авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«Герасименя В.П., Захаров С.В., Брусникин В.М., Клыков М.А., Семашева Л.П. ИННОВАЦИОННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБОВ ...»

-- [ Страница 4 ] --

На базе проведенных ООО «Инбиофарм» (г. Москва) исследо ваний под руководством профессора Герасимени В.П. в сотруд ничестве с рядом НИИ РАН и ведомств разработан целый ряд высокоэффективных экологически безопасных технологий нового поколения с применением наноструктурных частиц металлов, обеспечивающих получение различных веществ и материалов с принципиально новыми, ранее не известными физико-химическими и биологическими свойствами [49,50].

К ним, прежде всего, относится разработанный по ТУ 9185-025 87552538-12 «Концентрат коллоидного серебра в водной диспер сии» («Концентрат КС») [102,111,115,118]. «Концентрат КС» пред ставляет собой подготовленный водный раствор концент рированного коллоидного серебра. «Концентрат КС» является источником серебра с размерами частиц коллоидного серебра менее 100,0 нм [120,121].

По результатам санитарно-эпидемиологической экспертизы от 22.11. 2012 г,, проведенной ФГБУ «НИИ Питания» РАМН, «Концентрат КС» соответствует действующим законодательным актам и нормативным требованиям к качеству и безопасности, установленным для данного вида пищевой продукции, в том числе требованиям ЕврАзЭС «Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно эпидемиологическому надзору (контролю)» и нормативно-техни ческой документации изготовителя [122].

На основании Экспертного заключения ФГБУ «НИИ Питания»

РАМН Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека проведена Государ ственная регистрация «Концентрата КС» с разрешением его приме нения в качестве сырья для производства пищевых добавок.

Для безопасного применения разработанного «Концентрата КС»

в биотехнологии культивирования мицелия Pleurotus ostreatus в глубинной культуре в работе поставлена цель исследования, заключающаяся в изучении нанотехнологической составляющей «Концентрата КС» (ТУ 9185-025-87552538-12) и разработке предложений по его применению в биотехнологии культивирования мицелия в глубинной культуре с оценкой активности выделенных из мицелия биологически активных веществ в клеточной системе in vitro.

Для достижения поставленной цели были решены следующие частные задачи:

- изучена характеристика состава «Концентрата КС» и его основных показателей;

- изучена и описана нанотехнологическая составляющая «Концентрата КС»;

- изучено цитотоксическое действие «Концентрата КС» на первичные фибробласты человека на уровне in vitro и установлена безопасная доза для дальнейшего его применения в качестве компонента в разработанной биотехнологии культивирования мицелия в глубинной культуре;

- разработаны предложения по применению «Концентрата КС» в биотехнологии культивирования мицелия в глубинной культуре;

- разработан технологический процесс культивирования мицелия в глубинной культуре и его переработки в экстракт биологически активных веществ;

- изучена на уровне in vitro биологическая активность экстракта, полученного из мицелия, культивируемого в питательной среде, обогащенной «Концентратом КС», на цитокинетические параметры клеток HeLa.

4.2 Результаты изучения нанотехнологической составляющей «Концентрата КС»

Изучение наноструктурных частиц серебра проводили на вариантах приготовленного «Концентрата коллоидного серебра в водной дисперсии» с концентрацией до 4,0·10-3 г-ион/л.

При изучении «Концентрата КС» определялись наличие частиц коллоидного серебра в водных растворах, их концентрация, раз меры, форма, состав и распределение в исследуемых вариантах растворов.

Наличие наноструктурных частиц коллоидного серебра в «Концентрате КС» определялось методом спектрального анализа приготовленных из раствора препаратов в области 400-420 нм с использованием двухлучевого спектрофотометра УФ- и видимой области «HELIOS ALPHA» (Великобритания) с микропроцессорной системой управления.

Размеры, форму, состав наноструктурных частиц коллоидного серебра и их распределение в исследуемых вариантах «Концен трата КС» изучали с использованием аналитического транс миссионного электронного микроскопа LEO912 AB OMEGA с разрешением 0,3 нм, при ускоряющем напряжении 100 кВ и электронного микроскопа Hitachi H700 (Япония) с разрешением 0, нм при ускоряющем напряжении 100 кВ. Для изучения выше указанных характеристик исследуемых вариантов растворов приготавливали препараты по стандартному для этой задачи методу.

Полученные препараты изучали и фотографировали в электронном микроскопе Hitachi H700 (Япония) с разрешением 0, нм при ускоряющем напряжении 100 кВ. Для дальнейшей обработки негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением точек на дюйм (472 точки на сантиметр) и глубиной представления цвета 16 бит. Сканирование осуществляли с помощью слайд сканера Epson Perfection 4990 PHOTO.

Анализ полученных результатов изучения содержания в «Концентрате КС» наноструктурных частиц коллоидного серебра показал, что, в соответствии с разработанной нами технологией, содержание наноструктурных частиц коллоидного серебра соот ветствует вышеуказанной их концентрации в полученных растворах «Концентрата КС».

Диапазон распределения наноструктурных частиц серебра лежит в пределах от 11 нм до 41 нм, причем 80-85% составляют наночастицы с размером от 11 нм до 20 нм.

Форма наноструктурных частиц коллоидного серебра – шаровидная.

По составу наноструктурные частицы коллоидного серебра представляют собой кристаллическую структуру атомов серебра, объединенных в шаровидную мицеллу кристаллического водо нерастворимого поверхностно-активного вещества. В разработан ных вариантах растворов «Концентрата КС» входящие в их состав мицеллы наноструктурных частиц коллоидного серебра равномерно распределяются по объему без слипания между собой и объединения в более крупные конгломераты частиц.

Таким образом, в результате проведенных исследований по разработке и созданию «Концентрата КС» нами получены документальные подтверждения, описывающие процесс контроля на наноуровне (микрофотографии и др.) нанотехнологических переделов (формируемых в водном растворе наноструктурных частиц коллоидного серебра) в технологическом процессе его производства.

Изучение цитотоксического действия «Концентрата КС» на первичные фибробласты человека на уровне in vitro Для безопасного применения «Концентрата КС» в разработанной в биотехнологии культивирования мицелия Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm в глубинной культуре изучено цитотоксическое действие «Концентрата КС» на первичные фибробласты человека.

В результате установлено, что суспензия «Концентрата КС» не оказывает токсического воздействия на первичные фибробласты человека в концентрации коллоидного серебра в водном растворе 0,25%, 0,125%, 0,025% и ниже.

По результатам изучения действия «Концентрата КС» по ТУ 9185-025-87552538-12 на цитокинетические параметры культиви руемых клеток в клеточной системе in vitro, установлено, что рекомендуемая в составе культуральной питательной среды 0,005% концентрация «Концентрата КС» не обладают цитотоксическим действием на культивируемые нормальные фибробласты человека.

Полученные безопасные концентрации «Концентрата КС» в водной дисперсии были положены в основу дальнейшей разработки биотехнологии культивирования мицелия Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm в глубинной культуре.

4.3 Особенности технологического процесса культивирования мицелия в глубинной культуре, обогащенной «Концентратом КС»

Технологический процесс культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и его переработки в экстракт включает в себя ряд последовательно выполняемых технологических операций, а именно:

- подготовку и приготовление применяемых исходных веществ для питательных сред, включая приготовление «Концентрата КС»;

- технологические циклы двухстадийного культивирования ми целия;

- экстракцию низкомолекулярных биологически активных ве ществ из мицелиальной массы;

- фильтрацию нативного раствора низкомолекулярных биоло гически активных веществ от мицелиальной массы;

- упаривание нативного раствора низкомолекулярных биоло гически активных веществ;

- определение антимикробной активности полученного экстракта;

- фасовку и упаковку готовой продукции.

Практически все операции указанного технологического процесса аналогичны описанному в [43] процессу двухстадийного культивирования мицелия и его переработки в экстракт за исклю чением особенностей, связанных с введением в питательную среду «Концентрата КС».

Соответственно применение «Концентрата КС» осуществляется на следующих этапах технологического процесса:

- подготовка ферментативной среды (II пассаж);

- культивирование ферментативного мицелия на 2-ой стадии (II пассаж).

Подготовка ферментативной среды (II пассаж) предназначена для глубинного культивирования мицелия с целью получения его биомассы.

Для приготовления среды II пассажа используется 15-16° баллинговое сусло.

Состав ферментативной среды, из расчета ее подготовки на колбу Эрленмейера объемом 750мл:

- пивное сусло - 40% (120 мл);

- вода водопроводная - 60 % (178,5 мл);

- Концентрат КС - 0.005% (1,5 мл).

При приготовлении питательной среды все ее составляющие в процентном соотношении масс загружаются в отдельную емкость и тщательно перемешиваются до получения однородного раствора.

Замеряются баллинги и pH среды.

Приготовленная питательная среда разливается в колбы Эрленмейера объемом 750мл, из расчета по 300 мл в каждую колбу, которые тщательно закрываются специально приготовленными ватными пробками, и стерилизуется при заданных режимах работы автоклава.

Примеры практической подготовки посевной среды II пассажа подробно изложены в [43].

Чистая и качественно приготовленная среда имеет цвет от светло-коричневого до темно-коричневого. Насыщенность цвета питательной среды не зависит от введенного в нее «Концентрата КС», а зависит только от исходного цвета сусла и правильно подобранного режима автоклавирования. Среда должна быть прозрачной. Допускается наличие небольшого осадка в среде.

Ферментационная среда II пассажа используется в этом варианте для получения увеличенной биомассы мицелия. Засев среды осуществляется 7-суточным посевным мицелием (I пассаж). Объем посевного материала составляет 5% к объему ферментационной среды.

Пересев культуры мицелия из колб с посевной средой I пассажа производится в колбы с ферментативной средой II пассажа сте рильно.

После засева посевной средой I пассажа колбы устанавливаются на качалку, на которой осуществляется 7-суточное культивирование посевного мицелия.

Условия культивирования аналогичны условиям культивиро вания посевного мицелия I пассажа.

Характеристика мицелия:

- pH культуральной жидкости – 5,5-5,9;

- внешний вид: средние пеллеты округлой формы, фильтрат культуральной жидкости (к.ж.) прозрачный.

4.4 Результаты экспериментального культивирования мицелия в среде, обогащенной «Концентратом КС», и получения из него экстракта Экспериментальное культивирование мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в среде, обогащенной «Концентратом КС», и его переработка в экстракт проводились в сравнении с мицелием, параллельно культивированным в среде без обогащения «Концентратом КС» и его переработкой в экстракт.

Целью проведения лабораторных экспериментальных исследований являлось изучение особенностей двухстадийного культивирования мицелия в питательной среде, обогащенной «Концентратом КС», и получения из выращенного мицелия экстракта в виде геля.

Для достижения поставленной цели в процессе экспериментальных исследований были решены частные задачи:

- подготовка питательных сред I и II пассажей;

- двухстадийное культивирование мицелия;

- экстракция мицелия;

- упаривание спиртового инфильтрата до получения экстракта в виде геля с содержанием в нем связанной воды не более 30% по массе;

- сравнительная оценка полученных образцов мицелия и экстракта по выбранным физико-биологическим параметрам.

4.4.1 Материалы и методы Исследуемые вещества:

- мицелий, полученный по разработанному технологическому процессу его двухстадийного культивирования в глубинной культуре;

- экстракт, полученный по разработанному технологическому процессу переработки мицелия;

- мицелий, полученный по разработанному технологическому процессу его двухстадийного культивирования в глубинной культуре, обогащенной «Концентратом КС»;

- экстракт, полученный по разработанному технологическому процессу переработки мицелия, культивируемого в среде, обогащенной «Концентратом КС».

Контролируемые параметры мицелия и полученного из него экстракта:

- параметры технологических процессов культивирования мицелия и получения из него экстракта в виде геля;

- особенности культурально-морфологической характеристики мицелия;

- биомасса выхода мицелия и полученного из него экстракта;

изучение на уровне in vitro биологической активности экстракта на цитокинетические параметры клеток HeLa.

Исследованию подвергалось 4 варианта культивирования мице лия и 2 варианта полученных из него экстрактов.

Исследуемые варианты мицелия:

- вариант № 1 – контроль. Мицелий, полученный по технологии без введения в питательную среду «Концентрата КС»;

- вариант № 2 – опытный. Мицелий, полученный по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,0033 мл/мл питательной среды II пассажа;

- вариант № 3 – опытный. Мицелий, полученный по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,005 мл/мл питательной среды II пассажа;

- вариант № 4 – опытный. Мицелий, полученный по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,0066 мл/мл питательной среды II пассажа.

Исследуемые варианты экстракта:

- вариант № 1 – контроль. Экстракт, выделенный из мицелия, полученного по технологии без введения в питательную среду «Концентрата КС»;

- вариант № 2 – опытный. Экстракт, выделенный из мицелия, полученного по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,005 мл/мл питательной среды II пассажа.

Вариант № 2 экстракта из ряда полученных опытных образцов (варианты 1,2,3) в сравнении с контрольным образцом № выбран нами на основании проведенного анализа полученной биомассы мицелия и экстракта по каждому варианту. В опытном варианте № 3, полученном по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,005 мл/мл питательной среды II пассажа, эти параметры оказались наибольшими по сравнению со всеми другими исследуемыми вариантами.

Поэтому именно этот вариант был выбран нами для дальнейших исследований в качестве перспективного варианта.

Все вышеперечисленные варианты культивирования мицелия и его переработки в экстракт проводились одновременно при заданных физико-климатических параметрах и технических характе ристиках технологического оборудования и технических устройств, по максимому обеспечивающих создание асептических условий в боксах подготовки и камерах для культивирования мицелия.

4.4.2 Результаты исследования При проведении экспериментальных исследований контроль параметров технологических процессов культивирования мицелия и получения из него экстракта в виде геля осуществлялся в соответствии с разработанным биотехнологическим процессом [140].

Изучение особенности культурально-морфологической характе ристики мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и медико-биологической активности экстрактов проводилось учеными и специалистами ООО ИЛЦ «УНИВЕРСАЛ» под руководством д.б.н., профессора Поля кова В.Ю. и д.б.н. Кирьянова Г.И.

Были исследованы особенности культурально-морфологических характеристик мицелия, полученного по технологии с введением в питательную среду «Концентрата КС», из расчета 0,005 мл/мл питательной среды II пассажа (опытный вариант № 3) в сравнении с мицелием, полученным по технологии без введения в питательную среду «Концентрата КС» (контрольный вариант № 1).

Исследования проведены по методике, описанной в [141].

Анализ результатов показал, что практически все культурально морфологические характеристики опытного варианта № 3 образца мицелия соответствуют характеристикам контрольного варианта № 1 мицелия.

Сравнительная картина выхода биомассы мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и полученного из него экстракта во всех исследуемых вариантах № 1,2,3,4 приведена в таблице 4.1.

Таблица 4.1 - Сравнительная картина выхода биомассы мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и полученного из него экстракта Полученная масса продукта без учета № варианта Количество Состав мицелия и массы культуральной жидкости колб экстракта полученного Масса экстракта Масса мицелия из него на на 1колбу 30 колб 1колбу 30 колб Контроль.Образцы, полученные без 2,400г 72,0 г 28,1 г 843,0 г 1 введения в среду «Концентрата КС»

Образцы, полученные с введением в среду «Концентрата КС» из 3,233 г 97,0 г 30,6 г 918,0 г 2 расчета 0,0033 мл/мл среды Образцы, полученные с введением в среду «Концентрата КС» из 3,900 г 117,0 г 37,6 г 1128,0 г 3 расчета 0,005 мл/мл среды Образцы, полученные с введением в среду «Концентрата КС» из 2,400 г 72,0 г 22,1 г 666,3 г 4 расчета 0,0066 мл/мл среды 4.5 Результаты изучения на уровне in vitro биологической активности экстракта на цитокинетические параметры клеток HeLa Экспериментальные исследования проведены на биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством доктора биологических наук, профессора Полякова В.Ю. [141].

4.5.1 Материалы и методы Исследуемые вещества приведены в таблице 4.2.

Таблица 4.2 - Исследуемые вещества № Состав варианта Концентрация Ag в экстракта препаратов экстракте мицелия (ЭМ) Контроль - ЭМ Pleurotus ostreatus, 1.

гель (100 мкг/мл) Контроль - ЭМ Pleurotus ostreatus, гель 2.

(50 мкг/мл) Смесь №1 ЭМ Pleurotus ostreatus, гель 3.

0. 25 мкл (100 мкг/мл) с Ag Смесь №2 ЭМ Pleurotus ostreatus, гель 4.

0. 125 мкл (100 мкг/мл) с Ag Смесь №1 ЭМ Pleurotus ostreatus, гель 5.

0.125 мкл (50 мкг/мл) с Ag Смесь №2 ЭМ Pleurotus ostreatus, гель 6.

0.0625 мкл (50 мкг/мл) с Ag ЭМ Pleurotus ostreatus, гель ( 7.

мкг/мл), полученный при культивировании в среде с Ag (0, мл на 1,0 мл среды) ЭМ Pleurotus ostreatus гель, ( 8.

мкг/мл), полученный при культивировании в среде с Ag (0, мл на 1,0 мл среды) ЭМ – экстракты мицелия в виде геля;

Ag – «Концентрат КС».

Работу проводили на культивируемых in vitro клетках человечес кой цервикальной карциномы (HeLa).

Методы исследования Клетки HeLa культивировали на покровных стеклах в среде ДМЕМ с добавлением эмбриональной сыворотки теленка (HyClone) и противомикробно-противогрибкового реагента (Gibco) в течение 3-х суток до формирования конфлюэнтного монослоя.

В ходе эксперимента переносили стекла с клетками в свежую среду культивирования и вносили тестируемые вещества согласно протоколу (таблица 4.2).

Аликвоты готовили из заранее приготовленных навесок, растворяя их в стерильном PBS, модифицированном по Дюльбекко, с добавлением противомикробно-противогрибкового препарата.

Клетки HeLa инкубировали в присутствии тестируемых веществ в течение одних суток. Контроль - среда без добавления исследуе мых 1 – 8 вариантов препаратов.

Через час после внесения в среду с клетками HeLa каждого варианта из указанных в таблице 4.2 препаратов анализировали клетки HeLa для выявления возможных быстрых токсических эффектов.

Через 24 часа после внесения тестируемых препаратов клетки фиксировали 3,7% раствором формальдегида на PBS (15 минут), пермеабилизровали плазматические мембраны 0,5% раствором Тритона X-100 на PBS, окрашивали DAPI (0,5 мкг/мл) и заключали в мовиол. Полученные препараты изучали на предмет морфологи ческих отличий и подсчитывали митотический и апоптотический индексы.

4.5.2 Результаты исследования Микроскопический анализ клеток HeLa, проведенный через час после пересева в среду, содержащую испытуемые препараты, не выявил нарушений в структуре интерфазных и митотических клеток и в динамике роста популяции.

1, 2 варианты препаратов Pleurotes ostreatus, контроль. Микро скопический анализ, проведенный через 24 часа инкубации клеток HeLa в среде, содержащей контрольные препараты Pleurotus ostreatus (таблица 4.2, варианты 1,2), показал, что испытуемые препараты ЭМ (гель) в концентрации 100 и 50 мкг/мл не влияют на пролиферацию клеток HeLa и не обладают токсическим действием на культивируемые клетки.

При этом ЭМ (гель) в концентрации 50 мкг/мл примерно в 2 раза снижает апоптотический индекс культивируемых клеток HeLa.

3-6 варианты опытных препаратов Pleurotus ostreatus 1137 с дополнительным введением в полученный экстракт «Концентрата КС». Микроскопический анализ, проведенный через 24 часа инкубации клеток HeLa в среде, содержащей опытные препараты Pleurotus ostreatus 1137 (таблица 4.2, варианты 3-6), показал, что испытуемые препараты ЭМ (гель) в концентрации 100 и 50 мкг/мл среды не влияют на пролиферацию клеток HeLa и не обладают выраженным токсическим действием на культивируемые клетки.

При этом добавление к 100 мкг экстракта 0,25 мкл «Концентрата КС» примерно в 2 раза повышает апоптотический индекс клеток HeLa.

7, 8 варианты опытных препаратов экстракта Pleurotus ostreatus 1137, полученного при совместном культивировании мицелия с «Концентратом КС», введенным в питательную среду. Микро скопный анализ, проведенный через 24 часа инкубации клеток HeLa в средах, содержащих соответственно 100 и 50 мкг/мл среды экстракта Pleurotus ostreatus 1137, показал, что полученные экстракты из мицелия, культивированного в присутствии «Концен трата КС», не изменяют свойства по отношению к контролю (варианты 1, 2). При этом не влияют на пролиферацию клеток HeLa и не обладают выраженным токсическим действием.

Выводы по главе 1. Разработана инновационная биотехнология двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и выделения из него экстракта низкомолекулярных биологически активных веществ (от 100 до 500 дальтон) при глубинном культивировании мицелия в питательной среде, обогащенной «Концентратом КС.

2. Изучено влияние нанотехнологической составляющей нано структурных частиц серебра, в частности «Концентрата КС», на биотехнологические процессы культивирования мицелия в глу бинной культуре и его переработки в экстракт биологически активных веществ. Получены следующие результаты:

- характеристики состава «Концентрата КС» и его основные показатели, а также изучено его цитотоксическое действие на первичные фибробласты человека на уровне in vitro;

- установлена безопасная доза «Концентрата КС» для его дальнейшего применения в качестве сырья в разработанной биотехнологии культивирования мицелия;

- подробно разработан и описан технологический процесс культивирования мицелия в глубинной культуре и его переработки в экстракт биологически активных веществ, изучена на уровне in vitro биологическая активность экстракта.

3. Анализ полученных результатов экспериментального культи вирования в среде, обогащенной «Концентратом КС», и его пере работки в экстракт показывает, что в дальнейшем для увеличения выхода биомассы культивируемого мицелия и выделения из него экстракта в виде геля наиболее целесообразно вводить в состав питательной среды II пассажа «Концентрат КС» из расчета 0, мл/мл среды.

В этом случае выход мицелия и экстракта, по сравнению с контрольным вариантом, увеличился, соответственно, на 34,0% и 62,5 % при сохранении всех требуемых свойств и медико биологической активности экстракта. При этом количество выде ляемого из мицелия экстракта составляет, из расчета на одну колбу с питательной средой 300 мл, в среднем 3,5-4,5 г.

4. Контрольные образцы препарата экстракта мицелия в концен трации 100 и 50 мкг/мл среды ДМЕМ (варианты 1, 2) не обладают токсическим действием на культивируемые клетки HeLa.

5. Добавление к 100 мкг экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 0,25 мкл «Концентрата КС» примерно в два раза повышает апоптотический индекс клеток HeLa.

6. Культивирование мицелия в присутствии «Концентрата КС» в дозе 0,005 мл/мл питательной среды не меняет свойств экстракта, выделяемого из этого мицелия по отработанной технологии.

Глава 5 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО СОЗДАНИЮ И ПРОИЗВОДСТВУ ДЕТОКСИКАЦИОННОГО ПРЕПАРАТА 5.1 Состав детоксикационного препарата Состав детоксикационного препарата с полифункциональной медико-биологической активностью, одновременно обладающего максимальной противоопухолевой, детоксицирующей, гиполипиде мической и гепатопротекторной активностями, был разработан на основании полученных результатов исследований [46,47].

В состав детоксикационного препарата входят [46,47,52]:

- действующее вещество производное стерола 4-hydroxy-17R methylincisterol IUPAC: (3aS,5aR,6R,8aR)-6-[(2R,3E,5S)-5,6-dimethyl hept-3-en-2-yl]-3a-hydroxy-5a-methyl-3a,4,5,5a,6,7,8,8a-octahydro-2H indeno[5,4-b]furan-2-one с молекулярной массой 332,2452 дальтон, выделенное из экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F–819);

- фармацевтическая субстанция в виде экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 со стандартизованным соотношением низкомолекулярных (с молекулярной массой от 100 до 500 дальтон) биологически активных веществ, включающих углеводы, амино кислоты, высшие жирные кислоты, органические кислоты, вита мины, минеральные вещества и воду;

- вспомогательные вещества растительного происхождения, обогащающие фармацевтическую субстанцию, такие как: 1- глюкан с молекулярной массой глюкозы 512 дальтон, ди- и трисахарида 674 и 836 дальтон;

дигидрокверцетин (2,3-дигидро 3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он) с молекулярной массой 304,26 дальтон.

По проявлению медико-биологической активности входящих веществ разработанный состав детоксикационного препарата мож но подразделить на три основные группы:

- первая группа включает выделенное из экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 действующее вещество в виде произ водного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol, вызывающее гибель раковых клеток путём запуска в них механизма апоптоза и оказы вает гепатопротекторное действие, проявляющееся в блокировке развития стеатогепатита с нормализацией липидного спектра в сыворотке крови;

- вторая группа содержит антиоксиданты, усиливающие актив ность процесса детоксикации печени и создающие надежную защиту организма больных от токсического действия «кислородного стресса», вызываемого химиотерапией или радиационным облу-чением;

- третью группу составляют -глюканы, усиливающие противо опухолевый иммунный ответ, обычно подавленный у онкологи ческих больных.

Противоопухолевый эффект разработанного стандартизован ного состава препарата изучался в ходе проведения лабораторных медико-биологических экспериментов и доклинических испытаний на экспериментально прививаемой опухоли мышей - меланома В 16. Показано, что индивидуальное применение детоксикационного препарата в дозе 100 мг/кг после перепрививки мышам опухоли в течение 10 суток значительно тормозит развитие опухоли по ее размерам от 100 до 60% в течение контрольных 45 суток наблюде ния.

С учетом результатов на уровне in vitro нами установлено, что главным механизмом противоопухолевого эффекта разработанного препарата является стимуляция апоптоза в опухолевых клетках.

5.2 Алгоритм технологического процесса производства детоксикационного препарата I ЭТАП - выращивание биомассы мицелия СЕЛЕКЦИОННЫЕ РАБОТЫ СО ШТАММОМ ГРИБА Выполняются и передаются в пробирках для приготовления посевного материала штамма гриба, выращенного на агаризованной среде.

СТЕРИЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ШТАММА ГРИБА НА АГАРИЗОВАННОЙ СРЕДЕ В ПРОБИРКАХ Производится пересев посевного материала и его культивирование на агаре в пробирках или чашках Петри в течение 7-ми суток в термостатированном шкафе.

1-ая СТАДИЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОСЕВНОГО МИЦЕЛИЯ ГРИБА НА КАЧАЛКЕ при 220 об/мин и t= 26-280C Культивирование посевного мицелия производится в 750 мл колбах в количестве 40 шт с объемом питательной среды в каждой колбе 300 мл на стерилизованном обогащенном водном растворе пивного сусла в течение 7-ми суток в стерильных условиях.

2-ая СТАДИЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТОВАРНОГО МИЦЕЛИЯ ГРИБА НА ФЕРМЕНТЕРЕ Культивирование товарного мицелия производится на стерилизованном обедненном водном растворе пивного сусла в течение 7-ми суток в 200 литровом ферментере с рабочим объемом жидкости 150 л при заданной температуре и аэрации среды в стерильных условиях при стерильном пересеве в подготовленную культуральную среду в ферментере посевного мицелия из 40 колб.

II ЭТАП - производство экстракта из мицелия ЭКСТРАКЦИЯ ЭТАНОЛОМ Перед экстракцией мицелия этанолом мицелий после 2-ой стадии культивирования сливается вместе с культуральной жидкостью в эмалированный или из нержавеющей стали сосуд в обычных условиях.

Далее мицелий отделяется от культуральной жидкости и заливается подкисленным до pH= 3 96% этанольным спиртом в соотношении:

масса мицелия к массе спирта 1,0 : 1,5. Экстракция мицелия в спирту производится в течение 24 час при комнатной температуре в закрытом эмалированном сосуде под вытяжкой.

ФИЛЬТРАЦИЯ После экстракции мицелия этанолом производится фильтрация инфильтрата спирта от переработанного мицелия. Полученный инфильтрат с содержимым растворенной в нем смеси биологически активных веществ подлежит тонкой фильтрации от оставшихся в нем мелких волокон первично неотфильтрованного мицелия и сливается в отдельные сосуды для его упаривания на роторном испарителе.

Оставшаяся часть переработанного мицелия отбирается, просушивается до сухого состояния в естественных условиях под вытяжкой и складируется в полиэтиленовых мешках для дальнейшего его использования.

УПАРИВАНИЕ ЭКСТАКТА (в вакууме) Упаривание смеси биологически активных веществ из инфильтрата спирта производится на роторном испарителе на водяной бане при температуре воды до 45 С до получения вязкой однородной желеобразной смеси с содержанием в ней воды до 30%. остаточной воды до 30%.

III ЭТАП - подготовка и производство сырья для препарата ПОДГОТОВКА И ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ ЭКСТРАКТА И МИЦЕЛИЯ ЧИСТЫХ МОНО ВЕЩЕСТВ Выделение из экстракта мицелия Выделение из производного стерола переработанного мицелия 4 - hydroxy – 17R – methylincisterol 1-3 глюкана.

Подготовка дигидрокверцетина ФАСОВКА, УПАКОВКА И ХРАНЕНИЕ СЫРЬЯ Полученные в соответствии с ТУ и ТИ на производство экстракта мицелия в в виде геля, а также подготовленные и выделенные из экстракта и мицелия вещества фасуются и разливаются в герметически закрытые сосуды, предназначенные для пищевой промышленности.

IV ЭТАП - производство детоксикационного препарата Производство детоксикационного препарата осуществляется в соответствии с ТУ и ТИ на его призводство.

V ЭТАП - фасовка, упаковка и хранение товарной формы детоксикационного препарата Хранение готовой продукции производится на складе в холодильнике при температуре не ниже 4 0С в соответствие с ТУ и ТИ на производство данной продукции.

5.3 Предложения по созданию технологического комплекса по производству фармацевтической субстанции детоксикационного препарата 5.3.1 Цель исследований Создание высокоэффективного технологического комплекса (ТК) по производству экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, применяемого в качестве фармакцевтической субстанции детокси кационного препарата.

5.3.2 Назначение технологического комплекса Разработанный ТК предназначен для осуществления промыш ленного двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137, используемого для получения сгущенного экстракта в виде смеси низкомолекулярных (от 100 до 500 дальтон) биоло гически активных веществ.

ТК включает в себя: ротационную качалку-инокулятор (РКИ);

ферментер (ФР);

систему управления (СУ).

5.3.2.1 Решенная научно-техническая задача Оптимизация биологических и физико-химических технологи ческих процессов, повышающих эффективность опытно-промыш ленного двухстадийного культивирования мицелия, используемого для получения сгущенного экстракта низкомолекулярных (от 100 до 500 дальтон) биологически активных веществ.

5.3.2.2 Научная новизна технических решений Разработанный ТК кардинально повышает технологичность и качество производимого мицелия и снижает сибестоимость произ водства детоксикационного препарата на основе выделенного из мицелия экстракта, применяемого в препарате в качестве фарма цевтической субстанции.

По отдельным элементам ТК по производству мицелия Pleurotus ostreatus 1137, применению полученного из него экстракта для лечения целого ряда заболеваний человека получены 12 патентов РФ [45-51,53-57].

5.3.2.3 Основные технические требования к параметрам ТК РКИ обеспечивает культивирование мицелия на первой стадии в условиях автономного режима работы качалки при продолжительном по времени (до 7 суток) плоско-параллельном вращательном движении (180-220 об/мин) установленных на нее колб Эрленмейера с объемом каждой 750 мл с исходной питательной средой в соответствии с заданным алгоритмом (циклограммой) ее работы.

ФР обеспечивает культивирование мицелия на второй стадии выращивания мицелиальной культуры в условиях автономного режима работы ферментера при продолжительном по времени (до 7 суток) аэрирования залитой в него исходной питательной среды с инокулюмом. Ферментация культуральной жидкости с инокулюмом производится в соответствии с заданным алгоритмом (циклограм мой) его работы.

СУ обеспечивает управление РКИ и ФР и служит для сбора и отображения информации об их работе, а также взаимодействует с системой бесперебойного питания электроэнергией и агрегатами обеспечения микроклимата в боксе.

5.3.2.4 Конструктивные требования:

Требования к конструкции РКИ В качалку входят следующие основные узлы:

- столешница с поддоном;

- основание;

- корпус;

- электропривод;

- блок управления качалкой.

Качалка должна вмещать не менее 68 колб, которые располагаются на выдвижном поддоне.

Колбы на поддоне должны легко закрепляться в специальных держателях или стаканах и легко сниматься. При работе качалки закреплённые колбы не должны смещаться в каком-либо направ лении относительно поддона.

Конструкция поддона должна обеспечивать, в случае разлива или разрушения колбы, вмещение жидкости объемом не менее мл, исключая ее попадание на поверхность основания.

Поддон крепится на столешнице и в рабочем положении (установленный на столешницу) должен фиксироваться.

Конструкция столешницы должна быть жесткой, то есть при работе не должна деформироваться и вызывать резонансных вибраций.

При работе качалки поддон должен совершать круговое плоско параллельное движение в горизонтальной плоскости с радиусом вращения 15 мм.

Поддон должен вращаться по часовой стрелке, если смотреть на него сверху.

Вращательное движение обеспечивается кулачками. На полуосях кулачков находятся подшипники. Верхние полуоси установлены в столешнице, а нижние - опираются на основание качалки.

Столешница приводится в движение кулачком, размещенным на дебалансе. Ось вращения дебаланса расположена в центре осно вания качалки.

Конструкция дебаланса должна предусматривать возможность установки/съема дополнительного противовеса в зависимости от объёма (150 мл или 400 мл) исходного сырья, заливаемого в колбы.

Для удобства наблюдения должно быть предусмотрено освещение поддонов люминесцентными лампами мощностью 15...

20 Вт.

Конструкция качалки должна предусматривать возможность крепления ее основания к раме РКИ.

Детали качалки должны быть изготовлены из материалов и покрытий, не подверженных коррозии.

Для удобства транспортировки, переноса и разборки качалки должна быть предусмотрена возможность ее демонтажа стандарт ным инструментом.

Таблица 5.1 - Некоторые технические данные РКИ № Наименование параметра Ед. Значение Питающая сеть напряжением В 220/ Частота напряжения питающей Гц 50 + сети Средняя потребляемая кВт 1, мощность, не более °С Температура окружающей среды + 10... Относительная влажность % воздуха при 25°С, не более Климатические условия УХЛ 4. Габаритные размеры мм 450x1300x (В хШ хГ ), не более Масса качалки, не более кг Требования к конструкции ФР Состав ферментера:

- посевной аппарат (термостатируемый сосуд) с емкостью питательной ферментативной среды 100 л для культивирования вегетативного мицелия;

- поворотный механизм;

- герметично выполненные загрузочное и выгружное устройства;

- входящие и выходящие патрубки для культуральной жидкости и мицелия;

- фильтры очистки подаваемого в сосуд воздуха (газа);

- патрубки для ввода и вывода воздуха (газа);

- электропривод;

- электродвигатель;

- блок силового питания двигателя;

- пульт управления;

- комплект датчиков, объединенных с системой управления ТК.

Блок управления электроприводом должен включать контроллер управления электроприводом (КУЭ).

Блок управления электроприводом должен осуществлять:

- хранение и выполнение рабочей программы управления приводом;

- обмен информацией с СУ;

- регулирование скорости вращения вентильного двигателя посредством регулирования напряжения, подаваемого на обмотки электромагнитов (информация о фактической скорости вращения);

- регулирование скорости вращения асинхронного двигателя на основе алгоритма частотного управления;

- опрос датчиков и передачу информации в СУ.

Электропривод должен быть реализован на базе (один из двух вариантов):

- высоконадежного вентильного двигателя (синхронной диско вой бесконтактной электромашины постоянного тока с постоян ными магнитами);

- трехфазного (однофазного) асинхронного двигателя.

Блок силового питания должен включать:

- сетевой индуктивно-емкостной фильтр;

- однофазный мостовой выпрямитель;

- регулятор постоянного напряжения;

- однофазный инвертор или управляемый трехфазный мост;

- иметь необходимые средства дублирования (резервирова ния) на уровне аппаратных средств.

Требования к системе управления РКИ и ФР Состав СУ:

- центральный контроллер (ЦК);

- пульт управления качалкой (ПУК);

- комплект датчиков.

Для обеспечения высокой надежности СУ должна:

- осуществлять самодиагностику аппаратных средств;

- иметь встроенную систему электронной быстродействующей защиты от перегрева и перегрузок по току.

Центральный контроллер должен осуществлять:

- хранение и выполнение рабочей программы управления качалкой;

- обмен информацией;

- опрос датчиков и передачу информации на РКИ и ФР.

Пульт управления качалкой (ПУК).

ПУК должен включать кнопки управления, жидкокристал лический дисплей (ЖКД) и светодиодные индикаторы.

Пульт управления качалкой должен обеспечивать функции оперативного управления качалкой.

Контроллер ПУК служит для обеспечения связи с РКИ, ФР и с кнопками управления.

ЖКД служит для отображения на своем экране:

- текущей информации о работе качалки и ферментера (номер выполняемого этапа;

длительность этапа и скорость вращения;

время, оставшееся до окончания работы);

- информационно-диагностических сообщений;

- сообщений об ошибках.

Комплект датчиков должен включать следующие датчики:

- температуры окружающего воздуха;

- относительной влажности воздуха;

- температуры корпуса двигателя;

- температуры охладителя силовых полупроводниковых прибо ров (СПП) электропривода;

- перемещения или вибрации (ДПВ) основания качалки.

Для обеспечения высокой надежности СУ должна:

- осуществлять самодиагностику аппаратных средств;

- иметь средства контроля обеспечения нормальных режимов эксплуатации РКИ и ФР (датчики температуры корпуса двигателя и силовых элементов питания привода, датчик вибрации основания качалки).

По надежности ТК должен соответствовать требованиям ГОСТ 27.003-90 «Надежность в технике. Состав и общие правила задания требований по надежности».

По эксплуатации ТК должен соответствовать требованиям ГОСТ 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств», Приложение 2 «Производство медицин ских биологических препаратов», раздел «Помещения и обору дование», п.17.

По техническому обслуживанию и ремонту ТК должен соот ветствовать требованиям ГОСТ 19.508-79 «Руководство по техническому обслуживанию. Требования к содержанию и офор млению».

По упаковке, маркировке и транспортировке ТК должен соответствовать требованиям ГОСТ 17768-90 (Упаковка, марки ровка и транспортировка лекарственных средств), ОСТ 64-504- (Контроль качества лекарственных средств) и ОСТ 42-505- (Технологический регламент производства).

Ожидаемый результат и сравнение его с существующим уровнем.

В результате реализации вышеуказанных требований разработан ТК по производству экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, применяемого в качестве фармацевтической субстанции для детоксикационного препарата.

5.4 Технико-экономическая оценка промышленного производства фармацевтической субстанции детоксикационного препарата Реализация разработанных предложений по производству детоксикационного препарата в настоящее время организована ООО «Инбиофарм» совместно с рядом научно-производственных и медицинских учреждений в рамках проводимой НИОКР.

После завершения НИОКР производство мицелия и всех составляющих детоксикационного препарата на основе базидио мицета Pleurotus ostreatus 1137 будет организовано на совре менных биотехнологических комплексах предприятий России.

Ожидаемый коммерческий эффект проекта (дополнительный объем реализации в рублях/год).

По завершении проекта для его реализации на фармако логическом рынке в России и за рубежом в дальнейшем планируется организация проведения серии доклинических и клинических испытаний детоксикационного препарата, оформле ние фармакологических статей на субстанцию и лекарственное сред-ство с их регистрацией в реестре лекарственных средств.

В последующие 1,5…2 года, начиная с 2015 г., после регис трации детоксикационного лекарственного средства планируется организация производства мицелия Pleurotus ostreatus 1137 с использованием созданного технологического комплекса с произ водительностью 60-100 кг мицелия в месяц и его переработкой в экстракт (6-10 кг в месяц) для производства лекарственного средства в количестве 6000-10000 единиц продукции.

Расчет стоимости проведения 1 цикла производства экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 приведен в таблице 5.2.

Таблица 5.2 - Расчет стоимости производства 1,0 кг экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармацевтической субстанции) Стоимость 1 операции: инокулят в колбах + ферментация составляет 175 471,02 руб.

5.5 Предложения по производству детоксикационного препарата Разрабатываемый детоксикационный препарат планируется производить биотехническим способом с использованием:

- культуры Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) для выращивания биомассы мицелия;

- агара микробиологического по ГОСТ 17206-84;

- сусла пивного пищевого по ГОСТ 51-174-98;

- мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (BKПМ, F-819), выращенного в погруженных условиях в жидкой стерильной питательной среде по ТУ 9317-01-87552538-08;

- сгущенного экстракта в виде геля, состоящего из смеси низкомолекулярных веществ, выделенного из мицелия Pleurotus ostreatus 1137 по ТУ 9317-01-87552538-08;

- действующего вещества производного стерола 4-гидрокси 17R-метилинцистерол, выделенного из сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (геля);

- полисахарида 1-3 глюкана, выделенного из переработанного мицелия Pleurotus ostreatus 1137 после экстракции из него экстракта в виде смеси низкомолекулярных биологически активных веществ;

- дигидрокверцетина, выпускаемого промышленно в виде аморфного порошка с молекулярной массой 304,26 дальтон по ТУ 9197-031-02699613-2006;

- спирта этилового ректификата по ГОСТ Р51652-2000;

- кислоты соляной по ГОСТ 3118-77;

- воды питьевой по ГОСТ 2874, ГОСТ Р 51232-98;

- фруктозы кристаллической, CF4118136AG, Германия DAB;

- кислоты лимонной пищевой по ГОСТ 908-79, сорт высший;

- бензоата натрия, 3382SE023494C4, фармакопея Германия DAB;

- дихлорметана ХЧ, ТУ 2631-019-44493179-98, Россия.

В соответствии с разработанным в п. 5.2 алгоритмом техно логический процесс производства детоксикационного препарата включает 5 этапов и состоит из следующих операций.

На первом этапе культивирования биомассы мицелия селек ционные работы со штаммом (поддержание штамма) проводят путем пересева на свежую агаризованную среду. Для проведения селекционной работы проводят рассев спор, выделение моноспоровых вариантов и оценку их свойств, что позволяет поддерживать целевые признаки культуры [94, 95].

Посевной материал выращивают в пробирках со скошенной агаровой средой, в составе которой присутствуют пивное сусло, агар и вода. После засева пробирки помещают на 7 суток в термостат с температурой 28°С.

В соответствии с технологической инструкцией [43, 44] глубин ное культивирование мицелия осуществляют в две стадии в жидкой питательной среде [43]. Посевной мицелий со скошенного агара вносят в среду из расчета 1 пробирка посевного материала на 1 л среды.

На 1-ой стадии глубинное культивирование посевного мицелия производится на ротационной качалке-инокуляторе при 220 об/мин и t=26-280C. Культивирование посевного мицелия производится в 750-мл колбах в количестве 40 шт с объемом питательной среды в каждой колбе 300 мл на стерилизованном обогащенном водном растворе пивного сусла в течение 7 суток в стерильных условиях.

На 2-ой стадии глубинное культивирование товарного мицелия производится на ферментере. Культивирование товарного мице лия производится на стерилизованном обедненном водном растворе пивного сусла в течение 7 суток в 200 литровом ферментере с рабочим объемом жидкости 150 л при заданной температуре и аэрации среды в стерильных условиях при стериль ном пересеве в подготовленную культуральную среду в фермен тере посевного мицелия из 40 колб.

Отделение выращенной биомассы мицелия от культуральной жидкости производят фильтрованием через, например, марлю до полного истечения жидкости из биомассы. Полученный влажный мицелий подвергают экстракции.

На втором этапе осуществляют производство сгущенного экстракта в виде геля, состоящего из смеси низкомолекулярных веществ, образующих фармацевтическую субстанцию детоксика ционного препарата.

В соответствии с разработанным алгоритмом данный этап включает следующие виды работ:

- экстракцию этанолом;

- фильтрацию спиртового инфильтрата от мицелия;

- упаривание экстракта из спиртового инфильтрата.

В соответствии с технологической инструкцией [43] перед экстракцией мицелия этанолом мицелий из ферментера после 2 ой стадии культивирования сливается вместе с культуральной жидкостью в эмалированный сосуд или сосуд из нержавеющей стали в обычных нестерильных условиях. Далее мицелий отделяется от культуральной жидкости и заливается подкисленным до pH=3 96% этанольным спиртом в соотношении: масса мицелия к массе спирта 1,0:1,0-1,2. Экстракция мицелия в спирте производится в течение 24 час при температуре 4°С в закрытом сосуде под вытяжкой.

После экстракции мицелия этанолом производится фильтрация инфильтрата спирта от переработанного мицелия. Полученный инфильтрат с растворенной в нем смеси биологически активных веществ подлежит тонкой фильтрации от оставшихся в нем мелких волокон первично неотфильтрованного мицелия и сливается в отдельные сосуды для его упаривания на роторном испарителе.

Оставшаяся часть переработанного мицелия просушивается до сухого состояния в естественных условиях под вытяжкой и скла дируется в полиэтиленовых мешках для дальнейшего использова ния.

Упаривание смеси биологически активных веществ из инфильтрата спирта производится на роторном испарителе на водяной бане при температуре воды до 450С до получения вязкого однородного концентрата в форме сгущенного экстракта в виде геля с содержанием в нем 30% связанной воды. При этом для контроля на соответствие отбирают навеску экстракта и опреде ляют содержание химических веществ (углеводов, аминокислот, высших жирных кислот, органических кислот, витаминов, мине ральных веществ и воды).

На третьем этапе осуществляется подготовка сырья для производства детоксикационного препарата [44,45].

Данный этап включает следующие биотехнологические опера ции:

- подготовку и выделение из экстракта и мицелия индиви дуальных веществ (выделение из экстракта мицелия производного стерола 4–hydroxy-7R-methylincisterol, выделение из перерабо танного мицелия 1-3 глюкана, подготовку дигидрокверцетина);

- фасовку, упаковку и хранение сырья. При этом, полученные в соответствии с ТУ и ТИ на производство экстракта в виде геля, а также подготовленные и выделенные из экстракта и мицелия вещества фасуются и разливаются в герметически закрытые сосуды, предназначенные для пищевой промышленности.


Дополнительное выделение производного стерола 4-гидрокси 17R-метилинцистерол из отобранной части сгущенного экстракта мицелия в виде геля производится по разработанной новой технологии [45,51] путем его фракционирования хлористым мети леном с последующей фильтрацией и лиофилизацией для даль нейшего использования в препарате в качестве обогащающего вещества, вводимого в фармацевтическую субстанцию из расчета:

на 79 или 156 массовых частей фармацевтической субстанции – 1,0 или 2,0 массовые части действующего вещества в виде производного стерола 4-гидрокси-17R-метилинцистерол.

Выделение высокомолекулярного полисахарида 1-3 глюкана из переработанного мицелия после упаривания из него экстракта производят также по разработанной новой технологии [44,45], путем ферментативного гидролиза экстрагированного этанолом мицелия с целью дальнейшего использования 1-3 глюкана в препарате в качестве обогащающего вещества, вводимого в фармацевтическую субстанцию из расчета: на 79 или массовых частей фармакологической субстанции – 10,0 или 20, массовых частей 1-3 глюкана.

Опытным путем установлено, что из 1000 мг сухого переработанного мицелия Pleurotus ostreatus 1137 выделяют до 700-750 мг 1-3 глюкана.

Подготовка товарной формы дигидрокверцетина производится для его дальнейшего использования в составе препарата в качестве обогащающего вещества, вводимого в фармацевтическую субстанцию из расчета: на 79 или 156 массовых частей фарма цевтической субстанции - 10,0 или 20,0 массовых частей дигидро кверцетина.

Для применения дигидрокверцетина в разработанном составе препарата, выполняемом в виде геля перед обогащением фармацевтической субстанции экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 данным веществом предварительно перед его смешиванием с составом экстракта в виде геля, аморфный порошок дигидрокверцетина размельчают до мелкокристалли ческого порошка (пудры).

Для применения дигидрокверцетина в разработанном составе препарата, выполняемом в виде сиропа, аморфный порошок дигидрокверцетина предварительно растворяют в приготовленном горячем сиропе фруктозы при температуре 600С.

Применение аморфного порошка дигидрокверцетина в препа рате в виде таблеток или обезвоженных гранул производят путем его дозирования в экстракт, приготовленного в виде измельченного мелкокристаллического порошка.

На четвертом этапе производится приготовление готовой товарной формы детоксикационного препарата в виде геля, или сиропа, или таблеток, или обезвоженных гранул [45].

Приготовление состава детоксикационного препарата в той или иной форме включает в себя:

- дозировку фармацевтической субстанции препарата, содер жащей сгущенный экстракт из низкомолекулярных биологически активных веществ (углеводы, аминокислоты, высшие жирные кислоты, органические кислоты, витамины, минеральные веще ства);

- введение в экстракт производного стерола 4-гидрокси-17R метилинцистерол с молекулярной массой 332,2452 дальтон, поли сахарида 1-3 глюкана и дигидрокверцетина с молекулярной массой 304,26 дальтон, при следующем их массовом соотношении:

(1) :(2) : (3) : (4) как (79,0 - 158,0) : (1,0 – 2,0) : (10,0 – 20,0) : (10,0 – 20,0).

При этом минимальные и максимальные значения ингредиентов приняты в составе препарата исходя из требований токсикологи ческой безопасности и медико-биологической активности его применения и подтверждены результатами токсических и медико биологических испытаний готовой формы препарата и его составляющих компонент.

На пятом этапе производится фасовка, упаковка и хранение товарной формы детоксикационного препарата. Хранение готовой продукции производится на складе в холодильнике при темпера туре не ниже 40С в соответствии с ТУ и ТИ на производство данной продукции.

Примеры приготовления готовой формы детоксикационного препарата:

Пример 1.

Приготовление готовой формы препарата в виде геля осуществляют простым тщательным последовательным переме шиванием приготовленных заранее в требуемом массовом соотношении входящих в состав препарата 1-го, 2-го, 3-го и 4-го компонентов биологически активных веществ.

На первом этапе, из расчета на 100,0 массовых частей готовой формы препарата, взвешивают 79,0 массовых частей сгущенного экстракта (1-го компонента препарата) и подогревают его до слабо вязкого текучего состояния на водяной бане при t=40-500С.

На втором этапе в 79,0 массовых частей подогретого до t =40 500С сгущенного экстракта вводят 1,0 массовую часть произ водного стерола 4-гидрокси-17R-метилинцистерол (2-го компоне нта препарата) от 100,0 массовых частей готовой формы препа рата с последующим тщательным перемешиванием этих компо нент при установленной температуре (t=40-500С) до однородного гомогенного состояния.

На третьем этапе в приготовленную двухкомпонентную смесь сгущенного экстракта и производного стерола 4-гидрокси-17R метилинцистерол вводят 10,0 массовых частей полисахарида 1- глюкана (3-го компонента препарата) от 100,0 массовых частей готовой формы препарата с последующим тщательным переме шиванием этих компонент при установленной температуре (t=40 500С) до однородного гомогенного состояния.

На четвертом этапе в приготовленную трехкомпонентную смесь сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, произ водного стерола 4-гидрокси-17R-метилинцистерол и полисахарида 1-3 глюкана вводят 10,0 массовых частей дигидрокверцетина (4-го компонента препарата) от 100,0 массовых частей готовой формы препарата с последующим тщательным перемешиванием этих компонент при установленной температуре (t=40-500С) до однородного гомогенного состояния.

На пятом этапе проводят анализ качества приготовленной готовой формы препарата в виде геля и производят его фасовку по 100,0 мг или 200,0 мг, например, в герметично закрывающиеся стеклянные флаконы и их товарную упаковку.

Пример 2.

Приготовление готовой формы детоксикационного препарата в виде сиропа осуществляют простым тщательным последова тельным перемешиванием приготовленных заранее в требуемом массовом соотношении входящих в состав препарата сиропа, состоящего из смеси 64,0-х массовых частей фруктозы кристаллической, 0,85-ти массовой части кислоты лимонной, 0,15 ти массовой части бензоата натрия, 34,0-х массовых частей воды и 1,0-й массовой части готовой формы препарата в виде геля с применением 1-го, 2-го, 3-го и 4-го компонентов биологически активных веществ заявляемого препарата, приготовленного в соответствии с описанным выше примером 1.

На первом этапе приготавливают сироп на дистиллированной воде. В предназначенную для приготовления сиропа емкость заливают 34 массовых частей воды от общей массы сиропа и подогревают ее до температуры t=45-500С.

После подогрева воды в нее вводят 64,0 массовые части фруктозы кристаллической от общей массы сиропа и тщательно ее растворяют в воде при t=45-500С.

После получения двухкомпонентной смеси сиропа в его состав вводят 0,85 массовой части кислоты лимонной от общей массы сиропа и тщательно ее растворяют в сиропе при t=45-500С.

После получения трехкомпонентной смеси сиропа в его состав вводят 0,15 массовой части бензоата натрия от общей массы сиропа и тщательно его растворяют в сиропе при t=45-500С.

На втором этапе приготавливают готовую форму препарата в виде геля с применением 1-го, 2-го, 3-го и 4-го компонентов биологически активных веществ препарата, приготовленного в соответствии с вышеописанным примером 1.

На третьем этапе в приготовленные 99,0 массовых частей состава сиропа вводят 1,0 массовую часть готовой формы препарата в виде геля с применением 1-го, 2-го, 3-го и 4-го компонентов биологически активных веществ заявляемого препарата при t=45-500С и тщательно перемещивают до однородного гомогенного состояния.

На четвертом этапе приготовленный препарат в виде сиропа охлаждают до комнатной температуры, проводят анализ качества и производят его фасовку, например, по 80,0 мл или 160,0 мл в герметично закрывающиеся стеклянные флаконы и их товарную упаковку.

Выводы по главе 1. Предложения по производству детоксикационного препарата с полифункциональной медико-биологической активностью завер шают цикл исследований и включают в себя:

- разработанный состав детоксикационного препарата;

- разработанный алгоритм технологического процесса производства детоксикационного препарата;

- предложения по созданию технологического комплекса по произ водству фармацевтической субстанции детоксикационного препа рата;

- технико-экономическую оценку промышленного производства фар мацевтической субстанции детоксикационного препарата;

- предложения по производству детоксикационного препарата.

2. Создание высокоэффективного технологического комплекса обеспечит промышленное двухстадийное культивирование мице лия Pleurotus ostreatus 1137, используемого для получения сгущенного экстракта в виде смеси низкомолекулярных (от 100 до 500 дальтон) биологически активных веществ, составляющих фармацевтическую субстанцию детоксикационного препарата.

3. Технологический комплекс включает в себя: ротационную качалку-инокулятор, ферментер и систему управления и обес печивает производство экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 4. Научная новизна технических решений заключается в разра ботке предложений по созданию технологического комплекса, включающего в себя ротационную качалку-инокулятор, ферментер и систему управления, кардинально повышающего технологичность и качество производимого мицелия, объемы его производства при снижении себестоимости выпускаемого детоксикационного препа рата.

5. В результате проведенных исследований разработаны предло жения по производству детоксикационного препарата с приме нением технологического комплекса, повышающего эффек тивность двухстадийного культивирования мицелия, используемого для получения сгущенного экстракта низкомолекулярных (от 100 до 500 дальтон) биологически активных веществ, составляющих фармацевтическую субстанцию препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время одним из приоритетных направлений в области отечественного здравоохранения является разработка новых лекарственных препаратов.


Актуальность исследований, направленных на получение новых перспективных лекарств, подчеркивается в Распоряжении Правительства Российской Федерации от 6 июля 2010г. № 1141-р и в Федеральной целевой программе «Развитие фармацев тической и медицинской промышленности РФ на период до года и дальнейшую перспективу», утвержденной Распоряжением Правительства РФ от 1.10.2010 № 1660-р.

В этих документах приводится перечень стратегически значимых лекарственных средств (в том числе препаратов для лечения онкологических заболеваний), производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации.

Существует несколько общепринятых алгоритмов создания новых лекарственных препаратов, одному из них (по сути, биотехнологическому), использующему в качестве фармацевти ческой субстанции продукты растительного происхождения, посвящена данная работа, в которой изложены новые научные результаты создания инновационной биотехнологии промыш ленного культивирования и переработки грибов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm в экстракт биологически активных веществ, исполь зуемых в фармацевтической практике для создания медицинских препаратов.

При этом обязательным условием для создания лекарственных препаратов является полномасштабная оценка (скрининг) спектра фармакологической активности исходных экстрактов и полученных из них химически чистых веществ в системах in vivo (на экспе риментальных животных) и in vitro (на модели культивируемых клеток).

Как показали проведенные исследования в этом направлении, создание инновационных лекарственных препаратов на основе природных компонентов - задача, требующая совместных коор динированных усилий представителей различных специальностей:

биотехнологов, химиков, специалистов по клеточной и молеку лярной биологии и практикующих врачей.

В настоящей работе, итогом которой явилась разработка инновационного детоксикационного препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, помимо сотрудников ООО «Инбиофарм», непосредственное участие принимали сотрудники ведущих научных и медицинских центров Москвы: МГУ (НИИ ФХБ, Биологический факультет), Института химической физики им. Н.Н.

Семенова РАН, ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»

Минздрава России, Центрального научно-исследовательского инс титута туберкулеза РАМН, автономной некоммерческой организации «Институт медико-биологических исследований и технологий» и др.

В качестве продуцента биологически активных веществ, ранее не изучавшихся для создания потенциальных лекарственных препаратов, использовался базидиомицет Pleurotus ostreatus (ВКПМ F-819).

Выбор этого объекта исследования был обусловлен, прежде всего, проявлением изученной полифункциональной медико биологической активности выделенных из экстрактов мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus биологически активных веществ, которые потенциально могут быть использованы в медицине для профилактики и лечения многих тяжелых заболеваний, таких, как бактериальные и вирусные инфекции, ВИЧ, диабет, гиперхолес теролемия, сердечно-сосудистые патологии, лейкозы и онкологи ческие заболевания. Это удивительное свойство Pleurotus ostreatus привлекает пристальное внимание различных областей медицины, биохимии и молекулярной биологии.

Работа планировалась и осуществлялась в соответствии с алгоритмом, принятым для биотехнологических методов создания лекарств.

Предварительный анализ литературы показал, что на практике применяются два противоположных подхода к выделению из мицелия базидиомицетов биологически активных веществ – экстрагирование или в водных средах, или в органических раство рителях.

В первом варианте в экстракт переходят полимерные вещества – белки и полисахаропептиды (-глюканы), во втором - различные низкомолекулярные соединения, часть из которых идентифи цирована. Это эргостерины и никотиновая кислота, полифенолы, эллаготаннины и гидролизируемые танины, а также антиоксиданты.

Некоторые из них обладают антираковой активностью, заклю чающейся либо в прямом цитотоксическом действии на клетки опухоли за счёт индукции апоптоза, либо действуют опосредованно, путём стимуляции противоракового иммунитета.

Однако применение этих веществ в медицине до настоящего времени ограничено. В основном, это обусловлено тем, что выделение эффективно действующих компонентов из экстрактов медицинских грибов и, соответственно, разработка лекарственных препаратов на их основе требует кардинального усовершенст вования технологии культивирования мицелия, а также стандар тизации методов выделения, очистки и определения химического состава экстрактов.

Таким образом, в результате проведенных исследований по совершенствованию культивирования Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре и его переработки в экстракт низкомо лекулярных биологически активных веществ нами решена одна из актуальных задач в области современной биотехнологии разработка технологической платформы, позволяющей перевести экспериментальные работы по установлению и испытанию свойств экстрактов медицинских грибов на экономически обоснованный промышленный уровень.

В целом изложенные в данной работе результаты посвящены первому этапу исследований по усовершенствованию технологии выращивания мицелия, гарантирующей стабильные параметры экстрагированных из него экстрактов низкомолекулярных биоло гически активных веществ.

Одним из первых шагов в установлении активно действующих начал в составе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 была оптимизация состава сырья для получения питательных сред и стандартизация методов культивирования мицелия с экстраги рованием из него экстракта низкомолекулярных биологически активных веществ.

Под руководством профессора В.П. Герасимени и при непосредственном участии специалистов ООО «Инбиофарм» в сотрудничестве с учеными других привлеченных научных орга низаций были разработаны технологические регламенты культи вирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и выделения из него экстракта низкомолекулярных биологически активных веществ.

В результате предложены технологические регламенты культивирования мицелия и разработаны методы получения экстрактов мицелия с постоянным составом компонентов.

Основной итог первого этапа работы - создание иннова ционной экспериментально обоснованной биотехноло-гической базы, которая может быть использована для получения линейки лекарственных препаратов на основе экстрактов медицинских грибов, включая Pleurotus ostreatus 1137.

Проведенная валидация технологии двухстадийного глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 позволила повысить выход биомассы в 1,5-2 раза, что создает существенную экономию времени и затраченных средств на производство исход ного сырья.

Впервые обнаружен феномен стимуляции роста мицелия в присутствии наночастиц коллоидного серебра.

Разработана технология экстракции мицелия и алгоритмы испы тания экстракта в системе in vitro и in vivo.

Создание инновационной биотехнологической базы позволило приступить ко второму этапу, направленному на более строгое исследование стандартизованных составов экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 как на клеточном уровне (in vitro), так и на уровне in vivo (на лабораторных животных).

Однако уже в настоящее время проведенные исследования по выявлению медико-биологических эффектов действия экстра гированных из мицелия веществ, вместе с известными данными литературы позволили предложить композицию детоксика ционного препарата, в состав которого кроме экстракта входят дозированные компоненты экстракта, включая впервые выделен ное нами из него действующее вещество производного стерола 4-гидрокси-17R-метилинцистерол.

Ранее было показано, что этот препарат в рекомендованных для использования дозах не обладает токсичностью. Состав препарата сбалансирован таким образом, что позволяет использовать его для снижения токсического действия медицинских цитостатиков и других токсических реагентов, используемых при лечении тяжелых патологий в комплексном лечении больных.

Список литературы 1. Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами: обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3, 1999 p. 31-62.

2. Корсун В.Ф. Противоопухолевые свойства грибов / В.Ф.Корсун, Л.М.Краснопольская, Е.В.Корсун, М.А.Авхукова. –М.:

«Мэйлер»,2012. -210 с.

3. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении био логически активных веществ базидиальных грибов / Е.П.

Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология -1998, т.34, № 6, -С. 597-608.

4. Yang Q.Y., Jong S.C., Li X.Y., Zhou J.X., Chen R.T., Xu L.Z.

Antitumor and immunomodulating activities of the polysaccharide peptide (PSP) of Coriolus versicolor. J Immunol Immunopharmacol 1992 a;

12: 29-34.

5. Wang H.X., Liu W.K., Ng T.B., Ooi V.E.C., Chang S.T. Immuno modulatory and antitumor activities of a polysaccharide-peptide cоmplex from mycelial culture of Tricholoma sp., a local edible mushroom. Life Sci. 1995;

57: 269-81.

6. Герасименя В.П. Роль и значение нового полифункционального препарата «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в сопровождении комплексной терапии онкологических заболеваний:

аналитический обзор / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Г.И.Кирьянов, В.Ю.Поляков. -М.: ООО «Инбиофарм», 2010. – 33с.

7. Collins R.A., Ng T.B. Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type infection. Life Sci. 1997;

60: PL 383-87.

8. Wang H., Gao J., Ng T.B. A new lectin with highly potent antihepatoma and anti sarcoma activitees from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus.. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Sep 7;

275(3): 810-6.

9. Герасименя В.П. Результаты экспериментальных (доклиничес ких) исследований противоопухолевой активности экстракта мицелия гриба «вешенка обыкновенная» и его способности потенцировать антибластомное действие цитостатических препаратов. Аналитический обзор/ В.П.Герасименя, Т.И. Милевич, С.В. Захаров и др. // Журнал Здравоохранение Беларуси. Минск.:

-2012. -12с.

10. V.P. Gerasimenia, S.V. Zakharov, V.Yu. Polyakov, G.I. Kirianov, K.Z. Gumargalieva, L.A. Putyrskyi, Yu.L. Putyrskyi, and T. I. Milevich.

Application of a New Polyfunctional Preparation "Oyster Mushroom Mycelium Extract 'Ovodorin®'" to the Correction of Drug Intolerance in the Complex Treatment of Oncological Diseases: The Overview of Cytological, Biological and Medical Results // Volume 2 Issue 1. The Overview of Cytological, Biological and Medical Results. 2012. -48s.

11. Изучение и установление механизма действия «Экстракта мицелия вешенки «ОВОДОРИН»: сводный отчет о НИР / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю, Герасименя В.П., Захаров С.В. - М.: ООО ИЛЦ «Универсал». 2009. - 49 с 12. Герасименя В.П..Гепатопротекторные свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования: информационные материалы. Выпуск 2 / В.П.

Герасименя, С.В. Захаров, А.В. Трезвова и др. - М.: ООО «Инбиофарм», 2009. -22 с.

13. Герасименя В.П. Гиполипидемические свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования: информационные материалы. Выпуск 3 / В.П.

Герасименя, С.В. Захаров, З.Ш. Голевцева и др. - М.: ООО «Инбиофарм», 2009. -20 с.

14. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии экспериментального стеатоза печени / В.Ю. Поляков, С.А.

Голышев, Г.И.Кирьянов, Е.А. Арифулин, В.П. Герасименя, С.В.

Захаров, К.З. Гумаргалиева, Ю.Л. Путырский // Биологические мембраны. - 2011, том 28, № 4. -С.1-7.

15. Кнооп Мартин. Все о грибах. / Пер. с нем. –М.: БММ, АО, 2000. 256 с.: ил.

16. Дудка И.А. Промышленное культивирование съедобных грибов / И.А. Дудка, С.П. Вассер, А.С. Бухало, и др.;

под общ. ред. И.А.

Дудки. – Киев: Наук. Думка, 1978. – 264 с.

17. Бисько Н.А. Биология и культивирование грибов рода вешенка / Н.А. Бисько, И.А. Дудко. – Киев: Наук. думка, 1987, -147 с.

18. Дудка И.А. Вешенка обыкновенная / И.А. Дудка, В.В. Шепа, С.П.

Вассер и др. – Киев: Наук. думка, 1976. -110 с.

19. Наука и практика грибоводства: материалы IV Международной конференции -М.: Межрегиональная Ассоциация Грибоводов, 1997.

– 92 с.

20. Заикина Н.А. Основы биотехнологии высших грибов: учебное пособие. / Н.А. Заикина, А.Е. Коваленко, В.А. Галынкин, Ю.Т.

Дьяков, А.Д. Тишенков. – Санкт Петербург;

«Проспект Науки», 2007.

– 336 с.

21. Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами: обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3, 1999. p. 31-62.

22. Справка о состоянии исследования, перспективы разработки и внедрения в практику медицины фармацевтической компанией ООО «Инбиофарм» нового поколения медицинских препаратов на основе биологически активных веществ экстракта мицелия (FR.) KUMM. 1137, обладающих Pleurotus ostreatus полифункциональной специфической фармакологической активностью: отчет о НИР/ Захаров С.В. Герасименя В.П. – М.:

ООО «Инбиофарм», 2011. -64 с.

23. Герасименя В.П. Влияние препаратов, полученных из мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, на пострадиационные нарушения иммунитета у животных / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Т.И.

Милевич и др. // VI съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность).

Тезисы докладов, том 1 (секция I –VIII, РАН. 2010. - C. 92.

24. Герасименя В.П. Радиозащитный эффект препаратов вешенки после воздействия гамма-излучения: Материалы международной научной конференции / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Т.И.Милевич и др. // - Гомель, 14-15 октября 2010 г. -С. 69-70.

25. Захаров С.В. Применение БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких: пособие для врачей / В.В.Ерохин, Н.П.Карпина, И.А.Васильева, Ю.Е.Коссий, М.В.Ерохина, В.П.Герасименя, С.В.

Захаров, А.В. Трезвова, В.Н.Григорьева. –М.: Мин. здравоохрн. соц.

Развития, ЦНИИ туберкулеза РАМН, ООО «Инбиофарм»,2010. –21 с.

26. Герасименя В.П. Антимикробные, антитоксические, радиопротекторные, радиосорбционные свойства новой биологически активной добавки к пише «Экстракт мицелия вешенки «ОВО-Д»: Успехи медицинской микологии: Материалы Первого Всероссийского конгресса по мед. микологии / В.П. Герасименя, О.В. Камзолкина, О.В.Ефременкова, Т.А.Богуш, Т.И.Милевич, А.Е.Орлов;

под ред. Ю.В.Сергеева. - Москва: Нац. академия микологии. 2003. - Т. 1. - С. 265-267.

27. Гришанина А.Н. Изучение культурально-морфологических свойств штаммов Pleurotus ostreatus: дипломная работа/ А.Н.

Гришанина, О.В. Камзолкина. – М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2003.

-49 с.

28. Герасименя В.П., Ефременкова О.В, Камзолкина О.В. и др.

Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба P. Ostreatus 1137 для его получения, патент РФ 2192873.

20.11.2002. Бюл. № 32.

29.Герасименя В.П. Антимикробная и антитоксическая активность экстракта Pleurotus ostreatus (Fr.)Kumm: тезисы доклада / В.П.Герасименя, О.В.Ефременкова, О.В.Камзолкина, Т.А.Богуш // International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol.3, Num. 2-3, 2001. С. 147.

30.V.P.Gerasimenya. Antimicrobial and Antitoxical Action of Edible and Medicinal Mushroom P. ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm.

Extrasts./International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 4, p.p. 127 132 (2002).

31. Конопля Е.Ф. Антимикробная и антитоксическая активность экстрактов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm / Е.Ф.Конопля, Т.Н.

Милевич, В.П.Герасименя, А.Е.Орлов, О.В Ефременкова, Т.А.Богуш // Becцi HAH Беларусi Сер. мед.-бiял. Навук. 2002. - № 3. - С. 92-96.

32. Герасименя В.П. Биосинтез антитоксических веществ штамм мом P. ostreatus (Fr.) Kumm.): отчет о НИР (шифр «ОВОД-2002»/ В.П.Герасименя, О.В. Камзолкина, О.В.Ефременкова // - М., НИИНА РАМН. 2002. - 53 с.

33. Милевич Т.Н. Исследование радиозащитных свойств экстракта вешенки при однократном облучении мышей/ Т.Н.Милевич, Е.Ф, Конопля, Л.А..Путырский, В.П.Герасименя, А.Е.Орлов // Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии: Сб. науч. работ. Минск: ГУ НИИ онкологии и мед.радиологии им. Н.Н.Александрова.

2002. - С. 502-508.

34. Милевич Т.И. Влияние препарата природного происхождения на противоопухолевую активность цитостатиков, применяемых в клинике/ Т.Н.Милевич, Е.Ф.Конопля, А.Е.Машкович, Л.А..Путырский, В.П.Герасименя, А.Е.Орлов // Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии: Сб. науч. работ.- Минск: ГУ НИИ онкологии и мед. радиологии им. Н.Н.Александрова. 2002. - С. 509 514.

35. Меерович И.Г. Изучение комбинированного действия цикло фосфана и экстракта мицелия вешенки на меланому B16-FO мышей, эксперссирующей зеленый флюоресцирующий белок/ И.Г.

Меерович, В.П.Герасименя, А.Е.Орлов и др. // Российский Биотерапевтический Журнал. -2005 - № 3. Т4. - С. 95-100.

36. Милевич Т.И. Биологические и радиозащитные свойства препаратов, полученных из Pleurotus ostreatus: дис. …канд. биол.

наук: 03.00.01/ Милевич Татьяна Ивановна.// - Минск. 2005. -157 с.

37. Герасименя В.П. Гепатопротекторные свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследо вания: информационные материалы. Выпуск 2 / В.П.Герасименя, С.В. Захаров, А.В.Трезвова и др. //- М., ООО «Инбиофарм». 2009. 22 с.

38. Герасименя В.П. Потивоопухолевое действие экстракта мице лия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования:

информационные материалы. Выпуск 3 / В.П.Герасименя, С.В.

Захаров, Л.А.Путырский и др. // Информационные материалы.

Выпуск 3, // - М., ООО «Инбиофарм». 2009. -44 с.

39. Герасименя В.П., Захаров С.В., Голевцева З.Ш. и др.

Гиполипидемические свойства экстракта мицелия вешенки.

Экспериментальные и клинические исследования: информации онные материалы. Выпуск 3 / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, З.Ш.

Голевцева и др. // - М., ООО «Инбиофарм». 2009. -20 с.

40. Gerasimenia V.P., Orlov A.E., Kiryanov G.I. Joint effect of Pleurotus ostreatus and citostatic agents (cyclophosphomide and doxorubicin) on the induction of tumor apoptosis in experiments // Palais des Congres, Paris, France, February 6 - 9, 2007. - P. 401.

41. Евдокимов В.В. Антиоксидантная терапия при сниженной фер тильности у мужчин / В.В.Евдокимов, В.П.Герасименя, С.В. Захаров и др. // Экспериментальная и клиническая урология. -№ 4, -2010.-С.

38 - 42.

42. Состояние вопроса результатов исследования и применения в медицине БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВО-Д» штамм Pleurotus ostereatus (Fr.) Kumm.1137: отчет о НИР. (Шифр «ОВО-Д – 2005) / Герасименя В.П. - М., ЗАО «Пульмомед». 2005. - 69 с.

43. Захаров С.В. Инструкция описания технологического про цесса культивирования мицелия Pleurotus ostreatus (ВКПМ, F-819) и получения из него экстракта биологически активных веществ : инструкция / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Л.П.Семашева –М.: ООО «Инбиофарм», 2008. – 39 с.

44. Инновационный детоксикационный препарат с полифункцио нальной медико-биологической активностью для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении онколо гических заболеваний и в реабилитационный период. Технология, создание лекарственной формы, производство: отчет о НИР (Шифр «Онководин») / Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю. – М.: ООО «Инбиофарм»,2011. -146 с.

45. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.