авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |

«IV Всероссийский симпозиум с международным участием ‡ ‚ ‡‚ ‡‡„ Сборник тезисов симпозиума 21-22 апреля 2010 Санкт-Петербург ...»

-- [ Страница 7 ] --

Для определения степени активности остеогенеза сопоставляли морфологи ческие и рентгенологические данные, а так же данные статистической обработки. КПМ по степени активности распределились следующим образом от максимальной при ис пользовании «Депротекс»+БоТП, до минимальной активности при – «Депротекс». Это связано с типом КПМ. «Депротекс», содержит депротеинизированную костную муку, которая является природным гидроксиапатитом, и строительным материалом для фазы минерализации костной ткани. Его рентгенологическая плотность выше плотности кос тной ткани и сразу после пластики визуализируется как участки затемнения в диастазе ребер, а через 30 суток как гомогенный участок высокой плотности.

выводы. Использование костно-пластических материалов на основе гидрок сиапатита в сочетании с БоТП, как источника аутогенных факторов роста приводит к ускорению остеогенеза в ранние сроки и формированию органотипического регенерата в последующие сроки наблюдения, поскольку БоТП инициирует процессы костеобразо вания на начальных стадиях, а «Депротекс» – фазу минерализации.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия оЦенка биоЛоГиЧеСкоЙ приГоДноСти ДеминераЛизованноЙ коСтноЙ ткани ДЛЯ иСпоЛЬзованиЯ в каЧеСтве транСпЛантатов в кЛиниЧеСкоЙ практике колтовой н.а., колокольчикова е.Г., конюшко о.и., бочарова в.С.

НИИ Скорой Помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва It was applied special Biostation for automatic registration of interaction fi broblast cell cultures M27 line and transplant. It was evaluate suitability of transplant for transplantations.

введение. Культивированные в условиях in vitro клетки используются для оценки биологических и токсических свойств различных материалов. Для динамичес кого наблюдения за живыми клетками в условиях культивирования in vitro традиционно применяется метод цитраферной съемки (регистрация изображений через определенные интервалы времени). В настоящее время технические возможности позволяют исклю чить методические недостатки цитраферной съемки. Для этих целей была использова на автоматическая станция для наблюдения за поведением живых клеток – Biostation IM (Nikon). Возможности станции позволяют наблюдать и регистрировать в реальном масштабе времени динамические изменения формы и структуры клеток, находящихся в стандартных культуральных условиях (температура –37оС, влажность – 95%, содержа ние CO2 – 5%). Регистрация изображений может осуществляться в большом количестве полей зрения длительное время (3-4 суток).

Цель исследования. Разработать критерий оценки качества деминерали зованного костного матрикса человека для использования в качестве трансплан татов для восстановления костно-хрящевой ткани с помощью культивируемых фибробластов.

материалы и методы. Биостанцию использовали для оценки биологических свойств деминерализованного костного матрикса человека. Использовались фиброблас ты линии М27 (НИИ Полиомиелита и Вирусных Энцефалитов РАМН) на уровне 19- пассажа. Наблюдение за клетками производилось с помощью метода фазового контрас та (увеличения – 20х, 40х, 80х), витальные красители не использовались.

результаты. В процессе наблюдения установлено направленное движение фибробластов к деминерализованному костному матриксу. Зарегистрированы различные варианты перемещения фибробластов, измерены скорости перемещения фибробластов.

Получены данные о митотической активности фибробластов линии М27 в присутствии деминерализованного костного матрикса. Наблюдался различный характер прохожде ния митозов в зависимости от длительности культивирования, зафиксированы времен ные различия в прохождении фаз митоза.

выводы. Автоматическая регистрация с помощью Биостанции характера по ведения культивируемых фибробластов в присутствии деминерализованного костного матрикса позволяет произвести оценку степени биологической пригодности и отбор об разцов для изготовления трансплантатов.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия муЛЬтипотентнЫе мезенХимаЛЬнЫе СтромаЛЬнЫе кЛетки в терапии меСтнЫХ ЛуЧевЫХ пораЖениЙ котенко к.в., бушманов а.Ю., мороз б.б., онищенко н.а., Дешевой Ю.б., Лебедев в.Г., еремин и.и., расулов м.Ф., Сидорович Г.и., Слободина т.С., Дубицкий С.е.

ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова, Москва In the course of work preclinical trials have been taken which have shown efficiency of mesenchymal stem cells application in treatment of the local radiation injuries invoked by a local beta irradiating in rats. After that some patients with radial and thermal burns have been treated with MMSC. As a result, full healing of the deep radial ulcers resistant to conservative therapy has been reached, and terms of a cuticularization of burn surfaces are considerably reduced.

Местные лучевые поражения возникают в результате локального облучения при авариях с источниками ионизирующих излучений. При тяжелых местных лучевых поражениях в ряде случаев лечение оказывается неэффективным, особенно при возник новении поздних язв, когда необходимо хирургическое вмешательство.

Исследовалось влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных кле ток (ММСК) костного мозга на течение лучевых ожогов у крыс Вистар после локального бета-облучения источником 90Sr/90Y в дозе 140 Гр при различных условиях и способах трансплантации клеток. Установлено, что трансплантация ММСК на поверхность уже сформировавшейся язвы через 21 сутки после облучения ускоряет заживление кожной раны. Подкожное введение ММСК в ранние сроки после облучения (в период прояв ления влажного дерматита) приводило к уменьшению степени лучевого поражения и стимуляции процессов заживления.

После проведения испытаний на животных, в рамках научно-исследова тельской работы, с одобрения протокола исследований этическим комитетом и после подписания пациентом информированного согласия, были проведены ограниченные клинические испытания. Нескольким пациентам с хроническими лучевыми язвами или термическими ожогами различной степени тяжести, наряду со стандартной схемой ле чения, были трансплантированы аутогенные мультипотентные мезенхимальные стро мальные клетки костного мозга, выращенные ex vivo. Клетки трансплантировались на поверхность ран при помощи фибринового клея. Полимеризующийся на поверхности раны, фибриновый клей создавал защитную гемостатическую пленку, под которой про исходил процесс эпителизации. В результате было достигнуто полное заживление глу боких лучевых язв, неподдающихся консервативной терапии, и значительно сокращены сроки эпителизации ожоговых поверхностей, что позволило некоторым пациентам избе жать дополнительных операций по пересадке кожи.

Применение ММСК может быть целесообразным для лечения тяжелых мест ных лучевых поражений, ожогов различной этиологии, длительно незаживающих ран.

Оптимальные условия применения клеточной терапии в этих условиях подлежит даль нейшему изучению.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия ДеДиФФеренЦировка куЛЬтивируемЫХ кЛеток ретинаЛЬноГо пиГментноГо ЭпитеЛиЯ ГЛаза взроСЛоГо ЧеЛовека кузнецова а.в., милюшина Л.а., микаелян а.С., александрова м.а.

Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва The dedifferentiation is one of approaches for stem or progenitor cells generation for cellular therapy. In this study the differentiation states of cultured adult human retinal pigment epithelium (ahRPE) cells was established. In PCR of native ahRPE cells, monolayer and spheroid-like colonies of cultured primary and subcultived ahRPE cells the expression of the pluripotent markers, such as Nanog, Oct4 and Pax-6 were detected. Immunocytochemical analysis of cultured ahRPE cells showed expression of Pax-6 which involved in the develop ment of structures, usually derived from ectodermal tissues. Moreover our findings demon strate that mature human RPE cells have the capacity to express a neuron-associated gene in response to conditions that promote dedifferentiation.

Дедифференцировка соматических клеток является одним из возможных пу тей получения стволовых клеток для терапевтических целей.

Целью исследования явилось изучение дифференцировочного потенциала ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза взрослого человека в культуре.

материалы и методы. РПЭ выделяли из глазных яблок, полученных при ау топсии от 27 доноров в возрасте 24-73 лет. Первичную культуру выращивали на сыворо точной среде в пластиковых флаконах площадью 25 см2. Субкультивирование проводили на двух альтернативных средах, сывороточной и бессывороточной. Бессывороточную среду использовали для получения сфер в суспензионной культуре. Для ИЦХ харак теристики культур использовали: Pax6, CD133, нестин, -тубулин-III, нейрофиламен ты (NF), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), N-кадгерин, коннексин-43, RPE65, клеточный ретиналдегид-связывающий белок (CRALBP), Recoverin, Factor Von Willebrand, hSTRO1, коллаген I типа, фибронектин (FN), -гладкомышечный актин ( SMA), Ki67. При ПЦР культур РПЭ исследовали сигнальные белки (TGFbeta2, PEDF), транскрипционные факторы (Oct4, Nanog, Pax6, Pitx2, FoxC1, Prox1) и маркеры диффе ренцировки (RPE65, Recoverin, Nestin, -tubulin-III, Musashi 1, GFAP, NS).

результаты. Клетки РПЭ in vitro активно пролиферировали, мигрировали, де пигментировались, приобретали веретенообразную форму. При ИЦХ клетки РПЭ теря ли маркеры исходной дифференцировки (RPE65, CRALBP) и экспрессировали маркеры, отвечающие за адгезию, клеточную миграцию и тканевую контракцию (FN, коллаген I типа, N-кадгерин, -SMA), а также маркеры плюрипотентных клеток (Pax6), что сви детельствует о дедифференцировке клеток в культуре. Кроме того, культивированные клетки РПЭ экспрессировали маркеры НСК (нестина, -тубулина-III и др.), свидетельс твующее о проявлении ими пронейральных свойств. Результаты ПЦР подтвердили дан ные ИЦХ: клетки РПЭ экспрессировали нейральные маркеры (-tubulin-III и Musashi 1) и маркеры «стволовости» (Nanog, Oct4 и Pax-6). Причем уровень экспрессии гена Nanog был выше в сфероподобных структурах, чем в прикрепленных клетках. Признаки де дифференцировки были ярче выражены в клеточных культурах медленнее выходящих 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия в монослой при первичной посадке, т.е. в клетках с фибробластоподобной и смешан ной морфологией. Эти признаки сохранялись на ранних пассажах и исчезали по мере пассирования.

выводы. В клетках РПЭ глаза взрослого человека in vitro происходят фе нотипические и молекулярно-генетические изменения. Фенотип клеток РПЭ in vitro определяется вначале плотностью посадки, затем клетки РПЭ in vitro претерпевают де дифференцировку, происходящую в присутствии сыворотки в среде культивирования.

Дедифференцировка – это промежуточное состояние клеток РПЭ, индуцированное ус ловиями in vitro. Направленная индукция in vitro приводит зрелые клетки РПЭ взрос лого человека к экспрессии маркеров плюрипотентности, пролиферации, миграции, изменению фенотипа и, наконец, к проявлению клетками пронейральных свойств.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-00081 и 08-04-00462.

СтимуЛЯЦиЯ коСтноЙ реГенераЦии у травматоЛоГиЧеСкиХ боЛЬнЫХ С помоЩЬЮ компонентов аутопЛазмЫ крови Лунева С.н., Самусенко Д.в., Гребнева о.Л.

ФГУ «Российский научный центр «Восстановительной травматологии и ортопедии»

им. академика Г.А. Илизарова Росмедтехнологий», г. Курган Effect of autoplasma components on regeneration of bone tissue was studied in pa tients with comminuted femoral fractures. Comparison group showed longer period of regen erate formation, and deformities after frame removal, whereas index group (with usage of autoplasma) showed none of these complications.

Цель исследования. Изучение воздействия компонентов аутоплазмы крови на регенерацию костной ткани у больных с оскольчатыми переломами бедра.

материалы и методы. Способ стимуляции репаративного остеогенеза был применен у 12 больных с многооскольчатыми и раздробленными переломами бедра (ос новная группа). Группу сравнения составили 25 пациентов с аналогичными диагнозами без стимуляции компонентами аутоплазмы крови. Для лечения больных использовали метод внешнего остеосинтеза аппаратом Г.А. Илизарова по методикам, разработанным в ФГУ РНЦ «ВТО». Забор крови проводили на 14-21-е сутки после травмы. Технология получения компонентов плазмы включала процедуры осаждения, гель-проникающей хроматографии, диализа, лиофилизации и стерилизации. Показанием для забора крови в целях проведения стимуляции считали наличие двойных продольно расколотых и мно гооскольчатых переломов диафиза бедра, что позволяло предполагать увеличение сроков консолидации и органотипической перестройки костной мозоли. Показанием для введе ния препарата считали замедленное появление костной мозоли или снижение темпов ее минерализации, определяемое непрямым методом при помощи фотоденситометрии рент генограмм. Введение препарата проводили в сроки 6-7 недель после травмы. Для купиро вания кратковременных гиперергических реакций и с целью их профилактики назначали антигистаминные, десенсибилизирующие препараты, инфузионную терапию.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия результаты. Было обнаружено, что в группе сравнения наблюдались более длительные сроки созревания регенерата, а также деформации после демонтажа аппа рата. В основной группе таких осложнений не наблюдали. При сравнении пациентов с идентичными показателями (возраст, пол, характер травмы, локализация и характер перелома, величина смещения) у четырех пар больных были выявлены существенные различия в сроках и/или результатах лечения. Полученные данные доказывают перс пективность применения компонентов плазмы крови в качестве стимуляторов костной регенерации.

кЛетоЧнЫЙ ноСитеЛЬ аутоГеннЫХ ЭпитеЛиаЛЬнЫХ проГениторов роГовиЦЫ ЧеЛовека макеев о.Г., коротких С.а., князева е.С., Герасимов м.Ю., зверева а.е.

ГОУ ВПО «Уральская Государственная Медицинская Академия Росздрава», ГУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», г. Екатеринбург Тhe purpose of the study is to develop a method of obtaining corneal graft using surface of soft contact lenses as the substrate for the cultivation of autologous cells.

It was shown that the Pure Vision ® (Balafilcon A) and Biofinity ® (Comfilcon A) lenses are promising carriers for the cultivation of autologous cells.

Восстановление прозрачности роговицы составляет важную проблему совре менной офтальмологии, решение которой требует разработки новых методологических подходов.

Цель исследования. Получение биотрансплантанта эпителиальных прогени торов роговицы человека на поверхности мягкой контактной линзы.

По протоколу, одобренному этическим комитетом ГОУ ВПО УГМА Росздрава, от трех пациентов, оперированных по поводу катаракты, после заполнения испытуемы ми добровольного информированного согласия, получали биоптаты роговицы из облас ти лимба. В течение 4-х недель культивирования (среда DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки) получали стабильную культуру клеток роговицы человека. На мо мент нанесения на линзу, культура содержала кератоциты (85%) и эпителиальные про гениторы (15%).

Для исследования были отобраны 3 вида линз с отсутствием кислород-опос редованного влияния на дыхание культивируемых клеток: Biofinity® (Comfilcon A), Pure Vision® (Balafilcon A) и Acuvue® Oasys (Senofilcon A). В исследовании использовали по линзы каждого вида. Суспензию клеток в количестве 2Ч105 наслаивали на роговичную поверхность контактных линз, и далее культивировали в течение 10 суток.

При исследовании витальных препаратов оказалось, что на всех исследуемых линзах первичный слой формируют фибробластоподобные кератоциты, с наибольшей эффективностью клонирования на линзах Biofinity® и Pure Vision®. В первом случае об разовывались упорядоченные колонии, из которых к восьмым суткам формировался мо нослой кератоцитов. При этом наблюдалась хаотичная адгезия кератоцитов с быстрым формированием монослоя на роговичной поверхности линзы. В отличие от кератоцитов 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия эпителиальные прогениторные клетки ни в одном случае не образовывали на поверх ности линз первичные колонии. Наиболее активно вторичное колониеобразование на блюдалось на монослое кератоцитов на поверхности линз Pure Vision®: сначала в виде адгезии единичных эпителиоцитов, а к восьмым суткам – с признаками колониального роста.

На линзах Acuvue® Oasys к восьмым суткам была отмечена только фиксация отдельных клеток с остановкой дальнейшего роста.

вывод. Линзы Pure Vision® (Balafilcon A) и Biofinity® (Comfilcon A) являются перспективными клеточными носителями аутогенных эпителиальных прогенеторов ро говицы человека.

кЛетоЧно-тканеваЯ терапиЯ при ЛеЧении боЛезни пертеСа макушин в.Д., тепленький м.п., парфенов Э.м.

ФГУ «Российский научный центр «Восстановительной травматологии и ортопедии»

им. академика Г.А. Илизарова Росмедтехнологий», г. Курган The dynamics of reparative processes in the femoral head of 11 patients with Perthes diseases after operative treatment has been studied. Trans-articular introduction of cellular articular suspension accelerates organotypic reconstruction of the epiphysis in hip osteochon dropathy at the fragmentation stage.

Цель исследования. Изучить динамику репаративной остеорегенерации в эпифизе головки бедренной кости при болезни Пертеса.

материалы и методы. Проанализирована динамика рентгенологических показателей головки бедренной кости в послеоперационном периоде у 11 пациен тов с остеохондропатией тазобедренного сустава в стадии фрагментации эпифиза.

Средний возраст составил 7±1 год. Оперативное вмешательство включало: лаваж с оздоровлением среды тазобедренного сустава, введением в пораженный эпифиз 2- мл клеточно-тканевой суспензии, полученной из костномозговой полости больше берцовой кости пациента, остеосинтез аппаратом «Фиксарт» (Патент РФ № 54305) для центрации головки бедра во впадине и поддержания постоянной ширины сустав ной щели. Продолжительность лечения в стационаре составила 70-90 дней. В даль нейшем после снятия аппарата пациентов переводили на амбулаторное наблюдение с рекомендациями исключения нагрузки на пораженный сустав. Использовали мо дифицированную повязку (жилет) Snуder. Вопрос о полной нагрузке на ногу решали после окончательной органотипической перестройки в эпифизе головки бедренной кости.

результаты и обсуждения. При изучении данных рентгенографии у всех па циентов отмечена в эпифизе головки бедренной кости положительная динамика в виде ускорения рассасывания некротизированных участков эпифиза, замещения новообразо ванной костной тканью, частичного восстановления структуры и субэпифизарных отде лов шейки бедренной кости, улучшение контуров головки.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия выводы. Трансартикулярное введение клеточно-тканевой суспензии ускоряет органотипическую перестройку головки бедренной кости при остеохондропатии тазо бедренного сустава. Применение аппарата «Фиксарт» обеспечивает поддержание посто янства суставной щели.

поЛуЧение инДуЦированнЫХ пЛЮрипотентнЫХ СтвоЛовЫХ кЛеток из ФетаЛЬнЫХ неЙраЛЬнЫХ СтвоЛовЫХ кЛеток ЧеЛовека медведев С.п., 1Григорьева е.в., 1Шевченко а.и., 1малахова а.а., Дементьева е.в., 1Соболев и.а., 2александрова м.а., 3,4плотников е.Ю., Сухих Г.т., 1,5закиян С.м.

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, 2Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва, 3НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a new type of pluripotent cell which can be obtained by overexpression of few genes during reprogramming of different somatic cells.

The aim of the study was to obtain human iPSCs from fetal neural stem cells without a genetic modification of genome. In our work reprogramming was carried out using a transient trans fection of the human fetal neural stem cells with two plasmid vectors. The pCAG2LMKOSimO polycistronic vector carrying the mouse Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc gene cDNA in one case and the phOct4-IRES-DsRed2 plasmid containing coding region of the human OCT4 gene in the other case were used. As a result human iPSCs possessing all the properties of pluripotent cells were obtained. Thus, it has been shown that iPSCs can be obtained from fetal neural stem cells without a genetic modification of genome by transient expression of the only one gene, OCT4, and can be used in a range of fundamental and clinical studies.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представля ют собой новый тип плюрипотентных клеток, которые могут быть получены в ходе репрограммирования различных типов соматических клеток за счет сверхэкспрессии нескольких генов. Такие клетки по своим характеристикам и свойствам сходны с эм бриональными стволовыми клетками (ЭСК) и могут быть использованы в различных фундаментальных и прикладных исследованиях, в том числе, в заместительной кле точной терапии заболеваний человека. Одним из основных ограничивающих факто ров использования ИПСК в клинических исследованиях является «замусоривание»

генома клеток чужеродной ДНК, особенно при использовании ретро- и лентивирус ных векторов.

Целью данной работы было получение ИПСК человека из фетальных нейраль ных стволовых клеток (НСК) без генетической модификации генома. Репрограммирование было осуществлено в результате временной трансфекции НСК векторами двух типов. В одном случае был применен полицистронный вектор pCAG2LMKOSimO несущий кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши, в другом случае – плазмида phOct4-IRES-DsRed2, 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия содержащая кодирующую часть гена OCT4 человека. На 9-й день после трансфекции были обнаружены первые колонии клеток морфологически сходные с ЭСК человека.

Выделенные в ходе эксперимента клоны ИПСК человека, сходны с ЭСК по способу рос та и морфологии, экспрессируют щелочную фосфатазу. Иммуноцитохимический анализ показал, что ИПСК человека полученные из фетальных нейральных стволовых клеток экспрессируют маркеры ЭСК человека: транскрипционные факторы NANOG и OCT4, поверхностные антигены SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81. ОТ-ПЦР анализ транскрипции 21-го гена показал, что полученные ИПСК имеют сходный с ЭСК паттерн экспрессии генов. С помощью иммуноцитохимического окрашивания полученных из ИПСК эмб риоидных телец на экспрессию маркеров дифференцировки показали, что полученные нами ИПСК человека дифференцируются в производные трех зародышевых листков, что характерно для плюрипотентных клеток. Методом ПЦР было обнаружено, что ИПСК полученные с помощью плазмиды phOct4-IRES-DsRed2 не несут в геноме встроек плаз мидной ДНК. Таким образом, было показано, что плюрипотентные клетки могут быть получены из фетальных нейральных стволовых клеток без генетической модификации генома, посредством временной экспрессии всего одного гена – OCT4 и могут быть ис пользованы во всем спектре фундаментальных и клинических исследований.

оСобенноСти куЛЬтивированиЯ камбиаЛЬнЫХ кЛеток роГовиЧноГо ЭпитеЛиЯ милюдин е.С., 2волова Л.т., 2россинская в.в., 1милюдин а.е.

НИИ офтальмологии, 2Институт экспериментальной медицины и биотехнологий, ГОУВПО «Самарский Государственный Медицинский Университет Росздрава», г. Самара Aim of this research to develop technology of a harvest and growing allogenic stem cells of corneal epithelium from donors-corpses.

Donor materials have been harvested from eighteen donors eyes for growing cor neal epithelium cells. Growth of corneal epithelium cells were received in both experimental groups. But in the second group, despite careful processing of donor eyes, the allogenic cellular material has appeared infected. In 77% cases the bacterial flora was resistant to antibiotics:

gentamycin, vancomycin, lincomycin, ampicillin. The most activity, concerning the revealed microorganisms, in 92% cases possessed ciprofloxacin.

The technique of a material harvest during experiment allows to receive in enough stem corneal epithelium cells. The created standard conditions provide good growth and dou bling of density of culture within three days. A donor material, which was harvest at donors corpses for growth corneal epithelium, more contaminate, than the cellular material taken at performance of surgical operation at live donors.

В последние годы многие авторы рассматривают трансплантацию культиви рованных стволовых клеток как наиболее перспективный метод, позволяющий влиять на ход репарации тканей организма человека. Одной из важных областей клинического применения культивированных клеток является лечение патологических изменений по верхностного эпителия роговицы глаза.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия Цель данного исследования. Разработать технологию получения и культиви рования аллогенных лимбальных клеток от доноров-трупов.

материал и методы. Всего в двух группах было выполнено восемнадцать заборов донорского материала для культивирования клеток роговичного эпителия. В первой группе донорский материал забирали у пяти больных с посттравматическим увеитом. Участки лимбальной ткани толщиной от 100 до 200 мкм иссекали трепаном х1,0 мм во время выполнения энуклеации. Во второй группе донорский материал заби рали у доноров-трупов в течение первых 12-18 часов после наступления смерти. После стандартной обработки глазного яблока в растворах антисептиков и антибиотиков по периметру лимба трепаном х1,0 мм иссекали 6-8 кусочков ткани толщиной от 100 до 200 мкм.

Фрагменты лимбальной ткани помещали в питательную среду с антибиотика ми (ампицилин 5000 ед/мл, стрептомицин 5 мг/мл, гентамицин 10мг/мл) и транспортиро вали в лабораторию культивирования клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. В лаборатории по стандартным протоколам выделяли кле точный материал и в последующем культивировали в пластиковых культуральных фла конах фирмы «Costar» объемом 50 мл в среде МЕМ.

результаты. Рост клеток роговичного эпителия получен в обеих эксперимен тальных группах. В первой группе удвоение плотности культуры происходило быстро, в течение первых – третьих суток. По форме культивированные клетки были однородно мелкие, кубоидальные, ядерно-цитоплазменный индекс приближался к значению 1:1.

На втором этапе, через 5-7 дней культивации клеток при 37°C с содержанием 5% CO в подаваемом в инкубатор воздухе, осуществляли нанесение культуры эпителиальных клеток на матрицу диаметром 12 мм. В качестве матрицы использовали предварительно подвергнутую специальной физической и химической обработке силиковысушенную амниотическую мембрану. Полученную структуру помещали в питательную среду для сохранения до трансплантации.

Во второй группе, несмотря на тщательную обработку донорских глаз ал логенный клеточный материал оказался инфицированным. В структуре выделенных микроорганизмов превалировали Staphylococcus spp., а именно, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus aureus в 70% (n=9) случаев. В единичных случаях идентифицировались Enterobacter cloacae, Enterococcus durans, Kocuria varians. Грамотрицательных бактерий и грибов не выявлено.

В 77% (n=10) случаев бактериальная флора была резистентной к антибиотикам гентамицин, ванкомицин, линкомицин, ампицилин. Наибольшей активностью в отно шении выявленных микроорганизмов в 92% (n=12) случаев обладал ципрофолоксацин.

Таким образом, отработанная в ходе эксперимента методика забора материала позволяет получить в достаточном количестве культуры клеток роговичного эпителия.

Созданные стандартные условия обеспечивают хороший рост и удвоение плотности культуры в течение трех суток. Донорский материал при заборе у кадавров для куль тивирования клеток роговичного эпителия более контаминирован, чем клеточный ма териал, взятый при выполнении хирургической операции у живых доноров и требует совершенствования методов и средств для предварительной обработки кадаверных глаз.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия вЫЖиваемоСтЬ ХрЯЩевЫХ орГаннЫХ куЛЬтур вне питатеЛЬнЫХ СреД на поДЛоЖкаХ из криСтаЛЛов арСениДа ГаЛЛиЯ никитюк и.е., Гаркавенко Ю.е., афоничев к.а.

Научно-исследовательский детский ортопедический институт им. Г.И.Турнера Росмедтехнологий, Санкт-Петербург The elastic cartilage incubated in complete absence of trophicity may not only re main viable but also demonstrate an ability to regenerate itself in a location close to monocrys tals of gallium arsenide. The study of these identified patterns is promising for development of implants based on semiconducting materials for optimizing the survival of cartilage in transplantations.

В настоящее время развитие современных медицинских технологий требует продолжения поиска адекватных воздействий на биологические ткани с целью повышения их репаративного потенциала и жизнеспособности при трансплантации. В последние годы достоверно обнаружены эффекты воздействия структурных форм, таких как кристаллы, на процессы, протекающие в биологических системах (Петраш В.В. и др. 2007). Природа этого взаимодействия пока не выяснена, хотя хорошо показан его эффект, проявляющийся в продлении жизнеспособности хрящевых эксплантатов (Никитюк И.Е. и др. 2009).

Целью настоящего исследования явилось изучение на модели эластического хряща влияния кристаллов полупроводниковой природы на репаративную способность хрящевой ткани в условиях полного отсутствия трофики.

материал и методы.

Исследование проведено на 6 кроликах породы шин шилла в возрасте от 6 месяцев до 1 года. У каждого животного в области кончика левого уха выстригали шерсть и под проводниковой анестезией 2% раствором новокаина про изводили иссечение концевого отдела ушной раковины. Из каждого эксплантата ушной раковины исссекали четыре фрагмента размерами 1,0х1,0 см, которые упаковывали в тонкую полиэтиленовую пленку толщиной 30 мкм для изоляции от среды. Все образ цы, содержащие ткань эластического хряща, укладывали на текстолитовые подставки в пластиковые контейнеры, в которых поддерживалась относительная влажность воз духа 100%. В опытной группе под каждый фрагмент ушной раковины укладывали мо нокристалл арсенида галлия (GaAs), общая площадь которого составляла ј от площади фрагмента. Под фрагменты ушной раковины контрольной группы полупроводниковые кристаллы не укладывали. Контейнеры с образцами контрольной и опытной групп вы держивали в термостате при температуре 37°С. Их извлечение из термостата и гистоло гическое исследование производили каждый день в течение 3 суток.

результаты. По сравнению с контрольными образцами, которые полностью некротизировались на следующие сутки инкубации, строение эластического хряща опытной группы весь период было с незначительными дистрофическими изменения ми, несмотря на отсутствие трофики. В структуре хряща, термостатированного на по лупроводниковом кристалле, отмечалась вакуолизация хондроцитов, при этом они из округлых превратились в полигональные с некоторым увеличением объема. Хотя ок рашиваемость их ядер основными красителями была снижена, вместе с тем структура хрящевой ткани имела отличительный признак, а именно: наличие тенденции к реге 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия нерации хондроцитов. Это проявлялось как за счет деления самих хондробластов, при лежащих к надхрящнице, так и за счет деления хондрогенных клеток надхрящницы по обеим сторонам хрящевой пластинки. То есть, эластический хрящ проявил способность к интерстициальному (внутритканевому) и аппозиционному (за счет продукции клеток надхрящницы) росту, несмотря на то, что необходимым условием протекания указан ных процессов является обеспечение оптимальной трофики.

вывод. Эластический хрящ, инкубированный при полном отсутствии пита ния, может не только сохранять жизнеспособность, но и проявлять способность к регене рации в условиях нахождения вблизи с монокристаллами арсенида галлия. Дальнейшее изучение выявленных закономерностей перспективно в плане разработки имплантатов на основе полупроводниковых материалов для оптимизации приживления хрящевой ткани при ее трансплантации.

резюме. Эластический хрящ, инкубированный при полном отсутствии пита ния, может не только сохранять жизнеспособность, но и проявлять способность к реге нерации в условиях нахождения вблизи с монокристаллами арсенида галлия. Изучение выявленных закономерностей перспективно в плане разработки имплантатов на основе полупродводниковых материалов для оптимизации приживления хрящевой ткани при ее трансплантации.

раССаСЫваЮЩиеСЯ матриЧнЫе материаЛЫ на оСнове Хитина и Хитозана, преДназнаЧеннЫе ДЛЯ меДиЦинСкиХ ЦеЛеЙ панарин е.Ф., 1нудьга Л.а., 1бочек а.м., 1петрова в.а., 1Гофман и.в., баклагина Ю.Г., 1Сапрыкина н.н., 2блинова м.и., 2Юдинцева н.м., Спичкина о.Г., 2кухарева Л.в., 3Самусенко и.а., 2пинаев Г.п.

Институт высокомолекулярных соединений РАН (ИВС РАН), 2Институт цитологии РАН, Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова, МЧС России, Санкт-Петербург The films and spongy materials based on chitin and chitosan with the collagen ad ditives, are developed to be used for replacement cell therapy. Both in-vitro and in-vivo tests of all materials under study have evidenced the absence of any toxic actions on the cultivated cells and on the tissues of organism. The matrices are stable in the conditions of cultivation and resorb completely in in-vivo conditions in 10 days after the transplantation. A method for pro ducing chitin fibers with modified surface, suitable for use as a biodegradable surgical suture material. On the basis of fibers can also be woven materials of different densities, suitable for use as a matrix for growing cells of human skin.

Получены пленочные и губчатые материалы на основе хитина и хитоза на с добавками коллагена, предназначенные для заместительной клеточной терапии.

Проведенные испытания всех материалов in vitro и in vivo продемонстрировали отсутс твие токсического эффекта на культивируемые клетки и на живую ткань организма.

Матрицы устойчивы в условиях культивирования и полностью резорбируют в условиях in vivo через 10 дней после трансплантации. Разработан способ получения хитиновых 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия волокон с модифицированной поверхностью, пригодных для использования в качестве рассасывающегося хирургического шовного материала. На основе полученных волокон можно также получать тканые материалы разной плотности, пригодные для использо вания в качестве матриц для выращивания клеток кожи человека.

перСпективЫ применениЯ в транСпЛантоЛоГии муЛЬтипотентнЫХ муЛЬтипотентнЫХ мезенХимаЛЬнЫХ СтромаЛЬнЫХ кЛеток в СоСтаве ГиДроГеЛеЙ, микроСФер и ШирокопориСтЫХ криоГеЛеЙ на оСнове аЛЬГината петренко а.Ю., 1петренко Ю.а., 1правдюк а.и.,1ревенко е.б., иванов р.в., 2Лозинский в.и.

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАНУ, ул. Елизарова 23, г. Харьков, Украина, Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова, РАН, Москва Growth and induced differentiation of multipotential mesenchymal stromal cells (MMSC) from different sources within tissue engineered constructs on the base of alginate were investigated. MMSC are able to adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation into both alginate microbeads and wide-porous sponges, though for proliferation cell adhesion and spreading are necessary. Alginate is a promising material for incorporation of MMSC into hydrogels, microbeads and wide-porous sponges for following transplantation.

Цели. В настоящее время альгинаты используются в медицине, главным об разом, в качестве вспомогательных веществ при производстве лекарственных средств или в качестве биологически активных веществ в медицинских препаратах. Благодаря совокупности присущих альгинатам физико-химических свойств они могут найти ши рокое применение в тканевой инженерии в качестве носителей или матриц для клеток.

Перспективным клеточным компонентом для тканевой инженерии являются мульти потентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК). Целью работы явилось изу чение роста и дифференцировки ММСК in vitro в составе альгинатных микросфер и в криогелевых губках с модифицированными поверхностями пор, а также скорости за живления ожоговых ран при нанесении ММСК в смеси с альгинатным гидрогелем.

материалы и методы. ММСК выделяли из костного мозга или жировой ткани взрослого человека, а также тканей мезодермального происхождения плода в соответс твии с этическими нормами. После экспансии в монослойной культуре иммунофенотип клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии. ММСК смешивали с альги натным гидрогелем или инкапсулировали в альгинатные микрокапсулы, или заселяли криогелевые широкопористые губки. Пролифератицию ММСК в составе микросфер и широкопористых криогелей исследовали Alamar blue тестом. Дифференцировку в ади погенном и остеогенном направлениях осуществляли добавкой соответствующих ин дукторов в среду культивирования. Термическое повреждение кожи крыс моделировали прикладыванием металлической пластинки, нагретой до 200єС. ММСК в составе альги натного гидрогеля наносили на поверхность раны через 1 сутки после ожога.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия результаты. Цитофлуориметрические исследования показали, что клетки, изолированные из всех источников, после 4-го пассажа имели иммунофенотип, харак терный для мезенхимальных стромальных клеток (CD29+, CD44+, CD73+, CD105+, CD34-, CD45-). После инкапсуляции в микросферы или заселения широкопористых криогеле вых губок ММСК сохраняли сферическую форму и не пролиферировали. Модификация носителя путем ковалентной сшивки желатиновых наночастиц к поверхности пор уве личивала адгезивные свойства носителя. В ходе последующего культивирования в ши рокопористых криогелях с модифицированной желатином поверхностью пор ММСК пролиферировали и мигрировали, занимая весь объем носителя. Изучение дифферен цировочных возможностей показало, что ММСК способны дифференцироваться в ос теогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях как в составе альгинатных микросфер, так и в широкопористых криогелевых губках. Присутствие ММСК в составе альгинатного гидрогеля ускоряло заживление ожоговых ран, приводило к нормализа ции показателей периферической крови, а также уровня коллагена и неколлагеновых белков в межклеточном веществе дермы.

Рассматриваются вопросы о перспективах применения тканеинженерных конструкций на основе мезенхимальных стромальных клеток и альгинатных носителей в комбустиологии, стоматологии, пластической хирургии, ортопедии и травматологии.

Работа выполнена при поддержке совместного гранта РФФИ и ГФФИ Украины (проект № 09-04-90403-Укр_ф_а).

ЭФФективноСтЬ интрамиокарДиаЛЬноЙ транСпЛантаЦии аутоГеннЫХ СтвоЛовЫХ кЛеток у паЦиентов С иШемиЧеСкоЙ боЛезнЬЮ СерДЦа повещенко о.в., 1повещенко а.Ф., 1ким и.и., 1Янкайте е.в., 1Хабаров Д.в., Смагин а.а., 1комбанцев е.а., 2романов а.б., 2покушалов е.а., 1коненков в.и.

НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, ФГУ «НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», г. Новосибирск New strategy of treatment of patients with cardiovascular pathology is cellular car diomyoplastics. Intramyocardial injections of autologic stem cells after G-CSF mobilization by granulocyte-colony-stimulating factor might be useful as a new regenerative treatment in patients with ischaemic heart disease. Use of systems NOGA and XP allows to deliver stem cells in the most requiring sites of a myocardium.

Хроническая сердечная недостаточность является одной из распростра ненных и прогностически неблагоприятных осложнений патологий сердечно-сосудис той системы, наиболее частой причиной развития которой является ИБС. Не смотря на оптимальную терапию и электрофизиологическое лечение не всегда процесс ремоде лирования миокарда возможно приостановить. Новой стратегией лечения больных с кардиоваскулярной патологией является клеточная кардиомиопластика путем исполь зования различных клеточных материалов.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия Целью исследования является изучение эффективности интрамиокардиаль ного введения аутогенных стволовых клеток (мононуклеарной фракции) (МНК) пери ферической крови после мобилизации гранулоцитарным колоние-стимулирующим фактором (Г-КСФ).

материалы и методы. В исследование включены пациенты с ишемической болезнью сердца, не подлежащих прямой реваскуляризации миокарда ввиду наличия противопоказаний или неэффективности прямой реваскуляризации с III функциональ ным классом хронической сердечной недостаточности (ХСН) (по NYHA). Мобилизацию стволовых клеток из костного мозга проводили препаратом Грасальва, сепарирован ную кровь после мобилизации получали после цитафереза на аппарате Hemanetics.

Интрамиокардиальные инъекции осуществлялись системой NOGA XP в зоны гиберни рующего миокарда, которые определяются с помощью построения соответствующих карт при использовании навигационного катетера. Иммунофенотипирование проводи ли на проточном цитофлюориметре с использованием моноклональных антител.

результаты. Под действием G-CSF происходит эффективная мобилизация прогениторных клеток из костного мозга в периферическую кровь, что сопровождает ся повышением количества лейкоцитов в 5 раз и увеличением уровня CD34+ клеток в среднем в 7,9 раз. Эндотелиальные предшественники CD34+ CD133+ после мобилизации составляют в среднем 0,1% МНК. Трансплантированные клетки обладают высокой про лиферативной и функциональной активностью, реагируют на стимуляцию митогеном, около 11% клеток находятся в S/M фазах клеточного цикла, обладают низкой апопто тической активностью. В динамике через 6 и 12 месяцев после интрамиокардиального введения по данным NOGA XP отмечается увеличение зоны жизнеспособного миокарда и уменьшение области гибернированного миокарда в местах имплантации стволовых клеток. Тест 6-минутной ходьбы до лечения составлял 229±26 метров, через 6 месяцев после лечения – 364±95 метров, через 12 месяцев – 369±54 метра, 74% пациентов из III класса ХСН перешли во II класс, а 5 пациентов в I класс ХСН.

выводы. Аутотрансплантация мобилизованных стволовых клеток перифери ческой крови является высоко эффективным методом лечения ИБС, который позволяет улучшить качество жизни больных. Использование систем NOGA и XP позволяет доста вить СК в наиболее нуждающиеся участки миокарда.

метабоЛиЧеСкаЯ терапиЯ ГиперГомоЦиСтеинемиии и ДеФиЦита таурина – проФиЛактика оСЛоЖнениЙ транСпЛантаЦии орГанов поздеев в.к.

НИИ Гриппа СЗО РАМН, Санкт-Петербург Трансплантация органов диктует необходимость предупреждения осложне ний, связанных с нарушением метаболизма, в частности, аминотиолов и биологически активных аминокислот. Среди них существенное место занимает гипергомоцистеине мия и дефицит таурина.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия Цель исследования. Изучение обмена таурина, Tau;

аминотиолов (общего цистеина, tCys;

общего гомоцистеина, tHCy) при снижении функции печени и способов коррекции этих нарушений.

материалы и методы. Обследованы 14 здоровых волонтеров (20-45 лет) и больных хроническим гепатитом С (20-49 лет). Определение общего гомоцистеина, об щего цистеина и нейроактивных аминокислот осуществлялось по разработанному нами методу высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватиза цией орто-фталевым альдегидом и флуориметрическим детектированием*.

результаты. В плазме крови боьных концентрация tHCy в 2,5 раза выше (15, мкМ, p0,01) по сравнению с волонтерами (6,2 мкМ);

концентрация tCys (252,8±49, мкМ) в 1,5 раза выше нормы (172,3±35,3 мкМ, p0,02). Содержание Tau (29,2±8,8 мкМ) в 1,4 раза снижено по сравнению с нормой (40,9±13,3мкМ, p0,02). Уровень активности АлАТ повышен в 2-4 раза у 48 пациентов, АсАТ – у 44 пациентов. Стеатоз печени выяв лен у 22 пациентов.

обсуждение. Гипергомоцистеинемия активирует медиаторы воспаления (NF-k, IL-1, IL-6,IL-8);

оксидантный стресс (увеличивая продукцию внутриклеточ ного супероксидного аниона);

стресс эндоплазматического ретикулума, в частности, путем активации NF-k и JNK-протеинкиназы, запускающей программы апаптоза;

образование HCy-тиолактона, встраивающегося в структуру белков, снижающего их физиологическую активность и формирующего аутоиммунный ответ на HCy- тиолак тон-модифицированные белки.

Основные причины гипергомоцистеинемии: тяжелые поражения функ ции печени и почек разной этиологии, гипотиреоидизм, диабет, гетерозиготная му тация цистатионин--синтазы (1% популяции), гиповитаминозы В6, В12, фолиевой кислоты,трансплантация внутренних органов.Таурин – антиоксидант (активирует глутатионпероксидазу, предупреждает липопероксидацию), стабилизирует мембраны (нормализует сердечные ритмы), формирует парные желчные кислоты (включая гепа топротектор – таурохолевую), предупреждает осмотический стресс (накапливая К+, Мg+ в цитоплазме, активирует Са2+-зависимую АТФ-азу), предупреждает агрегацию тром боцитов, снижает уровень сахара в крови;

его дефицит связан с гиповитаминозом В6, низким содержанием в продуктах питания, мутациями декарбоксилазы цистеиновой и цистеинсульфиновой кислот.

выводы. 1. Необходима коррекция этих метаболических нарушений: сти мулирование инактивации HCy в течение 1-2 месяцев путем транссульфирования (пиридоксальфосфат 40-80 мг внутрь 2-4 раза в сутки) и одновременно реметилиро вания (В12 в/м по 100 мкг через день, фолиевая кислота 100-400 мкг внутрь);

антиок сидантная терапия (витамин С 500 мг 2 раза в день и витамин А 100000-300000 МЕ внутрь в сутки 1-2 месяца, токоферол 100-300 мг и селен 20-200мкг в сутки в/м 2- недели);

тауринотерапия – 200-400 мг в сутки внутрь 2-3 месяца (Орто-Таурин-Эрго или Витабс-Таурин).

2. ВЭЖХ-мониторирование аминотиолов и таурина в плазме крови втече ние всего периода наблюдения пациентов при проведении трансплантации органов и тканей.

*V.K.Pozdeev, N.V.Pozdeyev Determination of total aminothiols and neuroactive amino acids in plasma by high performance liquid chromatography with fluorescence detection // Biochemistry, Moscow,Supplement B, Biomedical Chemistry, 2010, v.4, № 3.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия морФоФункЦионаЛЬное СоСтоЯние оСновнЫХ иСтоЧников оСтеорепараЦии в завиСимоСти от интенСивноСти травмируЮЩеГо аГента попандопуло а.Г., 1буше в.в., 2оксимец в.м., 2магомедов Ю.а.

Государственное учреждение «Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К.Гусака АМН Украины», 2Научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького, г. Донецк, Украина The aim of the investigation is to study the morpho–functional state of the main osteocompetent cells lines out of the bone tissue failure zone by various density of traumatic agent mechanical effect. The experiment was performed on cells lines of periosium, endos tium and bone marrow-derived multipotential mesenchymal stromal cells (MMSC) which were taken out of the test animal (rats) bone fracture with simulated trauma of low and high density.

The morphological changes, proliferative activity and ability to differentiate on an osteogenic lineage have been studied. The dependence between above mentioned sources of osteorepara tion state and traumatic agent energy was established.

Проведены исследования, целью которых было изучение морфофункцио нального состояния трёх основных остеокомпетентных клеточных линий из зоны пов реждения костной ткани при различной интенсивности механического воздействия травмирующего агента.

Экспериментальные исследования выполнялись на клеточных линиях пери оста (1 группа), эндоста (2 группа) и ММСК костного мозга (3 группа), полученные из зоны перелома лабораторных животных (крысы) с моделированной травмой низкой (1-я подгруппа каждой группы) и высокой (2-я подгруппа каждой группы) интенсивности.

Контролем являлись клеточные линии эндоста, периоста и ММСК костного мозга интак тных животных. Оценку морфофункционального состояния осуществляли с помощью методов фазово-контрастной микроскопии для визуализации культур, МТТ – анализа для оценки пролиферативной активности и цитохимического метода с использованием субстрата BCIP/NBT Liquid Substrate System для детекции щелочной фосфотазы.

Клетки периоста первой подгруппы при культивировании формируют плот ную, упорядоченную структуру. Клетки второй подгруппы теряют эту способность и образуют сетевидную, не характерную для нормальных клеток периоста структуру. При постановке реакции с BCIP/NBT отмечали наличие продукции щелочной фосфотазы только клетками первой подгруппы.

Пролиферативная активность клеток периоста по данным МТТ-анализа в пер вой подгруппе была в 1,6 раза, а во второй в 1,4 раза выше, чем контрольное значение.

Различия между пролиферативной активностью клеток периоста первой и второй под группы также были достоверны, хотя и менее выражены.

Клетки эндоста первой подгруппы имели округлую форму, характерную для остеобластных клеток. Монослой упорядочен. Во второй подгруппе визуализирова лись фибробластоподобные клетки веретенообразной формы. Монослой образован клетками разной формы – от веретенообразных до крупных округлых клеток и клеток неправильной формы с цитоплазматическими отростками. При детекции продукции 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия клетками эндоста щелочной фосфотазы положительную реакцию наблюдали только в первой подгруппе.


Пролиферативная активность клеток эндоста по данным МТТ-анализа первой подгруппы практически не отличалась от контрольных значений, а активность эндос тальных клеток второй подгруппы была достоверно выше контрольных значений и про лиферативной активности клеток эндоста первой подгруппы.

При визуализации первичных культур ММСК костного мозга было отмече но, что количество адгезировавшихся к пластику клеток первой подгруппы, было зна чительно большее (примерно в 10-12 раз), чем ММСК второй подгруппы. Морфология клеток первичной культуры, а так же после пассирования в обеих группах была харак терной для данного клеточного типа.

По данным МТТ-анализа пролиферативная активность ММСК первой под группы была в 3,5 раза выше контрольных значений и в 1,4 раза, чем у ММСК второй подгруппы. Пролиферация ММСК второй подгруппы превышала контрольные значе ния в 2,5 раза.

Полученные данные свидетельствуют о том, что состояние вышеуказанных источников остеорепарации находится в зависимости от энергетики травмирующего агента.

муЛЬтипотентнЫе мезенХимаЛЬнЫе СтромаЛЬнЫе кЛетки как материаЛ ДЛЯ кЛетоЧноЙ терапии боковоГо амиотроФиЧеСкоГо СкЛероза рушкевич Ю.н., 2Шахбазов а.в., 3Гончарова н.в., 3петевка н.в., забродец Г.в., 3космачева С.м., 1Лихачев С.а., 3потапнев м.п.

ГУ РНПЦ неврологии и нейрохирургии, 2Институт генетики и цитологии НАН Беларуссии, ГУ РНПЦ гематологии и трансфузиологии, г. Минск, Беларусь ALS – is a neurodegenerative diseases characterized by progressive muscular weakness due to cerebral and spinal motoneurons death. There is no effective ALS treatment.

Multipotential mesenchimal stromal cells (MMSC) may consider as potentially effective treat ment. Our experiments have showed that MMSC may differentiate to cells with neuron-like phenotype especially in neural environment.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) – фатальное нейродегенератив ное заболевание, основой патогенеза которого является гибель моторных нейронов головного и спинного мозга, с развитием неуклонно прогрессирующей мышечной слабости. Распространенность БАС составляет 2-5 случаев на 100 000 населения, средний возраст начала болезни составляет 56 лет со средней продолжительностью жизни 3-5 лет от появления первых симптомов болезни [1]. Отсутствие эффективного лечения требует поиска новых терапевтических технологий. Одним из потенциаль ных методов лечения БАС может стать клеточная терапия с применением стволовых клеток. В литературе описывается трансплантация пациентам с диагнозом «БАС»

мультипотентных мезенхимальных стромальных леток (ММСК) костного мозга, 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия тем не менее, судить об эффективности терапии сложно, вследствие отсутствия ран домизированных исследований и незначительного количества наблюдений [2, 6].

ММСК, выделяемые из костного мозга – одна из наиболее исследованных плюри потентных популяций взрослого организма, которая в силу своей относительной доступности к выделению, способности к пролиферации и дифференцировке при культивировании in vitro и при реимплантации, имеет высокую значимость в клини ческой практике. Основным механизмом потенциально полезного действия ММСК при нейродегеративных заболеваниях, по-видимому, является их трофическая и им муномодулирующая функция. Исследования in vitro показали также возможность транс-дифференцировки – получения из ММСК нейрональных предшественников с последующей дифференцировкой их в клетки нервной ткани. На основе анализа экспрессии в индуцированных ММСК маркеров, специфичных для нервной ткани, электрохимических свойств клеток и секреции нейротрансмиттеров многие исследо ватели делают вывод о способности ММСК-производных нейроноподобных клеток выполнять функции клеток нервной системы [3]. В то же время, согласно данным P. Lu и соавт [4], нейрогенно индуцированные in vitro ММСК поддерживают рост аксонов при нейротравме на уровне, сопоставимом с нативными ММСК. Нами было ранее показано [5], что культивирование ММСК костного мозга человека в нейроген ных условиях приводит к приобретению частью клеток нейроноподобного фенотипа, что сопровождается экспрессией ряда молекулярных и иммуноцитохимических мар керов (NSE, МВР, МАР-2, -III-тубулин и др.). Последующие оценка и сравнение эф фекта трансплантации нативных либо индуцированных в нейрогенном направлении аутогенных ММСК костного мозга позволит расширить наше понимание принци пов действия и терапевтического потенциала стволовых клеток в клеточной терапии БАС и других нейродегенеративных заболеваний.

Andersen E.M., Borasio G.D., Dengler R., Hardiman O. Amyotrofic lateral sclero sis// Eur. J. of Neurol. 2005, 12:921-938.

L. Mazzini K. Mareschi, I. Ferrero et al., Stem cell treatment in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Journal of the Neurological Sciences (2008) 265: 78–83.

Long X., Olszewski M., Huang W. et al. Neural cell differentiation in vitro from adult human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. (2005). 14:65-69.

P. Lu, L.L. Jones and M.H. Tuszynski. BDNF-expressing marrow stromal cells sup port extensive axonal growth at sites of spinal cord injury. Experimental Neurology (2005) 191/2, 2005, 344-360.

Shakhbazau AV, Goncharova NV, Kosmacheva SM, Kartel NA and Potapnev MP.

Plasticity of human mesenchymal stem cell phenotype and expression profile under neurogenic conditions. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. (2009) V. 147(4): 513-516.

John T. Dimos, Kit T. Rodolfa,Kathy K. Niakan et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science August 2008:Vol. 321. no. 5893, pp. 1218 – 1221.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия ГепатоГеннаЯ ДиФФеренЦировка муЛЬтпотентнЫХ мезенХимаЛЬнЫХ СтромаЛЬнЫХ кЛеток, моДиФиЦированнЫХ биЦиСтроннЫм ЛентивируСнЫм вектором PHR-CMV-DREP Северин и.н., 2Гринев в.в., 2посредник Д.в., 1космачева С.м., 1потапнев м.п.

Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, Белорусский государственный университет, г. Минск, Беларусь We show highly efficient transfer of a newly-constructed bicistronic lentiviral plas mid pHR-CMV-DRep into human bone marrow multipotential mesenchymal stromal cells (BM hMMSC). Genetically modified BM-hMMSC sustain stable expression of transgenes for at least four weeks of cultivation. We also demonstrate the ability of genetically modified BM-hMMSC to differentiate along hepatic lineage as revealed by tests for glycogen storage and expression of specific genetic markers.

Способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток кост ного мозга (ММСК КМ), жировой ткани и пуповинной крови дифференцироваться в гепатогенном направлении в перспективе может быть использована для лечения заболе ваний печени. Помимо клеточной терапии широко обсуждают возможность применения генной терапии различных заболеваний в клинике. Применение ММСК в качестве кле точных векторов сдерживает низкая эффективность стандартных методов трансфекции в применении к ММСК. Лентивирусные вектора обеспечивают высокую частоту тран сдукции, стабильную интеграцию трансгена в хромосомальную ДНК;

для них менее характерно эпигенетическое подавление экспрессии трансгена;

лентивирусные вектор ные системы второго и третьего поколений включают целый комплекс модификаций и улучшений, гарантирующих их безопасность.

Целью работы было оценить эффективность генетической модификации ММСК КМ человека бицистронным лентивирусным вектором pHR-CMV-DRep, ус тойчивость экспрессии репортерных генов с данного вектора в условиях гепатогенной дифференцировки ММСК КМ, влияние генетической модификации ММСК КМ на их гепатогенный потенциал.

Нами сконструирован лентивирусный вектор доставки pHR-CMV-DRep второ го поколения, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, предназначенную для внутриклеточного синтеза двух репортерных белков eGFP и DsRed1 под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса человека. С использованием данного вектора получены рекомбинантные лентивирусы, псевдотипированные гликопротеином вируса везикулярного стоматита. Методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии показана высокая эффективность переноса и экспрессии белков-репорте ров в ММСК КМ человека (64.5±6.5%). Установлено, что экспрессия белков-репорте ров в трансдуцированных клетках стабильна на протяжении не менее одного месяца их культивирования in vitro.

Проведена гепатогенная дифференцировка ММСК КМ человека, трансдуци рованных вектором pHR-CMV-DRep, под действием EGF, FGF-4, HGF, никотинамида, дексаметазона, ITS+. Показана стабильная экспрессия репортерных генов eGFP и DsRed 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия в ММСК КМ по истечении трех недель дифференцировки. ММСК, подвергшиеся диф ференцировке, окрашивались на наличие внутриклеточного гликогена. Различия по накоплению гликогена между модифицированными и немодифицированными ММСК после трех недель гепатогенной дифференцировки не установлены. Был проведен анализ наличия в дифференцированных ММСК транскриптов тканеспецифических маркеров (альбумин, щелочная фосфатаза и др.) методом ПЦР в реальном времени. Анализ пока зал наличие данных маркеров в образцах РНК, выделенных из дифференцированных ММСК. При этом не было обнаружено отрицательного влияния генетической модифи кации ММСК вектором pHR-CMV-DRep на уровни экспрессии специфических маркеров гепатогенной дифференцировки.

Таким образом, нами показана высокая степень эффективности генетической модификации ММСК КМ человека бицистронным лентивирусным вектором pHR-CMV DRep, а также стабильная экспрессия репортерных белков eGFP и DsRed1 в ММСК на протяжении одного месяца. Генетическая модификация ММСК КМ человека данным вектором не повлияла на их гепатогенный потенциал. При этом в условиях гепатоген ной дифференцировки сохранялась устойчивая экспрессия репортерных генов в ММСК КМ.


СравнитеЛЬное повеДение ммСк и нСпк при транСпЛантаЦии IN VITRO в орГанотипиЧеСкие куЛЬтурЫ СетЧатки при травме Сергеев С.а., 1,2кошелева н.в., 2Сабурина и.н., 1Семенова м.Л.

Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова;

НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва The functional rehabilitation of damaged retina in different cases of pathology with stem/progenitor sells transplantation is very actual. But it is difficult to predict the effects of such transplantation in vivo. That’s why it is necessary to design models of damaged retina allowing to register the individual cell behavior after transplantation. Such model is the ex plantation retina culture damaged by laser irradiation. This is model can help us in answering questions about the effective reparation time of laser damaged retina after NSPC and MMSC transplantation;

minimal cell-migration time to the damaged area;

optimal transplantation time;

minimal number of transplanted stem cells required for migration at the distance up to 3 mm;

necessity of neuronal micro surrounding for NSPC migration and optimal way of cell transplantation.

Одним из наиболее интенсивно развивающихся и перспективных направле ний восстановления сетчатой оболочки глаза после травмы является трансплантация стволовых и прогениторных клеток. Современные представления о поведении транс плантированных стволовых клеток в нейрональных структурах при травме в быстрой направленной миграции трансплантата к месту повреждения отводят решающую роль регуляторным факторам, выделяемым гибнущими клетками. Однако данное пред ставление базируется на исследованиях целого организма, что не позволяет детально 1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия рассмотреть динамику морфологических изменений трансплантированных клеток, не дает возможности проследить за судьбой отдельных клеток в реальном времени. В противоположность исследованиям in vivo, трансплантация клеток in vitro в эксплан тационную культуру лишена этих недостатков. В связи с этим целью нашей работы было проведение трансплантаций GFP+ стромальных клеток костного мозга (ММСК) и нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) в 3D культуру нейросетчатки глаза крыс Wistar.

Культивирование сетчатки проводили в стандартных условиях в среде DMEM/ F12 с 20 нг/мл FGF и EGF, 7% FCS, гепарином, добавками В12 и N2. На 7-е сутки экс плантаты повреждали лазером Zilos-tk (300 мВт 1000 мс) по квадрату со стороной мкм (15 импульсов), и трансплантировали ММСК и НСПК из красного костного мозга большеберцовых костей и субвентрикулярной зоны мозга GFP+ мышей соответственно.

Клетки выращивали в клональной плотности или в культуре висячих капель для по лучения агрегатов и трансплантировали стеклянным микрокапилляром в эксплантаты сетчатки в концентрации 300-300000 клеток в 0,2 мкл.

Было показано, что решающим для успешной миграции трансплантата к области повреждения является время, прошедшее после травмы. Через сутки НСПК распространялись преимущественно диффузно, в то время как при инъекции сра зу после травмы наблюдалась направленная миграция 90% трансплантированных клеток в область повреждения эксплантата с области отдаленной от травмы на мкм, 56% на расстояние 1000 мкм и 27% на расстояние, удаленное более чем на мкм. По мере продвижения к зоне повреждения, НСПК утрачивали способность к быстрому перемещению, выпуская длинные нейритоподобные отростки и приобре тая морфологию биполярных нейронов и клеток глии под действием нового клеточ ного окружения эксплантата сетчатки глаза. Аналогичные изменения морфологии наблюдались и в трансплантированных ММСК, однако их распространение к об ласти травмы происходило менее эффективно, чем НСПК. Миграция трансплантата наблюдалась в течение 3-х суток после инъекции. Концентрация трансплантиро ванных ММСК оказывает сильное влияние на интенсивность их миграции, которая увеличивается с возрастанием плотности клеток при инъекции, минимальна 3Ч и максимальна при концентрации 3Ч105. Отмечено распространение трансплантиро ванных ММСК и НСПК преимущественно по клеточным элементам сетчатки гла за и практически полное отсутствие живых клеток на поверхности культуральной чашки. Пришедшие в область травмы клетки сохраняли свою жизнеспособность на протяжении более 30 суток. Однако на протяжении всего времени эксперимента экс прессия характерных маркеров дифференцировки нервных клеток, трансплантиро ванными ММСК так и не была выявлена.

Таким образом, удалось детально проследить судьбу ММСК и НСПК при трансплантации в нейросетчатку глаза, показать решающую роль клеточного окружения для направленной дифференцировки и миграции трансплантата, показать временную и пространственную зависимость эффективности миграции клеток в область повреж дения, оценить минимальное количество клеток, способное мигрировать на большие расстояния в область травмы.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия СозДание композитнЫХ материаЛов на оСнове поЛимернЫХ матриЦ С интеГрированнЫми СтвоЛовЫми кЛетками и нанокомпонентами Смирнова н.в., 1,2новикова п.Ю., 1Смолянинов а.б., 3вилесов а.Д., 1, Добровольская и.п., 3Юдин в.е.

ООО «Покровский банк стволовых клеток», 2Институт цитологии РАН, Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург The use of Mesenchymal stem cells as therapies for disease, repair and regenera tion of tissues is one of the new challenges in modern therapeutics. To facilitate the ability to localize, condition and protect cells, biocompatible porous membranes/ scaffolds are being developed that will improve the efficiency of these treatments.

Для восстановления утраченной структуры или функции органов все шире используются новые методы, основанные на применении клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Одной из ключевых задач в данном контексте является поиск эффективного способа доставки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в область поражения для коррекции различных типов патологий. Уникальные свойства ММСК (возможность направленной дифференцировки, отсутствие экспрес сии белков MHC II-го класса и экспрессия иммуносупрессорных белков) позволяют использовать их в разработке разнообразных схем лечения многих дегенеративных за болеваний, в регуляции иммунной системы, а также в протезировании с использова нием биоматериалов, содержащих ММСК и сокультивируемые ММСК и фибробласты.

Показано, что непосредственное введение суспензии клеток в область поражения малоэф фективно для терапии вследствие быстрой элиминации клеток. Использование в качестве матрицы для культивирования и переноса клеточных продуктов нетоксичных, биосовмес тимых пленочных и 3D структур, которые могли бы обеспечивать оптимальные условия для адгезии, экспансии иммобилизованных клеток, способствовать интеграции имплан тата с окружающими тканями, а также осуществлять доставку сигнальных молекул, инициирующих регенеративные процессы на клеточном уровне, делает трансплантацию значительно более эффективной.

Было проведено тестирование и модернизация свойств композитных мате риалов на основе производного природного полимера хитина – хитозана. При синте зе использовался принцип создания ориентированных полимерных материалов для максимальной реализации характеристик прочности, упругости и термоустойчивости.

Кроме того, было показано, что введение гидросиликатных наночастиц монтморилло нита (ММТ) позволяет заметно улучшить механические характеристики композита.

С использованием культуры дермальных фибробластов, а также ММСК, полученных из жировой ткани человека, нами проведен первичный анализ материалов с различны ми модификациями их физико-химических свойств (концентрации наночастиц ММТ, архитектоники пор, адгезивности для компонентов внеклеточного матрикса и др.) по критериям эффективности адгезии, миграции и пролиферации клеток, а также данным клеточной морфологии.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия Применение в качестве регуляторного механизма наночастиц с одной стороны существенно расширяет возможности варьирования физико-химических свойств таких конструкций и, соответственно, их клинического применения, но с другой стороны ста вит дополнительные задачи анализа возможного токсического влияния наночастиц на клеточные составляющие композита. Для оценки острой токсичности (через 24 ч куль тивирования) регистрировали уровень стабилизации белка р53 и образования фокусов гистона gamma-H2AX в опытных клетках. Для оценки воздействия в долгосрочной пер спективе анализировали динамику укорочения теломер с помощью Flow-FISH (как мар кер индуцированного репликативного старения дермальных фибробластов и ММСК) и эффективность колониеобразования ММСК (по числу F-CFU).

оСобенноСти куЛЬтивированиЯ и преДтранСпЛантаЦионноЙ поДГотовки муЛЬтипотентнЫХ меземХимнЫХ СтромаЛЬнЫХ кЛеток краСноГо коСтноГо мозГа Смолянинов а.б., новицкий а.в., Логачев а.а., Хрупина а.С.

Военно-медицинская академия, Покровский Банк Стволовых Клеток, Санкт-Петербург In the Stem Cell Bank Pokrovkyi the method of human bone marrow mesenchimal stem cell isolation and pretransplantation preparation was developed and adapted for clinical use. In the Stem Cell Bank Pokrovkyi patients suffering from lateral amyotrophic sclerosis and patients with severe spinal cord trauma were treated with mesenchimal stem cells isolated from their own bone marrow and cultivated in the laboratory conditions. After transplantation an improvement in their state was observed. Currently monitoring of their state is going on.

Красный костный мозг является богатым источником гемопоэтических и мезенхимных стромальных клеток, поэтому выделение и трансплантация стволо вых клеток красного костного мозга считается перспективным способом лечения ряда заболеваний.

В Покровском банке стволовых клеток была разработана и адаптирована для клинического применения методика выделения и подготовки к трансплантации мульти потентных мезенхимных стромальных клеток человека (ММСК). В Покровском банке стволовых клеток была произведена подготовка трансплантата для лечения пациентов с боковым амиотрофическим склерозом и с тяжелыми травмами спинного мозга. После выделения и культивирования пациентам проводили трансплантацию аутогенных ММСК красного костного мозга (ККМ). Выделение фракции аутоММСК из аспирата ККМ проводили с помощью аппарата Sepax (Biosafe, США) или в градиенте Ficoll-Paque Plus (Stemcell Technologies, Канада), после чего переносили клетки в пластиковые фла коны и культивировали их на среде -MEM с добавлением 20% FBS, глютамина и анти биотиков (пенициллина и стрептомицина). На 4 пассаже переводили культуру клеток на синтетический заменитель сыворотки. Перед трансплантацией клетки тщательно отмы вали раствором Hank`s, ресуспендировали в альбумине и переносили в гемакон.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия После выделения аутогенных ММСК человека и перед выдачей пациенту проводили иммунофенотипирование ММСК с помощью проточного цитофлуориметра Cytomics FC500 (Becman Coulter, США). ММСК окрашивали антителами к поверхнос тным антигенам CD34, CD90 и CD105. Также на последнем пассаже проводили анализ кариотипа культуры ММСК и бактериологическое исследование культуральной среды.

По результатам анализов бактериальной или грибковой контаминации ни в одном из образцов обнаружено не было, клетки имели нормальный кариотип, содержание CD 105+ составило 99,02±0,04%, содержание CD90+– 98,04±0,15%, количество CD34+ (гемопоэти ческих стволовых клеток) составило 0,5%.

После лечения наблюдалось улучшение состояния пациентов. В настоящий момент продолжается мониторинг состояния пациентов профильными клиниками.

«раДаХЛорин», СорбированнЫЙ на наноЧаСтиЦаХ перФторуГЛероДноЙ ЭмуЛЬСии проникает в СтвоЛовЫе кЛетки коСтноГо мозГа темнов а.а., 2Склифас а.н., 3терещенко а.в., 3белый Ю.а., Лысков н.б., 2кукушкин н.и.

НИИ Скорой Помощи им. Н.В.Склифосовского;

Москва, 2Учреждение РАН ИБК, г. Пущино, МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С.Н. Федорова, г. Калуга It has been shown that, upon incubation of mouse bone marrow stem cells (BMSC) in vitro with the nanoparticles of perfluorocarbon (PFC) emulsion stabilized by proxanol 268, these nanoparticles penetrate into cells and stay there for a long time (up to 20 days of observation).

It has been found that, under in vitro conditions, mouse BMSC loaded with both the nanoparticles of the original emulsion and the nanoparticles of the emulsion preliminarily incubated with radachlorine do not differ from control stem cells in the rate of division, stretch ing on a plastic support, and the formation of a monolayer.

It has been shown that the exposure to laser radiation of BMSC incubated with the nanoparticles of a PFC emulsion preliminarily incubated with radachlorine under in vitro conditions leads to the death of these cells due to the destruction of the cell membrane. The treatment with laser radiation of BMSC incubated with the nanoparticles of the starting PFC emulsion (without preliminarily incubation with radachlorine) causes no death of these cells.

Целью настоящей работы было выяснить возможность сорбции лекарствен ного препарата (ЛП) «Радахлорина» (РД) на наночастицах (НЧ) перфторуглеродной (ПФУ) эмульсии, стабилизированной проксанолом 268;

включения наначастиц с РД в стволовые клетки (СК) костного мозга. Препарат РД под действием лазерного облучения образует активные формы кислорода, вызывающие гибель клеток.

материалы и методы. В работе использовались НЧ ПФУ эмульсии, состоя щие из смеси перфторуглеродов: перфтордекалина (ПФД) и перфторметилциклогексил пипередина (ПФМЦП) в соотношении 9:1, 10 об%, стабилизированных 4% раствором проксанола 268.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия РД добавляли к эмульсии ПФУ в соотношении 5 мг/мл. В качестве доноров СК были использованы мыши линии С57black. Клетки выделяли из бедренной кости и культивировали в течение 5 дней при 37оС в среде DMEM с ростовыми факторами.

После 5 дней культивирования к клеткам добавляли НЧ исходной эмульсии, либо НЧ, содержащие сорбированный на них РД, и инкубировали в течение 30 минут при 37оС.

Затем клетки 5-кратно отмывали раствором Хенкса и помещали в термостат для даль нейшего культивирования.

Клеточную культуру, содержащую РД внутри СК, облучали лазером (662 нм) мощностью 1 Дж в течение 1 минуты. Затем в видимом свете проводили фотографиро вание в течение 3 минут с интервалом 15 секунд.

результаты. НЧ, содержащие лекарственный препарат РД, проникают в СК, где препарат сохраняет свою активность в течение 20 суток наблюдения. СК, содержа щие наночастицы с РД, при культивировании в условиях in vitro морфологически не отличаются от контроля. Воздействие лазерного излучения на клетки, содержащие наночастицы ПФУ эмульсий с РД в условиях in vitro, приводит к образованию актив ных форм кислорода и гибели клеток путем разрушения мембраны в течение 20 суток наблюдения.

иСХоДЫ кЛиниЧеСкоГо применениЯ ДеминераЛизованнЫХ коСтнЫХ транСпЛантатов по ДаннЫм СотруДников рниито и ДруГиХ ЛеЧебнЫХ уЧреЖДениЙ тихилов р.м., Савельев в.и., булатов а.а., рыков Ю.а.

ФГУ «РоссНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий», Санкт-Петербург During the period from 1979 to 2006 in the tissue bank RNIITO named after RR Vreden on his own technique was harvested 5888 demineralized bone transplantates (DBT), part of which (about 5,5 thousand) has been issued for clinical use in Traumatology – Orthopedics, Neurosurgery, Maxillo-facial surgery and other areas of reconstructive surgery. These experi ences demonstrated the feasibility and benefits of VCT that can enhance the quality of treat ment and to shorten their rehabilitation.

За период с 1979 по 2006 годы в тканевом банке РНИИТО им. Р.Р. Вредена по собственной методике было заготовлено 5888 деминерализованных костных трансплан татов (ДКТ), часть из которых (около 5,5 тысяч) была выдана для клинического исполь зования. При анализе результатов были получены следующие данные.

После применения ДКТ у 92 больных с различной патологией опорно-двига тельной системы (Сивков С.Н. 1988), положительные результаты были установлены у (92,4%), отрицательные у 7 (7,6%) пациентов. Причиной неудач послужила непрочная фиксация костных отломков металлическими конструкциями при лечении ложных сус тавов. Необходимо подчеркнуть, что на 96 операций заживление раны первичным натя жением получено в 95 случаях и лишь у 1 больного произошёл частичный некроз краёв раны. На окончательный исход лечения это не повлияло.

1 клетОчные технОлОгии, тканевая инЖенерия В работе В.И.Зотова (1991) представлены результаты хирургического лече ния 55 больных, у которых была произведена краниопластика деминерализованными трансплантатами после перенесённой черепно-мозговой травмы. Операция обеспечила положительные результаты у 52 больных (94,4%). Выявленные у 3-х (5,6%) пациентов осложнения не зависели от качества костно-пластического материала.

Э.Г.Грязнухин с соавт. (1990) с помощью биомассы из ДКТ осуществили успеш ное лечение свежих ран с дефектами кожи и подлежащих тканей у 88 больных. Лечение вяло гранулирующих и длительно незаживающих ран выполнено у 143 пациентов. Все они до этого безуспешно лечились общепринятыми способами. Также положительным оказалось лечение нагноившихся послеоперационных ран (122 наблюдения), околоспи цевых и околостержневых инфильтратов (82 случая) и пролежней. Каких-либо осложне ний, связанных с использованием биомассы из ДКТ в чистом виде или в комбинации с другими лекарственными средствами авторы работы не наблюдали.

В исследованиях К.Н.Быстрого (1986) деминерализованные костные транс плантаты использованы при лечении 57 детей с доброкачественными опухолями и опухолеподобными дисплазиями костей. Каких-либо осложнений, связанных с приме нением ДКТ автор не наблюдал. Все операционные раны зажили первичным натяже нием. В результате сравнительных исследований он доказал, что перестройка ДКТ в комбинации с компактной костью происходит через 1,5 года, тогда как перестройка не деминерализованных трансплантатов, консервированных замораживанием, наступала не ранее, чем через 3 года.

В НИИДОИ им. Г.И.Турнера ДКТ применяли также С.Г.Терехов (1986) при ле чении 52 подростков с врождённым вывихом бедра, Т.И.Хавико (19) при удлиняющих операциях на нижней конечности, А.П.Поздеев (1999) при лечении ложных суставов раз личной локализации. Первый автор пришёл к выводу, что ложные суставы, осложнен ные выраженной деформацией кости или её укорочением служат прямым показанием для обязательной стимуляции костеобразовательных процессов и увеличения объёма кости путём применения ДКТ. Второй автор, выполнивший 105 удлиняющих операций на нижней конечности с применением пластики зоны остеотомии деминерализованны ми трансплантатами, смог добиться относительно больших величин удлинения без за держки процесса регенерации. Хорошие результаты лечения были достигнуты в 56% случаев, удовлетворительные в 36%, неудовлетворительные в 8%. Автор установил, что при обычном дистракционном удлинении бедра положительные результаты лечении были получены только в 44% наблюдений, а при использовании ДКТ – в 62%, что свиде тельствует об их существенном стимулирующем влиянии на репаративный остеогенез.

Третий автор обобщил в своей работе опыт лечения 287 детей с ложными суставами, у которых более чем в половине случаев применялись деминерализованные трансплантаты для стимуляции процессов костеобразования. Автором при лечении латентных ложных суставов была разработана новая операция превентивной костной пластики, обеспечивающая высокие анатомические и функциональные результаты.



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.