авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 17 | 18 || 20 | 21 |

«РУКОВОДСТВО ПО СУДЕБНОЙ МЕДИЦИНЕ Под редакцией профессора В.В. Томилина профессора Г.А. Пашиняна А вт ор с ки й коллектив: С.С. Абрамов (главы ...»

-- [ Страница 19 ] --

Области применения ПЦР как в сфере фундаментальной науки, так и биотехнологии столь разнообразны и много численны, что их трудно пере числить. Главный же смысл этого открытия в том, что удалось преодолеть все потенциальные ограничения молекулярно генетических методов исследования, которые были связаны с недостаточным для анализа количеством ДНК.

Применительно к судебно-экспертной практике значение ПЦР заключается в том} что реакция позволяет выделить и размножить любую необходимую для анализа последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в десятки и даже сотни миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения теоретически позволяет работать с единич ными молекулами ДНК, а это означает, что открывается возможность проведения молекулярно-генетического типирования даже в случае исчезающе малых количеств доступного для экспертизы биологического материала. Действительно, еще в 1986 г. А.Джеффрис экспериментально доказал, что с помощью ПЦР становится реальной задача геномной дактилоско пии на уровне нескольких или даже одной клетки. Кроме того, ПЦР оказывается весьма эффективной при анализе сильно разрушенных ДНК, подвергшихся высокой степени деградации. Хорошей иллюстрацией может служить успешное выпол нение в 1992—1995 гг. уникального российско-британско-американского проекта по молекулярно-генетической иден тификации скелетиро-ванных останков Николая II и членов его семьи, которые пролежали в земле более 75 лет. (Эта ра бота проводилась под руководством и при непосредственном участии автора данной главы.) Научные принципы и общая методика ПЦР описаны во многих учебниках по молекулярной биологии и в монографи ях, поэтому мы лишь кратко напомним основные положения.

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотид-ных праймера (затравки), которые располага ются по флангам интересующего эксперта участка ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, молекулярной ассоциации («отжиг») праймеров с комплементарными им последова тельностями на ДНК-матрице и в последующей матричной достройке полинуклео-тидных цепей (начиная от этих прай меров) особым ферментом — термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой), выделенной из бактерии Thermus aquaticus. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы осуществляет ся только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК (рис. 129).

В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента — приблизительно как 2", где п — число прошедших циклов амплификации. Таким образом, за 20 циклов амплификации количество синтези рованных молекулярных копий исходного фрагмента составит 220, или примерно 1 млн. Поскольку праймеры включаются как составная часть в концы новосинтезируемых молекул, они физически ограничивают конечный продукт реакции — фрагмент ДНК, который получается равным по длине расстоянию между концами комплементарных прайме-рам участков на исследуемой молекуле ДНК.

Для проведения ПЦР, кроме исходного препарата ДНК, праймеров, Taq-полимеразы, нужны еще так называемые предшественники ДНК — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в пробирке и помещают в специальный прибор —программируемый термоцикл ер (амплифика тор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции. Весь процесс длится несколько часов.

Рис. 129. Полимеразная цепная реакция (показаны два первых цикла). Для амплификации известного участка молекулы ДНК синтезируют полинуклеотидные последовательности — праймеры, представляющие собой отрезки однонитевой ДНК длиной 20— 30 нуклеотидов и комплементарные каждой из нитей ДНК-матрицы. Участок гена, заключенный между праймерами, многократно копируется с помощью Taq-полимеразы, результатом чего является многократное (во много тысяч раз) увеличение его количества. Фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате амплификации, становятся доступ ными для обычного визуального анализа методом электрофореза в геле агарозы или полиакриламидном геле. Каждый этап удвоения ДНК в процессе амплификации состоит из 3 последовательных ступеней: 1 — денатурация ДНК;

2 — компле ментарное связывание праймерной последовательности с соответствующей последовательностью в ДНК-матрице («от жиг»);

3 — матричный синтез ДНК с помощью Taq-полимеразы (достройка праймера). Длинные фрагменты, синтезируе мые на исходной цепи, накапливаются в арифметической прогрессии. Специфические короткие фрагменты, ограниченные на концах праймерами (они появляются только в конце 3-го цикла), накапливаются в геометрической прогрессии и поэто му доминируют среди конечных продуктов амплификации.

Амплификациоиные молекулярно-генетические индивидуализирующие системы иа основе гипервариабельных локусов с варьирующим числом тан-демных повторов. Описанный выше метод эн зиматической амплификации ДНК положен в основу высокоспецифичных диагностических и индивидуализирующих тест-систем. Все они разрабатывались по единому принципу, который заключается в подборе праймеров на основе из вестной последовательности нуклеотидов ДНК (как правило, это олигонуклеотиды длиной 20—25 звеньев) и оптимиза ции условий энзиматической амплификации нужного генетического локуса. Существование же в геноме человека опи ность их сохранения в деградированной ДНК, На практике это означаем ощутимый «выигрыш» в чувствительности ана лиза. Кроме того, вероятя ность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплифи-i кацией низкомоле кулярных аллелей, крайне низка для микросателлитньщ локусов вследствие узости спектра длины аллелей.

Впервые систематическая работа по обнаружению и детальной характер ристике гипервариабельных локусов, пригод ных для целей геномно-«даю| тилоскопического» анализа с использованием ПЦР, была начата в конца 80-х годов в лабо ратории Р.Уайта (США). К настоящему времени для целее экспертно-криминалистической практики в США, Великобри тании и ряде стран Западной Европы разработано несколько десятков молекулярно-ге^ нетических ПДАФ-систем на ос нове мини- и микросателлитных полия морфных локусов.

Основы технологии геномной индивидуализации с использованием! ПДАФ-анализа. В общем случае технология ПДАФ анализа включает несколько последовательных стадий. Геномную ДНК вводят в реакционную смесь, содержащую все не обходимые компоненты для работы термостабильной ДНК-полимеразы. В такой системе хромосомная ДНК будет слу жить субстратом — матрицей для амплификации нужного локуса. Спещн фическим компонентом реакции и амплифика ционной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные праймеры, именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Реакционную смесь в течение нескольких часов инкубируют в термоциклере (ДНК-амплификаторе), где она подвергается-25—35 циклам нагревания — охлаждения в интервале температур от 50 до 95 °С. (Температурный профиль полимеразной реакции зависит от структур ры используе мых праймеров и потому индивидуален для каждой конкретной системы.) За время процесса интересующие исследователя последовательности ДНК, присутствующие в исходной геномной матрице, многократно (миля лионократно!) копируются Taq-полимеразой. Эти молекулярные копии накапливаются в ре акционной смеси, вследствие чего могут определяться уже количественно. Для этого полученные амплификационные про дукты фракционируют с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида (в последнем случае применяют как обычный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях), фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют с помощью различных методов детекции. Чаще всего полосы на электрофореграмме визуализируют флюоресцентным красителем этидиумбромидом и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашива ния нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией геля. В последнее время, однако, все более ак тивно внедряется регистрация амшшфицированных фрагментов ДНК с использованием более чувствительных методов детекции, например с помощью флюоресцентных меток, возбуждаемых лазерным излучением. Эти методы требуют специ ального аппаратного обеспечения и относительно дороги, однако позволяют анализировать картину электрофоретического разделения с очень высокой точностью и в режиме реального времени.

Гели агарозы традиционно считаются наиболее удобными и технологичными системами для электрофоретического анализа ДНК в молекуляр-но-генетических криминалистических исследованиях. Они не требуют многих подготови тельных процедур, необходимых для приготовления ПААГ, с ними легко манипулировать и они не обладают присущим ПААГ нейротоксическим действием. Однако разрешающая способность агароз ных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера существенно ниже, чем у ПААГ. Это заставило фирмы производители работать над улучшением разделяющих свойств агарозных гелей и над созданием на их основе новых элек трофоретических сред, которые могли бы сочетать технологичность классической агарозной среды и высокие аналитиче ские свойства ПААГ.

Такие агарозные среды хорошо известны. Это, например, специальные модифицированные агарозы семейства NuSieveR фирмы «FMC Bio Products» (США). Они полностью отвечают тем высоким требованиям, которые предъявля ются к гелевым средам разделения при анализе продуктов амплификации локусов с вариабельным числом тандемных по второв. Еще более высокие параметры разрешения имеют гели агарозы Metaphor™, также выпускаемой указанной фир мой.

Идентификационный ПДАФ-анализ хромосомной ДНК в целом аналогичен монолокусному ПДРФ-анализу и предпо лагает регистрацию индивидуализирующих признаков ДНК в виде индивидуально-специфичного набора из двух поли морфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля.

Этот так называемый амплификационный профиль ДНК и является в данном случае индивидуализирующей геномной ха рактеристикой личности человека, которому принадлежит анализируемая ДНК. Различия между ПДРФ- и ПДАФ системами обусловлены главным образом тем, что первые характеризуются непрерывным, а последние — дискретным распределением аллелей (это определяет некоторые различия в методах интерпретации данных, см. ниже).

Использование ПДАФ-анализа для установления генетического пола хромосомной ДНК. Важным элементом судебно биологического экспертного исследования вещественных доказательств является определение половой принадлежности следов и биологических объектов, изъятых с места преступления. Традиционные методы установления генетического пола основаны на анализе микроструктуры ядер интерфазных клеток и выявлении гранул полового хроматина. Однако эти ци тологические методы имеют существенные ограничения, которые очень часто не дают возможности однозначно опреде лить генетический пол объекта исследования. Эти ограничения обусловлены, с одной стороны, несовершенством морфо логических критериев определения специфических признаков пола на уровне исследования хроматина (в частности, их статистическим характером), а с другой стороны, как факультативным присутствием истинных Х- и Y-хромоцент-ров в ядрах нормальных клеток мужского и женского организма, так и существованием в хроматине сходных структур, которые не коррелируют с полом.

Появление в арсенале судебно-биологической экспертизы технологии геномной «дактилоскопии» придало этой про блеме особую остроту. Точное определение пола чрезвычайно важно при производстве генно-идентифи-кационной экс пертизы смешанных следов, поскольку с экспертной точки зрения нельзя однозначно интерпретировать генотипы ДНК с неустановленной половой принадлежностью (представление генетического «паспорта» ДНК с неустановленной половой принадлежностью может привести к серьезным следственным ошибкам).

Экспертное исследование биологических объектов на молекулярном уровне существенно повышает объективность и доказательность анализа их половой принадлежности. Молекулярно-генетические методы исследования на уровне ДНК половых хромосом позволяют предельно конкретизи 12 3 4 Рис. 130, Анализ половой приладь лежности ДНК.

УФ-визуализация электрофоретичеИ кого фракционирования продуктов амплификации гетероморфного сегмента гена амелогснина на матрице мужской (2) и женской (3) ДНК. 1 — негативный контроль;

4 — маркерная «лестница» BRL 123bp.

ровать экспертный вывод, по-4 скольку выявляют половый признаки, имеющие абсолютную специфичность.

Для установления половой принадлежности ДНК предложен достаточно широкий спектр методических подходов. Так, на ранних этапах внедрения мультилокусной геномной «дактилоскопии» использовали гибридизационный анализ по Саузерну в пятнах («дот-блотт»-анализ) или in situ с применением Y специ-фичных молекулярных зондов. Позже автором этой главы был разработан рестриктазный анализ с прямой УФ-визуализацией специфических для пола фрагментов ДНК человека в рамках разработанной им концепции параллельного или сопряженного анализа половой принадлежности ДНК (сопряженный анализ играл роль «встроенного контроля» при выполнении генетического идентификационного исследования). Тогда же появились методы определения пола, основанные на использовании ПЦР и, в частности, ПДАФ-анализа.

В 1993 г. в лаборатории П.Гилла с участием автора этой главы был разработан новый ультрачувствительный метод определения пола на основе энзиматической амплификации фрагментов X/Y-гетероморфного гена аме-логенина.

Последовательности ДНК гена амелогенина, кодирующего один из белковых компонентов зубной эмали человека, представлены гомологичными копиями на Х- и Y-хромосомах, причем в Х-хромосоме в гене имеется делеция в 6 нуклеотидах. Для амплификации используются прай-меры, позволяющие амплифицировать очень короткие участки гена, которые содержат этот X/Y-гетероморфный сайт и потому являются высокоспецифическими половыми маркерами ДНК. В результате Х- и Y-специфичес-кие продук ты амплификации имеют разную длину —соответственно 106 и 112 п.н.;

их и необходимо дискриминировать для того, чтобы отличить дублет 106/112 нуклеотидов — «XY» (мужской пол) от полосы 106 нуклеотидов, представляющей на самом деле дублет 106/106 нуклеотидов — «XX» (женский пол). Для этого продукты реакции фракционируют электрофорети чески: 1) в гелях агарозы NuSieve или Metaphor («FMC BioProducts», США) и анализируют в УФ-свете после окрашива ния этидиумбромидом или 2) в ПААГ с последующим окрашиванием серебром (рис. 130).

Этот тест по праву считается одним из лучших. По чувствительности он превосходит все известные на сегодняшний день амплификационные ин дивидуализирующие системы, оперирующие на уровне хромосомной ДНК человека, позволяя диагностировать генетический пол препаратов с единичными молекулами ДНК. Кроме того, амелогениновый тест очень надежен. В частности, амплификация Х- и Y-специфичных фрагментов осуществляется одновременно в одной реакции с использованием одних и тех же праймеров, а близкий размер совместно амплифицируемых (в слу чае генотипа XY) фрагментов гарантированно обеспечивает эквивалент ную продукцию обеих гетероформ даже при анализе сильно деградиро ванной ДНК. Указанные свойства амелогенинового теста явились предпо сылкой для разработки на его основе более сложных комбинированных индивидуализирующих систем, которые позволяют определять половую принадлежность исследуемого генетического материала параллельно с установлением его генотипа по ряду гипервариабельных локусов.

44.3.3. Анализ сайт-полиморфизма нуклеотидных после довательностей ДНК Молекулярно-генетические индивидуализирующие системы на основе полиморфных локусов с аллельнымн различиями в последовательности иук-леотидов. С точки зрения судебной медицины, главный смысл ис пользования ПНР заключается в том, чтобы наработать необходимую для анализа ДНК в количестве, достаточном для последующего идентифика ционного исследования теми или иными молекулярно-генетическими ме тодами. Иными словами, если в распоряжении эксперта уже имеется ам плифици-рованный продукт, полученный на матрице интересующего его генетического локуса, он имеет возможность применить разные методи ческие подходы для анализа генетической вариабельности в этом локусе и выявления соответствующих индивидуализирующих признаков.

Амплификация участков ДНК, содержащих делеции или инсерции, как это имеет место в случае тандемно организованных гипервариабельных локусов, приводит к формированию продуктов (аллельных фрагментов), различающихся по длине;

их дифференцируют путем электрофоретиче ского фракционирования. Этот принцип лежит в основе индивидуализи рующих систем ПДАФ-типа, о которых говорилось в предыдущих разде лах.

Вместе с тем уже отмечалось, что существенная часть вариаций в по ли-нуклеотидных цепях геномной ДНК обусловлена так называемыми точко-выми нуклеотидными заменами: очень многие локусы, в том числе и высокополиморфные, имеют варианты (аллели), которые на молекуляр ном уровне одинаковы по длине, но в той или иной степени различаются по последовательности нуклеотидов, составляющих эти молекулы. Это так называемый сайт-полиморфизм (от англ. site — участок), который ус ловно можно обозначить сокращением ППАФ — полиморфизм нуклео тидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК. По нятно, что амплификация локусов ДНК, обладающих свойством сайт полиморфизма, приведет к образованию неразличимых по длине фраг ментов. Дифференцировать такие фрагменты с помощью обычных мето дов электрофореза невозможно, поэтому в индивидуализирующих систе мах ППАФ-типа используются иные принципы дифференциации аллель ных вариантов.

Наиболее радикальный, хотя и наиболее дорогой, трудоемкий и дол гий путь, это так называемое секвенирование (от англ. sequencing) ампли фицированных фрагментов ДНК, т.е. определение первичной структуры поли-нуклеотидной цепи. Теоретически это самый точный и доказатель ный метод из всех возможных методов анализа индивидуальных генетических вариаций, поскольку по своей сути секвенирование — это расшифровка генетического кода, который в принципе уникален для каждого организ ма. Существуют две основные технологии секвенирования ДНК, разрабо танные в конце 80-х годов и названные по именам их авторов — лауреа тов Нобелевской премии А.Максама, У.Гилберта и Ф.Сэнгера. Метод Сэнгера может быть полностью автоматизирован, что и реализовано ря дом западных фирм. Мировым лидером в производстве автоматических ДНК-секвен-серов является американская корпорация «Perkin-Elmer».

В настоящее время единственной молекулярно-генетической индиви дуализирующей системой, основанной на секвенировании сайт полиморфных амплифицированных фрагментов ДНК,является локус D петли мито-хондриальной ДНК (мтДНК). Эта система не относится к хромосомным индивидуализирующим системам;

она обладает совершен но особыми свойствами и здесь мы ее рассматривать не будем.

Другой относительно более простой путь дифференциации сайт-поли морфных последовательностей ДНК — это амплификационно-гибридиза ционный анализ с использованием аллельспецифичных зондов. Такой подход предполагает регистрацию индивидуального структурного поли морфизма ДНК при помощи молекулярной гибридизации с мечеными зондами. Последние в соответствующих условиях будут связываться только со «своими» последовательностями ДНК, т.е. с полностью им комплементарными, и не будут реагировать с другими фрагментами, ко торые имеют нуклеотид-ные замены.

Аллельспецифичные зонды представляют собой короткие (обычно 10— 30 звеньев) олигонуклеотиды, в которых последовательность состав ляющих их нуклеотидов полностью комплементарна последовательности нуклеоти-дов того или иного аллеля полиморфного локуса. Амплифика ционный продукт, полученный на матрице анализируемой ДНК, подвер гают термической диссоциации и затем гибридизуют в строго заданных условиях с молекулами зонда. Условия гибридизации подбирают так, что бы комплементарное связывание происходило только между точными мо лекулярными копиями;

изменения даже одной позиции в полинуклеотид ной цепи должно оказаться достаточным, чтобы связывание с зондом не произошло. Определение условий дифференциальной молекулярной гиб ридизации — ключевой момент в создании систем индивидуализации на основе анализа сайт-полиморфизма ДНК: чем выше степень оптимизации процесса, тем меньше опасность получить артефактные результаты, обу словленные кеспеци-фической перекрестной гибридизацией разных алле лей.

Классический вариант постановки олигонуклеотидной гибридизации?

называется дот-блотт-анализом (от англ. dot blotting — промакивание пят на). Денатурированные амплифицированные фрагменты анализируемой ДНК иммобилизуют в ограниченной зоне (пятне) на мембранном фильтре — китроцеллюлозном или полиамидном. Далее зону фильтра с ампли фицированными фрагментами инкубируют в растворе, который содержит молекулы зонда, меченные радионуклидом или иным способом (напри мер, с помощью флюоресцентных или хемилюминесцентных меток или биоти-нилирования). При такой постановке эксперимента каждая индиви дуальная гибридизация с аллельным зондом представляет собой самостоя тельный тест, который требует приготовления стольких ДНК-пятен на фильтре, сколько аллелей предполагается тестировать.

Чтобы преодолеть связанные с этим затруднения и сделать анализ бо лее технологичным американская фирма «Cetus» в 1989 г. разработала новый подход, названный реверс-дот-блотт-форматом (от англ. reverse dot-blot).

В этом варианте на одном фильтре в индивидуальных зонах иммобилизиру ют все возможные аллельные олигонуклеотидные зонды, и такой фильтр один раз гибридизуют с мечеными амплифицированными фрагментами ин тересующей эксперта ДНК. Визуализация гибридизационных зон и, таким образом, идентификация амплифицированных аллелей могут осущест вляться разными методами в зависимости от способа мечения ДНК.

ППАФ-анализ аллельных вариантов локуса HLA DQA1 и локусов сис темы PoIyMarkerR. Исторически первой и наиболее широко известной мо лекулярно-генетической индивидуализирующей системой ППАФ-типа стала разработанная в 1989 г. фирмой «Cetus» система типирования локу са HLA DQalpha, ныне называемого по номенклатуре ВОЗ локусом HLA DQA1.

Локус DQA1 расположен на 6-й хромосоме и представляет собой поли морфный ген, кодирующий альфа-субъединицу одного из белков — DQ класса II (HLA D) так называемого комплекса лейкоцитарных антигенов человека HLA (от англ. Human Leikocyte Antigen), относящегося к главному комплексу гистосовместимости. Белки, входящие в этот комплекс, играют ключевую роль в механизмах реализации иммунного ответа, и их высокая вариабельность обусловлена именно этими функциями.

Ген DQA1 имеет 8 аллельных состояний, различия между которыми обусловлены множественными точковыми заменами нуклеотидов на отно сительно коротком участке полинуклеотидной цепи. Четыре основных ал леля гена DQA1 обозначаются А1, А2, A3 и А4;

эти 4 аллеля отличаются друг от друга как минимум на 5 нуклеотидов в 30-нуклеотидном участке ги первариабельного сегмента. Кроме того, два из основных аллелей, А1 и А4, имеют подварианты, последовательности которых отличаются всего 1— нуклеотидами: А1.1, А1.2, А1.3, А4.1, А4.2 и А4.3.

Р.Сайки, Р.Хигучи и Г.Эрлих разработали амплификационные прайме ры, с помощью которых осуществлена высокоэффективная полимеразная реакция на матрице этого гипервариабельного генного сегмента. Размер амплифицированных аллельных фрагментов практически одинаков и со ставляет 242 п.н. для аллелей А1 и A3 и 239 п.н. — для А2 и А4.

Детекция аллельных вариантов локуса DQA1 основана на использова нии аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов. Первоначальный ва риант системы включает 8 диагностических элементов-зондов, которые применяются по сложной комбинированной схеме и позволяют идентифи цировать 6 аллелей. Четыре индивидуальных зонда распознают 4 главных аллельных типа — А1, А2, A3 и А4;

эти зонды заметно отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности. Аллели Al.l, A1.2 и А1.3 иден тифицируют с помощью других 4 зондов. При этом один из них специфи чен в отношении только А1.1, другой — только А1.3, третий «узнает» А1.2, А1.3 и А4.1, а четвертый реагирует со всеми аллелями, кроме А1.3. Геноти пы, содержащие аллели А1.2 и А1.3, дискриминируют на основании комби наторного анализа гибридизационных картин, получаемых с двумя послед ними зондами Вся система реализована в реверс-дот-блотт-формате. В на стоящее время стандартные наборы реагентов под коммерческим названием «AmpliTypeR HLA DQA1 PCR Amplification and Typing Kit» выпускаются компанией «rerkin-Elmer» (США).

Эта система очень удобна, технологична и надежна. Она способна дис криминировать 21 генотип, прекрасно стандартизована, не требует дорого стоящего оборудования. Единственным ее недостатком можно считать вы сокую коммерческую стоимость самих наборов реагентов.

При типировании локуса HLA DQA1 ДНК, выделенную из биоматерш ла, применяют в качестве матрицы для амплификации в ПЦР. Постанови реакции осуществляется с использованием реагентов, поставляемых в на боре AmpliType. Эти реагенты находятся в виде специальной буферно смеси, которая включает биотинилированные олигонуклеотидные прайме ры, нуклеотиды-предшественники и Taq-полимеразу. К этой смеси добя ляют аликвоту анализируемой ДНК (2—200 нг) и по завершении 30—32J цикловой ПЦР полученный амплифицированный продукт гибридизуют полосками нейлонового мембранного фильтра, несущими иммобилизован ные аллельспецифичные зонды. После 20-минутной гибридизации и с мывки фильтров амплифицированные аллели гена DQA1 выявляют с помь щью ферментативных методов. В качестве конечного детектора выступает] конъюгированная с молекулами стрептавидина пероксидаза хрена, которая в зонах гибридизации — in situ — переводит хромогенный субстрат тетрамен тилбензидин из растворимой бесцветной формы в малорастворимую и ок рашенную: голубое окрашивание тех или иных зон с иммобилизованными зондами указывает на присутствие соответствующих амплифицированных аллелей гена DQA1. Генотип образца определяют визуально на основе ком бинаторного анализа гибридизационной картины.

В 1995 г. появился усовершенствованный вариант данной системы, ко торый позволяет дополнительно дифференцировать редкие аллели А4.Я А4.2 и А4.3.

Основываясь на успешном опыте внедрения системы AmpliTypeR HLA DQA1, в 1994 г. в фирме «Roche Molecular Systems» (партнер корпорации «Perkin- Elmer») была разработана другая индивидуализирующая система ППАФ-типа — AmpliTypeR РМ PCR Amplification and Typing Kit, известная также под названием «PolyMarker». Эта система позволяет анализировать одновременно 5 генетических локусов при использовании тех же оборудаа вания и реагентов, что и система типирования аллелей локуса DQA1. Пять молекулярно-генетических маркеров системы Polymarker представлены сле дующими локусами: LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), GYPAl (Gly cophorin A), HBGG (Hemoglobin G Gammaglobin), D7S8 (обозначении no HGM) и GG (Group Specific Component).

Гены LDLR, GYPA и D7S8 являются диморфными, два других - HBGG и GC — трехаллельными. В состав реакционной смеси входгаи пар амплификационных праймеров, которые работают в одинаковых ус4 лови ях и обеспечивают одновременную амплификацию аллелей всех 5J маркер ных компонентов и одного контрольного локуса в одной постановке ПЦР.

В качестве контрольного локуса используют константную частя гена HLA DQA1. Типирование аллельных вариантов маркерных генов] осуществляют с помощью реверс-дот-блотт-гибридизации амплифицирон ванных фраг ментов с 14 аллельспецифичными зондами, иммобилизован! ными на ней лоновой мембране. Как и в системе AmpliType* HLA DQA1. зоны молеку лярной гибридизации визуализируют с помощью ферментан тивной кон версии бесцветного субстрата-хромогена в окрашенный прея ципитат.

В 1995 г. система PolyMarker была доработана таким образом, что вмес то константного сегмента гена HLA DQA1, выполнявшего только коэа трольные функции, в нее была введена вариабельная 8-аллельная последо- вательность этого гена, выступающая теперь в качестве 6-го маркерногш элемента. Фактически системы AmpliTypeR HLA DQA1 и AmpliTypeR PMj удалось объединить в единую индивидуализирующую систему с очень вьщ соким потенциалом дискриминации.

44.4. Интерпретация молекулярно-генетических экспертных дан ных 44.4.1. Общие принципы учета результатов Применительно к задачам и практике судебно-медицинской эксперти зы молекулярно-генетический анализ наиболее эффективен в двух случаях:

в идентификации личности и при установлении биологического родства (в наиболее распространенном варианте — экспертиза спорного отцовства).

Под идентификацией понимаются, во-первых, задача экспертизы по конкретному уголовному или гражданскому делу, во-вторых, собственно процесс и результат экспертного исследования, который заключается в ус тановлении тождества исследуемых объектов (а в случае отрицательного ре зультата исследования их различия). Предпосылкой для идентификации объекта служит его индивидуализация — процесс выявления и оценки при знаков объекта, обладающих максимальной значимостью с точки зрения его неповторимости, т.е отличия от любых иных объектов. В соответствии с этим судебно-экспертная молекулярно-генетическая идентификация лич ности предполагает установление тождества идентифицируемого лица с конкретным человеком (или их отличия друг от друга) по характеризующим их отличительным (индивидуализирующим) молекулярно-генетическим признакам. Отождествление или дифференциация осуществляется на осно вании сравнительного анализа совокупности индивидуализирующих при знаков ДНК, выявленных в ходе идентификационного исследования. В ка честве индивидуализирующих признаков выступают генотипические комби нации аллелей полиморфных генетических локусов. Эти аллели в зависи мости от используемого методического подхода визуализируются (реги стрируются) либо в виде полос, которые образуют полиморфные фрагмен ты ДНК на электрофореграмме, либо в виде аллельспецифичных дот-гиб ридизационных сигналов на мембранных фильтрах. Такие индивидуально специфичные наборы полос или дот-сигналов, представляющие собой ге нотипические аллельные комбинации индивида, можно назвать локальными геномными профилями.

Результаты сравнительного исследования (совпадение — несовпадение) геномных профилей идентифицирующих объектов (ими могут быть как биологические образцы, заведомо происходящие от идентифицируемого лица, так и объекты неизвестного происхождения, связанные с расследуе мым событием — вещественные доказательства, следы биологической при роды и т.п.) отражаются в выводах о вероятном тождестве этих индивиду ально определенных объектов экспертизы или их безусловном отличии.

Следует особо обратить внимание на то, что вероятностная оценка генети ческой идентичности объектов экспертизы строго обязательна. Это требо вание диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных индиви дуумов (подробнее см. в разделе 44.4.3).

Аллельные варианты каждого полиморфного локуса наследуются по ядерному типу, т.е. примерно 50 % всех маркерных элементов, составляю щих локальный геномный профиль человека, происходит от его отца, а другие 50 % — от матери. Это обусловлено аутосомной локализацией ги первариабельных локусов: каждый аллельный вариант наследуется как про стой менделевский кодоминантный признак. Высокий индивидуальный полиморфизм гипервариабельных локусов в сочетании с их соматической 33 - Рис. 131. Семейный анализ полиморфных вариантов гипер- вариабельных минисателлитов семейства М13.

Блотт-гибридизация Mval-гидролизатов индивидуаль ных ДНК^ представляющих семейное «трио» (1 — мать, 2 — ребенок, 3 —| отец), с радиоактивно мечен ным зондом MI3.

стабильностью и менделевским характером наследо-| ва ния позволяет использовать метод геномной иден-| тифи кации для определения биологического родствая Экспер тиза спорного отцовства по сути также является иденти фикационным тестом. Однако в отличие от прямой су дебно-медицинской идентификация личности отождеств ление в этом случае носит опосре*4 дованный характер:

признаки «образующего» объекта (здесь — признаки ро дительского индивидуума), используемые с целью иден тификации, отражаются в «воспринимающем» объекте — ребенке не непосред-1 ственно, как в биологических сле дах, а преломляются через призму сложных генетических закономерностей. Знание и правильная оценка этих зако номерностей необходимы для адекватной интерпретации результатов экспертного исследования. Учитывая это, проведение экспертизы спорного отцовства с исполь-;

зо ванием технологии геномной идентификации ха рактеризуется рядом принципиальных моментов, на ко торых следует остановиться в дополнение к сказанному выше.

Современная экспертиза спорного отцовства (ма теринства) должна ответить на два вопроса: а) исклю чается или не исключается отцовство (материнство) дан ного индивидуума в отношении данного ребенка (плода);

б) если отцовство (материнство) не исключается, то како ва вероятность того, что это не является результатом слу чайного совпадения индивидуализирующих признаков неродственных лиц.

Идентификационный тест, направленный на раз решение случаев оспариваемого отцовства, предполагает сравнительный анализ геномных профилей ребенка, матери и предпола гаемого отца. При этом сначала регистрируют те полосы в геномном отпе чатке ребенка, позиции которых совпадают с «материнскими» полосами, а оставшиеся полосы у ребенка сопоставляют с геномным профилем муж чины. Если исследуемое «трио» представляет истинную биологическую семью, все «нематеринские» полосы ребенка обнаружатся в геномном профиле отца. В противном же случае часть полос в локальных геномных профилях ребенка окажется «лишними», т.е. не «найдет» соответствия в геномных профилях заявленных родителей (рис. 131). Это стандартный алгоритм решения данной экспертной задачи, который базируется на за кономерностях наследования гипервариабельных локусов. В частности, опираясь на менделевский характер наследования, можно считать, что все полосы, составляющие геномный профиль ребенка, должны иметь либо отцовское, либо материнское происхождение. Поэтому присутствие у ре бенка посторонних фрагментов слу жит основанием для исключения заявленного отцовства (при условии, что материнство рассматривается как бесспорное). В свою очередь полное комплементарное соответствие геномного профиля ребенка таковым заяв ленных родителей означает неисключение заявленного родства.

Суммируя сказанное, в контексте судебно-экспертной идентификации личности результаты молекулярно-генетического типирования должны ин терпретироваться в следующем логическом ключе.

А Сравнительный анализ: зафиксировано совпадение или несовпадение локальных генетических профилей либо (в случае экспертизы родст ва) индивидуальных аллелей, выявленных у идентифицирующего объекта и у идентифицируемого лица, или соответственно у ребенка и родителей.

Вероятностный анализ: в случае совпадения генетических профилей или аллелей — какова статистическая значимость этого события?

44.4.2. Сравнительный анализ геномных профилей Формальное сравнение. В принципе два геномных профиля можно счи тать одинаковыми (совпадающими), если они неразличимы по генотипу.

Для индивидуализирующих систем, основанных на использовании поли морфных локусов с дискретным распределением аллелей, это означает со впадение в сравниваемых геномных профилях всего набора составляющих аллелей. Чтобы это утверждать, надо, очевидно, уметь определить (иденти фицировать) сами аллели. В этом есть свои особенности.

Дело в том, что прямое (безусловное) генотипирование, т.е. прямое ус тановление локального генотипа, возможно только для систем, использую щих аллельспецифичные диагностикумы, например ППАФ-типа. RТак, при ППАФ-анализе локуса HLA DQA1 и локусов системы PolyMarker иденти фикация аллелей легко достигается за счет того, что регистрируемые дот сигналы являются аллельспецифичными и потому непосредственно указы вают, какой именно аллельный вариант выявлен. Регистрируемые таким образом генетические характеристики имеют абсолютное значение и пото му могут помещаться в банк данных для последующего сравнения с любы ми другими аналогичными данными.

В тех же случаях, когда прямое генотипирование невозможно, необхо димо соблюдать определенные условия, которые должны обеспечить кор ректность процедуры генотипирования. Например, для ПДАФ-систем на основе гипервариабельных локусов с варьирующим числом тандемных по второв, которые предполагают электрофоретическое фракционирование амплифицированных фрагментов ДНК, аллели определяют не прямым ме тодом, а опосредованно — на основании физического расположения (пози ционирования) фрагментов ДНК на дорожке геля. Но тогда для идентифи кации аллелей необходимы правила, которые определяли бы критерии по зиционного совпадения полос на геле. Важно понимать, что такие крите рии различаются в зависимости от свойств аналитической системы и спо соба сравнения (см. ниже). Поэтому регистрируемые генетические характе ристики имеют не абсолютное, а относительное значение. Иначе говоря, они могут быть пригодны для сравнения в рамках одного эксперимента и не могут использоваться для более широкого исследования. (Поэтому в банк данных они могут помещаться только тогда, когда установлено их со ответствие такому уровню точности, который обеспечивает возможность сравнения с любыми аналогичными данными.) 33" На практике совпадение геномных ПДАФ-профилей фиксируется в том) случае, когда картины распределения полос на сравниваемых дорож ках! геля однотипны и похожи, а позиции соответствующих фрагментов попадают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам.

Подобные принципы сравнительного позиционного анализа примени мы и для индивидуализирующих систем, которым свойственно непрерыв ное распределение аллелей, например, таких как минисателлитные моно-и мультилокусные ПДРФ-системы, поскольку для них определение генотипа еще более проблематично. В этом случае существуют проблемы как теоре тические, так и практические. Так, индивидуально-специфическая картина гибридизации, состоящая из множества характеристический полос и получающаяся при мультилокусной геномной дактилоскопии, представля ет собой своего рода «черный ящик», в котором остаются не^ выясненны ми ни генетическая природа, ни аллельные состояния локусов, соответст вующих этим полосам. Таким образом, поскольку для мультило-кусных систем критерии генетического тождества полос не определены, по сути сравнение осуществляется не по самому генотипу, а как бы пя внешнему образу генотипа. В данном случае это оказывается возможным благодаря выраженной графической индивидуальности мультилокусного геномного профиля, который характеризуется сразу несколькими параметрами: чис лом полос, их расположением на дорожке и интенсивностью каждой поло сы.

При этом, однако, надо помнить, что оценочная специфичность муль-т тилокусного геномного «отпечатка» зависит от конкретных условий про ведения анализа, параметров и особенностей экспериментальных проце дур, количества и качества анализируемой ДНК. Это имеет принципиаль ное значение, поскольку отождествляемые препараты ДНК могут значи тельно различаться по своим «дактилоскопическим» свойствам, в частно сти вследствие процессов деградации нативных молекул ДНК. Таким об разом, при интерпретации результатов следует учитывать всю совокуп ность экспериментальных условий, действующих факторов и получаемых данных. Следует признать, что пока для мультилокусных систем эта задача в общем виде решена не полностью, хотя определенный прогресс наблю дается в решении] некоторых частных вопросов.

Интерпретация гибридизационной картины в случае использования мо-нолокусных зондов проще, чем для мультилокусных систем. Принци пиальное значение приобретает тот факт, что теоретически в геномных профилях сравниваемых объектов совпадающие полосы заведомо тожде ственны, поскольку они представляют один и тот же аллельный вариант конкретного генетического локуса, т.е. один и тот же индивидуализирую щий признак. Следует, однако, оговориться, что в свою очередь для моно локусных систем более проблематичным может оказаться решение вопро са собственно совпадения полос из-за сплошного характера их распреде ления и отсутствия внутренних маркеров геометрической однородности геля. (В мультилокусных системах роль таких маркеров играют достаточ но многочисленные мономорфные полосы.) Для решения этой проблемы предложены специальные методические и биостатистические подходы, в частности так называемый бининг (от англ. bin — интервал), когда аллели учитывают не индивидуально, а определенными группами.

В дальнейшем мы сосредоточим внимание на вопросах, связанных с интерпретацией только амплификационных геномных профилей локусов с варьирующим числом тандемных повторов, поскольку в нашей стране именно они имеют наибольшее практическое значение.

Позиционное сопоставление амплификационных геномных профилей. Во прос о том, одинаковы или неодинаковы геномные профили, которые по лучены при анализе препаратов ДНК, выделенных из объектов экспертизы (например, из биологических следов на вещественных доказательствах и из крови проходящих по делу лиц), является ключевым для молекулярно-ге нетической идентификации. Это ясно, поскольку от того, как будет интер претирован результат сравнения, зависит экспертный вывод: в одном слу чае это неисключение, а в другом —исключение причастности данного лица к происхождению исследованных следов. Между тем именно вопрос о похожести и непохожести геномных профилей может создать большую опасность неверного решения из-за множества причин. Некоторые из них мы рассмотрим в данном разделе.

Итак, как уже упоминалось, при анализе электрофореграммы можно выделить два аспекта:

• картины распределения полос на сравниваемых дорожках геля похо жи или непохожи;

• позиции соответствующих фрагментов совпадают или не совпадают.

Л о ж н о е г е н о т и п и р о в а н и е. Что касается общей похожести одного геномного профиля на другой, то в данном случае ложный результат может быть обусловлен двумя причинами.

Во-первых, присутствие в сравниваемых препаратах ДНК постороннего генетического материала (чаще всего в результате случайных загрязнений) может имитировать как совпадение, так и различие их геномных профилей.

Во-вторых, этот же эффект может проявиться как результат неправильного генотипирования, в частности в результате ложноопределеинои гомо- или гетерозиготности анализируемых объектов. Это связано с артефактами ПЦР, возникающими под влиянием неоптимальных условий ее проведе ния:

— избыточным или недостаточным исходным количеством матричной ДНК;

— плохим качеством препарата;

— неспецифичностью праймеров и(или) неадекватно подобранным для них рабочим режимом (например, отжиг при более низкой, чем сле дует, температуре);

— неоптимальной концентрацией Taq-полимеразы в реакционной сме си, в частности, ее избыточным количеством;

— присутствием в реакции неоптимальной концентрации Mg2+;

— профилем кривой нагрева реакционной смеси с неоптимальными значениями температурных переходов (это может быть вызвано не удачными техническими параметрами прибора, используемого для амплификации ДНК);

— неоптимальной продолжительностью процесса циклического нара щивания.

Наиболее распространенный артефакт, так называемый феномен пред почтительной амплификации аллелей, довольно часто приводит к ошибоч ному заключению о гомози готности. Вместе с тем наряду с опасностью ти пирования ложных гомозигот нередки и более сложные случаи искажения генотипа, характеризующиеся не только частичной утратой истинных алле лей, но и амплификацией неспецифических (неаллельных) фрагментов, что имитирует ложногетерозиготныи аллельныи профиль. Решить проблему ложноопределеинои гомо- или гетерозиготности в некоторых случаях сложно. Помочь в этом случае может только скрупулезный анализ устойчи вости амплификационных профилей, основанный на амплификационнои титровании сомнительных препаратов и многократной проверке воспроиз водимости результата.

С д в и г п о л о с. Физическое сопоставление полос на электрофоре грамме также требует учета многих факторов. Одна из сложностей — тая называемый сдвиг полос, когда в процессе электрофореза фрагменты ДНК в одной дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичны!

фрагменты в соседней дорожке. Это явление имеет несколько причин:

— неодинаковое количество ДНК в разных дорожках геля;

— неодинаковые ионные характеристики препаратов, внесенных в раз- ные дорожки геля (присутствие в препаратах примесей, влияющих на электрофоретическую подвижность ДНК — солей, спирта, фенола, этидиумбромида и др.);

— избыточная напряженность электрического поля;

— перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток);

— истощение электрофорезного буфера;

— микрогетерогенность геля (в частности, недостаточно высокое каче ство среды разделения).

Большая часть перечисленных факторов поддается контролю, поэтому решением проблемы может быть оптимизация и текущий мониторинг соот ветствующих параметров.

В некоторых случаях сдвиг полос имеет не ступенчатый, а сглаженный характер (например, хорошо известный эффект «улыбки»). Тогда вознщ кающие геометрические искажения электрофоретической картины в принт ципе поддаются математическому анализу и могут быть скомпенсированы на стадии обработки изображения. Для этого рекомендуется, кроме флан кирующих дорожек, также и каждую 3—4-ю дорожку геля делать референт ной, т.е. вносить в нее маркеры молекулярных масс, по которым будет рас считываться фактор коррекции. Следует, однако, отметить, что надежная коррекция возможна не всегда и электрофорез по возможности надо повто рить.

Р а з р е ш а ю щ а я с п о с о б н о с т ь э л е к т р о ф о р е з а. Другой очень важный момент, о котором следует помнить при позиционном сопо ставлении полос на электрофореграмме, это разрешающая способность ис пользуемой электрофоретической системы. Оценка этого параметра имеет принципиальное значение для решения вопроса о самой возможности аде кватного сравнения амплификационных профилей. Для того чтобы иметь такую возможность, необходимо быть уверенным, что применяемая для фракционирования амплифицированных фрагментов ДНК система позво ляет надежно различать аллельные варианты, отличающиеся по длине как минимум на одно повторяющееся звено. Иначе можно ошибочно посчи тать идентичными те фрагменты, которые имеют близкую, но не одинако вую длину.

Для разделения аллелей применяемых на практике локусов с варьирую щим числом тандемных повторов, таких как STR-локусов (длина повторя ющейся последовательности 2—4 п.н.) и VNTR-локусов с коротким шагом (в частности, минисателлитного локуса D1S80, длина повторяющейся пос ледовательности которого составляет 16 п.н.), необходимо иметь возмож ность различать фрагменты ДНК, которые отличаются по длине на 1—2 % (и даже меньше в случае коротких тандемных повторов). Кстати, это спра ведливо и в случае электрофоретического фракционирования половых ге тероформ амелогенинового гена, при котором надежность разделения дуб лета XY имеет принципиальное значение для использования данного теста.

Обеспечить такое разрешение способна далеко не любая электрофоре тическая система. В первую очередь этим обусловлены высокие требова ния, предъявляемые к электрофоретическим средам разделения.

Электрофорез в геле — стандартный метод, широко используемый для разделения и характеристики (идентификации) фрагментов ДНК в лабора торной практике. В основе его лежит эффект «молекулярного сита», прису щий многим гелевым средам (например, агарозным, крахмальным, агаро вым, ПААГ). Этот феномен обеспечивает возможность функционирования молекул ДНК в электрическом поле как по величине электрического заря да, т.е. по размеру, так и другим параметрам (например, пространственная конфигурация молекул), что в целом характеризует электрофорез в геле как сложный аналитический метод, в котором определяющую роль играет именно среда разделения. В современном анализе ДНК применяют агароз ные и полиакриламидные гели.

Агарозные гели, безусловно, являются наиболее удобными и техноло гичными системами для электрофоретического анализа ДНК: с ними легко манипулировать, они не обладают присущим акриламиду нейротоксичес ким действием. Кроме того, стандартные нативные агарозные гели в гораз до меньшей степени, чем ПААГ, чувствительны к случайным флюктуациям в макроструктуре молекул ДНК. Поэтому они менее «склонны» к опреде ленным, связанным с этим артефактам, которые могут приводить к пози ционным искажениям в анализируемом геномном профиле и как следствие к ошибкам при идентификации аллелей. Однако следует помнить, что раз деляющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у ПААГ. Поэтому в молекулярно генетических экспертных исследованиях предпочтительнее использовать специальные агарозные среды, такие как модифицированные агарозы се мейств NuSieveR и MetaPhorR фирмы «FMC Bio Products» (США) или ана логичные им продукты других фирм.

Могут применяться как нативные, так и денатурирующие акриламид ные гели. Эти системы имеют ряд особенностей, которые должны быть предметом отдельного рассмотрения. Из принципиальных моментов отме тим лишь то, что интерпретация электрофореграмм, полученных в денату рирующих условиях, может осложняться эффектом «разделения цепей», когда индивидуальные фрагменты ДНК в геле оказываются представлен ными двумя полосами. Что касается нативных ПААГ, то в целом это систе мы с нехарактерными для агарозы электрофоретическими свойствами: они гораздо более чувствительны к пространственно-конформационным пара метрам молекул ДНК. Поэтому в этих гелях электрофоретическое поведе ние фрагментов ДНК значительно зависит от их нуклеотидного состава.

Это может проявляться в так называемом эффекте аномальной электрофо ретической подвижности и вызывать определенные геометрические иска жения амплификационного профиля, в частности позиционные несоответ ствия, касающиеся наблюдаемых и реальных размеров фрагментов.

На практике разрешение электрофореза можно контролировать визу ально с помощью наборов локусспецифичных аллельных маркеров (аллель ных «лестниц») или компьютерных программных средств, используя внут ренние или внешние маркеры молекулярных масс.


Измер ение электрофоретической подвижности ф р а г м е н т о в ДНК;

ф и з и ч е с к а я п о г р е ш н о с т ь а н а л и т и ч е с к о й с и с т е м ы. Из сказанного выше очевидно, что позицион ное совпадение или несовпадение амплифицированных фрагментов ДНК в сравниваемых геномных профилях (по сути вопрос их тождественности или отличия) не всегда может быть адекватно определено «на глазок». И прежде всего потому, что при таком способе оценки трудно учесть все действую щие факторы в их совокупности, а именно это влияет на результат. Так, на пример, мы знаем, что при невысоком электрофоретическом разрешении можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофореграмме. Однако в более сложных случаях в сочетании с выраженным эффектом сдвига полос недостаточное разреше ние электрофореза может привести к тому, что, наоборот, заведомо одина ковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как разные аллели (рис. 132).

Поэтому, строго говоря, вопрос позиционного совпадения или несовпа дения фрагментов ДНК должен решаться аналитическим путем на том ос новании, что позиции сравниваемых фрагментов попадают или же не попа дают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам. Очевидно, что такой подход в первую очередь требует физических измерений на электрофореграмме и учета их неизбежных неточностей.

Существует множество методов, позволяющих проводить измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК на геле. При этом вполне определенные ограничения на применение того или иного метода накладывают погрешности измерений. Так, наиболее простой, но и наиме нее точный способ — измерение обычной линейкой. Он оказывается не приемлемым для относительно коротких агарозных гелей, когда цена деле ния мерной шкалы легко «вмещает» разницу в подвижности двух соседних аллелей. Наивысшие надежность и точность измерений обеспечивают авто матические компьютеризованные сканирующие или линейные регистри рующие системы, которые используются в наиболее совершенных прибо рах. Более или менее универсальный вариант — это так называемый диги тайзер (от англ. digitizer), представляющий собой электронный модуль, ко торый состоит из курсора-измерителя и цифрового координатного устрой ства. Такой модуль можно использовать как самостоятельно, так и в каче стве составной части компьютерных систем обработки изображения.

Разработано много моделей подобных устройств. В качестве примера можно привести первую в нашей стране компьютеризованную систему TVID-DATAPHOR, созданную в 1994 г. в Бюро главной судебно-медицин ской экспертизы МЗ РФ. При помощи видеокамеры данная система позво ляет получать и хранить в памяти компьютера «оцифрованное» изображе ние геля. На экране монитора изображение воспроизводится с общим гео метрическим разрешением 280 х 460 точек и монохромным тоновым разре шением в 256 градаций. Программные средства позволяют эксперту осу ществлять контроль электрофоретического разрешения, проводить анализ распределения материала в полосе на электрофореграмме и двумерное из мерение пробега в геле, определять размеры фрагментов ДНК с использо ванием нескольких алгоритмов. Предусмотрена также возможность коррек ции электрофоретической неоднородности геля. Программа-дигитайзер имеет координатную систему с ценой деления в 1 пиксел, что в зависимости от аппаратной оптики может обеспечить точность измерений в реальном масштабе в пределах ±0,1 мм.

Погрешности измерений — составная часть общей ошибки измерений (физическая погрешность), которая в конечном итоге определяет разре шающую способность всей используемой аналитической системы. Кроме погрешности метода измерения, свой вклад в общую физическую ошибку Б В А I-S +S т Рис. 132. Решение вопроса о позиционном совпадении или несовпадении амплифи-цированных фрагментов ДНК в сравниваемых геномных профи лях.

Этот вопрос не всегда может быть правильно решен «на глазок». Например, при невысоком электрофоретическом разрешении в сочетании с эффектом сдвига полос можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофоре-грамме (как аллели 6 и 7 в дорожках Б и В), или наоборот, заведомо одинаковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как различные аллели (как фрагмент 5 в дорожках Б и В). Показана схематическая картина электрофо ретического фракционирования в 3 дорожках на геле аллельной «лестницы»

одного и того же полиморфного локуса с дискретным распределением алле лей, имеющего более 8 аллельных вариантов: А — условно нормальное рас пределение фрагментов на геле;

Б — случайный сдвиг полос на величину -S (замедление);

В — случайный сдвиг полос на величину +S (ускорение). В разных зонах геля в зависимости от достигнутой величины электрофоретиче ского разрешения величина случайного сдвига (физическая погрешность системы, S) по-разномухсоотносится с величиной аллельно-го шага. Если это соотношение меньше /г, то позиционное совпадение или несовпадение фрагментов интерпретировать невозможно, поскольку это могут быть как одинаковые, так и разные аллели (зона а). Если это соотношение находится в интервале между 1Л и 1А (зона б), то можно однозначно интерпретировать только две ситуации: когда полосы полностью совпадают — в этом случае можно быть уверенным, что это идентичные аллели;

когда позиции полос различаются больше чем на 2S — тогда это по определению разные аллели.

Любое же несовпадение на величину, меньшую чем 2S, однозначно интер претировать нельзя — это могут быть как одинаковые, так и разные аллели (ср., например, фрагменты 4 и 5 или 5 и 6 в дорожках Б и В). Если величина сдвига полос (S) меньше УА длины аллельного шага (зона в), то при любом взаимном расположении полос на геле имеется возможность решить вопрос об аллельной идентичности фрагментов.

системы вносят такие факторы, как разрешение электрофореза, характере степень геометрических искажений в геле, форма, ширина и интенсивности самих полос и др.

Чтобы на практике оценить общую физическую погрешность исполы зуемой аналитической системы, необходимо определить так называемое окно для фрагмента, т.е. границы пространства на геле, в котором он стад тистически может оказаться. Эта величина зависит главным образом от свойств электрофоретической системы: статистического сдвига полос (т.е.

величины случайных вариаций подвижности идентичных фрагментов), стен пени диффузии и разрешения электрофореза, точности измерительной сиш темы.

Отметим, что физическую погрешность можно выразить в виде доли (з процентах) от длины анализируемого фрагмента ДНК, но тогда эта величи на будет зависеть от длины фрагмента. Например, по данным автора этой главы, на агарозных электрофоретических средах MetaPhorR в сочетаниям описанной выше системой TVID-DATAPHOR, на стандартном 12 см геле позиция фрагмента ДНК длиной 800 п.н. определяется с погрешностью!

соответствующей 0,6 % длины этого фрагмента. Это означает, что такой фрагмент на разных дорожках геля попадает в «окно», аналитический разл мер которого не превышает 2 минимальных единиц измерения при достизи нутом разрешении 5 н.п. на 1 ед. измерения.

В плане решения ключевого вопроса — позиционного совпадения или несовпадения фрагментов ДНК — оценка величины физической погреш ности используемой экспертом аналитической системы позволяет устано- вить для данной системы соответствующие объективные правила и количе- \ ственные критерии позиционного сопоставления геномных профилей.

П о з и ц и о н н ы е к р и т е р и и с о п о с т а в л е н и я геномных п р о ф и л е й. Теоретически обобщенные требования для аналитической системы просты — позиции на геле разных аллельных фрагментов] не должны совпадать. Действительно, если бы физическая погрешность! сис темы равнялась нулю, то полное совпадение позиций на геле двух фраг-J ментов ДНК в противоположность любому позиционному несовпадение могло бы рассматриваться как критерий их аллельной идентичности^ Любое же несовпадение должно было бы означать разные аллели. Единст- \ венной оговоркой в этом случае будет разрешение электрофореза, которое, очевидно, должно быть способно продемонстрировать имеющуюся разницу в электрофоретической подвижности фрагментов как детектируемую (из меряемую) геометрическую величину. Отсюда ясен физический смысл ве личины электрофоретического разрешения, который заключается в том, что эта величина определяет минимальную абсолютную разницу в длине] анализируемых фрагментов ДНК, которую может «показать» используемая система. Важно подчеркнуть, что эта величина зависит от длины самих iфрагментов.

Учитывая сказанное, можно было бы предложить следующие критерии.

• Два фрагмента ДНК тождественны друг другу, если их позиции на геле неразличимы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы зафиксировать разницу в длине между сосед ними аллелями.

• Два фрагмента ДНК нетождественны, если при том же условии их по зиции на геле не совпадают.

Однако не следует забывать, что физическая погрешность используемых на практике аналитических систем — реальная величина и потому позиции идентичных фрагментов на геле вполне могут различаться — в пределах со ответствующего «окна». Следовательно, в реальной системе два фрагмента ДНК можно считать тождественными друг другу в том случае, если, во-пер вых, их позиции на геле не выходят за пределы границ соответствующего «окна», и, во-вторых, если заведомо разные фрагменты не могут попасть в эти границы. (Надо четко понимать, что если последнее условие не опреде лено, то задача отождествления фрагментов на основании их позиции на геле в принципе невыполнима.) Поскольку пространство «окна» ограничено удвоенной величиной фи зической погрешности, то на первый взгляд можно было бы сказать так:


для того чтобы иметь возможность в любом случае решить вопрос об ал лельной идентичности фрагментов, разрешение электрофореза должно быть достаточным, чтобы величина физической погрешности не достигала Vi длины аллельного шага на минимально измеряемую величину. Однако на самом деле это справедливо только в том случае, если известны границы «окна» каждого фрагмента на геле. Поскольку эти границы априори неиз вестны, при таком разрешении геля можно однозначно интерпретировать только две ситуации: 1) когда полосы полностью совпадают, — в этом слу чае можно быть уверенным, что это идентичные аллели, 2) когда позиции полос различаются больше, чем на удвоенную величину физической по грешности, — тогда это разные аллели. Любое же несовпадение на величи ну, равную или меньшую, чем удвоенная физическая погрешность, одно значно интерпретировать невозможно — ведь это могут быть как одинако вые, так и разные аллели. Отметим, что это правило остается верным и в случае примененения локусспецифичных аллельных маркеров (так назы ваемой аллельной лестницы).

Чтобы избежать подобной неопределенности и действительно при лю бом взаимном расположении полос на геле иметь возможность решить во прос об аллельной идентичности фрагментов, разрешение электрофореза должно быть таким, чтобы величина физической погрешности системы оказалась меньше 1А длины аллельного шага на минимально измеряемую величину.

Таким образом, мы сформулировали универсальные критерии.

А Два фрагмента ДНК тождественны друг другу, если их позиции на геле не отличаются более чем на удвоенную величину физической по грешности системы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы величина физической погрешности была меньше У\ длины аллельного шага на минимально измеряемую величину;

Два фрагмента ДНК нетождественны, если при том же условии их по зиции на геле отличаются более чем на удвоенную величину физичес кой погрешности.

С р а в н е н и е г е н о м н ы х п р о ф и л е й, п о л у ч е н н ы х на р а з н ы х г е л я х. По существу сопоставление геномных профилей, по лученных на разных гелях, означает, что сравнению подвергаются результа ты разных экспериментов. Этот факт имеет принципиальное значение:

если при сравнении позиций фрагментов ДНК на одной электрофореграм ме их позиционное совпадение или несовпадение устанавливают путем прямого (непосредственного) сопоставления друг с другом, то при анализе разных электрофореграмм этого сделать нельзя, поскольку профили элек трофоретического разделения в каждом эксперименте оказываются не одинаковыми. На разных гелях амплификационные профили идентичных объектов могут быть весьма похожими, но они необязательно будут геомет-' рически тождественны. Поэтому сравнение можно делать только опосредо ванно — путем независимого сопоставления параметров сравниваемых полос с некой третьей величиной. Далее известно, если две величины по рознь равны третьей, они равны между собой и т.д.

Совершенно очевидно, что таким согласующим параметром является аллельная принадлежность фрагментов в сравниваемых геномных профи лях. Сопоставление аллелей (генотипов) в отличие от позиционного срав нения амплификационных профилей имеет уже не относительный, а аб солютный характер, поэтому генотипированные аллельные профили в принципе можно сравнивать независимо от того, получены они в одном или в разных экспериментах. Это означает, что генотипические характе ристики исследованных объектов могут быть организованы в информаци онную базу данных и использоваться как элементы банка генетических данных.

Для индивидуализирующих систем, основанных на использовании по лиморфных локусов с дискретным распределением аллелей, применение локусспецифичных аллельных маркеров (аллельных «лестниц») позволяет относительно просто осуществлять генотипирование локальных аллельных профилей и при условии, что в каждом эксперименте были соблюдены не обходимые позиционные критерии сопоставления полос (см. выше), пере ходить от позиционного анализа в рамках одного эксперимента к безотно сительному сравнению генотипов объектов.

В том случае, если используются другие (неаллельные) маркеры молеку лярных масс, первичной согласующей величиной для сравнения на разных гелях амплифицированных фрагментов ДНК является длина этих фрагмен тов. Однако в этом случае понадобятся дополнительные условия, которые обсуждаются в следующем разделе.

Опр едел ени е р азм ер а фрагм ентов и г енотипиро в а н и е г е н о м н ы х п р о ф и л е й. Физические измерения пробега фрагментов ДНК на электрофореграмме дают возможность вычислять их условный молекулярный размер, например длину в парах нуклеотидов.

Между этими двумя параметрами существует вполне определенная взаимо связь: молекулярная масса (а следовательно, и размер) обратно пропорцио нальна величине электрофоретической подвижности. Надо подчеркнуть, что эта зависимость имеет сложный характер, она не является линейной и ее конкретные характеристики могут существенно различаться на разных гелях. Последнее объсняется тем, что электрофоретическая подвижность молекул нуклеиновых кислот в геле, в частности ДНК, определяется целым рядом параметров, таких как молекулярная масса, линейный размер моле кул, а также молекулярные структурные особенности высших порядков.

Вклад каждого из факторов и, следовательно, форма кривой, характеризую щей эту многопараметрическую зависимость, могут быть разными: все за висит от аналитических свойств конкретной гель-электрофорезной сис темы Таким образом, чтобы определить размеры амплифицированных фраг ментов ДНК по их расположению на геле, нужно проанализировать про филь электрофоретического разделения для данного конкретного геля и для него определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров. Это можно сделать, используя стандарты молекулярных масс, т.е. фрагменты ДНК заранее известного размера, которые фракционируют на том же геле, что и анализируемые ам плифицированные фрагменты.

По характеру применения электрофоретические стандарты молекуляр ных масс бывают внешними и внутренними. Внешние стандарты наносят на гель так, что они образуют самостоятельные контрольные или маркер ные дорожки. Для минимизации возможных пространственных искажений, как реальных, так и кажущихся (параллаксных), влияющих на точность со поставления характеристик стандартной и анализируемой дорожек, мар керные дорожки следует располагать на геле как можно ближе к дорожкам, по которым движутся анализируемые фрагменты ДНК. Такой проблемы не возникает в том случае, если стандарты молекулярных масс вносят непо средственно в ту же дорожку, где фракционируют интересующие эксперта амплифицированные фрагменты (внутрений стандарт). Однако в обычной практике использовать внутренние стандарты можно лишь для решения ог раниченного круга задач;

универсализация же этого подхода требует специ альной приборной базы (например, многоцветной флюоресцентной детек ции).

Анализ данных электрофоретического разделения стандартных (маркер ных) фрагментов позволяет определить параметры кривой зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров для данного конкретного геля и затем, используя эти параметры, рассчитать длину ана лизируемого фрагмента на основании величины его электрофоретической подвижности. Для этого существуют специальные расчетные алгоритмы.

Эти алгоритмы характеризуются разной степенью точности.

Важно понимать, что погрешность расчетов при определении размера фрагментов является еще одной составляющей (вместе с физической по грешностью) общей ошибки генотипирования, присущей данной аналити ческой системе в целом. Поэтому, если вернуться к сопоставлению элек трофоретических данных, полученных на разных гелях, то в том случае, когда не используются аллельные маркеры, а сравниваются длины фраг ментов, определенные с помощью стандартов молекулярных масс, следует учитывать и ошибку расчетов.

Наиболее заметный вклад в методическую разработку вопросов повыше ния точности расчета длин фрагментов ДНК внесли работы Э.Сазерна и А.Элдера (начало 80-х годов). Предложенные этими авторами алгоритмы расчетов в принципе позволяют определять размер фрагментов ДНК с по грешностью, не превышающей 0,1 %. Однако принципиальное значение имеет то, что такой результат возможен только при условии, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты гомологичны, т.е.

представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями.

Если же это условие не соблюдено, т.е. нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК различны, то ошибка в оп ределении размера фрагментов может достигать нескольких процентов.

(Это связано с минорными различиями в физико-химических и как след ствие электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с разным нуклеотидным составом.) Определяемый размер фрагментов служит «ключом» к генотипирова нию, т.е. к идентификации аллелей. Однако следует помнить, что из-за по грешности расчета определение размеров амплифицированных фрагментов ДНК не всегда может гарантированно обеспечить правильную идентифика цию аллелей, которым эти фрагменты соответствуют.

Речь идет о том, что позиционное «окно» фрагмента, которое задается физическими параметрами системы и «пространство» которого в норме распределено симметрично относительно истинного аллельного размера, при перерасчете в «окно» допустимых длин оказывается асимметричным — смещенным от среднего положения на величину алгоритмической погреш ности. Если эта погрешность относительно велика, скажем, сравнима с ве личиной аллельного шага, то «окно» длин фрагмента может и вовсе пере двинуться на место, соответствующее соседнему аллелю. Если этот эффект не учитывать, может сложиться положение, когда, например, идентичные фрагменты, аллельную принадлежность которых в разных экспериментах определяли с помощью разных стандартов молекулярных масс, могут быть ошибочно отнесены к разным аллелям.

Представим себе такую ситуацию. Величина физической погрешности системы составляет 4 п.н., и мы имеем право, например, анализировать ал лель N22 локуса D1S80 (494 п.н.), поскольку удовлетворяется критерий по зиционного сопоставления фрагментов на геле (аллельный шаг в этой зоне составляет 3,2 % от длины фрагмента, а погрешность — 0,8 %). В этих усло виях аллель N22 может попасть в 1,6 % позиционный интервал («окно»).

Если бы погрешность расчета размера фрагмента по его подвижности была равной нулю, то это соответствовало бы значениям 21,75—22,25;

соседний же аллель N23 (510 п.н.) определялся бы в интервале 22,75—23,25. Однако погрешность расчета для гетерологичного стандарта молекулярных масс может составить 3 %. Для анализируемого локуса это 0,95 аллельного шага.

Тогда интервал для аллеля N22 сместится, примет значения 22,7—23,2 и пе рекроет формальное «окно», предназначенное для аллеля N23. Иными сло вами, фрагмент уже не будет определяться как аллель N22, а будет опре деляться как N23. В другом случае, при использовании иного стандарта, по грешность расчета может оказаться совсем другой, например 0,5 % (0, аллельного шага), и аллель N22, вероятнее всего, будет определен именно как N22.

Все это означает, что генотипические характеристики, полученные рас четным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются условными и по тому не всегда могут быть напрямую использованы для сопоставления как элементы банка данных. Чтобы получить такую возможность, необходимо использовать как минимум одинаковые маркеры или же провести норми рование ошибки и осуществить коррекцию всех данных по эталону, напри мер по гомологичному аллельному маркеру. Последний вариант предпо чтителен, поскольку позволяет оперировать не условными, а истинными генотипами, что необходимо для корректной статистической обработки данных.

44.4.3. Вероятностная оценка генетической идентичности объ ектов при совпадении их геномных профилей Обоснование вопроса и постановка задачи. Вероятностная оценка гене тической идентичности объектов экспертизы строго обязательна. Это тре бование диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных индиви дуумов.

Совпадение амплификационных профилей (генотипов) в препаратах ДНК, полученных из биологических следов с места преступления, и в ДНК подозреваемого еще не означает, что у этих двух ДНК общее происхожде ние. Иначе говоря, сам по себе факт генотипического совпадения необяза тельно влечет за собой вывод о том, что следы произошли именно от этого человека;

они могли произойти и от другого индивидуума, который неотли чим по исследованным генетическим признакам от первого. Точно так же в экспертизе спорного отцовства факт совпадения отцовских аллелей в гено типе ребенка с аллелями, присутствующими в геноме предполагаемого отца, еще не означает доказанного отцовства. Это объясняется тем, что как бы ни высока была индивидуализирующая значимость анализируемых при знаков, а именно аллельных вариантов гиперполиморфных генов, она не абсолютна. Практически все эти признаки группоспецифические, т.е. в той или иной степени каждый из них распространен в популяции. Поэтому после того как в ходе экспертизы установлен факт совпадения ДНК-про филей, характеризующих объекты экспертизы, и выполнено их генотипи рование, перед экспертом встает последний и самый важный вопрос:

• если генотипические аллельные комбинации двух препаратов ДНК совпадают, то какова вероятность того, что они произошли от одного человека.

Или в случае экспертизы спорного происхождения детей:

• если все аллели ребенка находят соответствие в генотипах матери и предполагаемого отца, то какова вероятность того, что предполагае мый отец является биологическим отцом этого ребенка?

Для того чтобы ответить на этот ключевой вопрос и тем самым оконча тельно решить экспертную задачу, понадобится прояснить два момента. Во первых, необходимо оценить индивидуализирующее значение выявленного комплекса признаков, т.е. количественно определить, насколько по лученные в ходе исследования генетические признаки позволяют отграни чить исследованный объект экспертизы от любого другого, ему подобного.

Во-вторых, нужно правильно выбрать алгоритм расчета интересующей нас вероятности для оценки идентификационной значимости результатов экс пертизы.

Количественная оценка индивидуализирующего значения геиоттшчсских характеристик. Для того чтобы оценить индивидуализирующее значение выявленного геномного профиля, нужно определить, какая часть популя ции может быть донором данного типа ДНК. Заметим, что определение в популяции доли потенциальных «двойников», т.е. индивидуумов, которые не различаются по тому или иному исследуемому признаку, является стан дартным предметом популяционнои генетики и соответственно решается стандартными методами этой науки. Поэтому мы не будем касаться тонко стей методологии популяционных расчетов, что подробно описано в спе циальной литературе, а сосредоточим внимание лишь на тех понятиях и той логике, которые имеют принципиальное значение для вопросов, по ставленных перед судебной экспертизой.

Итак, по существу перед экспертом стоит задача определить частоту идентификационного признака в популяции. В качестве индивидуализирую щих и в конечном счете идентификационных признаков в судебно-экс пертном молекулярно-генетическом анализе выступают конкретные аллели полиморфных локусов ДНК. Они могут анализироваться либо самостоя тельно (например, в случае решения вопросов о родстве), либо в составе ге нотипических аллельных комбинаций (при идентификации личности).

Исходным параметром популяционных выкладок, касающихся оценки распространенности признака, служит величина, называемая вероятностью признака. В нашем случае это вероятность аллеля, которая обозначается символом (р). По определению эта величина равна отношению числа алле лей данного типа к общему числу аллелей исследуемого локуса в наблюдае мой выборке. Величину (р) называют также аллельной частотой. Ее опреде ляют эмпирически, на основании результатов популяционных исследова-J ний.

Помимо вероятности аллеля, другой важной характеристикой является частота встречаемости аллеля в популяции — так называемая статистичесЛ кая частота аллеля. Она обозначается символом (q). Обращаем внимание на то, что этот параметр, хотя и «созвучен» аллельной частоте, отличается от нее как по величине, так и по смыслу. Для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди—Вайнберга, величина (q) связана с величиной (р) соотношением q = 2р—р2. Она также может быть определена на основа нии данных популяционных исследований: статистическая частота аллеля — это отношение числа генотипов, в которых присутствует данный аллель, к общему числу всех возможных генотипов в популяционной выборке.

Из этого определения следует, что, например, в экспертизе спорного отцовства именно статистическая частота аллеля (q) должна фигурировать как мера распространенности в популяции индивидуализирующего призна ка, присущего сравниваемым субъектам (ребенку и предполагаемому отцу) и используемого в целях идентификации биологического отца ребенка.

Иными словами, это и есть мера индивидуализирующего значения призна ка, в данном случае аллеля: величина (q) служит тем параметром, который определяет шансы любого (случайного) мужчины, имеющего данный ал лель в генотипе, считаться биологическим отцом любого ребенка, у которо го этот конкретный аллель был идентифицирован как отцовский.

В случае же идентификации личности в качестве индивидуализирующе го признака, имеющего идентификационное значение, выступает уже не отдельный аллель, а целиком локальный генотип. Напомним, что для каж дого отдельного локуса это комбинация двух аллелей, которые могут быть разными (aj;

аг — гетерозиготное состояние), а могут оказаться и одинако выми (ai;

ai — гомозиготное состояние). Поэтому в этом случае для количе ственной оценки индивидуализирующего значения признака используют статистическую частоту генотипа, а именно, частоту встречаемости кон кретного профиля ДНК в популяции. Эту величину иногда обозначают символом Q;

ее определяют эмпирически на основании данных популяци онных исследований или же рассчитывают, исходя из величины вероятности каждого аллеля (ра, и р-а) на основании закономерностей менделевского на следования. Для гетеро- и гомозиготного генотипов расчетные величины Q соответственно равны: Q = 2 • ра, • р02 и Q = ра,2. Важно, однако, подчеркнуть, что в современной мировой практике для расчета 2статистической частоты гомозиготных профилей вместо выражения Q = ра, обычно применяют ис кусственную, но более консервативную оценку Q = 2р для компенсации эффекта ложной гомозиготности. (Приведенные формулы справедливы только для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди— Вайн берга.) Таким образом, в случае идентификационного исследования величина Q служит параметром, который определяет шансы любого (случайного) че ловека, имеющего данный генотип, считаться именно тем лицом, от кото рого произошла любая ДНК с этим генотипом.



Pages:     | 1 |   ...   | 17 | 18 || 20 | 21 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.