авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 25 |

«гематология Под общей редакцией доктора медицинских наук, профессора К. М. Абдулкадырова.- Г о с у д а р с т ...»

-- [ Страница 3 ] --

Диагностике некоторых типов миелобластных лейкозов, вошед ших в новейшие классификации, помогают выявленные корреля ции между цитогенетическими аномалиями в лейкозных клетках и их иммунологическими детерминантами. Трудно ассоциировать иммунофенотип и цитогенетические особенности клеток с их мор фоцитохимическими характеристиками и проводить корреляции между ними. Однако названия лейкозов базируются по-прежнему на морфологических особегпгостях клеток, а в основе новейших классификаций лежат морфоцитохимические характеристики, и диагностическая работа во многих лабораториях начинается с мор фоцитохимического анализа клеточного субстрата. Тем не менее необходимо еще раз подчеркнуть, что только комплексное исполь зование всех современных методов может сделать диагностику лей коза успешной.

Цитохимическая окраска клеток позволяет разделить острые лейкозы на 2 основные группы — острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) и острые нелимфобластные лейкозы (ОНЛЛ), а также, основываясь на морфоцитохимических характеристиках клеток, выделить среди ОНЛЛ несколько основных вариантов. Классифи кация ОЛЛ в настоящее время полностью основана на иммунофе нотипировании и цитогенетике, и тем не менее в ряде случаев мор фоцитохимия может иметь некоторое вспомогательное значение в предварительной дифференциальной диагностике Т- и В-клеточ ных форм ОЛЛ.

82 Часть 1. Теоретическая гематология Цитохимические реакции проводятся на мазках крови, лейко концентратов, костного мозга, на отпечатках и срезах биопсийного материала из лимфоузлов, селезенки, кости и других органов и тканей.

Проведение цитохимических реакций требует строгого соблю дения многих правил, связанных с приготовлением препаратов и рабочих растворов из реактивов, фиксацией мазков, условиями их инкубации в процессе реакции и дальнейшей окраской.

Цитохимические реакции следует проводить до начала терапии лейкоза. Результаты исследований, которые проводятся в процес се лечения, в период рецидивов заболевания, сильно зависят от химиотерапии, в результате которой может не только измениться характер и интенсивность цитохимических реакций, но также мо жет быть полностью редуцирована активность некоторых фер ментов.

Очевидно, что просто морфологическая диагностика вариантов острого лейкоза без цитохимических исследований чаще всего не возможна, и в то же время любое цитохимическое исследование начинается с анализа морфологических особенностей исследуе мых клеток, с обычной паноптической окраски. Поэтому правиль но говорить о морфоцитохимических исследованиях клеток.

Цитохимические методы иссчедования лейкозов Перед началом цитохимических исследований производится морфологический анализ окрашенных по Романовскому- Гимзе или Май-Грюнвальду мазков костного мозга и/или периферической крови. Для осуществления цитохимической диагностики лейкозов широко используются следующие цитохимические реакции:

1. Определение содержания полисахаридов в PAS-реакции по методам McManus (1946), R. D. Hotchkiss (1948) (Лецкий В. Б., 1973;

Глузман Д. Ф. и др., 2000 ).

2. Определение содержания фосфолипидов в реакции с Суда ном черным Б, по методам Shneehan и Storey (1947);

Ackerman (1952).

3. Определение активности миелопероксидазы по методу Sato (1928) и Quaglino (1958), W. Loele (1936) (Глузман Д. Ф. и др., 2000;

Лецкий В. Б., 1973 ).

4. Определение активности хлорацетат-эстеразы по методу Moloney с соавт. (1960).

5. Определение активности кислой фосфатазы по методам Р. П. Нарциссова (1968);

Гольдберга и Барка (1962);

Берстона (1958).

Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга 6. Определение активности а-нафтилацетат-эстеразы по мето дам Хейхо с соавт. (1964);

Э. Пирса (1960) в модификации Леф флера(1961).

7. Определение активности щелочной фосфатазы по методам Kaplow (1955);

Ф. Г. Дж. Хейхо. Д. К. Кваглино (1958);

М. Г. Шу бич (1967) (ЛецкийВ. Б., 1973;

Глузман Д. Ф. и др., 2000;

Хей хо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983).

Общепринятый способ оценки реакции в световом микроскопе был предложен Kaplow в 1955 г. и в 1957 г. модифицирован Асталь ди и Верга. Он основан на оценке интенсивности реакции. Прежде всего в окрашенном препарате подсчитывают не менее 100 иссле дуемых клеток. При острых лейкозах оценку реакции проводят в бластных элементах;

определяют процент положительно реагиру ющих клеток (ППК), а также средний цитохимический коэффици ент окраски (СЦК).

Реакция считается положительной при наличии 3 и более про центов клеток, в которых выявлена положительная реакция, при этом количество клеток с положительной окраской может коле баться от 3 до 100%.

Вторым показателем реакции является интенсивность окраски, которая отражает активность фермента или количество исследуе мого вещества в клетке. Она выражается средним цитохимиче ским коэффициентом — СЦК. Для его вычисления учитывают различную степень интенсивности окраски клеток. При подсчете 100 клеточных элементов любого типа различают 4 степени реак ции: 0 (нулевая) — с отрицательной реакцией;

I — со слабоположи тельной реакцией;

II — с положительной реакцией;

III — с выра женной реакцией.

Цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляют по формуле:

где цифры означают степень интенсивности окраски, а буквы количество клеток (в %), соответствующее указанным в формуле степеням окраски. Максимальный СЦК равен 3,0.

При 0 (нулевой) степени интенсивности окраски окрашивание клеток отсутствует.

При I степени интенсивности окраски имеют место единичные окрашенные гранулы в цитоплазме, либо слабое диффузное окра шивание всей цитоплазмы, либо наличие небольшого окрашенно го участка — фокусное или локальное окрашивание.

Часть 1. Теоретическая гематология При II степени интенсивности окраски наблюдается заполне ние окрашенными зернами или диффузно почти всей цитоплазмы, но неокрашенные ее участки имеются.

При III степени окраски интенсивно окрашенные гранулы за полняют всю цитоплазму, иногда частично покрывая ядро. При диффузном характере реакции наблюдается очень яркая интен сивная реакция во всей цитоплазме. Таким образом, СЦК свиде тельствует, как уже было сказано, о содержании вещества или о его активности в клетке.

Пример: из 100 подсчитанных клеток одного типа (бластных клеток при остром лейкозе) 50 клеток реагировали отрицательно и 50 клеток — положительно. При этом окрашенные клетки рас пределились по степени интенсивности окраски следующим обра зом: I степень — 30 клеток;

II степень — 18 клеток;

III степень — 2 клетки.

Согласно формуле:

„тт„ 0x50 + 1x30+2x18 + 3x v, LLrv = — U, / z, СЦК =0,72;

ППК=50%.

При оценке реакции, особенно при отсутствии окрашивания клеток, необходимо быть уверенным, что нулевая степень интен сивности окраски не зависит от качества реакции. Поэтому надо обязательно найти в. мазке положительно реагирующие клетки любого типа. В противном случае реакцию нужно повторять.

Для оценки реакции ориентируются на нормальные цитохими ческие показатели клеток здоровых людей (Лецкий В. Б., 1973).

Острые миелоидныё лейкозы (ОМЛ)* Авторы ФАБ-классификации острых миелобластных лейкозов выделяют 3 типа миелобластов при ОМЛ: I— клетки с узкой голу бой или базофильной, не содержащей азурофильных гранул, ци топлазмой, ядром с нежнозернистой структурой хроматина и од ной крупной нуклеолой;

II — клетки с 2-4 мелкими нуклеолами, отличаются более широкой цитоплазмой, содержащей от несколь ких до 20 азурофильных гранул;

III —в периферической крови и костном мозге больных ОМЛ иногда выявляют бласты с много * Придерживаясь новейшей классификации лейкозов ВОЗ, мы все же со храняем в тексте нумерацию острых миелоидных лейкозов, рекомендованную авторами ФАБ-классификации.

Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга численными азурофильными гранулами;

наличие таких бластов в некоторых случаях ОМЛ с созреванием (М2) коррелирует с транс локацией t(8;

21) (Bennet J. M. et al., 1985).

Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифферен цировкой (ОМЛ МО), или острый недифференцируемый лейкоз характеризуется отрицательными реакциями на МП, липиды, ХАЭ и КФ. Может наблюдаться слабоположительная PAS-реакция ти пичного для ОМЛ диффузного или мелкогранулярного характера.

Очень редко в небольшом количестве бластов выявляется слабая, не подавляемая фторидом натрия реакция на осНАЭ (Cuneo A.

et al., 1995). Морфологические особенности бластных клеток при МО преимущественно I типа неоднородны, но преобладают клет ки среднего диаметра. Их содержание может достигать 95%. Ха рактерные только для этой формы лейкоза хромосомные аберра ции не выявлены (Воробьев А. И. и др., 2002). МО диагностирует ся по результатам иммунофенотипирования — наличия маркеров CD13, CD33, CD34, CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференци альная диагностика проводится с ОМЛ М7 и ОЛЛ.

Острый миелобластный лейкоз без созревания (ОМЛ М1) характеризуется наличием в пунктате костного мозга более 90% бластных клеток. Наблюдаются преимущественно бласты I типа, без зернистости. Азурофильная зернистость определяется менее чем в 10% бластов. Согласно Д. Ф. Глузман и соавторам (2000), палочки Ауэра обнаруживаются приблизительно у 50% больных ОМЛ Ml. По нашим наблюдениям, палочки Ауэра при этом вари анте лейкоза отсутствуют. Властные клетки характеризуются сред ними и крупными размерами, округлыми, иногда неправильной формы ядрами с 1-4 нуклеолами и нежнозернистой структурой ядерного хроматина. Иммунофенотип бластов включает CD33, CD13, CD117, CD14, CD64, CD15, HLA-DR и МПО, реже CD34, CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференциальный диагноз про водится с ОМЛ М2, ОМЛ М5, ОМЛ М7 и ОЛЛ.

Острый миелобластный лейкоз с созреванием (ОМЛ М2) отличается от ОМЛ Ml меньшим содержанием бластных клеток в пунктате костного мозга (менее 89% бластов). Властные клетки I и, главным образом, II типов характеризуются средними и крупными размерами и заметным полиморфизмом. Их ядра могут быть округлыми или неправильной формы. Структура ядерного хрома тина тонкодисперсная. Значительная часть бластов содержит азуро фильную зернистость (бласты II типа), встречаются палочки Ауэра, которые могут обнаруживаться в более зрелых гранулоцитах. Со зревающие гранулоциты составляют более 10% клеток (Bennet J. M.

86 Часть 1. Теоретическая гематология et al., 1985). Иммунофенотипические маркеры при ОМЛ М2 — CD13, CD15, CD33, CD64, МПО, HLA-DR. Небольшое количе ство бластов экспрессирует CD34 и CD117 (Воробьев А. И. и др., 2002;

Бене М. К. и др., 1996).

Для этих двух вариантов ОМЛ характерна положительная ре акция бластов на миелопероксидазу липиды и ХАЭ, которые явля ются маркерными для миелобластов. Выраженность реакции в бла стах на МП вариабельна, по нашим наблюдениям, она колеблется от 7 до 100% МП позитивных клеток. При ОМЛ М2 процент кле ток, положительно реагирующих в реакции на МП, липиды и ХАЭ, значительно выше, чем при ОМЛ без созревания — Ml. Миелопер оксидаза выявляется в цитоплазме в виде гранул золотисто-жел того цвета при использовании в реакции ортотолидина или в виде гранул темно-синего цвета при использовании бензидина. Количе ство гранул различно от случая к случаю — от небольшого их числа в одном участке цитоплазмы до полного ее заполнения. Реакция на МП, как и реакция на липиды, часто лучше выявляет палочки Ауэра, чем обычная паноптическая окраска. Согласно нашим на блюдениям и сообщениям других авторов (Френкель М. А., 1999), у части больных ОНЛЛ (Ml, M2) могут выявляться только один или два цитохимических маркера. В ряде случаев при отсутствии в бластах МП большая часть зрелых нейтрофилов может быть также пероксидазоотрицательна. В процессе лечения клетки иногда утра чивают фермент.

Вторая маркерная реакция для ОМЛ с созреванием и без созре вания — реакция на липиды с Суданом черным Б. По мнению неко торых исследователей и согласно нашим наблюдениям, она даже более надежна, чем миелопероксидаза (Ковалева Л. Г., 1990). Фос фолипиды выявляются в 14-100% бластов в виде черных гранул, которые часто заполняют всю цитоплазму клетки. Интенсивность реакции различна.

Реакция на гранулоцитарную эстеразу — ХАЭ — также являет ся маркерной для нейтрофилов, но имеет меньшее значение в диаг ностике, особенно для ОМЛ Ml, так как фермент начинает выяв ляться в основном со стадии промиелоцита. По мере созревания клеток активность фермента снижается. Реакция на полисахари ды не имеет особого диагностического значения. В миелобластах PAS-положительное вещество может отсутствовать или иметь диф фузный или диффузномелкогранулярный характер распределения.

Мелкие, реже средние гранулы темно-малинового цвета беспоря дочно располагаются на фоне диффузно окрашенной бледно-розо вой цитоплазмы.

Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга Реакция на а-нафтилацетат-эстеразу способствует дифферен циальной диагностике ОМЛ Ml и ОМЛ М2 с острыми моноцитар ными лейкозами. Она может быть отрицательной в миелобластах, однако в случае положительной реакции диагностическое значе ние имеет отсутствие ингибиции реакции в миелобластах фтори дом натрия в отличие от монобластов, в которых она подавляется ингибитором.

Фермент выявляется в виде буровато-коричневых гранул (при использовании в реакции синего прочного В или ВВ) на фоне диф фузного окрашивания цитоплазмы.

Кислая фосфатаза не имеет диагностического значения для этих двух вариантов ОМЛ. При наличии положительной реакции необ ходимо обратить внимание на взаимодействие фермента с ингиби тором — ионами тартрата. В отличие от моноцитарных клеток ре акция в бластных клетках при мнелобластных лейкозах не подав ляется тартратом натрия.

Очень редкий вариант ОМЛ М2 — острый базофильный лейкоз (классификация ВОЗ, 2000,2002) — характеризуется содержанием более 5% базофилов от неэритроидной популяции костного моз га. При этом типе ОМЛ выявляется транслокация t(6;

9)(p23;

q34) и делеция или транслокация короткого плеча хромосомы 12. Выде ляют редкий вариант этого лейкоза, содержащий вариабельное, иногда значительное, количество базофильных клеток различной степени зрелости. Клетки характеризуются средним диаметром и неширокой голубой цитоплазмой. Ядра могут иметь неправиль ную форму;

ядрышки, как это свойственно базофилам, почти не видны. В бластах выявляется крупная базофильная зернистость.

Реакция на МП, липиды и гранулоцитарную эстеразу отрицатель ная, но положительная с альциановым синим (Френкель М. А., 1999). PAS-реакция в виде крупных гранул и блоков. Пунктат кост ного мозга малоклеточный, кроме базофильных бластов в нем об наруживают более зрелые клетки этого ряда.

Острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ МЗ). Особый тип бластнвгх клеток наблюдается при остром промиелоцитарном лей козе (ОПЛ, или ОМЛ МЗ). Это название было дано из-за наличия в лейкемических клетках обильной зернистости. Властные клетки, или атипичные промиелоциты при ОПЛ характеризуются выра женным полиморфизмом и анаплазией. Их ядра имеют неправиль ную форму, часто лопастную, двудольчатую, складчатую и могут располагаться эксцентрично. Цитоплазма — от голубого до базо фильного цвета, иногда имеет выросты. В ней выявляется обиль ная зернистость 2 типов: грубые крупные темно-фиолетовые гра Часть 1. Теоретическая гематология пулы IT более мелкие пурпурного цвета. Гранулы заполяют цито плазму и иногда покрывают ядро клетки. Как правило, бласты содержат палочки Ауэра, иногда в виде пучков. Кроме этих бластов наблюдаются клетки с мелкой зернистостью и не более 8—10% обычных миелобластов. Это типичный макрогранулярный вари ант ОПЛ.

Нетипичный, редкий микрогранулярный вариант этого лейко за — О МЛ M3v — характеризуется бластами с очень скудной, мел кой, иногда пылевидной зернистостью. Палочки Ауэра немного численны. При этом варианте ОПЛ бласты отличаются уродливо стью ядер (бобовидные, двудольчатые, лопастные, рассеченные, с глубокими выемками) и могут напоминать бласты при остром мо нобластном лейкозе с созреванием (ОМЛ М5в). Из-за этого сход ства необходимо проводить дифференциальную диагностику меж ду этими двумя типами лейкоза, тем более что своевременная диаг ностика ОПЛ важна в связи с возможностью достижения полной ремиссии под воздействием дериватов ретиноевой кислоты (Сав ченко В. Г. и др., 2001, а, о;

Huang M.-E., 1988). Клетки при ОМЛ МЗ содержат главные маркеры миелоидных клеток — МП, липи ды, ХАЭ в максимальных количествах. Даже реакции на а-нафтил ацетат-эстеразу, не подавляемую фторидом натрия, и полисаха риды значительно более выражены, чем в бластных клетках при Ml и М2 вариантах ОМЛ. Основываясь на нашем опыте, следует отметить, что интенсивность реакций на МП, ХАЭ и осНАЭ хотя и достаточно высокая, тем не менее в некоторых случаях M3v ниже, чем при макрогранулярном ОПЛ. При дифференциальной диаг ностике с монобластным лейкозом с созреванием помогает отсут ствие миелоидных цитохимических маркеров или их слабая выра женность и яркая реакция на аНАЭ, подавляемую фторидом на трия в монобластах в отличие от бластов при ОПЛ (Bennet J. М.

et al, 1976). Гранулы лейкозных клеток при ОПЛ содержат кислые сульфатированные мукополисахариды (Абду'лкадыров К. М. и др., 1978). С помощью цитогенетических исследований при ОПЛ об наруживается транслокация t(15;

17)(q22;

ql2-21) и ряд других абер раций. Иммунофенотипически клетки ОПЛ характеризуются экс прессией антигенов CD13, CD33, МПО, CD64 и CD15. Клетки не несут антигены CD34, HLA-DR (Савченко В. Г. и др., 2001, а;

Paietta E. et al., 1994).

Острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ, или М4) — би линейный лейкоз, и его клеточный субстрат представлен клетками нейтрофилыгого и моноцитарного рядов, которые эксирессируют антигены обеих линий - CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD64, Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга CDllc, CD117, CD4 и HLA-DR. Наиболее частые цитогенетичес кие аберрации — t(9;

ll), трисомия 4, t(l;

7), t(8;

21), связанные с Hq23. При этом варианте лейкоза обе клеточные линии характе ризуются заметной дифференцировкой до зрелых форм. Сумма миелобластов I и II типов и монобластов в костном мозге обычно не превышает 60%, а на долю созревающих и зрелых гранулоцитов и моноцитов приходится в общей сложности от 20 до 40% клеток.

Моноциты периферической крови составляют не менее 5 х 109/л.

Цитохимически выявляются миелобласты, дающие положитель ную реакцию на МП, липиды, ХАЭ и монобласты, характеризую щиеся присутствием в них моноцитарной а-нафтилацетат-эстера зы, подавляемой фторидом натрия (Fischer R., Schmalze E, 1964) и КНЭ. Дифференциальный диагноз проводится с ОМ Л М2 и ОМ Л М5в.

Подвариантом билинейного типа ОММЛ является миеломоно цитарный лейкоз с эозинофилией (М4эоз). Количество эоэинофи лов в костном мозге составляет более 6%. Имеют место и характер ные цитогенетические аберрации, в частности инверсия хромо сомы 16 (pl3;

q22) и t(16;

16)(pl3;

q22). Атипичные эозинофилы со держат крупные незрелые пурпурно-фиолетовые гранулы. Имеет место ядерная гиперсегментация. Эозинофилы дают положитель ную реакцию на полисахариды и ХАЭ. Властные клетки и даже зрелые нейтрофилы могут содержать палочки Ауэра.

Бифенотипичный вариант ОММЛ составляет около 1% случа ев ОНЛЛ. При этом варианте лейкоза бласты содержат одновре менно МП, липиды, ХАЭ и аНАЭ, подавляемую фторидом на трия. В таких случаях при диагностике проводят реакцию на двой ную эстеразу — ХАЭ и аНАЭ. Здесь можно увидеть, что одни и те же клетки содержат цитохимические маркеры как неитрофильнои, так и моноцитарной линий.

Острый монобластный лейкоз (ОМоЛ, или М5) подразделяет ся на монобластный лейкоз без созревания (М5а) и с созреванием (М5в). При М5а-варианте более 80% клеток — монобласты. Это клетки большого диаметра с округлыми или овальными ядрами, 1-2 нуклеолами, с нежносетчатой структурой ядерного хроматина и достаточно широкой голубой или базофильной цитоплазмой.

В части клеток наблюдается скудная пылевидная зернистость.

В редких случаях можно видеть очень нежные, едва заметные па лочки Ауэра. В бластах "содержится большое количество неспеци фической эстеразы (аНАЭ и аНБЭ), подавляемой фторидом на трия и КНЭ. Неспецифическая эстераза, чувствительная к инги битору, служит маркером моноцитов и монобластов и имеет 90 Часть 1. Теоретическая гематология большое значение для диагностики острых монобластных лейко зов, будучи высокоспецифичной для этих клеток. Положительная реакция выявляется в виде красновато- или буровато-коричневых обильных мелких гранул, заполняющих цитоплазму, поэтому иног да реакция кажется диффузной. Ингибиция реакции вариабель на — от частичной до тотальной. В отдельных монобластах выяв ляется слабая реакция на миелопероксидазу и липиды в виде ред ких рассеянных гранул. R. МсКеппа и соавторы (1975) описали несколько случаев монобластного лейкоза с высокой активностью аНАЭ, подавляемой фторидом натрия, и слабой активностью ХАЭ в большинстве клеток. Авторы считают, что в этих случаях бласт ные клетки обладают свойствами моноцитарных и гранулоцитар ных клеток. В литературе приводятся примеры аНАЭ негативных случаев ОМоЛ (Scott С. S. et al., 1993). Наблюдается умеренная активность КФ, подавляемая ионами тартрата. Дифференциаль ный диагноз М5а нужно проводить с ОМЛ МО, ОМЛ Ml.

При ОМоЛ с созреванием (М5в) содержание бластных клеток колеблется от 20 до 80%, остальные клетки представлены промо ноцитами, моноцитами и гранулоцитами. Моноцитарные клетки при ОМоЛ с созреванием отличаются полиморфизмом. Властные клетки — крупного размера, с бобовидными, иногда расщепленны ми, лопастными, вдавленными ядрами, содержащими несколько нуклеол. Структура ядерного хроматина нежносетчатая;

цито плазма умеренная, со скудной пылевидной азурофильной зернис тостью. Как и при ОМоЛ без созревания, при этом варианте лей коза монобласты содержат большое количество подавляемой фто ридом натрия неспецифической эстеразы (Яворковский Л. И., 1987) и КНЭ. Липиды и пероксидаза содержатся в части бластов в не больших количествах. В сыворотке и моче, как и при ОМоЛ без созревания, определяется большое количество фермента лизоци ма. Бласты при ОМоЛ экспрессируют CD13, CD15, CD33, CD11, CD4, CD7 и моноцитарные CD 14. При М5а может выявляться CD34 — антиген ранних клеток-предшественников. Установлены цитогенетические аберрации — транслокации t(9;

ll);

t(10;

ll);

t(ll;

17), связанные с Ilq23.

Нужно еще раз отметить, что в отличие от монобластных лейко зов при Ml, М2, МЗ и М7 вариантах ОМЛ, с которыми нужно проводить дифференциальный диагноз, позитивная реакция на аН АЭ обусловлена экспрессией общих или немоноцитарных эсте раз (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983). Реакция в этих случаях резистентна к ингибиции, но эта резистентность тоже может быть очень вариабельной. Диагностическое значение имеет высокая Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга активность кислой фосфатазы в монобластах при ОМоЛ, которая ингибируется ионами татрата в отличие от других, не моноцитар ных клеток (Яворковский Л. И., 1987;

Глузман Д. Ф. и др., 2000).

Гранулоцитарная эстераза (ХАЭ) не свойственна моноцитар ным клеткам. Гликоген выявляется в части бластов в виде бледно розового диффузного или мелкогранулярного окрашивания. ОМЛ М5в необходимо дифференцировать с ОМЛ M3v и ОМЛ М4.

Острый эритромиелоз (Мб). При остром эритромиелозе число лейкемических эритрокариоцитов в костном мозге достигает 50% и более, а содержание бластных клеток составляет более 20% от числа неэритроидных клеток (классификация ВОЗ, 2000, 2002).

При подсчете бластов эритробласты не учитываются (Wardi man J. W. et al., 2002). Содержание бластов имеет решающее значе ние при дифференциальной диагностике с В,,-дефицитной и неко торыми другими гемолитическими анемиями, рефрактерной ане мией с увеличением бластов, при которых содержание бластных клеток менее 20%. Властные клетки представлены эритробласта ми, миелобластами, недифференцированными бластами. Эритро идные клетки имеют признаки выраженной дисплазии, наблюда ются мегалобласты, макроциты, многоядерные эритрокариоциты, асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, дольчатость ядер.

Могут наблюдаться явления эритрофагоцитоза лейкозными эрит робластами. В миелобластах могут обнаруживаться палочки Ауэра.

Признаки дисплазии отмечены в мегакариоцитах и нейтрофилах (гигантские уродливые ядра метамиелоцитов и палочко- и сегмен тоядерных нейтрофилов). Наблюдается созревание эритрокарио цитов, и в пунктате можно видеть все стадии эритроидных клеток.

Вообще картина костного мозга при этом варианте лейкоза очень вариабельна. Миелобласты I и II типов демонстрируют положи тельные реакции на МП, липиды, ХАЭ. Дополнительное диагнос тическое значение имеет позитивная PAS-реакция в эритрокарио цитах. PAS-положительное вещество располагается в цитоплазме незрелых красных клеток в гранулярной форме, а в более зрелых „аритрокариоцитах — в диффузной форме. Реакция вариабельна и непостоянна. Это не абсолютно специфичный признак, так как известны случаи эритромиелоза, когда эритрокариоциты PAS-не гативны. Нужно также учитывать, что PAS-позитивная реакция в ядросодержащих эритроидных клетках встречается при некото рых гемолитических анемиях. В эритрокариоцитах при остром эрит ромиелозе может быть обнаружена слабоположительная реакция на ссНАЭ, резистентная к ингибитору, КНЭ и КФ (Глузман Д. Ф. и др., 2000). Иммунологическими маркерами этого лейкоза являются 92 Часть 1. Теоретическая гематология CD 13, CD33, CD41, CD71 и гликофорин А. Имеют место хромо сомные аберрации, относящиеся к 5 и 7 хромосомам (Воробь ев А. И. и др., 2002;

Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., 2001, б;

Савченко В. Г. и др., 2001, а).

Вариантом острого эритромиелоза является острый эритролей коз (Мбв), при котором в костном мозге преобладают эритроблас ты без признаков созревания (Глузман Д. Ф. и др., 2000;

Френ кель М. А., 2001). Лейкемические эритробласты содержат полиса хариды в гранулярной форме и в виде блоков. Установить диагноз острого эритролейкоза помогает иммунофенотипирование, в ре зультате которого выявляется экспрессия эритробластами специ фического для них маркера — гликофорина А и В, а также CD36, CD71, CD33, CD117 (Глузман Д. Ф. и др., 2000;

Френкель М. А., 2001). Дифференциальный диагноз проводится с О МЛ МО, М (мегакариоцитарный лейкоз).

Острый мегакариоцитарный лейкоз (М7) — редкая форма ост рого лейкоза, которая характеризуется очень полиморфной карти ной костного мозга. Морфоцитохимическая диагностика этого лей коза затруднена. Властные клетки в количестве не менее 20% пред ставлены недифференцированными бластами, миелобластами и микрогенерациями мегакариобластов. Последние почти таких же размеров, как лимфобласты или миелобласты. Ядра мегакариобла стов характеризуются плотной структурой ядерного хроматина, неотчетливыми нуклеолами, узкой отростчатой базофильной ци топлазмой. Аспират из кости, как правило, беден вследствие мие лофиброза и потому часто малоинформативен. В пунктате встре чаются микрогенерации мегакариоцитов, свободные ядра мегака риоцитов и их обломки. Иногда можно видеть мегакариоциты, отделяющие пластинки. Мегакариобласты не содержат липидов, МПО и ХАЭ. При электронной микроскопии в них выявляется тромбоцитарная нероксидаза. Они демонстрируют довольно высо кую активность осНАЭ, КНЭ и умеренную активность аНБЭ, не сколько чувствительных к ингибитору — фториду натрия (Лугов ская С. А. и др., 1999). Полисахариды располагаются в них в виде скоплений у края мембраны на фоне диффузно окрашенной в ро зовый цвет цитоплазмы. Важно исследование периферической кро ви, где выявляются фрагменты мегакариоцитов и иногда наблюда ется гипертромбоцитоз. Нужно проводить дифференциальную диа гностику с МО, Ml, M5a и острым лимфобластным лейкозом, которая возможна только по результатам иммунофенотипирова ния, выявляющего характерные для М7 маркеры: CD41, CD42 и/ или CD61, CD36. Не менее 50% клеток должны иметь иммунофе Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга нотип мегакариоцитов (Логинский В. Е. и др., 1996;

Глузман Д. Ф.

и др., 2000). В 5% случаев находят цитогенетические нарушения, наиболее частыми из которых являются моносомия 7 или трисо мия 8, 10 и 21. Таким образом, из острых миелобластных лейкозов острый недифференцируемый лейкоз, эритролейкоз и острый ме гакариоцитарный лейкоз прежде всего нуждаются в обязательном иммунофенотипировании для установления антигенного профиля их бластных клеток.

Острый плазмобластный лейкоз — очень редкая форма острого лейкоза. Одни авторы считают, что он является лейкозом de novo, следствием пролиферации и экстрамедуллярного распростране ния незрелых плазматических клеток (Воробьев А. И. и др., 2002;

Mufti G. J. et al.,1996). По мнению других авторов, это может быть проявлением множественной миеломы, ее бластной трансформа цией (Dimopoulos M. A., Palumbo A.,1994). Плазмобластный лей коз характеризуется анемией и нейтропенией. Костный мозг ин фильтрирован плазмобластами и более зрелыми клетками этого ряда. Маленькие плазматические клетки могут циркулировать в крови в большом количестве, в отличие от множественной миело мы. Плазмоциты имеют выраженную базофилию цитоплазмы, сгу щающуюся к краю мембраны, и перинуклеарную зону. В цитоплаз ме могут встречаться азурофильные включения, подобные тель цам Ауэра. В некоторых случаях плазмобласты могут достигать больших размеров и напоминать бластные клетки при некоторых миелобластных лейкозах или крупные бласты злокачественной лимфомы (Mufti G. J. et al, 1996). Цитохимически в плазмоблас тах выявляется высокая активность кислой фосфатазы и р-глюку ронидазы в виде гранул (Глузман Д. Ф., 1978;

Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К, 1983). Плазмобласты продуцируют патологиче ские иммуноглобулины. Рекомендовано обязательное иммунофе нотипирование для выявления обычных антигенов В-клеточной лимфоидной дифференцировки и поздних В-клеточных антиге нов, например CD38 (Mufti G. J.,1996).

Под нашим наблюдением находилось двое больных с плазмо бластным лейкозом. В обоих случаях имело место тотальное за мещение костного мозга плазмоцитами различной степени зрелос ти — от плазмобластов до зрелых плазматических клеток. Плазма тические клетки циркулировали в периферической крови, наблю далась спленомегалия. При проведении цитохимических реакций у обоих больных в большинстве клеток определялась высокая ак тивность кислой фосфатазы. В части клеток была выявлена аНАЭ и слабая диффузная реакция на полисахариды.

94 Часть 1. Теоретическая гематология Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ). Внедрение метода иммунофенотипирования позволило разделить ОЛЛ на Т- и IB клеточные типы, включающие иодварианты, соответствующие раз личным уровням дифференцировки лимфоидных клеток. Возраст ные, клинические, прогностические особенности ОЛЛ также по казали, что лимфобластные лейкозы представляют собою весьма гетерогенную группу заболеваний. Авторы последних классифи каций лейкозов (классификация ВОЗ, 2000, 2002) сочли нецелесо образным сохранение терминологии ФАБ-классификации для ОЛЛ (LI, L2, L3) в связи с тем, что диагностические и прогности ческие критерии морфологических вариантов L1 и L2 недостаточ ны, их корреляции с иммунофенотипом и генетическими маркера ми чаще всего не наблюдается, а форма L3 ОЛЛ является эквива лентом лимфомы Беркитта в фазе лейкемизации. Классификация ВОЗ включает вместо лимфобластного лейкоза В-лимфобластный лейкоз/лимфому и Т-лимфобластный лейкоз/лимфому. В то же время А. И. Воробьев с соавторами (2002) сочли необходимым вы делять ранее описанные основные формы В- и Т-лимфобластных острых лейкозов у детей и взрослых.

Морфологические особенности лейкозных лимфобластов варьируют в широких пределах. Микрогенерации лимфобластов (7-10 мкм) характеризуются очень узкой цитоплазмой, плотным ядерным хроматином, слаборазличимыми единичными нуклео лами. Существуют варианты ОЛЛ, отличающиеся более гетеро генным составом бластной популяции, включающей как мелкие, так и средние и крупные бластные клетки с ядрами различных очертаний, более тонкой структурой ядерного хроматина и чет кими одним-двумя ядрышками. Их цитоплазма достаточно выра жена, и в таких случаях необходима дифференциальная диагнос тика с ОМЛ — Ml, МО, Мбв. М7. Бластные клетки при беркитто подобном ОЛЛ/лимфоме Беркитта характеризуются средними и большими размерами, резко базофильной вакуолизированной ци топлазмой. В настоящее время главным критерием в классифика ции ОЛЛ являются не морфоцитохимические характеристики бластов, а их иммунофенотипическая характеристика и выявле ние линейных (Т- или В-клетки) или стадиеснецифических мар керов. Кроме того, для диагностики имеет значение выявле?ше различных патогенетических аномалий в лимфобластах. В то же время в ряде случаев морфоцитохимические особенности лим фобластов могут быть дополнительным критерием в дифферен циальной диагностике как между Т- или В-клеточными вариан тами ОЛЛ, так и между ОЛЛ и некоторыми формами нелимфо Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга бластных лейкозов. Литературные данные (Глузман Д. Ф. и др., 1975: Глузман Д. Ф. и др., 1987;

Глузман Д. Ф. и др., 2000) и наш опыт показали, что Т- и В-лимфобласты имеют морфоцитохими ческпе особенности. В-лимфобласты отличаются большим поли морфизмом, в то время как Т-лимфобласты — небольшие клетки с высоким ядерноцитоплазматическим соотношением. Призна ком В-лимфобластов является наличие в них, в большинстве слу чаев, полисахаридов. В миело- и монобластах реакция имеет сла бый диффузный или мелкогранулярный характер, причем грану лы располагаются беспорядочно на фоне диффузно окрашенной цитоплазмы. В В-лимфобластах средние и крупные темно-мали новые гранулы гликогена располагаются в виде венчика на фоне неокрашенной цитоплазмы, иногда сливаясь в блоки. Могут вы являться лишь 1-2 крупные гранулы в небольшом количестве клеток, иногда располагаясь над ядром клетки. В Т-лимфоблас тах полисахариды чаще всего не выявляются или имеют характер скудной мелкой зернистости в части клеток. В то же время в Т-лим фобластах обнаруживается высокая активность кислой фосфата зы, ос-нафтилацетат-эстеразы и КНЭ. Кислая фосфатаза может располагаться в цитоплазме этих клеток в виде крупных гранул или фокусно — в виде пятна. Такой характер распределения фер мента, а также отсутствие или слабая реакция на полисахариды типичны для Т-клеточного ОЛЛ, хотя нужно учитывать, что по добный характер реакции наблюдается иногда в эритро-, моно- и мегакариобластах. осНАЭ располагается в Т-лимфобластах ло кально, в виде 1-2 небольших, интенсивно окрашенных пятны шек. Реакция не чувствительна к фториду натрия. Активность КФ, аНАЭ и КНЭ в В-лимфобластах чаще всего не определяется или слабо выражена.

Для подтверждения диагноза ОЛЛ имеет значение не только выявление полисахаридов или кислой фосфатазы, но и отрица тельные реакции на маркерные для миелоидных клеток миелопер оксидазу, липиды и хлорацетат-эстеразу.

Диагностика редких вариантов бифенотипичных, гибридных (бласты несут одновременно антигены двух различных клеточных линий) или стволовоклеточных лейкозов (клетки экспрессируют в основном антигены ранних предшественников гемопоэза) цели ком основана на иммунофенотипировании.

Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Роль цитохимических ис следований при хронических лейкозах не столь велика, как при ОНЛЛ, однако нужно отметить важность реакции на щелочную фосфатазу (ЩФ) в зрелых нейтрофилах при ХМЛ. Щелочная фос 96 Часть 1. Теоретическая гематология фатаза является маркером этой формы лейкоза. При ХМЛ в раз вернутой фазе заболевания активность ЩФ в нейтрофилах резко снижена или может вообще отсутствовать. Дефицит ЩФ в нейт рофилах ассоциирован с хромосомными нарушениями при ХМЛ и является скорее всего результатом транслокации t(9;

22) и суще ствования химерного гена BCR-ABL.

Властный криз ХМЛ характеризуется повышением активности ЩФ и иногда ее полной нормализацией. Определение активности ЩФ имеет значение при дифференциальной диагностике ХМЛ с миелофиброзом, полицитемией и лейкемоидными реакциями, при которых активность ЩФ нормальна или даже повышена. Исполь зование цитохимических реакций на МП, фосфолипиды и поли сахариды способствует идентификации БК ХМЛ миелоидного или лимфоидного типа.

Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ). При ВКЛ более чем в 90% случаев клетки имеют иммунофенотип зрелых В-лимфоци тов. Они экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD19, CD20, CD22. Кроме обычного варианта ВКЛ описывают лейкемический тип этого заболевания, при котором, как считают, лейкемические клетки менее зрелые. Особенностью ВКЛ является присутствие в костном мозге и периферической крови специфических лейкеми ческих клеток, морфология которых послужила основанием для появления названия этого лейкоза. Это мононуклеары, цитоплаз ма которых имеет отростчатые, ворсинчатые очертания. Ядра кле ток круглые, овальные, лопастные, имеют нежносетчатую структу ру хроматина и слабо контурируемые 1-2 нуклеолы. Цитоплазма голубого или серо-голубого цвета. Для диагностики ВКЛ имеет значение выявление активности тартрат-резистентной кислой фос фатазы, которая обнаруживается у 95% больных (Луговская С. А.

и др., 1999), и НЭ. Одно-, двух- или трехростковая цитопения, нейтропения и моноцитопения, а также спленомегалия очень ха рактерны для ВКЛ (Волкова М. А., 2001).

Таким образом, вопреки мнению некоторых авторов, предлага ющих отказаться от морфоцитохимического анализа клеток при диагностике лейкозов (Бене М. К. и др., 1996), в настоящее время' общепризнано, что первоначальная диагностика большинства ОНЛЛ основана на результатах морфоцитохимических исследо ваний, которые являются в этих случаях достаточно информатив ными и доступными методами. В то же время для диагностики таких вариантов штелобластных лейкозов, как ОМЛ Ml, ОМЛ МО, ОМЛ Мбв, ОМЛ М7, для дифференциальной диагностики между М2 и M3v, М5в и M3v вариантами ОМЛ, а также для всех Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга лимфобластных лейкозов необходимо проводить иммунофеноти пирование и цитогенетические исследования.

Литература Абдулкадыров К. М., Харченко М. Ф., Шляпочникова Г. П. и др. Цитоморфологи ческие и некоторые биохимические особенности бластных клеток при остром промиелоцитарном лейкозе // Пробл. гематол. 1978. № 23(9). С. 18-20.

Бене М. К., Кастольди Г., Harm В. и др. Предложения для иммунологической классификации острых лейкозов (Европейская группа по иммунологической классификации лейкозов) // Гематол. и трансфузиол. 1996. № 6. С. 43-45.

Бронштейн М. И., Френкель М. А. Гистохимические особенности лейкоцитов крови и костного мозга в норме /'/ Руководство по гематологии / Под ред.

А. И. Воробьева. М, 2002.Т. 1. С. 137-145.

Волкова М. А. Волосато-клеточный лейкоз // Клиническая онкогематология:

Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 396-410.

Воробьев А. И., Бриллиант М. Д., Савченко В. Г. Гемобластозы // Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1. С. 147-236.

Глузман Д. Ф., Юдин В. М., Сидоренко С. П. и др. Морфологические критерии распознавания Т- и В-лимфоцитов и их возможное применение при изучении неопластических процессов // Иммунология опухолей. Киев, 1975. С. 57-59.

ГлузманД. Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. Киев, 1978. 215 с.

Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А. и др. Рецепторы поверхностных мембран, дифференцировочные антигены и цитохимические признаки клеток крови при остром лимфобластном лейкозе у детей // Эксп. онкол. 1987. № 3.

С. 36-39.

Глузман Д. Ф., Абраменко И. В., Скляренко Л. М. и др. Диагностика лейкозов:

Атлас и практическое руководство / Под ред. Д. Ф. Глузмана. Киев, 2000.

Дульцина С. М., Дягилева О. А., Кореневская М. К. и др. Исследование активно сти ос-нафтилбутират-эстеразы в клетках периферической крови здоровых лю дей // Лаборат. дело. 1986. № 10. С. 590-594.

Ковалева Л. Г. Острые лейкозы. М„ 1990. 272 с.

Лецкип В. Б. Цитохимические исследования лейкоцитов. Л., 1973. 36 с.

Логинский В. Е., Выговская Я. И., Масляк 3. В. и др. Значение иммунологическо го фенотипирования бластных клеток в диагностике острой миелоидной лей кемии у взрослых // Эксп. онкол. 1996. № 18. С. 146-149.

Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е. Лабораторная диагностика лей козов: Учебное пособие. Тверь, 1999. 78 с.

Морозова В. Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л., 1977.152 с.

Пирс Э. Гистохимия. М., 1962. 944 с.

Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., Исаев В. Г. и др. Острые промиелоцитарные лейкозы: Эпоха новых знаний и достижений // Гематол. и трансфузиол. 2001.

№ 46 (3). С. 26-34 (а).

Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н. Острые лейкозы // Клиническая онкогемато логия. Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 156-207 (б).

Френкель М. А. Современная диагностика острых лейкозов // Заочная акаде мия последипломного образования. М., 1999. С. 25-33.

Френкель М. А. Лабораторная диагностика острых лейкозов // Клиническая онкогематология: Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М., 2001.

С. 146 4 Гематология. Нов. справочник Глава КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ В ГЕМАТОЛОГИИ Кроветворные клетки животных и человека начали культиви ровать в конце XIX—начале XX в. (Скворцов И. П., 1885;

Arnold, 1887;

Maximov A. A., 1927).

Под культурой клеток понимают совокупность жизнеспособ ных клеточных элементов, полученных в результате их выращива ния и сохранения при определенных условиях вне организма хозя ина. Для культивирования клеток и тканей, а также поддержания их жизнедеятельности применяют различные культуральные сис темы. Культуральные системы с использованием сред на гелевой основе (агар, метилцеллюлоза, коллаген), в отличие от жидких культур, ограничивают способность имплантированных в среду клеток к движению, фиксируют их в одном месте, не позволяя «расползаться» в процессе деления материнской клетки. Таким образом, клетки, способные пролиферировать, образуют в полу твердых и вязких средах дискретные колонии — клеточные агрега ты, представляющие из себя клон, т. е. потомство одной делящейся клетки, состоящее из однотипных клеточных элементов, которые можно анализировать. Поэтому методы культивирования клеток в полутвердых и вязких средах, а также колониеобразование в усло виях in vivo, называют методами клонирования.

Изучение кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга с использованием методов клонирования относится к 70-м годам прошлого столетия. С этого времени, благодаря работам J. E. Till, Е. A. McCulloch (1961), а также исследованиям A. J. Friedenstein и соавторов (1968), Т. R. Bradley, D. Metcalf( 1966) и других исследо вателей, методы клонирования кроветворных и стромальных кле ток заняли прочное место среди других функциональных методов изучения системы крови. Клонирование кроветворных клеток от крыло новые огромные возможности для понимания процессов Глава 6. Клеточные культуры в гематологии кроветворения. Благодаря этому удалось доказать клоногенный характер стволовых кроветворных клеток (СКК), т. е. происхожде ние клона однотипных клеток из одной исходной клетки.

Выявление клонов, содержащих клетки двух и более клеточных типов (смешанные колонии), доказало полипотентность СКК, то есть способность их к развитию в направлении всех кроветворных ростков. Разработка воспроизводимых методов клеточных куль тур для различных типов гемопоэтических клеток-предшествен ников послужила мощным импульсом для изучения нормального и патологического кроветворения. Культуральные методы, позво лившие изучать гемоноэз ex vivo, оказались очень полезными для исследования СКК, коммитированных (направленных к диффе ренцировке) клеток-предшественников (ККП) и их потомства, а также для различных манипуляций с гемопоэтическими клетками в культуре, изучения экспрессируемых ими медиаторов кроветво рения — цитокинов, влияния на эти клетки различных экзо- и эндогенных факторов, таких как радиация, медикаментозные сред ства и различные гуморальные и физические факторы.

Методы клонирования клеток позволили оценить величину пула СКК в костном мозге, охарактеризовать потомство этих клеток, объединенных в клоны, выявить промежуточные этапы их диффе ренцировки от мультипотентной СКК через стадии коммитиро ванных поли- и моноолигоиотентных клеток-предшественников различных клеточных линий до уровня морфологически распо знаваемых в световом микроскопе бластных клеток костного моз га, а также доказать клоногенные свойства стволовых клеток и клеток-предшественников стромы костного мозга. Поли- и моно олигопотентные клетки-предшественники способны дифференци роваться в направлении 2-5 кроветворных линий. Клетки, дающие рост колоний в условиях вне организма, называют колониеобразу ющими единицами (КОЕ). Например КОЕ, образующие в агаре, метилцеллюлозе или селезенке облученного животного смешан ные колонии из гранулоцитов, эритрокариоцитов, макрофагов и мегакариоцитов, называют КОЕ-ГЭММ и т. д.

Результаты этих исследований, ставшие возможными благода ря внедрению методов клонирования, изучение кинетики гемопоэ тических клеток, открытие явления апоптоза — запрограммиро ванной клеточной смерти — оказались чрезвычайно важными для понимания механизма гомеостаза — равновесия внутренней среды организма и сбалансированности всего процесса кроветворения.

Сегодня значение культуральных исследований гемопоэтических клеток для науки и практической медицины трудно переоценить.

Часть 1. Теоретическая гематология В то же время необходимо решать многие проблемы, связанные с особенностями культуральных методик, в частности, с вариабель ностью роста и качеством колоний в зависимости от типа культу ральной системы, количества и концентрации различных компонен тов культуральных сред, применяемых в различных лабораториях.

Стандартизация и оптимизация культуральных сред и условий культивирования призваны уменьшить возможные ошибки и по высить адекватность и информативность этих методов. Среди не обходимых условий культивирования нужно отметить прежде все го использование качественных культуральных сред, содержащих необходимые колониестимулирующие факторы (КСФ), а также температурные условия, влажность, газовую среду и т. д. Наруше ние условий культивирования приводит к снижению эффективно сти клонирования и изменению качества и морфологического со става клеточных агрегатов в культуре.

Методы культивирования клеток По способу культивирования клеток различают культуры ех vivo — вне организма и in vivo — в организме. Для выращивания клеток ex vivo применяют различные культуральные системы и среды. Культуралыгая среда призвана обеспечить оптимальный ре жим жизнедеятельности клеток и тканей. Среды для культивиро вания делят на естестественные (сыворотка, плазменный сгусток и др.) и синтетические (среды Игла, МакКоя, Пскова и их модифи кации — D-MEM, IMDM, RPMI и многие другие). Хорошо зареко мендовали себя среды IMDM (среда Дульбекко, модифицирован ная Исковым), среды с метилцеллюлозой (Methylcellulose Culture Medium), «полные» среды с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), эритропоэтином (ЭРП) и всеми необходимыми для роста СКК и коммитированных клеток-предшественников ростовыми факторами, а также «неполные» — без ЭРП, или ЭТС, или каких либо цитокинов. Культуральные среды предназначаются для под держания жизнедеятельности непролиферирующих соматических клеток (поддерживающие среды) или для обеспечения процессов пролиферации и дифференциации клеток (ростовые среды с рос товыми факторами).

Культуральные среды могут быть жидкими, вязкими, полутвер дыми и твердыми. Синтетические среды состоят из воды, солевых растворов, буферных систем, витаминов, аминокислот, ростовых факторов и т. д. Составной частью многих сред являются сыворот ки: крови человека, эмбриональная телячья, бычья, лошадиная, Глава 6. Клеточные культуры в гематологии свиная, новорожденных телят и ягнят, сыворотка плаценты здоро вых рожениц (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985;

Гольдберг Е. Д.

и др., 1992). Культуры могут быть краткосрочными (4-24 часа). 8 14-дневными и длительными (5-8 недель и более), в зависимости от поставленных задач.

По характеру базового субстрата культуральные системы де лятся на: 1) суспензионные, где клетки находятся в жидкой пита тельной среде в разобщенном состоянии;

2) на основе плазменного сгустка;

3) на основе полутвердых агаровых или коллагеновых сред;

4) на основе вязких сред — метилцеллюлозы. Кроме того, клональ ный рост стволовых кроветворных клеток и коммитированных кле ток-предшественников изучают in vivo, например, в селезенке смер тельно облученных мышей или в диффузионных камерах с агаром или плазменным сгустком, имплантированные облученным жи вотным интраперитонеально или под капсулу почки, а также в длительных культурах на стромальной подложке. Основным усло вием для получения колоний, образованных различными гемопоэ тическими предшественниками, является присутствие в культуре необходимых колониестимулирующих факторов (факторов роста клеток).

Метод селезеночных колоний (Till J. E., McCulloch E. A., 19G1) заключается в том, что внутривенно вводят костномозговую кле точную взвесь смертельно облученной мыши, собственный гемо позз которой тотально подавлен, после чего в ее селезенке образу ются макроскопически видимые скопления кроветворных клеток, каждое из которых является клоном, т.


е. представляет собою по томство одной клетки — колониеобразующей единицы селезенки (КОЕс). Среди них наблюдаются колонии, состоящие из однотип ных клеток (гранулоцитов, макрофагов, эозинофил'ов, эритроидных клеток и др.), и смешанные колонии, включающие представителей двух и более клеточных линий. Так был доказан клоногенный характер КОЕс и их полипотентность — способность развиваться в направлении нескольких клеточных линий. При переносе отдель ных клеток из этих колоний в новую культуральную систему сно ва получали дискретные колонии из однотипных клеток или сме шанные колонии, что говорит о способности этих клеток к само поддержанию. Полагают, что в селезенке облученных животных клональные свойства проявляют СКК с ограниченной способно стью к самоподдержанию, а также их потомки — коммитирован ные клетки-предшественники клеточных линий (коммитирова ние — необратимая направленность стволовой клетки к диффе ренцировке).

104 Часть 1. Теоретическая гематология Различные культурадьные системы обладают различной «раз решающей» способностью для клонирования клеток. Простые ага ровые системы, в которых источником КСФ для клоногенных кле ток служат лейкоциты донорской крови, обеспечивают клональ ный рост только моно- и бнпотентных КОЕ, или КОЕк — коло ниеобразующих единиц в культуре, где они формируют локализо ванные клеточные агрегаты — колонии, которые могут быть иден тифицированы и анализированы под обычным световым микро скопом. Среди них различают КОЕ-Г (гранулоцитарные), КОЕ-М (моноцитарно-макрофагальные), КОЕ-Эоз (эозинофильные), КОЕ-ГМ (гранулоцито-макрофагальные) и др. Более сложные культуральные системы, оптимизированные кондиционированны ми средами (КС) или различными КСФ, обеспечивают клональ ный рост не только уни- и бипотентных клеток-предшественни ков, но и КОЕ-ГЭММ.

Для культивирования клеток используют стерильные пласти ковые или стеклянные чашки Петри, флаконы Карреля, Эрла и др.

Культивирование производят либо в инкубационных камерах при +37 °С, с постоянной газовой атмосферой (кислорода — 5%, углекислого газа — 10% и азота — 85%) и 100% влажностью, либо в термостате при +37 °С, в герметически закрытых стеклянных эк сикаторах или пластиковых контейнерах, где также поддерживает ся необходимая влажность и газовая атмосфера.

Для достижения эффекта клонирования в культуральную среду должны быть внесены стимуляторы роста клеток (специфические ростовые факторы). Характер и количество ростовых факторов зависят от типа культуралыгой системы и поставленных задач.

Культивирование клеток в агаре Клетки-предшественники грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ).

Полутвердые агаровые среды используют в одно- и двухслойных агаровых культурах для выращивания и поддержания жизнедея тельности моноцитарно-макрофагальных, гранулоцитарных, гра нулоцито-макрофагальных и других миелоидных клеток-предше ственников. Агар, получаемый из морских водорослей, образует гелевый субстрат, позволяющий клонировать клетки. Используют такие образцы агара, как бактоагар Difco (США), агар-агар, бакто агар Serva (Германия) и др.

В 1966 г. Т. R. Bradley и D. Metcalf в двуслойной агаровой систе ме культивировали костный мозг мыши и получили рост грануло цито-макрофагальных колоний. В 1970 г. В. L. Pike и W. A. Robinson использовали двуслойную агаровую среду для культивирования Глава 6. Клеточные культуры в гематологии человеческих кроветворных клеток. При данном методе в чашку Петри помещают 0,5%-ный расплавленный агар с донорскими лей коцитами (источник КСФ) и после застывания на него наслаива ют верхний слой 0,3%-ного агара с тестируемыми клетками в коли честве 1,0-1,5 х 10'миелокариоцитов. Таким образом, нижний слой служит питательной средой для клеток верхнего слоя.

Колониестимулирующим фактором для гранулоцитов и макро фагов в этой системе является КСФ, продуцируемый моноцитами и макрофагами донорской крови. Чашки Петри помещают в термо стат при описанных выше условиях на 7-8 дней. По истечении этого срока оценивают количество выросших клеточных агрега тов-колоний и кластеров в световом микроскопе. За кластер при нимают клеточные агрегаты, содержащие от 3 до 40-50 клеток.

Агрегаты в составе 40-50 и более клеток оцениваются как коло нии. Количество гранулоцитарных, моноцитарно-макрофагальных и гранулоцито-моноцитарных колоний в норме колеблется от 8 до 150 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем около 30, количество кластеров — от 10 до 340 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем около 70 (Афанасьев Б. В. и др., 1980;

Балашова В. А., 1985;

Entriii ger M. A. et al., 1977). Соотношение кластер/колония в норме ко леблется в среднем от 2 до 5 и не превышает 12 (Metcalf D. et al., 1979). Эта культуральная система пригодна для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В культуре доказана их высокая чув ствительность к радиации, воздействию химиопрепаратов и таких физических факторов, как излучение лазера, УФО, магнитные из лучения, соединения перфторуглеродов и т. д. (Балашова В. А. и др., 1988;

Абдулкадыров К. М. и др., 1992, 1995).

Культивирование гемопоэтических клеток в системе «агаровая капля—жидкая среда»

Эта система предложена Б. В. Афанасьевым в 1983 г. и пред назначена главным образом для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В отличие от системы Пайка и Робинсона она не содер жит нижнего агарового слоя. Вместо верхнего слоя агара использу ется агаровая капля — гель. Тестируемые клетки имплантируют в 0,3%-ный агар (Difco, США) в количестве 1,0-1,5 х 105 миелока риоцитов на 0,5 мл агаровой среды, включающей также ЭТС и питательную среду типа D-MEM, IMDM и др. С помощью шприца и тупоконечной иглы жидкий агар с клетками размещается на дне чашки Петри, где и застывает в форме капли-геля. После застыва ния капли в чашку наливают 2,5 мл питательной среды с донорски ми лейкоцитами в концентрации 1 х 10 клеток на 1 мл жидкой IOG Часть 1. Т е о р е т и ч е с к а я г е м а т о л о г и я среды (фидер). В состав среды входят также ЭТС и антибиотики.

Фидер служит источником гранулоцитарно-моноцитарного КСФ, основным продуцентом которого являются моноциты донорской крови. Эффективность клонирования возрастает при внесении в жидкую фазу системы специальной среды, кондиционированной стимулированными ФГА (фитогемагглютинин) монойуклеарны ми лейкоцитами периферической крови, или добавлении коктейля из рекомбинантных цитокинов (McNiece I. К. et al., 1991;

Bern stein I. D. et al., 1991;

Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995).

В таких системах растут не только КОЕ-ГМ, но и КОЕ-ГЭММ, и КОЕ-Бл (бластные колонии). Преимуществом системы «агаровая капля—жидкая среда» является способность поддерживать кло нальную пролиферацию не только нормальных, но и лейкозных клеток (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Система также бо лее оптимальна для межклеточных взаимодействий тестируемых клеток с клетками фидера (лейкоцитами донора) и позволяет из учать влияние на КОЕ-ГМ различных веществ, препаратов и фи зических факторов.

Клонирование клеток-предшественников эритропоэза и мегакариоцитопоэза (БОЕЭ, КОЕЭ, БОЕ- Мгщ КОЕ Мгкц) Для клонирования клеток-предшественников эритропоэза (КПЭр) используют различные культуральные системы, но глав ным образом системы с применением плазменного сгустка, агара или метилцеллюлозы. Получение максимально обогащенной клет ками-предшественниками эритропоэза клеточной взвеси достаточ но трудоемко и состоит из нескольких этапов, одним из которых является осаждение клеток в градиентах плотности (Stephenson I. R.

et al., 1971;

Tepperman A. D. et al., 1974). Культивирование КПЭр в агаровых культурах практически не отличается от культивирова ния КОЕ-ГМ, однако при клонировании эритроидных предше ственников необходимо внесение в культуру главного регулятора эритропоэза — эритропоэтина (ЭРП) и некоторых кондиционных сред (бурстстимулирующей активности — БСА), полученных в результате стимулирования ФГА клеток селезенки или лейкоци тов (ФГА-ЛКС). Более ранние примитивные предшественники эритропоэза называют бурстобразующие («бурст» — взрыв) еди ницы эритропоэза (БОЕ-Э). Они формируют в метилцеллюлозе, оптимизированной кондиционированными средами и/или росто выми факторами, большие агрегаты из 16 и более кластеров и со держат до 104 клеток. Более зрелые БОЕ-Э образуют малые бур сты из 3-8 кластеров и могут содержать 200-500 гемоглобинизи Глава 6. Клеточные культуры в гематологии рованных эритроидных клеток. КОЕ-Э (колониеобразующие еди ницы эритропоэза) образую! агрегаты, содержащие 100-200 эри трокариоцитов (Eaves С. I., Eaves А. С, 1978;

McNiece et al, 1991).

Для идентификации клеток в эритроидных колониях и бурстах используют также пероксидазную окраску с бензидином (Гольд берг Е. Д. и др., 1992), производят оценку колоний по способности клеток утилизировать железо (59Fe) или проводят иммунофено типирование для выявления маркера эритроидных клеток — гли кофорнна А.

Для клонирования клеток-предшественников мегакариоцито поэза (БОЕ-Мгкц и КОЕ-Мгкц) используют различные культу ральные системы: культивирование в агаре, плазменном сгустке, на коллагене и агарозе. Разработана система с использованием сво бодной от ЭТС среды, так как ЭТС, содержащая TGF-p и обычно используемая в системах для клонирования эритроидных и грану лоцитарно-моноцитарных клеток-предшественников, ингибирует рост мегакариоцитов (Kaushansky К.,1995;

Bertolini F. et al., 1997).

Рекомбинантные цитокины, особенно тромбопоэтин, а также IL3 и IL6, позволяют оптимизировать условия для пролиферации и диф ференциации КОЕ-Мгкц. Кроме того, использование гелевых по лутвердых сред па коллагене (среда Mega-Cult) позволяет кло нальному потомству одной клетки оставаться вместе для образо вания колоний. Коллаген, как считают, удобен и предпочтителен для формирования стабильного гелевого матрикса, который под держивает рост и развитие КОЕ-Мгкц и позволяет in situ произво дить иммуногистохимическую окраску колоний с использованием антител против CD41 (маркера мегакариоцитов) после дегидрата ции геля. При окраске на кислую фосфатазу мегакариоциты окра шиваются в розовый цвет, а их ядра — в голубой.


Мегакариоцитарные колонии должны содержать от 4 до 50 кле ток. Выделяют три типа колоний: I — колонии из 4-30 зрелых мегакариоцитов;

II — колонии из более чем 30 клеток мегакарио цитарного ростка;

III — колонии из мононуклеаров, экспрессирую щих маркеры мегакариоцитов и дифференцирующиеся позже в мегакариоциты (Гольдберг Е. Д. и др., 1992).

Клонирование полипотентных коммитированных предшественников в агаре и метилцеллюлозе В полутвердой агаровой и вязкой метилцеллюлозной средах в присутствии кондиционированных сред (КС) и ЭРП происходит рост смешанных колоний - КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГЭМ, КОЕ-ГММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭ, КОЕ-ЭМ (Колесникова А. И., Смирнов А. Н., 108 Часть 1. Теоретическая гематология 2002;

Johnson G. R., Metcalf D., 1977;

Fauser A. A., Messner H. A., 1979). Разработаны высокоэффективные «полные» среды IMDM на метилцеллюлозе с коктейлем из рекомбинантных цитокинов.

Компоненты этих сред поддерживают рост в культуре СКК и обес печивают рост мультилинейных колоний (КОЕ-ГЭММ), эритро идных колоний (БОЕ-Э, КОЕ-Э), грануломоноцитарных (КОЕТМ) и др. (Bernstein I. D. et al, 1991). «Полная» среда может включать кроме метилцеллюлозы с IMDM эмбриональную телячью сыво ротку, бычий сывороточный альбумин, 2-меркаптоэтанол, L-глю тамин, ростовый фактор стволовых клеток (ФСК), ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и ЭРП. В таких системах СКК способны в течение 2-3 недель образовывать очень большие (10 3 клеток) колонии, состоящие только из бластов. Перенесенные в свежую среду блас ты генерируют дочерние бластные колонии, демонстрируя способ ность к самоподдержанию. Оптимизировать рост бластных коло ний, в состав которых входят СКК, можно, используя взвесь кост номозговых клеток, обогащенных субпопуляциями СВ34*-клеток, являющихся ранними предшественниками гемопоэтических клеток.

Длительные клеточные культуры Эти культуры растут на подложке — выращенном слое стро мальных клеток — фибробластов, адипоцитов, макрофагов, эндо телиальных клеток (Чертков И. Л., Гуревич О. А., 1984;

Dexter Т. М.

et al., 1977). Клетки в этих культурах можно многократно пере севать, они выдерживают несколько пассажей и не теряют поли потентности (Moore M. A. S. etal, 1978;

Petzer A. L. etal., 1996). Это происходит благодаря контакту кроветворных тестируемых кле ток со стромальными клетками подложки, питающими их. В дли тельных культурах кроме уни- и бипотентных КОЕ достигается рост ранних гранулоцитарных, эритроидных и мегакариоцитарных клеток-предшественников уровня КОЕ-ГЭММ, КОЕс, КОЕ-Бл, КООБ, а также Т-лимфоцитов (Дерюгина Е. И. и др., 1990;

Fanning S. F. et al., 1993). КООБ — клетки, образующие области «булыжника», были названы так потому, что клеточные элементы в них тесно прилегают друг к другу. Каждая КООБ является кло ном, состоящим из бластов, среди которых находятся и СКК. Кро ме того, в длительных культурах на стромальной подложке выяв лено большое количество мезенхимальных полипотентных кле ток, которые, как известно, являются предшественниками не только клеток стромы, но и при определенных условиях могут трансфор мироваться в гемопоэтические клетки (Friedenstein A. J. et al.,1968;

Репин В. С, 2001;

Сухих Г. Т. и др., 2002;

Seshi В. et al.. 2000).

Глава 6. Клеточные культуры в гематологии Длительные клеточные культуры, оптимизированные жидкой средой типа MyeloCult (Myeloid Long-term Culture Medium) (Ка нада), в присутствии рекомбинантных цитокинов позволяют:

1) создать слой стромальных клеток для поддержания примитив ных гемопоэтических клеток;

2) охарактеризовать ростовые фак торы, ингибиторы и молекулы адгезии, продуцируемые стромаль ными клетками;

3) проанализировать факторы, влияющие на нор мальные и лейкемические клетки на модели костномозгового микроокружения ex vivo;

4) исследовать клетки, индуцирующие длительную культуру;

5) нарастить популяцию гемопоэтических клеток.

При исходной плотности костномозговых клеток более 10ь на 1 мл в длительной культуре сначала образуется «прилипающий»

слой мезенхимальных стромальных клеток. Примитивные гемопо этические клетки при наличии соответствующей среды и добавок, условий инкубирования и графика питания, в течение многих не дель взаимодействуя со стромальной подложкой, образуют миело идные клоногенные предшественники и зрелые гранулоциты. Жид кую среду MyeloCult при добавлении кондиционированных сред или рекомбинированных цитокинов также можно использовать для наращивания массы гемопоэтических предшественников в сво бодной от стромы суспензионной культуре.

Методы клонирования гемопоэтических клеток при гематологических заболеваниях Разработка и внедрение методов клонирования кроветворных клеток открыли новые возможности для понимания природы лейкозной стволовой клетки, уровня ее поражения лейкозоген ными факторами, патогенеза лейкозов (Чертков И. Л., Фриден штейн А. Я., 1966;

Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Культу ральные системы обеспечивают клональный рост костномозговых клеток и делают возможным изучение процессов пролиферации и этапов дифференцировки клеток-предшественников и их потом ков в условиях ex vivo. При культивировании клеток крови и кост ного мозга клоногенные свойства могут проявлять как лейкозные, так и нормальные клетки. D. Metcalf (1984) справедливо отметил, что говорить с уверенностью о принадлежности колониеобразую щих клеток в культуре к лейкозному клону можно только при проведении кариологических, иммунофенотипических и других ис следований клеток каждой отдельной колонии. Сегодня такой ана лиз стал возможным.

110 Часть 1. Теоретическая гематология Колониеобразующая способность (КОС) клеток-предшественников гранулоионоцитопоэза при острых лейкозах Результаты многочисленных исследований лейкозных клеток в культуре свидетельствуют о том, что при острых нелимфобласт ных лейкозах (ОНЛЛ) в острой фазе заболевания клоногенные свойства нормальных КОЕк чаще всего угнетены и имеет место патологическое колониеобразование лейкозными клетками-пред шественниками (Афанасьев Б. В., Алмазов В.. А., 1985;

Bull I. M.

et al., 1973;

Moore M. A. S. et al, 1974). При острых лейкозах наблю дается угнетение нормального гемопоэза и замещение нормальной гемопоэтической ткани лейкозными клетками. В то же время при клонировании клеток костного мозга больных малопроцентным лейкозом было показано, что развитие панцитопении у них связа но не только с вытеснением нормальных клеток, по и с высвобож дением из лейкозных клеток кислых изоферритинов, ингибирую щих рост нормальных гемопоэтических клеток. Эксперименталь но было доказано, что рекомбинантный изоферритин ингибирует рост в культуре СКК и ККП (Cassileth P. А. 1984;

Broxmeyer H. Е.

et al., 1981, 1982), а развитие колоний из нормальных КОЕк подав ляется при добавлении в культуральную среду лейкозных клеток (Spitzer G. et al., 1978;

Broxmeyer H. E. et al., 1987;

Olofsson Т., Olsson I., 1980). Кроме того, известно, что лейкозные клетки при ОНЛЛ более чувствительны к низким дозам колониестимулирую щего фактора (КСФ), чем нормальные. Возможно, это является одной из причин преимущественного роста лейкозных клеток in situ по сравнению с нормальными клетками, учитывая, что при острых лейкозах, по данным некоторых авторов, клетки крови не вырабатывают достаточного количества КСФ (Takaku E, 1982;

Metcalf D., 1984) и при снижениии уровня КСФ может возникать «старение» нормальных клоногенных клеток (Senn I. S. et al., 1974).

Пролиферативное преимущество лейкозных клеток подтвержда ется высоким уровнем «тимидинового самоубийства» клеток при ОЛ, в отличие от нормальных клеток.

При ОНЛЛ в большинстве случаев КОС и КЛОС (кластерооб разующая способность) клоногенных миелоидных предшествен ников в агаровых культурах отсутствует или при резком снижении КОС наблюдается повышенное кластерообразование (лейкемиче ский тип роста) (Афанасьев Б.В., 1980;

Мур М. А. С, Меткалф Д., 1973). Колонии и кластеры могут состоять из незрелых миелоид ных клеток — про- и миелоцитов или из одних миелобластов (Spit zer G. et al., 1978).

Глава 6. Клеточные культуры в гематологии G. Spitzer с соавторами (1978) выделили три типа колониеобра зования при острых лейкозах:

1. Отсутствие роста колоний и кластеров либо наличие отдель ных колоний с нормальной морфологией клеток.

2. Множество мелких кластеров (до 20 клеток).

3. Агрегаты лейкозного типа с числом клеток более 20. У боль ных 3-й группы реже достигалась ремиссия, которая была менее продолжительной, чаще развивалась резидуальная болезнь. Авто ры сделали вывод, что характер колониеобразования может слу жить прогностическим признаком при лейкозе.

Б. В. Афанасьев (1980) предложил следующие типы роста КОЕк в агаровой культуре.

1. Нормальный тип роста — КОС от 8 до 67 колоний на 1 х ядросодержащих клеток. Соотношение кластер: колония менее 12.

2. Гипопластический тип роста — КОС менее нижней границы нормы (от 0 до 7), а КлОС — менее 84.

3. Гиперпластический рост — КОС более верхней границы нор мы (67), соотношение кластер : колония не превышает 12.

4. Лейкемический рост — КОС от 0 до 7, КлОС превышает 84, соотношение кластер : колония более 12.

Главным критерием для установления лейкемического типа ро ста является резкое увеличение соотношения кластер/колония.

М. A. S. Moore и соавторы (1974) отмечали наиболее высокую спо собность к образованию кластеров при остром промиелоцитарном лейкозе. Это подтверждают данные М. А. Френкель и соавторов (1994) и наши наблюдения.

Плохим прогностическим признаком считается отсутствие рос та клеток в культуре или повышенное образование крупных клас теров (Moore M. A. S. et al, 1976), хотя есть и прямо противопо ложные сообщения.

Отмечены высокая частота ремиссий у больных с нормальным типом роста в культуре (Moore M. A. S. et al., 1974) и плохой про гноз у больных с лейкемическим типом роста в сочетании с высо кой клонирующей эффективностью (Алмазов В. А. и др. 1981;

Афа насьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). После проведения химиотера пии рост колоний и кластеров, как правило, отсутствует.

В период ремиссии часто происходит восстановление нормаль ного типа колонне- и кластерообразования (Bodey L. P., Rodri guez V., 1978), а цитогенетические исследования подтверждают про исхождение клеток из нормальных предшественников. Показате ли КОС являются ранним прогностическим признаком реакции на химиотерапию, гак как часто ее восстановление происходит рань 112 Часть 1. Теоретическая гематология ше, чем восстанавливается нормальная морфологическая картина костного мозга (Moore М. А. S., 1976;

Spitzer G. et al, 1977). Норма лизация КОС и КлОС — достоверный признак, указывающий на близкую ремиссию.

В то же время С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) выявили у части больных ОМЛ, обследованных ими в период полной ремис сии, характерный лейкемический рост КОЕ-ГМ. Мы ни разу не отмечали этого, но, по нашим наблюдениям, отсутствие какого бы то ни было роста в культуре в период ремиссии не редкость.

Острый лимфобластный лейкоз чаще всего характеризуется от сутствием роста в агаровых системах, приспособленных для КОЕ ГМ, или наличием небольшого числа мелких кластеров и колоний в костном мозге и повышенным колонне- и кластерообразованием в крови.

При использовании культуральных систем с метилцеллюлозой, средой IMDM и рекомбинантными цитокинами при остром лейко зе наблюдается отсутствие роста нормальных КОЕ-Э, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ. В то же время, как и в агаровых культу рах, нередко присутствие большого количества мелких кластеров из бластных клеток. При наступлении ремиссии происходит сни жение (до исчезновения) числа бластных кластеров и появляются нормальные эритроидные и миелоидные колонии (Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995). Рецидив ОНЛЛ часто характеризу ется появлением большого количества мелких кластеров. Проис ходит возвращение к колониеобразованию лейкозного типа, но в этот период наблюдается очень пестрая картина, так как в костном мозге одновременно персистирует колониеобразование за счет нор мальных КОЕк (Spitzer G. et al., 1976). Резкое снижение КОС костного мозга обнаруживают уже за 2-8 недель до развертывания рецидива (Greenberg P. L. et al., 1971).

С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) на примере больных ОНЛЛ, у которых была выполнена аутологичная ТКМ, показали, что ве роятность развития рецидива острого лейкоза существенно выше у тех из них, у кого был выявлен лейкемический тип роста колоний в культуре.

Колониеобразующая способность КОЕ-ГМ при хронических миелопролиферативных заболеваниях При хроническом миелолейкозе (ХМЛ) поражение происходит на уровне полипотентной стволовой клетки, что, в частности, подтверждается фактом нахождения Ph'-хромосомы во всех мие Глава 6. Клеточные культуры в гематологии лоидных клетках и в некоторых популяциях В-лимфоцитов (Bernheim A., Berger R., 1981). Хронический миелолейкоз до разви тия бластного криза (БК) характеризуется гиперпластическим ти пом роста в агаре КОЕк, костного мозга и особенно крови (Забели на Т. С. и др., 1980;

Френкель М. А. и др., 1982).

Гиперплазия пула КОЕк и КЛОЕк у больных ХМЛ может быть объяснена либо увеличением способности лейкемичсских клеток предшественников к самоподдержанию, либо увеличением прито ка КОЕк из пула полипотентных СКК, тем более что пролифера ция лейкозных клеток не увеличена и процент «тимидинового са моубийства» снижен (Забелина Т. С. и др., 1980). Все клетки в колониях и кластерах содержат Ph'-хромосому. Морфология кле ток и соотношение кластер/колония нормальное, хотя число агре гатов может быть в 500 раз больше, чем в норме. При ХМЛ наблю дается повышение уровня КСФ в сыворотке. Прогрессировать заболевания ведет к еще большему росту КОС и КлОС, иногда с преобладанием эозинофилытых агрегатов.

При успешном лечении количество КОЕк уменьшается одно временно со снижением числа гранулоцитов. В период ремиссии КОС костного мозга нормализуется. В стадии БК ХМЛ количе ство КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ в культуре резко снижается, наблю дается лейкемический или гипопластический тип роста КОЕк, как при ОЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980). Появление лейкемического типа роста на ранних этапах, за несколько недель до начала терми нальной фазы, позволяет заподозрить развитие БК ХМЛ (Афа насьев Б. В. и др., 1980;

Афанасьев Б. В., 1980). В период ремиссии БК показатели КОС и КлОС близки к таковым в хронической стадии болезни. Типичным для ХМЛ является наличие бластных колоний и значительное увеличение числа макрофагов.

При клонировании клеток больных ХМЛ в среде IMDM с ме тилцеллюлозой, оптимизированной КС или рекомбинантными цитокинами, также наблюдается резкое увеличение всех типов мие лоидных колоний, в том числе КОЕ-Э и БОЕ-Э (Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995). Для хронического миеломоноци тарного лейкоза наиболее характерен гиперпластический тип рос та КОЕк, а для хронического эритромиелоза — лейкемический тип роста в культуре.

У больных миелофиброзом найдено увеличение КОЕ-ГМ в пе риферической крови и у части больных — в костном мозге.

Истинная полицитемия (ИП). Это миелопролиферативное за болевание, которое характеризуется повышенной репродуктивной способностью общей для миелопоэза клетки-предшественника.

http://www.bestmedbook.com/ 114 Часть 1. Теоретическая гематология Уровень циркулирующего КСФ при ИП повышен (Spitzer G. et al., 1978;

Eaves С. I., Eaves A. C, 1978).

По данным Л. В. Филева и соавторов (1982), в агаровой куль туре клеток костного мозга больных ИП число КОЕ-ГМ и КЛОЕ-ГМ на 1 х 10' клеток соответственно в 3-7 раз превышало нормальные показатели. В период ремиссии данные показатели снижались, хотя оставались высокими. Эта особенность ИП помо гает в дифференциальной диагностике с симптоматическими эрит роцитозами (СЭ), при которых КОС клоногенных миелоидных клеток ниже, чем в норме, так как СЭ характеризуется угнетением функциональной активности КОЕ-ГМ.

В метилцеллюлозе со средой IMDM, оптимизированной КС или коктейлем рекомбинантных цитокинов, колон иеобразующая способность БОЕ-Э и КОЕ-Э при ИП резко увеличена. Образуют ся колонии из созревающих эритробластов, причем более чем 10% КОЕ-Э и БОЕ-Э продуцируют гемоглобинизированные колонии в отсутствие ЭРП, хотя их размер, степень созревания и гемоглоби низация ниже, чем в культурах с ЭРП. Эта ненормальная эритро поэтин-незавнеимость неопластических эритроидных предшествен ников сохраняется даже после многих лет лечения больного, что используют для диагностики ИП. Не так постоянно, но такие ЭРП независимые колонии могут развиваться и при ХМЛ и эссенци альной тромбоцитемии.

Миелодиспластический синдром (МДС) При МДС, учитывая выраженную гетерогенность этой группы заболеваний, наблюдается различная КОС костного мозга. G. Spit zer с соавторами (1978), L. P. Bodey, V. Rodriguez (1978) показали 3 типа роста КОЕк в агаре при МДС:

1-й — формирование нормальных колоний и кластеров с их нормальным соотношением;

2-й — развитие колоний и кластеров как нормального, так и лейкозного типа;

3-й — формирование клеточных агрегатов только лейкозного типа (маленькие кластеры, состоящие из бластов, при отсутствии колоний. Их число может быть очень большим).

У больных со 2-м и 3-м типом роста клеток в культуре острый лейкоз развивался за 0,5-3 месяца. У остальных наблюдался по степенный переход от 1-го к 3-му типу. Число КОЕк обычно сни жено, и степень снижения коррелирует с вероятностью развития лейкоза. По мере прогрессировав ия заболевания наблюдается сме Глава 6. Клеточные культуры в гематологии на типа роста: нормальный — лейкемический;

гипопластический —» лейкемический — более лейкемический. Происходит увеличе ние клонирующей эффективности лейкозных бластов и наруше ние созревания клеток (Афанасьев Б. В. и др., 1982). Анализ зави симости между течением МДС и характером колониеобразования показал, что при наличии лейкемического типа роста в агаре резко возрастает риск возникновения лейкоза (Tennant G. В. et al., 1991).

Гипопластический тип роста при МДС также является неблаго приятным, и выживаемость больных с нормальным и гиперплас тическим ростом в агаре больше. При ранних вариантах МДС (РА и РАКС) наблюдается чаще всего нормальный характер роста (Ruu tu Т. et al, 1984). При клонировании клеток костного мозга боль ных МДС в максимально обогащенных ростовыми факторами и интерлейкинами средах с метилцеллюлозой и средой IMDM наблюдается резкое снижение или отсутствие КОЕ-Э, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ. В некоторых случаях нормальные грану лоцитарные или эритроидные колонии соседствуют с маленькими бластными колониями.

Апластическая анемия (АА) Заболевание характеризуется гипопластическим типом роста КОЕк у подавляющего большинства больных в период разверну той картины заболевания, и лишь у части больных величина КОС близка к нижней границе нормы (Балашова В. А. и др., 1994;

Аб дулкадыров К. М. и др., 1995). В период ремиссии КОС костного мозга увеличивается и может нормализоваться.

При нейтропениях различного генеза может иметь место как нормальное, так и пониженное и повышенное колониеобразова ние в агаре (Афанасьев Б. В., 1980). По-видимому, происходит нарушение гуморальной регуляции, так как в присутствии КСФ гранулоцитарные предшественники костного мозга больных не которыми нейтропениями начинают нормально дифференциро ваться и формируют нормальное количество колоний (Barack Y.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 25 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.