авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 25 |

«гематология Под общей редакцией доктора медицинских наук, профессора К. М. Абдулкадырова.- Г о с у д а р с т ...»

-- [ Страница 4 ] --

et al., 1971). S. Nakino с соавторами (1997) показали, что СВ34+кроветворные клетки, которые культивировали в количе стве 5 х 10 в течение 14 дней в метилцеллюлозе со средой IMDM в присутствии ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и фактора стволовой клетки, генерировали 2 х 109 миелоидных клеток и 5 х 10' КОЕ-ГМ. Пред принимаются попытки лечения нейтропений после высокодоз ной химиотерапии инфузией таких клеточных популяций (Wil liams S. F. et al., 1996).

116 Часть 1. Теоретическая гематология Хронический лимфолейкоз и другие лимфопролиферативные заболевания характеризуются гипопластическим типом роста или его отсутствием в рассмотренных выше культуральных системах, приспособленных для миелоидной серии клеток.

Таким образом, культивирование гемопоэтических клеток по зволяет:

1) производить количественную и качественную оценку пула СКК и ККП костного мозга, периферической и пуповинной крови;

2) изучать процессы пролиферации и дифференциации СКК и ККП;

3) изучать процессы пролиферации и дифференциации ство ловых клеток стромы костного мозга и их потомков;

4) производить дифференциальную диагностику и прогнози рование гематологических заболеваний;

5) осуществлять контроль за эффективностью и адекватностью проводимой терапии;

6) выявлять и оценивать ростовые факторы и другие регулято ры гемопоэза, экспрессируемые кроветворными клетками в культуре;

7) оценивать влияние на СКК и ККП различных регуляторов кроветворения и других гуморальных и физических факто ров;

8) оценить качество и жизнеспособность трансплантата при ал логенной и аутологичной трансплантации костного мозга;

9) наращивать массу СКК и ККП для различных исследований как источника клеток для трансплантации;

10) контролировать поступление в периферическую кровь из костного мозга миелоидных клоногенных клеток, используе мых затем для пересадки.

Стимуляция костного мозга для выхода в кровяное русло ство ловых и коммитированных клеток-предшественников осуществ ляется с помощью рекомбинантных цитокинов — нейпогена, гра ноцита и других миелоидных КСФ.

Культуральные исследования с целью определения количества КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ являются одними из самых информативных методов оценки качества трансплантата при пересадке костного мозга, а также определения жизнеспособности криоконсервиро ванного костного мозга и крови, предназначенных для трансплан тации. Культуры клеток используют при изучении гемопоэтиче ского потенциала пуповинной крови. Клонирование клеток пупо винной крови показало, что она является альтернативным источ Глава 6. Клеточные культуры в гематологии ником СКК и ККП для целей трансплантации (Абдулкадыров К. М.

и др., 2003;

Нао О. L. et al, 1995;

Hunt С. J. et al, 2003).

Достижения последних лет, связанные с клонированием эмбрио нальных стволовых клеткок (ЭСК), совершили настоящую рево люцию в биологии и медицине (Thomson J. A. et al., 1998). Появи лась возможность крупномасштабного выращивания специализи рованных клеток человека, в том числе и гемопоэтических (Ре пин В. С, 2001;

Сухих Г. Т. и др., 2002). Сегодня перспективы ЭСК в медицине очень велики. Возможности тотипотентных ЭСК уже используют в медицине для заместительных клеточных трансплан таций. Большое внимание привлекают сегодня исследования, свя занные с мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), кото рые отличаются низкой антигенной активностью и наличием им муносупрессорных белков. Поэтому применение МСК как био сырья для тканевой регенерации имеет большие перспективы в медицине. Уже сегодня аллогенные и аутологичные пересадки МСК используют для лечения множественной миеломы, апластической анемии и цитопений — заболеваний, связанных с дефектами стро мы (Репин В. С, 2001). Результаты культивирования эмбриональ ных, мезенхимальных и дефинитивных стволовых клеток в средах с ростовыми факторами показали возможность репрограммирова ния стволовых клеток и направленного изменения их свойств (Ды бан А. П., Дыбан П. А., 2002).

Литература Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Использование лазерного и СВЧ-излучения при лечении больных злокачественными заболе ваниями системы кроветворения // Эксп. онкол. 1992. Т. 14. С. 67-70.

Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Колониеобразующая способность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза у больных апластической анемией на фоне различных методов лечения // Архив анат., гистол., эмбриол. 1995. № 3. С. 58-62.

Абдулкадыров К. М., Романенко Н. А. Организационные проблемы создания банка пуповинной крови // Гематол. и трансфузиол. 2003. Т. 3. № 2. С. 49-53.

Алмазов В. А., Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г. и др. Клонирование кроветворных клеток при различных формах острого лейкоза в двуслойной агаровой системе // Тер. архив. 1981. Т. 53. № 9. С, 110-115.

Афанасьев Б. В. Использование результатов клонирования клеток крови и кост ного мозга в двуслойной агаровой системе для дифференциального диагноза различных заболеваний системы крови // Тер. архив. 1980. Т. 52. № 9. С. 71-76.

Афанасьев Б. В., Сайдали М. А., Зарицкий А. Ю. и др. Пролиферация и созре вание гемопоэтических клеток больных хроническим миелолейкозом в стадии бластного криза // Проблемы гематол. и перелив, крови. 1980. № 4. С. 15-21.

Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г., Забелина Т. Н. и др. Клонирование кроветвор ных клеток больных с различными формами гемопоэтических дисплазнй в Глава ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ Немецкие ученые Arnold (1879) и von Hansemann (1891) еще в конце XIX в. первыми начали анализировать хромосомы. В начале XX в. исследователи попытались не только определить число и форму хромосом, но и установить их роль в неопластических про цессах. Первый труд, обобщающий работы в этой области, был опубликован Boveri в 1914 г. Согласно его представлениям злока чественно перерожденные клетки характеризуются аномалиями в структуре хроматина. Современная же цитогенетика берет свое начало с 1956 г., когда Tjio и Levan установили истинное диплоид ное число хромосом — 46 и описали основные морфологические характеристики хромосом. В 60-е гг. было проведено множество исследований, посвященных изменениям хромосом опухолевых клеток.

Американские ученые P. S. Nowell и D. A. Hungerford в 1960 г.

описали первый генетический маркер опухоли — делению пример но половины длинного плеча одной из хромосом G группы в клет ках крови больных хроническим миелолейкозом. Измененную хро мосому назвали филадельфийской (Ph'), по названию города, где ее обнаружили. Rubkin и соавторы в 1964 г. с помощью цитоспект рофотометрического метода измерения количества ДНК устано вили, что в Ph'-xpoMoco.vie отсутствует около 40% генетического материала.

Огромные возможности для идентификации как нормальных, так и измененных хромосом человека появились после того, как были внедрены в практику новые методы дифференциального окрашивания хромосом. Сначала был предложен метод флюорес центной окраски с помощью кинакрина — Q-окраски, затем — R-, С-, Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах G-окрасок препаратов хромосом, в результате которых каждая хро мосома приобретает специфическую исчерченность, позволяющую ее идентифицировать.

В 1971 г. на Парижской конференции была предложена Между народная классификация хромосом человека и их исчерченности (ISCN, 1971). В 1981 г. опубликована используемая до сих пор стандартная номенклатура нормальных хромосом человека (ISCN, 1981).

Если первоначально цитогенетические исследования проводи ли преимущественно в случаях гематологических неоплазий, то в последнее время, благодаря развитию методов интерфазной цито генетики, возросла интенсивность исследований солидных опухо лей. Одновременно с накоплением данных цитогенетических ис следований в 80-е гг. получены результаты молекулярно-биологп ческих исследований, которые значительно расширили наши представления о механизмах неопластических процессов.

Основные термины Кариотипом называют совокупность определенного вида и чис ла митотических хромосом данного индивидуума. В норме сомати ческие клетки человека содержат диплоидный (2и = 46), а половые клетки — гаплоидный (п = 23) наборы хромосом. У мужчин и жен щин одинаковый набор (22 пары) аутосомных хромосом, 23-я па ра — половые хромосомы: у женщин — XX, у мужчин — ХУ.

Хромосома разделена центромерой на два плеча: длинное — q и короткое — р. По положению центромеры хромосомы делятся на метацентрическис, субметацентрические и акроцентрические. В ме тацентрических хромосомах центромера располагается приблизи тельно посередине р- и q-плечи приблизительно одинаковой дли ны. В субметацентрических хромосомах центромера занимает про межуточное положение и р-плечо по длине гораздо короче q-плеча.

В акроцентрических хромосомах центромера находится в верхнем конце q-плеча. На концевых участках хромосомы располагаются теломеры. С их помощью хромосомы сохраняют свою морфоло гию и не соединяются друг с другом.

Парижская номенклатура предназначена для описания по еди ной форме линейной структуры каждой хромосомы. Ее обозначе ние строится на следующих принципах. Каждая хромосома рас сматривается как непрерывная совокупность сегментов, независи мо от их окраски. Хромосомные плечи (р и q) подразделяются па районы (regions), а районы, в свою очередь, на сегменты (bands) — участки хромосом, четко отличающиеся от соседних по интенсив 124 Часть 1. Теоретическая гематология ности окраски. Районы и сегменты нумеруются арабскими цифра ми — от центромеры к теломере, отдельно для каждого плеча. По этой системе обозначение индивидуального сегмента включает информацию о хромосоме, плече и районе, в котором он находится.

Так, символ 1р22 означает второй сегмент в районе 2 короткого плеча хромосомы 1. Если возникает вопрос о выделении субсег ментов того или иного сегмента, для их обозначения вводят следу ющий ряд цифр, принцип нумерации остается прежним.

Известны следующие структурные изменения кариотипа:

1) транслокация (t) — обмен участками между хромосомами (чаще двумя);

2) делеция (del) — утрата хромосомой части своего мате риала;

3) инверсия (inv) — поворот района в пределах одной хро мосомы на 180°;

4) инсерция (ins) — включение в хромосому ново го материала;

5) изохромосома (i) — хромосома, состоящая из двух одинаковых плеч;

6) дериват (der) — измененная хромосома.

Численные изменения кариотипа — это наличие дополнитель ных или потеря целых хромосом, что обозначается соответственно знаком «+» или «-». Клетки с числом хромосом более 46 называют гипердиплоидными, а менее 46 — гиподиплоидными. Выявление структурной аномалии в двух и более клетках свидетельствует о наличии клонального нарушения. Обнаружение дополнительных хромосом в двух и более клетках, а потеря — в трех и более говорит о численном нарушении кариотипа.

Стандартное цитогенетическое исследование позволяет анали зировать весь хромосомный набор клетки целиком. При этом сто ит помнить, что даже при максимальном разрешении этот метод способен выявить только сравнительно крупные аномалии хромо сом (размером 10 6 -10' пар оснований ДНК) и что анализируются только клетки в митозе. В ряде случаев эти ограничения удается преодолеть с помощью молекулярно-генетических методов.

Наиболее широкое применение для молекулярной диагностики гемобластозов получили методы FISH (флуоресцентная in situ гиб ридизация) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).

FISH основан на способности хромосомной ДНК-мишени свя зываться с отрезками ДНК-зонда, содержащими комплементар ные ДНК-мишени последовательности. ДНК-мишенью при FISH является ядерная ДНК интерфазных клеток или ДНК метафазных хромосом, нанесенных на стекло. Визуализация гибридизовавших ся зондов проводится при помощи флуоресцентной микроскопии.

С помощью FISH возможно определение нормальной или ано мальной локализации гена, числа его копий и наличия хромосом ных перестроек. Следует заметить, что при помощи FISH-метода Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах возможен анализ только тех участков хромосом, молекулярные зонды которых используются, а не всего хромосомного набора, как при цитогенетическом исследовании. Недавно разработано много цветное спектральное кариотипирование (multicolor spectral karyotyping - SKY), основой которого является метод FISH.

ПЦР — метод амплификации (многократного копирования) специфических последовательностей ДНК с помощью специфи ческого фермента — термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-no лимераза). ПЦР представляет собой циклический процесс, вклю чающий фазы денатурации ДНК, отжига (присоединение прайме ров) и синтеза заданных участков ДНК. В каждом цикле ДНК происходит удвоение числа копий исследуемого участка, что поз воляет по истечении 25-30 циклов накопить в реакционной сме си от 10''до 109 молекул ДНК заданной длины (обычно 150-900 ос нований) и известной нуклеотидной последовательности. Чув ствительность ПЦР метода высока: он позволяет обнаружить одну опухолевую клетку со специфической ДНК- или РНК-последова тельностью среди 10'-10" нормальных клеток. ПЦР является чрез вычайно быстрым, дешевым и чувствительным методом обнару жения минимальной резидуальной болезни.

Клиническое и биологическое значение хромосомных аберраций при гемобластозах К настоящему времени накоплена обширная информация по хромосомным аномалиям. Общее число случаев новообразований с описанными хромосомными нарушениями составляет более 26 тыс., причем 73% из них относятся к лейкозам и другим гемато логическим заболеваниям.

Анализ хромосом при этих состояниях вошел в перечень обяза тельных исследований как на этапе диагностики, так и в динамике заболевания. Некоторые геномные нарушения строго ассоцииру ются с характерной клинической и иммунологической картинами, посредством чего обеспечивают основу для определения подтипа заболевания. Во время диагностики кариотип является также важ ным прогностическим фактором. Современные терапевтические схемы оказывают огромное влияние на прогноз при острых лейко зах (ОЛ), где 2/3 детских и 1/4 взрослых пациентов имеют дли тельную безрецидивную выживаемость. Цитогенетические иссле дования повышают количество надежных прогностических факто ров, способствующих подбору адекватной терапии этим пациентам по распространенным схемам. Корреляцию между кариотипом, Часть 1. Теоретическая гематология прогнозом и диагнозом при ОЛ впервые продемонстрировали L. Seeker-Walker и соавторы в 1978 г. и подтвердили многие иссле дователи. Отмечалось, что цитогенетическая картина всегда ин формативнее других показателей относительно прогноза заболе вания. Особенно значимы обнаружения специфических хромосом ных нарушений, изменений модального числа хромосом и, наконец, присутствие или отсутствие клональных аномалий.

В настоящее время разрабатывается генетическая классифика ция лейкозов, которая объединяет и дополняет предшествующие, основанные только на фенотипических особенностях опухолевых клеток. Генетическая классификация выделяет группы гемоблас тозов, имеющих одинаковые генетические аномалии, сходство мор фологии, иммунофенотипа и биологических свойств опухолевых клеток. Основой генетической классификации является комплекс цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследо ваний. Это позволяет более точно определить степень злокаче ственности опухоли и прогноз заболевания.

Хромосомные нарушения при остром лимфобластном лейкозе Изучение хромосомных аномалий при остром лпмфобластном лейкозе (ОЛЛ) представляется крайне важной задачей. Цитогене тический анализ случаев ОЛЛ долгое время был связан со значи тельными методическими трудностями из-за плохой морфологии метафазных хромосом, патогномичной для лимфобластных кло пов. Усовершенствование методик позволило установить измене ния кариотипа примерно у 70% (55-90%) больных, причем, в от личие от других форм лейкозов, модальное число хромосом при ОЛЛ — самостоятельный прогностический признак.

У 25-30% пациентов клоны клеток содержат более 50 хромо сом. Этот кариотип ассоциирован с pre-B/common иммунофено типом.

Гипердиплоидия (и 50 хромосом), как правило, ассоцииру ется с наибольшей продолжительностью первой ремиссии и высо кой безрецндивной выживаемостью (медиана составляет 50 меся цев). Предполагается, что гипердиплоидные клетки высокочувстви тельны к терапии фазовоспецифичными противоопухолевыми препаратами вследствие большой продолжительности S-фазы. По чти в половине случаев гипердиплоидии п 50 обнаруживаются дополнительные структурные хромосомные аберрации. Чаще дру гих встречаются: t(9;

22), t(4;

ll) и iso(17q). Наличие в кариотипе опухолевых клеток перечисленных неслучайных структурных ано Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемоблаетозах малий обусловливает у таких пациентов возникновение ранних рецидивов или плохой ответ на терапию.

Промежуточный прогноз заболевания характерен для группы больных с модальным числом хромосом в лейкозных клетках — от 47 до 50 (гипердиплоидия п = 47-50). Довольно сложно оценить прогноз у пациентов с околотриплоидным набором хромосом из-за недостаточного числа подобных наблюдений. По некоторым дан ным, случаи с околотетраплоидным набором хромосом часто ассо циируются с Т-клеточным фенотипом ОЛЛ и могут иметь небла гоприятный прогноз. Наиболее часто в трисомии вовлекаются сле дующие хромосомы: 4, 6, 10, 14, 17, 18, 21 и X. Дополнительные структурные аномалии, как правило, являются типичными для ОЛЛ.

Частота встречаемости гиподиплоидии (и 46) при ОЛЛ со ставляет 7-8%. Как правило, такие клоны характеризуются высо кой злокачественностью и резистентностью к химиотерапии.

Основной интерес относительно патогенетической роли хромо сомных нарушений при ОЛЛ все же сконцентрирован вокруг струк турных аберраций. В настоящее время при ОЛЛ описано около 40 типичных хромосомных нарушений. Некоторые из них, наибо лее характерные, приведены в табл. 2 с указанием иммунофеноти па лейкозных клеток и генов, вовлекающихся в аберрации.

Среди выявляемых маркеров важное диагностическое и про гностическое значение имеет филадельфийская (Ph') хромосома (рис. 2).

rrtt 19 Рис. 2. Кариограмма пациентки М. Ы. Ю.: 46, XX, t(9;

22)(q34;

qll) 128 Часть 1. Теоретическая гематология Таблица Первичные хромосомные аберрации при ОЛЛ Нарушение Вовлекаемые гены Типичный иммунофенотип AF1P;

MLL t(l;

ll)(p32;

q23) Mixed lineage РВХ!;

Е2А t(l;

19)(q23;

pl3) Mixed lineage Dup(l)(ql2-21q31-32) Не определены Prc-B, B-cell IGK;

MYC B-cell t(2;

8)(pl2;

q24) t(4;

ll)(q21;

q23) AF4:MLL. Early B-precursor, Biphenotypic del(6q) MYB B- or T-lineage Не определены +8 B- or T-lineage MYCTCRA/ t(8;

14)(q24;

qll) T-lineage TCRD MYC;

IGH t(8;

14)(q24;

q32) B-cell t(8;

22)(q24;

qll) MYCIGL B-cell Не определены del(9p) B- or T-lineage Не определены Pre-B T/dic(9;

12)(pll-13) Не определены i(9q) Pre-B t(9;

22)(q34;

qll) ABL;

BCR B-lineage.

t(10;

14)(q24;

qll) HOXlhTCRD T-lineage t(ll;

14)(pl5;

qll) RBTN1:TCRD T-lineage t(ll;

14)(pl3;

qll) RBTN2;

TCRD T-lineage T/dcl(12p) He определены B- or T-lineage TGH;

BCL t(14;

18)(q32;

q21) B-lineage He определены i(17q) Mixed lineage -20 He определены B-lineage +21 He определены B-lineage Выявляется она в три раза чаще.у взрослых больных, чем при детских ОЛЛ. Встречаемость Ph'-маркера у взрослых пациентов с ОЛЛ составляет 15-20%, а у детей — 5%. Характерны высокий лейкоцитоз с большим количеством бластных клеток и поражение центральной нервной системы (ЦНС). Ph'-хромосома при ОЛЛ, как и при хроническом миелолейкозе (ХМЛ), образована вслед ствие реципрокной транслокации между дистальными частями длинных плеч хромосом 9-й и 22-й пар: t(9;

22)(q34;

ql 1). На хромо соме 9 в области поломки находится с-abl онкоген, который вслед ствие транслокации переносится на 22-ю хромосому и соединяет ся с находящимся там bcr-геном. В итоге на хромосоме 22 образу ется новый химерный ген bcr-abl, белковый продукт которого обладает повышенной тирозинкиназной активностью.

Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах Цитогенетически Ph'-хромосома у больных ОЛЛ и ХМЛ не отличается. Однако молекулярно-генетические исследования по казывают, что уровень поломки bcr-гена может быть различным.

Обнаружены два основных типа перестройки данного гена при ОЛ. Один из них точно такой же, как и при ХМЛ, когда образуется белок р 210-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 8,5 kb, Ь2-а2. Дру гой вариант поломки — внутри первого нитрона bcr-гена. При этом образуется белок р 190-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 7,5 kb, el-a2.

Наличие клонов с t(9;

22) определяет крайне неблагоприятный прогноз заболевания. Полную ремиссию удается получить при мерно у 60% пациентов, медиана ремиссии составляет 5-10 мес, а 3-летняя выживаемость — всего 13%. У некоторых больных Ph'-хро мосома отсутствует при цитогенетическом исследовании, тогда как на молекулярном уровне обнаруживается типичная t(9;

22). Сле довательно, для молекулярио-генетической диагностики и мони торинга Ph'-позитивного ОЛЛ целесообразно использовать кроме цитогенетического анализа молекулярные методы: ГЩР или FISH.

Иммунологически больные с Ph'-позитивными ОЛЛ чаще имеют смешанную лимфоидную и миелоидную картину, чем пациенты с другими хромосомными нарушениями (исключая ОЛЛ с 1 Iq поломкой).

Аберрации, затрагивающие ii(q23), встречаются при различ ных формах острых лейкозов. Обусловлено это тем, что данные аномалии происходят в полипотентной стволовой кроветворной клетке, которая способна дифференцироваться как в миелоидную, так и в лимфоидную линию. При ОЛЛ перестройки, вовлекающие' 11(q23), в число которых входят r(4;

11 )(q21;

q23), t( 1;

11 )(p32;

q23), t(6;

l I)(q21;

q23),t(ll;

19)(q23:pl3) и del(llq23), встречаются в 10 15% случаев и ассоциированы с pre-pre-В-иммунофенотипом бла стов и плохим прогнозом.

Наиболее важная цитогенетическая патология, которая встре чается у 5% взрослых больных ОЛЛ, — транслокация t(4;

il) (q21;

q23) (рис.3).

Пациенты характеризуются очень высоким лейкоцитозом с большим числом бластов и выраженной опухолевой инфильтраци ей органов. Это нарушение впервые обнаружено Oshimura с соав торами в 1977 г. и впоследствии описано как типичное для ОЛЛ Van Den Berghe с соавторами в 1979 г. На Ilq23 картирован ген MLL, на 4q21 — ген AF4. Вследствие транслокации на der(ll) образуется химерный ген AF4/MLL. Данная аномалия кариотипа выявляется чаще у молодых пациентов с недифференцированным 5 Гематология. Нов. справочник Часть 1. Теоретическая гематология 130 ' 4 Ц II п\ 13 14 15 16 17 **» 14 *• §* |а 19 20 21 22 ху Рис 3. Кариограмма пациента Р. А. А.: 46. XY. t(4;

ll)(q21;

q23) иммунологически фенотипом лейкоза. Lampert с соавторами обна ружили у больных с t(4;

l 1) перестройку генов тяжелых цепей им муноглобулинов, что позволяет говорить о В-клеточной природе заболевания. Описаны также врожденные ОЛЛ с t(4;

ll). При на личии у пациентов этой аберрации прогноз заболевания крайне тяжелый. Ремиссии удается достичь примерно у 50-60% больных, а ее продолжительность составляет всего 3 месяца. Для монито ринга минимальной резидуальной болезни можно использовать методы ПЦР и FISH.

Для больных ОЛЛ характерны нарушения кариотипа, затраги вающие хромосому 8-й пары, где расположен с-тус онкоген, и области локализации генов тяжелых и легких цепей иммуноглобу линов - 2р12,14q32 и 22qll. Образуется t(2;

8)(pl2;

q24) и ее вари анты: t(8;

14)(q24;

q32), t(8;

22)(q24;

qll), которые приводят к акти вации онкогена с-тус, увеличивающейся его транскрипции и, в конечном счете, к неопластической трансформации. Иммунологи чески характерен В-клеточный вариант. Для пациентов с описан ными выше аберрациями типичны поражение ЦНС, гепатоспле номегалия, лимфаденопатия, резко повышенные уровни мочевой кислоты и лактатдегидрогеназы в крови. Ранее такие нарушения кариотипа относили к прогностически неблагоприятным хромо сомным аномалиям. Используя современные протоколы терапии, полную ремиссию удается достичь у 86% взрослых больных, а 3-летняя выживаемость у них составляет 74%.

Для больных с Т-клеточным вариантом ОЛЛ типичными явля ются изменения кариотипа, затрагивающие точки локализации ге http://www.bestmedbook.com/ Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах 19 Рис. 4. Кариограмма пациента С. Ю. В.: 46, XY. del8(q24) нов Т-клеточных рецепторов. Примером может служить t(8;

14) (q24;

qll), при которой с-тус онкоген патологически экспрессиро ван. В результате слияния генов MYC, картированного на 8(j24, и TCRD, локализованного на 14q, образуется химерный ген, кодиру ющий протеин с новыми свойствами. Эта транслокация обуслов ливает крайне тяжелый прогноз заболевания (медиана выживае мости составляет 5 месяцев).

Приблизительно у 5% больных ОЛЛ встречается изолирован ная делеция del8(q24), которая также ассоциируется с крайне не благоприятным прогнозом заболевания (рис. 4).

Делеция длинного плеча 6 хромосомы (del 6(q21)) (рис. 5) яв ляется характерным нарушением для ОЛЛ и встречается у 5-10% пациентов. На уровне 6q21-24 располагается онкоген c-myb, гипер экспрессия которого обнаруживается во всех случаях заболеваний с del6(q21). Большей частью аномалия встречается при common ОЛЛ. Прогноз заболевания при данном нарушении кариотипа от носительно благоприятный, медиана выживаемости составляет около 38 месяцев.

Однако описываются случаи обнаружения del6(q) и при ОНЛЛ и ХМЛ. В этих случаях пациенты часто имеют дополнительные хромосомные нарушения.

Данная аномалия обнаруживается при всех вариантах ОНЛЛ, но чаще наблюдается при ОНЛЛ Мб (26% всех eq-ОНЛЛ случа ев). Как правило, уровни поломок находятся на ql2 27. причем в 80% наблюдений вовлекается 6q21—23 район. Экспрессия c-myb обнаруживается во всех случаях.

132 Часть 1. Теоретическая гематология Нh,# » i 10 11 17 13 14 Рис. 5. Кариограмма пациентки К. А. С: 46, XX, del 6(q21) ?! U tl II 1 2 3 ti it м it I* f 6 7 8 10 11 " M «I *i 41 |;

16 17 13 14 J •• **1 * 21 22 x 19 Рис. 6. Кариограмма пациентки Я.Р. А.: 46, XX, t(l;

19)(q23;

pl3) Транслокация t(l;

19)(q23;

pl3) (рис. 6) встречается в 3% всех случаев ОЛЛ с кариологическими нарушениями.

Это нарушение ассоциируется с pre-B-ОЛЛ фенотипом. Моле кулярные особенности t(i;

19) в настоящее время до конца не из учены. Однако известно, что аберрация приводит к слиянию Е2А Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах гена, картированного на 19р13, с РВХ1 геном, расположенным на Iq23. Dedera и соавторы обнаружили в экспериментах на живот ных, что данный химерный ген индуцирует не только пролифера цию и апоптоз, но и злокачественные лимфомы у животных.

Прогностические особенности t(l;

19) не совсем ясны, однако большинство исследователей показывают, что данная аберрация обусловливает неблагоприятный исход заболевания. У большин ства больных рецидив наступает в течение года после достижения ремиссии.

Транслокация t(12;

21)(pl3;

q22) — наиболее часто встречаю щаяся при В-клеточном ОЛЛ аномалия кариотипа у детей. Она является криптической (скрытой), не выявляющейся при стандарт ном цитогенетическом исследовании. Данная аберрация выявля ется при помощи молекулярно-генетических методов исследова ния в 19-27% детских ОЛЛ. У взрослых описаны лишь единичные случаи. На молекулярном уровне вследствие транслокации обра зуется химерный ген из генов TEL (12р13) и AML1 (21q22). Кли нически данная транслокация ассоциируется с возрастом больных от 1 до 10 лет, относительно невысоким лейкоцитозом (50 000/мкл), хорошим ответом на терапию и практически 100% безрецидивной выживаемостью пациентов.

Нарушения кариотипа больных острым нелимфобластным лейкозом В настоящее время клональные аномалии хромосом обнаружи ваются у 70-80% нелеченных больных с ОНЛЛ. Встречающиеся хромосомные нарушения носят неслучайный характер — наблюда ется определенное соответствие между типом цитогенетической аберрации и типом лейкоза по FAB-классификации. Установлено два основных типа нарушений: сбалансированные аберрации — реципрокные транслокации и инверсии, а также несбалансирован ные — потеря целой хромосомы и/или ее части. Наиболее часто встречающиеся нарушения кариотипа при ОНЛЛ представлены в табл. 3.

Важное клиническое значение имеет реципрокная аберрация t(8;

21)(q22;

q22) (рис. 7), обнаруживающаяся у 7-8% всех наблю даемых пациентов с ОНЛЛ и у 46% с М2 вариантом ОНЛЛ. Дан ная аберрация редко наблюдается при Ml, М4 и М5 ОНЛЛ.

В транслокацию вовлекаются гены AML1, расположенный на 21-й хро мосоме, и ЕТО (eight twenty one), картированный на 8-й хромосо ме. Так образуется слитый химерный ген AML1/ETO. и молеку лярно-генетические исследования показывают, что располагается Часть 1. Теоретическая гематология Таблица Первичные хромосомные аберрации при ОНЛЛ Вариант заболевания* Типичные хромосомные нарушения Ml del или t с 3q26 и 1р36, 2р13-22, 5q31- М2 t(8;

21)(q22;

q22) t(6;

9)(p23;

q34) (с базофилией) del(2)(p23)Hdel(2)(p21) МЗ t(15;

17)(q22;

q21) М4 inv(16)(pl3q22) (с эозинофилией) t(16;

16)(pl3;

q22) (с эозинофилией) del(16)(q22) del или t e l l q del или t 1 Iq23 (напр. t(6;

ll)(q27;

q23), М t(9;

ll)(p21;

q23), t(10;

ll)(pl5;

q23) t(3;

3)(q21;

q26) (с нарушениями тромбоцитов Мб и мегакариоцитов) inv(3)(q21;

q26) del(2O)(qll) dup( 1 q) -5 или * При всех вариантах заболевания встречаются следующие аберрации:

del(5q);

-7 или del(7q): + If И Ji IS M it* it H ИU и »l If 4b Si I ft ЯЯ 19 Рис. 7. Кариограмма пациентки Ж. О. С: 46, XX. t(8;

21)(q22;

q 22) Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах он всегда на der(8) хромосомы. Локализация точек разрывов в обоих генах у различных больных примерно одинаковая, что приводит к формированию только одного типа РНК-транс криптов.

Транслокация t(8;

21) чаще обнаруживается у молодых боль ных. Примерно у 70% больных мужчин с t(8;

21) в кариотипе обна руживается дополнительная потеря Y-хромосомы, а у 25% жен щин — Х-хромосомы.

У 90% пациентов с данной аберрацией удается получить пол ные ремиссии, а около 60% больных живут 5 лет и более, что ука зывает на благоприятное прогностическое значение данной ано малии.

Реципрокная t(15;

17)(q22;

q21) является высокоспецифичес ким маркером МЗ варианта ОНЛЛ (рис. 8). Эта хромосомная абер рация встречается почти в 100% всех наблюдаемых ОПЛ (острых промиелоцитарных лейкозов).

Впервые она описана в 1975 г. в лаборатории Rowley. В 1987 г.

ген, кодирующий рецептор ретиноевой кислоты (RARa), был кар тирован на участке 17 q21 хромосомы. На хромосоме 15, в локусе 15q22, — идентифицирован ген PML. Вследствие t( 15;

17) они объ единяются в химерный ген PML/RARa. Хотя разрывы гена RARa на 17-й хромосоме всегда происходят в интроне 2, точки разрыва !

* li ••».

н с;

1 ** 1у II *• *;

/.•V ff 7« 10 11 6 К • * «г • а 1* * *ч •* \ 13 14 16 17 •.

19 20 21 X Рис. 8. Кариограмма пациентки М. Е. Л.: 46, XY, t(15;

17)(q22;

qll) Часть 1. Теоретическая гематология на 15-й хромосоме группируются в двух разных интронах и одном экзоне гена PML. Это приводит к появлению различных слитых белков, для которых еще не придумано общепринятых названий.

Корреляции между локализацией точек разрыва в гене PML и кли ническими характеристиками, такими как морфология, ответ на проводимую терапию и выживание, пока не обнаружено.

Последние данные показывают, что ген PML/RARa может до минантно делокализовать PML-ген из его нормального ядерного положения, и этот процесс устраняется действием трансретиное вой кислоты. Научные открытия в области онкологии редко бы вают настолько исключительными, что немедленно меняют лечеб ную тактику н существенно улучшают понимание механизмов заболевания. Однако открытие специфической молекулярно-гене тической аномалии рецепторов к ретиноидам и универсальная эф фективность трансретиноевой кислоты при лечении больных ОПЛ существенно углубили научное понимание патогенеза лейкоза и радикально изменили подходы к терапии этого заболевания.

r Нарушения 16-й пары хромосом — (in\ (16)(pl3;

q22), t(16;

16)((pl3;

q22), del(16)(q22) (рис. 9)) являются характерными аберрациями для пациентов с ОНЛЛ М4Е и М4 вариантами. На молекулярном уровне и при inv(16), и при t( 16;

16) происходит слияние фрагментов гена CBFb, локализованного в районе 16q22, и гена MYH11, картированного на 16р13. Продукт химерного гена CBFb/MYHl 1 является фактором транскрипции.

Обнаружение перечисленных аномалий ассоциируется с хоро шим прогнозом заболевания и длительной безрецидивной выжи ваемостью. Полные ремиссии удается получить у 90% пациентов с 19 20 21 22 x у Рис. 9. Кариограмма пациента Д. А. М.: 46, XY, del(16)(q22) Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах данными аберрациями, а медиана выживаемости составляет 80 ме сяцев.

При стандартном цитогенетическом исследовании обнаруже ние inv( 16) и t( 16;

16) часто затруднено. Надежно диагностировать перечисленные аномалии позволяют молекулярно-генетические методы исследования ПЦР и FISH.

У больных М5 вариантом ОНЛЛ изменения кариотипа прежде всего касаются длинного плеча хромосомы 11 (в локусе q23-24).

Впервые эта связь была установлена Berger и соавторами в 1982 г.

Кроме изолированной делении del H(q23) (рис. 10) обнаружено, что с хромосомой 11 -й пары могут вступать в реципрокные обмены различные хромосомы — 1, 2, 6, 10, 17, 19 и др.

Наиболее известная перестройка, в которую вовлекается 1 Iq23, — это t(9;

ll)(p22;

q23). Впервые она была описана Rowley и соавто рами в 1975 г. Kabwinski и соавторы провели сравнительный ана лиз заболевания у больных ОНЛЛ с патологией длинного плеча 11 -й хромосомы и с другими изменениями кариотипа. Было отме чено, что t(9;

ll) обнаруживается только у больных ОНЛЛ М вариантом.

Больные с повреждениями 11-й хромосомы отличаются более молодым возрастом, высоким уровнем лейкоцитов в периферичес кой крови, более частой встречаемостью геморрагических ослож нений и нейролейкемией. Больные нуждаются в более интенсив ной терапии.

Ряд изменений хромосом, такие как потеря из кариотипа целой или части хромосомы 5-й пары и/или 7-й пары, встречается как у 1 ii Рис. 10. Кариограмма пациентки С. А. Б.: 46, XX, dell I(q23) Часть 1. Теоретическая гематология •+ i Ш 1 • *-«;

i i* % * 1 2 i !« It • 7 6 8 9 и -rf 1- "ITS w 13 14 15 16 I g ft I h (—- ^j L "It "«I у 19 20 21 22 X Рис. 11. Кариограмма г [ациентки М. Н. A.: 46. XX, de!5(q31) больных ОНЛЛ, так и у пациентов с ОЛЛ. Примером таких нару шений может служить кариограмма больной ОНЛЛ с del5(q31) (рис. 11).

Характерной особенностью данных цитогенетических патоло гий является то, что они выявлены у пациентов с вторичными острыми лейкозами, индуцированными воздействиями ионизиру ющей радиации, алкилирующих агентов и других мутагенов.

Однако эти нарушения описаны и при de novo острых лейкозах.

У пациентов с потерей из кариотипа части или целой хромосомы 5-й и/или 7-й пар отмечены общие клинические особенности.

А именно — резистентность или непродолжительный ответ на про водимую терапию и плохой прогноз. Смерть больных наступает, как правило, на ранних стадиях заболевания вследствие тяжелых инфекционных или геморрагических осложнений.

Изменения кариотипа при хроническом миелолейкозе Приблизительно у 95% больных с клинико-морфологическими признаками хронического миелолейкоза (ХМЛ) выявляется спе цифический маркер — филадельфийская (Ph') хромосома, обра зующаяся в результате реципрокной транслокации t(9;

22)(q34;

ql 1).

Примерно в 5% случаев Ph'-хромосома является результатом слож ных или простых вариантных (атипичных) транслокаций t(9;

22).

При сложных транслокациях в перестройках участвуют три и бо лее хромосом, причем две из них — 9-я и 22-я — постоянно.

В большинстве случаев диагноз ХМЛ можно поставить и без цитогенетического исследования, на основании клинико-гемато логнческих данных. Однако нередко необходимо дифференциро Глава /. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах вать ХМЛ с другими гематологическими заболеваниями (напри мер, «ювенильный» ХМЛ, хронический миеломоноцитарный лей коз), и обнаружение Ph'-хромосомы или химерного гена BCR/ABL помогает подтвердить диагноз.

Огромное значение имеет цитогенетическое исследование и при мониторинге эффективности терапии больных ХМЛ препаратами интерферона. Для ХМЛ характерна связь между эволюцией карио типа и прогрессированием заболевания. Так, у большинства боль ных (70%) за 3-6 месяцев до развития властного криза появляют ся дополнительные к Ph'-хромосоме структурные и/или числен ные хромосомные аберрации: +8, +19, +17, дополнительная Ph' хромосома, iso(17q), t(3;

21) и другие. На рис. 12 представлена кариограмма больного ХМЛ (бластный криз) с Ph'-хромосомой и рядом дополнительных нарушений.

ТТ IT 4 Ч1 i I"H"it Ii Рис. 12. Кариограмма пациента 3. А. Я.: 46, XY. -7, t(9;

22)(q34;

qll), dei(der9)(p21),+mar Для оценки минимальной остаточной болезни при ХМЛ можно использовать молекулярно-генетические методы ПЦР и FISH.

Хромосомные аномалии, выявляемые при миелодиспластическом синдроме При миелодиспластическом синдроме (МДС), как и при лейко зах, клоновый характер кроветворения подтверждается вместе с другими характеристиками и цитогенетическими исследования ми, при помощи которых у пациентов обнаруживаются те или иные хромосомные аберрации. Нарушения кариотипа выявляются при близительно у 60% больных с МДС. Среди аномалий преобладают Часть 1. Теоретическая гематология ftt) ft 'He 13 14 15 16 17 19 20 21 22 x y Рис. 13. Кариограмма пациентки М. Е. А.: 46, XX, del 7(q31) **DC(2;

21) 1 2 dei;

6qi * 6 7 tJel7q) g 9 10 11 } 13 14 15 16 17 и ( "- ШИК *-1 н*—тИ w» * • '!• г \ \ ™ Л 19 2 0 -20 21 -21 22 х * у Часе м, м2 м Рис. 14. Кариограмма пациентки Д. 3. Я.: 46, ХО, -4.+9.-13.+14-17,-20,-21,-Х, DC(2 ;

21),add5(q36),del6(q21),del7(q31), +М1.+ М2, +МЗ, асе потери целой или части хромосом и трисомии. Реже наблюдаются транслокации (кроме случаев вторичных МДС).

Наиболее частыми изменениями кариотипа при первичном МДС являются потеря хромосом 5-й и 7-й пар, дополнительная 8-я хро мосома и делеции длинного (q) плеча хромосом 5-й. 7-й и 20-й пар (около 30% всех исследованных пациентов). Кариограммы некото рых из них представлены ниже.

Для вторичного МДС характерны потеря целой и/или части 7-й и/или 5-й хромосом (рис. 13). Кроме этого, приблизительно у 50% больных встречаются комплексные нарушения кариотипа.

Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах h if ИМИ H - * i •-Ж-т-HI-*--** И г - » Ь*~гн I] -8 ^- 8 9 10 -:Д - 13 14 15 16 17 §., ( - 19 20 -° 21 ~-DC(8;

10)(q24:p15) Рис. 15. Кариограмма пациентки С. А. А.: 46, XX, -2,add4(pl6), -8,+ 10,+ 12, -14,-15,-20,-22,DC(8;

10)(q24;

pl5),+Ml.+M2.+M3,+M 1 2 aer(2j '—*—I 9 10 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 x у Рис. 16. Кариограмма пациента Ю. В. Ц.: 45, XY, -12,t(2;

5)(p24;

ql4),del8(pl2) Примерами таких изменений могут служить кариограммы двух пациентов (рис. 14, 15). Делеция 5q при вторичном МДС редко обнаруживается как изолированное нарушение (рис. 16). Значи тельно чаще, чем при первичном МДС, встречаются изменения 12р, 3 q n l l q.

Имеются данные, что у больных с МДС и нормальным кариоти пом риск трансформации в ОЛ меньше и сроки выживаемости 142 Часть 1. Теоретическая гематология больше, чем у больных аномалиями хромосомы 7-й, 8-й и 11-й.

Относительно благоприятным считается прогноз заболевания в тех случаях, когда выявлены клоны клеток с единственной пере стройкой: 5q- или 20q-. Обнаружение клона с комплексными нару шениями кариотипа является крайне неблагоприятным прогнос тическим признаком.

Нарушения кариотипа при множественной миеломе У больных множественной миеломой аномалии кариотипа об наруживаются, по различным сообщениям, в 20-60% исследован ных случаев. Из них у 30% пациентов обнаруживается гиподипло идия, у 30% — псевдодиплоидия и у 30/о — гипердиплоидия. Ти пичными для данного варианта заболевания являются: моносо мия 13, трисомии 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19.

Среди структурных нарушений чаще других выявляется 14q+ мар кер, присутствующий у 30% пациентов с цитогенетическими ано малиями. В перестройки вовлекается локус 14q32, аберрации ко торого при молекулярно-гснетическом исследовании FISH обна руживаются у 75% больных с аномальным кариотипом в два раза чаще, чем при цитогенетическом. Как правило, локус 14q32 вовлекается в транслокацию t( I I;

14)(ql3;

q32).

Приблизительно у 30% пациентов с аберрациями выявляются аномалии 1р11-22. С вовлечением данного локуса описаны транс локации, делеции — терминальная и интерстициальная, а также частичная дупликация.

Наилучший прогноз заболевания у больных с нормальным ка риотипом. Огромное прогностическое значение имеют некоторые структурные нарушения. Так, резистентны к терапии пациенты с t(l I;

14)(ql3;

q32), частичной или полной потерей 13-й хромосомы, делецией длинного плеча 11-й хромосомы. Крайне неблагоприят ным прогностическим признаком являются множественные нару шения кариотипа.

Заключение Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время прослежива ется четкая тенденция к активному расширению исследований по изучению хромосомных аномалий при гемобластозах. Это связано с тем, что большинство сообщений, позволивших установить про гностическое значение различных аберраций, относится к 90-м го дам XX в. Изменения в терапевтических режимах, очевидно, по требуют внесения корректив в прогностические оценки значимое Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах ти цитогенетических исследований. Кроме того, далеко не все час то встречающиеся хромосомные аномалии описаны в достаточной степени. Для некоторых из них отсутствуют данные о прогности ческой ценности и диагностическом значении. Важной задачей представляется также определение редких вариантов хромосом ных нарушений и генов и/или онкогенов, расположенных вблизи точек разрывов.

Так как события, происходящие на генетическом уровне, лежат в основе любой лейкозной трансформации и опухолевой прогрес сии, определение кариотипа больных гемобластозами как важного прогностического фактора является патогенетически обоснован ным. Интенсификация лечения сопряжена с целым рядом ослож нений, следовательно, определение прогностических групп риска, в том числе и цитогенетических, становится все более важным.

Накопление сведений о прогностической роли генетических абер раций при гемобластозах в условиях использования интенсивных программ лечения позволит применять данные цитогенетического исследования для адекватного выбора современных методов ле чения.

Известно, что препараты метафазных пластин, полученные из опухолевых клеток, отличаются плохим качеством хромосом. В на стоящее время в лабораторной практике исследователи использу ют компьютерные анализаторы изображений, что позволяет зна чительно упростить и ускорить цитогенетическое исследование.

Такая система анализа изображений, которая в течение последних нескольких лет используется нами, помогает не только улучшить качество исходного изображения, но и выводить результаты иссле дования на. печать, создавать базу изображений и результатов анализа.

Литература Генкин А. А. Новая информационная технология анализа медицинских данных.

СПб.. 1999. С. 24-32.

Кобзев Ю. Н., Домрачева Е. В. Молекулярная цитогенетика в диагностике ост рых лейкозов и миелодиспластических синдромов. 1996. Т. 4. С. 32-38.

Кобзев Ю. Н., Флейшман Е. В. Хромосомные изменения при гемобластозах:

Руководство для врачей. 2001. С. 92-114.

Сергеев А. Г., Иванов Р. А. Генодиагностика лейкозов: Пособие для врачей. 1998.

An Atlas of Malignant Haematology. 1997. P. 5-25.

Appelbaum F. et al. The biology and treatment ol acute myeloid leukemia // Haematology. Education Program Book. 1998. P. 15-43.

BergerR., Bemheim A., DanielM.-T. Karyotypes and cell phenotypes in acute leukemia following other diseases // Blood Cells. 1993. V. 7. P. 93-299.' Глава КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ Ни один раздел современной науки не обходится без иммуно логических исследований. В гематологии эти исследования ведут ся по следующим основным направлениям: исследование особен ностей иммунного статуса больных, где используются общеимму нологические методы;

иммунофенотипирование лейкозной клетки, позволяющее уточнить диагноз;

иммуногематологические иссле дования, изучающие антигены и антитела составных частей крови.

Некоторые аспекты клинической иммунологии Как известно, главной функцией иммунной системы является иммунологический надзор за постоянством внутренней среды орга низма и элиминация чужеродных агентов как экзогенной, так и эндогенной природы. В выполнении этой задачи участвуют гумо ральный и клеточный иммунитет, системы фагоцитов, комплемен та и др. Все эти компоненты выполняют свои функции в тесном взаимодействии друг с другом.

Нарушения иммунитета прежде всего проявляются в развитии иммунодефицитных состояний, которые бывают первичными (ге нетически детерминированными) и приобретенными, или вторич ными (например, СПИД). Проявлением нарушений в иммунной системе являются также различные аутоиммунные заболевания, связанные с отменой толерантности и нарушением распознавания «своего» и «чужого». Под вторичными иммунодефицитами подра зумевают такие нарушения иммунной системы, которые возника ют через какой-то определенный промежуток времени после рож дения, и их развитие связано с воздействием на организм какого либо повреждающего фактора (например, лучевая, цитостатическая терапия).

146 Часть 1. Теоретическая гематология В основе изучения клеточного иммунитета лежит количествен ное определение Т-лимфоцитов и их субпопуляций, идентифика ция продуцируемых ими цитокинов и выявление способности осу ществлять эффекторные функции. К тестам гуморального имму нитета относят определение уровня сывороточных и секреторных иммуноглобулинов. Выделяют также факторы неспецифического иммунитета, к которым относят фагоцитоз, системы комплемента и естественных клеток-киллеров (ЕК).

Развитие современной техники оценки различных клеточных субпопуляций связано с двумя крупными научно-техническими достижениями: созданием панели моноклональных антител (МАТ) к различным поверхностным антигенам клеток и разработкой но вого типа проточных цитофлуориметров. В настоящее время с по мощью МАТ идентифицировано множество поверхностных анти генов лимфоцитов. В большинстве случаев определены их молеку лярная масса, химическая структура и функция. Лейкоцитарные антигены называют кластерами дифференцировки и обозначают буквами CD и соответствующим номером. На 7-м Международ ном рабочем совещании (2000 г.) обозначено уже около 200 класте ров дифференцировки лейкоцитов, включая антигены лимфоци тов, моноцитов/макрофагов, миелоидных клеток, ЕК-клеток, ре цепторы к цитокинам и колониестимулирующим факторам.

Наиболее значимыми поверхностными маркерами для опреде ления Т-лимфоцитов являются CD3 и CD7, для Т-хелперов и Т-цитотоксических/супрессорных клеток — CD4 и CD8 соответствен но. Для характеристики В-лимфоцитов используют маркеры CD19, CD20, CD21, CD22, CD24 и CD72, а также определяют экспрес сию поверхностных иммуноглобулинов (slg). Для ЕК-клеток при меняют маркеры CD 16, CD56 и CD57. Однако следует помнить, что CD16 — низкоаффинный Fc-рецептор — присутствует практи чески на всех гранулоцитах и на некоторых моноцитах. Маркера ми миелоидных клеток являются CD13, CD 14 (экспрессируется на моноцитах), CD15 и CD33. На мегакариоцитах и тромбоцитах экспрессированы молекулы CD41 и CD42, которые играют суще ственную роль в адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосу дов. Наиболее важными маркерами гемопоэтических стволовых клеток являются CD34 и CD117. Кроме того, на всех кроветвор ных клетках выявляются молекулы CD45. Для большинства цито кинов в настоящее время также установлены рецепторы в соот ветствии с кластерами дифференцировки (Фрейдлин И. С, Тото лян А. А., 2001).

Наилучшим методом выявления поверхностных маркеров яв ляется проточная цитофлуориметрия. Она позволяет дифферен Глава 8. Иммуногематология пировать большое число субпопуляций лимфоцитов в очень ко роткие сроки. Определение осуществляется по двум параметрам:

интенсивности свечения лимфоцитов, окрашенных МАТ. конъю гированными с флуоресцентными красителями, и размерам и зер нистости, позволяющим дифференцировать лимфоциты от нейт рофилов и моноцитов. С помощью проточной цитометрип осу ществляют идентификацию клеток, определяют частоту их встре чаемости и количественные характеристики. При использовании двухцветной цитофлуориметрии имеется возможность получить информацию о двух и более антигенах на одной и той же клетке.

Например, при сепарации гемопоэтической стволовой клетки мож но установить уровень ее дифференцировки: CD34 CD33 или CD34 CD33+.


Определение уровня иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, IgD и IgE) является очень важным при диагностике и клиническом мони торинге иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, аутоим мунных заболеваний и других патологических состояний. Так, IgG является особенно активным против грамотрицательных бактерий, токсинов и вирусов. С помощью IgG-антител микробы и чужерод ные клетки агглютинируются и лизируются. Комплемент взаи модействует с СН1- и СН2-доменами IgG. С помощью СН2- и СНЗ-доменов IgG взаимодействует с Fc-рецептором макрофагов, моноцитов, нейтрофилов, киллеров и клеток плаценты. IgG состоит из 4 подклассов, которые отличаются количественно. Наибольшим по количеству является IgG 1, наименьшим — IgG4. IgA нейтрализу ет вирусы и бактериальные токсины, может активировать систему комплемента. В секретах слизистых оболочек IgA находится в ди мерной форме. Секреторный IgA имеет два вида Н-цепи: od и а2. Он выявляется в слюне, молозиве и грудном молоке. Концентрация IgA у детей первых лет жизни очень низка и только к 10-14 годам при ближается к уровню взрослых. IgM с эволюционной точки зрения является старейшим. Он образуется на ранних этапах иммунного ответа и совместно с комплементом лизирует бактерии и другие чужеродные клетки. При первичном контакте с антигеном синтези руются сначала IgM-, а затем IgG-антитела. При повторном введе нии того же антигена IgG-аптитела синтезируются быстрее и в боль шем количестве, чем IgM, который в сыворотке находится в виде пентамера и имеет наибольший молекулярный вес.

Иммуноглобулин Е относится к минорным компонентам сыво роточных Ig. После секреции В-клетками IgE присоединяется к туч ным клеткам и базофилам с помощью Fc-фрагмента. При взаимо действии IgE с антигеном происходит освобождение вазоактивных 148 Часть 1. Теоретическая гематология аминов из этих клеток, т. е. он является главным иммуноглобу лином, участвующим в аллергических реакциях. Полагают, что IgE-антитела участвуют в борьбе против паразитарных инфекций.

Иммуноглобулин D является рецепторным иммуноглобулином только В-лимфодитов, и наличие сывороточного IgD рассматри вается как результат сбрасывания рецепторного IgD с В-клеток при их активации. В настоящее время накапливаются данные, что IgD может местно синтезироваться в подслизистых оболочках слюнной железы. Иными словами, так же, как секреторный IgA, этот класс иммуноглобулинов выполняет определенную роль при защите слизистых оболочек от инфекционных агентов.

Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организ ме иммунные комплекы с соответствующими антителами. Этот процесс может стать причиной системной или органной патоло гии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) зави сит от их величины и индивидуальной активности фагоцитирую щей системы. Антитела в составе иммунных комплексов могут вклю чать каскад активации комплемента. Кроме того, IgG- и IgM-антитела могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их Fc-рецепторами. Концентрация ЦИК, как правило, повышена при системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра, шистозоматоз), а также при злокачественных новообразованиях.

Величина и состав их зависят как от свойств антигена, так и от свойств антител, и в то же время от их абсолютной и относительной концент рации. Соотношение антиген : антитело в составе ЦИК зависит от относительных концентраций обоих компонентов. Принято считать, что ЦИК, возникающие в условиях небольшого избытка антигена, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их цир куляции и высокой комплементактивирующей способности.

Цитокины — это множество факторов полипептидной природы, синтезируемых стромальными (фибробласты, эндотелий), денд ритными, эпителиальными, нейроэндокринными и другими видами клеток. Однако основными продуцентами цитокинов являются ак тивированные клетки иммунной системы. Цитокины осуществля ют регуляцию всего многообразия межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении и межсистемных взаи модействиях. В основе механизма их действия лежит свойство вы зывать дифференцировку, пролиферацию и программируемую ги бель клеток — апоптоз.

Наиболее важные характеристики цитокинов:

1. Индуцибельность - генетически детерминированная зависи мость выработки цитокинов от стимулирующих воздействий.

Глава 8. Иммуногематология Индукция экспрессии генов цитокинов или усиление их активнос ти, приводящее к усиленному синтезу цитокинов, происходит под влиянием внешних факторов (микроорганизмов, их продуктов, кон кретных антигенов, других цитокинов).

2. Локальность функционирования - действие цитокинов про исходит в определенном микрообъеме (местно), куда проникает инфекционный агент (носитель антигена) и где активируются клет ки-продуценты цитокинов и клетки-мишени. В норме цитокины, образуемые при первичном иммунном ответе, практически не по ступают в кровоток, и только при патологии их содержание в сыво ротке крови повышается.

3. Избыточность - каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов и каждая разновидность цитокинов может секретироваться разными клетками. Цитокины избыточны в био логических свойствах, для них характерна полифункциональность с сильным перекрыванием эффектов.

4. Взаимосвязанность и взаимодействие компонентов. Цитоки ны оказывают сильное влияние на выработку друг друга, они мо гут как усиливать продукцию цитокинов, вызванную другими аген тами, так и ингибировать ее, проявляя плейотропность.

В соответствии с особенностями структуры цитокинов и цито киновых рецепторов их разделяют на несколько основных семейств:

гемопоэтины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических предшественников;

интерфероны (ИНФ), осуществляющие есте ственную защиту организма от вирусов;

факторы некроза опухоли (ФИО), обладающие провоспалительными, иммуностимулирую щими и многими другими свойствами;

хемокины, привлекающие в очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты из циркулирующей кро ви;

«бессемейственные» цитокины, не отнесенные пока к какому либо семейству (Ярилин А. А., 1997).

Исходя из общих закономерностей функционирования систе мы цитокинов, представители разных семейств могут оказывать однотипные воздействия на клетки и представители одного семей ства — вызывать разные эффекты. Так, в регуляции гемопоэза уча ствуют не только гемопоэтины, но и ФНО и ИНФ. А в реакции воспаления провоспалительные свойства проявляют не только ФНО и ИНФ, но и целый ряд интерлейкинов (ИЛ), относящихся к другим семействам.

В группу провоспалительных цитокинов включают ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа, ИНФ и др. Они действуют на HMMVHOKOM петентные клетки на ранней стадии воспалительного ответа, участву ют в запуске специфического иммунного ответа и в его эффекторной 150 Часть t. Теоретическая гематология фазе. Альтернативную группу представляют противовоспалительные цитокины: ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, тканевой фактор роста (ТФР) и др.

Цитокины оказывают существенное влияние на гемопоэз, ре гулируя процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. В зависимости от характера этого влияния их условно раз деляют на позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. К по зитивным относятся те факторы, которые поддерживают проли ферацию полипотентных стволовых клеток, эритроидных, мие лоидных и лимфоидных предшественников, стимулируя соответ ствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, фактор ство ловой клетки, различные колониестимулирующие факторы, зрит ропоэтин и целый ряд интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-11 и др.). Другие цитокины (ФИО, ИНФ, ТФР), напро тив, могут снижать клоногенность всех типов предшественников гемопоэтических клеток, в силу чего их относят к негативным ре гуляторам гемопоэза. Цитокины являются наиболее многочислен ной группой биологически активных веществ, влияние которых на процесс апоптоза считается доказанным. Так, выявлена большая группа цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-10, факторы роста), при действии которых на клетку запускается эндогенная програм ма защиты клеток от апоптоза, опосредованная через белки Вс1-2, Bcl-х и др. Тем не менее ряд цитокинов обладает способностью индуцировать апоптоз (ФНОа, ИНФ-у, ИЛ-1 и др.);

при этом наиболее апоптогенным цитокином считается ФНОа.

Таким образом, цитокины характеризуются полифункциональ ностью, плейтропностью, действуют в синергизме друг с другом или являются антагонистами и в зависимости от условий могут оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее действие на клетки. Регуляторные эффекты цитокиновой сети построены на равновесии оппозитных пулов молекул, нарушение которого, по всей видимости, ведет к патологии.

Иммуногематология — раздел иммунологии и гематологии, из учающий антигены и антитела составных частей крови, их роль в организме, а также патологические состояния, связанные с имму нологическими реакциями. Иммуногематология как наука появи лась в 1900 г., когда проведенные 32-летним венским ученым К. Ландштейнером исследования по изучению антител эритроци тов человека привели к открытию групповых, а затем и резус антигенов и впервые позволили эффективно и безопасно осуще ствлять переливание крови.

Этот успех, пожалуй, оставался единственным достижением иммуногематологии в течение полувека, пока в середине 50-х го Глава 8. Иммуногематология дов, продолжая идеи К. Ландштейнера, J. Dosset, R. Payne и J. van Rood, не начали изучать антитела к ядерным клеткам кро ви — лейкоцитам, что привело к открытию главного комплекса гистосовместимости и стало огромным вкладом в успешное разви тие трансплантации органов и тканей в качестве лечебного метода.

Главный комплекс гистосовместимости, или major histo compatibility complex (MHC) — генетическая система, ответствен ная за развитие специфического иммунного ответа. У человека эта система получила название HLA — human leukocyte antigens "человеческие лейкоцитарные антигены, поскольку впервые они были обнаружены на белых клетках крови.


Первый антиген системы HLA — MAC — открыл в 1958 г. J. Dos set, который в 1980 г. был удостоен Нобелевской премии (Дос се Ж., 1959). Кроме него наибольший вклад в развитие учения об этой системе внесли R. Cepellini, впервые предложивший на ос новании семейного анализа концепцию о существовании единой генетической системы;

J. van Rood, впервые показавший много аллельность системы и предложивший компьютерную обработку результатов серологических реакций, и P. Terasaki, разработав ший микролимфоцитотоксический тест, который до настоящего времени является основным методом серологического исследо вания.

Вторая Нобелевская премия за изучение системы HLA была присуждена в 1996 г. Zinkernagel и Doherty за установление роли молекул главного комплекса гистосовместимости в иммунном от вете — так называемую теорию «двойного распознавания» — свое го и чужого для организма. Присуждение за столь короткий пери од двух наиболее престижных наград мирового научного сообще ства свидетельствует как о чрезвычайно быстром прогрессе в изучении этого раздела медицинской науки, так и об огромной важности этих открытий.

Генетическая структура системы HLA Гены, кодирующие молекулы HLA, локализуются на корот ком плече 6-й хромосомы, занимая участок, вмещающий более 4000 пар нуклеотидов, и состоят из трех групп генов — I, II и III класса. К I классу относятся гены локусов А, В, С («классические», открытые первыми), а также Е, F, G, Н. Во II класс входят гены локусов DR, DQ, DP, а также DO, DM, TAP, MICA. И к III классу относятся гены, собственно генами комплекса гистосовместимо Часть 1. Теоретическая гематология сти не являющиеся (но расположенные на 6-й хромосоме между классами I и II): это гены компонентов комплемента С2 и С4, бел ков теплового шока HSP70, факторы некроза опухоли и некоторые другие (Histocompatibility testing, 1993).

Наследование генов HLA происходит по ко-доминантному ти пу — ребенок наследует половину признаков от отца и половину — от матери. Это позволяет использовать HLA-фенотип в качестве маркера при установлении спорного отцовства в судебной меди цине.

Продукты HLA-генов — мембранные гликонротеины. Здесь мо лекула I класса состоит из а-цепи и Р-2 микроглобулина, а молеку ла II класса состоит из а- и (З-цепей. Молекулы как I, так и II классов являются трансмембранными гетеродимерами, имеющи ми внутриклеточную и внеклеточную части. Большинство вариа бельных аминокислотных остатков сосредоточены в верхней час ти молекулы, где она образует глубокую полость, или бороздку для связывания чужеродного пептида. Продукты различных HLA-ге нов отличаются друг от друга по аминокислотным последователь ностям и, следовательно, по конфигурации антигенсвязывающей бороздки.

Экснрессированы молекулы HLA I класса практически на всех ядросодержащих клетках организма. Наибольшее количество этих молекул представлено на лимфоцитах. Молекулы HLA II класса экспрессированы на так называемых профессиональных антиген представляющих клетках — это дендритные клетки,-В-лимфоциты и макрофаги.

Функции продуктов ШЛгенов Первичная роль адаптивной иммунной системы заключается в распознавании и элиминации различных агентов, которые могут причинить вред организму. Важной особенностью этой функции является то, что иммунная система должна правильно выявить различия между собственными (безвредными) и чужими (потен циально вредными) антигенами. Молекулы МНС играют ключе вую роль в том процессе, посредством которого организм проводит разделение на молекулярном, клеточном, а возможно, и организ менном уровне между собственными и чужими элементами.

Эта роль определяется основными биологическими функциями продуктов HLA-гснов, к которым в настоящее время относят: опре деление молекулярного репертуара Т-клеточных антигенных рецеп торов;

презентацию пептидов Т-клеткам;

регуляцию цитотоксичес кой активности ЕК-клеток;

защиту вынашиваемого плода.

Глава 8. Иммуногематология. МНС и селекция репертуара Т-клеточного рецептора. Распо знавание Т-клетками антигенов, несущих генетически чужеродную информацию, осуществляется антигенными рецепторами Т-кле ток. Для развития адекватного иммунного ответа Т-клеточный ре цептор должен четко отличать «свое» от «чужою», и при непосред ственном участии МНС-молекул в тимусе происходит «позитив ная» и «негативная» селекция репертуара Т-клеточного рецептора, в результате которой Т-клстки, обладающие повышенной ауторе активностью или, наоборот, не распознающие собственные антиге ны, подвергаются апоптозу. В результате окончательный реперту ар слабоаутореактивных Т-клеток содержит рецепторы, которые распознают изменение собственных МНС, вызванных воздействи ем «чужих» пептидов, в нем отсутствуют рецепторы, которые рас познают немодифицированные собственные МНС-молекулы или аутологичные пептиды, связанные с собственными МНС-моле кулами.

Презентация антигенов Т-клеткам является второй важной функцией МНС-молекул. Т-клеточные рецепторы распознают ком плекс, который состоит из пептида, связанного внутри бороздки МНС-молекулы. Конфигурация этой комбинации определяет аф финитет данного комплекса для набора Т-клеточных рецепторов и последующей активации Т-клеток. Большинство чужеродных пеп тидов, представляемых Т-клеточным рецепторам МНС-молекула ми, образуются из более крупных белковых цепей путем частично го переваривания в специализированных цитоплазматических об разованиях — эндосомах внутри клеток. Две молекулы Т-клеточной дифференцировки — CD8 и CD4 — прямо взаимодействуют с мо лекулами МНС I и II классов соответственно и участвуют в Т-кле точной активации и иммунной функции клетки-эффектора.

Комплекс молекулы HLA I класса — пептид взаимодействует с CD8'Т-клетками. Пептиды, презентируемые молекулами I класса, происходят преимущественно из протеинов, которые продуциру ются самими клетками. Этот путь назывется эндогенным путем презентации антигена. CD8 T цитотоксические Т-лимфоциты пер вично распознают и убивают аутологичные клетки, которые экс прессируют чужеродные вирусные или другие антигены. При алло генной трансплантации цитотоксические Т-лимфоциты также уби вают ал.тогенные клетки-мишени, экспрессирующие как чужие молекулы HLA I класса, так и чужие пептиды.

Основной функцией HLA II класса является презентация CD4* клеткам пептидов, которые происходят из экзогенных источни ков. Данная популяция Т-клеток включает клетки, которые могут 154 Часть 1. Теоретическая гематология функционировать или как Т-хелперы при продукции антител В-клет ками, или как регуляторные клетки, регулирующие продукцию цитокинов, в зависимости от типа сигналов, которые Т-клетки получают во время их активации. В этом случае чужеродные бел ки, микроорганизмы и другие антигены захватываются антиген презентирующими клетками и перерабатываются в пептиды внут ри цитоплазматических эндосом. CD4" клетки необходимы для начального распознавания экзогенных пептидов таким образом, чтобы клеточные и гуморальные ответы были направлены на эли минацию внедрившегося агента (Ройт А. и др..'2000).

Регуляция активности естественных клеток-киллеров. Есте ственные киллеры — ЕК-клетки — весьма разнообразная и широ кая популяция лимфоцитов, которая осуществляет прямую цнто токсичпость, антнтелозависимую клеточную цитотоксичность. а также вырабатывает провоспалительные цитокины — такие как ИНФ, ФНО и колониестимулирующие факторы. ЕК-клетки, ко торые являются фактором врожденного иммунитета, в эволюци онном отношении являются «двоюродными братьями» Т-клеток.

Функция ЕК-клеток как цитотоксических клеток заключается в особом свойстве убивать некоторые типы опухолевых клеток-ми шеней in vitro, но точный механизм распознавания был неизвес тен в течение многих лет. В настоящее время установлено, что ЕК-клеточная активация угнетается присутствием молекул МНС.

Каждая ЕК-клетка имеет множественные рецепторы распозна вания, которые активируют или ингибируют эффекторную функ цию. Рецепторы активации распознают широко распространенные структуры клеточной поверхности, такие как некоторые Fc-рецеп торы. Рецепторы ингибиции распознают общие («публичные») эпи топы HLA-молекул, включая Bw4 эпитоп, некоторые продукты генов локуса HLA-C и неклассические HLA-молекулы — HLA-E и HLA-G.

Защита вынашиваемого плода. Во время внутриутробного раз вития плод, являющийся своего рода аллотрансплантатом, защи щен от иммунной агрессии со стороны иммунной системы матери благодаря наличию разнообразных механизмов. Местно выраба тываемые гормоны плаценты — стероиды и гонадотропные гормо ны хориона — обладают иммуносупрессивным действием. В до полнение классические продукты генов I класса — HLA А, В и С — не экспрессированы на клетках трофобласта плаценты, в интер фейсе соприкосновения плода и матери.

Следовательно, Т-клетки должны быть индифферентны в отно шении трофобласта и плода. Однако ЕК-клетки в большом коли Глава 8. Иммуногематология чес i ве находятся в плаценте и по всем правилам должны бы были атаковать HLA-негативные клетки трофобласта. Причиной, поче му они не распознают эти клетки, по-видимому, является наличие двух специализированных молекул I класса - HLA-G и -Е, кото рые в значительном количестве экспрессированы в тканях трофо бласта. Преимущественным сайтом для распознавания одного из глав-, ных ингибиторных рецепторов ЕК-клеток являются HLA-E-MO лекулы. Таким образом, неклассические HLA-молекулы - HLA-E и -G - играют специальную биологическую роль - предохраняют развивающийся плод от атак как Т-клсток, так и ЕК-клеток (Ab bas A. et al., 1991).

Популяционная иммуногенетика HLA-система невероятно разнообразна, у человека насчитыва ется более тысячи аллельных специфичностей. У индивидуума может быть до 22 различных классических продуктов HLA-генов, функционирующих как лиганды Т-клеточного рецептора.

Яркие примеры необходимости функционального разнообра зия продуктов HLA-генов представляют исследования генетичес ки замкнутых популяций индейцев Центральной и Южной Аме рики. Народы Северной Азии, которые заселили Северную и Юж ную Америку примерно 30 тыс. лет назад, разделились на отдельные племена, поселившиеся в различных географических и экологи ческих зонах. Изучение HLA в этих изолятах в 1970-е годы пока зало наличие очень ограниченного числа продуктов HLA-генов I класса на основании серологического типироваиня. Это ограни чение заставляет предположить, что популяции имели либо очень высокий уровень смертности до или после заселения, либо крайне ограниченное число родоначальных особей (эффект основателя).

Примечательно, что последующее изучение HLA-генов у изо лированных туземных американских популяций с использовани ем метода секвенирования показало, что внутри ранее наблюдав шихся ограниченных специфичностей имеется большее количе ство аллельных вариантов. Основным механизмом создания разнообразия в течение относительно короткого периода (столе тий) является конверсия генов, при которой небольшие участки нуклеотидов других HLA-аллелей внутри HLA-комнлекса заме щают существующую последовательность в гене. Этот процесс вос создает репертуар продуктов HLA-генов для эффективной защиты от патогенов, которые существуют в новой окружающей среде (Ко ненков В. И., 1999).

156 Часть 1. Теоретическая гематология Таким образом, теоретически набор продуктов HLA-генов, об наруженных у большинства нелинейных индивидуумов, имеет до статочное разнообразие для того, чтобы дать возможность Т-клет кам распознавать пептиды любого патогена. Избыточность функ ции — отличительный признак иммунной системы, позволяющий снизить опасность того, что новые микробные мутации смогут по бедить хозяина.

HIA и болезни Поскольку характер иммунного ответа во многом определяется индивидуальным HLA-генотипом, естественно предположить, что это может оказывать существенное влияние на течение различных заболеваний. В 1973 г. появилось сообщение о поразительной по силе ассоциации между HLA-B27 и анкилозирующим спондили том: оказалось, что более 80% больных имеют эту специфичность.

В последующем были изучены сотни заболеваний на предмет свя зи с HLA и обнаружены статистически значимые ассоциации бо лее чем для 50 из них (Rodey G., 2000).

За некоторыми исключениями, HLA-ассоциированные заболе вания у людей — это незлокачественные хронические заболевания.

Важной характеристикой многих из них являются аутоиммунные проявления. Большинство болезней имеет мультифакторную этио логию, вовлекая несколько генов и один или более факторов внеш ней среды. Многие из этих заболеваний, по-видимому, иницииру ются микроорганизмами.

Клиническая значимость HLA-ассоциаций - это возможность диагностировать или предсказать вероятность развития заболева ния у индивидуума на основании типирования. Оценка силы ассо циаций между HLA-фактором и заболеванием определяется путем расчета относительного риска развития заболевания. При этом важ но, чтобы и больные, и группа сравнения принадлежали к одной и той же расовой и этнической группе, так как частота HLA-антиге нов в различных популяциях варьирует.

В 1980-е гг. картирование комплекса HLA было неполным, по этому полагали, что комплекс содержит кроме собственно HLA-ге нов гены иммунного ответа, которые определяют восприимчивость к заболеванию. В настоящее время известно, что большинство фе номенов, приписываемых ранее генам иммунного ответа, по-види мому, являются функциональными характеристиками известных генов I и II классов.

Поскольку главные функции HLA-молекул включают презен тацию антигенов Т-клеткам и селекцию репертуара Т-клеточного Глава 8. Иммуногематология рецептора, логично предположить, что восприимчивость к некото рым заболеваниям отражает нарушение этих процессов. Опреде ленные унаследованные HLA-молекулы могут, в частности, эф фективно презентировать аутологичные пептиды (или микробные пептиды, которые имеют сходство с аутологичными), что приво дит к развитию аутоиммунного заболевания (HLA in health and disease, 2000).

С другой стороны, финальный репертуар Т-клеток, отобранный набором HLA-молекул данного индивидуума, может не включать рецепторы, распознающие те или иные вирусные пептиды, что яв ляется необходимым для распознавания и удаления вируса. Нару шение может привести к хронической вирусной инфекции.

Заболевания, при которых HLA-молекулы напрямую влияют на их развитие либо из-за нарушения связывания определенных пептидов, либо из-за избыточного связывания, — это анкилозиру ющий спондилит и сахарный диабет 1 типа. Анкилозирующий спон дилит ассоциирован с HLA-B27 во всех изученных популяциях.

Аллели восприимчивости характеризуются специфическим «кар маном» в пептид-связывающей бороздке, который аккомодирован к восприятию боковой цепи аргинина. Другие заболевания, ассо циированные с В27, включают болезнь Рейтера, передний увеит, некоторые формы постинфекционных артритов, связанные с грам отрицательными организмами (Salmonella, Yersinia, Shigella, Neisserid).

Ревматоидный артрит ассоциирован с очень специфическими HLA-аллелями: DRBl*0401, *0402, *0404, *0408, и, менее часто, с DRBl*0101 (кавказоиды), *0405 (японцы) и *1402 (американские индейцы).

Аллель HLA-DRB1*O3 является маркером генетической пред расположенности ко многим аутоиммунным заболеваниям (сахар ный диабет 1 типа, системная красная волчанка, диффузный ток сический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Объяснение этого фак та, по-видимому, заключается в особенностях биохимической структуры рецепторов, кодируемых данным аллелем: связываю щий участок является высокоаффинным, но низкоспецифичным по отношению к антигенам. Так, более 90% больных сахарным диа бетом 1 типа (жители Санкт-Петербурга) имеют в своем генотипе аллели-провокаторы DRB1*O3 и DRB1*O4, при этом те больные, у которых встречаются оба этих аллеля, значительно чаще заболева ют в более раннем возрасте — до 15 лет. У больных диффузным токсическим зобом при наличии в генотипе сочетания DRB1*O3 и DQAl*0501 риск развития эндокринной офтальмопатии увеличн Часть 1. Теоретическая гематология вается в 10 раз (Глазанова Т. В. и др., 2002). Механизм HLA-acco циированности аутоиммунных заболеваний рассматривается как предпочтительное связывание аутоантигенных пептидов и пред ставление их потенциально аутореактивным клеткам.

Значение иммуногематологии для трансплантации органов и тканей Одно из важных достижений иммуногематологии XX в. — это открытие в начале века групп крови, которое позволило успешно осуществлять переливания крови, а открытие в середине XX сто летия антигенов гистосовместимости сделато реальным преодоле ние иммунологического барьера при трансплантации других орга нов и тканей.

Открытие новых HLA-специфичностей главного комплекса ги стосовместимости шло одновременно с изучением их влияния на результаты пересадки органов и тканей. Было однозначно показа но, что совпадение пар донор—реципиент по антигенам HLA зна чительно повышает выживаемость аллогенных органов. Хотя со зданные в последние годы эффективные методы иммуносупрессии позволяют функционировать в течение длительного времени не полностью совпадающим трансплантатам, однако влияние степе ни иммунологического подбора по-прежнему остается значитель ным.

В результате коллективного исследования Collaborative Transplant Study (CTS), в котором принимати участие более 300 ла бораторий Европы и Америки, включая Санкт-Петербургский центр трансплантации почки, была показана прямо пропорцио нальная зависимость выживаемости почечного трансплантата от числа совпадений, в особенности по антигенам II класса: так, пяти летняя выживаемость при отсутствии несовпадений возрастает на 20%. Поэтому в трансплантационных центрах как Европы, так и Америки аллогенные трансплантаты почек распределяются в со ответствии со степенью HLA-совместимости.

В Санкт-Петербурге круглосуточную службу типирования и подбора пар донор—реципиент осуществляет Республиканский центр иммунологического типирования тканей на базе Российско го НИИ гематологии и трансфузиологии.

Трансплантация костного мозга Трансплантация костного мозга в настоящее время является методом лечения многих гематологических заболеваний. При этом Глава 8. Иммуногематология установлено, что успешное приживление и функционирование ал логенных гемопоэтических стволовых клеток возможно только при высокой степени точности подбора пар донор—реципиент. Так, на пример, при полном совпадении больных хроническим миелолей козом и доноров костного мозга по А-, В-, С-, DRB1- и DQ-специ фичностям пятилетняя выживаемость после трансплантации со ставила 61%, тогда как при расхождении по антигенам/генам двух локусов — всего 33%.

Особенностью трансплантации гемопоэтических стволовых кле ток по сравнению с трансплантацией других органов и тканей яв ляется то, что пересаживается иммунологически активный мате риал. В связи с этим возникает риск развития реакции «трансплан тат против хозяина», отсутствующий, например, при пересадке почки. В связи с этим требования к подбору пар донор- реципиент гораздо более высокие, требуется практически полное совпадение по всем основным локусам (А, В, DR, DQ).

Регистры потенциальных доноров костного мозга. Трансплан тация гемопоэтических стволовых клеток имеет то преимущество перед трансплантацией сердца, печени и даже почки, что материал для трансплантации может быть взят у донора в достаточном ко личестве практически без ущерба для его здоровья. Это позволяет располагать теоретически неограниченным пулом доноров и про водить подбор с высокой степенью точности. Однако для того что бы значительному числу больных и в достаточно короткие сроки был подобран HLA-совместимый донор, необходимо иметь боль шое количество доноров, типированных по HLA-A, -В и -DR локу сам. Поэтому успех аллогенной трансплантации костного мозга в значительной-степени зав.исит от величины донорского регистра, которым располагает лечебное учреждение.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 25 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.