авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 8 |

«Н.П. МАСЮК, Ю.И. ПОСУДИН, Г.Г. ЛИЛИЦКАЯ ФОТОДВИЖЕНИЕ КЛЕТОК Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, ...»

-- [ Страница 3 ] --

Изотропность углового распределения клеток при освещенности 1500 лк можно объяснить переходом части клеток к негативному фототопотаксису, причем количество клеток, двигающихся в направлении к источнику света и от него, приблизительно одинаково.

- 52 Таблица 4.3. Результаты статистической обработки различными методами экспериментальных данных, касающихся зависимости углового распределения подвижных клеток Dunaliella viridis от уровня освещенности образца боковым стимулирующим светом (рН 6–7, температура 21 0С) Е, лк Параметры оценки 0 30 500 1500 фототопотаксиса N 105 112 144 104 1 2 3 4 5 Тест Релея r R:

Параметры вектора угол q (градусы) - 140 147 82 длина, r (отн.ед.) 0,10 0,15 0,24 0,15 0, Значение параметра z = Nr :

фактическое 1,11 3,01 9,12 2,88 2, табличное:

при Р = 0,05 2, при Р = 0,01 4, Степень вероятности:

для Р = 0,05 НС НС С НС С для Р = 0,01 НС НС С НС С V-тест Значенияпараметра V:

-0,74 -4, фактическое +1,49 +2,46 +4, табличное:

для Р = 0,05 1, для Р = 0,01 2, Степень вероятности:

для Р = 0,05 НС С С НС С для Р = 0,01 НС С С НС С c -критерий Значения c (число степеней свободы n = 2):

фактическое 8,38 4,82 12,25 3,26 13, 1 2 3 4 5 табличное:

для Р = 0,05 5, для Р = 0,01 9, Степень вероятности:

для Р = 0,05 НС НС С НС С для Р = 0,01 НС НС С НС С Метод моментов Значения параметра 0,50 0,63 0,68 0,38 0, m Следует отметить, что в условиях природных гипергалинных водоемов юга Украины, где интенсивность освещенности на поверхности рапы достигает 100000 лк и выше, постоянные их обитатели – - 53 исследуемые нами виды Dunaliella – ведут себя по-разному: зеленые клетки D. viridis сосредотачиваются в более затененных придонных слоях рапы, а красные клетки D. salina – собираются на ее поверхности, которая освещена наиболее ярко [Масюк,1973]. Правда, природные и исследуемые нами лабораторные популяции D.salina отличаются окраской клеток (соответственно, красной и зеленой). Очевидно, накопление каротина и глицерина вегетативными клетками D. salina в природных условиях значительно повышает толерантность этого вида к яркому освещению. В природных популяциях D. salina не наблюдался переход от позитивного к негативному фототопотаксису даже при уровне освещенности, который в 100 раз превышал установленный нами в лабораторных исследованиях порог этого перехода [Масюк, 1973].

Возможно, уникальное поведение красных клеток D. salina объясняется не только фототолерантностью в связи с гиперсинтезом каротина, но и способностью клеток этого вида накапливать значительное количество глицерина [Ben-Amotz et al., 1982а;

Enhuber, Gilmmer, 1980;

Wegmann, 1979], что повышает их плавучесть и, возможно, как и каротин, играет защитную роль. Механизмы, которые обуславливают особенности фотоповедения красных клеток D. salina в природных водоемах, еще требуют специальных исследований.

Применение критерия c2 (табл. 4.2 и 4.3) в общем подтверждает выводы, сделанные на основании использования двух предыдущих тестов: существенное отклонение фактического распределения подвижных клеток обоих видов Dunaliella под влиянием бокового освещения от изотропного наблюдается при освещенности 500 и 40000 лк. Вместе с этим такой подход позволяет получать дополнительную информацию и с высокой степенью вероятности (Р = 0,05 для D. salina и Р = 0,01 для D. viridis) оценить относительное количество клеток, двигающихся в заданном стимулирующим светом направлении.

Дополнительную информацию также можно получить, применяя метод моментов, который позволяет оценить бимодальность углового распределения подвижных клеток видов Dunaliella под влиянием бокового стимулирующего света, т.е. определить относительное число клеток водорослей, которые двигаются в противоположных направлениях: к источнику света и от него. Результаты применения этого метода также подтверждают выводы, сделанные на основании трех предыдущих тестов:

максимальные значения параметра µ, которые характеризуют относительное число клеток, двигающихся в противоположных направлениях, соответствуют уровням освещенности 500 и 40000 лк (табл. 4.2, 4.3).

Таким образом, применение вышеупомянутых статистических методов оценки полученных нами экспериментальных данных позволило с высокой долей достоверности определить основные доминирующие направления в процессе фототопотаксиса Dunaliella, степень анизотропности углового распределения клеток при боковой освещенности образца (тест Релея), знак фототопотаксиса (V-тест), а также оценить относительное количество клеток, которые двигаются в заданном направлении (c2 критерий) и дать количественную оценку бимодальности углового распределения клеток (метод моментов). В целом, для полной характеристики углового распределения подвижных клеток целесообразно использовать совокупность всех перечисленных выше статистических методов, которые дополняют друг друга.

Наличие некоторых различий параметров фотодвижения двух видов Dunaliella в зависимости от внешних условий дает возможность использовать эти параметры для выявления экологического своеобразия этих видов, что представляет интерес для их аутэкологии, таксономии и может найти применение в практике.

4.3.3. Результаты Фурье-преобразования углового распределения клеток Dunaliella Процедура Фурье-преобразования углового распределения клеток D. salina для различных уровней освещенности образца дает возможность разложить полученные из реальных гистограмм данные в дискретный набор гармоник, характеризующихся амплитудами и фазами колебаний (причем, амплитуда соответствует числу клеток, двигающихся в определенном направлении, которое определяется соответствующей фазой) и реализовать обратное Фурье-преобразование данных, позволяющее удалить гармоники высших порядков, т.е. избавиться от “шумов”, обусловленных случайными факторами.

- 54 При отсутствии светового стимула (освещенность Е = 0 лк) гистограмма реального распределения клеток D. salina (рис. 4.7, а) характеризуется пиками практически во всех направлениях;

амплитуды первых 7 гармоник также не демонстрируют каких-либо существенных отличий (рис. 4.7, б). Фазы этих гармоник (рис. 4.7, г) свидетельствуют о движении клеток по направлениям, характеризующимся углами 135°, 235°, 180°, т.е. вряд ли можно выделить в данной ситуации какое-либо доминирующее направление движения клеток (рис. 4.7, в).

Включение источника бокового освещения, обеспечивающего освещенность 500 лк, вызывает появление ярко выраженных пиков в реальном распределении движущихся клеток (рис. 4.8, а). Можно выделить амплитуды первой и второй гармоник (рис. 4.8, б), фазы которых свидетельствуют о направлении движения клеток в области 270°, т.е. по направлению к источнику света (рис. 4.8, г). Результаты обратного Фурье-преобразования свидетельствуют о наличии доминирующего направления движения клеток к источнику света, т.е. положительного фототопотаксиса (рис. 4.8, в).

Рис. 4.7. Результаты Фурье-преобразования углового распределения движущихся клеток Dunaliella salina Teod. при отсутствии светового стимула (Е = 0). Здесь и далее: а – реальные гистограммы углового распределения;

б – амплитуды гармоник (А);

в – гистограммы обратного Фурье-преобразования для семи основных гармоник;

г – фазы гармоник;

n – номер сектора в угловом распределении [Посудин и др., 1991].

Рис. 4.8. То же, что и на рис. 4.7, при освещенности образца 500 лк. Здесь и далее направление распространения света указано стрелками [Посудин и др., 1991].

- 55 Рис. 4.9. То же, что и на рис. 4.7, при освещенности образца 40000 лк [Посудин и др., 1991].

Использование бокового освещения образца, обеспечивающего освещенность 40000 лк, вызывает появление по крайней мере пяти интенсивных пиков в реальном распределении (рис. 4.9, а). Из семи гармоник Фурье-разложения можно выделить отличающиеся по амплитуде первые четыре гармоники (рис.

4.9, б), фазы которых близки к нулю (рис. 4.9, г). Реконструированная для основных гармоник гистограмма (рис. 4.9, в) свидетельствует об отрицательном фототопотаксисе клеток D. salina.

Таким образом, метод Фурье-преобразования позволяет исследовать зависимость углового распределения клеток Dunaliella от степени освещенности образца боковым белым светом. Достоинством метода является возможность построения гистограмм углового распределения, избавленных от случайных факторов и дающих представление об истинных доминирующих направлениях движения клеток в ответ на световой стимул различной интенсивности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Виды Dunaliella подобно другим жгутиковым водорослям проявляют способность к свободному перемещению в жидкой среде под воздействием света, т.е. к фотодвижению (фототаксису).

Виды Dunaliella способны к фотокинетическим и фотовекторным реакциям (наличие фотокинетических реакций у Chlamydomonas в литературе оспаривается). Что касается фотофобических реакций, то у видов Dunaliella в отличие от Chlamydomonas и Euglena нам не удалось их наблюдать, хотя литературные данные (Wayne et al., 1991) свидетельствуют о возможности таких реакций и у Dunaliella.

Средняя скорость поступательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella при оптимальной для фотокинеза этих видов степени освещенности составляла 48±2 мкм/с (D. salina) и 36± мкм/с (D. viridis). Эти значения на 1-3 порядка превышают таковые микроорганизмов, не обладающих жгутиковым аппаратом, и находятся в пределах, известных для других жгутиконосцев, как про-, так и эукариотических. Однако средние скорости движения гипергалобных видов Dunaliella ниже (иногда на порядок) чем таковые морских (Dunaliella bioculata) и пресноводных видов (Chlamydomonas reinhardtii, Euglena gracilis), что, по всей вероятности, связано с разной вязкостью среды обитания.

Средние скорости вращательного движения видов Dunaliella 0,52±0,04 об/с (D. salina) и 0,54±0, об/с (D. viridis) ниже, чем у пресноводных жгутиконосцев, что может быть связано с вязкостью среды - 56 обитания. Зависимость поступательной и вращательной скорости движения клеток Dunaliella от длины волны падающего света не установлена.

Максимальные значения средних скоростей поступательного и вращательного фотодвижения клеток Dunaliella наблюдались в пределах интенсивности белого света 10-20 вт/м2, освещенности 150- лк. Фотокинетические реакции обоих видов на изменение интенсивности белого света и спектрального состава света были идентичными - максимальные значения фотокинетических реакций обоих видов наблюдались в интервале освещенностей около 250 лк.

Статистически достоверные отличия скорости поступательного движения обоих видов Dunaliella при воздействии на них поляризованного света по сравнению с белым неполяризованным светом той же интенсивности не обнаружены. Это свидетельствует о некристаллической недихроичной природе фоторецепторов у этих видов (Посудин и др., 1988).

Характер углового распределения траекторий движения клеток обоих гипергалобных видов Dunaliella в лабораторных культурах при воздействии латерально направленного белого света зависит от освещенности образца;

максимальная анизотропия этого распределения достигается при 500 лк (положительный фототопотаксис);

при освещенности порядка 1 500 лк наблюдается переход от положительного фототопотаксиса к отрицательному;

последний отмечали при освещенности 40 000 лк.

Эти показатели находятся в границах, известных для других водорослей. Однако пороги чувствительность к слабой и сильной освещенности, перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису у разных видов водорослей отличаются в значительной степени и позволяют судить об их теневыносливости, солнцелюбивости и устойчивости к высокой освещенности. D. viridis более, чем D.

salina, чувствительна к слабому (30 лк) и интенсивному (до 100000 лк) свету, что соответствует особенностям поведения этих двух видов в природе. Оба вида в лабораторной культуре более чувствительны к высокой освещенности, чем Chlamydomonas reinhardtii, переход которого к отрицательному фототопотаксису отмечается при 100 000 лк. Однако, в условиях крымских гипергалинных водоемов с высокой степенью освещенности (свыше 100 000 лк) природные популяции D. salina, представленные так называемой “красной формой”, демонстрируют отсутствие отрицательного фототопотаксиса. Таким образом, гипергалобные виды D. salina и D. viridis отличаются по степени их чувствительности, как к высокой, так и к низкой интенсивности света, что обусловлено особенностями занимаемых ими в природе экологических ниш.

Переход видов Dunaliella от положительного фототопотаксиса к отрицательному осуществляется иным способом, чем у хламидомонад. В отличие от последних у видов Dunaliella не наблюдается изменение характера биения жгутиков от цилиарного (гребного) к ундуляторному (волнообразному), а нарушается лишь частота биения одного из жгутиков, в результате чего происходит поворот клетки и движение ее в противоположную от источника света сторону.

Спектр действия фототопотаксиса двух гипергалобных видов Dunaliella идентичен;

он находится в пределах 400-520 нм и имеет два максимума: при 410-415 нм и при 465-475 нм. Спектр действия фототопотаксиса Dunaliella несколько отличается от такового Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis, демонстрирующих широкую полосу в области 400-550 нм с основным максимумом при 500 нм, что может свидетельствовать о различиях в составе фоторецепторных пигментов.

- 57 ГЛАВА ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ПАРАМЕТРЫ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA В процессе фотодвижения подвижные микроорганизмы подвергаются воздействию ряда абиотических факторов: механических (механических шоков, гидростатических давлений), гравитационных, тепловых, электромагнитных (излучений ультрафиолетового, видимого, инфракрасного и радиочастотного диапазонов, электрических и магнитных полей) и ионизирующих. Кроме того, на фотодвижение микроорганизмов оказывают влияние химический, газовый и ионный состав водной среды, в которой они обитают, рН среды, наличие в ней биогенных элементов и других организмов [Jahn, Bovee, 1968;

Крицкий, 1982;

Синещеков, Литвин, 1982;

Colombetti et al., 1982]. Влияние света на параметры движения двух видов Dunaliella были рассмотрены в главе 4.

Подвижные микроорганизмы реагируют на разнообразные абиотические факторы окружающей среды в поисках оптимальных условий существования и роста популяций. Среди этих факторов следует отметить тепловые [Poff, 1985] и химические [Berg, 1985] градиенты, гравитационные [Hder, 1987b], электрические [Mast, 1911] и магнитные [Esquivel, de Barros, 1986] поля, оптическое излучение [Nultsch, Hder, 1988].

В данной главе будет рассмотрено влияние таких абиотических факторов как температура, электрические поля, рН среды, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, а также одновременное воздействие нескольких внешних физических факторов (оптического излучения, температуры и электрического поля) на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella.

5.1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ Методика измерений. Определение температурной зависимости скорости движения клеток осуществляли изменением температуры (в пределах от 16 до 35 0С) термостата, в котором размещали микроскоп с исследуемым образцом. Как показали измерения температуры суспензии водорослей с помощью терморезистора СТЗ-14, относительное изменение температуры образца при включении стимулирующего фотокинетические реакции света не превышает сотых долей градуса. Это свидетельствует об отсутствии существенного нагрева образца со стороны источника стимулирующего света [Посудин и др., 1988].

Кинетическая реакция на изменение температуры определялась как Ri = (Vi- V0)/V0, где Vi и V0 скорости движения клеток при исследуемой t1 и начальной t0 (в наших опытах 16 0С) температуре соответственно [Посудин и др., 1988]. Время установления температуры (2-3 мин) определялось инерционностью термостата.

Результаты и обсуждение. Изменение средней скорости поступательного движения обоих видов Dunaliella в зависимости от температуры воздуха свидетельствует о том, что максимальные значения скорости наблюдаются при температуре от 20 до 30 0С. Температурный оптимум для скорости поступательного движения клеток обоих видов составляет 25 0С. Кинетические реакции этих видов на изменение температуры (относительно начальной температуры 16 0С) идентичны (рис. 5.1). Величина кинетической реакции на повышение температуры в пределах 16-25 0С возрастает до R(t) = 0,19, причем наиболее быстрое увеличение R(t) происходит в интервале от 16 0С до 20 0С.

- 58 Рис.5.1. Зависимость среднихзначений скорости поступательного движения D.

salina (1) и D. viridis (2) от температуры кинетические реакции R(t) обоих видов (3) на изменениетемпературы. По оси ординат: слева – средня яскорость поступательного движения клеток, справа – кинетическая реакция. По оси абсцисс – температура t воздуха и ее изменение D t [Посудин и др., 1988].

Дальнейшее повышение температуры до 35 0С приводит к снижению величины кинетической реакции до R (t) = 0,12 (см. рис. 5.1). Зависимость скорости поступательного движения клеток от температуры можно связать с возможным уменьшением вязкости среды при нагревании среды от 16 до С и постепенным ингибированием жгутикового аппарата в области температур 25-35 0С.

Температура в испытуемых пределах не влияет существенно на фототопотаксис водорослей.

5.2. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ Методика измерений. Использована специальная кювета с прямоугольным углублением для суспензии Dunaliella salina и позолоченными электродами, расположенными параллельно друг другу на расстоянии мм, связанными с источником постоянного (не более 3 В) напряжения. Для предотвращения процесса электролиза суспензии электроды были отделены от углубления буферными зонами, заполненными желатином и 0,3 М раствором KCl [Посудин и др., 1991а].

При исследовании степени подавления фотопотаксиса внешними электрическими полями был использован метод прямого Фурье-преобразования, позволяющий представить угловое распределение подвижных клеток как набор гармоник с определенными амплитудами (количеством клеток, двигающимися в определенном направлении) и фазами (направлениями движения клеток), также как и метод обратного Фурье-преобразования, дающий возможность избавиться от высших гармоник, обусловленных случайными «шумами», и оставить основные гармоники, характеризующие фотодвижение клеток.

Результаты и обсуждение. Приложение электрического поля напряженностью 10-20 В/м вызывало подавление фототопотаксиса водоросли D. salina при ее боковом освещении белым светом (освещенность Е = 500 лк). На рис. 5.2 приведены гистограммы углового распределения клеток в отсутствии и при включении электрического поля напряженностью 20 В/м (регистрацию фототопотаксиса клеток осуществляли через 2 мин после включения поля). Использование метода Фурье-преобразования позволило оценить степень уменьшения амплитуд основных гармоник (первой – в 3 раза, второй – в 3,7 раза и т.д.). В целом гистограмма углового распределения демонстрирует ингибирование фототопотаксиса D. salina при включении внешнего электрического поля напряженностью 20 В/м и восстановление фототопотаксиса через 2 мин после его выключения.

- 59 Рис.5.2. Влияние внешнего электрического поля, напряженностью 20 В/м, приложенного к суспензии водорослей, на угловое распределение клеток и интенсивность фототопотаксиса D. salina: 1 – поле выключено;

2 – поле включено. Стрелка указывает направление распространения стимулирующего света (освещенность 500 лк).

.Внешние электрические поля оказывают определенное влияние на движущиеся под воздействием света микроорганизмы. Это объясняется участием биоэлектрических процессов в различных типах фотодвижения микроорганизмов, что подтверждается результатами ряда работ [Marbach, Mayer, 1971;

Litvin et al., 1978;

Nultsch, Hder, 1979;

Синещеков, Литвин, 1982;

Dolle, Nultsch, 1988]. Так, метод экстраклеточной регистрации биопотенциалов на одиночной клетке позволил связать биоэлектрические реакции с фотодвижением зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [Litvin et al., 1978]. Приложение внешнего постоянного или низкочастотного электрического поля ингибирует отрицательные фотофобические реакции синезеленой водоросли Phormidium uncinatum [Nultsch, Hder, 1979].

Фототопотаксис Chlamуdomonas reinhardtii обратимо подавляется при наложении электрического поля [Nultsch, Hder, 1979]. В. Нулч [Nultsch, 1983] выдвинул гипотезу, согласно которой после поглощения фоторецепторной молекулой кванта света происходит ее возбуждение, что сопровождается конформационными изменениями фоторецепторных белков. Это, в свою очередь, приводит к отпиранию кальциевых каналов в области плазматической мембраны, покрывающей стигму, и потоку ионов кальция внутрь клетки. Плазматическая мембрана локально деполяризуется, что вызывает соответствующее отпирание кальциевых каналов в жгутиковой мембране, поток ионов кальция к аксонеме жгутиков и биение последних. Ингибирование фотопототаксиса Сhlamydomonas внешним электрическим полем интерпретируется как результат изменения мембранного потенциала, участвующего в сенсорном преобразовании [Marbach, Mayer, 1971], или как конкуренция фототопотаксиса и гальванотаксиса [Ekelund et al., 1988]. Подобная связь фотореакций и изменений фотоиндуцированных мембранных потенциалов обнаружена также у бактерий и простейших.

Анализ полученных нами результатов по исследованию влияния электрических полей на фотодвижение Dunaliella и данных, касающихся Chlamydomonas [Marbach, Mayer, 1971;

Dolle, Nultsch, 1988] и Haematococcus [Litvin et al., 1978], позволяет заключить, что, по всей вероятности, этим водорослям присуще участие электрических потенциалов (в частности, потенциала действия, возникающего в ответ на световой стимул) в процессах фоторегуляции движения водорослей;

наложение внешнего электрического поля вызывает нарушение распространения этих потенциалов от рецептора до жгутикового аппарата и, как следствие, подавление фототопотаксиса.

- 60 5.3. ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ Активная реакция среды, зависящая от концентрации водородных ионов (Н+) и измеряемая в единицах рН, - один из наиболее фундаментальных факторов жизнедеятельности организмов в разных ее проявлениях. Существует обширная литература, освещающая влияние рН на рост, развитие, темпы размножения, продукцию биомассы в культурах водорослей (Масюк, Юрченко, 1962;

Wegmann,1968;

Wegmann, Metzner, 1971;

Malis-Arad et al., 1980;

Goldman et al., 1982а, 1982б;

Ghazi et al., 1983;

De Busk, Ryther, 1984;

Gimmler, Weis, 1992;

Lustigman et al., 1995) и их распространение в природе (Масюк, 1973;

Lopez Archilla, Amils, 1999;

Lopez-Archilla et al., 2001;

Topics, http://www.bio.uni-potsdam.de/oeksys/ fsvte.htm), на синтез пигментов (Ghazi et al., 1983), интенсивность фотосинтеза (Wegmann, 1968;

Wegmann, Metzner, 1971;

Gimmler, Weis, 1992), активность ферментов (Миронюк та ін.,1980), транспорт ионов (Балнокин и др., 1983;

Lukas et al., 1986;

Pick, 1992), на скорость движения цитоплазмы [Masashi, Teruo, 1982]. Изучают соотношение рН среды обитания и концентрации водородных ионов внутри клеток водорослей (Beardall, Entwisle, 1984;

Braun, Hegemann, 1999), в цитозоле и вакуолях с клеточным соком (Кuchitsu et al., 1989), трансмембранный электрический потенциал ацидофильных видов (Remis et al., 1992) и роль трансмембранного протонового насоса в регуляции внутриклеточного рН (Sanders et al., 1981). В последнее время особое внимание уделяют механизмам, обеспечивающим гомеостаз Н+ в цитозоле ацидофильных и гипергалобных видов водорослей, в т.ч. на молекулярном уровне (Sekler et al., 1991, 1994;

Gimmler, Weis, 1992;

Pick, 1992, 1999;

Weiss, Pick, 1996;

Ohta et al., 1997;

Messerli et al., 2005;

Topics…, http://www.bio.uni potsdam.de/oeksys/fsvte.htm;

Pick et al., http://www.weizmann.ac.il/ Biological_Chemistry/ scientist /Pick/uri_pick.html;

Pick et al., http://bioinformatics. weizmann.ac.il/ _Is/uri_pick/uri_pick.html).

Вместе с тем, данные о влиянии рН на параметры фотодвижения водорослей, в частности гипергалобных видов Dunaliella, весьма скудны. Установлены лимиты рН, за пределами которых клетки D. salina (Масюк, Юрченко, 1962] и D. viridis Teod. (Baas-Becking, 1930) теряли подвижность и вскоре погибали. Однако зависимости степени подвижности этих водорослей, скорости движения их клеток и фoтотопотакcиcа от рН среды в указанных интервалах остаютcя неизученными.

В данном разделе освещены результаты исследования зависимости различных параметров фотодвижения гипергалобного каротиноносного вида D. salina от значений рН среды (Масюк, Посудин, 2007).

Зависимость параметров фотодвижения D. salina (скорости поступательного движения клеток V, мкм/м;

фототопотакcиса F и относительного числа подвижных Nm/N0, % или неподвижных Nim/N0, % клеток) от рН среды исследовали, варьируя рН среды от 2,95 до 9,50 c помощью концентрированных щелочи (КОН) или кислоты (НСl). Градиент рН в незабуференной среде задавали в начале опыта и далее не корректировали.

Измерения рН среды производили рН-метром рН340 в конце первых, седьмых и двадцатых суток после внесения инокулята.

К концу первых суток после посева клетки D. salina проявляли подвижность в области 2,95 рН 9,50. В первом варианте с начальным рН 2,95 в конце первых суток все клетки были неподвижными (Nim/N = 100 %), деформированными и впоследствии полностью разрушились. В остальных вариантах водоросли проявляли способность к фотодвижению в разной степени, причем рН-оптимумы для разных параметров фото-движения были неодинаковыми (рис. 5.3). Оптимум рН для подвижности клеток Nm/N0 = 100 %;

Nim/N = 0) отмечен при рН 6,8;

для фототопотаксиса (F = 0,7) - при рН 7,35;

для скорости поступательного движения клеток (V = 47 ± 2 мкм/с) - при рН 8,00 (см. рис. 5.3).

Область значений рН, при которых число подвижных клеток D. salina составляла не менее 80 % (а неподвижных не прeвышало 20 %), была довольно широкой: 3,26 рН 9,32. За пределами этой области числo неподвижных клеток резко возрастало. Область значений рН, при которых скорость поступательного движения клеток D. salina составляла не менее 80 % максимальных значений, находится в интервале 5, рН 8,40, a для фототопотаксиса эта область еще уже: 5,70 рН 8,20 (см. рис. 5.3).

За пределами указанных интервалов скорость поступательного движения клеток постепенно снижалась (более медленно в сторону низких значений рН, быстрее - в сторону высоких), а способность к - 61 фототопотакcису резко падала.

Таким образом различные параметры фотодвижения обладают не только разными рН-оптимумами, но и разной чувствительностью к воздействию экстремальных значений этого фактора: наиболее чувствительным оказался фототопотаксис (F), наименее - подвижность (Nm/N0);

скорость поступательного движения клеток (V) занимает по этому признаку промежуточное положение между двумя другими параметрами. Полученные данные свидетельствуют в пользу нашего предположения (Посудин и др., 1992, 1995, 2004;

Масюк и др,, 2006) о том, что регуляция различных параметров фотодвижения может осуществляться разными путями и обладать различными механизмами.

Рис.5.3. Зависимость скорости V поступательного движения (1), фототопотаксиса F (2) и относительного числа Nim/N (3) неподвижных клеток Dunaliella salina от рН среды в конце первых суток после начала опыта. На вертикальной оси слева - значения скорости V поступательного движения (мкм/с) и уровни фотопотаксиса F (отн. ед.);

справа относительное число Nim/N0 неподвижных клеток;

на горизонтальной оси - значения рН.

Довольно широкие пределы толерантности D. salina к первоначально заданным рН незабуференной среды (2,95 рН 9,50) объясняются, с одной стороны, наличием внутриклеточных механизмов, обеспечивающих гомеостаз концентрации Н+ в цитозоле клеток этого вида на уровне рН 7,1 независимо от рНсредывизвестныхпределах(Рicketal.,http://www.weizmann.ac.il/Biological_Chemistry/scientist/Pick/uri_pick.h tml). С другой стороны, в процессе культивирования D. salina происходят изменения первоначально заданных значений рН среды (табл. 5.1).

Как видно из табл. 5.1, в кислых, нейтральных и слабо щелочных средах значение рН увеличивалось, в щелочных и сильно щелочных, наоборот, уменьшалось. Наибольшие изменения рН (разница +2,20 и -1,08 единицы рН) наблюдались в крайних вариантах с кислой или высокощелочной средами, наименьшее - в варианте с начальным значением рН 8,1 (0,05) (см. табл. 5.1). В результате этих изменений к концу 20-х суток опыта значения рН в разных вариантах устанавливались в пределах 6,50-8,47, пригодных для жизнедеятельности данного вида. Примерно в этих пределах рН 6,5-9,5 зафиксирована вегетация D. salina в природе (Масюк, 1973).

- 62 Таблица 5.1. Изменения рН среды в процессе культивирования Dunaliella salina в течение 20-суточного эксперимента Время Значения рН контроля, сутки 1 -е 4,30 5,30 6,29 6,80 7,35 8,10 8,25 8,35 9,15 9,40 9, 2, 7-е 5,10 6,00 6,70 7,20 7,70 8,10 8,20 8,30 8,25 9,10 9, 20-е 6,50 7,25 7,70 7,87 8,07 8,15 8,15 8,17 8,35 8,47 8, Разниа - -0,10 -0,18 -0,8 -0,93 -1, значений рН в 2,20 1,95 1,50 1,07 0,72 0, конце 20-х и 1 х суток П р и м е ч а н и е : прочерки означают отсутствие подвижных клеток водоросли.

Оптимумы рН для подвижности и фототопотаксиса D. salina не совпадают с таковыми для роста культуры этого вида (Масюк, Юрченко, 1962) и активности каталазы D. salina (Миронюк и др., 1980);

рН оптимум для скорости поступательного движения клеток (8,00) наблюдается в варианте, претерпевающем наименьшие изменения рН в ходе культивирования и находится в пределах ростового оптимума 8- (Масюк, Юрченко, 1962). Очевидно, именно эти показатели (скорость поступательного движения клеток, минимальные изменения первоначально заданного рН незабуференной среды наряду с ростовым оптимумом рН) могут быть полезными критериями при подборе оптимальных условий для промышленного культивирования гипергалобных каротиноносных водорослей.

Таким образом, клетки гипергалобного вида Dunaliella salina проявляют подвижность в области первоначально заданных рН незабуференной среды 2,95 рН 9,50. В процессекультивирования во всех вариантах, кроме крайнего (рН 2,95) наблюдается саморегуляция среды, в пределах рН 6,5-8,47, благоприятных для роста культуры и подвижности клеток водорослей.

Степень чувствительности к концентрации водородных ионов и оптимумы рН для разных параметров фотодвижения не совпадают, что подтверждает возможность существования разных механизмов управления этими параметрами.

Параметры фотодвижения, в первую очередь, скорость поступательного движения клеток, могут быть полезными критериями пригодности сред для промышленного культивирования каротиноносных жгутиковых водорослей (Масюк, Посудин, 2007).

5.4. ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ Поскольку подвижные микроорганизмы, демонстрирующие фотодвижение, испытывают в природных условиях одновременное воздействие нескольких внешних факторов, исследование и учет их совместного влияния на параметры фотодвижения представляет актуальную задачу.

Методика измерений. Цель экспериментов - исследование зависимости скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F двух видов Dunaliella от одновременного воздействия освещенности клеток белым светом, температуры воздуха и напряженности внешнего электрического поля.

Для этого кювету с суспензией клеток водоросли, оснащенную двумя электродами (описание ее дано в разд.

5.2), размещали на предметном столике микроскопа, который, в свою очередь, помещали в термостат.

Термостат был оборудован окном для пропускания белого света, который направляли под углом 30 0 к поверхности предметного стекла с суспензией водорослей. Контроль температуры в термостате с точностью ±1 0С осуществляли с помощью электроконтактного термометра типа ТПК-3П-128.

- 63 Величины внешних факторов варьировали на двух дискретных уровнях – минимальных (освещенность l = 100 лк;

температура t = 18 0С;

напряженность электрического поля е = 0 В/м) и максимальных (освещенность L = 500 лк;

температура T = 30 0С;

напряженность электрического поля E = 2,4 В/м). Измерения параметров V и F проводили для всех возможных комбинаций внешних факторов: l-e-t, L-e-t, l-E-t, L-E-t, l-e-T, L-e-T, l-E-T, L-E-T.

Для обработки полученных нами экспериментальных данных [Мартыненко и др., 1996;

Martynenko et al., 2000] был использован метод множественной регрессии, позволяющий учесть влияние отдельных внешних факторов и их комбинаций на параметры фотодвижения [Мельников и др., 1972;

Mosteller et al., 1978]. Анализ данных проводили в рамках линейной регрессионной модели;

значимость коэффициентов модели оценивали при помощи критерия Фишера, а адекватности – критерия Кохрена. Уравнения регрессии содержали члены со статистически значимыми коэффициентами.

Результаты и обсуждение. Результаты измерений скорости V поступательного движения клеток и параметра F, характеризующего фототопотаксис двух видов Dunaliella, в зависимости от всех возможных комбинаций внешних факторов представлены в табл. 5.2–5.5, где Х1 – уровень освещенности, Х2 – напряженность электрического поля, Х3 – температура, V и F – средние значения параметров фотодвижения, SV и SF – их среднеквадратичные отклонения.

Зависимость скорости V поступательного движения клеток двух видов Dunaliella от внешних параметров (уровня освещенности L, температуры T и напряженности электрического поля E) описывается следующими регрессионными уравнениями:

D. salina: V = 34,8 + 0,6L – 0,62E – 1,66T + 1,3(LE) – 0,6(LТ) – 0,8(LET);

( 5.1 ) D. viridis: V = 37,6 – 0,6L + 2,0T – 2,6(ET) + 0,53(LET). ( 5.2 ) Как видно, наибольший вклад в данные уравнения вносит свободный член (собственная скорость движения клеток), не зависящий от внешних факторов и равный 34,8 для D. salina и 37,6 для D. viridis.

Весовые коэффициенты при переменных L, E и T определяют вклад каждого из факторов в изменение скорости движения V. Как видно из уравнения ( 5.1 ), наибольшее влияние на скорость движения клеток D.

salina оказывает температура, причем ее возрастание в указанных выше пределах приводит к уменьшению скорости (коэффициент равен –1,66). Освещенность и электрическое поле выступают в роли альтернативных факторов: скорость D. salina возрастает при увеличении освещенности (+0,6) и уменьшается при увеличении напряженности электрического поля (-0,62). Взаимодействие этих двух факторов также оказывается существенным (+1,3) и приводит к увеличению скорости движения клеток.

Эффекты взаимодействия освещенности и температуры (-0,6) и тройного взаимодействия света, электрического поля и температуры (-0,8) направлены на уменьшение скорости движения, т.к. входят в уравнение регрессии с отрицательным знаком. Таким образом, для культуры D. salina эффекты взаимодействия указанных факторов являются статистически значимыми и соизмеримыми с влиянием отдельных факторов.

Как видно из уравнения (5.2), кинетические реакции D. viridis на те же внешние факторы иные, чем у D. salina. Повышение температуры (в указанных пределах) не замедляет, а ускоряет движение клеток;

освещенность выступает в качестве альтернативного фактора: при возрастании освещенности движение клеток замедляется. Наиболее существенное влияние оказывает возрастание температуры, приводящее к увеличению скорости (весовой коэффициент равен +2,0), и взаимодействие напряженности электрического поля и температуры, которое приводит к замедлению скорости движения клеток этого вида (весовой коэффициент равен -2,6). Уровень освещенности направлен на уменьшение (–0,6), а тройное взаимодействие освещенности, напряженности электрического поля и температуры – на увеличение скорости движения (+0,5). Таким образом, для культуры D. viridis эффекты взаимодействия факторов также являются статистически значимыми и соизмеримыми с влиянием отдельных факторов, однако их - 64 воздействие на скорость движения клеток D. viridis противоположно тому, что наблюдается в культуре D.

salina. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях одного природного водоема эти близкие виды могут занимать различные экологические ниши, что подтверждает наши наблюдения в природе [Масюк, 1973].

Зависимость фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от внешних факторов представлена следующими регресионными уравнениями:

D. salina: F = 0,07 – 0,07E + 0,09(ET);

( 5.3 ) D. viridis: F = 0,07 – 0,125Е + 0,079Т + 0,148(ET). ( 5.4 ) Таблица 5.2. Зависимость скорости V поступательного движения клеток D. salina от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х V Х1 Х2 Х3 V1 V2 V3 SV L e t 38,200 39,900 37,30 38,467 1, L e t 45,800 35,700 37,100 39,533 2, L E t 40,900 31,700 32,700 35,100 2, L E T 40,400 37,800 38,000 38,733 2, L e T 35,300 33,200 33,000 33,833 1, L e T 33,800 32,000 32,700 32,833 0, L E T 33,700 32,300 31,200 32,400 1, L E T 33,200 33,600 33,700 33,500 0, Таблица 5.3. Зависимость скорости V поступательного движения клеток D. viridis от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х V Х1 Х2 Х3 V1 V2 V3 SV L e t 30,900 32,000 34,900 32,600 4, L e t 33,200 33,100 31,700 32,667 0, L E t 36,700 40,600 39,900 39,067 4, L E T 38,000 36,900 38,600 37,833 0, L e T 44,200 42,300 43,000 43,500 0, L e T 39,900 40,600 40,100 40,200 0, L E T 37,700 38,000 36,900 37,533 0, L E T 36,909 38,000 36,700 37,200 0, Из уравнения (5.3) видно, что определяющим для фототопотаксиса D. salina фактором является напряженность электрического поля, повышение которой оказывает ингибирующее действие (коэффициент равен –0,07);

повышение температуры снимает ингибирующий эффект электрического поля и стимулирует фототопотаксис D. salina (+0,09). Вместе с тем, для этого вида влияние температуры на фототопотаксис не является определяющим.

- 65 Уравнение (5.4), полученное для D. viridis, показывает, что как и в случае D. salina, электрическое поле ингибирует фототопотаксис (-0,125). В отличие от D. salina, повышение температуры положительно влияет на фототопотаксис D. viridis (+0,079). Наибольший эффект оказывает взаимодействие обоих факторов (+0,148): при напряженности электрического поля, равной 2,4 В/см, и возрастании температуры до 30 0С фототопотаксис возрастает.

Такой сложный характер воздействия внешних факторов на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella можно объяснить, на наш взгляд, следующим образом. Как показано в наших предыдущих исследованиях, скорость движения клеток обоих видов зависит от освещенности суспензии водорослей Dunaliella, причем максимум двигательной активности клеток приходится на область150-550 лк [Посудин и др., 1988].

Зависимость скорости движения клеток от температуры также характеризуется максимальным значением скоростей в области температур 20-30 0С (там же).

Таблица 5.4. Зависимость фототопотаксиса F клеток D. salina от совместного действия внешних факторов:

освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х F Х1 Х2 Х3 F1 F2 F3 SF L e t 0,110 0,190 0,240 0,180 0, L e t 0,310 0,360 0,270 0,313 0, -0, L E t 0,160 0,030 0,003 0, -0,140 -0,250 -0,097 -0, L E T 0, -0, L e T 0,140 0,200 0,063 0, -0,090 -0, L e T 0,000 0,060 0, L E T 0,020 0,120 0,160 0,100 0, Таблица 5.5. Зависимость фототопотаксиса F клеток D. viridis от совместного действия внешних факторов:

освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х F Х1 Х2 Х3 F1 F2 F3 SF L e t 0,240 0,260 0,200 0,233 0, L e t 0,250 0,270 0,180 0,233 0, -0,280 -0,330 -0, L E t 0,140 0, -0,570 -0,360 -0,190 -0, L E T 0, -0, L e T 0,100 0,330 0,107 0, -0, L e T 0,500 0,260 0,087 0, L E T 0,210 0,200 0,200 0,203 0, Максимальные значения положительного фототопотаксиса достигаются при освещении образца белым светом 500 лк;

при освещенности 1500 лк фототопотаксис отсутствует, а при дальнейшем повышении освещенности он становится отрицательным [Посудін та ін., 1991]. Приложенное к образцу электрическое поле (см. разд. 5.2) ингибирует фототопотаксис.

- 66 Используемые в наших экспериментах пределы изменения освещенности образца (100 и 500 лк) и температуры (18 и 30 0С) находятся, как видно, вблизи максимальных точек зависимости параметров фотодвижения исследуемых видов водорослей от внешних факторов, которые могут конкурировать и друг с другом, и с электрическим полем, усиливая или ослабляя воздействие других факторов на параметры фотодвижения при совместном действии. Подобные конкурирующие и зачастую противоположные действия внешних факторов объясняют различия в экологии и поведении этих видов в условиях естественных бассейнов [Масюк, 1973].

5.5. ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ Солнечное излучение является одним из важнейших внешних факторов, влияющих на жизнедеятельность и поведение высших и низших растений. Cпектральный состав солнечного излучения характеризуется наличием ультрафиолетового (200-400 нм), видимого (400-800 нм) и инфракрасного (800 нм - 50 мкм) диапазонов. Солнечное излучение существенно воздействует на подвижных обитателей водных экосистем, в частности, на параметры фотодвижения водорослей – подвижность, фототопотаксис и скорость движения клеток.

Ультрафиолетовое излучение делят на три спектральные области в зависимости от характера воздействия этого излучения на биологические объекты [Foster, Lning, 1996]: УФ-А (320-400 нм), УФ-В (280-320 нм) и УФ-С (200-280 нм). В природных условиях ультрафиолетовое излучение в области УФ-С, которое характеризуется наименьшей длиной волны и, следовательно, обладает наибольшей энергией, достаточной для стимулирования ионизационных процессов в верхней атмосфере, не достигает земной поверхности за счет поглощения слоем атмосферного озона. Что же касается ультрафиолетового излучения в УФ-В области, то оно достигает поверхности Земли, причем интенсивность излучения существенно зависит от широты местности, высоты стояния Солнца, облачности, отражательной способности поверхности и толщины озонового слоя. Именно истощение последнего приводит к увеличению интенсивности падающего на земную поверхность УФ-В излучения, которое чрезвычайно пагубно действует на живые организмы, что объясняется поглощением излучения молекулами нуклеиновых кислот и белков [Hder, 1996b]. Поглощение более длинноволнового УФ-А излучения осуществляется в основном молекулами с двойными сопряженными связями, циклическими и полициклическими структурами, к которым относятся изопреноиды, флавины, хиноны, алкалоиды, а у фототрофных организмов – хлорофилл [Garcia-Pichel, 1996];

таким образом, воздействие ультрафиолетового излучения в диапазоне 320-400 нм приводит к подавлению фотосинтеза, обесцвечиванию фотопигментов и, следовательно, к уменьшению первичной продукции [Hder, 1991, 1995, 1996b;

Hder et al., 1995;

Ekelund, 1996]. Ингибирующее действие искусственного УФ-В излучения на водоросли усиливается с уменьшением длины волны и, соответственно, с увеличением энергии излучения.

Ультрафиолетовое излучение (как природное, так и искусственное) также оказывает существенное влияние на поведенческую стратегию и продуктивность водорослей. Имеются данные об ингибирующем действии природного и искусственного ультрафиолетового излучения на фотосинтетическую активность и ориентационное поведение водорослей, в частности, на подвижность и фототопотаксис Euglena gracilis [Hder, 1985;

Hder, 1986a;

Hder, Hder, 1988];

фотосинтез, белковый и пигментный состав Euglena gracilis [Gerber, Hder, 1992], гравитаксис Euglena gracilis [Hder, Shi-Mei Liu, 1990], подвижность Astasia longa [Hder, Hder, 1989a], фотоориентацию, подвижность и пигментацию Peridinium gatunense [Hder et al.,1990], и Cryptomonas sp. [Hder, Hder, 1989b, 1990, 1991], фотодвижение и пигментацию Gyrodinium - 67 dorsum [Ekelund, Bjorn, 1990], подвижность Phormidіum uncinatum [Hder et al., 1986], фотосинтез Laminaria digitata [Foster, Lning, 1996] и Dictyota dichotoma [Flores-Moya et al., 1999], подвижность Dunaliella bardawil [Jimenez et al., 1996], жгутиковый аппарат Chlamydomonas reinhardtii [Donk, Hessen, 1996], фиксацию неорганического углерода морской водорослью Dunaliella tertiolecta [Beardall et al., 2002].

Мы исследовали зависимость фототопотаксиса двух видов Dunaliella от длины волны стимулирующего бокового излучения [Посудин и др., 1990]. Для сопоставления наших результатов с полученными П. Хэллдэлом для Tetraselmis hazenii (= Platymonas subcordiformis) – водоросли, спектр действия фототопотаксиса которой простирается и в ультрафиолетовую область [Halldal, 1961], мы также изучали другой вид того же рода - Tetraselmis viridis (Rouch.) Norris et al. (= Platymonas viridis Rouch.). Было показано отсутствие фототопотаксиса у двух видов Dunaliella в ультрафиолетовой области спектра, где флавины имеют два интенсивных максимума поглощения и сделан вывод, что не флавины, а каротиноиды являются фоторецепторными пигментами, ответственными за фототопотаксис двух видов Dunaliella;

в то же время, фототопотаксис в ультрафиолетовой области спектра присущ, по всей вероятности, роду Tetraselmis [Посудин и др., 1990].

В данном разделе освещаются результаты исследования влияния предварительного облучения суспензии водорослей из рода Dunaliella искусственным ультрафиолетовым изучением различной интенсивности, длины волны и продолжительности облучения с последующим измерением параметров фотодвижения под действием бокового белого света;

освещенность образца составляла 500 лк, температура в процессе измерений равнялась 18-20 0С [Посудин и др., 2004]. Использование искусственных источников ультрафиолетового излучения позволит приблизиться к пониманию роли природного ультрафиолетового излучения для жизнедеятельности и фотоповедения Dunaliella в поисках оптимальных условий существования.

Методика измерений. В данных исследованиях в качестве источника ультрафиолетового излучения был использован осветитель ОРК-21, спектр излучения которого занимает область 250-350 нм. Изучали зависимость параметров фотодвижения двух видов Dunaliella, в частности, скорости V поступательного движения, фототопотаксиса F и относительной подвижности Nm /N0 (где Nm – количество подвижных клеток, N0 – общее число клеток) от интенсивности предварительного ультрафиолетового излучения, которую регулировали в пределах от 0,76 до 11 Вт/м2 путем изменения расстояния между источником излучения и объектом исследования. Интенсивность ультрафиолетового излучения оценивали с помощью дозиметра ДАУ-81.

Зависимость параметров фотодвижения водорослей от времени облучения исследовали в пределах от 0 до 10 мин. Спектральную чувствительность параметров фотодвижения Dunaliella определяли с помощью интерференционных фильтров, которые размещали между источником ультрафиолетового излучения и объектом. Максимумы пропускания этих фильтров приходились на такие длины волн (нм): 248, 280, 302, 313, 334 и 365. Продолжительность облучения культуры водорослей в этом случае была 5-10 мин.

Контролем во всех экспериментах служили параметры фотодвижения клеток необлученных культур Dunaliella spp. в условиях освещения боковым белым светом при освещенности образца 500 лк и температуре окружающего воздуха 18-20 0С [Посудин и др., 2004].

- 68 Рис. 5.4. Зависимость скорости V поступательного движения (а) и фототопотаксиса F (б) клеток двух видов Dunaliella от интенсивности (І) предварительного нефильтрованного ультра-фиолетового излучения (в диапазоне длин волн 250-350 нм) продолжительностью 5 мин. (-- - Dunaliella salina;

-- - Dunaliella viridis;

К – контроль).

Все измерения повторяли по три раза для определения средних величин измеряемых параметров и погрешностей измерений.

Результаты и обсуждение. Зависимость скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от интенсивности І нефильтрованного ультрафиолетового излучения представлена на рис. 5.4;

видно, что значения скорости V поступательного движения обоих видов не изменяются при увеличении интенсивности излучения в указанных пределах, тогда как фототопотаксис F подавляется высокими (в пределах от 2 до 11 Вт/м2) интенсивностями ультрафиолетового излучения.

Зависимость скорости V поступательного движения, фототопотаксиса F и относительной подвижности Nm/N0 клеток двух видов Dunaliella от продолжительности t облучения нефильтрованным ультрафиолетовым излучением интенсивностью до 10 Вт/м2 представлена на рис. 5.5.

- 69 Рис. 5.5. Зависимость скорости V поступательного движения (а), фототопотаксиса F (б) и относительной подвижности Nm /N0 (в) клеток двух видов Dunaliella от продолжительности t предварительного воздействия нефильтрованого ультрафиолетового излучения (в диапазоне длин волн 250-350 нм) интенсивностью 10 Вт/м2 (-- D. salina;

-- -D. viridis;

К – контроль).

В сравнении с контрольным образцом скорость V подвижных клеток обоих видов не изменяется при предварительном облучении в течение 10 мин, не выходя за пределы ошибок измерения, тогда как фототопотаксис F и относительная подвижность Nm /N0 ингибируются на протяжении 7-10 мин облучения.

Это свидетельствует о различиях механизмов, управляющих скоростью поступательного движения (параметр V), с одной стороны, фотоориентацией (параметр F) и подвижностью клеток (параметр Nm/N0) - с другой стороны. Нельзя исключить возможные различия в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за скорость поступательного движения и фотоориентацию клеток. Эти данные согласуются с результатами наших исследований, посвященных влиянию рН среды и ионизирующего излучения на параметры фотодвижения Dunaliella [Посудин и др., 1992;

Масюк, Посудин, 2007] (см. разд. 5.3 и 5.6).

В литературе имеются данные о влиянии природного солнечного и ультрафиолетового излучений на скорость поступательного движения и фототопотаксис Euglena gracilis [Hder, 1986а]: средняя скорость - 70 поступательного движения клеток E. gracilis составляла 120 мкм/с;


лишь через 1,5-2 часа воздействия солнечного излучения и подвижность, и фототопотаксис, и скорость движения клеток уменьшались до нуля.

Использование искусственного озонового фильтра (кюветы, заполненной озоном в концентрации мкг/мл), который уменьшал на 5 % интенсивность УФ-В (290-320 нм) компоненты солнечного излучения (по оценкам автора интенсивность УФ-В компоненты составляет 1,2 Вт/м2), приводило к увеличению жизнеспособности клеток (через 3 часа после облучения оставалось 50 % подвижных клеток) и к уменьшению скорости поступательного движения за этот промежуток времени до 80 % от начальной величины. Если же кювету с суспензией водорослей покрывали стеклом (которое не пропускает ультрафиолетовое излучение), то фототопотаксис E. gracilis достигал значений, типичных для контрольных, необлучаемых образцов [Hder, 1986а].

Такую зависимость параметров фотодвижения E. gracilis нельзя объяснить избыточным поглощением световой энергии хлорофиллом, поскольку клетки Astasia longa, лишенные пигментов, и E.

gracilis, обесцвеченные в темноте, демонстрировали такую же реакцию на ультрафиолетовое облучение [Hder, 1986а]. Ингибирование подвижности и скорости поступательного движения при воздействии солнечного нефильтрованного излучения в течение нескольких часов демонстрируют также водоросли Peridinium gatunense, Cryptomonas spp., Gyrodimium dorsum, Cyanophora paradoxa [Hder, 1991]. Воздействие нефильтрованного солнечного излучения приводило к иммобилизации клеток Сryptomonas maculata через 140 мин, а нефильтрованного искусственного ультрафиолетового излучения – через 60 мин [Hder, Hder, 1991]. Различие полученных нами данных с результатами исследований, приведенными выше, можно объяснить тем, что в наших экспериментах использовалось нефильтрованное ультрафиолетовое излучение более высокой (до 10 Вт/м2) интенсивности. Тот факт, что фототопотаксис F и относительная подвижность Nm /N0 ингибируются на протяжении 10 мин УФ облучения свидетельствует о том, что, вероятно, решающим фактором, оказывающим влияние на параметры фотодвижения водорослей, является доза D облучения, которая определяется как D = It, где I - интенсивность ультрафиолетового излучения, а t - его продолжительность: для упомянутых выше водорослей использованная доза D = 1 Вт/м2120 мин была одного порядка с дозой D = 10 Вт/м210 мин в наших экспериментах.

Рис. 5.6.Зависимость скорости V поступательного движения (а,в) и фототопотаксиса F (б, г) клеток Dunaliellasalina (а, б) и D. viridis (в, г) от длины волны l ультрафиолетового излучения (интенсивностьизлучения 2 Вт/м2;

продолжительность облучения 5 минут;

к – контроль).

Что касается скорости поступательного движения Dunaliella, отличие наших результатов от данных Хэдера [Hder, Hder, 1991] возможно объясняется тем, что мы измеряли скорость индивидуальных клеток, сохранявших подвижность, а не среднюю скорость клеток в суспензии, которая оценивается системой видеомикрографии;

в наших опытах даже при небольшом количестве оставшиеся подвижными клетки сохраняли скорость на постоянном уровне.

- 71 Зависимость скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от длины волны ультрафиолетового излучения (интенсивностью 2 Вт/м2) представлена на рис. 5. (продолжительность предварительного облучения 5 мин) и рис. 5.7 (продолжительность предварительного облучения 10 мин).

Рис. 5.7. Зависимость скорости V поступательного движения (а, в) и фототопотаксиса F (б, г) клеток Dunaliella salina (а, б) и Dunaliella viridis (в, г) от длины волны l ультрафиолетового излучения (интенсивность излучения 2 Вт/м2;

продолжительность облучения 10 мин;

к – контроль).

Нами не установлена зависимость скорости V поступательного движения D. salina (рис. 5.6, а) и D.

viridis (рис. 5.6, в) от длины волны ультрафиолетового излучения. В то же время, воздействие монохроматического излучения ультрафиолетовой области спектра на фототопотаксис F двух видов Dunaliella неоднозначно – 5-минутное облучение приводит к уменьшению уровня фотоориентации (параметра F) ниже контрольных значений вплоть до появления отрицательных значений фототопотаксиса F: в области 248-334 нм у D. salina (рис. 5.6, б) и 248 нм у D. viridis (рис. 5.6, г). Более продолжительное (в течение 10 мин) облучение двух видов Dunaliella приводит к полному ингибированию фототопотаксиса: в области 248-280 нм у D. salina (рис. 5.7, б) и 248-334 нм у D. viridis (рис. 5.7, г).

Ультрафиолетовое облучение в области 302-365 нм (D. salina) и 365 нм (D. viridis) в течение 10 мин вызывает у обоих видов отрицательный фототопотаксис. Мы не встречали в литературных источниках сведений о преобразовании положительного фототопотаксиса водорослей в отрицательный под воздействием ультрафиолетового облучения с последующим ингибированием фототопотаксиса при увеличении продолжительности облучения. Исследования спектральной чувствительности водоросли Euglena gracilis к ультрафиолетовому излучению показали, что излучение в полосе 295 нм и ниже также является ингибирующим для подвижности и фотоориентации клеток водоросли [Hder, 1985].

Следует отметить, что значения параметра F восстанавливаются до контрольных значений на всех исследуемых длинах волн (кроме 248 нм) через два часа после прекращения облучения интенсивностью Вт/м2 (рис. 5.8). Способность к восстановлению фототопотаксиса через 24 часа после прекращения совместного воздействия в течение 10 часов излучения видимого и ультрафиолетового диапазонов демонстрируют также клетки Dunaliella bardawil;

интенсивность излучения составляла 26,01 Вт/м2 для комбинации видимого и УФ-А излучений и 39,72 Вт/м2 для комбинации видимого, УФ-А и УФ-В излучений [Jimenez et al., 1996].

- 72 Существует несколько гипотез относительно воздействия ультрафиолетового излучения на водоросли. Согласно одной из них основной мишенью воздействия ультрафиолетового излучения является молекула ДНК;

в пользу этого суждения свидетельствует совпадение спектра поглощения ДНК и спектра действия ингибирования подвижности Euglena gracilis [Yammamoto et al., 1983]. Однако, как было показано позднее [Hder, 1991], тонкая структура спектра действия ингибирования подвижности E. gracilis характеризуется наличием основного максимума при 270 нм, который входит в УФ-С область, небольшого максимума при 305 нм и плеча при 290 нм (входящими в УФ-В область) и не соответствует спектру поглощения ДНК [Jagger, 1983]. Кроме того, против участия ДНК как УФ-мишени свидетельствует слишком быстрое подавление подвижности клеток E. gracilis. Еще одна гипотеза основывается на возможном разрушении клеток за счет фотодинамического эффекта, вызванного совместным действием оптического (в данном случае – ультрафиолетового) излучения и химических соединений.

Предполагается, что ультрафиолетовое излучение поглощается соответствующей молекулой фоторецептора, которая переходит с основного состояния в возбужденное;

если возбужденная молекула не затрачивает свою энергию на фотохимические реакции или теплоту, то возможна передача ее энергии молекуле фотосенсибилизатора, что сопровождается образованием синглетного кислорода 1О2 [Maurette et al., 1983] или свободных радикалов [Spikes, 1977], обладающих сильными реактивными свойствами и участвующих в разрушении мембран и других клеточных компонентов.

Однако, против этой гипотезы свидетельствуют результаты экспериментов с использованием специфических диагностических реагентов и тушителей синглетного кислорода и свободных радикалов, которые не увеличивали жизнеспособность облученных клеток водорослей [Hder et al., 1986;

Hder, Hder, 1988b]. Более того, добавление тяжелой воды D2O, которая увеличивает время жизни синглетного кислорода на порядок, не повлияло на ингибирующее действие ультрафиолетового излучения [Hder, 1991], что также исключает механизм фотосенсибилизации.

Рис. 5.8. Фототопотаксис Dunaliella salina (а) и D.

viridis (б) спустя 2 часа после прекращения 10 минутного ультрафиолетового облучения интенсивностью 2 Вт/м.

Возможным приемлемым механизмом воздействия ультрафиолетового излучения на фотодвижение водорослей можно считать воздействие этого излучения на белки, связанные с двигательным аппаратом водоросли, управляющим биениями жгутиков, или/и с фоторецепторной системой. Об этом - 73 свидетельствуют повреждения белков, выделенных из паражгутикового тела E. gracilis (предполагаемого фоторецептора водоросли), при воздействии на них солнечного или ультрафиолетового излучения [Hder, 1991]. В пользу этой гипотезы в наших исследованиях свидетельствуют различные уровни воздействия ультрафиолетового излучения на параметры фотодвижения Dunaliella - скорость поступательного движения V и фототопотаксис F, что можно связать с возможными различиями в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за скорость поступательного движения и фотоориентацию клеток.

Зависимость фототопотаксиса и подвижности клеток исследуемых водорослей от интенсивности, длины волны ультрафиолетового излучения и продолжительности облучения свидетельствует о возможности использования этих водорослей для биотестирования природного ультрафиолетового излучения.

5.6. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Методика измерений. В данном разделе освещаются результаты воздействия g-излучения на суспензию клеток двух видов Dunaliella с последующим анализом дозовых кривых для скорости и направления движения клеток, облученных в пределах 0-1000 Гр. В качестве источника ионизирующего излучения использовали 60Со (установка МРХ-g-25 “Исследователь” с мощностью дозы 0,2 Гр/с). Суспензию клеток водорослей помещали в пробирках в поле излучения источника. После облучения пробирки вынимали из установки, водоросли переносили в лабораторию для измерения скорости поступательного движения и оценки фототопотаксиса. Для выяснения степени повреждения клеток в процессе облучения суспензию обоих видов (облученную и необлученную) пропускали через проточную ячейку цитофлуориметра “Соulter Erics C”, регистрируя дифракцию лазерного излучения на клетках и флуоресценцию движущихся клеток.


Запись и обработка на компьютере измерений большого числа клеток позволяет построить моно- и бипараметрические гистограммы частот, с которыми встречаются клетки одного размера. На этих гистограммах амплитуда сигнала заносится на ось абсцисс, а количество клеток одного и того же размера, давших одинаковую амплитуду сигнала, - на ось ординат. Для получения статистически достоверных результатов были использованы для каждого вида три колбы суспензии, из которых брали по три пробы для облучения и определения параметров V и F. Дозы облучения составляли 30, 600 и 1000 Гр. Освещенность колб в процессе культивирования - 1200 ± 50 лк;

температура воздуха в культуральном шкафу 23 ± 1 0С, в процессе микроскопирования 17 ± 1 0С. Скорость V движения клеток и параметр F, характеризующий направление движения клеток, определяли как результат усреднения данных, полученных для 9 образцов (три колбы, по три пробы) в условиях определенного режима облучения. Измерения V и F проводили через 1, 2, 7 и 11 суток после облучения. Для выяснения степени влияния облученной среды культуру Dunaliella в одном из вариантов сразу после облучения разбавляли свежей средой в соотношении 1:19;

измерения параметров V и F проводили на 1-е сутки и через 16 суток после разбавления [Посудин и др., 1992].

Результаты и обсуждение. В первые сутки после воздействия ионизирующего излучения скорость V клеток D. salina изменяется линейно лишь в пределах погрешности измерений вплоть до 600 Гр, уменьшаясь на 20 % по сравнению с контролем (рис. 5.9, а). При дозе 1000 Гр наблюдается резкий спад скорости до нулевых значений. Что же касается параметра F, то зависимость его от дозы также является линейной вплоть до 600 Гр, однако угол наклона этой зависимости отличается от такового для параметра V.

Дозы свыше 600 Гр (в наших экспериментах до 1000 Гр) резко ингибируют как скорость, так и фототопотаксис. Для D. viridis зависимость параметра V от дозы сохраняется линейной вплоть до 1000 Гр;

угол наклона примерно такой же, как в случае D. salina в пределах ошибок измерений. Однако параметр F уменьшается до 10%-ного уровня, соизмеримого со случайными значениями F, уже при дозе 30 Гр (рис. 5.9, б). Возможно, такое различие в зависимости параметра F от дозы у разных видов связано с различными размерами клеток двух видов. На вторые, седьмые и одиннадцатые сутки характер дозовых кривых практически не изменялся, что свидетельствует о необратимых воздействиях ионизирующего излучения.

Что касается культуры, которую после облучения разбавили свежей средой, то здесь мы не обнаружили особых отличий в численных значениях параметров V и F по сравнению с культурой, не разбавленной - 74 свежей средой (сравнение проводили вплоть до 16 суток). Это может свидетельствовать об отсутствии ингибирующего действия облученной водной среды после воздействия ионизирующего излучения на параметры фотодвижения клеток водоросли.

В результате воздействия ионизирующего излучения, по всей вероятности, имеет место изменение размеров (или формы) клеток и содержания в них хлорофиллов. Об этом свидетельствует смещение пиков и изменение амплитуды гистограмм, характеризующих как рассеяние лазерного излучения на клетках, так и флуоресценцию хлорофилла, присутствующего в клетках у облученных образцов по сравнению с контрольными для обоих видов Dunaliella (рис. 5.10, 5.11). Таким образом, приведенные гистограммы (рис.

5.10, 5.11) подтверждают возможное необратимое повреждение клеток D. salina и D. viridis и их фотосинтетического аппарата под воздействием g-облучения в указанных дозах.

Рис. 5.9. Зависимость скорости V поступательного движения (1) и параметра F, характеризующего фототопотаксис (2), от дозы ионизирующего излучения в первые сутки после облучения: а D. salina;

б - D. viridis. По оси абсцисс – доза облучения, Гр.

Рис. 5.10. Гистограммы, характеризующие соотношение между рассеянием лазерного излучения клетками и флуоресценцией клеток Dunaliella salina (а);

флуоресценцию клеток (б);

рассеяние лазерного излучения на клетках (в) и рассеяние под углом 900 (г) для D. salina: 1 - до g-облучения;

2 – после g-облучения.

- 75 Рис. 5.11. Гистограммы, характеризующие соотношение между рассеянием лазерного излучения клетками и флуоресценцией клеток Dunaliella viridis (а);

флуоресценцию клеток (б);

рассеяние лазерного излучения на клетках (в) и рассеяние под углом 900 (г) для D. viridis: 1 - до g-облучения;

2 – после g-облучения.

Одним из основополагающих аспектов проблемы фотодвижения водорослей является изучение местоположения и природы фоторецептора, ответственного за прием кванта света и преобразование его в сигнал, управляющий биениями жгутиков. В отношении таких зеленых водорослей как Chlamydomonas существует мнение, что фоторецепторная система расположена у поверхности клетки, в плазмалемме [Nultsch,1983]. У эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis фоторецептор, как известно, находится внутри клетки, у основания жгутика, в паражгутиковом теле [Colombetti et al., 1982]. Что же касается Dunaliella, то данные о расположении фоторецептора у видов этого рода отсутствуют. Логика наших рассуждений такова: пусть фоторецептор, определяющий способность клетки ориентироваться относительно направления распространения света, расположен у Dunaliella у поверхности клетки (как у Chlamydomonas);

если системы, ответственные за скорость и направление движения клеток, имеют различную локализацию, это определит также различный характер дозовых кривых для параметров V и F соответственно.

Основным результатом, полученным в наших исследованиях по изучению влияния ионизирующего излучения на параметры фотодвижения Dunaliella, является установление различного наклона дозовых кривых для параметров V и F движущихся клеток Dunaliella (см. рис. 5.9). По нашему мнению, это свидетельствует о различиях механизмов, управляющих скоростью поступательного движения (параметр V) и фототопотаксисом (параметр F) клеток. Нельзя исключать возможности потери при воздействии - 76 ионизирующего излучения белковыми молекулами плазмалеммы конформационных свойств. Как считают авторы работы [Посудин, Супрун,1992], белки, входящие в состав клеточной мембраны, принимают участие в селективном пропускании ионов (как правило, Са2+) в зависимости от условий освещения. Процесс фоторецепции можно рассматривать как возбуждение мембранных белков при поглощении молекулой фоторецептора кванта света, при котором имеют место конформационные изменения белков, приводящие к активации ионных каналов мембраны. Изменение концентрации ионов Са2+ в окружающем пространстве приводит к биению жгутиков и фотоориентации клетки. Воздействие ионизирующего излучения, по всей вероятности, вызывает изменение конформационных свойств белков в клеточной мембране и потерю клетками способности ориентироваться относительно источника света. Повреждающее действие g излучения на скорость движения и фототопотаксис Dunaliella различно;

очевидно, фоторецептор Dunaliella, ответственный за фотоориентацию клеток, в большей степени подвержен действию ионизирующего излучения, чем аппарат, управляющий скоростью поступательного движения клеток. Следует также отметить некоторые отличия в дозовых кривых для параметра F у двух видов Dunaliella – D. salina и D.

viridis, которые, по всей вероятности, можно связать с различными размерами фоторецепторных систем у представителей двух видов и неодинаковой их чувствительностью к ионизирующему излучению. Линейный характер дозовых кривых (например, для параметра V) свидетельствует о возможности использования водорослей в качестве биологических датчиков (в наших опытах –до 1000 Гр) для биотестирования ионизирующего излучения. Кроме того, концепция мишени, предполагающая структурно-функциональную гетерогенность клетки для воздействующего ионизирующего излучения, позволяет реализовать оценки объема и массы мишеней, ответственных за поражение той или иной реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, изучено влияние освещенности, температуры, рН, напряженности электрических полей, ультрафиолетового и ионизирующего излучений на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella:

подвижность (относительное число подвижных клеток от общего числа клеток, Nm /N0, %), скорость (V, мкм/с) и направление движения клеток (F, отн. ед.), а также взаимодействие некоторых факторов окружающей среды (освещенности, температуры, напряженности электрических полей) при их одновременном воздействии на фотодвижение водорослей.

Максимальные значения подвижности, скорости движения клеток, положительного и отрицательного фототопотаксиса отмечены при температуре 20-30 0С и наблюдались в пределах рН 6,50-8,47, причем оптимумы рН для различных параметров фотодвижения неоднозначны. Неодинакова также чувствительность разных параметров фотодвижения к предельным значениям рН среды.

Приложение электрических полей подавляло фототопотаксис Dunaliella, как и других водорослей (Chlamydomonas reinhardtii, Haematococcus pluvialis), что свидетельствует об участии биоэлектрических потенциалов в этом процессе. Повышение температуры от 18 до 30 0С снимает ингибирующее влияние напряженности электрического поля и стимулирует фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella.

Используемые в наших экспериментах пределы изменения освещенности образца (100 и 500 лк) и температуры (18 и 30 0С) находятся, как видно, вблизи максимальных точек зависимости параметров фотодвижения исследуемых видов водорослей от внешних факторов, которые могут конкурировать и друг с другом, и с электрическим полем, усиливая или ослабляя влияние других факторов при совместном действии. Подобными конкурирующими и зачастую противоположными действиями внешних факторов можно объяснить также различия в экологии и поведении видов Dunaliella в условиях естественных бассейнов [Масюк, 1973].

Ионизирующее и ультрафиолетовое излучения ингибируют фототопотаксисD. salina и D. viridis.

Ингибирующий эффект зависит от дозы облучения, а в случае использования УФ излучения - и от длины волны. Ионизирующее в пределах до 600 Гр, а также ультрафиолетовое излучения не влияют на скорость движения клеток Dunaliella. Впервые у видов Dunaliella под влиянием УФ облучения обнаружено - 77 преобразование положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим ингибированием его до нулевых значений. В пределах доз, испытанных в опытах, воздействие ультрафиолетового излучения обратимо;

ионизирующее излучение подавляет способность клеток Dunaliella к фотодвижению необратимо, причем два вида этого рода проявляют неодинаковую чувствительность к ультрафиолетовому и g излучению.

Один из параметров фотодвижения - относительное число подвижных клеток (Nm/N0) в популяциях Dunaliella колеблется от 0 до 100 % и демонстрирует те же зависимости от характеристик светового стимула и условий окружающей среды, что и фототопотаксис, существенно отличаясь по наличию/отсутствию и степени таких зависимостей от ряда факторов (рН, интенсивность и длина волны падающего света, доза предварительного ионизирующего и ультрафиолетового облучения) от фотокинеза, что свидетельствует о возможных различиях в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за разные параметры фотодвижения у одного и того же и разных видов.

- 78 ГЛАВА СТРУКТУРА ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ 6.1. ПРОБЛЕМЫ ФОТОРЕЦЕПЦИИ У ВОДОРОСЛЕЙ Проблема фоторецепции у водорослей имеет несколько аспектов: 1) местоположение и структура фоторецепторной системы;

2) состав фоторецепторных пигментов;

3) механизмы фоторецепции.

Длительное время – в течение почти 100 лет считали, что функцию фоторецепции в клетках жгутиковых водорослей выполняет стигма («светочувствительное пятно», «глазок», «вічко», «еyespot», «Augenflecke») [см. обзоры: Dodge, 1973;

Седова, l977;

Ettl, 1980;

Масюк, Посудин, 1991б]. Предположение о фоторецепторной роли стигмы впервые было высказано в конце прошлого столетия [Engelmann, 1982a, b].

Косвенно это предположение подтвердили многочисленные известные факты ее наличия в подвижных окрашенных вегетативных и репродуктивных клетках водорослей, ее исчезновения в материале, длительное время хранящемся в темноте, и восстановления при перенесении на свет [Kivic, Vesk, I972, 1974].

Сохранение стигмы в неподвижных клетках многих тетраспоральных водорослей рассматривается как пример атавизма, что подтверждается ее полным исчезновением на коккоидном уровне организации вегетативного тела водорослей. Вместе с тем известны многочисленные случаи отсутствия стигмы в подвижных клетках водорослей (Raphidophyta, многие Haptophyta;

зооспоры Chlorhormidium flaccidum (Ktz.) Fott, Coleochaete Brb., Urospora penicilliformis (Roth) Aresch., подвижные жгутиковые мужские гаметы Bacillariophyta, Bryopsis hypnoides Lamour.). Эти случаи трудно объяснимы с позиций гипотезы фоторецепторной функции стигмы, поскольку лишенные стигмы клетки этих водорослей способны реагировать на свет.

В начале ХХ ст. была высказана еще одна гипотеза, согласно которой функцию фоторецептора в подвижных клетках водорослей выполняет особая область у основания одного из жгутиков, воспринимающая сигналы стигмы [Mast, 1927]. В настоящее время можно считать доказанным, что стигма играет вспомогательную роль модулирующего свет устройства в процессах фоторецепции жгутиковых водорослей. Таким образом, фоторецепторные системы у этих водорослей, как правило, состоят из собственно фоторецептора и модулирующей свет стигмы.

Фоторецепторные системы жгутиковых водорослей из разных отделов и классов различаются по структуре, местоположению и принципам действия [Foster, Smyth, 1980;

Kivic, Walne, 1983;

Greuet, 1987 и др.]. Детальное рассмотрение этих систем в пределах различных высших таксонов водорослей приведено в работе [Масюк, Посудин, 1991б]. Здесь мы ограничимся сравнительным анализом фоторецепторных систем зеленых водорослей.

6.2. СТРУКТУРА ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ СИСТЕМ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Фоторецепторная система зеленых жгутиковых водорослей состоит из обычно хорошо заметной стигмы и фоторецептора, местоположение и структура которого с точностью не установлены. Стигма является частью хлоропласта, расположена у его поверхности, непосредственно под двухмембранной оболочкой хлоропласта, тесно примыкающей к плазмалемме. Она состоит из одного или нескольких (до девяти) слоев пигментированных глобул. В многослойных стигмах указанные слои разделены промежутками, в которых находится бесцветная строма хлоропласта, а иногда заходят также фотосинтетические ламеллы или отдельные тилакоиды, обычно лишенные пигментов [Foster, Smyth, 1980]. Стигма зеленых водорослей принадлежит к типу А по классификации Дж. Д. Доджа [Dodge, 1973] (рис. 6.1).

- 79 Рис.6.1.Различныетипы стигм, обнаруженные в клетках эукариотических водорослей: 1 – Chlamy domonas Ehrenb. (тип А);

2 –Dino- bryon Ehrenb. (тип В);

3 –Euglena Ehrenb. (тип С);

4 –Glenodinium (Ehrenb.) Stein (типД);

5 – Nematodinium (тип Е);

а хлоропласт;

б – стигма;

в – пластинчатое тело;

г – линзовидное тело;

д – ретиноид;

е– пигментированные тела;

ж – паражгутитковое тело (по Dodge, 1973).

Ещё С.О. Маст [Mast, I927] заметил, что при освещении прямыми лучами солнечного света глазки колониальных зеленых водорослей Pandorina Bогу и Eudorina Ehrenb. отражают зеленоватоголубой свет, причем более крупные передние глазки отражают больше света, чем задние, более мелкие. В трансмиссионном световом микроскопе этот эффект незаметен, так как отраженный свет не достигает глаза.

Маст впервые высказал предположение, что описанный феномен имеет значение в фототопотаксисе этих водорослей. Впоследствии описанное Мастом явление было подтверждено с помощью современных технических средств и зафиксировано на фотопленке [Foster, Smyth, 1980]. В рефлектирующих глазках зеленых водорослей пигментированные глобулы в пределах каждого слоя располагаются плотно, в гексагональном порядке (рис. 6.2);

расстояния между центрами глобул колеблются от 75 до 100 нм [Nakamura et al., 1973;

Bray et al., 1974].

Используя электронномикроскопическую фотографию среза четырехслойной стигмы Chlamydomonas reinhardtii P.A. Dang., изготовленную с помощью специальной методики [Linder, Staehelin, 1979], максимально сохраняющей структуру объекта (рис. 6.3), К. Фостер и Д. Смис [Foster, Smyth, 1980] измерили толщину пигментированных (69,0 нм) и непигментированных (77,7 нм) слоев, а также толщину окруженного мембраной тилакоида (15,4 нм), прилегающего к внутренней поверхности каждого пигментированного слоя стигмы.

Учитывая эти данные и различия в индексах преломления пигментированного и непигментированного слоев стигмы, К. Фостер и Д. Смис рассчитали с помощью компьютера, что отражательные свойства такой стигмы очень близки к таковым четвертьволновой пластины (рис. 6.4) - 80 Рис. 6.2.Тонкая структура стигмы уChlamydomonas Ehrenb.: 1 -Двухслойная стигма Ch.reginae Ettl et Green, продольный срез через два слоя пигментированных глобул, между которыми видны тилакоиды;

2 - стигма того жевидасповерхности;

3-одослойная стигма С. moewusii Gerloff продольный срез;

4 стигматого же вида при болеесильном увеличении с поверхности;

1, 2 - по Ettl,Green, 1973;

3, 4 - по Walne, Arnott, 1967.

Используя опубликованные в литературе микрофотографии стигм других видов зеленых водорослей (Volvulina pringsheimii Starr, Platydorina caudata Kofoid, Volvox aureus Ehrenb., V. tertius Meyer, Pteromonas tenuis Belcher et Swale, Pyramimonas montana Geitl., Eudorina illinoisensis (Kofoid) Pascher), К. Фостер и Д.

Смис пришли к выводу, что и у этих видов стигмы построены по принципу четвертьволновой пластины [Foster, Smyth, 1980], выполняя функцию интерференционного рефлектора.

Ультраструктурное исследование поверхности прилегающих к стигме мембран (плазмалеммы и мембран хлоропласта) у безоболочкового мутанта Chlamydomonas reinhardtii методом замораживания скалывания обнаружило высокую степень их специфичности. Плазмалемма в районе стигмы хактеризуется более плотным расположением внутримембранных частиц по сравнению с остальной ее поверхностью (рис.

6.5). Здесь преобладают более мелкие частицы диаметром 8-12 нм, а более крупные (I6-20 нм) находятся за пределами прилегающей к стигме зоны. Аналогичная картина обнаружена на наружной мембране хлоропластной оболочки в районе стигмы, однако здесь внутримембранные частички еще мельче (2-6 нм).

Плазмалемма и наружная мембрана хлоропластной оболочки в районе стигмы тесно скреплены друг с другом, промежуток между ними составляет 20-30 нм. Предполагается, что специализированные участки обеих мембран принимают участие в процессах фоторецепции и первичных сенсорных преобразований, связанных с фототопотаксисом [Melkonian, Robenek, 1980]Таким образом, фоторецептор зеленых водорослей, по всей вероятности, находится на мембранах, расположенных между стигмой и прилегающей частью клеточной оболочки.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 8 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.