемого в настоящее время в качестве «золотого стандарта» для установления источников и факторов передачи при групповых заболеваниях, но имеющего ряд ограничений в применении, считаем целесообразным провести в дальнейшем изучение имеющихся штаммов также и этим методом для сравнительного анализа с результатами риботипирования и IS1541-RFLP типирования.

Полученные данные свидетельствуют, что во время одной вспышки, характеризующейся одномоментностью возникновения и кратковременностью течения, возможно инфицирование людей различными клонами генетически неоднородной популяции псевдотуберкулезного микроба, циркулирующего среди различных видов мелких млекопитающих. Полученные нами результаты согласуются с данными Н.Ф. Шубина и соавт. (1997), которые установили, что вспышки и спорадические случаи псевдотуберкулеза могут быть вызваны представителями поликлональной популяции Y. pseudotuberculosis [73]. При этом, в одной и той же вспышке среди штаммов, относящихся к разным плазмидным вариантам, преобладающим являлся какой-либо один. Было показано также, что распространение возбудителей различных клонов происходило в процессе транспортировки контаминированных овощей.

На основании проведенного анализа структуры популяции Y..pseudotuberculosis в России с использованием различных генетических маркеров считаем, что метод IS1541-RFLP, в сравнении с методом риботипирования обладающий более высокой дискриминирующей способностью, может быть рекомендован для применения при скрининговых исследований циркулирующих штаммов. Данный метод позволяет оценить региональную распространенность штаммов, выявить среди них специфические российские и редкие для территории нашей страны генетические варианты. В результате проведенных исследований определены как доминирующие IS1541-типы, являющиеся значимыми в распространении инфекции, так и генетические варианты, вызывающие инфицирования людей в случаях эпидемических ситуаций или только при спорадических случаях. Изучение штаммов редких для России генетических вариантов, не связанных с заболеваниями людей, в сопоставлении со штаммами, выделенными от больных псевдотуберкулезом в других странах мира, имеющими такую же молекулярно-генетическую характеристику, показало, что они являются потенциально опасными и для территории нашей страны, Существенно также отметить, что применение метода IS1541-RFLP с использованием одной рестриктазы EcoRV и соответствующего зонда, по сравнению с методами риботипирования и 2IS-RFLP, оправдано также с практической стороны – нет необходимости использования дополнительных рестриктазы и зонда, т.к. каждому IS1541-типу, за исключением одного (IS1541 тип 4, см. Таблица 2.8) соответствует один 2IS-тип. Использование метода риботипирования в сочетании с IS1541-RFLP-типированием целесообразно для установления источников и факторов передачи псевдотуберкулеза при групповых заболеваниях.

Учитывая циркуляцию на территории России штаммов Y. pseudotuberculosis различных серотиповрекомендуется применение метода О гено(серо)типирования, позволяющего выявлять эпидемиологически значимые штаммы определенных серотипов, характерные для конкретных регионов.

Данный метод является более специфичным, в сравнении с традиционным определением серотипа в реакции агглютинации с использованием типовых специфических сывороток. Также его применение дает возможность определить серотип у штаммов, находящихся в R-форме и нетипируемых классическим методом. Среди исследованных нами 273 штаммов у 22 (8,1 %) при постановке РА не удалось определить серотип, т.к. в настоящее время перечень диагностических сывороток, выпускаемых в нашей стране ограничен и позволяет идентифицировать штаммы только двух классических серотипов - О:1 и О:3.

Ранее показано, что большинство российских изолятов Y. pseudotuberculosis относится к повсеместно распространенному серотипу О:1b. Вместе с тем, в сибирском регионе циркулируют также штаммы серотипа О:3. На Дальнем Востоке выявлены представители пяти серотипов О:1а, О:1b, О:3, О:4а, О:4b, при этом штаммы серотипов О:1b О:3, О:4b являлись причиной групповых заболеваний [74, 78]. Важно подчеркнуть, что в ходе нашего исследования у семи из 193 российских штаммов методом О-гено(серо)типирования определен серотип О:1а. В северо-западном и дальневосточном регионах такие штаммы были выделены при плановом мониторинге Y. pseudotuberculosis от грызунов, в сибирском – от грызуна и больного человека во время двух вспышек.

Следует отметить также что, в зависимости от комбинации генов суперантигенного токсина YPM и острова высокой патогенности HPI, штаммы Y..pseudotuberculosis пяти серотипов, встречающихся на территории России, могут быть отнесены к нескольким генетическим группам и спрособны вызывать заболевания, характеризующиеся различными клиническими проявлениями, что серьезно осложняет дифференциальную диагностику инфекции [26, 28, 69, 122].

С другой стороны, существует вероятность завозных случаев из других стран, где циркулируют штаммы, относящиеся к серотипам, имеющим значение в патологии человека, но нехарактерным для территории нашей страны. Например, в Западной Европе, Китае, Японии изолируют Y. pseudotuberculosis серотипов О:1-О:5 [122]. В ходе нашего исследования также изучены европейские штаммы данных серотипов, выделенные как от людей, так и от сельскохозяйственных животных. Таким образом, нельзя исключить возможность проникновения таких возбудителей при импорте мясных продуктов в Россию. Случай обнаружения Y..pseudotuberculosis в смывах со свиных языков, доставленных из США, описан в Республике Саха (Якутия) [74]. По данным официальной статистики самыми высокими показателями заболеваемости иерсиниозам (псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз) среди европейских стран характеризуются соседняя с территорией СЗФО России Финляндия, где известны случаи выделения Y..pseudotuberculosis от свиней, а в последние годы, и Литва [84, 179, 182].

Таким образом, необходим микробиологический мониторинг с использованием молекулярно-генетических методов не только по эпидемическим показаниям для определения родства штаммов и установления взаимосвязи между источником инфекции, фактором передачи и заболеваниями людей, но и для проведения плановых диагностических исследований для выявления характерных и новых для территории наблюдения генотипов возбудителя. Эти данные могут быть важны при установлении диагноза псевдотуберкулеза при отсутствии типичных клинических симптомов.

Глава 3. Совершенствование серологической диагностики иерсиниозов 3.1. Разработка и лабораторные испытания тест-системы на основе рекомбинантных аналогов белков наружной мембраны патогенных иерсиний для выявления иммуноглобулинов М, А и G методом ИФА К началу наших исследований отечественные иммунологические тест системы для серологической диагностики иерсиниозов не были разработаны.

Известно, что методом РНГА выявляют антитела к ЛПС-комплексу Y..pseudotuberculosis серотипа О:1 и Y. enterocolitica серотипов О:3 и О:9. Однако в отдельных регионах страны заболевание вызывают также возбудители других серотипов. Существует также вероятность инфицирования продуктов питания, импортируемых из стран, где циркулируют патогенные иерсинии, относящиеся к серотипам, имеющим этиологическое значение в патологии человека, но нехарактерным для территории нашей страны.

В то же время, при развитии патологического процесса важное значение в нейтрализации иммунного ответа макроорганизма принадлежит белкам наружной мембраны (БНМ) патогенных иерсиний независимо от серологической принадлежности возбудителей. В этой связи, в качестве универсального препарата для этиологической диагностики при различных формах и стадиях иерсиниозов, равно как для ретроспективных исследований или серологического мониторинга групп профессионального «риска», может служить тест-система для ИФА на основе БНМ патогенных иерсиний. До начала настоящих исследований такой отечественный препарат отсутствовал.

Таким образом, разработка препарата для определения антител к патогенным иерсиниям, включающим возбудителей различных серотипов, циркулирующих на территории России, являлась важной задачей как для повышения эффективности серологической диагностики, так и мониторинга иерсиниозов.

В этой связи следующий этап исследования включал создание на основе рекомбинантных аналогов БНМ патогенных иерсиний отечественной тест системы для ИФА, предназначенной для выявления иммуноглобулинов А, М, G, и оценку ее диагностической эффективности.

Выполнение работы включало следующие основные этапы:

- выбор производственного штамма - получение рекомбинантных аналогов БНМ иерсиний - получение экспериментальных образцов тест-систем - изучение их диагностической эффективности в модельных и клинических исследованипях.

Для выбора производственного штамма из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера предварительно отобраны штаммы иерсиний, содержащие плазмиду вирулентности pYV. Для этого определяли фенотипические признаки, связанные с плазмидным детерминированием свойства аутоагглютинации, кальций-зависимости роста при 37 0С (8 штаммов).

Также методом ПЦР определяли наличие специфического участка гена yadA, локализованного на плазмиде, кодирующего ведущий адгезин иерсиний ( штаммов). В результате отобрано 6 рYV+ штаммов иерсиниий – кандидатов в производственные. В дальнейшем проведена оценка их вирулентных свойств при инфицировании монослоя клеток HEp-2 (Таблица 3.1).

В качестве производственного штамма из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера отобран штамм Y. enterocolitica № 670 серотипа O:3, выделенный от больного человека. При определении фенотипических признаков, связанных с плазмидным детерминированием, установлено, что штамм обладает свойствами аутоагглютинации, кальций-зависимости роста при 37 0С. В ПЦР у штамма № 670 выявлен специфический участок гена yadA. При проверке антигенной активности штамма № 670 в объемной РА с гипериммунной диагностической сывороткой к вирулентным иерсиниям (СВИ), позволяющей дифференцировать pYV+ и pYV- штаммы, регистрировали специфическую агглютинацию в разведении сыворотки 1/5120 – 1/10240.

При инфицировании штаммом монослоя клеток HEp-2 наблюдали Таблица 3.1. Оценка вирулентности штаммов иерсиний в культуре клеток НЕр- № Кол-во бактерий на одну клетку Цитопатические Степень иерсиний % «пораженных» клеток изменения вирулент штамма Вид (в баллах), ности через 2 ч через 5 ч (серотип) инкубации 5 ч/24 ч инкубации 1128 31,3±2,4 58,2±2, Y. pseudotuberculosis высокая 1,0/1, (1) 71,0±1,7 91,0±1, 22,2±1, 336 31,2±2, умеренная 1,0/1, 82,0±2,2 90,0±1, (1) 28,4±2, 636 20,1±2, умеренная 1,0/1, 79,0±1,7 87,0±1, (1) 37,7±2, 670 50,9±2, высокая 1,5/2, (О:3) 98,0±1,3 100±1, Y. enterocolitica 915 11,7±0,3 15,9±1, слабая -/0, (О:9) 44,0±2,9 56,0±2, 33,2±2, 25,3±2, 1401 (О:3) умеренная 1,0/1, 84,0±2,1 96,0±1, выраженную адгезию и инвазию во все сроки исследования, в т. ч. через 24 часа (среднее количество иерсиний на одну клетку через 2 часа – 37,7±2,9, через часов – с увеличением до 50,9±2,9, p0,01), и цитопатические изменения в клетках (Рисунок 3.1). Известно, что именно плазмидные белки-эффекторы Yops обладают цитотоксическим действием и вызывают морфологические изменения инфицированных клеток-мишеней [123, 145, 204, 205]. Ранее исследованиями Г.Я.

Ценевой (1987) по сравнительному изучению действия изогенных pYV+ и pYV вариантов иерсиний на эпителиальные клетки показано, что утрата плазмиды ведет к снижению вирулентности возбудителей [62]. На основании проведенных исследований в соответствии с разработанными Г.Я. Ценевой дифференциальными критериями оценки степени вирулентности штаммов иерсиний при изучении взаимодействия Y. pseudotuberculosis и а б Рисунок 3.1. Размножение клеток штамма № 670 в клетках культур НЕр-2.

Окраска по Романовскому-Гимза. а – внутриклеточное размножение иерсиний и их цитопатическое действие, 5 ч (ув. 1200);

б – выраженные цитопатические изменения оставшихся на стекле клеток монослоя, заполненных микробами, 24 ч (ув. 600).

с эпителиальными клетками, штамм № 670 является Y.enterocolitica высоковирулентным.

Таким образом, установлено, что штамм № 670 обладает комплексом факторов вирулентности, детерминируемых генами плазмиды pYV. Штамм является охраноспособным. В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов) он зарегистрирован под номером Y..enterocolitica O:3 КМ 174 в качестве тест-штамма с высокой вирулентностью.

Указанные характеристики штамма № 670 позволили использовать его для клонирования генов yops в технологии получения рекомбинантных аналогов белковых антигенов наружной мембраны патогенных иерсиний. Рекомбинантные белки получены на базе ООО «Омникс» (Санкт-Петербург). На основании имеющихся данных о применении Yops с диагностическими целями, нами при разработке тест-систем в качестве сенситина использовано четыре рекомбинантных белка, соответствующих природным факторам вирулентности иерсиний: аналоги белков-эффекторов, оказывающих повреждающее действие на клетки иммунной системы макроорганизма, YopE 23 кДa, YopM 44 кДa, YopН кДa, и аналог белка YopD 35 кДa, участвующего в формировании пор в мембране для проникновения эффекторов в эукариотические клетки.

На этапе совместного с ООО «Омникс» получения экспериментальных образцов тест-систем подобраны стандартные реагенты и условия проведения анализа. В ходе исследования для каждой стадии анализа учтены основные принципы, способствующие достижению необходимой чувствительности метода [19, 58]. Для тестирования использованы две панели ОСК. Опытная панель – ОСК от больных псевдотуберкулезом и кишечным иерсиниозом (К+, n=24) с диагнозом, подтвержденным выделением культур иерсиний и/или, содержанием специфических антител к патогенным иерсиниям по данным ИФА с применением коммерческих наборов «recomWell Yersinia IgА/IgM/IgG» (MIKROGEN, Германия). Контрольная панель включала ОСК от клинически здоровых людей, отрицательные по данным ИФА с использованием указанных коммерческих тест систем (К-, n=48). Для оценки результатов проведения ИФА рассчитывали критическую величину оптической плотности (ОПкрит.). Она представляет собой пограничное значение оптической плотности (cut-off), позволяющее разграничить положительные и отрицательные образцы, взятые в одном разведении.

ОПкрит = ОП К- ср. + 3, где ОП К- ср. – среднее арифметическое значение ОП для ОСК здоровых доноров, – величина стандартного отклонения. Таким образом, образец считался положительным, если его оптическая плотность превышала ОПкрит. Коэффициент серопозитивности (КС) подсчитывали как отношение значения ОП исследуемого ОСК к значению ОПкрит. Положительному результату соответствовал КС не менее 1,1.

Известно, что чувствительность анализа зависит от ряда факторов, включающих сорбционную емкость носителя, его способность к неспецифическому связыванию компонентов, концентрацию сорбента, рН, ионную силу, время и температуру инкубации, определящих скорость достижения равновесия в специфических реакциях на каждой стадии, и др. Указанные условия были подобраны опытным путем.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.