авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |

«Н.П. МАСЮК, Ю.И. ПОСУДИН, Г.Г. ЛИЛИЦКАЯ ФОТОДВИЖЕНИЕ КЛЕТОК Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, ...»

-- [ Страница 5 ] --

Рассмотрим взаимодействие света с периодически расположенными пигментированными глобулами стигмы, образующими дифракционную решетку с периодом d = D + s, где D – диаметр глобулы;

s – промежуток между глобулами. При падении света с длиной волны l под углом q0 на такую дифракционную решетку, состоящую из N глобул диаметром D, разделенных промежутками s, происходит взаимодействие волн, отраженных от различных глобул (лучи 2 и 3 на рис. 8.4). В результате после отражения света от решетки образуются дифракционные максимумы, положение которых определяется уравнением [Борн, Вольф, 1973]:

p = d(sinq - sinq0) = ml, ( 8.1 ) где р - параметр дифракции;

q - угол между нормалью к решетке и направлением на дифракционный максимум (угол дифракции);

m – целое число (m = 0;

±1;

±2;

…), равное количеству длин волн, на которое волна от некоторого элемента данного промежутка отстает от волны, исходящей от такого же элемента соседнего промежутка, или опережает ее. Интенсивность дифракционного максимума m-го порядка сложным образом зависит от параметра дифракции р, который, в свою очередь, зависит от угла q дифракции и длины волны l падающего света.

- 109 Рис. 8.4. Схематическое изображение оптических явлений, происходящих при взаимодействии света с периодической структурой, образованной отдельными сферическими глобулами стигмы (а) или глобулами, соединенными в сплошной слой (б, в). Здесь q0 и qm – углы падения и дифракции света;

d = D + s период дифракционной решетки, образованной глобулами диаметром D, разделенными промежутками s;

1 – падающий луч света;

2, 3–лучи света, отраженные от глобули взаимодействующие друг с другом [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin, Massjuk, 1996].

Для количественной оценки эффективности дифракционного механизма в конкретном случае мы использовали литературные данные, полученные с помощью электронной микроскопии и характеризующие строение однослойной стигмы зеленой водоросли Dunaliella salina [Владимирова, 1978]: диаметр пигментированных глобул ( D ) равен 91,5 нм;

среднее расстояние между глобулами ( s ) – 3,5 нм;

количество глобул ( N ) – 18. Подобные количественные оценки размеров глобул стигмы характерны для других зеленых водорослей [Melkonian, Robenek, 1984]. Параметры D, s и N были использованы нами для вычисления на компьютере зависимости интенсивности света, дифрагировавшего на периодической структуре, от параметра р дифракции (угла q) и длины волны l [Борн, Вольф, 1973]. Зависимость интенсивности дифракционных максимумов F(p) от параметра р, а следовательно, и угла дифракции для случая нормального падения (q0 = 0) света и для длины волны l = 480 нм представлена на рис. 8.5.

Рис.8.5.Зависимость интенсивности дифракционных максимумов F от дифракционного параметра р = sinq для случая нормального падения света на дифракционную решетку (q0 = 0). Использованы параметры стигмы Dunaliella salina Teod.: N = 18;

D = 91,5 нм (диаметр глобул);

s – 3,5 нм (расстояние между глобулами);

l = 480 нм (длина волны) [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin, Massjuk, 1996].

- 110 Положение дифракционных максимумов определяется значениями параметра р = l/d;

2l/d;

3l/d и т.д. Зависимость интенсивности дифракционного максимума первого порядка (m = 1) от параметра р для случая нормального падения (q0 = 0) света для различных длин волн l падающего света представлена на рис. 8.6, из которого видно, что положение максимумов, определяемое параметром р, существенно зависит от длины волны l.

Таким образом, приведенные расчеты подтверждают возможность действия дифракционного механизма фоторецепции у подвижных организмов, обладающих стигмой с периодической структурой.

Этот механизм может обеспечить их реагирование на угол падения светового потока и длину световой волны. При изменении направления движения организма угол падения света на стигму изменяется, что приводит к изменению интенсивности и пространственного положения дифракционных максимумов, изменению освещенности фоторецептора и коррекции направления движения организма, т.е. к фотоориентации.

Рис.8.6. Зависимость интенсивности дифракционного максимума (F) первого порядка(m=1) отдифракционного параметра (р) для различных длин волн света.

Обозначения те же, что и на рис.8.5 [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin,Massjuk,1996].

Предложенный дифракционный механизм, по-видимому, является универсальным для всех монадных биологических объектов, обладающих периодической структурой стигмы, однако он не исключает одновременного дополнительного действия у разных объектов других механизмов: модуляционного, интерференционного, дихроичного и др., усиливающих световой сигнал и увеличивающих точность фотоориентации.

8.3. О РОЛИ БЕЛКОВ В МЕХАНИЗМАХ ФОТОРЕГУЛЯЦИИ ДВИЖЕНИЯ ЖГУТИКОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Немаловажную роль в фоторегуляции движения жгутиковых водорослей играют белковые молекулы, входящие в состав как фоторецепторных систем, так и жгутикового аппарата и, в частности, конформационные изменения, которые претерпевают эти молекулы.

В основе биения жгутика лежат процессы динамики a-спиральных белков, обусловленные их возбуждением [Костюк и др., 1988]. Могут быть реализованы два типа возбуждения: экситонное или солитонное [Давыдов, Супрун, 1974]. Экситон возбуждается оптическим излучением видимого или инфракрасного диапазонов;

при этом все возбуждение равномерно распределено по возбужденному объекту. Такой тип возбуждения реализуется либо непосредственно в мембранных белках, которые перестраивают свою пространственную конфигурацию при непосредственном воздействии излучения по схеме: свет ® возбуждение экситонного состояния в a-спирали ® конфигурационная перестройка мембранного белка, либо посредством фоторецептора по схеме: свет ® возбуждение экситона в - 111 фоторецепторе ® передача экситонного возбуждения на a-спираль мембранного белка и его возбуждение ® конфигурационная перестройка молекулы белка. Солитон, в отличие от экситона, возбуждается не оптическим путем а за счет неупругого рассеяния фосфатных групп на a-спиральных участках белков жгутикового аппарата. Солитонные возбуждения интересны тем, что они локализованы в небольшой области a-спирали и могут переносить возбуждение или заряд без диссипации, с околозвуковой скоростью и на большие расстояния в пределах a-спирали [Давыдов, Супрун, 1974].

Известно, что и экситонные, и солитонные состояния реализуются в виде симметричных и антисимметричных возбуждений. При симметричном возбуждении все три пептидные цепи в a-спирали симметрично сокращаются, а расстояния между ними сим-метрично увеличиваются, т.е. вся молекула как бы сокращается и утолщается. При солитонных возбуждениях эти процессы происходят локально, в небольшой области (рис. 8.7, а).

При антисимметричном возбуждении одна пептидная цепь не деформируется, тогда как две другие сокращаются, что приводит к изгибу молекулы в целом при экситонных возбуждениях и к локальным изгибам при солитонных возбуждениях (рис. 8.7, б). Именно эти деформации вызывают локальные и общие изменения конфигурации белковых молекул, приводящие в каждом конкретном случае к соответствующим проявлениям, рассмотренным выше – активации ионных каналов в мембране и последующим биениям жгутиков.

Рис. 8.7. Деформация пептидных групп при: а – симметричном;

б – антисимметричном возбуждении [Давыдов, Супрун, 1974].

Таким образом, функционирование мембраны связано с активностью мембранных белков, при возбуждении которых происходит перестройка их конфигурации таким образом, что в них образуются ионные каналы, через которые ионы кальция достаточно свободно диффундируют внутрь клетки, стимулируя двигательную активность водорослей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Учитывая особенности фоторецепторных систем водорослей, в частности, строение стигмы, можно полагать, что всем монадным жгутиковым водорослям за исключением тех, у которых отсутствует стигма, свойственен наиболее древний, первичный модуляционный механизм фоторецепции, унаследованный от прокариот или общих с ними предков;

у некоторых зеленых водорослей могут одновременно функционировать три механизма (модуляционный, дифракционный и интерференционный), повышающие интенсивность поглощаемого фоторецептором светового сигнала.

Немаловажную роль в фоторегуляции движения жгутиковых водорослей играют белковые молекулы, входящие в состав как фоторецепторных систем, так и жгутикового аппарата и, в частности, конформационные изменения, которые претерпевают эти молекулы под влиянием стимулирующего света.

- 112 ГЛАВА СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ 9.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕНСОРНОГО ПРЕОБРАЗОВАНИЯ Исследования фоторегуляции движения водорослей связаны с выяснением того, каким образом поглощенный молекулой фоторецептора квант света преобразуется в сигнал, управляющий деятельностью двигательного аппарата. Совокупность событий, связывающих фоторецепцию и работу двигательного аппарата водоросли, называют сенсорным преобразованием принятого кванта света в физиологический сигнал (в дальнейшем мы будем использовать для краткости термин «сенсорное преобразование»). К методическим приемам, позволяющим приблизиться к пониманию механизмов сенсорного преобразования, следует отнести:

1) исследование влияния ионов кальция на фотодвижение водорослей и изучение действия препаратов, изменяющих проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция (блокаторы кальциевых каналов, ионофоры);

2) применение разнообразных химических препаратов, специфически действующих на отдельные этапы процесса фоторегуляции движения (например, оуабаина - ингибитора Na+-K+-АТФазы и ионов химических элементов);

3) использование электрофизиологических подходов, позволяющих регистрировать электрические явления на клеточном уровне или воздействовать на них посредством внешних электрических полей.

Рассмотрим основные методические и экспериментальные подходы, позволяющие приблизиться к пониманию основных этапов сенсорного преобразования на примере достаточно изученных в этом отношении водорослей.

9.2. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У EUGLENA GRACILIS В отношении сенсорного преобразования у Euglena gracilis существует гипотеза [Tollin, 1969, 1973], согласно которой изменения интенсивности света, падающего на фоторецептор, могут активизировать образующийся в процессе фотосинтеза поток АТФ к двигательному аппарату водоросли (жгутику), вызывая при этом изменения биений жгутика с последующим изменением направления движения. Однако, на основании этой гипотезы не представляется возможным объяснить проявление фотодвигательных реакций обесцвеченными в темноте клетками и клетками, лишенными хлоропластов, которые выполняют защитные функции при воздействии высоких интенсивностей света [Checcucci et al., 1976].

Авторы работы [Jahn, Bovee, 1968] предположили, что паражгутиковый стержень аксонемы и паражгутиковое тело (ПЖТ) E. gracilis являются пьезоэлектрикамквазикристаллами, в которых при сжатии или растяжении в определенных направлениях возникает электрическая поляризация даже в отсутствии электрического поля. За счет пьезоэлектрической активности возникает поток ионов вдоль жгутика, что вызывает его изгиб и биение. Фоторецептор (ПЖТ) выполняет функции накопителя зарядов, высвобождающего их при освещении. Несмотря на реальность предлагаемого процесса сенсорного преобразования, эта гипотеза до сих пор не получила экспериментального подтверждения.

- 113 Рис. 9.1. Модель сенсорного преобразования в клетке Euglena gracilis: изменения интенсивности света передаются от фото пигментов фоторецептора некоему гипотетическому «компаратору», который сравнивает сигнал, полученный от фоторецептора, с сигналом, прошедшим синаптическое соединение в области между плазматическими мембранами основного и короткого жгутиков. Здесь: ПЖТ – паражгутиковое тело;

С – стигма;

ОЖ – основной жгутик;

КЖ – короткий жгутик;

К – компаратор;

Э – эффектор, управляющий работой жгутикового аппарата [Piccini, Omodeo, 1975].

Существует предположение [Piccini, Omodeo, 1975], согласно которому сигналы фоторецептора (ПЖТ) пропорциональны степени обесцвечивания фоторецепторных пигментов. Изменения интенсивности света передаются от фотопигментов, содержащихся в ПЖТ, некоему гипотетическому «компаратору» (от англ. compare – сравнивать), который сравнивает сигнал, полученный от фоторецептора, с сигналом, прошедшим синаптическое соединение в области между плазматическими мембранами основного и короткого жгутиков (рис. 9.1). Сигнал сравнения передается эффектору – компоненту гипотетической модели, управляющему биением жгутиков и расположенному предположительно у края резервуара, в котором находится жгутик.

Для того, чтобы выяснить, имеется ли связь между фотодвижением и фотосинтетической активностью E. gracilis, был проведен эксперимент по изучению препаратов, влияющих на индуцированное светом выделение кислорода и вызывающих разрушение хлоропластов – 3(3/,4/-дихлорфенил)-1,1-диметил мочевины (ДХММ), 2,4-динитрофенола (ДНФ) и азида натрия (NaN3). Было показано [Barghigiani et al., 1979], что эти препараты не влияют на фотофобические реакции E. gracilis при увеличении концентрации вплоть до таких уровней, при которых клетки теряют подвижность и претерпевают серьезные морфологические изменения. Отсутствие действия азида натрия на фотофобические реакции E. gracilis свидетельствует о том, что фотосинтетическая активность и фотосенсорная система водоросли не связаны друг с другом. В работе [Colombetti et al., 1982] сообщается о существенном подавлении отрицательного фототопотаксиса E. gracilis азидом натрия в концентрации 510-5 М;

положительный фототопотаксис при этом не изменяется. Авторы работы [Barghigiani et al., 1979] отмечают, что после внесения азида натрия в концентрации 310-5 М в суспензию E. gracilis число подвижных клеток уменьшается до 40 %, а скорость их движения – до 86 %. По мнению авторов, фототопотаксис и фотофобические реакции водоросли не связаны между собой, а положительный и отрицательный фототопотасисы реализуются посредством различных цепей сенсорного преобразования.

В то же время можно допустить участие ионного транспорта в сенсорном преобразовании E.

gracilis. В пользу этого утверждения свидетельствуют эксперименты по исследованию влияния ионов химических элементов на фотодвижение водоросли: показано, что максимальную подвижность клетки E.

gracilis демонстрируют в присутствии ионов Mg2+, Ca2+ и K+, тогда как ионы Ni2+ вызывают иммобилизацию клеток. Увеличение концентрации ионов Ca2+, Mn2+ Ba2+ приводит к соответствующему увеличению частоты пространственных изменений положения клеток;

продолжительность фотофобических реакций E.

gracilis увеличивается в присутствии дивалентных ионов в последовательности 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Ca Ba Mn Co Mg Ni. Увеличение длительности фотофобических реакций E. gracilis вызывают также NaCl и оуабаин (ингибитор Na+-К+ -ионного транспорта через мембрану).

В присутствии ионофора А23187 ионы кальция индуцируют специфический, независимый от света и зависимый от концентрации Ca2+ отклик E. gracilis, проявляющийся в беспрерывном кувыркании клеток.

- 114 Для E. gracilis не установлено какое-либо влияние электрических полей на фототопотаксис клеток [Hder, 1986b], что позволяет предположить отсутствие влияния электрических мембранных потенциалов на фотоориентацию E. gracilis. В пользу этого предположения свидетельствует отсутствие влияния на фотоориентацию E. gracilis липофильного катиона ТРМР+, который проникает через мембрану и уменьшает ее электрический потенциал [Nultsch, Hder, 1988].

В попытке обобщить результаты упомянутых выше экспериментов авторы работ [Doughty, Diehn, 1979;

Doughty et al., 1980] предлагают гипотетическую модель процессов сенсорного преобразования у E.

gracilis, согласно которой переориентация жгутика водоросли управляется увеличением концентрации ионов Ca2+ в околожгутиковом пространстве. В процессе сенсорного преобразования светового стимула в двигательную реакцию водоросли квант стимулирующего света поглощается молекулой хромофора (флавина), находящегося в паражгутиковым теле E. gracilis;

энергия возбуждения хромофора активизирует работу Na+-K+-насоса жгутиковой мембраны, регулирующего поток моновалентных (K+ и Na+) и дивалентных (Ca2+) ионов через жгутиковую мембрану (рис. 9.2). Na+-K+-насос отвечает за поддержание высокой концентрации K+ и низкой концентрации Na+ внутри клетки по сравнению с внешней средой.

Активный транспорт ионов Na+ и K+ необходим для транспорта ионов кальция. Считается [Костюк и др., 1988], что ионы натрия служат движущей силой, вызывающей обширный поток ионов кальция через плазматическую мембрану. Деятельность Na+-K+-насоса активизируется светом и подавляется оуабаином.

Рис.9.2. Гипотетическая модель сенсорного преобразования в клетке Euglena gracilis (Lencietal.,1984):1–ПЖТ (паражгутиковое тело), содержащее хромофор (флавин);

2 – Na+-K+-насос, активируемый фотоном с энергией hn и блокируемый оуабаином;

3 - Na+-канал;

4 – Ca2+-канал, открываемый ионами Na+;

5 - Ca2+-канал, ответственный за выход ионов кальция изклетки;

6– жгутик, переориентирующийся при увеличении концентрации Ca2+ (приуменьшении интенсивности стимулирующего света);

ОЖ–основание жгутика;

жгутик находится в состоянии покоя при концентрации ионов кальция С 10-8 М, тогда как при превышении этой концентрации происходит биение жгутика.

В результате стимулированной светом активности Na+-K+-насоса в клетке водоросли накапливаются ионы Ca2+, что является необходимым предварительным условием суммарного действия потока этих ионов на жгутик, вызывающего его биение и соответствующую переориентацию клетки по отношению к источнику света. Таким образом, согласно данной гипотетической модели, изменения в фотоповедении и фоточувствительности E. gracilis индуцируются моновалентными и двувалентными катионами, потоки которых управляются активируемым светом (и блокируемым оуабаином) Na+-K+-насосом. В то же время, недостаток экспериментальных данных и отсутствие знаний об основных этапах цепи сенсорного преобразования E. gracilis позволяет рассматривать эту цепь как своеобразный «черный ящик» [Lebert, Hder, 2000].

- 115 9.3. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ В результате многочисленных исследований установлена несомненная роль ионов кальция и связанных с ними мембранных явлений в сенсорном преобразовании Chlamydomonas reinhardtii: фотостимуляция осуществляется за счет потока ионов Ca2+ через клеточную мембрану, вызывая изменение внутиклеточной концентрации этих ионов [Marbach, Mayer, 1971;

Stavis, Hirshberg, 1973;

Stavis, 1974;

Schmidt, Eckert, 1976;

Nichols, Rikmenspoel, 1978;

Hyams, Borisy, 1978;

Nultsch, 1979;

Marangoni et al., 1996]. Экспериментальные измерения фотодвигательных реакций или фотоиндуцированных электрических токов в присутствии различных уровней ионов кальция во внешней среде [Hegemann et al., 1990] или различных концентраций ингибиторов кальциевых каналов [Nultsch et al., 1986;

Hegemann et al., 1990] подтвердили мнение о том, что ионы кальция играют основную роль в фотооткликах зеленых водорослей Ch. reinhardtii и Haematocoсcus pluvialis. Фототопотаксис и фотофобические реакции водорослей постепенно подавлялись в присутствии таких блокаторов кальциевых каналов как w-конотоксин и пимозид [Hegemann et al., 1990], которые селективно ингибируют кальциевые каналы. По-видимому, существует еще один тип кальциевых каналов, который участвует в фототопотаксисе, но не связан с фотофобическими реакциями. Этот канал блокируется верапамилом [Hegemann et al., 1990]. Электрический сигнал, генерируемый одиночной клеткой, зависит от концентрации внеклеточных ионов кальция [Sineshchekov, 1991a]. Хотя участие ионов кальция в сенсорном преобразовании у обоих видов водорослей очевидно, четкое представление о процессах, участвующих в этом преобразовании, отсутствует. Исследование влияния специфических препаратов на фототопотаксис Ch. reinhardtii [Stavis, Hirshberg, 1973;

Stavis, 1974] показало отсутствие связи между фотодвижением и фотосинтезом водоросли.

Полное подавление фототопотаксиса Ch. reinhardtii отмечается при концентрации азида натрия - 3,510 М;

при этом число подвижных клеток составляло 62 % от общего числа клеток, а скорость движения клеток уменьшается до 93 % [Stavis, 1974]. Внесение азида натрия в концентрации 10-5 М в суспензию Ch.

reinhardtii вызывает уменьшение фототопотаксиса на 80 %, и подвижности – на 30 % [Pfau et al., 1983].

Обе водоросли, Ch. reinhardtii и Haematocoсcus pluvialis, демонстрируют фотоиндуцированные мембранные потенциалы, которые можно измерить с помощью микроэлектродной техники. Обнаружены два типа потенциалов – положительный, отражающий поверхностные свойства мембраны, и отрицательный, трансмембранный. Кроме того, выявлены строго периодические изменения положительного потенциала под действием света и обратимые быстрые изменения его уровня [Синещеков и др., 1976].

Применение электрофизиологических методов (микроэлектродная регистрация электрических сигналов на поверхности протопласта) позволило обнаружить высокочастотные ритмические процессы, связанные с изменениями электрического потенциала у H. pluvialis с продолжительностью периода в несколько десятков секунд, имеющие тесную связь с метаболизмом этого фототрофного жгутиконосца [Sineshchekov, Govorunova, 2001а]. Это позволило авторам выдвинуть интересную гипотезу о регуляторном значении этих ритмических процессов в фотодвижении водорослей.

Возможна связь периодических процессов с функционированием сократительных вакуолей. У Сhlamydomonas reinhardtii две сократительные вакуоли расположены вблизи базальных тел жгутиков. Их поведение у клеток, удерживаемых на микропипетке, проанализировано с помощью видеомикрографии.

Интервал между двумя сокращениями вакуоли составляет около 30 с. Сокращение обеих вакуолей происходит с близкими частотами, но сдвинутыми по фазе относительно друг друга. Величина этого сдвига периодически меняется [Sineshchekov, Govorunova, 2001а].

Авторы предполагают, что эти периодические процессы играют роль в регуляции движения клетки.

При длительной регистрации траекторий движения индивидуальных клеток Haematocoсcus pluvialis и Сhlamydomonas reinhardtii наблюдаются периодические спонтанные изменения направления их движения, которые отличаются теми же свойствами, что и периодические изменения электрического потенциала поверхностей их клеток и микродвижений протопласта, что указывает на их общее происхождение - 116 [Sineshchekov, Govorunova, 2001а]. При оптической регистрации биения жгутиков клетки H. pluvialis, фиксированной на микропипетке, наблюдаются спонтанные кратковременные (1-2 с) изменения плоскости биения жгутиков со средним периодом 20-40 с, что, по всей вероятности, и обусловливает изменение направления движения свободной клетки. Наблюдаются также спонтанные периодические изменения характера биения жгутиков с ресничного на ундулирующий.

Подобные изменения типа биения жгутиков наблюдаются при фотофобической реакции в ответ на электрическую реакцию, запускаемую открыванием потенциалзависимых кальциевых каналов в мембране жгутиков [Синещеков и др., 1978;

Beck, Uhl, 1994;

Holland et al., 1997].

Авторы высказали предположение, что взаимодействие двух осцилляторов клетки, функции которых выполняют сократительные вакуоли, лежит в основе механизма регуляции знака фототопотаксиса [Sineshchekov, Govorunova, 2001a]. Показано, что два жгутика демонстрируют различные по интенсивности реакции на свет (изменение частоты и плоскости биения) [Sineshchekov, 1991a, b]. У свободно движущихся клеток преимущественная реакция цис-жгутика (расположенного на стороне фоторецептора) должна привести к повороту от источника света (негативный фототопотаксис), а преимущественная реакция транс жгутика (удаленного от фоторецептора) – к повороту в сторону источника света (позитивный фототопотаксис). При длительной регистрации траектории движения индивидуальной клетки обнаружено, что клетка движется попеременно то в направлении к источнику света, то от него. Частота этих изменений сопоставима с частотою электрических импульсов на поверхности клетки. Знак фототопотаксиса определяется величиной сдвига фаз между ритмами двух осцилляторов - пульсирующих вакуолей. Эта величина зависит от многих факторов: интенсивности освещения, степени аэрации, ионного состава среды, возраста культуры и т.д. Она обусловлена, по-видимому, различной чувствительностью осцилляторов к этим факторам [Sineshchekov, Govorunova, 2001a].

9.4. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У DUNALIELLA 9.4.1. Методы исследований В ходе наших исследований были использованы ионы кальция (соль СаСl26Н2О);

ионофор А23187;

оуабаин;

азид натрия;

ионы кобальта (СоСl2);

блокаторы кальциевых каналов циннаризин и изоптин.

Препараты испытывали в концентрациях: СаСl26Н2О - 10-6 М - 10-2 М;

ионофор А23187 - 10-5 М;

СоСl2 и циннаризин - (10-6 -10-3) М;

изоптин - (10-7-10-4) М и азид натрия - (10-7-10-3) М. Параметры V и F измеряли в трех повторностях (три образца, взятые из одной колбы с исследуемой культурой водорослей).

Каждая точка на графиках зависимости параметров V и F от концентрации упомянутых выше препаратов представляет собой средний результат измерений не менее трех образцов. Измерения проводили через один час после введения препарата в исследуемую суспензию. Исследования положительного фототопотаксиса Dunaliella проводили при освещенности образца белым светом 500 лк, отрицательного при 40000 лк.

В задачи исследований входило сравнение действия упомянутых выше препаратов на фотодвижение двух видов Dunaliella [Посудин и др., 1993].

9.4.2. Влияние ионов кальция Результаты исследований. Зависимость параметров фотодвижения клеток Dunaliella (скорости V поступательного движения и фактора F) от концентрации С содержащихся в среде ионов кальция (соль СаСl26Н2О), которая изменялась от 10-6 М до 10-2 М, представлена на рис. 9.3, а - для D. salina и рис. 9.3, б для D. viridis. Максимальные значения F приходятся на область концентрации кальция (10-6-10-4) М для обоих видов;

при высоких (порядка 10-2 М) концентрациях величина параметра F уменьшается до 80-90 % - 117 относительно контрольных значений, регистрируемых при отсутствии ионов кальция в среде. В то же время мы не установили каких-либо существенных отличий скорости V клеток от контрольных значений во всей исследуемой области концентрации кальция.

Рис.9.3. Зависимость параметров фотодви жения F и V двух видов Dunaliella (а – D. salina и D.viridis) от концентрации CaCl26H2O [Посудин и др., 1993].

Обсуждение результатов. Несмотря на то, что роль кальция в фотодвижении водорослей очевидна (активация кальциевых каналов, управление ионными насосами, изменение проницаемости клеточных мембран), многие аспекты этой проблемы еще требуют своего разрешения. Зависимость параметров фотодвижения двух видов Dunaliella от концентрации ионов кальция характеризуется наличием максимума параметра F в области концентраций СаСl26Н2О (10-6-10-4) М;

в то же время, не установлена зависимость скорости движения V от концентрации ионов кальция. Наши данные по исследованию влияния ионов кальция на фотодвижение Dunaliella совпадают с данными, полученными в работе [Avron, Ben Amotz, 1992], согласно которым подвижность, скорость движения и линейность траектории движения D.

salina и D. bioculata слабо зависят или вообще не зависят от концентрации кальция в среде, и частично совпадают с результатами, полученными рядом авторов для Chlamydomonas reinhardtii.

Так, оптимальная (с точки зрения достижения максимальных значений фототопотаксиса клетками этой водоросли) область концентраций кальция составляет 510-5 М [Dolle et al.,1987;

Nultsch, 1979, 1983];

при концентрации 10-5 М уровень фототопотаксиса снижается до 50 %, а при концентрации 210-4 М - до % относительно контрольных значений фототопотаксиса. При концентрации 10-3 М фототопотаксис клеток Chlamydomonas полностью подавляется. Зависимость фототопотаксиса Chlamydomonas от содержания кальция в среде весьма чувствительна к интенсивности стимулирующего света [Dolle et al., 1987;

Morel Laurens, 1987]. В то же время, следует отметить зависимость скорости движения клеток Chlamydomonas от концентрации ионов кальция в среде и от интенсивности стимулирующего света [Morel-Laurens,1987]. Виды Dunaliella отличаются от Chlamydomonas тем, что скорость движения их клеток не зависит от концентрации ионов кальция в испытанных пределах.

- 118 9.4.3. Влияние ионофора А Результаты исследований. Ионофоры - это вещества, которые связывают различные ионы в растворах и обеспечивают проницаемость биологической мембраны для связанного иона. Результаты использования ионофора А23187, который повышает проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, представлены на рис. 9.4, а, б для обоих видов Dunaliella (концентрация СаСl26H20 в среде составляла 10- М). Внесение ионофора в среду в концентрации 10-5 М вызывает практически полное подавление фототопотаксиса D. salina и D. viridis. Восстановление параметра F до начальных (контрольных) значений достигается лишь через 12 ч для D. salina и через 24 ч для D. viridis. Добавление кальция (10-3 М) через 24 ч после внесения ионофора не изменяет величины параметра F. Изменений скорости движения клеток в этих опытах нами обнаружено не было.

Обсуждение результатов. Результаты добавления ионофора А23187 в концентрации 10-5 М в среду свидетельствуют о столь обширном поступлении кальция внутрь клетки, при котором фототопотаксис Dunaliellа практически мгновенно подавляется;

скорость движения клеток при этом существенно не изменяется. Такие результаты можно объяснить тем, что ионофор А23187 повышает проницаемость мембраны для ионов кальция.

Даже если соли кальция отсутствуют в составе среды, предназначенной для культивирования Dunaliellа, ионы кальция могут присутствовать в воде, используемой для приготовления среды;

источниками этих ионов могут быть предметные и покровные стекла (по оценкам, представленным в работе [Dolle et al., 1987]).

Тот факт, что скорость движения Dunaliellа не изменяется, является отличительным признаком действия препарата на параметры фотодвижения водоросли по сравнению с другой зеленой водорослью – Chlamydomonas [Pfau et al., 1983], у которой в результате применения ионофора А23187 в концентрации 10- М ингибируется и фототопотаксис, и скорость движения клеток.

Рис. 9.4.Временная зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а - D. salina и б - D. viridis) от добавления в среду ионофора А (момент добавления указан стрелкой) [Посудин и др., 1993].

Авторы этих исследований объясняют ингибирующее действие ионофора на скорость движения клеток Chlamydomonas возможным сокращением (или сбрасыванием) жгутиков с последующим их восстановлением (или регенерацией). Сравнительный анализ различий и сходств в действии ионофора на параметры фотодвижения представителей двух родов (Dunaliellа и Chlamydomonas) свидетельствует о - 119 наличии у Dunaliellа более высоких адаптивных способностей, проявляющихся в экстремальных условиях.

Можно предположить также специфическое действие ионофора на различные параметры фотодвижения водорослей, представляющих разные таксоны, – направление движения клеток у Dunaliellа, направление и скорость движения клеток у Chlamydomonas, частоту и длительность пространственных кувырканий у Euglena gracilis [Doughty, Diehn, 1979].

9.4.4. Влияние оуабаина Результаты исследований. В наших экспериментах внесение оуабаина в концентрациях от 10-7 до 10- М не привело к каким-либо ощутимым изменениям параметров V и F фотодвижения Dunaliella.Обсуждение результатов. Использование оуабаина - ионотропного препарата, ингибирующего Na+-K+-АТФазу, вызывает увеличение длительности кувырканий клеток Euglena gracilis при изменении интенсивности света и скорости аккумулирования клеток в освещенной области [Doughty et al., 1980]. Подобное влияние оуабаина можно объяснить ингибированием потока одновалентных ионов натрия (из клетки) и калия (внутрь клетки), что сопровождается изменениями электрических градиентов на клеточной мембране, влияющими на поступление двухвалентных ионов кальция внутрь клетки. А это, в свою очередь, приводит к переориентации жгутиков E. gracilis [Meyer, Hildebrand, 1988]. Отсутствие влияния оуабаина на параметры V и F фотодвижения Dunaliella позволило предположить, что поступление ионов кальция внутрь клетки Dunaliella управляется не с помощью Na+-K+-насоса, как в случае Euglena, а, вероятно, за счет непосредственного, индуцированного светом, поступлением ионов кальция внутрь клетки, как это имеет место у Chlamydomonas [Nultsch,1983].

9.4.5. Влияние ионов кобальта Результаты исследований. Наши исследования показали, что добавление кобальта в среду в концентрации (10-6-10-3) М СоСl2 влияет на фототопотаксис Dunaliella, в то время как скорость движения клеток при концентрации СоСl2 (10-6-10-4) М практически не изменяется (рис. 9.5, а, б). На протяжении пяти суток после внесения ионов кобальта в среду их ингибирующее действие сохраняется. Добавление ионов кальция в концентрации 10-3 М восстанавливает параметр F до значений, присущих контрольным образцам, выращенным в среде без добавления СоСl2 и СаСl26H20.

Обсуждение результатов. Известно, что ионы кобальта, лантана, марганца и никеля являются блокаторами кальциевых токов через мембрану, вызывающими реверсивные, изменяющие направление движения клеток биения жгутиков Chlamydomonas [Schmidt, Eckert, 1976;

Doughty, Diehn, 1982]. Такая зависимость фотодвижения Chlamydomonas от блокаторов кальциевых каналов свидетельствует об участии ионов кальция и кальциевых каналов в процессах сенсорного преобразования у водоросли.

Подобная зависимость пространственных и временных изменений поведения (фотофобических реакций) клеток в присутствии двухвалентных ионов кальция, бария, марганца, кобальта и магния наблюдалась у Euglena gracilis [Colombetti et al., 1982]. Наблюдаемое нами ингибирующее действие ионов кобальта на фототопотаксис Dunaliella позволяет предположить участие кальциевых токов через жгутиковую мембрану в сенсорном преобразовании у водорослей этого рода и, таким образом, наличие ионной природы сенсорного преобразования у Dunaliella.

- 120 Рис.9.5.Зависимость параметров фото-движения F и V двухвидовDunaliella (а - D. salina и б -D. viridis) от концентрации CoCl2 [Посудин и др., 1993].

9.4.6. Влияние циннаризина и изоптина Результаты исследований. Использование циннаризина, являющегося блокатором кальциевых каналов, показало, что при концентрации циннаризина (10-6-10-4) М имеет место ингибирование обоих (V и F) параметров фотодвижения Dunaliellа. Лишь при концентрации циннаризина 10-3 М у обоих видов оба параметра полностью ингибируются (рис. 9.6, а, б). Мы не замечали восстановления параметров фотодвижения Dunaliella в течение 24 ч после внесения циннаризина в среду. Другой используемый нами блокатор кальциевых каналов - изоптин также ингибирует оба параметра фотодвижения: при концентрации изоптина 10-4 М фототопотаксис обоих видов Dunaliella уменьшается до 60-70%, а скорость движения - до 75-90 % относительно контрольных значений (рис. 9.7, а, б).

Обсуждение результатов. Использование этих препаратов, являющихся блокаторами кальциевых каналов, показало, что они ингибируют оба (V и F) параметра фотодвижения у обоих видов Dunaliellа.

Интересно сравнить полученные нами результаты исследований с циннаризином и изоптином с данными других авторов, использовавших такие блокаторы кальциевых каналов как флунаризин, верапамил, дилтиазем и нимодипин [Nultsch et al., 1986].

- 121 Рис.9.6. Зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а- D salina и б-D. viridis) отконцентрации циннаризина [Посудин и др., 1993].

Обнаружено что увеличение концентрации флунаризина от начального уровня 10-6 М вызывает уменьшение фототопотаксиса и подвижности Chlamydomonas [Nultsch et al., 1986];

при концентрации 510- М оба параметра ингибируются полностью, что дает право авторам не считать подобный эффект специфическим (т.е. вызывающим подавление одного лишь фототопотаксиса). Микроскопический анализ убеждает в том, что потеря подвижности клетками вызывается укорочением или даже отделением жгутиков, как это наблюдалось при воздействии азида натрия или ионофора А23187 [Pfau et al., 1983]. Через 6 часов после воздействия флунаризина и фототопотаксис, и подвижность клеток Chlamydomonas восстанавливались, что связано с регенерацией жгутиков.

Верапамил в концентрации 210-5 М ингибирует фототопотаксис и подвижность клеток в различной степени - до 40 % фототопотаксис, до 50-60 % - подвижность, что связывают с постепенным отделением жгутиков Chlamydomonas [Nultsch et al., 1986]. Через 10 часов после воздействия препарата подвижность восстанавливается до 20 % от начального уровня, тогда как фототопотаксис вообще не восстанавливается, что свидетельствует о специфическом действии верапамила на фототопотаксис Chlamydomonas.

Дилтиазем и нимодипин влияют на фототопотаксис Chlamydomonas, не затрагивая при этом подвижности клеток. В концентрации 210-5 М оба препарата вызывают ингибирование фототопотаксиса до 30-35 %. В данном случае также наблюдается восстановление фототопотаксиса до начального уровня через 6 ч при использовании дилтиазема и через 10 ч после воздействия нимодипина.

- 122 Таким образом, действие таких блокаторов как верапамил, дилтиазем и нимодипин на параметры фотодвижения Chlamydomonas можно считать специфичным, т.е. влияющим в различной степени на фототопотаксис и подвижность клеток. Циннаризин и изоптин, использованные нами в настоящих исследованиях, действуют и на скорость движения, и на фототопотаксис: при высоких (порядка 10-3 М) концентрациях препаратов полностью подавляется скорость движения и фототопотаксис.

9.4.7. Влияние азида натрия Результаты исследований. Из рис. 9.8 видно, что в пределах использованных концентраций азида натрия скорость движения клеток обоих видов Dunaliella практически не изменялась как при умеренных (500 лк), так и при высоких (40000 лк) значениях освещенности образца белым светом;

уровень средних значений скорости движения клеток исследуемых видов Dunaliella зависел лишь от освещенности образца (рис. 9.8, 1, 2).

Рис. 9.8. Зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а - D. salina и б D. viridis) от концентрации азида натрия. Здесь: 1 и 2 – скорость поступательного движения при освещенности образца белым светом 500 лк и 40000 лк соответственно;

3 и 4 –фототопотаксис при освещенности образца белым светом лк и 40000 лк соответственно. Вертикальные разноски – погрешности измерений [Посудин и др., 1995].

Отмечено полное подавление положительного фототопотаксиса двух видов Dunaliella при концентрациях азида натрия C 10-4 М, а отрицательного – при концентрациях C 10-5 М для D. salina и C 10-4 М для D. viridis (рис. 9.8, 3, 4). Таким образом, азид натрия избирательно действовал на фототопотаксис двух видов Dunaliella, не влияя при этом на скорость движения их клеток.

Обсуждение результатов. В наших экспериментах установлено избирательное действие азида натрия на фототопотаксис двух видов Dunaliella;

при этом препарат не влияет на скорость движения клеток.

Сравним действие азида натрия на параметры фотодвижения Dunaliellа и других водорослей. Из работ [Stavis, Hirschberg, 1973;

Pfau et al.,1983] известно, что препарат ингибирует положительный фототопотаксис Chlamydomonas reinhardtii при концентрациях того же порядка (3,510-4-10-4) М, что и в наших экспериментах с Dunaliellа. Что касается подавления отрицательного фототопотаксиса азидом натрия, то - 123 оно известно для эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis (510-5 М) [Colombetti et al., 1982] и (10-3 М) [Nultsch et al., 1983]. На положительный синезеленой водоросли Anabaena variabilis фототопотаксис этих водорослей препарат не влияет. Мы не отмечали действия азида натрия на скорость движения клеток двух видов Dunaliellа, что наблюдали также для A. variabilis при интенсивном освещении [Nultsch et al., 1983]. Для других водорослей, таких как E. gracilis [Barghigiani et al., 1979], A. variabilis при слабом освещении [Nultsch et al., 1983], Phormidium uncinatum [Nultsch, Hder, 1979], известно, что добавление азида натрия снижает скорость движения клеток. Такое действие препарата объясняют появлением внутриклеточных структурных изменений у E. gracilis [Barghigiani et al., 1979] и воздействием на процессы нециклического фотосинтетического переноса электронов у A. variabilis [Nultsch et al., 1983].

Влияние азида натрия на подвижность клеток Ch. reinhardtii связывают [Pfau et al., 1983] с возможным укорочением или отделением жгутиков.

Избирательное действие азида натрия на способность клеток Dunaliellа spp. осуществлять направленное движение относительно направления распространения света при отсутствии влияния препарата на скорость движения клеток свидетельствует о существовании двух отдельных каналов в цепи сенсорного преобразования светового сигнала у этих водорослей: один из них зависит от действия азида натрия и управляет ориентацией клеток относительно источника света, другой не зависит от действия препарата и управляет скоростью движения клеток. Это предположение согласуется с результатами g облучения клеток Dunaliellа, продемонстрировавшими различный наклон дозовых кривых для фототопотаксиса и фотокинеза [Посудин и др., 1992].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, отмечаются некоторые отличия в действии использованных препаратов (например, ионофора А23187) на различные виды водорослей, принадлежащиe к одному роду Dunaliella. В отличие от Chlamydomonas reinhardtii, во многих случаях реагирующего на введение в среду обитания веществ, стимулирующих или блокирующих ионные каналы неспецифически (аутотомия жгутиков), клетки Dunaliella в этих условиях жгутики не сбрасывают, поэтому их двигательные реакции можно считать специфическим ответом на блокирование/стимулирование ионных процессов. Наблюдаемые нами отличия в действии специфических препаратов на параметры фотодвижения гипергалобных видов Dunaliella и обитателей пресноводных водоемов Euglena gracilis и Ch. reinhardtii позволяют предположить более высокую толерантность исследуемых гипергалобных видов Dunaliella к внешним ингибиторам.

Максимальные значения фототопотаксиса гипергалобных видов Dunaliella наблюдаются при наличии в среде обитания CaCl26H20 в концентрациях 10-5-10-3 М. Повышение концентрации хлористого кальция до 10-2 М подавляло фототопотаксис на 10-20 %. Внесение в среду ионофора А23187, повышающего проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, вызывало полное ингибирование фототопотаксиса как у D. salina, так и у D. viridis. Внесение в среду CoCl2, блокирующего мембранные кальциевые каналы, в концентрации 10-6-10-3 М ингибирует фототопотаксис видов Dunaliella. Подобное действие на фототопотаксис Dunaliella оказывают и такие блокаторы кальциевых каналов как циннаризин и изоптин, а также азид натрия - ингибитор цитохромоксидазы. Оаубаин, стимулирующй Na+-K+-АТФазу, не влияет на фототопотаксис Dunaliella. Вместе с тем, указанные препараты в использованных концентрациях не влияют на скорость движения клеток Dunaliella.

Обобщая полученные нами результаты использования препаратов, специфически действующих на параметры фотодвижения Dunaliella, можно сделать вывод о том, что процесс сенсорного преобразования у видов Dunaliella, как и у Chlamydomonas, имеет ионную природу, а фоторегуляция процессов, управляющих скоростью движения клеток и фототопотаксисом, происходит по различным каналам цепи сенсорного преобразования принятого фоторецептором кванта света в сигнал, который управляет биением жгутиков. Отсутствие влияния оуабаина на параметры движения Dunaliella spp.

позволяет исключить участие Na+-K+-АТФазы в процессах фоторегуляции движения этих водорослей.

- 124 ГЛАВА РАБОТА ЖГУТИКОВОГО АППАРАТА 10.1. СТРУКТУРА ЖГУТИКОВОГО АППАРАТА Жгутики являются органеллами, которые в большинстве случаев расположены на апикальном (переднем по ходу движения) конце клетки;

обычно длина жгутиков равна, несколько короче или превышает длину клетки [Масюк, 1973]. Каждый жгутик представляет собой бичевидное образование диаметром около 0, мкм. Благодаря активным изгибам жгутики обычно производят тянущее или толкающее воздействие на клетку, обеспечивая ее поступательное движение с одновременным ее вращением вокруг собственной продольной оси. Жгутик, расположенный ближе к стигме, называется цис-жгутиком, а удаленный от нее транс-жгутиком.

Жгутиковый аппарат водорослей состоит из трех основных частей – собственно жгутика (Ж), базального тела (БТ) и структур, ассоциированных с базальными телами (связок и жгутиковых корешков).

Жгутик, в свою очередь, состоит из трех частей: жгутиковой верхушки (flagellar top), жгутикового ствола (flagellar shaft) и жгутикового переходного района (flagellar transition region) [Melkonian, 1984] (рис. 10.1).

Жгутик ограничен мембраной, представляющей продолжение клеточной плазмалеммы. Под мембраной расположена аксонема (стержень жгутика) – система микротрубочек (9+2), погруженная в аморфный матрикс. Базальные тела обоих жгутиков образуют V-образную фигуру, связанную исчерченным дистальным и проксимальным волокнами (рис. 10.2). Базальные тела соединяются с жгутиковыми корешками - системой микротрубочек и микрофибрилл;

пучки таких микротрубочек крестообразно отходят от так называемой плотной пластины (см. рис. 10.2) и располагаются под клеточной мембраной [Ringo, 1967;

см. обзор: Melkonian, 1984].

Аксонема состоит из девяти периферических дублетов микротрубочек ПТ и двух центральных ЦТ (структура, условно обозначаемая 9+2). Внешние дублеты содержат по два компонента – А и В трубочки, связанные поперечными мостиками. Трубочка А имеет в поперечном сечении округлую форму, а трубочка В – серповидную форму. Оба типа трубочек имеют общую часть их поверхности. Трубочки А снабжены парами боковых ручек, ориентированными в плоскости поперечного сечения жгутика к соседнему дублету по часовой стрелке, и радиальными спицами (рис. 10.3). Среди основных белков, входящих в состав жгутикового аппарата, следует отметить тубулин, основной материал жгутиковых и цитоплазматических микротрубочек, и динеин, находящийся в боковых ручках. В периферических связках обнаружен белок нексин. В составе жгутикового аппарата зеленых водорослей обнаружен также белок центрин, способный к сокращению и релаксации, вызывающих биения жгутиков.

Динеин характеризуется АТФ-фазной активностью;

молекулы динеина ответственны за химико механические преобразования. Взаимодействие между внешними динеиновыми ручками трубочки А и соседней с ней трубочкой В обуславливает изгиб жгутика [см. обзоры: Квитко и др., 1978;

Melkonian, 1984].

- 125 Рис. 10.1. Схема тонкой структуры жгутикового аппарата: І - наружная часть жгутикового аппарата (собственно жгутик);

ІІ - внутриклеточная часть жгутикового аппарата (базальное тело жгутика);

А - вершина жгутика;

Б ствол жгутика;

В - переходная зона;

Г - базальное тело;

1 - продольный разрез через жгутиковый аппарат;

2-11 десять поперечных сечений через жгутик и базальное тело в различных местах, обозначенных соответствующими цифрами на продольном разрезе;

ЖМ - жгутиковая мембрана;

ПТ - периферические дублеты микротрубочек;

ЦТ центральная пара микротрубочек (по Ringo, 1967, из: Ettl, 1980).

Рис. 10.2.Схема жгутикового аппарата Chlamydomonas: Ж – жгутики, ПР –переходной район, БТ – базальное тело, – проксимальная и 2 – дистальная исчерченная связка, 3 – плотная пластина [Ringo, 1967].

- 126 Рис.10.3. Схематическое изображение деталей строения аксонемы жгутика.

Показана взаимосвязь между элементами структуры на разных уровнях: а – на конце жгутика, б – в средней части, в на уровне базального тела;

1 – микротрубочки А;

2,3 – центральный дублет микротрубочек;

4 – центральная оболочка;

5 – радиальная спица;

6 – динеиновая ручка микротрубочки А;

7 – микротрубочка В;

8 – нексиновый мостик;

9 – микротрубочки С [Квитко и др., 1978].

10.2. ОСОБЕННОСТИ БИЕНИЯ ЖГУТИКОВ 10.2.1. Биения жгутика Euglena gracilis Изгибы жгутика Euglena gracilis в процессе биений характеризуются спиралеобразной формой, хотя, строго говоря, структура биений больше соответствует серии изгибов, каждый из которых представляет собой часть спирали. Разделены эти спиралеобразные участки прямолинейными отрезками жгутика (рис. 10.4).

Это дало основание назвать такую форму жгутика в процессе биения «прерванною спиралью» (“interrupted helix”) [Jahn, Bovee, 1968].

Рис. 10.4. Схематическое изображение структуры биений жгутика Euglena gracilis, представляющей собою серию изгибов (“прерванную спираль”), каждый из которых (1, 2) представляет собой часть спирали;

разделены эти спиралеобразные участки прямолинейными отрезками жгутика (а, б) [Jahn, Bovee, 1968]. Здесь стрелки указывают направление распространения изгибов;

пунктирные линии соответствуют границам изгибов.

Биения жгутика E. gracilis обеспечивают движение клетки по спиралеобразной траектории. Клетка совершает при этом обороты вокруг своей продольной оси с частотою 2 Гц (около 0,32 об/с = 19 об/мин).

- 127 10.2.2. Биения жгутиков Chlamydomonas reinhardtii Жгутики Chlamydomonas reinhardtii демонстрируют синхронные биения симметричной формы относительно продольной оси тела в одной плоскости. Движение жгутиков состоит из двух этапов. Первый этап - движение жгутиков спереди назад в распрямленном состоянии (силовой удар - “power stroke”), второй - возвращение жгутиков в исходное состояние благодаря их плавному изгибанию, начиная от их основания;

волна изгиба распростроняется от основания жгутика к его концу (возвратный удар - “return stroke”) (рис. 10.5, а, б, в) [Ringo, 1967]. Если во время силового удара жгутиков клетка толчком продвигается вперед, то во время возвратного удара - слегка сдает назад. Такой характер движения клетки Д.Л. Ринго назвал “плаванием стилем брасс”, а движение жгутиков отнес к цилиарному типу (такое веслообразное биение характерно для цилий инфузорий) [Ringo, 1967;


Квитко и др., 1978]. Движение клетки назад во время фотофобической реакции обеспечивается волнообразным движением жгутиков, причем волна распространяется от дистального конца жгутиков к их основанию (рис. 10.5, г) [Colombetti, Marangonu, 1991].

Рис.10.5. Биения жгутиков Chlamydomonas reinhardtii: а - движение клетки вперед обеспечивается распрямленными жгутиками, которые расходятся в стороны (силовой удар, power stroke);

б - возвратный удар (return stroke) [Ringo, 1967];

в - цилиарное (веслообразное) движение жгутиков при плавании стилем “брасс”;

г - волнообразное (ундуляторное) движение жгутиков при движении клетки назад во время фобической реакции [Colombetti, Marangoni, 1991]. Стрелки указывают направление движения клетки.

Во время поступательного движения клетка вращается вокруг своей продольной оси с частотою Гц [Rffer, Nultsch, 1985]. Поворот клетки Ch. reinhardtii по направлению к источнику света происходит таким образом [Rffer, Nultsch, 1990;

Nultsch, 1991]: свет детектируется фоторецептором, расположеном в плазмалемме напротив стигмы асимметрично по отношению к продольной оси клетки. Освещение фоторецептора сопровождается потоком ионов кальция через мембрану жгутиков. В ответ на поступление ионов кальция ближайший к стигме жгутик (цис-жгутик) производит биения большей амплитуды, чем удаленный от стигмы жгутик (транс-жгутик). Такой дифференциальный отклик двух жгутиков на изменение концентрации кальция во внутрижгутиковом пространстве вызывает изменение направления движения клетки по направлению к источнику света, т.е. фототопотаксис.

Подобную особенность работы жгутикового аппарата, характеризующегося поступлением разных потоков ионов кальция к цис- и транс-жгутикам, демонстрирует Haematococcus pluvialis [Sineshchekov, 1991a].

- 128 10.2.3. Биения жгутиков Dunaliella Dunaliella bioculata. В процессе своего движения клетка D. bioculata движется по синусоидальной траектории, вращаясь вокруг своей продольной оси против часовой стрелки. В процессе биения каждый жгутик движется спереди назад и располагается вдоль тела клетки;

возвратное биение восстанавливает первоначальное положение жгутика за счет распространяющихся вдоль него изгибов. Отличительной особенностью работы жгутикового аппарата Dunaliella по сравнению с Chlamydomonas является то, что при изменении направления движения клетки один из жгутиков кратковременно становится неподвижным, тогда как другой обеспечивает поворот клетки, после чего клетка движется в новом направлении с двумя работающими жгутиками [Dunaliella …, 1992]. Кроме того, частота биений двух жгутиков Dunaliella bioculata неодинакова (50 и 60 Гц), что приводит к появлению некоторого угла между плоскостями биений жгутиков. Это вызывает вращение клетки и ее движение по синусоидальной траектории [Shoevaert et al., 1988].

10.3. РЕГИСТРАЦИЯ БИЕНИЙ ЖГУТИКОВ 10.3.1. Высокоскоростная микрокинематография Высокоскоростная микрокинематография (100-500 кадров/с) позволяет проанализировать кадр за кадром движение клеток водорослей. Для Chlamydomonas reinhardtii были оценены параметры движения клеток:

поступательная скорость при комнатной температуре 100-200 мкм/с (максимальное значение 240 мкм/с);

скорость вращательного движения 1,4-2 Гц (0,22-0,32 об/с) при максимальном значении 2,5 Гц (0,4 об/с);

частота биения жгутиков, которые обеспечивают спиралеобразное движение клетки, от 45 до 62-70 Гц у жгутика, находящегося на внешней стороне спирали, и 45 Гц у жгутика, находящегося на внутренней стороне спирали [Rffer, Nultsch, 1985]. Благодаря использованию метода высокоскоростной киносъемки были определены скорость поступательного движения Dunaliella bioculata, которая составила 105 ± мкм/с [Dunaliella …, 1992], и частота биения жгутиков (50 и 60 Гц) этого вида [Shoevaert et al., 1988].

10.3.2. Лазерная допплеровская спектроскопия Суть эффекта Допплера заключается в том, что при облучении объекта, который движется со скоростью V, светом определенной частоты l имеет место рассеивание света, причем частота (длина волны) рассеянного света зависит от скорости движения объекта. Допплеровское смещение Df частоты света зависит от угла рассеяния q света объектом, скорости движения V объекта и от угла j между направлением движения объекта и направлением распространения света [Ascoli et al., 1980]:

q 2V. ( 10.1 ) Df = cos j sin l Воздействуя на клетки жгутиковых водорослей лазерным излучением и регистрируя допплеровские сдвиги частоты, Ц. Асколи с сотрудниками удалось оценить скорости поступательного и вращательного движений (для E. gracilis скорость поступательного движения составила 100 мкм/с, а частота вращения клетки около 2 Гц), а также частоту биения жгутиков [Ascoli et al., 1978, 1980]. Использование техники допплеровской спектроскопии дало возможность оценить скорость поступательного движения Dunaliella bioculata, которая составила 109 ± 5 мкм/с [Dunaliella …, 1992].

Tипичные допплеровские спектры, позволяющие оценить частоту биения жгутиков для разных водорослей, представлены на рис. 10.6. Как видно, частота биения жгутиков D. salina находится на уровне около 25 Гц.

- 129 10.3.3. Метод светорассеяния Суть метода светорассеяния поясняется рис. 10.7. Инфракрасный компонент излучения источника 1, проходя через инфра-красный фильтр 2 и темнопольный конденсор 3, попадает на исследуемую суспензию 4 водорослей. Вспышка света, которая подается на суспензию, не попадает в объектив за счет темнопольного конденсора. Однако, модули-рованный за счет биения жгутиков сигнал собирается объективом 5 и регистрируется фотоприемником 6, выходной сигнал которого подается на спектроанализатор 7, сопряжен-ный с компьютером 8 [Ascoli, Petracchi, 1991].

Экспериментальная система дает возможность проводить измерения, накапливая с помощью компьютера данные через каждые 300 мс в шестикратной повторности. Используя технику быстрого Фурье преобразования, можно сравнить начальный спектр интенсивности для совокупности исследуемых клеток с теми, которые получены при различных временных задержках относительно вспышки света, и получить представление об эволюциях частоты биения жгутиков водоросли.

Рис. 10.6. Типичные допплеровские спектры, позволяющие оценить частоту биения жгутиков для разных водорослей [Ascoli et al., 1980]. Здесь: P(n) – интенсивность рассеянного на движущимся объекте сигнала, регистрируемого на частоте n.

Техника светорассеяния выгодно отличается от методов допплеровской спектроскопии, поскольку позволяет использовать традиционные источники некогерентного белого света. Будучи промодулированным по интенсивности за счет подвижных клеток, свет формирует сигнал, который регистрируется фотоприемником;

на выходе последнего фототок изменяется по закону [Ascoli, Petracchi, 1991]:

I(t) = bI(1 +Mf cos2pnft + Mr cos2pnrt, ( 10.2 ) где b – квантовая эффективность фотоприемника;

I – среднее значение интенсивности рассеянного на клетках излучения, попадающего в объектив;

Mf и Mr – коэффициенты, зависящие от биения жгутиков и вращения клетки соответственно;

nf – частота биения жгутиков;

nr – частота вращения клетки.

Средние значения интенсивности рассеянного света дополняются модуляционными членами, величина которых зависит от движения клеток и анизотропии рассеяния [Ascoli, Petracchi, 1991].

Зависимость распределения интенсивности рассеянного света клетками от частоты биений жгутиков, полученное нами при работе с клетками D. salina, представлено на рис. 10.8, а для малой ( мВт/см2) и на рис. 10.8, б – для высокой (10 мВт/см2) интенсивности света. Как видно из рисунков, характер распределения интенсивности, индуцированного вспышками света, не приводят к спектральным сдвигам максимумов распределения до и после вспышки.

- 130 Рис. 10.7.Схема экспериментальной установки, предназначенной для регистрации светорассеяния (пояснения в тексте) [Angelini et al., 1986].

Не влияет на характер распределения интенсивности рассеянного света и изменение интенсивности света. Это свидетельствует об отсутствии у D. salina фотофобической реакции.

10.3.4. Метод фотометрии В основе фотометрических методов лежит регистрация абсолютных или относительных значений потоков излучения, прошедших через основания подвижных жгутиков: перемещающиеся в пространстве основания жгутиков модулируют световой поток, регистрируя который можно получить информацию о частоте биения жгутиков.

Рис. 10.8 а. Спектры интенсивности рассеянного клетками Dunaliella salina света при малых (1 мВт/см2) уровнях интенсив-ности вспышки света: а - до вспышки света;

б - в момент вспышки света;

в - через 10 с после вспышки света. Здесь вертикальная линия соответствует максимуму распределения интенсивности рассеянного света в зависимости от частоты биения жгутиков;

t0 - момент вспышки света;

tmax - момент времени, соответствующий образованию максимума распределения интенсивности рассеянного света [Посудин, 1992а].

- 131 Рис. 10.8 б. Спектры интенсивности рассеянного клетками Dunaliella salina света при высоких (10 мВт/см2) уровнях интенсивности вспышки света: а - до вспышки света;


б - в момент вспышки света;

в - через 10 секунд после вспышки света. Обозначения те же, что и на рис. 10.8 а [Посудин, 1992а].

В процессе фотометрирования клетка исследуемой водоросли закрепляется между предметным и покровным стеклами, после чего к основанию жгутиков подводят зонд микроскопа (нами был использован микроскоп ЛЮМАМ И3). Процедура измерений сводилась к следующим операциям: 1) модуляции светового потока биениями жгутиков;

2) регистрации модулированного светового потока фотоэлектронным умножителем микроскопа;

3) подаче выходного сигнала фотоэлектронного умножителя на вход усилителя преобразователя;

4) фильтрации сигнала в диапазоне от 3 до 100 Гц усилителемпреобразователем;

5) обработке сигнала с помощью триггера Шмидта (который вырабатывает стандартный импульс определенной длительности при превышении сигналом заданного уровня) и синхронизирующего триггера;

6) запуску счетчика импульсов;

7) аналогоцифровому преобразованию регистрируемого сигнала.

Таким образом, система регистрации, используемая в данном методе, позволяла преобразовать частоту биения жгутиков в аналоговую форму и регистрировать ее на самописце.

Значения частоты биения жгутиков двух видов Dunaliella, измеренные методом фотометрии, находятся в пределах 20-50 Гц (наши неопубликованные данные).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Зеленые водоросли в процессе фотодвижения различаются по характеру биения жгутиков.

Движение клетки Chlamydomonas вперед осуществляется с помощью цилиарного биения жгутиков;

во время фотофобической реакции клетки двигаются назад благодаря ундуляторному (волнообразному) биению жгутиков. Поскольку у гипергалобных видов Dunaliella отсутствуют фотофобические реакции, у них не наблюдается ундуляторное биение жгутиков. Повороты клеток Chlamydomonas происходят благодаря неравной амплитуде и частоте биения цис- и транс-жгутиков;

клетки Dunaliella при поворотах приостанавливают биение одного из жгутиков.

Частота биения жгутиков у морских и гипергалобных видов Dunaliella (20-50 Гц) примерно того же порядка, что и у пресноводных Haematococcus и Chlamydomonas.

- 132 ГЛАВА ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ВОДНЫХ СРЕД Наблюдение за состоянием биотической компоненты биосферы, ее реакцией на антропогенные воздействия, отклонения от нормального природного состояния на разных уровнях (молекулярном, клеточном, организменном, популяционном и биоценотическом) называется биологическим мониторингом.

Биотестирование – использование для мониторинга окружающей среды организмов или совокупности организмов, у которых содержание определенных элементов или соединений, а также морфологическая, гистологическая или клеточная структура, метаболические и биохимические процессы, поведение и популяционная организация позволяют дать количественную оценку качества окружающей среды или изменений этой среды.

Тест-объект – организм или совокупность организмов, по степени воздействия на которые судят о качестве (например, степени токсичности) среды.

Тест-реакция – физиологический или поведенческий отклик организма на изменение качества среды.

В качестве тест-объектов используют бактерии, грибы и актиномицеты, водоросли, простейшие, беспозвоночные, рыбы, растения [Крайнюкова, 1988;

Методическое..., 1991].

Тест-реакциями, которые могут быть использованы во время биотестирования, могут служить интенсивность размножения, иммобилизация клеток, двигательная активность, фотосинтетическая активность, проницаемость мембраны, биолюминесценция, импеданс суспензии, биоэлектрическая реакция и т.д. [Баренбойм, Маленков, 1986;

Крайнюкова, 1988].

Преимуществом метода биотестирования является высокая чувствительность, быстрота, надежность, возможность создания автоматизированных систем сбора и обработки информации. К недостаткам можно отнести отсутствие количественной оценки каждого из токсичных веществ, присутствующих в среде, и возможного взаимодействия отдельных компонентов токсичных соединений, которые находятся в смеси.

Если организмы используются в природных условиях, методы биотестирования называются пассивными, если в лабораторных – активными.

11.1. ВОДОРОСЛИ РОДА DUNALIELLA КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ Среди используемых в качестве тест-объектов живых организмов особое место занимают монокультуры одноклеточных водорослей, которые представляют собой однородные, удобные для количественных оценок разнообразных воздействий объекты.

Рассмотрим, как используются в качестве тест-объектов монокультуры зеленых водорослей, принадлежащих к роду Dunaliella.. Виды этого рода – представители зеленых водорослей (Chlorophyta), близких родственников высших растений. Они могут служить модельными объектами, представляющими наиболее обширное и важное для практических нужд человечества царство зеленых растений Viridiplantae.

Микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, свойственные видам этого рода, – большие преимущества этих организмов как модельных тест-объектов.

Представители этого рода изменяют свое поведение и показатели развития при значительных колебаниях солености воды и освещенности и действии разнообразных токсикантов.

Так, в работе Ф. Пейса и др. [Расе еt а1., 1977] представлены результаты исполь-зования Dunaliella salina, D. bioculata, D. tertiolecta для диагностики тяжелых металлов (меди и свинца) по выделению кислорода, фотосинтетической активности, потере клетками калия, росту культуры и пигментному составу клеток. Рост культуры D. salina в присутствии меди, свинца, кадмия и ртути, а также распределение - 133 металлов в культуре были исследованы с помощью полярографического метода в работах [Barghigiani et al., 1981, 1983;

Serritti et al., 1981]. Влияние бора на выделение кислорода при фотосинтезе D. tertiolecta, а также его потребление в процессе дыхания исследовано в работе А.М. Ахме-да и др. [Ahmed et а1., 1988].

Тушащее действие меди на индукцию флуоресценции D. tertiolecta установлено в работе Дж. Сэмсона и др.

[Samson еt а1., 1988]. Некоторые авторы [Балаян, Стом, 1988] предлагают использовать в качестве тест функции потерю подвижности клетками D. salina в присутствии токсиканта. В этом случае показателем токсичности была выбрана концентрация, вызывающая 90 %-ную иммобилизацию клеток. Клетки D. viridis, D. tertiolecta и др. были использованы для биотестирования наличия тяжелых металлов (Нg, Сu, Сd, Рb), хлорорганических соединений и нефтепродуктов в воде [Цвылев, Ткаченко, 1981]. Чувствительность водорослей к действию металлов определяли по интенсивности замедленной флуоресценции и скорости ассимиляции 14С. В работе [Orme, Kegley, 2004] сообщается об использовании клеток D. salina для анализа уровня токсичности ряда пестицидов;

основными тест-функциями при этом были подвижность клеток, биохимические показатели, изменения размеров клеток, содержание хлорофилла, скорость роста численности популяции, биомасса. Появились сообщения об использовании в качестве тест-функции скорости движения и ориентации клеток водорослей [Паршикова та ін., 1990;

Stallwitz, Нdеr, 1993].

В настоящее время ведутся интенсивные поиски новых методов диагностики неотложных хирургических состояний человеческого организма, которые требовали бы небольшого количества исследуемого материала и могли бы обеспечить быструю оценку степени тяжести состояния пациента.

Доказана целесообразность использования монокультуры Dunaliella viridis в качестве тест-системы для оценки наличия цитотоксических соединений в сыворотке крови и в других биологических жидкостях человека. В качестве тест-функции в числе других показателей избрана относительная подвижность клеток [Дмитриев и др., 2005].

11.2. ПАРАМЕТРЫ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA КАК ТЕСТ-ФУНКЦИИ Большинство известных методов биотестирования наличия химических соединений в водных средах основано на регистрации одного параметра, изменяющегося под воздействием этих соединений. Однако регистрация только одной тест-функции существенно ограничивает возможности биотестирования, поскольку различные химические соединения, присутствующие в водной среде, могут производить одинаковое действие на регистрируемый параметр. Увеличение числа регистрируемых тест-функций приводит к повышению уровня качественной и количественной оценки токсикантов, присутствующих в среде.

Мы предлагаем использовать в качестве тест-функции несколько (от двух и выше) одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей. Присутствующие в водной среде токсиканты могут оказывать специфическое воздействие на различные параметры фотодвижения (поступательную и вращательную скорости движения клеток, относительное число подвижных клеток, фототопотаксис, частоту биения жгутиков и т.д.), зависящее от вида и концентрации токсиканта, механизма его взаимодействия с водорослями.

Предполагается, что одновременное использование нескольких регистрируемых параметров фотодвижения водорослей позволит увеличить чувствительность метода биотестирования. Целью настоящего исследования было обоснование целесообразности использования в качестве тест-функций в процессе биотестирования водных сред нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей (на примере зеленых водорослей рода Dunaliella) и апробация векторного метода обнаружения токсикантов в водных средах.

В качестве тест-объектов были апробированы альгологически чистые культуры зеленых водорослей D. salina штамм № 10 и D. viridis, штамм N 42 из коллекции Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины [Масюк, Терещук, 1983];

в качестве тест-функций – такие параметры фотодвижения водоросли как скорость V поступательного движения их клеток, скорость n вращательного движения клеток, фототопотаксис F и относительная подвижность Nm/N0 клеток (Nm – число подвижных клеток, N0 – общее - 134 количество клеток). Описание экспериментальной установки и методики измерений параметров фотодвижения водорослей на основе видеомикрографии представлены в разделе 4.2.

В опытах были использованы такие поверхностно-активные вещества (ПАВ): катионактивное (КПАВ) - катамин, анионактивное (АПАВ) - натриевая соль додецилсульфокислоты, неионноактивное (НПАВ) - гидропол, а также природное соединение полисахаридной природы (ППАВ), выделенное из синезеленых водорослей, возбудителей «цветения» води. Концентрацию ПАВ варьировали в пределах от мг/л до 40 мг/л.

Влияние различных типов ПАВ, их комбинаций и продолжительности действия на скорость движения клеток водорослей оценивали с помощью дисперсионного анализа трехфакторных неортогональных комплексов. Данные по скорости движения клеток (от 0 до 55 мкм/с) группировали по разрядам и обрабатывали с использованием биометрических методов [Лакин, 1973]. Исследовано два трехфакторных комплекса. В первом изучали степень влияния на скорость движения клеток таких факторов как тип ПАВ (КПАВ, АПАВ, НПАВ), их комбинаций (КА - катионактивное-анионактивное ПАВ, КН катионактивное-неионактивное ПАВ, АН - анионактивное-неионактивное ПАВ, КАН - катионактивное анионактивное-неионактивное ПАВ), вид водорослей (D. salina, D. viridis) и продолжительность влияния на них ПАВ (через 0,5;

1;

2;

3 и 4 ч после внесения ПАВ). Во втором комплексе изучали влияние разных концентраций ПАВ (1;

5;

10;

20;

30 и 40 мг/л), типа ПАВ (КПАВ, АПАВ, НПАВ, ППАВ) и вида водорослей (D. salina, D. viridis).

Влияние пестицидов на параметры фотодвижения изучали с такими препаратами: ацетал (55 %), ацетазин (50 %), алахлор (45 %), арилон (75 %), баста (20 %), дуал (96 %), ДПЦ (20 %), гармони (75 %) и текто (45 %). Концентрацию пестицидов варьировали в пределах (10-7 -10-2) М.

Программу исследований с тяжелыми металлами осуществляли с солями меди (CuSO45H2O), кадмия CdCl2 и свинца Pb(NO3)2. Диапазон изменения концентраций солей тяжелых металлов составлял (10 -10-2) М.

11.3. ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ФОТОДВИЖЕНИЕ DUNALIELLA 11.3.1. Характеристика поверхностно-активных веществ Поверхностно-активные вещества (ПАВ) относятся к химическим соединениям, широко распространенным в водоемах. Их накопление осуществляется вследствие действия как антропогенных факторов, так и природных процессов.

Синтетические ПАВ поступают в окружающую среду за счет загрязненных стоков легкой, металлургической, нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей, химической и др. отраслей промышленности. Так, содержание ПАВ в сточных водах текстильных фабрик достигает 2500 мг/л, а в продуктах органического синтеза – 10000 мг/л [Ставская, 1981]. Процесс удаления ПАВ из сточных вод достаточно сложный, в результате чего большая часть ПАВ попадает в окружающую среду: так, например, из 27000 т катионактивных ПАВ, выпущенных в Германии в 1980 г., 23000 т попало в водоемы [Таранова, 1987]. ПАВ различной химической природы найдены в воде практически во всех регионах мира, а в некоторых водоемах содержание ПАВ достигает почти 5 мг/л [Филенко, 1988].

Природные ПАВ создаются в процессе метаболизма многими организмами: они найдены в некоторых бактериях [Margaritis et al., 1979;

Cooper, Zajic, 1980;

Duvnjak et al., 1982], зеленых, синезеленых и диатомовых водорослях [Chamberlain, 1976;

Сиренко, Козицкая, 1988], клеточных культурах высших растений [Вахмистров, Богоров, 1987]. К сожалению, химическая природа биологических ПАВ и их роль в метаболизме выяснены недостаточно.

Существенный интерес представляет изучение мембранотропного действия ПАВ, обусловливающего проявление бактерицидного [Калиниченко и др., 1986;

En-Zanfeily, Nawar, 1980] и фунгицидного [Злочевская и др., 1981] эффектов, а также негативного влияния ПАВ на рост культур, - 135 формирование состава пигментов и фотосинтетическую активность водорослей [Брагинский, 1986;

Паршикова, 1988;

Паршикова, Пахомова, 1988]. Доказано [Лєнова та ін., 1989] токсическое действие одного из анионактивных ПАВ (додецилсульфата натрия) на культуру Dunaliella viridis и влияние его на распределение клеток D. viridis по размерам в зависимости от концентрации действующего вещества.

Вместе с тем известно, что некоторые ПАВ используются как стимуляторы роста водорослей макрофитов в аквакультуре [Калугіна-Гутник, Бєляєв, 1987]. Такое действие ПАВ представляет существенный практический интерес с учетом развития промышленного культивирования различных видов макроводорослей.

Таким образом, целесообразно изучить взаимодействия различных ПАВ с водорослями в связи с возможным влиянием этой группы химических соединений на рост и поведение этих организмов не только в природных условиях, но и в процессе культивирования.

11.3.2. Влияние различных типов ПАВ, их комбинаций и продолжительности действия на скорость движения клеток Dunaliella Результаты измерений. Результаты трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние различных факторов на скорость движения клеток разных видов Dunaliella, представлены в табл. 11.1 и 11.2.

Результаты, представленные в табл. 11.1 и 11.2, свидетельствуют, что независимое и суммарное влияние таких факторов как тип ПАВ, их концентрация и продолжительность действия на скорость движения клеток водоросли статистически достоверны, чего нельзя сказать о влиянии вида водорослей и комбинации «концентрация ПАВ - тип ПАВ - вид водорослей» (рис. 11.1, 11.2).

Как видно из рис. 11.1, а, КПАВ и АПАВ в концентрации 1 мг/л одинаково стимулирующе действуют на фототопотаксис, а в более высоких (до 20 мг/л) концентрациях подавляют фототопотаксис видов Dunaliella путем приостановления движения клеток и изменения направления их движения, тогда как НПАВ и ППАВ в области 1-10 мг/л стимулирующе действуют на фототопотаксис, а в концентрации 40 мг/л через 4 часа после контакта уменьшают фототопотаксис более чем вдвое (рис. 11.1, б) Таблица 11.1. Данные трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние типа и продолжительности действия ПАВ на скорость движения клеток разных видов водорослей р = 0,05 р = 0, Средне Число Критерий квадратичное Фактор степеней достоверности, Степень Степень достоверности FS FS отклонение, свободы FФ достоверности s Т1 5 204,3 387,4 2,2 Д 3,0 Д В 1 0,97 1,8 3,9 НД 6,7 НД t 2 124,0 235,1 3,0 Д 4,6 Д Т1В 5 10,8 20,4 2,2 Д 3,0 Д Т1t 10 6,4 12,2 1,8 Д 2,3 Д Вt 2 9,9 18,8 3,0 Д 4,6 Д Т1 Вt 10 2,9 5,6 1,8 Д 2,3 Д П р и м е ч а н и е. Т1 – тип ПАВ;

В – вид водорослей;

t - продолжительность действия ПАВ на водоросли;

Т1В, Т1t, Вt и Т1 Вt - комбинации действия разных факторов [Паршикова та ін., 1990].

- 136 Таблица 11.2. Данные трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние различных факторов на скорость движения клеток различных видов водорослей р = 0,05 р = 0, Число Средне Фактор Критерий степеней квадратичное Степень Степень достоверности достоверности, свободы отклонение, FS FS достовер FФ s2 ности С 5 295,5 244,2 2,2 Д 3,0 Д Т2 3 612,3 506,1 2,6 Д 3,8 Д В 1 3,8 3,1 3,9 НД 6,7 НД СТ2 15 31,0 25,6 1,7 Д 2,0 Д СВ 5 5,1 4,2 2,2 Д 3,0 Д Т2В 3 29,4 24,3 2,6 Д 3,8 Д С Т2В 15 0,5 0,4 1,7 НД 2,0 НД П р и м е ч а н и е. С – концентрация ПАВ;

Т2 – тип ПАВ;

В – вид водорослей;

СТ2, СВ, Т2В и СТ2В - комбинации действия разных факторов [Паршикова та ін., 1990].

Рис. 11.1. Зависимость фототопотаксиса двух видов Dunaliella от концентрации: а – КПАВ и АПАВ;

б – НПАВ и ППАВ. Контакт – в течение 4 часов. Влияние типа ПАВ и их концентрации на фототопотаксис для обоих видов Dunaliella одинаково [Паршикова та iн., 1990].

- 137 Рис. 11.2. Зависимость скорости движения двух видов Dunaliella от концентрации: а – КПАВ и АПАВ;

б – НПАВ и ППАВ.

Контакт – в течение 4 часов. Влияние типа ПАВ и их концентрации на скорость поступательного движения для обоих видов Dunaliella одинаково [Паршикова та iн., 1990].

На рис. 11.2, а показано ингибирующее действие КПАВ и АПАВ на скорость поступательного движения клеток видов Dunaliella при увеличении концентрации ПАВ до 20 мг/л;

ингибирующее действие НПАВ и ППАВ проявляется в меньшей степени;

скорость движения клеток уменьшается примерно до 50 % от первоначальных значений.

Изучение зависимости параметров фотодвижения клеток от продолжительности влияния различных типов ПАВ и их комбинаций (в концентрации 10 мг/л) показало, что токсичное действие ПАВ на подвижность (Nm/N0) клеток видов Dunaliella уменьшается в такой последовательности: КПАВ КПАВ + АПАВ АПАВ КПАВ + НПАВ АПАВ + НПАВ КПАВ + АПАВ + НПАВ НПАВ НПАВ + ППАВ ППАВ.

Первое соединение (КПАВ) обусловливает полную остановку движения клеток через 1 ч после их контакта с веществом;

остальные (НПАВ и ППАВ) приводят к уменьшению подвижности клеток на протяжении 3 ч после контакта только на 30 %.

Обсуждение результатов. Таким образом, исследуемые типы ПАВ влияют на подвижность, скорость и направление движения клеток двух видов Dunaliella. Характер действия ПАВ зависит от химического состава соединения, его концентрации и продолжительности действия на клетки. КПАВ, которые дают положительно заряженные ионы, в концентрации 1-20 мг/л уменьшают и полностью останавливают фотодвижение клеток. АПАВ, которые дают негативно заряженные ионы, а также НПАВ и ППАВ, которые вообще не создают ионов, вызывают меньшие изменения скорости и направления движения клеток, чем КПАВ. Максимальная чувствительность клеток к положительно заряженным ионам КПАВ указывает на возможное влияние ПАВ на x-потенциал клеток и связанные с ним двигательные реакции.

Однако, имеющихся экспериментальных данных недостаточно для полного понимания механизмов этого взаимодействия.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 8 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.