авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» ...»

-- [ Страница 4 ] --

При получении иммуносорбента в качестве твердой фазы применяли 96-ти луночные полистироловые или полихлорвиниловые разборные планшеты для иммунологических реакций производства ОАО «Медполимер» (Санкт Петербург) или «ГосНИИмедполимер» (Москва), характеризующиеся хорошей сорбционной емкостью, используемые отечественными производителями тест систем. В качестве специфических антигенов на твердой фазе методом физической сорбции иммобилизовали четыре рекомбинантных белка. Важным моментом на стадии получения иммуносорбента являлось время достижения равновесия: специфический реагент – твердая фаза. Оно зависит от концентрации специфического реагента. При взаимодействии белка с полимером образуется мономолекулярный слой. Повышенная концентрация приводит к многослойной сорбции, при этом на следующем этапе слабосвязанные белки реагируют со специфическими антителами в тестируемых сыворотках и образующийся комплекс может удаляться после каждого этапа промывки, что снижает чувствительность анализа. Для достижения высокого уровня чувствительности метода нами в предварительных опытах при подборе концентрации индивидуального белка установлено его оптимальное содержание при значении отношения величины ОП положительного образца к величине ОПкрит. не менее 2,5-3. В соответствии с этим, концентрация каждого белка в смеси при внесении в лунки планшета составила для Yop D - 0,05мкг/мл, Yop E - 0,08 мкг/мл, Yop M 0,25мкг/мл, Yop H - 0,48 мкг/мл. Для разведения антигенов применяли буферные растворы с различным рН: фосфатно-солевой буфер (ФСБ, рН 7,2), натрия карбонатный буфер (рН 9,6), глициновый буфер (рН 8,2). Инкубацию антигенов проводили в течение 18 ч при 4 оС. Достоверной разницы в результатах при выборе того или иного буферного раствора не отмечено. Поэтому для сорбции и последующих промывок использовали один буфер ФСБ.

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой проводили этап промывки. Этот этап необходим для устранения многослойной сорбции первого специфического реагента и удаления неспецифически связавшихся компонентов при формировании многослойного комплекса на твердой фазе за счет проведения специфических реакций. Использовали распространенный промывочный буфер ФСБ, содержащий 0,05 % неионного детергента твин-20 (ФСБ-Т).

После иммобилизации антигенов проводили однократную промывку ФСБ- Т. На следующих этапах проведения анализа при последовательном добавлении реагентов необходимо было максимально снизить их неспецифическое связывание с твердой фазой, т.к. этот параметр в значительной степени определяет чувствительность метода. Твин в составе промывочного буфера, как поверхностно-активный реагент, препятствует неспецифической сорбции. Для предупреждения неспецифических взаимодействий образовавшихся после промывки иммуносорбента свободных активных центров сорбции носителя проводили также этап их блокирования иммунологически инертным белком.

Блокирование проводили 1 % раствором БСА в ФСБ в течение 2 ч при 20±2 оС. С этой же целью БСА в концентрации 0,05 % был включен в состав буфера для разведения и инкубации сывороток (стандартный состав). После блокирования БСА проводили однократную промывку ФСБ-Т.

ОСК исследовали в рабочем разведении 1:100. Инкубацию проводили в течение 60 мин при температуре (37 1) С, использование шейкера (скорость встряхивания платформы 500 об/мин) позволяло сократить время до 30 мин. При сравнительной оценке влияния количества промывок на результат ИФА после этапа инкубации исследуемых сывороток установлена необходимость пятикратного промывания планшета для удаления неспецифически связавшихся компонентов. После внесения промывочного буфера в планшет содержимое лунок перемешивали на шейкере 10 сек при скорости встряхивания платформы 500 об/мин.

В качестве конъюгатов использовали моноклональные мышиные антитела к IgG/IgM/IgА человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США).

Инкубация - 30 мин при (37 1) С. Встряхивание на шейкере не оказывало влияния на результаты реакции. После этапа инкубации конъюгатов также проводили промывку ФСБ-Т пять раз.

Для проведения ферментативной реакции готовили субстратный раствор, состоящий из хромогена ТМБ - 3, 3, 5, 5 - тетраметилбензидин (Fluka, США) и цитрат-фосфатного буфера, рН 5,0, с 0,03 % перекиси водорода. После внесения раствора планшет помещали на 10 мин в защищенное от света место при температуре (22 2) С. Реакцию останавливали 2 н соляной кислотой. Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм не позднее, чем через 10 мин после внесения стоп-реагента. Нулевой уровень (бланк) устанавливали по воздуху.

Таким образом, в ходе выполнения указанных исследований подобраны условия проведения ИФА с использованием в качестве сенситина рекомбинантных аналогов белковых антигенов наружной мембраны патогенных иерсиний с использованием стандартных реагентов получены экспериментальные серии тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз ИФА-IgG».

Дальнейшие лабораторные испытания были направлены на оценку специфичности, чувствительности, воспроизводимости, срока годности препаратов. Использовано по три экспериментальных серии тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgG».

Чувствительность и специфичность препаратов оценивали в сравнении с аналогичными коммерческими тест-системами «recomWell Yersinia IgA/IgG/IgM»

(MIKROGEN, Германия). Исследованы три группы ОСК: от больных с различной инфекционной патологией иерсиниозной и неиерсинозной этиологии, а также клинически здоровых людей.

1. ОСК больных псевдотуберкулезом (n=111) и кишечным иерсиниозом на разных сроках заболеваний с подтверждением диагноза (n=83) серологическими методами РНГА и ИФА с применением коммерческих тест систем. В 24,2 % случаев (n=47) диагноз был подтвержден также методом ПЦР.

Важно отметить, что из 111 изученных ОСК от больных псевдотуберкулезом были получены от заболевших при эпидемической ситуации в ЯНАО, псевдотуберкулезная этиология которой была подтверждена выделением культур (глава. 2.1).

2. ОСК больных нозологическими формами, с которыми наиболее часто дифференцируют иерсиниозы: дизентерия, сальмонеллез, эшерихиоз, гепатиты, клещевой боррелиоз, ОРВИ, инфекционный мононуклеоз (n=279). Диагноз у больных этой группы подтвержден сертифицированными специфическими диагностическими методами.

3. ОСК клинически здоровых людей (n=98).

Полученные данные показали, что при исследовании всех трех групп сывороток в ИФА с использованием коммерческих и экспериментальных тест систем, разработанных по отечественной технологии, получены сопоставимые результаты. Так, при тестировании ОСК из первой группы, по данным коммерческих тест-систем содержащих специфические антитела разных классов к патогенным иерсиниям, положительные результаты в ИФА с экспериментальными сериями тест-систем получены в 92-100 % случаев, что свидетельствовало об их высокой чувствительности (Таблица 3.2).

Сравнительные результаты исследования ОСК из второй и третьей групп коммерческими и экспериментальными тест-системами показали, что экспериментальные образцы характеризовались достаточно высокой специфичностью: у больных с различной инфекционной патологией неиерсинозной этиологии и клинически здоровых людей не выявлено Таблица 3.2. Результаты контроля чувствительности экспериментальных тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG»

Кол-во исследованных ОСК Из них с положительным результатом при использовании Нозологическая Всего экспериментальной тест-системы форма IgA IgM IgG абс. абс. абс.

% % % (М+m) (М+m) (М+m) Псевдотуберкулез 92,8±2,5 94,6±2,1 93,7±2, 111 103 105 Кишечный иерсиниоз 92,7±2,9 95,2±2, 83 77 83 100 иммуноглобулинов М к патогенным иерсиниям, что свидетельствует о специфичности препаратов и об отсутствии возможного острого процесса, обусловленного Y..pseudotuberculosis или Y. enterocolitica (Таблица 3.3).

Выявление иммуноглобулинов G у единичных больных и иммуноглобулинов А(при использовании коммерческого набора) и G у здоровых доноров может свидетельствовать о ранее перенесенном иерсиниозе, недиагностированном по причине нетипичного проявления болезни. Полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей, отмечавших персистенцию антител к БНМ иерсиний в здоровой популяции [199, 200, 224].

Комплектацию наборов реагентами, необходимыми для проведения ИФА, проводили в соответствии с ТУ 9398-002-71391004-2009 («Иерсиниоз-ИФА IgM/IgG»), ТУ 9398-003-71391004-2009 («Иерсиниоз-ИФА-IgA»).

Таблица 3.3. Результаты контроля специфичности экспериментальных тест систем «Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG» в сравнении с коммерческими аналогами Нозологическая Кол-во исследованных ОСК форма Всего Из них с положительных результатом,* абс. / % (M±m) IgA IgM IgG Дизентерия 1 / 3,1±3,1 К 32 - 2 / 6,3±4,3 Э Сальмонеллез 38 - Эшерихиоз 37 - - Инфекционный 2 / 4,7±3,1 К 43 - мононуклеоз 3 / 6,9±3,6 Э Гепатиты А 1 / 2,7±2,7 К 37 - 1 / 2,7±2,7 Э Гепатит В 28 - - Клещевой 1 / 4,5±4,4 К 22 - боррелиоз 2 / 9,1±6,1 Э ОРВИ 42 - - Здоровые 3 / 3,1±1,7 К 7 / 7,1±2,6 К 98 доноры 8 / 8,2±2,8 Э *К, Э – результаты получены при использовании коммерческого (К) и экспериментального (Э) наборов. Различия между ними недостоверны (р0,05).

Воспроизводимость теста контролировали внутри серии наборов, определяя коэффициент вариации CV результатов анализа трех сывороток с высоким, средним и низким содержанием антител. Величины CV внутри одного опыта определяли из 20 параллельных измерений каждой сыворотки для оценки внутри и межпланшетной воспроизводимости (по 4 разных лунки на пяти планшетах).

Величины CV в разных опытах получали, проводя по 4 параллельных измерения каждой сыворотки в течение пяти различных дней. Для каждой сыворотки расчет производили по формуле:

n (ОП(К+)i ОП(К )) СV, i ОП(К ) n где n - количество измерений, ОП(К ) - среднее арифметическое ОП (К+) по результатам n измерений, ОП(К+)i - результат i-го из n выполненных измерений.

Коэффициент вариации не превышал 5 % по результатам одного анализа и 8 % по результатам разных анализов.

Для определения срока годности наборов их хранили при температуре 5+ С. Активность компонентов тест-систем на разных сроках хранения контролировали в ИФА по величине ОП (К+). Показано, что компоненты тест системы полностью сохраняют свою активность при условии хранения в защищенном от света месте при температуре 5+2 о С в течение года.

3.2. Оценка дагностической эффективности тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG»

Полученные тест-системы использованы при исследовании клинического материала. Обследовано 127 спорадических больных с острым течением заболеваний с предварительными диагнозами псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, находившихся в стационаре или получавших амбулаторное лечение, у которых получены отрицательные результаты при обследовании на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии. Среди заболевших большинство составляли дети в возрасте от трех до 16 лет. Важно отметить, что заболевания характеризовались полиорганной смптоматикой, что существенно затрудняло правильную и своевременную постановку диагноза. Чаще всего отмечались такие клинические признаки, как острое начало заболевания, лихорадка, интоксикация, катаральные явления, боли в животе, расстройство стула, высыпания на коже, боли в суставах и мышцах, увеличение периферических лимфатических узлов, гепатомегалия, спленомегалия. Для подтверждения диагноза методом ИФА исследование ОСК больных проводили в динамике заболевания, начиная со второй недели от момента появления клинических симптомов, на 7-14 и 21-25 дни. Часть больных, у которых были обнаружены специфические антитела, обследовали в период реконвалесценции через два (n=31) и три (n=28) месяца.

На второй неделе болезни отмечено появление специфических антител всех трех классов у 42 обследованных (33,1 % случаев) при суммарном учете положительных реакций (таблица 3.4). Значения коэффициента серопозитивности (КС) были невысокими, незначительно превышая минимальный диагностический показатель 1,1 (таблица 3.5). На 21-25 день заболевания положительные результаты зарегистрированы у 68 больных (53,5 % случаев). На этом сроке происходило достоверное увеличение содержания антител всех классов в два раза и более (р0,05), что согласуется с данными о максимальном уровне образования антител к третьей неделе течения инфекционного процесса при иерсиниозах (см. таблицу 3.4). Сравнительное исследование сывороток в РНГА показало меньшую ее эффективность на этих сроках исследования (р0,05) (рисунок 3.2). Через два месяца наблюдали значительное снижение количества IgM, значения КС для IgG и IgА существенно не изменялись. Через три месяца IgM практически не выявляли, снижалась концентрация IgА, значения КС для IgG оставались высокими (см. таблицу 3.5).

Таким образом, в ходе проведенных исследований разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз- ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител различных классов к белкам наружной мембраны патогенных иерсиний.

Тест-системы представляют собой многокомпонентные наборы стандартных реагентов для постановки непрямого ИФА на твердофазном носителе. Их использование позволяет полуколичественно определить содержание антител определенного класса в сыворотке крови больных и реконвалесцентов. Данные Таблица 3.4. Результаты обследования больных с (n=127) предварительными диагнозами иерсиниозов в динамике заболевания серологическими методами День Кол-во положительных результатов, абс. /% (M±m) болезни РНГА ИФА Всего IgА IgМ IgG 42/ 31/ 41/ 43/ 27/ 7- 33,1±4,2 24,4±3,8 32,3±4,1 34,0±4,2 21,3±3, 68/ 60/ 68/ 66/ 48/ 21- 53,5±4,4 47,2±4,4 53,5±4,4 51,9±4,4 37,8±4, Таблица 3.5. Результаты определения содержания антител в динамике заболевания с применением тест-систем «Иерсиниоз-ИФА-IgА/IgM/IgG»

Период Кол-во Коэффициент серопозитивности (М+m) болезни больных IgА IgМ IgG 1,5±0,05 2,5±0,1 1,8±0, 7-14дн. 21-25 дн. 4,8±0,3 5,7±0,2 5,3±0, 2 мес. 3,9±0,2 2,8±0,1 4,9±0, 3 мес. 2,3±0,2 3,1±0, 53,5 53, 51, 50 47, 40 37, ИФА Ig cум.

34, 33,1 32, ИФА IgМ ИФА IgА 24, 21, ИФА IgG РНГА 7-14 день 21-25 день Рисунок 3.2. Частота лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозов серологическими методами.

препараты обладают высокой чувствительностью и специфичностью, не уступающей коммерческим аналогам. Разработанные тест-системы отвечают требованиям практики, так как их применение позволяет определить динамику антителообразования при остром и хроническом (Глава 4.3) течении заболеваний.

Их использование перспективно также для серологического мониторинга групп профессионального риска.

.

Глава 4. Применение методов этиологической диагностики для выявления различных форм иерсиниозов Псевдотуберкулез и иерсиниоз характеризуются вовлечением в патологический процесс многих органов и систем. С учетом полиморфной клинической картины их необходимо дифференцировать с рядом инфекционных и соматических заболеваний. Это обуславливает как гипо-, так и гипердиагностику инфекции и приводит к развитию рецидивов, хронизации заболевания [5, 6, 13, 45, 60, 71, 74, 78]. В этих случаях одним из условий достоверной постановки диагноза является подтверждение иерсиниозной этиологии заболевания диагностическими методами. Так как наиболее сложна дифференциальная диагностика псевдотуберкулезной и иерсиниозной этиологии патологии желудочно-кишечного тракта (длительные боли различной локализации, симптомы острого аппендицита, острого панкреатита, хронического панкреатита с обострением), нами проведено специальное лабораторное обследование этой категории больных.

4.1. Лабораторное обследование больных с абдоминальной патологией Обследованы больные, находившиеся на лечении в СПб ГПМА и ДДЦ № Кировского района Санкт-Петербурга в 2007–2010 г.г. Ведущим симптомом при обращении пациентов были боли в животе, продолжающиеся от нескольких дней до нескольких месяцев и даже от года до трех лет, а также запоры, субфебрилитет. Всего обследовано 225 больных. Из них 165 пациентов составили больные гастроэнтерологического профиля с рецидивирующими болями в животе. Также для выявления иерсиниозной этиологии острого аппендицита у детей обследовано 60 пациентов, находящихся в хирургическом стационаре.

Анализ историй болезни указанных пациентов показал, что при установлении диагноза учитывали анамнез болезни, эпидемиологические данные для установления возможного источника инфекции, данные физикального обследования пациентов. Всем больным выполняли общеклинические исследования (клинический анализ крови, общий анализ мочи, копрограмму, включая анализ на яйца глистов и лямблии), биохимическое исследование крови, УЗИ. С целью дифференциальной диагностики и по показаниям отдельным больным проводили обследования инструментальными методами: ФГДС с биопсией и гистологическим изучением биоптата, в ряде случаев лапароскопию, рентгенологическое исследование органов грудной полости и пазух, компьютерную томографию, а также иммунологическое исследование, исследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии.

Лабораторные исследования больным выполняли в первые дни нахождения в стационаре или после обращения к врачу в амбулаторных условиях. Применяли комплекс методов: методом ПЦР исследовали испражнения и ткани аппендикса, для выявления возбудителя в ткани аппендикса использовали также бактериологический метод;

определяли специфические антитела в крови методами РНГА, ИФА-Ig. Больные включены в изучаемую группу на основании лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозной инфекции при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии (за исключением сопутствующих инвазий), а также при отсутствии соматической патологии.

Результаты проведенных исследований представлены в Таблице 4.1. Видно, что подтверждение диагноза серологическим методом у больных гастроэнтерологического профиля получено в 17,0 % случаев. У 12,7 % больных выявлен псевдотуберкулез, у 4,2 % – кишечный иерсиниоз. Методом ПЦР иерсиниозы диагностированы у 9,1 % больных: специфические фрагменты ДНК и обнаружены при исследовании Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica испражнений у 5,5 и 3,6 % больных, соответственно. Одновременно полдожитель ные результаты в серологических реакциях и ПЦР получены у двух больных псевдотуберкулезом. Таким образом, абдоминальная форма иерсиниозной Таблица 4.1. Частота лабораторного подтверждения абдоминальной формы иерсиниозов Кол-во положительных результатов, абс. /% больные хирургические больные Всего гастроэнтерологического (исслед. ткани больных Диагноз профиля аппендикулярных иерсиниозами отростков) n= n= Серологич. ПЦР (исслед. ПЦР Бак.

метод испражнений) посев** Псевдо- 21/12,7 9*/5,5 11/18,3 1/1,7 39=28+11/ туберкулез 17,3±2, Кишечный 7/4,2 6/3,6 1/1,7 0 14=13+1/ иерсиниоз 6,2±1, Всего 28/17,0 15*/9,1 12/20,0 1/1,7 53=41+12/ случаев 23,6±2, *у двух больных выявлены также специфические антитела **при положительном результате ПЦР инфекции выявлена у 41 из 165 обследованных больных гастроэнтерологического профиля, что составило 24,8 % случаев.

Заболевания, обусловленные иерсиниями, не редко характеризуются затяжным (3-6 мес.) и/или хроническим (более 6 мес.) течением. В значительной степени это связано с поздним обследованием на эти инфекции. В нашей работе установлено, что использование ПЦР для подтверждения иерсиниозной этиологии заболевания эффективно не только на ранних стадиях патологического процесса, но и при обострении хронического течения болезни (р0,05, Таблица 4.2) Специфические антитела определяли не ранее 10 дня от начала заболевания.

Таким образом, с использованием специфических методов у 12 больных диагностировано острое течение иерсиниозов, у 29 – хроническое течение заболевания.

Частота встречаемости острого аппендицита при абдоминальной форме Таблица 4.2. Частота подтверждения абдоминальной формы иерсиниозов у гастроэнтерологических больных в зависимости от длительности течения заболевания Длительность заболевания 1 месяц более 6-ти месяцев Диагноз n=48 n= Количество положительных результатов, абс./% (M±m) Серологич. Серологич.

ПЦР ПЦР реакции реакции Псевдо- 3/ 7/ 6*/ 14/ туберкулез 6,3±3,5 14,6±5,1 5,1±2,0 12,0±3, Кишечный 1/ 1/ 5/ 6/ иерсиниоз 2,1±2,0 2,1±2,0 4,3±1,9 5,1±2, Всего 4/ 8/ 11*/ 20/ случаев 8,3±4,0 16,7±5,4 9,4±2,7 17,1±3, *у двух больных выявлены также специфические антитела иерсиниозов у детей в наших исследованиях составила 20 % (12 больных из обследованных) (см. Таблица 4.1). При этом подтверждение этиологической роли иерсиний в развитии острого аппендицита установлено при использовании только метода ПЦР у 11 из этих 12 больных. У 11 больных обнаружена ДНК Y..pseudotuberculosis, из них у одного пациента также выделена культура.

Впервые установлено, что острый аппендицит у детей может быть обусловлен также Y..enterocolitica — у одного пациента выявлена ДНК возбудителя.

Таким образом, комплексное применение молекулярно-генетического и серологических методов исследования позволило получить подтверждение диагноза иерсиниозов в целом у 53 из 225 обследованных пациентов с абдоминальной патологией, что составило 23,6 % случаев: 41-го из гастроэнтерологических больных и 12-ти - из 60 хирургических (см. Таблица 4.1).

При этом, иерсиниозная инфекция, вызванная Y. pseudotuberculosis, выявлена у 39 (17,3 %) пациентов, в то время как Y. enterocolitica – у 14 (6,2 %). Полученные результаты аргументируют показания к обследованию на иерсиниозы больных с диагнозом «острая кишечная инфекция неустановленной этиологии».

Учитывая, что при абдоминальной форме иерсиниозов специфическое подтверждение болезни в практическом здравоохранении имеет место в редких случаях, считаем важным привести частоту установленного нами вовлечения в патологический процесс различных органов. Острое течение иерсиниозов диагностировано у 24 детей (12 больных гастроэнтерологического профиля, 12 хирургических) (Таблица 4.3). Чаще поражался тонкий кишечник (энтерит) — у девяти пациентов;

колит, панкреатит выявлены по одному случаю.

Представляется важным отметить, что при абдоминальной форме иерсиниозной инфекции возможно развитие острого аппендицита с ярко выраженными клиническими симптомами: повышением температуры до 37,3 – 39,5 С, тошнотой, рвотой, болями в животе, чаще приступообразными. У 11 человек определен флегмонозный аппендицит, у одного — катаральный аппендицит и мезаденит.

У пациентов с хроническим течением иерсиниозов анамнез заболевания был длительным — от восьми месяцев до трех лет. При этом у пациентов в анамнезе отмечены: обращение ранее по поводу острого аппендицита;

энтероколиты с госпитализацией в инфекционные отделения, где диагностировали острую кишечную инфекцию неустановленной этиологии;

ранее диагностированный псевдотуберкулез. В отличие от острого процесса, при хроническом течении иерсиниозной инфекции, помимо проявлений энтерита или колита, или панкреатита, у 10 из 29 пациентов имело место сочетанное поражение органов брюшной полости (см. Таблица 4.3): энтерита и мезаденита, панкреатита и энтерита, панкреатита и колита. Боли в животе сопровождались у всех пациентов более выраженными симптомами интоксикации — головной болью, тошнотой, повышенной утомляемостью, а также снижением аппетита. У 65 % пациентов к тому же отмечалась сыпь на кожных покровах и шелушение кожи Таблица 4.3. Варианты течения абдоминальной формы у больных иерсиниозами (n=53) Поражения различных органов брюшной полости при Заболевание остром течении хроническом течении n=24 n= панкреатит панкреатит поражение поражение мезаденит мезаденит сочетан.

сочетан.

энтерит энтерит аппенд.

колит колит остр.

Псевдо- 8 0 1 1 11 0 8 1 1 0 туберкулез Иерсиниоз 1 1 0 0 1 0 6 3 0 0 Всего 9 1 1 1 12 0 14 4 1 0 стоп и кистей в анамнезе, субфебрильная температура — у 41 % больных.

Важным моментом в дифференциальной диагностике, особенно у детей, являются параллельные обследования на распространенные глистно-протозойные инвазии (лямблиоз, аскаридоз, трихинеллез). Установлено, что при абдоминальной форме иерсиниозов инвазии отмечались у больных в 22 % случаев. Представлялось необходимым сопоставить частоту встречаемости инвазий в зависимости от нозологической формы иерсиниозов. Чаще и в более широком спектре паразитарные инфекции выявляли при псевдотуберкулезе кроме лямблиоза, выявлены также аскаридоз и трихинеллез. При этом, у семи из восьми больных с инвазиями отмечено хроническое течение псевдотуберкулеза, у одного – острое (Таблица 4.4).

Можно полагать, что, сопутствующие инвазии, вызывая иммуносупрессию и создавая неблагоприятный преморбидный фон, способствовали развитию хронической псевдотуберкулезной инфекции. Ранее было отмечено также значение инвазий в развитии тяжелого септического варианта псевдотуберкулезной инфекции и рецидивов болезни [8, 9 74]. При кишечном иерсиниозе инвазии редко сопровождали заболевание. Таким образом, обнаружение возбудителей глистно-протозойных заболеваний не исключает Таблица 4.4. Результаты определения сопутствующих инвазий при иерсиниозах* Течение Выявление сопутствующих инвазий при заболевания псевдотуберкулезе кишечном иерсиниозе n=28 n= Острое 1 Хроническое 7 Всего 8 *обследованы больные гастроэнтерологического профиля (n=41) необходимости проведения обследования больных на иерсиниозы.

Таким образом, иерсиниозы можно отнести к числу инфекционных заболеваний, с которыми гастроэнтерологи встречаются гораздо чаще, чем предполагают. Это связано с особенностями абдоминальной формы иерсиниозов, которая протекает с поражением различных органов брюшной полости, проявляясь в виде энтерита, колита, панкреатита, аппендицита, мезаденита. Для подтверждения диагноза абдоминальной формы иерсиниозов необходимо применять комплекс лабораторных методов. Выявление возбудителей (ДНК) методом ПЦР целесообразно на всех сроках заболевания, включая хроническое течение, а специфических иерсиниозных антител - начиная с 10 дня болезни.

4.2. Этиологическая диагностика панкреатитов, обусловленных иерсиниями Острый панкреатит - полиэтиологическое заболевание [15, 52]. Среди причин, обусловливающих развитие острого панкреатита, определенное место занимают микроорганизмы, в частности, возбудители иерсиниоза и псевдотуберкулеза [56, 74, 108, 159, 207, 211]. Однако к началу наших исследований отсутствовали данные о частоте поражений поджелудочной железы возбудителями иерсиниозной природы и, как следствие, оставалась неразработанной оптимальная тактика обследования больных панкреатитами.

Это послужило основанием для проведения данного фрагмента работы, целью которого явилось выявление патологии поджелудочной железы, обусловленной иерсиниями, с применением методов специфической диагностики.

Проведено комплексное обследование 246 стационарных больных, госпитализированных в панкреатологическое отделение Санкт-Петербургского НИИ скорой помощи имени И.И. Джанелидзе в период с 2005 г. по 2010 г.

В основную группу (группа 1, n=181) вошли больные панкреатитом различной степени тяжести, у 72 из них диагностирован острый панкреатит, у 109 – обострение хронического панкреатита.

Так как в нашей работе были обследованы хирургические больные, то с целью определения специфичности патологического процесса была определена контрольная группа. Эту группу сравнения (группа 2) составили 65 больных с другими видами хирургической патологии (острая кишечная непроходимость, перфоративная язва двенадцатиперстной кишки (ДПК), кровотечение из язвы ДПК или желудка, желчнокаменная болезнь).

Для подтверждения иерсиниозной этиологии панкреатита у больных групп 1 и 2 при их поступлении в стационар проводили исследование сыворотки крови методом РНГА, ИФА-Ig;

методом ПЦР исследовали кал и выпот (содержимое сальниковой сумки и кист поджелудочной железы, выпот из брюшной полости).

В параллельных исследованиях указанный материал от больных по месту лечения изучали специфическими методами для исключения другой инфекционной патологии, с которой дифференцируют иерсиниозы и при которой также встречаются панкреатиты (шигеллезы, сальмонеллезы, гепатиты и др.).

При комплексном лабораторном обследовании 181 больного острым панкреатитом и хроническим с обострением (основная группа) иерсиниозная природа заболевания подтверждена серологическим методом у 58 больных (32, % случаев) (Таблица 4.5). У 9,9 % больных выявлен псевдотуберкулезный Таблица 4.5. Частота подтверждения иерсиниозной этиологии панкреатита специфическими методами Подтверждение Методы Обследовано псевдотуберкулеза кишечного больных иерсиниоза абс. абс.

% (M±m) % (M±m) Серологический 9,9±2,2 22,1±3, 181 18 ПЦР 4,6±2,6 4,6±2, 65 3* 3* испражнения ПЦР 30 0 выпот Всего 10,5±2,3 22,7±3, 181 18+1 40+ *у двух больных выявлены также специфические антитела процесс, у 22,1 % – кишечно-иерсиниозный. Важно отметить, что более чем у половины больных (56,9 %) значения титров в серологических реакциях в 2 и более раз превышали установленные минимальные диагностические значения.

Методом ПЦР специфические фрагменты ДНК и Y. pseudotuberculosis Y..enterocolitica обнаружены при исследовании испражнений у шести больных (9,2 % случаев). При этом, одновременное подтверждение диагноза серологическими и молекулярно-генетическим методами получено у четырех больных. Исследование выпота при данной патологии оказалось не информативным. Таким образом, у 60 из 181 (33,1 %) обследованного больного с различным клиническим течением панкреатита при исследовании сыворотки крови и испражнений установлена иерсиниозная природа заболевания. При этом, панкреатит в 2,2 раза чаще был обусловлен чем Y. enterocolitica, Y..pseudotuberculosis – в 22,7 и 10,5 % случаев, соответственно(t=3,1, р0,05).

Из результатов, приведенных в Таблице 4.6, видно, что в два раза чаще Таблица 4.6. Частота подтверждения иерсиниозной этиологии панкреатита в зависимости от клинического течения заболевания Острое Обострение Вид течение панкреатита хронического панкреатита возбудителя Количество положительных результатов, абс./% (M±m) Серологич. ПЦР Серологич. ПЦР реакции, реакции, n=26 n= n=72 n= 3/4,2±2,4 1/3,8±3,7 15/13,8±3,3 2*/5,1±3, Y..pseudotuberculosis Всего 3+1/5,6±2,7 15/13,8±3, 11/15,3±4,2 29/26,6±4,2 3*/7,7±4, Y. enterocolitica Всего 11/15,3±4,2 30/27,5±4, Возбудители 15/20,8±4,8 45/41,3±4, иерсиниозов всего *у двух больных выявлены также специфические антитела иерсинии вызывали обострение хронического панкреатита, чем острый процесс, соответственно, в 41,3 и 20,8 % случаев р0,05). При этом, (t= псевдотуберкулезная этиология обострения хронического панкреатита выявлена в 13,8 % случаев, острого течения заболевания – в 5,6 %, кишечно-иерсиниозная – в 27,5 и 15,3 %, соответственно (р0,05). Установлено, что Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica вызывают острые панкреатиты различной степени тяжести (Таблица 4.7). При этом Y. enterocolitica достоверно чаще обуславливали легкое течение острого панкреатита (р0,05).

Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что Y..pseudotuberculosis и Y. enterocolitica чаще обуславливают нетяжелое течение панкреатита (легкое и/или обострение хронического). Однако псевдотуберкулез Таблица 4.7. Частота подтверждения панкреатита псевдотуберкулезной и иерсиниозной этиологии в зависимости от тяжести течения острого панкреатита Подтверждение, абс./% (M±m) Тяжесть Обследовано течения псевдотуберкулеза кишечного больных острого иерсиниоза панкреатита Серологич. ПЦР Серологич. ПЦР реакции реакции 1/ 1/ 9/ Легкая 2,9±2,8 2,9±2,8 25,7±7, 1/ 1/ Среднетяжелая 20 0 5,0±4,9 5,0±4, 1/ 1/ Тяжелая 17 0 5,9±5,7 5,9±5, Всего 4/5,6±2,7 11/15,3±4, ную и кишечно-иерсиниозную этиологию панкреатита выявляли также при среднетяжелом и тяжелом его течении. Важно отметить, что существенно чаще обнаруживали иерсиниозную этиологию у больных с обострением хронического панкреатита. Можно полагать, что недооценка потенциальной этиологической роли иерсиний в развитии панкреатита способствовала хронизации заболевания.

При обследовании больных второй группы с острой хирургической патологией непанкреатогенной природы методом ПЦР получены отрицательные результаты. Антитела к иерсиниям выявлены в минимальных значениях диагностических тиров у двух больных (3,1 %): у пациентов с ущемленной грыжей и хронической язвой 12-ти перстной кишки, осложненной кровотечением. Так как у этих больных на момент обследования отсутствовали явные клинические признаки псевдотуберкулезной и кишечно-иерсиниозной патологии, можно полагать, что положительные ответы являются следствием недавно перенесенной иерсиниозной инфекции, протекавшей в атипичной или стертой форме.

Так как для псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза характерно многообразие клинической картины заболеваний, представлялось важным определить наличие или отсутствие отличительных признаков панкреатитов иерсиниозной природы от панкреатитов другой этиологии. Анализ историй болезни обследованных больных показал, что клинические проявления начала заболевания были достаточно типичными для панкреатитов вообще, независимо от их этиологического происхождения. У 61,9 % больных наблюдалась острая боль в верхнем отделе живота, как правило, опоясывающего характера с иррадиацией в позвоночник. Наличие аналогичных болей в животе в прошлом отмечалось у половины больных (52,3 %). У части больных (28,6 %) отмечено вздутие, урчание в животе, однократное или многократное расстройство стула (33,3 %), тошнота, однократная или многократная рвота (38 %). Перитонеальная симптоматика имела место у больных в 14,3% случаев. Гипертермия выше 37,5 °С встречалась редко (28,5 %), увеличения лимфатических узлов выявлено не было.

У отдельных пациентов кожные покровы были бледными (14,3%) или иктеричными (4,8 %). Высыпаний, типичных для иерсиниозов (по типу «перчаток» или «носков»), не отмечено. Увеличение печени регистрировалось почти у половины пациентов (47,6 %). Селезенка была увеличена в 14,3 % случаев. Лейкоцитоз обнаружен у 42,3 % заболевших.Таким образом, по данным историй болезни больных острым панкреатитом и с обострением хронического явных клинических признаков, указывающих на развитие специфического иерсиниозного процесса, не установлено. Данные, полученные при использовании инструментальных методов диагностики в момент поступления больных и в динамике отражали типичную картину воспаления в поджелудочной железе, соответствующую проявлениям острого или обострения хронического панкреатита. При оценке общеклинических лабораторных показателей у больных панкреатитом иерсиниозной и другой этиологии четких различий не выявлено.

Следует отметить умеренную эозинофилию на третьи-пятые сутки, а также повышение уровня трансаминаз у больных панкреатитом с подтвержденной иерсиниозной инфекцией, что косвенно могло указывать на специфический инфекционный процесс.

Таким образом, сопоставление клинических проявлений острого панкреатита иерсиниозной и неиерсиниозной этиологии не выявило между ними существенных отличий. Признаки и их сочетания, чаще всего встречавшиеся при панкреатите иерсиниозной этиологии, не были патогномоничными, их обнаруживали при панкреатите другой этиологии. В то же время, наличие у больных с обострением хронического панкреатита иерсиниозной этиологии некоторых признаков (длительность заболевания более недели, увеличение в размерах печени, селезенки, наличие в анамнезе инфекционного (ангина) заболевания) можно рассматривать как специфические. Однако они встречались не у всех пациентов. Тем не менее, их выявление позволяет заподозрить наличие инфекции, целенаправленно и своевременно провести лабораторное обследование.

Результаты проведенного исследования показали значительную роль иерсиний в развитии патологии поджелудочной железы. В наших наблюдениях иерсиниозную этиологию обнаруживали практически у каждого третьего обследованного больного с различным клиническим течением панкреатита (33,1%). Установлено также, что острые панкреатиты, обусловленные Y..pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, могут иметь различную степень тяжести.

Важно отметить, что у больных с обострением хронического панкреатита подтверждена иерсиниозная природа заболевания, что свидетельствует о недооценке существенной роли иерсиний в развитии панкреатита.

4.3. Оценка эффективности методов этиологической диагностики поражения суставов у больных при псевдотуберкулезе В последние годы установлено, что Y. pseudotuberculosis является одним из возбудителей часто вызывающих поражения опорно-двигательного аппарата. В отдельных работах показано, что частота поражений суставов и выраженность патологического процесса в различные периоды заболевания псевдотуберкулезом варьирует. Так, в остром периоде суставной синдром наблюдали у 14-97 % больных, преимущественно в виде артралгий [13, 74]. При затяжном и хроническом течении заболеваний в 2,7-8,0 % случаев развиваются артриты [39].

Однако в настоящее время вопросы диагностики поражений опорно двигательного аппарата иерсиниозной этиологии остаются проблемными. Они обусловлены рядом причин: особенностями биологических свойств иерсиний и патогенеза заболеваний, наличием стертого и атипичного течения болезни, отсутствием тактики обследования этой категории больных. Как следствие, у больных возможно развитие длительного течения заболеваний с формированием осложнений в виде реактивных артритов. В этой связи для подтверждения псевдотуберкулезной этиологии поражений суставов в различные периоды болезни необходимо было прежде всего оценить эффективность применяемых диагностических методов.

С этой целью нами проведена сравнительная оценка результатов лабораторного обследования 124 больных с поражениями суставов при различном клиническом течении инфекции, получавших амбулаторное лечение, а также поступивших в стационары КИБ им. С.П. Боткина и ОВКГ № 442 Санкт Петербурга, ИКБ № 2 Москвы в 2008-2010 г.г. Больные были распределены на группы: у пациентов 1-ой группы (78 чел.) диагностировано острое течение заболевания с поражениями суставов в виде артралгий, 2-ой (46 чел.) хроническое течение инфекции с развитием реактивных артритов. Критерием включения больных в исследование являлось лабораторное подтверждение диагноза «псевдотуберкулез» при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии, в том числе, вызывающие поражения суставов (урогенитальный хламидиоз, Лайм боррелиозом и др.), отсутствие соматической патологии.

Для подтверждения псевдотуберкулезной этиологии использовали комплекс методов: у больных 1 и 2 группы в первые дни нахождения в стационаре или при обращении к врачу в амбулаторных условиях бактериологическим методом и методом ПЦР исследовали испражнения. В сложных дифференциально диагностических случаях у части больных группы 2 (n=12) для подтверждения этиологии заболевания проводили артроскопию с исследованием в ПЦР синовиальной жидкости и биоптатов синовиальной оболочки. У всех больных исследовали сыворотки крови методом РНГА, ИФА-Ig.

Анализ историй болезни обследованных больных с острым течением псевдотуберкулеза с поражениями суставов в виде артралгий показал, что заболевания характеризовались развитием полиморфной клинической картины. У больных с хроническим течением псевдотуберкулеза с развитием реактивных артритов заболевания продолжались от семи месяцев до двух лет. Чаще всего поражались суставы нижних конечностей - коленные (43,5 % случаев) и голеностопные (28,3 %). Артриты в большинстве случаев (56,3 %) проявлялись по типу ассиметричного полиартрита. Важно отметить, что у этих больных ранее отмечали наличие симптомов, свойственных острому течению псевдотуберкулеза.

Так, у подавляющего большинства больных (89,1 % случаев) развитию артрита предшествовало повышение температуры до 38,0-39,0 0С;

экзантема развивалась в 56,5 % случаев;

отмечались симптомы поражения желудочно-кишечного тракта в виде болей в животе различной локализации (52,2 %). У больных с хроническим течением заболеваний, по сравнению с больными с острым течением инфекций, в патологический процесс достоверно чаще вовлекалась печень - гепатомегалия отмечена в 78,3 и 8,2 % случаев, соответственно (t=10, p0,05). У всех больных этой группы в анамнезе в острый период возникали артралгии. Однако обследования на наличие патологии иерсиниозной природы не проводились.

Результаты комплексного лабораторного обследования больных двух групп представлены в Таблице 4.8.

Таблица 4.8. Результаты установления псевдотуберкулезной этиологии заболевания у больных с поражениями суставов различными методами Кол-во положительных результатов, абс. /% (M±m) Течение ИФА болезни Бактер.

ПЦР РНГА Всего Ig M Ig G Ig A метод острое 9/ 25/ 41/ 68/ 61/ 68/ 57/ 11,4±3,6 32,1±5,3 52,6±5,7 87,2±3,8 78,2±4,7 87,2±3,8 73,1±5, n= хроническое 2/ 14*/ 10/ 34/ 4/ 34/ 24/ n= 30,4±6,8 21,7±6,1 73,9±6,5 8,7±4,2 73,9±6,5 52,2±7, 4,3±2, *ДНК Y. pseudotuberculosis выявлена в 11 пробах испражнений и трех биоптатах синовиальной оболочки При использовании прямых диагностических методов установлено, что методом ПЦР псевдотуберкулезная этиология заболеваний подтверждена в различные периоды болезни не менее, чем в 30 % случаев. При этом, частота получения положительных результатов методом ПЦР выше, чем бактериологическим методом, как при остром, так и, особенно, при хроническом течении, в 2,8 и 7,1 раз, соответственно (р0,05). Важно подчеркнуть, что при исследовании материала от трех из 12 больных с реактивными артритами, у которых заболевание протекало без характерных патогномоничных симптомов псевдотуберкулеза, этиологический диагноз подтвержден обследованных только обнаружением ДНК возбудителя в биоптатах синовиальной оболочки. Ранее С.М..Сидельникова и соавт. сообщали о выделении культуры (2000) Y..pseudotuberculosis из синовиальной жидкости [51].

Оценка эффективности традиционного метода серологической диагностики псевдотуберкулеза РНГА показала, что при остром процессе положительные результаты регистрировали в 52,6 % случаев, при хроническом – в 21,7 %.

Частота обнаружения антител методом ИФА у больных двух групп была достоверно выше. В группе больных с острым течением инфекционного процесса с развитием артралгий методом ИФА диагноз подтвержден обнаружением антител всех трех классов (p0,05) (см. Таблицу 4.8). В группе больных с хроническим течением, осложненным развитием артритов, частота обнаружения антител методом ИФА составила 73,9 и 52,2 % (p0,05) для антител класса G и A, соответственно. Полученные результаты указывают на длительную персистенцию возбудителя в тканях. Данные литературы свидетельствуют, что у пациентов с реактивным артритом особое значение приобретает определение IgA. В наших исследованиях их обнаруживали через 14-16 месяцев от начала заболевания иерсиниозами, причем увеличение их уровня было связано с обострением артрита. Таким образом, обнаружение IgA указывало на персистенцию возбудителя в организме. Антитела класса М, характеризующие острый процесс, на этих сроках заболевания практически не регистрировали.

Таким образом, проведенные исследования образцов сывороток крови больных псевдотуберкулезом с поражениями суставов выявили различия в иммунном ответе в зависимости от длительности заболевания. Обнаружение в ИФА антител классов G и A при отсутствии антител класса М позволяет дифференцировать острое и хроническое течение инфекции. Применение ПЦР у больных псевдотуберкулезом с развитием реактивных артритов позволяет повысить эффективность этиологического подтверждения диагноза. При этом показана эффективность использования в качестве материала для исследования не только испражнений, но также биоптатов синовиальной оболочки.

В целом, проведенные диагностические исследования больных с применением комплекса современных методов и полученные положительные результаты расширяют наши представления о спектре инфекционной патологии, этиологию которой обуславливают иерсинии. Они дополняют полученные нами ранее данные о частоте и проявлениях острых и хронических форм иерсиниозов, в первую очередь, псевдотуберкулеза, с характерными для этой инфекции чертами.

Показания к обследованию приведенных больных должны быть учтены при планировании и организации проведения диагностических и мониторинговых исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Недостаток сведений о структуре популяций Y. pseudotuberculosis на территориях России, знаний о значении возбудителей различных генотипов в распространении инфекции, необходимость распознавания многообразных клинических форм псевдотуберкулеза, особенно при увеличении в настоящее время в структуре заболеваемости спорадических случаев, требует совершенствования системы микробиологического мониторинга циркулирующих штаммов. В связи с этим актуально применение эффективных методов индикации, идентфикации, внутривидовой дифференциации Y. pseudotuberculosis и выявления специфических антител.

Для оценки геномного полиморфизма штаммов Y. pseudotuberculosis, распространенных в России, и в дальнейшем сравнения генотипических характеристик российских и зарубежных штаммов в целях установления возможных филогенетических связей, равно как для решения прикладных задач мониторинга возбудителя, необходимо было выбрать информативные молекулярные маркеры.

В ходе настоящего исследования впервые методами риботипирования и IS проведена внутривидовая дифференциация 273 штаммов RFLPs-типирования различного происхождения и географического Y..pseudotuberculosis распространения.

При риботипировании для каждого штамма получено два гибридизационных профиля. Большинство EcoRI-рибопрофилей характеризуются наличием шести фрагментов рестрикции геномной ДНК, содержащих рРНК оперон, у EcoRV-рибопрофилей отмечено шесть и семь фрагментов. У изученных штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных странах мира, выявлено 18 и 17 EcoRI- и EcoRV-рибопрофилей, соответственно. Риботип определен как сочетание полученных для каждого штамма двух гибридизационных профилей [129]. В результате получено 27 риботипов, в том числе четыре доминирующих. При этом дискриминирующий потенциал метода риботипирования при комбинировании двух профилей составил 0,94, превосходя его значения как при анализе индивидуальных EcoRI- и EcoRV-рибопрофилей, так и при серотипировании (D=0,72).

Использование метода О-гено(серо)типирования позволило субтипировать штаммы трех из шести классических серотипов, в результате зарубежные штаммы отнесены к девяти серотипам: О:1а, О:1b, О:2а, О:2b, О:3, О:4, О:5а, О:5b, О:6. При рассмотрении корреляции риботип – серотип показано, что среди большинства выявленных риботипов (n=21) каждый характеризует штаммы только одного серотипа. Таким образом, риботипирование позволило субтипировать штаммы данных серотипов. На дендрограмме отдельные кластеры сформированы штаммами одного серотипа.

Установлено распространение штаммов 27 выявленных риботипов на территориях 24 стран мира пяти континентов. Вместе с тем, проведенный кластерный анализ зарубежных штаммов показал, что штаммы определенных риботипов, выделенных в одной стране или на одном континенте, распределяются между различными кластерами. С другой стороны, штаммы из различных континентов образуют один кластер или относятся к одному риботипу. Это подтверждает глобальную циркуляцию штаммов Y..pseudotuberculosis.

Также не происходит четкой кластеризации штаммов в зависимости от источника их выделения, что согласуется с положением об убиквитарности псевдотуберкулезного микроба, циркулирующего в объектах окружающей среды и среди широкого круга животных, формирующих резервуары возбудителей инфекции для человека. Исключение составляют штаммы серотипа О: доминантного риботипа 18, выделенные от людей и от сельскохозяйственных животных, но не из объектов окружающей среды, на различных континентах (в Африке, Южной Америке, Австралии, Европе). Ранее сделано предположение, что такие штаммы серотипа О:3, не ферментирующие мелибиозу, завезены из Европы в другие во время транспортировки скота, а также при экспорте мяса, т.к.

их не изолируют от диких животных [122].

У 193 российских штаммов Y. pseudotuberculosis выявлено шесть и семь гибридизационных EcoRI- и EcoRV-профилей, соответственно. Из них пять и три идентичны профилям EcoRI-рибопрофилей EcoRV-рибопрофиля зарубежных штаммов. В результате построения дендрограммы риботипов для российских штаммов определено 11 генотипов (D=0,47).

Таким образом, установлено, что, представители глобальной популяции Y..pseudotuberculosis характеризуются выраженным геномным полиморфизмом по локусам хромосомы, содержащим рРНК оперон. Напротив, российская популяция отличается относительной гомогенностью по указанному маркеру.

У российских штаммов определено два О-генотипа: О:1а (семь штаммов) и доминирующий О:1b (186 штаммов). При рассмотрении корреляции риботип – серотип установлено, что из 11 риботипов три дифференцируют серотип О:1а, семь – О:1b. Один риботип характеризует штаммы двух серотипов.

На дендрограмме риботипов изученных штаммов Y. pseudotuberculosis (n=273) большинство российских штаммов (93 %) образует самостоятельный кластер R1. Они характеризуются специфическими риботипами, встречающимися только у штаммов из России. При этом у штаммов, выделенных на территориях всех трех ФО, выявлены доминирующий риботип 27 и также 32, характеризующие 71 и 8 % штаммов, соответственно. Определены штаммы локальных риботипов, характерных для определенных территорий. Таким образом, установлено отличие генетических вариантов российских штаммов от штаммов, изолированных в других странах мира.

В то же время, часть штаммов российской популяции Y. pseudotuberculosis (13 штаммов, 7 %) обладает генетическим родством со штаммами из других стран мира и входит с ними в один кластер R2 (степень сходства 82 %). Эти 13 штаммов характеризуют редкие для нашей страны риботипы: пять идентичных риботипам штаммов из других стран, а также два специфических для российских штаммов.

На дендрограмме риботипов всех изученных штаммов Y. pseudotuberculosis эти штаммы из России кластеризуются со штаммами из других стран и обладают с ними выраженным родством (коэффициент сходства 82 %).


При проведении IS-RFLP-типирования для увеличения дискриминационой силы метода использовали комбинацию двух зондов и профилей рестрикции ДНК двумя эндонуклеазами: ДНК, рестрицированную EcoRI, гибридизовали с зондом IS285, EcoRV – с зондом IS1541. Анализ профилей и построение дендрограмм кластеризации штаммов осуществляли для индивидуальных IS285- и IS1541 профилей и их сочетаний (2IS-RFLP).

Профили исследованных штаммов, полученные при IS285-RFLP типировании, характеризовались наличием 1-11 фрагментов рестрикции, содержащих участок Сравнительный анализ эффективности трех IS285.

использованных IS-RFLP методов показал, что метод IS285-RFLP обладает наименьшей разрешающей способностью, особенно при изучении российских штаммов, что объясняется как ограниченным разнообразием профилей, так и выраженным доминированием штаммов, характеризующихся одним из них.

Показано, что частота транспозиции IS1541 в геноме выше, по сравнению с Это позволило при сопоставлении гибридизационных профилей IS285.

исследовать большее число фрагментов (1-33) c выраженной вариабельностью размеров и увеличило разрешающую способность метода.

У 80 зарубежных штаммов определен 61 IS1541-профиль (D=0,98), большинство штаммов (63,8 %) обладает индивидуальными профилями, что также обуславливает высокую дискриминирующую силу метода. Таким образом, при IS1541-RFLP-типировании происходит дифференциация кластеризованных штаммов отдельных EcoRV-рибопрофилей на большее количество IS1541 профилей.

Полученное разнообразие позволяет субтипировать IS1541-профилей штаммы всех девяти изученных серотипов зарубежных штаммов Y..pseudotuberculosis. Штаммы разных IS1541 профилей, относящиеся к одному серотипу, на дендрограмме часто входят в состав одного кластера.

Показано, что в трех случаях один и тот же IS1541-профиль выявляется у штаммов, различающихся происхождением или регионом выделения, но из профилей каждый характеризует штаммы, выделенные от одного источника (например, от диких животных) или в одном регионе. Эти результаты отличают метод IS1541-RFLP от IS285-RFLP-типирования и риботипирования.

Представители российской популяции Y..pseudotuberculosis по маркеру IS1541 также характеризуются выраженным отличием от зарубежных штаммов – они более однородны и из 16 выявленных у них профилей 15 являются специфическими и не встречаются у штаммов из других стран (D=0,58).

Для 15 из 16 IS1541-профилей российских штаммов установлена корреляция с серотипами.

В результате внутрикластерной дифференциации штаммов основного риботипа 27 кластера R1 выявлено 10 специфических IS1541-профилей. Один из них, доминирующий 66-й, относится к 60 % штаммов, выделенных в Сибири и на Северо-Западе. Другой, 62-ой, характеризует 24 % штаммов, распространенных в Сибири и на Дальнем Востоке. Выявлены также локальные IS1541-типы.

13 российских штаммов, обладающих генетическим родством со штаммами из других стран мира, в зависимости от количества рестрикционных фрагментов в профилях гибридизации, входят с зарубежными штаммами в два разных кластера D2, d2 и также распространены либо на территориях Сибирского и Северо Западного ФО, либо – Сибирского и Дальневосточного.

Установлено, что дискриминирующая возможность 2IS-RFLP метода была наибольшей. При этом у 80 штамммов из различных стран мира комбинирование двух полученных для каждого штамма IS-профилей привело к внутрикластерной дифференциации штаммов доминирующих IS285 и IS1541-профилей, что позволило разделить их на индивидуальные 2IS-типы. В целом, большинство 2IS RFLP-типов – 66 из 73 (90,4 %) - являются индивидуальными, и семь (9,6 %) характеризуют только по два штамма каждый (D = 0, 99).

При рассмотрении корреляции 2IS-тип – серотип показано, что штаммы каждого из девяти изученных серотипов, как и при использовании метода IS1541 RFLP, характеризовались своими индивидуальными 2IS-типами. На 2IS-RFLP дендрограмме большинство подветвей сгруппированы в соответствии с определенными серотипами. Однако, как и на IS1541-RFLP-дендрограмме, не происходит строгого выделения штаммов одного серотипа в один кластер.

Методы IS1541- и 2IS-RFLP также показывают сходные результаты, выявляя только три и два типа, соответственно, из 61 и 73 выявленных, общих для штаммов, отличающихся географическим происхождением или источником выделения. В то же время, оба метода не дают четкой кластеризации штаммов из одного региона или источника.

На дендрограмме, полученной при комбинировании девяти IS285- и IS1541-RFLP профилей у 193 исследованных штаммов из различных регионов России, определено 18 2IS-типов, 11 из них являются индивидуальными.

Индексы дискриминации методов IS1541- и 2IS-RFLP-типирования не различались (D=0,58). 17 2IS-типов встречаются только у штаммов из России.

Главный кластер R1 составляют штаммы 10-ти 2IS-типов, среди которых доминирующим является 88-й (60 % всех штаммов). В результате внутрикластерной дифференциации штаммов двух из четырех специфических риботипов – 27-го и 32-го, они подразделяются на 10 2IS-типов, что согласуется с результатами определения профилей. Восемь 2IS-типов IS1541-RFLP характеризуют 13 штаммов кластера R2, один из них (12-й) встречается у зарубежных штаммов. При сопоставлении соотношения риботип – 2IS-тип выявлен единственный штамм, обладающий генотипической характеристикой, свойственной зарубежным штаммам: риботип 12, 2IS-тип 12. Определены локальные генетические варианты. При этом не происходит кластеризации штаммов в зависимости от региона или источника выделения. Показана возможность использования данных методов для субтипирования штаммов внутри отдельных серотипов.

В целом, как показал анализ дендрограмм российских и зарубежных штаммов, при использовании методов методов IS1541- и 2IS-RFLP-типирования распределение штаммов по кластерам и подкластерам было однотипным.

В результате проведенного сравнительного изучения полиморфизма длин фрагментов рестрикции генов IS285 и IS1541 для штаммов Y..pseudotuberculosis глобального распространения показано, что по разрешающей способности данный метод внутривидового типирования превосходит риботипирование при анализе как индивидуальных IS-профилей (IS1541-RFLP), так и их сочетаний (2IS-RFLP). Выявлена выраженная дифференциация кластеризованных штаммов, характеризующихся определенными и EcoRI-, EcoRV-рибопрофилями риботипами, на IS-, 2IS-типы. Таким образом, штаммы, идентичные по рРНК локусам неоднородны по содержанию IS285 и IS1541 в геноме, что подтверждает целесообразность использования независимых генетических маркеров для изучения разнообразия популяции.

На основании представленных данных, с учетом близких значений индексов дискриминации методов IS1541- и 2IS-RFLP, распределения штаммов различного происхождения и географического распространения по кластерам, корреляции IS типов с серотипами, кластеризации штаммов специфических российских генотипов и филогенетически близких зарубежным штаммам, сопоставимости результатов двух методов IS-RFLPs с таковыми при MLST, можно заключить, что, с практической точки зрения, из шести использованных в данном исследовании методов молекулярного типирования, применение одного IS1541 RFLP метода (без сочетания с IS285-RFLP и, таким образом, без использования дополнительных рестриктазы и зонда) целесообразно для скринингового анализа штаммов Y. pseudotuberculosis при слежении за циркуляцией возбудителя на территории наблюдения. Он эффективен для сравнительного изучения большого количества штаммов, различающихся географическим происхождением, временем и источником выделения, относящихся к разным серотипам, и таким, образом, применим для анализа микроэволюционной изменчивости Y..pseudotuberculosis.

Использование комплекса молекулярно-генетических методов выявления и типирования перспективно для совершенствования Y. pseudotuberculosis микробиологического мониторинга возбудителя. Применение методов ИФА-Ag и ПЦР позволило повысить эффективность лабораторной диагностики и значительно ускорить этиологическое подтверждение групповых заболеваний, установить факторы передачи. Так, при исследовании материала от больных и из внешней среды во время двух вспышек в организованных коллективах, возбудитель выявляли методами ИФА-Ag и ПЦР в 36,9 и 22,6 % проб испражнений, 6,5 и 6,9 % смывов, соответственно. При этом положительные ответы получены при исследовании нативных проб в первые дни от момента регистрации групповых заболеваний.

При плановом микробиологическом мониторинге применение метода ПЦР для лабораторного контроля объектов окружающей среды и эпизоотологического обследования также способствовало раннему выявлению инфицированных образцов исследуемого материала: положительные результаты регистрировали в 6,2 % смывов с продуктов растительного происхождения и тары в овощехранилищах и 4,6 % проб от грызунов. Метод рекомендуется в качестве сигнального, определяющего целенаправленный поиск возбудителя бактериологическим методом.

В настоящее время использование методов ИФА-Ag и ПЦР при микробиологическом мониторинге циркуляции Y. pseudotuberculosis регламентировано методическими документами федерального уровня.

Результаты генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных регионах России, позволили получить ретроспективную оценку эффективности применения использованных генетических маркеров при микробиологическом мониторинге возбудителя.

Установлено, что штаммы доминирующих генотипов (риботипов и соответствующих IS1541-RFLP-типов) вызывают основную долю групповых (70,6%) и спорадических (60,3 %) заболеваний. При этом для генотипов, относящихся к штаммам от спорадических больных, характерно большее разнообразие и локальная специфичность. Полученные в ходе исследования результаты показали, что штаммы специфических для России генотипов, выделенные от больных, обладали факторами патогенности - хромосомными генам суперантигенного токсина YPM и «острова» высокой патогенности HPI. В соответствии с данными Н. Fukushima Н. et al. (2001), такие штаммы отнесены к генетической группе G3 (HPI-YPM+) и вызывали псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ [122]. Также установлено, что российские штаммы, выделенные от больных, характеризовались двумя редкими генотипами, идентичными таковым у штаммов из европейских стран и являлись представителями генетических групп G Обнаружение штаммов геногруппы G2, (HPI+YPM+), G2 (HPI+YPM-).


вызывающих, по данным Fukushima Н. et al. (2001), течение заболевания без типичных проявлений, характеризующееся, преимущественно, гастроинтестинальными симптомами, аргументируют показания к обследованию на псевдотуберкулез больных с диагнозом «острая кишечная инфекция неустановленной этиологии».

Кластерный анализ дендрограмм риботипирования и IS1541-RFLP типирования также показал, что часть штаммов редких для России генетических вариантов, для которых не установлено связи с заболеваниями человека, и штаммы, выделенные от больных псевдотуберкулезом в других странах мира, входят в один кластер и характеризуются идентичными или родственными риботипами и IS1541-RFLP-профилями. При определении факторов патогенности установлено, что большинство этх штаммов редких генотипов также относятся к генетической группе G2. Важно отметить также, что часть этих штаммов по результатам О-гено(серо)типирования относится к серотипу О:1а, встречающемуся на Дальнем Востоке нашей страны. Таким образом, полученная новая сравнительная молекулярно-генетические характеристики российских и зарубежных штаммов позволяет рассматривать штаммы редких для России генетических вариантов, не связанные с заболеваниями людей, как потенциально опасные для территории нашей страны.

Проведена также оценка эффективности использованных генетических маркеров при групповых заболеваниях псевдотуберкулезом. Определение генетических характеристик штаммов, выделенных во время семи из изученных вспышек псевдотуберкулеза, выявило присутствие в ходе одного и того же группового заболевания возбудителей различных серотипов и генотипов как специфических, так и редких для российских штаммов, изолированных из разных источников. Полученные данные показывают, что во время одной вспышки возможно инфицирование людей различными клонами генетически неоднородной популяции псевдотуберкулезного микроба. Для штаммов отдельных генотипов установлены эпидемиологические связи: грызун (источник инфекции), смыв с продуктов питания (фактор передачи), больной человек. При этом для маркирования штаммов более информативным является сочетание метода риботипирования и IS1541-RFLP-типирования.

Безусловно, молекулярно-генетические методы, применяемые для внутривидового типирования штаммов Y. pseudotuberculosis, не являются рутинными, но они предназначены для использования в референс-лабораториях и профильных учреждениях для определения ареала возбудителя, его клональной структуры, оценки генетического родства между штаммами различного географического распространения, выделенными из разных источников.

Полученные генотипические характеристики российских и зарубежных штаммов Y. pseudotuberculosis и их принадлежность к различным серотипам обосновывают необходимость выделения и идентификации культур разного происхождения с применением современных средств микробиологической диангностики равно как и ориентируют на (О-гено(серо)типирования), использование универсальных методов серологической диагностики при этиологическом подтверждении диагноза.

По данным ряда исследователей метод РНГА не полностью отвечает требованиям практики из-за недостаточной чувствительности диагностикумов и невозможности установить стадию заболевания. Этому назначению отвечает метод ИФА для выявления иммуноглобулинов различных классов. Нами разработаны отечественные диагностические иммуноферментные тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител различных классов к белкам наружной мембраны патогенных иерсиний. При создании тест-систем в предварительных опытах для выбора производственного штамма нами проведена оценка вирулентных свойств штаммов иерсиний из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера комплексом методов.

Установлено, что штамм Y. enterocolitica № 670 обладает комплексом факторов вирулентности, детерминируемых генами плазмиды pYV, и является высоковирулентным. В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов) он зарегистрирован под номером Y..enterocolitica O:3 КМ 174 в качестве тест-штамма с высокой вирулентностью.

Данный штамм использован для клонирования генов yops в технологии получения рекомбинантных аналогов белковых антигенов наружной мембраны патогенных иерсиний. Рекомбинантные белки получены на базе ООО «Омникс» (Санкт Петербург). На основании имеющихся данных о применении БНМ с диагностическими целями при разработке тест-систем в качестве сенситина нами использовано четыре рекомбинантных белка, соответствующих природным факторам вирулентности иерсиний: YopE, YopM, YopН, и YopD.

В результате выполненных исследований подобраны условия проведения анализа и на основе стандартных реагентов сконструированы тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgM/IgA/IgG», предназначенные для выявления антител различных классов к белкам наружной мембраны патогенных иерсиний. Тест системы представляют собой многокомпонентные наборы стандартных реагентов для постановки непрямого ИФА на твердофазном носителе. Их использование позволяет качественно и полуколичественно определять содержание антител определенного класса в сыворотке крови больных и реконвалесцентов. Данные препараты обладают высокой чувствительностью (92,7±2,9 %) и специфичностью (96,0±1,0 %), не уступающей коммерческим зарубежным аналогам. Применение тест-систем позволяет определить динамику антителообразования при остром и хроническом течении заболеваний, в том числе у больных без патогномоничных симптомов псевдотуберкулеза. Разработанные препараты предназначены также для серологического мониторинга «групп профессионального риска».

Препараты прошли Государственные испытания, имеют регистрационные удостоверения, приказом Росздравнадзора разрешены к производству, продаже и применению на территории РФ (Приложения В-В3). Их использование регламентировано методическими документами федерального уровня. В настоящее время препараты выпускаются партнером-разработчиком ООО «Омникс» (Санкт-Петербург). Тест-системы для ИФА рекомендованы национальным референс-центром по мониторингу за иерсиниозами для использования практическим здравоохранением в целях эпидемиологического надзора за иерсиниозами на территории РФ.

Применение комплекса методов этиологической диагностики позволило повысить частоту подтверждения различных форм псевдотуберкулеза и кишечвного иерсиниоза. Так как при иерсиниозах возможно поражение любого органа желудочно-кишечного тракта, распознавание абдоминальной формы иерсиниозов представляет значительные трудности. Применение комплекса молекулярно-генетического и серологического методов исследования позволило выявить иерсиниозную этиологию заболеваний, при которых ведущим симптомом были длительные абдоминальные боли, в 24,8 % случаев. При этом использование ПЦР эффективно не только на ранних стадиях патологического процесса, но и при обострении хронического течения инфекции. Подтверждение этиологической роли иерсиний в развитии острого аппендицита установлено только при использовании метода ПЦР в 20 % случаев. Определена частота вовлечения в патологический процесс различных органов брюшной полости.

Иерсиниозная природа панкреатита подтверждена в 33,1 % случаев.

Установлено также, что иерсинии в два раза чаще вызывали обострение хронического панкреатита, чем острый процесс, соответственно, в 41,3 и 20,8 % случаев (р0,05). Вероятно, недооценка потенциальной этиологической роли иерсиний в развитии панкреатита способствовали хронизации заболевания.

Вместе с тем следует подчеркнуть, что в клинической картине острого и хронического панкреатита с обострением у больных с иерсиниозной и неиерсиниозной природой заболеваний существенных отличий не выявлено, что указывает на показания к обследованию этой категории больных специфическими диагностическими методами.

Учитывая существующие трудности диагностики поражений опорно двигательного аппарата, вызванных проведена Y. pseudotuberculosis, сравнительная оценка эффективности комплекса методов этиологической диагностики поражения суставов у больных при различном течении заболеваний, сопровождающихся артралгиями и развитием реактивных артритов.

При использовании прямых диагностических методов установлено, что методом ПЦР при исследовании испражнений псевдотуберкулезная этиология заболеваний подтверждена в различные периоды болезни не менее, чем в 30 % случаев. При этом показана целесообразность исследования такого вида диагностического материала, как биоптаты синовиальной оболочки у больных с хроническим течением заболевания при отсутствии характерных патогномоничных симптомов псевдотуберкулеза.

Выявлены различия в иммунном ответе в зависимости от длительности заболевания. Так, в группе больных с острым течением инфекционного процесса и развитием артралгий обнаружены антитела всех трех классов при суммарном учете положительных результатов в 87,2 % случаев. В группе больных с хроническим течением, осложненным развитием артритов, выявляли антитела класса G и A в 73,9 и 52,2 % случаев, соответственно. Таким образом, обнаружение методом ИФА-Ig антител классов G и A при отсутствии антител класса М позволяет дифференцировать острое и хроническое течение заболевания.

Таким образом, сочетанное применение молекулярно-генетического и серологических методов позволило расширить спектр патологии, обусловленной иерсиниями, и объективнее судить о частоте заболеваний на территории наблюдения.

Проведение целенаправленных лабораторных исследований при выполнении данной работы с применением комплекса методов выявления, идентификации и генотипирования (ИФА-Ag, ПЦР, Y..pseudotuberculosis риботипирование, О-гено(серо)типирования) и IS1541-RFLP-типирование, обнаружения специфических антител (РНГА, ИФА-Ig) позволило обосновать дифференцированный подход к микробиологическому мониторингу возбудителя и диагностике различных форм псевдотуберкулеза и предложить алгоритм проведения плановых диагностических исследований и по эпидемическим показаниям, представленный в методических докуменгтах федерального уровня.

Выводы 1. Штаммы – представители глобальной популяции Y. pseudotuberculosis, характеризуются выраженным полиморфизмом локусов рРНК оперона, маркеров IS285 и IS154: выявлено 27 риботипов, 43 IS285-типа, 61 IS1541 тип. Представленные генотипы характеризуют штаммы различных серотипов, выделенных из различных источников;

установлено распространение штаммов выявленных генотипов на территориях 24 стран мира пяти континентов.

2. Популяцию на территории России отличает Y. pseudotuberculosis относительная генетическая однородность: охарактеризовано риботипов, 9 16 93 % штаммов IS285-типов, IS1541-типов.

Y..pseudotuberculosis, выделенных из различных источников на территориях Северо-Западного, Сибирского и Дальневосточного ФО, представлены доминирующими (риботип 27/IS1541-RFLP-типы 62, 66) и локальными генетическими вариантами, специфическими для российской популяции.

7% изученных российских штаммов филогенетически близки штаммам из других стран мира.

3. Тест-система, разработанная на основе рекомбинантных аналогов белков наружной мембраны патогенных иерсиний, характеризуется высокой диагностической эффективностью при определении специфических иммуноглобулинов M, G, A в сыворотке или плазме крови человека методом ИФА: чувствительность - 92,7±2,9 %, специфичность – 96,0±1,0 %.

Ее применение перспективно для диагностики иерсиниозов в клинической практике, а также при серологическом мониторинге групп профессионального риска.

4. Сочетанное применение методов выявления возбудителя (ПЦР) и определения специфических антител (РНГА, ИФА-Ig) расширяет возможности установления этиологической роли иерсиний, в том числе при абдоминальной патологии и поражениях опорно-двигательного аппарата.

5. Применение комплекса методов выявления (ИФА-Ag, ПЦР) и генотипирования Y..pseudotuberculosis повышает эффективность контроля за циркуляцией возбудителя. Метод IS1541-RFLP эффективен для внутривидовой дифференциации штаммов Y..pseudotuberculosis различного происхождения на территориях наблюдения. Использование метода риботипирования в сочетании с IS1541-RFLP-типированием целесообразно для установления источников и факторов передачи псевдотуберкулеза при групповых заболеваниях.

6. Предложенные методологические подходы к микробиологическому мониторингу циркуляции Y..pseudotuberculosis на основе применения комплекса информативных молекулярных маркеров, диагностических препаратов и оригинальных тест-штаммов вносят дополнения в систему эпидемиологического надзора за псевдотуберкулезом и обосновывают целесообразность их внедрения в качестве стандартных средств для практического здравоохранения. Их применение регламентировано документами федерального уровня.

Практические рекомендации На основании данных, полученных при проведении исследований в ряде ФО РФ с применением комплекса методов выявления и идентификации иерсиний, их внутривидовой дифференциации, определения специфических антител нами предложен алгоритм диагностических исследований, позволяющий усовершенствовать тактику микробиологического мониторинга циркуляции возбудителей иерсиниозов при плановом проведении и по эпидемическим показаниям учреждениями Роспотребнадзора. Детальное описание алгоритма лабораторной диагностики, включая эффективные диагностические методы и средства, порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в лабораториях учреждений Роспотребнадзора, в том числе в референс центре, формы и методы взаимодействия учреждений, представлено в методических документах федерального уровня.

Алгоритм диагностических исследований при мониторинге циркуляции иерсиний.

1. Взятие материала для исследований при плановом мониторинге.

1.1.Пробы с «объектов риска»: смывы с оборудования, инвентаря, тары, овощей в овощехранилищах, теплицах, на объектах животноводства, птицеводства, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, предприятиях по переработке сельхозпродукции, объектах торговли продуктами растительного и животного происхождения, пищеблоках общественного питания и организованных коллективов;

пробы готовой продукции;

пробы воды открытых водоемов и из ёмкостей для хранения.

1.2. Пробы для эпизоотологического исследования диких и синантропных грызунов. Исследуют тонкий кишечник мелких млекопитающих, брыжейку и мезентеральные лимфоузлы, субстрат гнезд грызунов, почву.

1.3. ОСК «групп профессионального риска»: животноводов, работников предприятий, перерабатывающих животноводческое сырье, овощехранилищ, общественного питания и торговли.

1.4. Материал от больных (подозрительных на заболевание) при диагностических исследованиях:

- больных с предварительными диагнозами псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз;

- больных с симптомами инфекционных, паразитарных, соматических, аллергических заболеваний, с которыми обычно дифференцируют иерсиниозы:

ОКЗ, вирусного гепатита, скарлатины, клещевого боррелиоза, ОРВИ, инфекционного мононуклеоза и др. Дополнительно иерсиниозную этиологию заболеваний необходимо выявлять у больных с симптомами реактивного артрита, больных с длительными абдоминальными болями, больных с симптомами острого аппендицита, острого панкреатита, хронического панкреатита с обострением.

Для индикации и идентификации возбудителей иерсиниозов исследуют:

испражнения, мочу, кровь, мазки из зева, операционный или секционный материал (ткани аппендикулярных отростков, мезентериальные лимфоузлы и патологически измененные органы и ткани, желчь, содержимое кишечника, биоптаты синовиальной оболочки). Сроки обследования больного (подозрительного на заболевание) - первые дни нахождения в стационаре;

в амбулаторных условиях – при обращении к врачу, до начала лечения антибиотиками.

Определение специфических антител проводят в динамике заболевания: в парных ОСК в конце первой – начале второй недели болезни и на третьей неделе.

2. Взятие материала для исследования по эпидемическим показаниям.

2.1. Материал от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий (аналогично п.1.4).

2.2. Смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения.

2.3. Экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;

помет мелких млекопитающих;

пробы, собранные в ходе эпизоотологического обследования (тонкий кишечник мелких млекопитающих и птиц, брыжейка и мезентеральные лимфоузлы, гнезда грызунов, почва).

3. Взятие и подготовка к исследованию проб из объектов окружающей среды, полевого материала, клинического материала осуществляется в соответствии с установленными правилами (МУ 3.1.1.2438-09, МУК 4.2.3019-12).

4. Методы исследования.

4.1. Индикация и идентификация возбудителя I этап. Исследование нативного материала ускоренными методами - ПЦР или ИФА-Ag. При получении положительного результата выдают предварительный положительный ответ.

Исследуемый материал вносят в среду накопления для «холодового обогащения».

II этап. Исследование материала из среды накопления на 2-3-и сутки «холодового обогащения» методами ПЦР или ИФА-Ag. При получении положительного результата выдают подтверждение предварительного положительного ответа.

В пробах с положительными результатами, полученными методами ПЦР или ИФА-Ag, являющихся сигнальными, проводят целенаправленный поиск возбудителя бактериологическим методом, до первого выделения культуры со среды накопления на плотной дифференциально-диагностической среде на 2-3, 5 7 или 10-15 сутки.

При отрицательных результатах ПЦР или ИФА-Ag на этапах I-II бактериологическое исследование пробы не проводят.

III этап. Идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по комплексу морфологических, биохимических признаков, определение биотипа Y..enterocolitica.

IV этап. Расширенная идентификация и дифференциация выделенных культур:

- серологическое типирование Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica с использованием набора диагностических сывороток;

- О-гено(серо)типирование штаммов Y. pseudotuberculosis с применением мультиплексной ПЦР;

- определение вирулентности Y. enterocolitica в РА на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

- определение плазмидного спектра выделенных штаммов;

- определение детерминант патогенности методом ПЦР (генов «островов патогенности» HPI, YAPI;



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.