авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

ANDREI

BELOVESHKIN

SYSTEMIC ORGANIZATION

OF HASSALL’S CORPUSCLES

СИСТЕМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ

БЕЛОВЕШКИН

АНДРЕЙ

Беловешкин А.Г.

СИСТЕМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ

hassallscorpuscles.com

Минск

«Медисонт»

2013

2

Beloveshkin Andrei MD PhD

SYSTEMIC ORGANIZATION

OF HASSALL’S CORPUSCLES

hassallscorpuscles.com

Minsk «Medisont»

2013 3 УДК [612.438+616-097]-053.3 Беловешкин, А. Г. Системная организация телец Гассаля / А. Г. Беловешкин. – Минск : Медисонт, 2014. – 180 с. ISBN 978-985-7085-22-4.

В монографии изложено комплексное исследование телец Гассаля тимуса детей первого года жизни. Установлено, что основными клетками, формирующими тельца Гассаля, являются эпителиальные клетки двух типов, которые отличаются друг от друга происхождением, строением, функциями, иммуногистохимическими и ультраструктурными характеристиками. Впервые показано, что системообразующим фактором организации телец Гассаля является процесс синтеза, мобилизации и передачи тканеспецифических аутоантигенов для формирования иммунной толерантности.

Полученные новые данные о системной организации телец Гассаля могут использоваться в гистологии, цитологии и эмбриологии, нормальной и патологической физиологии, онкологии, иммунологии, педиатрии, нормальной и патологической анатомии, судебной медицине, клеточной терапии и биотехнологии. Для научных и медицинских работников, преподавателей, аспирантов и студентов медицинских и биологических вузов.

Табл. 4. Ил. 12. Библиогр.: 224 назв.

Рецензенты:

Кандидат медицинских наук, доцент Стельмах И.А.

Кандидат медицинских наук, доцент Гайдук В.С.

Допускается использование и распространение книги по лицензии Common Creative Attribution 4.0 International License. Разрешается неограниченное распространение данной книги с указанием авторства, в некоммерческих целях, без создания производных на ее основе и без изменения ее редакции. hassallscorpuscles.com This book is licensed under a Creative Commons Attribution 4. International License.

More details at hassallscorpuscles.com © Беловешкин А. Г., ISBN 978-985-7085-22- © Оформление. ООО «Медисонт», ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений Список терминов Введение ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ТЕЛЬЦАХ ГАССАЛЯ 1.1 Современные представления о строении и функциях тимуса 1.2 Эволюция представлений о происхождении и развитии телец Гассаля 1.3 Вспомогательные клетки в составе телец Гассаля.

1.4 Функциональная морфология телец Гассаля 1.5 Выводы ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ГЛАВА 3. ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ 3.

1 Введение 3.2 Гетерогенность эпителиальных клеток телец Гассаля 3.3 Клетки первого типа 3.4 Экспрессия тканеспецифических антигенов в тельцах Гассаля 3.5 Клетки второго типа 3.6 Кератиновое ядро телец Гассаля 3.7 Выводы ГЛАВА 4. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ 4.1 Введение 4.2 Дендритные клетки 4.3 В-лимфоциты 4.4 Макрофаги 4.5 Многоядерные гигантские клетки 4.6 Эозинофилы 4.7 Миоидные клетки 4.8 Нейроэндокринные клетки 4.9 Тимоциты 4.10 Выводы ГЛАВА 5. СТАДИИ РАЗВИТИЯ ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ 5.1 Введение 5.2 Связь телец и кровеносных сосудов 5.3 Прогрессивные тельца Гассаля 5.4 Зрелые тельца Гассаля 5.5 Регрессивные тельца Гассаля 5.6 Выводы ГЛАВА 6. ТЕЛЬЦА ГАССАЛЯ КАК СИСТЕМА 6.1 Стадии развития и классификация телец Гассаля 6.2 Дифференцировка Aire-положительных клеток 6.3 Тельца Гассаля как система 6.4 Морфологическое описание системы телец Гассаля 6.5 Информационное описание системы телец Гассаля 6.6 Функциональное описание системы телец Гассаля 6.7 Валидность системы телец Гассаля 6.8 Выводы ЗАКЛЮЧЕНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИИ ОБ АВТОРЕ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК Список публикаций соискателя Список использованной литературы CONTENTS List of Abbreviations Glossary of Terms (in English) Introduction (in English) CHAPTER 1. HISTORICAL AND MODERN ASPECTS OF HASSALL'S CORPUSCLES' STUDY 1.1 Current ideas about the structure and function of the thymus 1.2 The evolution of ideas about the origin and development of Hassall's corpuscles 1.3 Accessory cells of Hassall's corpuscles. 1.4 Functional morphology of Hassall's corpuscles 1.5 Summary CHAPTER 2. MATERIALS AND METHODS (in English) CHAPTER 3. EPITHELIAL CELLS OF HASSALL'S CORPUSCLES 3.1 Introduction (in English) 3.2 Heterogeneity of epithelial cells in Hassall's corpuscles (in English) 3.3 Epithelial cells of the first type (in English) 3.4 The expression of tissue-specific antigens in Hassall's corpuscles (in English) 3.5 Epithelial cells of the second type (in English) 3.6 Keratin core of Hassall's corpuscles (in English) 3.7 Summary CHAPTER 4. ACCESSORY CELLS OF HASSALL'S CORPUSCLES 4.1 Introduction 4.2 Dendritic cells (in English) 4.3 B-lymphocytes (in English) 4.4 Macrophages (in English) 4.5 Multigiant cells (in English) 4.6 Eosinophils (in English) 4.7 Myoid cells (in English) 4.8 Neuroendocrine cells (in English) 4.9 Thymocytes (in English) 4.10 Summary CHAPTER 5. DEVELOPMENT OF HASSALL'S CORPUSCLES 5.1 Introduction 5.2 Communication between Hassall’s corpuscles and blood vessels (in English) 5.3 Progressive Hassall’s corpuscles (in English) 5.4 Mature Hassall’s corpuscles (in English) 5.5 Regressive Hassall’s corpuscles (in English) 5.6 Summary CHAPTER 6. HASSALL’S CORPUSCLES AS A SYSTEM 6.1 Stages of development and classification of Hassall's corpuscles (in English) 6.2 Differentiation of Aire-positive cells (in English) 6.3 Hassall’s corpuscles as a system 6.4 The morphological description of Hassall's corpuscles system 6.5 Informational description of Hassall’s corpuscles system (in English) 6.6 Functional description of Hassall’s corpuscles system 6.7 Validity of Hassall’s corpuscles system 6.8 Summary FIGURES (in English) ABOUT AUTHOR List of Publications (in English) List of References СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АПК – антигенпрезентирующие клетки АТЕ – автономная толерогенная единица К – цитокератин МЯГК – многоядерные гигантские клетки СТГ – система тельца Гассаля ФАГ – окраска – кислый фуксин-альциановый синий-гематоксилин ЦК – центральная клетка Aire – ген аутоиммунный (Ai) регулятор (re) СЕА – карциоэмбрионический антиген CD – кластер дифференцировки CGA – хромогранин A GFAP – глиальный фибриллярный кислый белок HLA – человеческие лейкоцитарные антигены MHC –главный комплекс гистосовместимости NSE – нейронспецифическая енолаза SYN – синаптофизин СПИСОК ТЕРМИНОВ Зрелые тельца Гассаля – стадия развития, при которой в тельце обнаруживается кератиновое ядро.

Кератиновое ядро – концентрическое скопление пластин (роговых чешуек), содержащих высокомолекулярные цитокератины в полости тельца.

Клетка I типа – клетка субпопуляции эпителиоцитов тельца, которые происходят из К8-положительных клеток мозгового вещества тимуса человека, характеризуются округлой формой и погибают механизмом аутофагической гибели.

Клетка II типа – клетка субпопуляции эпителиоцитов телец Гассаля, которые происходят из К14-положительных клеток мозгового вещества тимуса человека, характеризуются вытянутой формой, подвергаются терминальной дифференцировке и образуют чешуйки кератинового ядра тельца.

Полость тельца – это внутреннее пространство, ограниченное стенкой тельца. Полость возникает вследствие разрушения эпителиальных клеток.

Прогрессивные тельца Гассаля – стадия развития, при которой в тельце отсутствует кератиновое ядро и выраженная полость.

Регрессивные (стареющие) тельца Гассаля – стадия развития, при которой в полости и стенке тельца преобладают деструктивные процессы, кератиновые пластины занимают менее половины полости тельца либо отсутствуют вовсе.

Стенка тельца – слои клеток, окружающие полость тельца. В зависимости от их положения мы выделяем периферический слой тельца Гассаля – 1-2 слоя клеток со стороны мозгового вещества, и внутренний слой тельца Гассаля – 1-2 слоя клеток со стороны полости тельца.

Центральная клетка – эпителиальная клетка прогрессивных телец, вокруг которой происходит организация остальных клеточных элементов при росте тельца.

GLOSSARY OF TERMS Type I epithelial cells – the epithelial cell subpopulation of Hassall's corpuscles, which are derived from K8-positive cells of the medulla, are characterized by a rounded shape and die through autophagic death.

Type II epithelial cells – the epithelial cell subpopulation of Hassall's corpuscles, which are derived from K14 - positive cells of thymic medulla, are characterized by an elongated shape, undergo terminal differentiation and form squamas of keratin core.

Keratin core – a concentric cluster of keratin plates inside a corpuscle cavity containing high-molecular cytokeratins.

The corpuscle wall – layers of cells surrounding the corpuscle cavity.

Depending on their position we distinguish the peripheral (outer) layer of Hassall's corpuscles (1-2 cell layers adjacent to medulla), and the inner layer of Hassall's corpuscles (1-2 cell layers adjacent to corpuscle cavity).

The central cell – type I epithelial cell (unicellular corpuscle), around which other cellular elements are organized in the process of corpuscle growth.

Corpuscle cavity – internal space inside a corpuscle limited by epithelial walls. The cavity arises due to the destruction of epithelial cells.

Progressive Hassall's corpuscles – a stage of corpuscle development without a keratin core and prominent cavity.

Mature Hassall's corpuscles – a stage of corpuscle development at which the prominent keratin core is found in the corpuscle.

Regressive Hassall's corpuscles – a stage of corpuscle development at which destructive processes in a corpuscle cavity are domint, keratin core is more than 50% destructed and contains the infiltrate (may also contain cells or corpuscle fragments).

ВВЕДЕНИЕ INTRODUCTION Иммунная система обеспечивает генетическую целостность организма на протяжении его онтогенеза. Она способна обнаруживать чужеродные антигены и индуцировать против них иммунный ответ [20, 71]. Для правильного распознавания антигенов необходимо отсутствие чувствительности к антигенам собственного организма (иммунная толерантность). Она представлена двумя уровнями: центральная (в тимусе и красном костном мозге) и периферическая (в периферических органах иммунной системы) [145]. В тимусе иммунная толерантность формируется посредством двух основных механизмов: удалением аутореактивных тимоцитов и дифференцировкой Т-регуляторов, которые контролируют иммунный ответ на периферии [149, 183].

Тимус является одним из центральных (первичных) органов иммунной системы, в котором из клеток-предшественников дифференцируются различные субпопуляции T-лимфоцитов [44, 175, 202]. Процесс их дифференцировки начинается в корковом веществе тимуса, а завершается в мозговом. В центре мозгового вещества тимуса находятся скопления концентрически расположенных терминально дифференцированных эпителиальных клеток, получившие название телец Гассаля. Они привлекали внимание большого числа исследователей [28, 71, 137, 143, 204, 213], однако точные данные об их функции и строении отсутствуют до сих пор [204]. Это связано с преобладанием в научной среде представления о тельцах Гассаля, как об остатках дегенерирующего эпителия, которые аналогичны роговым чешуйкам эпидермиса и не выполняют значимых функций [102, 150]. Другой, не менее важной причиной, является преимущественное использование в качестве лабораторных животных мышей и крыс, в тимусе которых тельца Гассаля встречаются редко и развиты очень слабо [185]. Отметим и невозможность изучения развития телец in vitro, так как они не формируются в культурах клеток [97].

В последнее десятилетие тельца Гассаля вновь оказались в центре внимания морфологов и клиницистов, поскольку в них обнаружены тканеспецифические аутоантигены и выявлена их роль в патогенезе таких заболеваний как сахарный диабет 1 типа [78], ревматоидный артрит [62], рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит [181], синдром Гудпасчера [62] и ряда других. Также установлено, что тельца Гассаля синтезируют хемокины, влияющие на различные клеточные популяции мозгового вещества [34, 38, 203, 224]. Несмотря на это, сведения о взаимоотношениях телец Гассаля с другими клетками мозгового вещества тимуса (дендритными, миоидными, нейроэндокринными клетками, тимоцитами, макрофагами, эозинофилами и др.) до настоящего времени являются крайне неполными и часто противоречивыми [186]. Неясными остаются механизмы формирования этих связей и их функциональное значение [204]. Отсутствие подобных данных не позволяет сформировать целостное, системное представление о процессах иммуногенеза в тимусе.

Системные представления о процессах селекции в тимусе востребованы при трансплантации органов и тканей, в разработке новых подходов к лечению онкологических и аутоиммунных заболеваний. В основе развития данной патологии лежит иммунный дефект распознавания «свой-чужой» [51]. Эти заболевания характеризуется тенденцией к росту частоты встречаемости, ограниченной эффективностью традиционных методов лечения и зачастую неопределенным прогнозом. В настоящее время в экспериментальной и клинической медицине все чаще используются методики, в основе которых лежит управление дифференцировкой имуннокомпетентных клеток (дендритные вакцины и т.

п.) [221]. Их применение обусловлено высокой эффективностью и практически полным отсутствием побочных эффектов при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний, а также при трансплантации органов и тканей. Разработка данных методик сталкивается со сложностью моделирования механизмов дифференцировки иммунокомпетентных клеток, в частности Т лимфоцитов. Поэтому выяснение тонких механизмов закономерностей их дифференцировки является крайне актуальным для усовершенствования и повышения эффективности новых методик лечения и профилактики заболеваний. Так, изучение формирования механизмов центральной толерантности в тимусе внесет вклад в решение проблемы управления ею и, соответственно, влияния на состояние периферического пула зрелых Т-лимфоцитов [217].

В литературе имеются многочисленные данные о структуре, функции, развитии телец, однако в большинстве работ авторы используют небольшое количество методов исследования, что не позволяет им комплексно изучить организацию телец Гассаля [28, 71, 137, 143, 204, 213]. В настоящее время показано, что исследования подобного типа требуют особого подхода, в основу которого должен быть поставлен системный анализ изучаемых явлений [31, 42].

Накопление огромного количества научных данных приводит к необходимости не только их описания и систематизации, но и поиска взаимосвязи между отдельными явлениями, так как с точки зрения системного анализа, простое описание отдельных компонентов системы не приближает к пониманию ее функционирования. С учетом того, что в мозговом веществе тимуса обнаружено до 10 различных клеточных популяций, взаимодействующих друг с другом и с тельцами Гассаля [186], это замечание представляется особенно актуальным.

Для решения данной задачи необходимо выявить системные закономерности структурной организации компонентов иммунной системы. В связи с этим мы предприняли попытку всестороннего изучения телец Гассаля с использованием комплекса различных методов, в том числе и метода системного анализа. Такой подход в изучении компонентов мозгового вещества тимуса дает возможность не только дать системное описание строения телец Гассаля и объяснить взаимодействие телец с различными клеточными популяциями мозгового вещества тимуса, но и установить определенные взаимосвязи между функциональными и морфологическими особенностями организации телец.

Исследование формирования телец Гассаля, выяснение системных закономерностей их организации и функционирования представляет значительный как теоретический, так и практический интерес в иммунологии, онкологии, трансплантологии, геронтологии, клеточной инженерии и других отраслях знания. Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена практической и теоретической востребованностью данных по системной организации телец Гассаля.

The thymus is one of the central (primary) organs of the immune system, where progenitor cells differentiate into different subpopulations of T-lymphocytes [44, 175, 202]. The process of their differentiation begins in the thymus cortex and ends in the medulla. There are clusters of concentric terminally differentiated epithelial cells in the center of the thymus medulla, known as Hassall's corpuscles. They have attracted the attention of many researchers [28, 71, 137, 143, 204, 213] since their discovering, but the exact details of their function and structure are still insufficient [204]. This was due to the predominance in the scientific community of the ideas about Hassall's corpuscles as remnants of degenerating epithelium similar to the korneocytes of the epidermis and without any significant functions [102, 150]. Another equally important reason was the predominant use of mice and rats as laboratory animals with poorly developed and rare Hassall's corpuscles [185]. In addition Hassall's corpuscles cannot be studied in vitro, as they are not formed in the cell cultures [97].

In the past decade, Hassall's corpuscles were again in the focus of pathologists and clinicians, as the researchers found tissue-specific self antigens in corpuscles and revealed their role in the pathogenesis of diseases such as type 1 diabetes [78], rheumatoid arthritis [62], multiple sclerosis, autoimmune thyroiditis [181], Goodpasture's syndrome [62] and others. They also discovered that Hassall's corpuscles synthesize chemokines affecting different cell populations in thymic medulla [34, 38, 203, 224]. Despite this, the information on the relationship between Hassall's corpuscles with other cell types of thymic medulla (dendritic, myoid, neuroendocrine cells, thymocytes, macrophages, eosinophils, etc.) remains insufficient and often contradictory [186]. Mechanisms of these relationships and their functional significance are still unclear [204]. The lack of such data does not allow forming a holistic, systemic view of the differentiation processes in the thymus.

.

ГЛАВА ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ТЕЛЬЦАХ ГАССАЛЯ CHAPTER HISTORICAL AND MODERN ASPECTS OF HASSALL'S CORPUSCLES' STUDY 1.1 Общее представление о строении и функциях тимуса (1.1 Current ideas about the structure and function of the thymus) Генетическая целостность является важным условием существования сложных организмов. Для ее поддержания существует постоянная необходимость распознавания, переработки и устранения чужеродных тел и веществ [20, 71]. Только две системы организма (нервная и иммунная) способны к обработке информации и обладают такими качествами как обучение, память, распознавание и принятие решений в знакомых и незнакомых ситуациях [18].

Одним из центральных органов иммунной системы является тимус, в котором из клеток-предшественников дифференцируются различные субпопуляции T-лимфоцитов, имеющие уникальные Т клеточные рецепторы: Т-хелперы разных подтипов, Т-киллеры и Т регуляторы. Зрелые клетки покидают тимус и заселяют тимус зависимые зоны периферических (вторичных) органов иммунной системы [44]. Основной задачей Т-клеток является распознавание различных антигенов с помощью Т-клеточных рецепторов в комплексе с собственными молекулами комплекса гистосовместимости [203]. В связи с этим, главная функция тимуса – это генерация функционально активного периферического самоподдерживающегося пула Т-лимфоцитов, не реагирующего на аутоантигены.

Тимус снаружи покрыт соединительнотканной капсулой. От капсулы вглубь органа отходят соединительнотканные септы, отграничивающие неполные дольки, в которых различают корковое и мозговое вещество. В основе органа находится эпителиальная ткань, состоящая из эпителиоретикулоцитов (эпителиоцитов). Между эпителиоцитами находятся разнообразные вспомогательные клетки (дендритные клетки, макрофаги, миоидные клетки и др.), состав которых зависит от конкретной гистологической зоны. Паренхима тимуса представлена развивающимися Т-лимфоцитами (тимоцитами), которые мигрируют между эпителиальными и вспомогательными клетками и активно взаимодействуют с ними [2, 4, 6, 19, 23, 40, 207].

В отдельных гистологических зонах тимуса последовательно происходит процесс созревания Т-лимфоцитов, который включает в себя несколько стадий [71, 186]. Каждая из этих стадий требует наличия уникального микроокружения, оптимально обеспечивающего определенный этап дифференцировки. В основе каждой стадии лежат сложные механизмы кооперации между разнообразными клеточными элементами, характерными для данного микроокружения. Тимоциты разных стадий дифференцировки взаимодействуют с макрофагами, эпителиальными клетками различных субпопуляций, дендритными и миоидными клетками, гранулоцитами. В настоящее время в качестве отдельных структрурно-функциональных зон выделяют субкапсулярную зону, корковое вещество, кортико-медуллярную границу, внутреннее и наружное мозговое вещество, периваскулярные пространства [175].

В субкапсулярной зоне находятся пре-Т-лифоциты, в которых происходит перегруппировка генов Т-клеточного рецептора и начинается формирование Т-клеточных рецепторов. В коре обнаруживаются двойные положительные (CD8+CD4+) клетки, завершается формирование Т-клеточных рецепторов и происходит положительная селекция тимоцитов, при которой гибнет до 95% клеток. Кортико-медуллярная граница является зоной миграции клеток как в тимус, так и из него. В мозговом веществе находятся одинарные положительные клетки (CD8+ и CD4+), в нем происходит негативная селекция с выбраковкой аутореактивных лимфоцитов [44, 202]. H.Petrie [175] считает, что мозговое вещество неоднородно, и делит его на наружное и внутреннее. Наружное мозговое вещество характеризуется наличием большого количества зрелых дендритных клеток, и в нем происходят основные события негативной селекции.

Во внутреннем мозговом веществе формируется иное микроокружение, в котором находятся тельца Гассаля. Функции этой зоны в настоящее время изучены недостаточно.

1.2 Эволюция представлений о происхождении и развитии телец Гассаля (1.2 The evolution of ideas about the origin and development of Hassall's corpuscles) Тельца были открыты в 1849 году английским врачом, Артуром Гассалем, который изложил свои наблюдения в The Microscopic Anatomy of the Human Body in Health and Disease [114]. Одним из первых подробное описание этих структур дал Рудольф Вирхов, поэтому иногда их называются тельцами Гассаля-Вирхова.

На раннем этапе изучения тимуса большое внимание исследователей привлекало происхождение телец Гассаля. Так, предположение о том, что тельца возникают из эндотелиальных клеток мелких дегенерирующих сосудов («сосудистая» теория), было выдвинуто Б.Афанасьевым в 1877 г [5]. Согласно Б. Афанасьеву, образование телец начинается с набухания эндотелиоцитов сосудов мозгового вещества, далее наступает деление их ядер, выпячивание и пролиферация клеток. В дальнейшем наблюдается облитерация сосуда, отшнуровка от него образовавшегося тельца и формирование характерных слоистых структур.

Наиболее тщательные и системные исследования тимуса в этот период проводятся Максимовым A.A. [162] и «отцом тимологии»

J.Hammar [111, 112]. Последний описал ключевые моменты развития и строения телец Гассаля и предложил гипотезу, которая в общих чертах поддерживается подавляющим большинством современных исследователей. Согласно ей, тельца Гассаля образуются из дегенерирующих гипертрофированных эпителиальных клеток, наслаивающихся друг на друга с образованием характерных концентрических структур. J.Hammar также описал шесть стадий развития телец и их изменения при различных заболеваниях. Его выводы были позднее подтверждены многочисленными исследователями.

М.Kostowiecki в 1930 г. [141] пытался примирить «сосудистую»

теорию Б.Афанасьева с «эпителиальной» теорией J.Hammar. Он считал, что тельца происходят из эпителиальных клеток, расположенных вокруг сосудов и формирующих два типа телец:

«сосудистые» тельца – кольца эпителиальных клеток вокруг сосудов, и «истинные» тельца – скопления эпителиоцитов с дегенерирующими клетками в центре. Позднее появляются работы, оспаривающие происхождение телец из эпителиальных клеток. Известный исследователь тимуса J.Blau обнаружил, что некоторые вещества (частицы углерода, альбумин, иммуноглобулины) при внутривенном введении обнаруживается в просвете телец Гассаля, что указывало на сосудистую гипотезу возникновения телец [65, 70]. Под сомнение классическую модель развития телец Гассаля (J.Hammar) ставят и некоторые современные исследователи [191].

В 2005 году M.Drumea-Mirancea обнаружил связь телец Гассаля с сосудами посредством каналов-проводников [89]. Каналы проводники являются производными базальной мембраны, окруженной эпителиальными клетками. Он установили, что каналы проводники начинаются от сосудов и заканчиваются в тельцах Гассаля. Каналы-проводники in vitro способны транспортировать молекулы размером до 500 кД и не способны транспортировать клетки. Таким образом, они представляют собой транспортную систему для антигенов или цитокинов внутри мозгового вещества.

Однако до настоящего времени не было установлено, как возникают каналы-проводники, как формируется их связь с тельцами Гассаля.

Неясно также, функционируют ли они in vivo. Эпителиальные канальцы в тимусе мышей, вероятно, являются аналогичными структурами [12].

К настоящему времени эпителиальные клетки тимуса изучены хорошо, но ранние клетки-предшественники телец Гассаля так и не установлены [20]. Известно [86], что тимусные эпителиальные клетки представляют собой гетерогенную клеточную популяцию.

Существует много различных классификаций эпителиоцитов, в основу которых положено их происхождение, морфологические признаки, ультрамикроскопические и гистохимические особенности.

Так, по морфологическим признакам выделяют светлые и темные клетки [10,], в классификации по ультрамикроскопическим признакам выделяют 6 типов эпителиальных клеток [13, 118, 120]. Клетки типа ограничивают капсулу, перегородки и окружают периваскулярные пространства капилляров коркового вещества. Клетки типа 2, 3 и локализуются в корковом веществе;

клетки типа 5 представляют собой неспециализированные клетки мозгового вещества, а клетки типа формируют основную популяцию клеток мозгового вещества и участвуют в образовании телец Гассаля [118]. В настоящее время большинство авторов (на основе результатов иммуногистохимических исследований) выделяет четыре основных типа эпителиальных клеток: субкапсулярные (парасептальные, периваскулярные), кортикальные, медуллярные и клетки телец Гассаля [10, 198].

Значительное число исследователей придерживается взглядов о наличии двух субпопуляций эпителиальных клеток в мозговом веществе тимуса (т.н. «светлые» клетки энтодермального происхождения и «темные» - эктодермального) [20, 100, 199, 218].

Также существует ряд функциональных классификаций [71], в основу которых положен уровень экспрессии эпителиоцитами молекул MHC II, секреции тимических гормонов, активности транскрипционного фактора Aire и прочих молекул. Так, используя уровни экспрессии молекул MHC II и Ly51 (антигенная детерминанта эпителиоцитов коркового вещества), P. Ileana (2008) предложила разделить все эпителиальные клетки тимуса на 4 группы: MHC IIhi/Ly51+ (hi(gh) – высокий уровень экспрессии, lo(w) – низкий) и MHC IIlo/Ly51+ в корковом веществе и MHC IIhi/Ly51– и MHC IIlo/Ly51– – в мозговом веществе тимуса [6,8]. Следует отметить, что ни одна из перечисленных классификаций не позволяет связать функциональные и морфологические особенности клеток и показать участие тех или иных эпителиоцитов в строении телец Гассаля.

В последнее время появились данные [103] о том, что все эпителиальные клетки тимуса происходят из единой клетки предшественницы. Известно [14, 124], что эпителиальные клетки предшественники расположены на кортико-медулярной границе. При их дифференцировке образуются различные субпопуляции эпителиоцитов, которые предлагается классифицировать по экспрессии цитокератинов 5 или 14 и цитокератинов 8 или 18 (пары кератинов, которые экспрессируются совместно) [187]. Согласно этой классификации, выделяют две основные популяции тимических эпителиальных клеток – цитокератин 5-14-положительных (К14+) и цитокератин 8-18-положительных (К8+).

Согласно N.Eun (2011) [92], субпопуляция K14–K8+ гетерогенна функционально. Так, 30% клеток имеют высокие уровни экспрессии MHC IIhi CD80. Это указывает на их активное участие в процессах антигенпрезентации. 70% клеток данной субпопуляции имеют низкий уровень указанных маркеров, однако по мере дифференцировки K14– K8+ клеток, уровень указанных маркеров повышается. В свою очередь, K14+K8– клетки демонстрируют низкий уровень экспрессии молекул MHC II на своей поверхности, что указывает на их низкую вовлеченность в процессы антигенпрезентации.

Таким образом, в литературе существует три основных гипотезы об эпителиальном источнике происхождения телец Гассаля.

По одним данным [118], тельца Гассаля развиваются из особой субпопуляции эпителиальных клеток (клетки 6 типа), по другим – источником развития телец являются «светлые» клетки энтодермального происхождения [199]. Также существуют теории [198, 211], что все эпителиальные клетки мозгового вещества относятся к единому дифферону эпителиоцитов, и тельца Гассаля образуются из различных гибнущих клеток. Кроме того, ряд авторов поддерживает «сосудистую» теорию происхождения телец Гассаля [65, 70, 191]. Следовательно, установление точного источника развития телец актуально и по настоящее время.

Внимание многих исследователей привлекал процесс развития телец Гассаля и их классификация. Следует отметить, что большинство существующих классификаций телец соответствуют их стадиям развития. С помощью различных методов исследования было подробно изучено развитие телец Гассаля и в нем выделено от 3 до этапов [67, 111]. Большинство исследователей выделяло прогрессивную стадию (укрупнение светлой эпителиальной клетки, гипертрофию соседних клеток), стадию зрелости (формирование «луковицы») и регрессивную стадию (кальцификация или разрушение тельца и фагоцитоз его остатков).

J.Miller [23] выделял фазы возникновения, некроза и резорбции. B.Bodey [71] подтвердил представления J.Hammar о том, что образование телец происходит путем концентрического наслоения эпителиальных клеток, в которых начинаются процессы дегенеративного характера. Из отечественных исследователей отметим Аминову Г.Г. [4, 30], которая выделяла фазы возникновения, некроза, гиалиноза и обызвествления, и Харченко В.П., описавший 8 стадий развития телец [10]. Овченков В.С.и Кульпина Е.В. [28, 29] выделяют прогрессивную стадию (формирующихся и молодых телец) и регрессивную стадию (морфо функциональной зрелости или тип зрелых телец), а также фаза дегенерации (тип старых телец). Более подробная классификация этих авторов предусматривает свыше 16 разновидностей телец.

Следовательно, в настоящее время отсутствует общепринятая классификация телец Гассаля по морфологическим критериям.

Значительное разночтение в названиях телец Гассаля и их компонентов отражает существующую неопределенность в понимании процесса их развития. Так, содержимое полости определяется различными авторами как «чешуйчатые сферические включения» [17], «ядерный детрит», «распад набухших ретикулярных клеток» [19], «гиалиноз и обызвествление клеточного детрита» [10].

Уточнение подобных процессов требует тщательного изучения развития морфологических особенностей эпителиальных клеток, формирующих тельца Гассаля.

Финальной стадией развития тельца является его разрушение.

Активно изучали процессы разрушения телец такие исследователи как K.Hirokawa [120], J.Blau [69], M.Kotani [142, 143, 144]. M.Kotani [124] установил макрофагально-моноцитарное происхождение клеток, разрушающих тельца Гассаля. В них была обнаружена высокая внутри- и внеклеточная активность гидролитических ферментов:

кислой фосфатазы, бета-глюкоронидазы, неспецифической эстеразы, 5-нуклеозидазы. При экспериментах с внутрисосудистым введением чернил и последующим гамма-облучением было установлено, что макрофаги, разрушающие тельца Гассаля, остаются в тимусе, мигрируя в кортико-медуллярную и подкапсульную зоны тимуса [69].

На роль клеток, разрушающих тельца, кроме макрофагов, разными авторами выдвигались нейтрофилы, эозинофилы и многоядерные гигантские клетки [23, 71, 88]. В настоящее время известно, что в разрушении телец принимает участие несколько типов клеток, однако подробности и функциональное значение этого процесса остаются недостаточно изученными.

1.3 Вспомогательные клетки в составе телец Гассаля (1.3 Accessory cells of Hassall's corpuscles) Мозговое вещество долек содержит меньшее количество лимфоцитов, чем корковое. Его клеточный состав и структурная организация также имеют выраженные отличия от коркового вещества. Среди клеток мозгового вещества, кроме эпителиальных, выделяют ряд вспомогательных клеток и тимоциты.

Вспомогательные клетки мозгового вещества тимуса представлены дендритными клетками [195], макрофагами [171], В лимфоцитами [93], миоидными клетками [72] и эозинофилами [91], нейроэпителиальными клетками [20], нейтрофилами, базофилами и другими клетками [71]. Они взаимодействуют как между собой, так и с эпителиоцитами и развивающимися тимоцитами. В литературе имеются данные о взаимодействии некоторых вспомогательных клеток с тельцами Гассаля, однако зачастую они неполные и противоречивые.

Дендритные клетки представляют собой самую многочисленную популяцию вспомогательных клеток мозгового вещества, и их основной функцией является презентация аутоантигенов тимоцитам [8]. Способность захватывать из окружающей среды различные антигены – это важная особенность дендритных клеток. Они поглощают антигены и представляют их на своей мембране в комплексе с молекулами MHC I и MHC II. В тимусе встречаются дендритные клетки разных типов, основными из которых являются миелоидные и плазмацитоидные клетки [122, 220]. Часть дендритных клеток мигрирует в тимус в виде зрелых форм, но большинство созревает в тимусе. К настоящему времени лучше всего изучено происхождение и развитие доминирующей популяции дендритных клеток – миелоидных. Предшественники миелоидных дендритных клеток (моноциты и CD34+ клетки) мигрируют в тимус через стенку сосудов кортикомедуллярой границы. В процессе своего развития они проходят три стадии, на каждой из которых различаются по морфологии и характеризуются экспрессией разных иммуногистохимических маркеров [209, 220].

Первой стадией развития являются незрелые дендритные клетки с низкой активностью процессов захвата антигенов и антигенпрезентации. Созревающие клетки (вторая стадия) активно захватывают антигены, но обнаруживают низкую активность антигенпрезентации. Они характеризуются экспрессией маркера CD1a и при электронно-микроскопическом исследовании в них обнаруживаются гранулы Бирбека [172]. Следует отметить, что CD1a представляет собой белок, ответственный за захват липидных и гликолипидных антигенов. Он локализован на мембране клетки и в ранних эндосомах. Известно, что молекулы CD1a находятся в ассоциации с гранулами Бирбека [163]. Эти гранулы имеют форму теннисной ракетки и формируются путем эндоцитоза мембраны и ассоциированы с белком лангерином CD207 [166]. Последний действует как транспортный эндоцитозный рецептор в формировании гранул Бирбека.

Третья стадия развития представлена зрелыми дендритными клетками, которые характеризуются низким уровнем поглощения антигенов и высокой активностью антигенпрезентации [80]. Зрелые дендритные клетки располагаются в наружных отделах мозгового вещества тимуса. Отметим, что микроокружение мозгового вещества обеспечивает различные механизмы переноса антигенов к дендритным клеткам [140].

К числу хемокинов, стимулирующих дифференцировку дендритных клеток, относятся TNF-альфа [172], GM-CSF (стимулирует развитие лангергансоподобных клеток из CD1a положительных клеток), IL-7, TGF-бета, TSLP [117], SDF-1 [203] (привлекает Cd34+ предшественники из кровеносного русла).

Цитокины GM-CSF [195], TSLP, SDF-1 [203] секретируются исключительно эпителиальными клетками телец Гассаля.

Ряд авторов отмечает концентрацию дендритных клеток возле телец Гассаля, однако эти данные неполны и противоречивы. Так, Савченко А.С. [195] описывает дендритные клетки как в стенке, так и в полости телец, а согласно M. Raica [204], они расположены снаружи телец Гассаля. Согласно M.Zaiceva [203], созревающие дендритные клетки способны поглощать апоптотические тимоциты возле телец Гассаля, другие авторы отрицают эту возможность [172, 163].

Функциональное значение концентрации дендритных клеток возле телец точно не установлено, отсутствуют данные об особенностях дендритных клеток телец различных стадий развития.

В-лимфоциты также являются значимой субпопуляцией клеток тимуса. В настоящее время описано две основные субпопуляции В лимфоцитов, имеющие значительные топографические, морфологические и функциональные различия [96]. Первая субпопуляция представлена плазмоцитами периваскулярных и септальных пространств. Другой субпопуляцией В-лимфоцитов тимуса являются интрамедулярные В-лимфоциты, которые характеризуются экспрессией маркера CD20 и не содержат иммуноглобулины. Эти клетки составляют до трети всех клеток мозгового вещества [132] и характеризуются иммуногистохимическими маркерами активации [93]. В настоящее время доказано, что интрамедулярные В-лимфоциты играют важную роль в процессах негативной селекции и обладают способностью к антигенпрезентации [222]. Они активируются взаимодействием с Т лимфоцитами и нечувствительны к типичным В-клеточным стимуляторам, таким, как, например липополисахарид. Также они, наряду с дендритными клетками, принимают участие в негативной селекции тимоцитов [201]. Отмечена тенденция В-лимфоцитов к концентрации вокруг телец, но значение и особенности взаимосвязи телец Гассаля и В-лимфоцитов к настоящему времени не изучены.

Макрофаги являются важной субпопуляцией клеток тимуса, которые играют ключевую роль в поглощении апоптотических тимоцитов и синтезе ряда цитокинов [171]. Известно, что макрофаги принимают участие в разрушении телец Гассаля, но описание механизма разрушения у разных авторов противоречиво [23, 88, 120, 142, 160]. Кроме макрофагов, встречаются и многоядерные гигантские клетки (МЯГК), которые образуются путем слияния моноцитов или макрофагов под воздействием ряда цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4, интерферон и др.) [74]. Встречаются лишь единичные упоминания о них в научной литературе [142], впервые на существование таких клеток в нормальном тимусе человека указал N.Dourov в 1976 [88], подчеркнув их значительную роль в разрушении телец. Упоминал про существование МЯГК у человека и M.Kotani в 1982 году [142].

Отметим, что многоядерные гигантские клетки в тимусе были описаны у следующих видов: овцы, морские свинки [142, 144], нутрии [199] и даже рыбы [50]. M.Kotani при исследовании тимуса овец показал, что многоядерные гигантские клетки образуются из макрофагов и характеризуются наличием ряда гидролитических ферментов. Он подробно описал слияние «кластических» клеток с образованием полиядерных клеток, участвующих в разрушении телец Гассаля. В тимусе нутрий, как показал V.Miclaus [199], многоядерные гигантские клетки многочисленны и принимают активное участие в разрушении кератиновых ядер телец.

Эозинофилы в тимусе человека обнаружены достаточно давно [168] и считаются обязательной клеточной популяцией, участвующей в процессе негативной селекции тимоцитов [76]. Доказано [189], что эозинофилы являются антиген-презентирующими клетками, экспрессирующими на своей поверхности ряд костимуляторных молекул, таких как CD80 и CD86. Эозинофилы способствуют дифференцировке T-хелперов второго типа за счет селективного апоптоза T-хелперов первого типа [214]. Они стимулируют антигензависимую MHC-II T-клеточную пролиферацию, хоть и в меньшей степени, чем макрофаги [91]. Некоторые авторы описывали присутствие эозинофилов в тельцах Гассаля и отмечали их возможное структурно-функциональное взаимодействие [214], однако механизм участия эозинофилов в морфогенезе телец Гассаля изучен недостаточно. Следовательно, роль эозинофилов в морфогенезе телец является неясной, так, M.Tulic [214] считает, что эозинофилы играют важную роль в возникновении телец, а другие авторы – в разрушении телец [71]. Некоторые исследователи отрицают роль эозинофилов в разрушении телец [10].

Миоидные клетки тимуса – это уникальная клеточная популяция, встречающаяся только в мозговом веществе тимуса [72].

Несмотря на то, что по своему антигенному составу эти клетки схожи со скелетной мышечной тканью (содержат маркеры тропонин Т, десмин, миогенный транскриптоционный фактор MyoD, ацетилхолиновый рецептор), они имеют ряд особенностей: не формируют симпласты и не иннервированы [164]. Долгое время считалось, что кроме участия в патогенезе миастении, когда их количество существенно возрастает, эти клетки не играют важной роли в функционировании тимуса [205]. Однако работы последних лет показали, что роль миоидных клеток намного значительнее, чем считалось ранее. Обнаружено, что они участвуют в антигенпрезентации: способны представлять антигены тимоцитам в комплексе с MHC I и стимулировать пролиферацию их специфических клонов [164];

непосредственно взаимодействуют с тимоцитами – защищают их от апоптоза [173]. Они также имеют активные Н-холинорецепторы и способны к сокращению [135], однако функциональное значение данного факта точно не установлено [104]. Миоидные клетки синтезируют ряд цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, TNF-aльфа, RANTES, MIP-1a, MCP-1), при этом цитокиновый профиль миоидных клеток значительно отличается от профиля эпителиальных клеток [133].

По вопросу взаимоотношения миоидных клеток и телец Гассаля существует много противоречивых взглядов. Так, выдвинутая в году M.Imai [125] теория о миоидном происхождении телец Гассаля, была поддержана рядом исследователей, однако позднее от нее отказались [71]. Ряд современных исследователей отмечает либо полное отсутствие миоидных клеток в составе телец [204], либо их активное участие в формировании телец [223]. При этом включение миоидных клеток в состав телец может быть обусловлено плотным контактом миоидных клеток с эпителиальными клетками посредством десмосом [104].

Нейроэндокринные клетки являются важной популяцией тимуса человека [20]. Гормоны нейроэндокринной системы обладают выраженной иммунорегуляторной активностью, непосредственно влияя на такие процессы, как клеточная пролиферация, дифференцировка, миграция, секреция, апоптоз и продукция цитокинов [192]. Топографическая специфичность этих гормонов может указывать на их роль в регуляции процессов дифференцировки тимоцитов, происходящих в различных отделах тимуса [59, 212]. К наиболее значимым маркерам нейроэндокринных клеток относятся синаптофизин, хромогранин A, нейронспецифическая енолаза и глиальный фибриллярный кислый белок [20]. Синаптофизин положительные клетки сосредоточены возле телец Гассаля [34, 38, 156], экспрессия хромогранина А и нейронспецифической енолазы также обнаружена в клетках телец [73]. Однако остается неясным, представляют ли все нейроэндокринные клетки телец одну субпопуляцию и каков их вклад морфогенез телец Гассаля.

Тельца Гассаля взаимодействуют с различными клеточными популяциями, но их взаимодействие с тимоцитами до настоящего времени остается недостаточно изученным. Так, J.Blau [66, 68] считал, что тельца обладают фагоцитарной активностью и способны разрушать гибнущие тимоциты («кладбище тимоцитов»). Эта теория получила широкое распространение и поддерживается большим количеством исследователей. B.Bodey [170] предполагал, что гранулы в эпителиальных клетках телец являются фрагментами разрушенных тимоцитов. В пользу этого предположения приводились такие факты, как быстрое попадание меченой ДНК тимоцитов в просвет телец и высокая активность лизосомальных ферментов в клетках телец Гассаля. Некоторые современные исследователи (Адайбаев Т.А., Харченко В.С. и другие) также поддерживают теорию о фагоцитарной активности телец [3, 10]. Однако, несмотря на многочисленные исследования, так и не был описан механизм попадания тимоцитов в тельца.

Наряду с данной теорией, существуют и прямо противоположные мнения, согласно которым тельца Гассаля способствуют дозреванию тимоцитов. Некоторые исследователи обращают внимание на высокую плотность тимоцитов возле телец Гассаля. Так, R.Senelar [188] описал контакты клеток телец с тимоцитами и выдвинул предположение, что тельца являются местами дозревания последних. M. Raica [152] описывает «богатые лимфоцитами» тельца Гассаля. Следовательно, существует ряд противоречий в описании взаимодействия тимоцитов с тельцами Гассаля.

Таким образом, к настоящему времени накопился значительный объем данных по взаимосвязям телец Гассаля с различными типами клеток. Однако эти результаты зачастую неполные и противоречат друг другу. Механизмы взаимодействия эпителиальных и вспомогательных клеток недостаточно изучены. Неясными и неполными остаются вопросы о точной локализации и функциях вспомогательных клеток в тельцах Гассаля. Отсутствуют достоверные данные о качественных и количественных характеристиках вспомогательных клеток в зависимости от стадии развития телец и об особенностях взаимодействия их с эпителиоцитами телец. Поэтому системное и всестороннее изучение вспомогательных клеток телец является актуальным и способно расширить наши представления об их роли в организации телец Гассаля.

1.4 Функциональная морфология телец Гассаля (1.4 Functional morphology of Hassall's corpuscles) Функция тимуса стала понятна значительно позже, чем других органов человека, а функция телец Гассаля до сих пор остается недостаточно изученной. Представления об этой структуре колеблются от «остатков дегенерирующего эпителия, не имеющих функционального значения» [97, 119] до «ключа к иммунной системе»

[68]. Не принимая во внимание зачастую фантастические теории конца XIX - начала XX века, отметим, что с 70-80-ых годов XX века в научных публикациях начинает доминировать теория сходства развития телец Гассаля с дифференцировкой эпидермиса кожи [84].

Ряд исследователей устанавливает морфологические, гистохимические [200], электронно-микроскопические [102] и антигенные аналогии [150] между клетками телец и кератиноцитами.

Появляется теория, согласно которой тельца Гассаля представляют собой скопление дегенерирующих эпителиальных клеток, процесс морфогенеза которых аналогичен ороговению клеток эпидермиса [174]. «Эпидермальная» теория получила широкое распространение в научной среде и поддерживается рядом авторов до настоящего времени. С помощью гистохимических и иммуногистохимических методов в тельцах Гассаля были обнаружены высокомолекулярные кератины [150, 208], характерные для ороговевающих клеток эпидермиса. Электронно-микроскопические исследования [102] выявили пучки тонофиламентов, десмосомы между соседними клетками, гранулы кератогиалина в цитоплазме эпителиальных клеток телец Гассаля. Тщательное изучение ультраструктуры тимуса [118], позволило создать классификацию эпителиальных клеток и подробно описать ультраструктуру телец, подтвердив их ультрамикроскопическое сходство с эпидермисом.

Первые иммуногистохимические исследования телец были направлены на выявление в них различных цитокератинов [150] и также свидетельствовали в пользу данной теории. Так, L.Hale в году приводит дополнительные аргументы в пользу «эпидермальной»

теории, доказав сходство эпидермиса и телец Гассаля на примере экспрессии инволюкрина, калликреинов и ряда других молекул [109].

Позицию исследователей, разделяющих «эпидермальную»

теорию (F.D'Anna [81] и др.) хорошо иллюстрирует работа T.Itoh [97], который исследовал развитие телец in vitro и пришел к выводу, что они не играют какой-либо значимой роли в функционировании тимуса.

Вместе с тем, был обнаружен ряд особенностей телец Гассаля, которые не укладываются в рамки «эпидермальной» теории. К их числу относится обнаружение в некоторых клетках телец скопления большого количества вакуолей, развитых микроворсинок, признаков секреторной активности [126]. Кроме того, «эпидермальная» теория не принимала во внимание вклад в морфогенез телец вспомогательных клеток. Подробно была исследована активность различных ферментов в клетках телец Гассаля, полученные результаты свидетельствовали об их высокой метаболической активности [71]. Между тем, гетерогенность и разнонаправленность дегенеративных изменений в клетках (одни клетки уплощались, а другие накапливали вакуоли) также не получила удовлетворительной интерпретации в рамках данной теории [120]. Исследование цитокератинового спектра показало, что в тельцах, кроме типичных эпидермальных цитокератинов, встречаются цитокератины, характерные для однослойных, многослойных неороговевающих и переходного эпителиев [150].

Параллельно развивались гипотезы о взаимодействии телец и аутореактивных тимоцитов. Так, Сыкало А.И. [39] выдвинул предположение, что тельца Гассаля возникают вследствие гибели эпителиальных клеток, которые атакуются аутореактивными Т киллерами. J.Blau [68] полагал, что тельца Гассаля – это место разрушения тимоцитов. Взгляды о роли телец в разрушении тимоцитов поддерживает D.Doulek [86, 87], в работах которого подтверждено присутствие апоптотических тимоцитов в тельцах с помощью TUNEL-метода.

Следует особо отметить новаторские для своего времени исследования Белецкой Л.В. и Гнездицкой Э.В. [7, 61], которые внесли значительный вклад в изучение строения мозгового вещества тимуса в норме и при патологии. Ими была сформулирована теория о гетероорганных антигенах в тимусе человека, значительная часть из которых локализована в тельцах Гассаля.


Обнаружение большого количества разнообразных включений в клетках телец Гассаля позволило некоторым авторам выдвинуть теорию, что тельца накапливают различные вещества, необходимые для функционирования тимуса и развития тимоцитов, т.е. выполняют депонирующую функцию. В клетках телец обнаружены в больших количествах гранулы гликогена, нейтральные липиды и фосфолипиды, кислые мукополисахариды [75], иммуноглобулины [215] и ряд других соединений. К.Henry [177] отмечал наличие мукоидной субстанции в тельцах Гассаля и единичных клетках ретикулоэпителия. P.Gad [100] считал, что эта субстанция является сульфатированным мукоидным лимфопоэтическим гормоном. J.Izard [134] отмечал, что накопление мукоидов является достаточно редким явлением, и связано скорее с явлениями дегенерации, чем с секреторным процессом. Отметим, что некоторые современные исследователи тимуса [28, 29] до настоящего времени поддерживают гипотезу о депонирующей функции телец Гассаля.

В пользу существования секреторной функции телец свидетельствовало обнаружение в них ультраструктурных признаков секреции различных биологически активных веществ (тимических гормонов, нейромедиаторов и прочих сигнальных молекул) [120, 158].

Следует особо отметить обнаружение в тельцах Гассаля синтеза трех основных тимических гормонов: тимулина, тимопоэтина и тимозина [10].

Современный этап изучения телец Гассаля открывают работы В.Bodey [71, 170], которые задают тон для нового витка исследований и описывают тельца Гассаля не как дегенеративные структуры, а как активно функционирующие образования. При всем многообразии исследований, посвященных тельцам, большинство авторов разрабатывает два основных направления. Одно рассматривает тельца Гассаля как источник синтеза цитокинов, влияющих на различные клеточные популяции тимуса, а другое – изучает роль телец в процессах антигенпрезентации. В настоящее время установлено, что тельца Гассаля синтезируют цитокины MDC, Mig, ELC, IL-7, ТGF-, TSLP, GM-CSF и SDF-1 [20, 115, 172, 195, 203, 224]. Тельца характеризуются уникальным HLA-профилем, что свидетельствует об их особой роли в процессах антигенпрезентации. Так, роль телец Гассаля в негативной селекции доказана V.Mallet (1999), который выяснил, что в тельцах происходит презентация растворимых и мембран-связанных антигенов в составе HLA-DO и HLA-G [157].

Современной иммунологической концепцией, описывающей процессы, происходящие в мозговом веществе тимуса, является объединенная теория центральной толерантности, предложенная в 2006 году Y.Liu [149]. Она включает два основных механизма:

позитивная селекция Т-регуляторов, которые обеспечивают контроль иммунного ответа на периферии и негативная селекция аутореактивных тимоцитов. Позитивная селекция Т-регуляторов происходит в мозговом веществе тимуса, эти клетки дифференцируются из аутореактивных клонов Т-лимфоцитов и способны подавлять проявления аутоагрессии на периферии [53, 54].

Тельца Гассаля играют важную роль в дифференцировке Т регуляторов, синтезируя TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин) – цитокин, опосредованно влияющий на дифференцировку Т-регуляторов [115]. После созревания Т регуляторы выходят на периферию, где играют важную роль в механизмах периферической толерантности, оказывая супрессорное действие на аутореактивные клоны Т-лимфоцитов. N.Watanabe считает, что главной функцией телец является синтез TSLP и, соответственно, влияние на дифференцировку Т-регуляторов [115].

Вторым важным механизмом поддержания центральной толерантности является негативная селекция аутореактивных тимоцитов. Этот процесс происходит в мозговом веществе тимуса, где тимоциты взаимодействуют со зрелыми дендритными клетками.

Дендритные клетки презентируют тимоцитам аутоантигены в составе молекул комплекса гистосовместимости. Таким образом, аутоантигены необходимы для элиминации аутореактивных тимоцитов в процессе негативной селекции. Так как зрелые Т лимфоциты циркулируют по всему организму, то для негативной селекции необходимо создание в мозговом веществе тимуса полного аутоантигенного спектра, в том числе и тканеспецифических антигенов.

Эктопические (тканеспецифические) аутоантигены – это антигены, которые синтезируются только в определенных органах и тканях организма. Установлено [99], что в мозговом веществе тимуса существует небольшая популяция эпителиальных клеток, синтезирующих и накапливающих множество эктопических белков.

Их отличительной чертой является активность особого белка – фактора транскрипции Aire. Этот белок обеспечивает транскрипцию эктопических тканеспецифических белков, например, проинсулина, филлагрина, тиреоглобулина и многих других [182, 183]. Таким образом, в тимусе создается иммунологический «образ» всего организма. А Aire-положительные клетки являются своеобразными «транскрипционными машинами» по производству тканеспецифических антигенов, которые обязательны для создания и поддержания иммунологического гомеостаза [180, 181].

Взаимосвязь Aire-клеток и телец Гассаля не ясна. Однако известно, что они располагаются вокруг телец достоверно чаще, чем в других отделах мозгового вещества, но не входят в их состав [177]. В то же время, именно в тельцах Гассаля наблюдается максимальная концентрация тканеспецифических антигенов, причем неясно, как они туда попадают [78]. Более того, функциональное значение накопления аутоантигенов в тельцах также не выяснено.

Тем не менее, установлено, что именно нарушения синтеза тканеспецифических антигенов и дефекты их презентации в тельцах Гассаля могут приводить к развитию ряда аутоиммунных заболеваний. Такой механизм доказан для патогенеза сахарного диабета первого типа [77, 78 ревматоидного артрита [62], синдрома Гудпасчера [219]. В основе возникновения этих заболеваний ключевая роль принадлежит нарушению синтеза тканеспецифических антигенов в тельцах Гассаля: проинсулина, филлагрина и разновидности коллагена соответственно.

1.5 Выводы (1.5 Summary) 1. Как следует из приведенного обзора, в представлениях о строении и функциях телец Гассаля до настоящего времени остается немало «белых пятен», из-за которых затруднительно получить целостное представление о процессах дифференцировки Т лимфоцитов в мозговом веществе тимуса человека. Поэтому в настоящем исследовании мы сфокусировались на решении наиболее актуальных вопросов системной организации телец.

2. Представляют значительный интерес вопросы, относящиеся к эпителиальному компоненту телец. Так, окончательно не установлены источники происхождения эпителиоцитов телец, отмечаются разногласия в описании их морфологии. Недостаточно изученными являются закономерности и структурные особенности изменений телец в процессе их развития, отсутствует приемлемая классификация телец Гассаля.

3. Актуальным является изучение взаимосвязи эпителиальных клеток телец со вспомогательными клетками. Как указывалось ранее, большинство исследователей ограничивается лишь констатацией наличия тех или иных клеток в тельце, подробного изучения их стуктурно-функциональных связей с другими клетками телец не проводилось.

4. Чрезвычайно актуальным, но недостаточно изученным является проблема структурных основ накопления и мобилизации тканеспецифических антигенов эпителиальными клетками телец.

5. Таким образом, на современном этапе исследования телец Гассаля возникла необходимость в изучении их системной организации для более глубокого понимания механизмов формирования центральной толерантности. Эта задача требует использования широкого спектра методик для исследования телец (гистологические, гистохимические, иммуногистохимические, электронно-микроскопические, статистические, системный анализ).

6. Решение проблемы закономерностей строения телец Гассаля представляет значительный теоретический и практический интерес, так как выявление механизмов функционирования телец открывает путь к управлению этими процессами. Понимание закономерностей формирования иммунной толерантности в тимусе способно обеспечить прогресс в трех взаимосвязанных проблемах медицины:

иммунотерапии опухолей, лечения аутоиммунных заболеваний и трансплантации органов и тканей.

ГЛАВА МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ CHAPTER MATERIALS AND METHODS В соответствии с поставленными целью и задачами исследования в работе использовались гистологические, гистохимические, иммуногистохимические, электронно микроскопический, морфометрический, статистический методы и метод системного анализа (таблица 2.1).

В исследовании использовали фрагменты тимусов детей первого года жизни, удаленных в Республиканском детском кардиохирургическом центре РНПЦ "Кардиология" при вмешательствах по поводу минимальных сердечно-сосудистых пороков, в анамнезе которых отсутствовали инфекционные заболевания, иммунодефицитные состояния, прием стероидных гормонов, иммунодепрессантов. Забирались части тимусов, удаленные только по хирургическим показаниям (кровотечение, размозжение и др.) с учетом существующих этических и юридических норм. После изучения обзорных микропрепаратов тимуса для дальнейшего исследования отбирались случаи только с нормальным строением тимуса [17]. Исключались случаи с любыми проявлениями акцидентальной инволюции и дисплазий тимуса [17, 24, 213]. Таким образом, для исследования отобраны фрагменты тимусов 30 детей.

Для гистологического, гистохимического и иммуногистохимического исследования образцы тимуса размером не более 5х5х5 мм фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Материал заливали в парафин после проводки через хлороформ обычным способом и на микротоме МПС- (ТОЧМЕДПРИБОР, СССР) изготавливали серии срезов толщиной мкм.


Каждый случай исследовался с комплексным применением гистологических и 3 гистохимических методик [35] (таблица 2.1). Для обзорного гистологического исследования использовали окраску препаратов гематоксилином-эозином (1), в том числе и с модификациями для лучшего выявления отложений кальция (2) и обнаружения эозинофилов (3). Для определения различных гранулоцитов использовали окраску по Романовскому-Гимзе (4).

Для изучения распределения различных элементов внутри тельца использовали комбинированные методы окраски: резорцин фуксин по Вейгарду для выявления эластических волокон (5), фосфорнокислый молибденовый (6) и фосфорнокислый вольфрамовый (7) гематоксилин для обнаружения пучков тонофибрилл, метод Пачини (8) для определения высокомолекулярного кератина, базальных мембран, гранул базофилов и др.

Кроме того, нами была предложена и внедрена новая методика комбинированной окраски гематоксилином-альциановым синим фуксином (9). Предложенный способ позволяет дифференцировать отдельные структуры и компоненты телец Гассаля (альциан положительные структуры, пластины кератинового ядра, эозинофилы), за счет сочетанного воздействия поэтапного окрашивания и контраста. Получено удостоверение на рационализаторское предложение от 10.04.2012 № 23 «Способ комбинированной (гематоксилин-альциановый синий-фуксин) окраски тимуса».

Для идентификации определенных групп соединений и изучения их распределения в тельцах Гассаля использовали гистохимические методики [35]: ШИК-реакцию для выявления углеводов (1), окраску альциановым синим для обнаружения кислых мукополисахаридов (2), окраску по Эйнарсону для выявления нуклеиновых кислот (3).

Для определения типа клеток и стадии их дифференцировки использовали метод иммуногистохимического исследования. Список использованных антител приведен в таблице 2.2. Было отобрано случаев, каждый из которых изучался с использованием всей указанной панели антител (28 антител). Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартному протоколу, разведение и способ демаскировки конкретного антигена проводились в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения депарафинизации срезы, монтированные на стеклах, покрытых L полилизином, выдерживались 30 минут в термостате при температуре 67°. Затем - по 3 минуты в двух сменах ксилола и четырех сменах 96% этилового спирта. Блокирование эндогенной пероксидазы проводилось экспозицией в 3% перекиси водорода в течение 5 минут.

Демаскировка антигенов проводилась различными способами.

Применялось четыре способа демаскировки (цифрой обозначен соответствующий способ, таблица 2.1):

1) 20 минут при температуре 95°С-99°С в цитратном буфере (рН=6.0);

2) 20 минут при температуре 95°С-99°С в ЭДТА (рН-9,0);

3) без демаскировки;

4) демаскировка в протеинкиназе К (4 минуты).

Затем проводилась инкубация срезов с первичными антителами в течении 30 минут, после чего стекло промывалось в tween-буфере два раза по 5 минут. Инкубация со вторичными антителами длилась в течении 30 минут, после чего вновь следовало промывание в tween буфере два раза по 5 минут. Далее проводилась проявка результатов путем инкубации с хромогеном (диаминобензидин) в течении минут. Докрашивание ядер проводили гематоксилином, затем препараты промывали в проточной воде, после чего срезы проводились по 3 минуты через 2 смены этилового спирта 96%, смены изопропилового спирта и 2 смены ксилола. Далее препараты заключались в бальзам.

Для изучения эпителиальных клеток мы исследовали цитокератиновый спектр, который является важной характеристикой клеточной популяции и степени дифференцировки клеток [198]. В настоящем исследовании мы использовали панель цитокератинов, включающую 8 антител к следующим молекулам: K (экспрессируется в паре с К13, маркер терминальной дифференцировки многослойных плоских неороговевающих эпителиев), К7 (экспрессируется в паре с К19, маркер переходного эпителия, эпителия желудочно-кишечного тракта и протоков желез), К8 (экспрессируется в паре с К18, маркер однослойных эпителиев), К10 (экспрессируется в паре с К1, маркер терминальной дифференцировки многослойных плоских ороговевающих эпителиев), К14 (экспрессируется в паре с К5, маркер базальных клеток многослойных эпителиев), К-multi (смесь антител к различным цитокератинам), К HMW (смесь антител к высокомолекулярным цитокератинам).

Для общей характеристики вспомогательных клеток телец использовали антитела к виментину (белок промежуточных филаментов клеток мезенхимального происхождения). Для исследования дендритных клеток использовали маркеры S100 (общий маркер всех дендритных клеток тимуса), CD1a (маркер созревающих дендритных клеток). Для определения миоидных клеток использовали антитела к десмину, плазмоцитов – к иммуноглобулину G (IgG), В лимфоцитов – антитела к CD20, гладкомышечных клеток – к гладкомышечному миозину (SMM), макрофагов – к CD68. Для исследования тимоцитов и их отдельных субпопуляций использовали антитела к СD3 (общий маркер тимоцитов), СD25 (Т-регуляторы), СD30 (преапоптотические тимоциты). Для изучения взаимосвязи сосудов тимуса и телец Гассаля использовали антитела к эндотелиальным маркерам CD31, CD34 и к компоненту базальной мембраны коллагену 4 типа. Изучение экспрессии аутоантигенов проводили на примере CEA (карциоэмбрионического антигена). В качестве маркеров нейроэндокринных клеток использовали антитела к синаптофизину, хромогранину A, нейронспецифической енолазе (NSE) и глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP).

Сравнение гистологических методов окраски (гематоксилин эозин с модификациями и по Романовскому-Гимза) и результатов иммуногистохимической реакции на миелопероксидазу, выявило, что клетками, экспрессирующими миелопероксидазу (MPO) в тимусе, являются преимущественно эозинофилы. Апоптотические Т лимфоциты идентифицировали с использованием как гистологических и гистохимических методов окраски (хорошая визуализация достигается при использовании окраски по Эйнарсону для выявления нуклеиновых кислот), так и электронно микроскопического метода.

Для электронно-микроскопического исследования было отобрано 6 случаев. Фиксировали фрагменты органов по стандартной методике [9] в растворе 2,5% глютарового альдегида на 2 часа при температуре 4С. Затем материал измельчали и повторно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 2 часов при температуре 4С. После завершения альдегид-осмиевой фиксации материал обезвоживали в спиртах восходящей крепости и заливали в аралдит.

Материал, залитый в капсулы с аралдитом, для полимеризации помещали в термостат при температуре 37C, затем при температуре 56С на 2 суток. Срезы готовили на ультратоме марки ЛКБ (Швеция), контрастировали цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM 100CX (Япония). Количественное электронно микроскопическое исследование проводилось по стандартной методике [9], измерялся ряд показателей кератинового ядра телец.

Для изучения количественных параметров телец Гассаля был применен ряд морфометрических методов исследования.

Морфометрия проводилась либо в поле зрения микроскопа Zeiss Axiolab («Carl Zeiss AG», Германия) с окулярной сеткой, либо на цифровом изображении препаратов, полученных с помощью камеры UMD-300 («Gsmserver», Тайвань). Измерения линейных величин и расчеты площадей проводились программой Image Tool (UTHSCSA, USA). Калибровка морфометрической техники осуществлялась при помощи объект-микрометра ОМО (ЛОМО, СССР).

При проведении всех морфометрических исследований рассматривали 10 случайных полей зрения в каждом срезе тимуса толщиной 7 мкм при увеличении х40, в которых изучали все тельца Гассаля. Общее количество срезов для каждого случая приведено в таблице 2.1 (столбец 5). Всего было изучено 2720 телец. В тельцах разных стадий развития подсчитывали число клеточных ядер, что считали соответствующим числу клеток в срезе тельца. В 5 случайных участках тельца измеряли толщину стенки и диаметр сечения тельца.

Рассчитывали среднюю толщину стенки, средний диаметр и площадь сечения тельца.

Для определения плотности расположения иммуногистохимически положительных клеток (количество клеток на 1 кв. мм среза) в тельце Гассаля подсчитывали количество таких клеток, обнаруженных на срезе тельца и прямо или опосредованно контактирующих с ним. Рассчитывали площадь, занятую данными клетками и площадь полости тельца. Плотность иммуногистохимически положительных клеток определяли по формуле:

p=n/(Sn–Sc) (2.1) где p – плотность расположения клеток, n – количество клеток, Sn – площадь, занятая клетками, Sc – площадь полости тельца.

Для определения плотности расположения клеток (количество клеток на 1 кв. мм среза) в других отделах тимуса (кортико медуллярная граница, мозговое вещество) подсчитывали число иммуногистохимически положительных клеток в определенном участке, измеряли линейные параметры этого участка и рассчитывали его площадь.

Плотность расположения клеток определяли по формуле:

p=n/S (2.2) где p – плотность расположения клеток, n – количество клеток, Sn – площадь, занятая клетками.

Удельную долю СЕА-положительных структур рассчитывали с помощью окулярной морфометрической сетки при увеличении х40 по стандартной методике [1]. Подсчитывали количество узлов сетки, проецирующихся на СЕА-положительные клетки или иные структуры и на все тельце. Удельная доля рассчитывалась по формуле:

Р=n/N (2.3) где Р – удельная доля СЕА-положительных структур, n – количество узлов сетки, проецирующихся на СЕА-положительные клетки или иные структуры, N – количество узлов сетки, проецирующихся на все тельце.

Для описания телец использовали их простейшую классификацию, которая включает три стадии развития:

прогрессивные (растущие, незрелые), зрелые, регрессивные (стареющие) [23]. Формализация полученных результатов проводилась по алгоритму системного анализа, предложенному Перегудовым Ф.И. [31], также применялся ряд подходов к информационному анализу морфологических систем Леонтюка А.С.

[22].

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы STATISTICA (Version 6, Statsoft Inc.) для операционной среды Windows. Данные представлены в виде M±m, где M – среднее, m – стандартная ошибка среднего. Проверка нормальности распределения полученных данных проводилась при помощи критерия Шапиро-Уилка. При сравнении двух зависимых групп по количественному признаку, имеющему распределение, отличное от нормального, пользовались методом Колмогорова Смирнова. Различие расценивалось как статистически значимое при уровне значимости р 0,05 [15].

Methods of research: histological, histochemical, immunohistochemical, morphometrical, electron microscopy, statistical and systemic analysis.

ГЛАВА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ТЕЛЕЦ ГАССАЛЯ CHAPTER EPITHELIAL CELLS OF HASSALL'S CORPUSCLES 3.1 Введение (3.1 Introduction) Известно, что тельца Гассаля образованы преимущественно эпителиальными клетками [111]. Однако эпителиоциты мозгового вещества тимуса очень разнообразны, и в литературе отсутствуют точные данные об участии их отдельных разновидностей в морфогенезе телец Гассаля (раздел 1.2) [10, 158]. Поэтому решение данного вопроса является первоочередным в данном исследовании.

Изучение эпителиальных клеток телец Гассаля различными методами показало, что они представляют собой гетерогенную популяцию и различаются по морфологии, цитокератиновому спектру, накоплению определенных веществ и ряду других признаков.

Выявление дифферонов эпителиальных клеток в тимусе представляет собой достаточно сложную задачу, так как в процессе дифференцировки происходит значительное изменение морфологии клеток и цитокератинового спектра.

Тщательный анализ результатов, полученных комплексом разных методов исследования, привел нас к заключению, что наблюдаемая гетерогенность эпителиоцитов является проявлением присутствия в мозговом веществе тимуса как нескольких отдельных субпопуляций эпителиальных клеток, так и различных этапов их дифференцировки.

A comprehensive study of Hassall's corpuscles allowed us to show that the detected heterogeneity of the corpuscle epithelial cells is a manifestation of two sub-populations of epithelial cells existence and stages of their differentiation.

3.2 Гетерогенность эпителиальных клеток мозгового вещества и телец Гассаля (3.2 Heterogeneity of epithelial cells in Hassall's corpuscles) Для выявления субпопуляций эпителиальных клеток и этапов их дифференцировки, мы предприняли комплексное исследование ряда характеристик эпителиальных клеток мозгового вещества и телец Гассаля тимуса. Эпителиальные клетки телец как гетерогенная популяция представляют собой комплекс отдельных совокупностей, поэтому для анализа полученных данных мы применили метод группировки, т.е. деления изучаемых клеток на качественно однородные группы по соответствующим признакам. Выбор признаков, по которым проводилась группировка (группировочные признаки), был обусловлен постоянством их проявления в разных типах телец Гассаля.

В качестве группировочных признаков мы выделили следующие характеристики: экспрессия цитокератинов К4, К7, K8, К10, К14, экспрессия СЕА, накопление кислых мукополисахаридов (кМПС), накопление высокомолекулярных цитокератинов при окраске по Пачини (вмК), продольное (пКФ) и концентрическое (кКФ) расположение кератиновых тонофиламентов, уплощенное ядро (плЯ), наличие инвагинаций ядра (ивЯ) и аутофагосом (Аф).

Таблица 3.1 – Структурная группировка различных характеристик эпителиальных клеток телец Гассаля* Тип Стадии дифференцировки клеток клеток 1 стадия 2 стадия 3 стадия 4 стадия I тип К8, кКФ К4, К7, К8, К10, К4, К7, К8, СЕА, К4, СЕА, СЕА, кМПС, кКФ, кМПС, кКФ, ивЯ, кМПС ивЯ, Аф Аф II тип К14, пКФ К10, вмК, пКФ, плЯ К10, вмК, пКФ, К10, вмК, плЯ пКФ, *Обозначения в тексте Проведя структурную группировку (таблица 3.1) на основе полученных нами данных, мы обнаружили, что указанные признаки позволяют разделить эпителиоциты телец на две крупные группы (рисунок 3.1), в каждой их которых можно выделить 4 подгруппы.

Каждая группа соответствует определенной субпопуляции эпителиоцитов, а подгруппа – стадии дифференцировки клеток. Таким образом, в мозговом веществе тимуса присутствует две субпопуляции эпителиальных клеток, которые принимают участие в формировании телец Гассаля. В составе телец данные клетки проходят последовательных этапа дифференцировки.

Главными иммуногистохимическими маркерами данных субпопуляций являются цитокератины 8 и 14. Изучение результатов иммуногистохимической реакции к цитокератину 8 показало, что субпопуляция K14–K8+ клеток мозгового вещества характеризуется наличием округлых ядер, широкого ободка цитоплазмы и нескольких коротких отростков. Клетки данной субпопуляции, как правило, не контактируют друг с другом. Мы обнаружили также, что субпопуляция K14–K8+ эпителиальных клеток мозгового вещества неоднородна как по топографии клеток, так и по паттерну иммуногистохимической реакции. K14–K8+ клетки можно разделить на менее и более дифференцированные. Первые расположены на периферии мозгового вещества и характеризуются умеренной интенсивностью иммуногистохимической реакции к K8. Более дифференцированные эпителиоциты расположены в центре мозгового вещества и часто входят в состав наружных клеток стенки телец Гассаля. Они характеризуются интенсивной иммуногистохимической реакцией с выявлением цитокератинов K8 в виде пояска вокруг эухроматинового ядром и крупными размерами (рисунок 3.1-Б).

Изучение результатов иммуногистохимической реакции к цитокератину 14 показало, что K14+K8– эпителиоциты имеют иную морфологию и тип распределения в мозговом веществе. Эти клетки имеют округлые или умеренно вытянутые ядра, узкий ободок цитоплазмы и несколько длинных отростков, контактирующих с отростками других K14+K8–-положительных клеток (рисунок 3.1-В).

K14+K8– субпопуляция клеток морфологически однородна. K14+ клетки входят и в состав периферического слоя телец Гассаля, при этом они вытягиваются по его поверхности.

Как следует из результатов группировки (таблица 3.1), внутри каждой субпопуляции можно выделить 4 стадии развития (дифференцировки) эпителиальных клеток в составе телец.

На первой стадии развития эпителиальные клетки, расположенные на периферии телец Гассаля, схожи по строению и цитокератиновому спектру с эпителиоцитами мозгового вещества. На второй стадии клетки смещаются глубже в стенку тельца и характеризуются значительным изменением морфологии (в т.ч. и увеличением размеров) и цитокератинового спектра. В клетках, расположенных во внутреннем слое стенки тельца, развиваются дегенеративные процессы, и они погибают (третья стадия). Остатки этих клеток в полости тельца представляют собой четвертую стадию дифференцировки.

Мы установили, что тельца Гассаля разных стадий развития характеризуются различным строением. Однако строение и дифференцировка эпителиальных клеток практически одинакова во всех разновидностях телец. Следовательно, в развитии телец Гассаля принимают участие преимущественно эпителиальные клетки двух типов и их источниками являются субпопуляции эпителиоцитов мозгового вещества. Это сходство подтверждается особенностями цитокератинового спектра и другими морфологическими особенностями, такими как форма клеток, расположение кератиновых тонофиламентов, особенности строения ядра клеток.

Клетки телец Гассаля, происходящие из K14–K8+ субпопуляции мы условно назвали клетками I типа, а из K14+K8– субпопуляции эпителиоцитов – клетками II типа. Таким образом, гетерогенность эпителиальных клеток телец Гассаля (рисунок 3.1) объясняется неоднородностью эпителиальных клеток мозгового вещества (рисунок 3.2) тимуса, принимающих участие в морфогенезе тельца Гассаля.

Наши результаты в целом подтверждаются данными ряда авторов [92, 124, 218] о существовании двух основных субпопуляций эпителиальных клеток в мозговом веществе тимуса, но мы впервые показали, что обе популяции эпителиоцитов участвуют в формировании телец Гассаля.

We have called epithelial cells, originating from K14-K8 + medullary epithelial cells subpopulation type I epithelial cells, and those of K14 + K8- of medullary epithelial cells subpopulation - type II epithelial cells. Thus, the heterogeneity of Hassall's corpuscles epithelial cells arises due to the heterogeneity of thymus medullary epithelial cells involved in the morphogenesis of Hassall's corpuscles. Our results concerning two main subsets of epithelial cells in thymus medulla are confirmed by a number of authors [92, 124, 218, but we were the first to prove that both the populations are involved in the formation of Hassall's corpuscle epithelial cell. Figure 3.1, page 138.

3.3 Клетки I типа 3.3 Epithelial cells of the first type Сопоставив данные гистологических, гистохимических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических методов исследования, мы выявили специфические морфологические признаки клеток I типа и проследили их дифференцировку в составе телец Гассаля. К этим признакам относятся: округлая форма клеток (рисунок 3.3-И, К), эухроматиновое ядро с глубокими спиралевидными инвагинациями кариолеммы (рисунок 3.4-Б), аутофагосомы в цитоплазме клеток (рисунок 3.5-А, Б, Д), концентрически организованные в виде пояска вокруг ядра тонофиламенты, сформированные из цитокератина (рисунок 3.3-К,3.4 А), накопление кислых мукополисахаридов (рисунок 3.3-В, Г).

Следует отметить, что в крупных тельцах клетки I типа могут значительно уплощаться, однако они сохраняют основные особенности строения.

Строение данных клеток, их иммуногистохимические и ультраструктурные характеристики, изменяются по мере сдвига клеток к центру тельца, что отражает последовательные этапы их дифференцировки. Таким образом, можно выделить четыре последовательных стадии дифференцировки клеток I типа.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.