авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |

«Н.П. МАСЮК, Ю.И. ПОСУДИН, Г.Г. ЛИЛИЦКАЯ ФОТОДВИЖЕНИЕ КЛЕТОК Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, ...»

-- [ Страница 6 ] --

11.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ФОТОДВИЖЕНИЕ DUNALIELLA С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ ДОППЛЕРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ Метод лазерной допплеровской спектроскопии рассмотрен нами в разделе 10.3.2. В данном разделе будут освещены результаты использования этого метода для диагностики тяжелых металлов в водной среде на основе регистрации таких параметров фотодвижения как подвижность и скорость поступательного движения клеток.

- 138 Методика измерений. Допплеровский корреляционный спектрометр состоит из лазера, измерительной кюветы в термостате, фотоприемника, коррелятора и компьютера (рис. 11.3).

В эксперименте были использованы два вида Dunaliella – D. salina и D. viridis. Процедура измерений сводилась к облучению суспензии контрольного и опытного образцов с внесенным токсикантом с последующей регистрацией флуктуаций рассеянного движущимися клетками света. О токсическом действии внесенного в суспензию препарата судят по изменению величины энергозатрат W - параметра, характеризующего отношение средней кинетической энергии всех клеток в опытном m V и контрольном m V образцах, умноженного на отношение числа Nm подвижных клеток к числу Nim неподвижных [Бегма m V Vоп N m Nm и др., 1989]: W = =, ( 11.1 ) N im Vк N im m V где Vоп и Vк – средние значения скорости движения клеток в опытном и контрольном образцах соответственно.

Результаты измерений. На рис. 11.4 представлена зависимость энергозатрат совокупности клеток Dunaliella от времени воздействия токсиканта (Cu2+) в концентрации 10 мг/л. Видно, что параметр W, характеризующий энергозатраты, претерпевает существенные изменения по сравнению со своим первоначальным значением и может быть использован в качестве критерия количественной оценки действия препарата.

Рис. 11.3. Допплеровский корреляционный спектрометр: 1 – лазер, 2 – источник питания, 3 – диафрагма, 4 – линза, 5 – измерительная камера, 6 – термостат,7– фотоприемник, 8 – диафрагма, 9 – блок питания, 10 – усилитель, 11 – коррелятор, 12 – компьютер, 13 – таймер, 14 – цифропечатающее устройство [Бегма и др., 1989].

Зависимость параметра W для D. salina от концентрации токсикантов (Cu2+ и тритона Х-100) представлена на рис. 11.5. Отличия величины параметра W в опытных образцах по сравнению с контрольными очевидны.

Обсуждение результатов. Метод лазерной допплеровской спектроскопии, принцип действия которой заключается в регистрации изменений частоты оптического излучения, рассеянного движущимся объектом, позволяет быстро и с большой точностью реализовать оценки токсического действия химических веществ на подвижные клетки водорослей в водной среде.

- 139 Рис. 11.4.Зависимость энергозатрат W совокупности клеток Dunaliella от времени действия токсиканта (Cu2+, 10 мг/л):

1 – D. salina, 2 – D. viridis [Бегма и др., 1989].

11.5. ВЕКТОРНЫЙ МЕТОД БИОТЕСТИРОВАНИЯ Рис. 11.5.Зависимость энергозатрат W совокупности клеток Dunaliella salina от концентрации: 1 – ионов меди и 2 – тритона Х-100 в суспензии [Бегма и др., 1989]. Здесь С – концетрация, г/л.

Для оценки действия присутствующих в водной среде тяжелых металлов был использован "векторный" метод биотестирования [Посудин, 1992а, б;

Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996]. Тестобъекты помещали в опытную (с токсикантом) и контрольную (без токсиканта) среды в кюветы экспериментальной системы видеомикрографии, с помощью которой одновременно регистрировали несколько параметров фотодвижения (поступательную V и вращательную n скорости движения клеток, фототопотаксис F, число неподвижных Nim клеток относительно их общего числа N0). Затем оценивали величины и направление r вектора R, проекции которого на оси координат в N-мерном пространстве определяются как P1 /P1k, Р2/Р2k,..., PN /PNk, где P1, P2,...., РN - параметры фотодвижения тест-объектов в опытном образце;

P1k, P2k,..., PNk параметры фотодвижения тест-объектов в контрольном образце. Величину r и направление, задаваемое r углом q вектора R, построенного в двухмерной системе координат (см. рис. 11.6), предлагаем определять по формулам:

[( P / P ] ) 2 + ( P2 / P2k ) 2 ;

r= ( 11.2 ) 1 1k q = arctg [(Р1/Р1k)/(Р2/Р2k)], ( 11.3 ) где Рi – параметр фотодвижения тест-объектов в опытном образце (і = 1, 2, 3, …, N);

Рk – параметр фотодвижения тест-объектов в контрольном образце.

- 140 r В трехмерной системе координат (N = 3), эволюции вектора R характеризуются величиной r и направлением, задаваемым углами q1 и q2, которые (рис. 11.7) можно найти с помощью выражений:

[( P / P ] ) 2 + ( P2 / P2k ) 2 + ( P3 / P3k ) r= ( 11.4 ) 1 1k q1 = arccos [Р1/Р1k)/r];

( 11.5 ) q2 = arctg [(Р3/Р3k)/(Р1/Р1k)]. ( 11.6 ) r Величина r и направления (q1, q2 и q3) вектора R в четырехмерной системе координат (N = 4) определяются с помощью таких уравнений:

[( P / P ] ) 2 + ( P2 / P2k ) 2 + ( P3 / P3k ) 2 + ( P4 / P4k ) 2 ;

( 11.7 ) r= 1 1k Р1/Р1k = rcosq1;

( 11.8 ) Р2/Р2k = rsinq1cosq2;

( 11.9 ) Р3/Р3k = rsinq1sinq2cosq3;

( 11.10 ) F4/F4k = rsinq1sinq2sinq3. ( 11.11 ) Подобные подходы возможны и для N-мерного пространства при одновременной регистрации N параметров фотодвижения организмов (в наших экспериментах число одновременно регистрируемых параметров фотодвижения варьировало от 2 до 4). Однако при N 4 графическое построение вектора r R становится невозможным: величина и направление его задается численными значениями, которые табулируются.

Рис. 11.6.Величина r и направление, задаваемое углом q, r вектора R, построенного в двухмерной системе координат (V/Vk;

F/Fk). Здесь и далее (рис. 11.6-11.12) индекс « k » относится к контрольным образцам [Posudin et al., 1996] - 141 Рис.11.7.Величина r и направление, задаваемое углами q1 и r q2, вектора R, построенного в трехмерной системе координат (V/Vk;

F/Fk;

(Nim/N0)/ (Nim/N0)k) [Posudin et al., 1996].

11.6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЕКТОРНОГО МЕТОДА БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ РЕГИСТРАЦИИ ПАРАМЕТРОВ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA r R от типа и концентрации ПАВ 11.6.1. Зависимость вектора Результаты измерений. Данные по исследованию влияния ПАВ на параметры фотодвижения D. viridis представлены в табл. 11.3. В ней приведены средние значения параметров r фотодвижения и среднеквадратичные отклонения. Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат, от типа и концентрации ПАВ представлена на рис. 11.8.r Видно, что увеличение концентрации ПАВ приводит к уменьшению величины r и повороту вектора R по часовой стрелке в плоскости двух координат (V/Vk) и (F/Fk).

Обсуждение результатов. Увеличение концентрации ПАВ вызывает уменьшение как скорости V движения клеток, так и фототопотаксиса F клеток Dunaliella, однако скорость V движения клеток уменьшается быстрее по сравнению с фототопотасисом F. Следует отметить, что разные типы ПАВ по разному влияют на параметры фотодвижения D. viridis. Например, при концентрации ПАВ 10 мг/л r величина r и направление q вектора R принимают такие значения: r = 1,15;

q = 21,90 (КПАВ);

r = 1,22;

q = 26,60 (АПАВ);

r = 1,30;

q = 39,70 (НПАВ);

r = 1,39;

q = 44,10 (ППАВ). Эти данные согласуются с результатами, освещенными в разделе 11.3.2;

они подтверждают влияние ПАВ на двигательные реакции клеток D. viridis.

r Рис. 11.8.Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат (V/Vk;

F/Fk), от типа и концентрации ПАВ. Здесь: КПАВ - катионактивное ПАВ - катамин;

АПАВ - анионактивное ПАВ натриевая соль додецилсульфокислоты;

НПАВ - неионноактивное ПАВ - гидропол;

ППАВ - природное соединение полисахаридной природы, выделенное из синезеленых водорослей;

концентрации ПАВ: 1, 5, 10, 20, 30, 40 мг/л. Здесь r и далее (рис.11.9-11.10,11.14-11.16) Rk соответствует контрольному образцу [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

- 142 - 143 r Рис. 11.9.Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного для Dunaliella viridis в двухмерной системе координат (V/Vk;

F/Fk), от вида и концентрации солей тяжелых металлов: а – CuSO45H2O;

б – CdCl2;

в Pb(NO3)2. Числа 10-3;

10-4;

10-5;

10-6 обозначают концентрацию солей (М) [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

r R от типа и концентрации тяжелых металлов 11.6.2. Зависимость вектора Результаты измерений. Зависимость параметров фотодвижения – скорости V поступательного движения, фототоптаксиса F, относительного числа Nim/No неподвижных клеток и скорости n вращательного движения D. viridis от вида и концентрации тяжелых металлов, использованных в эксперименте, представлена в табл.

11.4. В ней приведены средние значения параметров фотодвижения и среднеквадратичные отклонения.

Графически описываемые зависимости изображены на рис. 11.9. Эти данные были использованы для r построения вектора R в двух-, трех-, и четырехмерной системах координат.

r Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат, от вида и концентрации солей тяжелых металлов представлена в табл. 11.5. Причем при воздействии на суспензию водорослей меди регистрировали все возможные пары параметров фотодвижения D. viridis. r На рис. 11.10 показаны величины и направления вектора R при действии на водоросли разных солей тяжелых металлов в одной и той же (10-4 M) концентрации. Графически показаны также погрешности r измерений величины r и направления qвектора R.

r Поведение вектора R зависит от степени воздействия токсиканта на тот или иной параметр фотодвижения. На рис. 11.11 представлена двухмерная система координат (при одновременном измерении скорости движения и фототопотаксиса клеток), в которой пока r Рис. 11.10.Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат, от вида солей тяжелых металлов [CuSO45H2O, CdCl2 и Pb(NO3)2] в одной и той же (10-4M) концентрации [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

- 144 r Таблица 11.5. Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения Dunaliella viridis ) от вида и концентрации солей тяжелых металлов [Posudin et al., 1996] Концентрация соли, М Параметры rи Соль q фотодвижения 0(конт 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10- роль) r 1,41 1,35 1,22 1,17 0,97 0,52 СuSO45H2O V/Vk и F/Fk q 45,0 46,5 52,3 52,6 70,8 82,3 r 1,41 1,48 1,52 2,03 2,85 5,42 СuSO45H2O V/Vk и (Nim/No)/ q 45,0 41,7 37,8 27,3 18,8 5,5 (Nim/No)k r 1,41 1,50 1,58 2,08 2,91 5,59 СuSO45H2O n/nk и (Nim/No)/ q 45,0 47,4 49,3 60,0 68,0 75,0 (Nim/No)k r 1,41 1,35 1,31 1,26 1,20 0,99 0, Pb(NO3)2 V/Vk и F/Fk q 45,0 47,1 47,8 49,8 52,1 68,1 76, r 1,41 1,36 1,30 1,19 1,02 0,91 CdCl2 V/Vk и F/Fk q 45,0 46,8 48,7 62.5 79,0 82,6 П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в табл. 11.6-11.7: V – скорость поступательного движения, F – фототопотаксис, Nim/No – относительное число неподвижных клеток, n – скорость вращательного движения клеток в образце с тяжелым металлом, Vk – скорость поступательного движения, Fk – фототопотаксис, (Nim/No)k – относительное число неподвижных клеток, nk – скорость вращательного движения клеток в контрольном образце;

прочерк означает неопределенность угла q при нулевом значении величины r.

r заны основные тенденции изменения величины и положения вектора R : при уменьшении обоих параметров, причем первый (Р1/Рк) уменьшается быстрее, чем второй (Р2/Рк) (см. рис. 11.11, а);

при увеличении первого параметра и уменьшении второго (см. рис. 11.11, б);

при уменьшении первого параметра и увеличении второго (см. рис. 11.11, в);

при уменьшении обоих параметров, причем первый уменьшается медленнее, чем второй (см. рис. 11.11, г);

при увеличении обоих параметров, причем первый увеличивается быстрее, чем второй (см. рис. 11.11, д);

при увеличении обоих параметров, причем первый увеличивается медленнее, чем второй (см. рис. 11.11, е).

r Результаты построения вектора R в трехмерной системе координат при одновременном измерении трех параметров фотодвижения водоросли (F/Fk, V/Vk и (Nim/No)/(Nim/No)k) приведены в табл. 11.6.

Построенные в соответствии с данными, представленными в таблице, графики трехмерного пространства позволяют сравнить действие различных видов металлов (рис. 11.12), проследить зависимость r R величины и направления вектора r от концентрации металла (рис. 11.13), изучить тенденции изменения величины и направления вектора R при уменьшении одного из параметров фотодвижения и одновременном увеличении другого (рис. 11.14) или при одновременном увеличении двух параметров фотодвижения (рис.

11.15) в ответ на увеличение концентрации тяжелого металла. r Зависимость величины r и направления (q 1, q 2 и q 3) вектора R в четырехмерной системе координат от вида и концентрации тяжелых металлов при одновременном измерении четырех параметров фотодвижения водоросли D. viridis F/Fk, V/Vk, (Nim/No)/ (Nim/No)k и n/nk приведены в табл. 11.7.

Обсуждение результатов. На примере изменения параметров фотодвижения водорослей при добавлении в суспензию соли тяжелого металла можно проследить основные тенденции в поведении r вектора R в зависимости от концентрации соли. Так, если с увеличением концентрации соли два параметра (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) уменьшаются (причем уменьшение Р1/Р1k идет быстрее, чем Р2/Р2k, то величина r вектора r уменьшается, а направление q изменяется так, что вектор R отклоняется от оси параметра, уменьшающегося более быстрыми темпами (см. рис. 11.11, а). Если один из параметров (Р1/Р1k) - 145 увеличивается с увеличением концентрации соли, а другой (Р2/Р2k) уменьшается, причем изменения обоих параметров происходит в одном темпе, т.е. на сколько увеличивается один параметр, на столько r уменьшается другой, то величина r вектора увеличивается, а направление q изменяется так, что вектор R приближается к оси увеличивающегося параметра (см. рис. 11.11, б, в).

r R в двухмерной системе координат Рис. 11.11. Основные тенденции изменения величины r и направления q вектора (Р1/Р1k;

Р2/Р2k) в зависимости от изменений значений двух избранных параметров фотодвижения: а - оба параметра уменьшаются, но первый уменьшается быстрее;

б - первый параметр увеличивается, а второй уменьшается;

в первый параметр уменьшается, а второй увеличивается;

г - оба параметра уменьшаются, но первый уменьшается медленнее;

д - оба параметра увеличиваются, но первый увеличивается быстрее;

е - оба параметра увеличиваются, но первый увеличивается медленнее [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

- 146 r R, построенного в трехмерной системе Таблица 11.6. Зависимость величины r и направления (q 1 и q 2) вектора координат при одновременной регистрации трех параметров фотодвижения Dunaliella viridis от типа и концентрации соли тяжелых металлов [Posudin et al., 1996] Концентрация соли, М r,q1и Соль Параметры q фотодвижения 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10- (контроль) V/Vk, F/Fk и r 1,73 1,74 1,79 2,14 2,87 5,42 СuSO45H2O q (Nim/No)/(Nim/No)k 54,69 55,72 57,20 64,25 71,72 84,49 q2 44,90 49,68 60,00 68,37 83,26 89,25 V/Vk, F/Fk и r 1,73 1,77 1,83 2,86 4,20 5,52 6, Pb(NO3) q (Nim/No)/(Nim/No)k 54,69 56,01 57,99 70,39 76,94 86,73 89, q2 44,90 51,16 60,25 72,50 82,27 88,54 89, V/Vk, F/Fk и r 1,73 1,68 1,64 1,54 2,13 3,38 CdCl q (Nim/No)/(Nim/No)k 54,69 54,02 53,30 51,32 64,09 75,44 q2 44,90 43,88 49,26 65,42 84,61 88,07 Рис. 11.12. График трехмерного пространства, на котором сравнивается действие различных видов металлов на параметры фотодвижения Dunaliella viridis:

относительную скорость поступательного движения клеток V/Vk;

относительный фототопотаксис F/Fk и относительную подвижность (Nim/N0)/ (Nim/N0)k клеток [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

- 147 Рис. 11.13. Графики трехмерного пространства, на которых представлена зависимость величины r и направления q r вектора R от концентрации соли металла: а – CuSO45H2O;

б – CdCl2;

в – Pb(NO3)2. Здесь К – контроль (отсутствие соли);

цифры –7, –6, –5, соответствуют концентрациям cолей 10-7, 10-6, 10-5,10-1 (М). По осям координат отложены относительная скорость поступательного движения клеток V/Vk;

относительный фототопотаксис F/Fk и r относительная подвижность (Nim/N0)/(Nim/N0)k клеток. Здесь К соответствует Rk контрольного образца [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

Рис.11.14. Изменение величины r и направления q r вектора R при уменьшении одного из параметров движения (V/Vk) и одновременном увеличении другого ((Nim/N0)/Nim/N0)k) в ответ на увеличение концентрации меди (10-6;

10-4;

10-3 М CuSO45H2O) [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

- 148 Рис. 11.15. Изменение величины r и направления q вектора r R при одновременном увеличении двух параметров фотодвижения - относительной скорости вращательного движения n/nk и относительной подвижности (Nim/N0)/(Nim/N0)k в ответ на увеличение концентрации CuSO45H2O (10-6;

10-4;

10-3 М) [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

Если оба параметра уменьшаются, но первый (Р1/Р1k) уменьшается медленнее, то величина r вектора r уменьшается, а направление q изменяется так, что вектор R отклоняется от оси параметра, уменьшающегося более быстрыми темпами (см. рис. 11.11, г). Одновременное увеличение значений обоих параметров фотодвижения (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) (причем первый увеличивается быстрее) с ростом концентрации соли приводит к увеличению величины r, причем направление q вектора изменяется так, что вектор r R удаляется от оси медленнее увеличивающегося параметра, т.е. (Р2/Р2k) (см. рис. 11.11, д). Одновременное увеличение значений обоих параметров фотодвижения (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) (причем первый увеличивается медленнее) с ростом концентрации соли приводит к увеличению величины r, причем направление q вектора r изменяется так, что вектор R удаляется от оси медленнее увеличивающегося параметра, т.е. (Р1/Р1k) (см.

рис. 11.11, е).

r R Таблица 11.7. Зависимость величины r и направления (q 1, q и q 3) вектора в четырехмерной системе координат от вида и концентрации солей тяжелых металлов при одновременном измерении четырех параметров фотодвижения водоросли Dunaliella viridis [Posudin et al., 1996] Концентрация соли, М Соль Параметры r, q 1,q 2 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10- фотодвижения (контроль) V/Vk, F/Fk, r 2,00 2,01 2,06 2,38 3,07 5,61 СuSO45H2O (Nim/No)/(Nim/No)k q1 60,90 61,90 67,05 72,55 84,68 60, q и n/nk 54,73 56,86 56,86 71,10 71,10 83,73 q3 45,24 41,58 41,58 29,77 29,77 21,97 V/Vk, F/Fk, r 2,00 2,04 2,11 3,05 4,31 5,63 7, Pb(NO3)2 q1 60,00 61,04 62,59 71,63 77,26 80,60 83, (Nim/No)/(Nim/No)k q и n/nk 54,73 58,97 61,98 73,75 79,86 96,18 88, q3 45,24 41,82 39,27 22,35 22,35 11,52 10, V/Vk, F/Fk, r 2,00 1,96 1,93 1,86 2,38 3,55 CdCl2 q (Nim/No)/(Nim/No)k 60,00 59,74 59,65 58,88 66,97 76,14 q и n/nk 54,73 56,68 58,91 71,70 85,28 88,17 q3 45,24 45,01 45,48 43,86 28,96 18,35 - 149 Степень точности оценки действия тяжелого металла при увеличении числа регистрируемых параметров повышается. Использование векторного метода в условиях нашего эксперимента позволяет дать сравнительную оценку токсичности трех исследованных тяжелых металлов (Рb Сu Cd) и наиболее токсичных концентраций их солей (10-2 М для СuSO45H2O и CdCl2, 10-1 M для Pb(NO3)2).

Использованные в наших экспериментах концентрации (10-4-10-1) М солей тяжелых металлов (СuSO45H2O;

CdCl2;

Pb(NO3)2) встречаются лишь в сточных водах, причем токсическое действие оказывают не сами металлы, а ряд соединений, выступающих в качестве антагонистов или синергистов. Нельзя не принять во внимание и возможное формирование комплексов металлов, приводящее к потере токсичности.

Таблица11.8 Влияние вида и концентрации пестицидов на параметрыфотодвижения Dunaliella viridis [ Posudin et al., 1996] Пара Концентрация пестицидов, М Вид Метры пести- фотодви цида жения и 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10- (контроль) вектора R V 38±5 37± 43± 5 43±4 43±5 43±4 42± F 0,35±0,03 0,30±0,04 0,20±0,05 0,10±0,04 0,05±0,04 0 Арилон R 1,41 1,31 1,15 1,07 1,02 0,88 0, 60,3 74,3 81,9 90 45 49, V 49±3 48±4 47±4 46±4 42±4 28±5 F 0,31±0,03 0,30±0,04 0,25±0,04 0,19±0,05 0,15±0,04 0,15±0,04 Фураре R 1,41 1,38 1,26 1,16 1,05 0,55 45 45,3 49,8 54,1 54,6 49,9 V 48±5 46±5 45±4 44±5 43±5 42±3 40± F 0,32±0,04 0,26±0,04 0,22±0,05 0,14±0,04 0,11±0,05 0,05±0,04 Эрадикан R 1,41 1,26 1,17 1,02 0,95 0,88 0, 45 49,8 53,7 64,4 69,1 79,6 V 48±5 47±4 46±4 45±4 41±6 31±3 F 0,42±0,04 0,33±0,05 0,25±0,04 0,18±0,04 0,12±0,07 0,05±0,04 Ацетазин R 1,41 1,25 1,13 1,03 0,89 0,65 45 51,5 58,4 65,4 71,8 79,4 V 44±5 44±5 43±4 42±7 41±6 40±3 35± F 0,44±0,05 0,32±0,05 0,27±0,04 0,17±0,06 0,10±0,05 0 Текто R 1,41 1,23 1,15 1,03 0,96 0,91 0, 45 53,9 58,1 67,7 76,1 - V 44±5 44±3 44±4 43±5 42±3 40±5 F 0,44±0,05 0,33±0,04 0,32±0,05 0,27±0,03 0,27±0,03 0,08±0,05 Ацетал R 1,41 1,39 1,28 1,28 0,94 1, 45 45 45,9 50,1 50,1 75,2 V 46±5 46±3 46±4 45±5 43±4 40±5 F 0,44±0,05 0,12±0,04 0,12±0,05 0,05±0,04 0,03±0,04 0 Алахлор R 1,41 1,41 1,41 1,07 0,96 0,87 45 45 45 66,8 90 90 V 42±3 42±5 42±4 40±4 35±5 30±4 27± F 0,26±0,05 0,24±0,04 0,22±0,04 0,17±0,04 0,19±0,04 0,05±0,04 Ладок R 1,41 1,36 1,31 1,15 0,83 0,73 0, 45 49,6 49,6 55,6 65,4 75,0 V 48±4 48±4 48±4 48±5 48±4 48±5 27± F 0,37±0,04 0,37±0,01 0,37±0,04 0,32±0,05 0,30±0,05 0,20±0, Баста R 1,00 0, 1,41 1,41 1,41 1,05 1, 45 45 45 49,3 50,9 87, 46± V 48±4 48±4 47±3 41±4 33±3 0,33±0, F 0,41±0,05 0,38±0,04 0,35±0,04 0,30±0,05 0,24±0,06 Дуал 1, R 1,41 1,07 1,04 1,02 0,73 50, 47,1 50,5 49,9 45 49, V 46±5 46±5 46±5 46±5 46±5 46±5 46± F 0,38±0,04 0,38±0,04 0,38±0,04 0,38±0,04 0,38±0,04 0,38±0,04 0,33±0, ДПХ R 1,41 1,41 1,41 1,41 1,41 1,41 1, 45 45 45 45 45 45 48, V 45±5 45±5 45±5 45±5 45±5 45±5 45± F 0,40±0,05 0,04±0,05 0,40±0,05 0,40±0,05 0,40±0,05 0,40±0,05 0,35±0, Гармони R 1,41 1,41 1,41 1,41 1,41 1,41 1, 45 45 45 45 45 45 48, - 150 r R от вида 11.6.3. Зависимость вектора и концентрации пестицидов Результаты. Влияние пестицидов различных видов в различных концентрациях на параметры фотодвижения D. viridis представлено в табл. 11.8. Типичные примеры зависимости величины r и r направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения D. viridis) от вида и концентрации пестицидов представлены на рис. 11.16.

r Рис. 11.16. Зависимость величины r и направления q вектора R, построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения Dunaliella viridis) от вида и концентрации (10-9;

10-8;

10 ;

10-6;

10-5;

10-4;

10-3;

10-2 М) пестицидов. По осям координат отложены относительная скорость поступательного движения клеток V/Vk и относительный фототопотаксис F/Fk [Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996].

Обсуждение результатов. Клетки D. viridis демонстрируют различную чувствительность к разным видам пестицидов. Отклик параметров фотодвижения клеток на некоторые пестициды начинается с концентраций 10 -4 М (ДПХ, гармони), тогда как на другие (арилон, эрадикан, ацетазин, текто) – с 10-9 М.

Интересно отметить специфическое действие некоторых пестицидов (алахлор, арилон) на фототопотаксис D. viridis, который подавляется в концентрациях, при которых скорость движения клеток остается без r изменений. Как правило, с ростом концентрации пестицида поведение вектора R в координатах (V/Vk, F/Fk) r характеризуется уменьшением величины r и поворотом вектора R против часовой стрелки (см. рис. 11.16).

11.6.4. Преимущества векторного метода биотестирования Увеличение числа измеряемых одновременно параметров фотодвижения водорослей и их обработка с помощью векторного метода позволят выявить более отчетливые различия в реакции тест-объектов на действие различных токсикантов. Количественную оценку концентраций конкретного токсиканта можно производить путем сравнения полученных опытных числовых данных с калибровочными, соответствующими определенной концент-рации данного токсиканта. Это сравнение можно производить с помощью компьютера на основании заложенных в его память данных. Предложенный метод позволяет также приблизиться к качественной оценке токсикантов, т.е. к их идентификации. Дальнейший прогресс в проведении подобных исследований авторы видят в использовании векторного метода и оценке его чувствительности при разных уровнях истинного загрязнения природных (пресных и морских) вод.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Высокая чувствительность видов Dunaliella к факторам окружающей среды обусловливает возможность их использования в качестве тест-объектов в процессах ее биомониторинга. Большим преимуществом этих объектов является их микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, фотокинетическим и фотовекторным реакциям, а также их солеустойчивость и эвригалобность.

- 151 В наших экспериментах изучена чувствительность различных параметров фотодвижения Dunaliella salina и D. viridis к наличию в среде обитания поверхностноактивных веществ (ПАВ: катионактивного катамина, анионактивного - натриевой соли додецилсульфокислоты, неионоактивного - гидропола, природного соединения полисахаридной природы, выделенного из синезеленых водорослей - возбудителей “цветения” воды в днепровских водохранилищах, а также их комбинаций при концентрациях от 1 до 40 мг/л), солей тяжелых металлов (CuSO4•5H2O, CdCl2 и Pb(NO3)2 в концентрациях 10-7-10-2 M и пестицидов (ацетал 55 %, ацетазин 50 %, алахлор 45 %, арилон 75 %, баста 20 %, дуал 96 %, ДПЦ 20 %, гармони 75%, текто % в концентрациях от 10-9 до 10-2 M).

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования подвижности, скорости поступательного и вращательного движения клеток, частоты биения их жгутиков, величины фототопотаксиса видов Dunaliella в качестве тест-функций в биологическом мониторинге водных сред.

Впервые предложено использование нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей, что позволяет увеличить чувствительность метода биотестирования. Для оценки действия градиента концентраций разных токсикантов в водной среде на несколько (от двух и более) одновременно регистрируемых параметров движения предложен векторный метод биотестирования, облегчающий обработку большого числа измерений, открывающий возможность приблизиться к количественной оценке концентрации токсикантов, а также к их качественной идентификации.

- 152 Г Л А В А DUNALIELLA КАК ОБЪЕКТ БИОТЕХНОЛОГИИ Исследуемые нами виды Dunaliella интересны с научной и практической точки зрения как модельные объекты для изучения механизмов устойчивости к экстремальным условиям солености, к высоким и низким температурам, к широкой амплитуде рН, как источники генов, кодирующих белки связанные с преодолением экстремальных условий существования, необходимых для получения трансгенных сортов устойчивых растений. Эти виды – объекты массовой культуры, источники промышленного получения b каротина (провитамина А), аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина, корма для рыбоводческих хозяйств и пр. [Масюк, 1973]. Dunaliella salina богатейший источник b-каротина [Дрокова, 1961;

Ben-Amotz et al., 1982a], используемого для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, артритов, рака (кожи, печени, желудка и лейкемии), макулярной дегенерации, астмы. Препараты, изготовленные из этих водорослей и содержащие b-каротин, способствуют повышению аппетита, избавлению от бессонницы.

Возможности использования биомассы Dunaliella, выращенной в водоемах, для производства корма, богатого b-каротином, или раствора b-каротина в масле, который широко используeтся в пищевой и фармацевтической промышленности, отражены в ряде работ [Масюк, 1966, 1967, 1973;

Масюк, Абдула, 1969;

Ben-Amotz, Avron, 1982, 1989, 1990;

Borowitzka et al., 1984, 1986;

Moulton et al., 1987;

Borowitzka, Borowitzka, 1988, 1990;

Mohn, Contreras, 1990;

Dunaliella..., 1992;

Borowitzka, 2005].

12.1. КАРOТИНОИДЫ, b-КАРОТИН И ЕГО СТЕРЕОИЗОМЕРЫ.

БИОСИНТЕЗ b-КАРОТИНА Каротиноиды - это желтые, оранжевые, красные или коричневые пигменты алифатического или алициклического строения, состоящие из изопреновых остатков и сильно поглощающие в сине-фиолетовой области. Они широко распространены в природе. Молекулы каротиноидов представляют собой длинные полиизопреноидные цепи, обладающие системой сопряженных двойных связей. На концах этих молекул находятся ненасыщенные замещенные циклогексановые кольца.

Каротиноиды разделяют на две основные группы: каротины и ксантофиллы. Каротины - это углеводороды, большую часть которых составляют тетратерпены (С40-соединения). Самым распространенным и самым важным из них является b-каротин. Позвоночные в процессе пищеварения способны расщеплять молекулу b-каротина на две молекулы витамина А. Поэтому b-каротин называют также провитамином А.

Ксантофиллы по химическому строению очень близки к каротинам и отличаются от них только тем, что содержат кислород. Поэтому их называют окисленными дериватами каротина. Вопросам изоляции, синтеза, идентификации, химии, стереохимии, свойствам, функциям, распространению каротиноидов посвящена огромная литература, суммированная в ряде монографий [Goodwin, 1980, 1988;

Bauernfeind, 1981;

Britton, 1988 и др.].

Химический синтез b-каротина был осуществлен в 1956 г. Формула b-каротина С40Н56, молекулярный вес 536,9. В кристаллическом виде он имеет фиолетовокрасную окраску, в масляном растворе – от желтой до оранжевой. Стоимость синтетического b-каротина 500 долларов США/кг. Однако потребность в b-каротине из природных источников возрастает с каждым годом [Borowitzka, Borowitzka, 1990].

Особенностью каротиноидов является цис-транс стереоизомеризационный феномен. Теоретически каждая двойная связь b-каротиновой алифатической цепи может существовать в двух конфигурациях, в результате чего может образоваться 272 цис-/транс- изомера b-каротина;

только 12 из них реально известны [Ben-Amotz, Shaish, 1992, in: Dunaliella..., 1992]. Специфическая абсорбционная кривая каротиноидов в - 153 связи с изомеризацией изменяется. Например, цис-стереоизомеры характеризуются сдвигом абсорбционного максимума с цис-пиком в ультрафиолетовой области. Считалось, что в большинстве случаев каротиноиды встречаются в природе в виде транс-форм. Однако в настоящее время показано, что природный b-каротин, экстрагированный из разных источников, содержит много различных моно-, би- и поли-цис-форм [Dunaliella..., 1992].

Содержание b-каротина в растениях варьирует в пределах от 0,01 до 10 мг/100 г. Богатыми растительными источниками b-каротина являются зеленые листья петрушки, шпината, брокколи, желтооранжевые плоды мандарин, манго, груш и некоторые овощи: морковь, тыква и др. Большие количества b-каротина аккумулируют отдельные виды микроорганизмов: гриб Phycomyces blakesleanus, дрожжи Rhodotorula (5 и 0,5 мг/г сухого вещества соответственно). Эти природные источники обычно содержат смесь различных каротиноидов, каротиноидных эфиров, каротиноидных изомеров вместе с варьирующим количеством b-каротина.

Dunaliella salina может накапливать в своих клетках огромное количество b-каротина и является самым богатым из известных в настоящее время природных источников провитамина А [Дрокова, 1961;

Милько, 1963;

Aansen et al., 1969;

Ben-Amotz et al., 1982a;

Loeblich, 1982]. b-каротин, накапливемый в клетках D. salina, состоит главным образом из двух стереоизомеров, соотношение которых зависит от количества света, поглощаемого в течение одного клеточного цикла [Ben-Amotz et al., 1982a, 1987, 1988;

Tsukida et al., 1982].

Dunaliella salina - удобный модельный объект для изучения процессов биосинтеза каротина.

Биосинтез b-каротина в клетках D. salina протекает в четыре этапа: 1) образование геранилгеранил пирофосфата из мевалоновой кислоты, 2) конденсация с образова-нием фитоина, 3) десатурация фитоина в ликопин и 4) циклизация ликопина с образованием b-каротина. В качестве промежуточных предшественников b-каротина были идентифицированы фитоин, фитофлюин, x-каротин, нейроспорин, b зеакаротин, ликопин, g-каротин, представленные двумя стереоизомерами каждый [Ben-Amotz et al., 1987;

Ben-Amotz, Shaish, 1992, in: Dunaliella..., 1992].

В условиях, благоприятных для роста и размножения, клетки D. salina имеют зеленую окраску и содержат лишь около 0,3 % b-каротина, т.е. столько же сколько листья растений и клетки других некаротиноносных водорослей. Только в условиях, задержи-вающих рост и размножение клеток, в последних акумулируется b-каротин в виде оранжевых масляных глобул расположенных в межтилакоидных промежутках хлоропласта. Среди параметров, регулирующих процессы роста, размножения и каротинообразования, первоочередное значение имеют интенсивность света, концентрация осмотически действующих солей, температура и содержание в среде биогенных элементов [Милько, 1963;

Масюк, 1966, 1973;

Масюк, Абдула, 1969;

Семененко, Абдуллаев, 1980;

Ben-Amotz et al., 1982a;

Loeblich, 1982]. Чем выше освещенность, тем медленнее рост культуры D. salina, тем интенсивнее каротинообразование. Избыточному накоплению b-каротина в ее клетках способствуют также повышенная концентрация осмотически действующих солей в среде обитания (до 5 М NaCl), экстремальные температуры (выше или ниже ростового оптимума), недостаток биогенных элементов в питательной среде (особенно голодание по азоту).

Таким образом, биосинтез b-каротина в клетках микроскопичаской водоросли Dunaliella salina легко регулируемый процесс. Предполагается, что себестоимость b-каротина, получаемого из водорослей, выращенных в нестерильных условиях под открытым небом в будущем будет снижаться на основе дальнейшего совершенствования технологического процесса [Borowitzka, Borowitzka, 1990;

Borowitzka, 1990, 2005]). Вместе с тем, не исключается целесообразность массового культивирования D. salina в закрытых установках с жестко контролируемыми условиями с целью промышленного получения препаратов природного b-каротина для специального назначения, прежде всего фармацевтической промышленности.

- 154 12.2. DUNALIELLA SALINA – ИСТОЧНИК ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ b-КАРОТИНА В результате поисковых исследований, проведенных в Украине в 1958-1960 гг. группой сотрудников Института ботаники и Института биохимии Национальной академии наук Украины, впервые установлено, что D. salina является самым богатым природным растительным источником b-каротина – провитамина А (до 1100 мг % воздушно-сухого веса водоросли) [Дрокова, 1960, 1961;

Масюк, 1961а, б;

Вендт, 1963;

Гелескул, 1964а, б, 1966, цит. по: Масюк, 1973]. Было показано, что D. salina в массовых количествах вегетирует в соленых водоемах Украины, вызывая красное “цветение” рапы. Естественные запасы этой водоросли в водоемах Крыма в июле–августе 1960 г. составляли около 40 т. [Масюк, 1961б].

Морфологические особенности этой водоросли (отсутствие клеточной оболочки) облегчало задачи извлечения каротина из клеток данного объекта. Все это послужило основанием для постановки вопроса об использовании естественных запасов D. salina для промышленного получения каротина [Дрокова, 1961;

Масюк, 1961 а, б;

Вендт, 1963, цит. по: Масюк, 1973]. Таким образом, впервые было установлено, что D.

salina благодаря своим биохимическим, физиологическим, экологическим и морфологическим особенностями является новым перспективным источником для получения b-каротина [Дрокова, 1960, 1961;

Масюк, 1961 а, б;

Вендт, 1963;

Гелескул, 1964 а, б, 1966, цит. по: Масюк 1973;

Гелескул, 1968].

Дальнейшие исследования показали, что D. salina является перспективным объектом для искусственного культивирования с целью промышленного получения b-каротина [см. обзор: Масюк, 1973].

Эвригалобность, эвритермность, гелиофильность и теневыносливость, устойчивость к колебаниям химического состава питательной среды, в т. ч. к содержанию основных биогенных элементов и концентрации гидроксильных ионов – все это делает D. salina удобным объектом биотехнологии. Типичный гипергалоб, D. salina обеспечена от конкуренции с преобладающим большинством других организмов и поэтому часто в открытых природных бассейнах развивается в виде монокультуры [Масюк, 1961а, б]. Это значительно упрощает ее культивирование в бассейнах под открытым небом.

Было показано, что концентрационные, температурные и световые оптимумы роста и размножения клеток D. salina, с одной стороны, и биосинтеза в них каротина, с другой, различны (рис. 12.1) [Милько, 1963;

Юркова, 1965;

Масюк 1965б, в, 1966, 1967;

Масюк, Абдула, 1969]. Исходя из того, что основные биологические процессы, обеспечивающие высокий урожай каротина (размножение клеток водоросли и биосинтез в них b-каротина) требуют для своего осуществления различных условий, был впервые предложен двухэтапный метод выращивания каротиноносных водорослей;

на первом этапе, на фоне двухмолярной (по NaCl) среды с добавлением биогенных элементов, при температуре 25-30 °C и освещенности 5-6 тыс. лк идет накопление биомассы водорослей, на втором - в открытых бассейнах при концентрации NaCl 4-5 М и температуре 35-40 °С, освещенности до 100 тыс. лк, без добавления биогенных элементов, – биосинтез каротина [Масюк, 1965а, б, в, 1966, 1967;

Масюк, Абдула, 1969, 1971]. Метод впервые был апробирован в 1963-1965 гг. под открытым небом в окрестностях Киева [Масюк, 1966], где, исходя из средней продукции каротина (24 мг/м2 в сутки), был впервые рассчитан возможный выход каротина за вегетационный сезон (5 месяцев в условиях Киева) – свыше 30 кг/га за сезон.

Предложенный метод массового культивирования D. salina с целью полупромышленного получения b-каротина был впервые положен в основу создания экспериментального каротинового хозяйства площадью 0,5 га на базе Сакского химического завода в Крыму с использованием дешевых хлормагниевой рапы и удобрений (суперфосфат, аммиачная селитра, калийная соль и др.) Опытное хозяйство располагало пятнадцатью 200-литровыми пластиковыми лотками, четырьмя однокубовыми и четырьмя пятикубовыми бетонированными бассейнами, в которых размножали посевной материал, а также рядом промышленных бассейнов с земляным дном (рис. 12. 2), в которых проходил второй этап – накопление каротина. Опыты, проведенные в этом хозяйстве в 1965-1968 гг., показали возможность получения на юге Украины до 120 кг каротина/га за вегетационный сезон (7 месяцев) [Масюк, Абдула, 1969;

Масюк и др., 1970;

Масюк, 1973].

- 155 Была также продемонстрирована возможность неоднократного повторного использования отработанной рапы в циклическом производстве каротина [Масюк, 1973].

Рис.12.1. Накопление биомассы во- дорослей и каротина в массовой культуре Dunaliella salina: 1 – плотность клеток;

2 – содержание каротина в клетках водорослей;

3 – содержание каротина в 1 л суспензии [Масюк, 1973].

и инженерные параметры [Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Параллельно была разработана оригинальная технология получения препаратов каротина в растительном масле, состоявшая из следующих этапов: 1) механическое разрушение клеток водорослей;

2) флотация клеточных осколков с каротином;

3) со осаждение последних с гидратом окиси железа и отделение осадка от рапы;

4) экстрагирование пигмента органическими растворителями и получение препаратов каротина [Вендт и др., 1965;

Гелескул, 1966, цит.

по: Масюк 1973]. К сожалению, по независимым от авторов причинам эти разработки не были доведены в Украине до промышленного внедрения.

Однако с прекращением исследований каротиноносных водорослей в Украине интерес к D. salina как продуценту b-каротина в мире не угас. В 70-е годы эти исследования были продолжены в Израиле, США, Австралии, Китае и других странах. Внимание ученых было сосредоточено на изучении механизмов солеустойчевости, осморегуляции, биосинтеза глицерина и b-каротина [Ben-Amotz et al., 1982a, b;

см.

обзоры: Borowitzka, Borowitzka, 1990;

Dunaliellа …, 1992].

В конце 70-х гг. возможностью получения b-каротина из D. salina заинтересовались коммерческие компании, что значительно ускорило исследования и создание экспериментальных каротиновых заводов на базе полупромышленного культивирования D. salina. В начале 80-х гг. в Западной Австралии, южнее тропика Козерога, в 100 км севернее Перта на базе морской лагуны, расположенной на 280 южной широты, было заложено экспериментальное каротиновое хозяйство и к 1982 г. построены первые опытные пруды площадью 10, 100, 250 и 600 м2. В 1986 г. были построены еще пять промышленных прудов, в 5 раз превышающих размеры опытного хозяйства, а в конце 1986 г. официально открыт завод по производству каротина. В 1988 г. число прудов удвоили. Параллельно с расширением производственных площадей проводились исследования, совершенствовались биотехнологические - 156 Рис.12.2. Экспериментальное каротиновое хозяйство на сырьевой базе Сакского химзавода, Крым, Украина, 1965 1969 гг.: А – лотки и бетонированные бассейны, в которых осуществляется первый этап выращивания Dunaliella salina;

Б - промышленные бассейны с земляным дном [Масюк, 1973].

Одним из наиболее сложных, трудоемких и дорогостоящих этапов в технологии получения каротина из микроскопических водорослей является отделение биомассы водорослей от жидкой среды обитания. Были испытаны методы фильтрации, центрифугирования, флотации и флоккуляции, осаждения, концентрирования клеток в градиенте солености и т.д. [Вендт и др., 1965;

Гелескул, 1966, цит по: Масюк, 1973;

Borowitzka, Borowitzka, 1990;

Mohn, Contreras, 1990]. В числе других был испробован также метод, основанный на фотодвижении (фототопотаксисе) водорослей [Kessler, 1982, цит. по: Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Оптимальной признана технология, базирующаяся на комплексе методов [Borowitzka, Borowitzka, 1990].

В дальнейшем биомасса Dunaliella salina перерабатывается с получением: 1) капсулированного 1,6 4 % раствора b-каротина в растительном масле, рекомендованого в качестве добавки при диетическом питании;

2) 30 % суспензии кристаллического b-каротина в растительном масле, используемого как красителя в пищевой промышленности;

3) сухого продукта, содержащего 2-3 % b-каротина, для использования в качестве кормовой добавки в животноводстве [Borowitzka, Borowitzka, 1990].

Подобные каротиновые хозяйства были созданы также в Южной Австралии, США (Калифорния);

более мелкие фирмы, производящие b-каротин из водоросли D. salina, имеются также в Израиле (см. фото 3, 4), Чили и Великобритании [Borowitzka, 1990;

Borowitzka, Borowitzka, 1990;

Mohn, Contreras, 1990], однако ведущее положение на мировом рынке b-каротина занимает Австралия.

Фото 4.

Фото 3.

Общий вид реактора (фото 3) и деталь реактора (фото 4) для получения биомассы Dunaliella вблизи города Эйлат, Израиль - 157 В последнее время интерес к b-каротину неизмеримо возрос в связи с открытием его противоопухолевой активности и его роли как антиоксиданта в питании человека. В настоящее время D.

salina как источник b-каротина культивируют в индустриальных масштабах в Австралии, США, Японии, Тайване, Китае, Индонезии [Borowitzka, 2005].

Препараты b-каротина Австралия экспортирует в Японию, США, Корею, Тайвань и другие страны.

Общий экспорт b-каротина только в Японию и США в 1990 г. принес 2 миллиона австралийских долларов прибыли [Borowitzka, 1990]. Себестоимость b-каротина из D. salina, по оценкам австралийских производителей, в 90-е годы составляла 50-100 австралийских долларов за кг, а цена природного b-каротина на мировом рынке в это же время колебалась в пределах 500-1000 долларов за 1 кг.

Побочными продуктами производства каротина из водоросли D. salina могут быть глицерин, составляющий до 30 % сухой биомассы водоросли, высококачественный белок, остающийся после экстракции b-каротина, аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты, а также другие ценные природные биологически активные органические соединения [Масюк, 1973;

Ben-Amotz et al., 1982a, b;

Borowitzka, Borowitzka, 1990;

Dunaliella …, 1992].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Виды Dunaliella - продуценты b-каротина, аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина и других ценных органических соединений, а также генов, кодирующих белки, связанные с устойчивостью к экстремальным условиям среды, – перспективные объекты биотехнологии. Массовые культуры Dunaliella используются в качестве источника корма в рыбоводческих хозяйствах для выращивания ценных пород осетровых. Dunaliella salina - самый богатый природный источник b-каротина. Массовое культивирование штаммов этого вида производится в ряде стран с целью промышленного получения препаратов b-каротина, используемых в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине для предупреждения и лечения онкологических, сердечно-сосудистых, офтальмологических заболеваний, авитаминозов, артрозов и других болезней. Изучение закономерностей фотодвижения видов Dunaliella может помочь в решении ряда технологических проблем производства каротина из этих водорослей.

- 158 ОБЩИЕ ИТОГИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Критическое рассмотрение терминологии и классификации разных типов фотоиндуцированного поведения свободно подвижных организмов показало, что существование различных классификационных систем является источником терминологической путаницы. Разработана параметрическая классификация светозависимого поведения как отдельных подвижных клеток (индивидуальный или микроэффект), так и их совокупностей (групповой или макроэффект).

За термином фототаксис (phototaxis) мы сохраняем его первоначальное значение: любое светозависимое перемещение свободно подвижных организмов в пространстве, вызванное светом. Под светозависимыми реакциями (photoresponse, photoreaction) подразумеваются любые немедленные двигательные отклики организмов на любые изменения светового стимула.

Подвижность биологических объектов - частный случай общего физического феномена движения. Поэтому подвижность организмов может быть описана такими параметрами, как скорость (V ), направление (r) и траектория (l ) движения. Световой стимул, в свою очередь, характеризуется такими параметрами, как интенсивность (I), направление ( S ), спектральный состав ( l ), поляризация ( P ), продолжительность, частота и форма световых импульсов. Принимая во внимание параметрический характер обеих величин (света и движения), мы считаем, что классификация фототаксисов должна основываться на параметрическом принципе. Любую зависимость скорости движения отдельных организмов или их групп от любых параметров светового стимула мы предлагаем называть фотокинезом (photokinesis), а зависимость направления движения отдельных организмов или их групп от каких-либо параметров света именуем фототопотаксисом (phototopotaxis) [Масюк та ін., 1988;

Масюк, Посудин, 1991а].

Предложенная классификация может быть детализирована путем учета добавочных параметров движения и света, их взаимодействия, или уточнения некоторых параметров. Классификация фототаксисов, основанная на параметрическом принципе, позволяет упорядочить существующую классификацию и терминологию, предвидеть еще не изученные связи, а также программировать дальнейшие исследования.

Феноменология фотодвижения. Виды Dunaliella подобно другим жгутиковым водорослям проявляют способность к свободному перемещению в жидкой среде под воздействием света, т.е. к фотодвижению (фототаксису).

Фотодвижение Dunaliella осуществляется в виде поступательного движения клетки, которое сопровождается вращением клетки вокруг ее продольной оси, поворотами в стороны от основного направления, а также в виде колебательных движений (“топтания на месте”). Иногда клетка прикрепляется дистальными концами жгутиков к субстрату, судорожно дергаясь вокруг места прикрепления, в результате чего отрывается от субстрата и продолжает свободное плавание.

В отличие от Chlamydomonas reinhardtii [Квитко и др., 1978;

Mitchell, 2000] и Euglena gracilis [Jahn, Bovee, 1968] у видов Dunaliella в процессе фотодвижения наблюдался только цилиарный (гребной или веслообразный) тип движения жгутиков. Лишь в исключительных случаях, при наличии механических преград, когда клетка Dunaliella salina оказывалась зажатой в очень тонком препарате между покровным и предметным стеклами, отмечался возврат к более древнему реликтовому ундуляторному (волнообразному) типу движения жгутиков.

Траектория поступательного движения клетки синусоидальная, проекция ее на плоскости неравномерно зигзагообразная. Предполагается, что подобно Chlamydomonas [Colombetti, Marangoni, 1991] Dunaliella осуществляет вращательные движения клетки вокруг ее продольной оси благодаря биению ее жгутиков в трехмерном пространстве. Движение по синусоиде – результат, хотя и почти синхронного, но неравного числа биения двух жгутиков одной клетки [Shoevaert et al., 1988]. В отличие от Chlamydomonas [Ringo, 1967] при смене направления движения один из жгутиков в клетке Dunaliella прекращает биения, а - 159 второй продолжает гребные удары, в результате чего клетка поворачивается;

после этого первый жгутик возобновляет биения и клетка продолжает двигаться в новом направлении [Dunaliella …, 1992].

Фотореакции. Виды Dunaliella способны к фотокинетическим и фотовекторным реакциям (наличие фотокинетических реакций у Chlamydomonas в литературе оспаривается [Feinleib, Carry, 1967;


Nultsch, Throm, 1975]. У видов Dunaliella в отличие от Chlamy-domonas и Euglena нам не удалось наблюдать фотофобических реакций, хотя литературные данные [Wayne et al., 1991] свидетельствуют о возможности таковых и у Dunaliella.

Фотокинез. Скорость перемещения клеток Dunaliella зависит от интенсивности светового стимула и условий окружающей среды: температуры [Посудин и др.,1988;

Посудин, Масюк, 1993], рН Масюк, Юрченко, 1962;

Масюк, Посудин, 2007], напряженности электрического и электромагнитного поля [Зельниченко и др., 1988, Посудин, 1992а], дозы ионизирующего излучения [Посудин и др., 1992], концентрации блокаторов кальциевых каналов, изоптина и циннаризина [Посудин и др., 1993], азида натрия [Посудин и др., 1995], поверхностно активных веществ [Паршикова та ін., 1990], солей тяжелых металлов и пестицидов [Posudin et al., 1996], а также от комбинации нескольких факторов [Мартыненко и др., 1996].

Однако скорость движения отдельных клеток Dunaliella в условиях наших опытов не зависела от длины волны падающего света [Посудин и др., 1988], от дозы предварительного УФ облучения [Посудин и др., 2004], от концентрации ионов кобальта и кальция, внесения в среду ионофора, повышающего проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, а также ионотропных препаратов, стимулирующих Na+-K+-АТФазу [Посудин и др., 1993].

Средняя скорость поступательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella составляла 48±2 мкм/с (D. salina) и 36±2 мкм/с (D. viridis) [Посудин и др., 1988]. Средние скорости движения двух близких видов D. salina и D. viridis в разных опытах колебались в довольно широких пределах, нивелирущих различия между указанными видами по данному показателю [Посудин и др., 1988;

Posudin et al., 1992;

Посудин и др., 1993;

1995]. Модальное значение средней скорости движения морского вида D.

bioculata 105±5 мкм/с [Dunaliella, 1992]. Эти значения на 1-3 порядка превышают таковые микроорганизмов, не обладающих жгутиковым аппаратом [Nultsch, 1980], и находятся в пределах, известных для других жгутиконосцев, как про - так и эукариотических [Громов, 1985;

Евтодиенко, 1985;

Посудин и др., 1988]. Однако средние скорости движения гипергалобных видов Dunaliella ниже (иногда на порядок), чем таковые морских (Dunaliella bioculata [Dunaliella, 1992]) и пресноводных видов (Chlamydomonas reinhardtii [Racey et al., 1981;

Rffer, Nultsch, 1985], Euglena gracilis [Haupt, 1959;

Bovee, 1968]), что, по всей вероятности, связано с разной вязкостью среды обитания.

Средние скорости вращательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella были практически одинаковыми [Посудин, 1992а]: 0,52±0,04 оборота/с (D. salina] и 0,54±0,04 об./с (D. viridis) и вместе с тем ниже таковой пресноводного Chlamydomonas reinhardtii [Rffer, Nultsch, 1985]. Максимальные значения средних скоростей поступательного и вращательного фотодвижения клеток Dunaliella наблюдались в пределах интенсивности белого света 10-20 Вт/м2, освещенности 150-550 лк, температуры 20-30 °С, рН 8,00 [Посудин и др., 1988;

Масюк, Посудин, 2007].

Если ритмической активностью Haematococcus pluvialis, регулирующей движение клетки, управляют периодические импульсы, предположительно связанные с функционированием сократительных вакуолей [Photomovement, 2001], то у гипергалобных видов Dunaliella пульсирующие вакуоли отсутствуют, а ритм биения жгутиков, по-видимому, связан с другими осцилляторами. Частота биения жгутиков гипергалобных видов Dunaliella (25-50 Гц) того же порядка, что и у пресноводного Chlamydomonas reinhardtii (до 64 Гц) [Rffer, Nultsch, 1985].

Фототопотаксис. Направление движения клеток Dunaliella по отношению к источнику света (фототопотаксис) зависит от параметров светового сигнала (интенсивности света, его спектрального состава, градиентов интенсивности в пространстве и времени) и условий окружающей среды – температуры [Посудин и др., 1991], рН [Масюк, Посудин, 2007], напряженности электрического и электромагнитного полей [Зельниченко и др., 1988;

Посудин, 1992а], дозы ионизирующего [Посудин и др., 1992] и - 160 ультрафиолетового излучения [Посудин и др., 2004], концентраций Са2+, Со2+, циннаризина, изоптина [Посудин и др., 1993], азида натрия [Посудин и др., 1995], поверхностно активных веществ [Паршикова та ін., 1990], солей тяжелых металлов и пестицидов [Posudin et al., 1996], а также от комбинации некоторых из них [Мартыненко и др., 1996]. Однако фототопотаксис видов Dunaliella не зависит от внесения в среду обитания ионотропных препаратов, стимулирующих Na+-K+-АТФазу [Посудін та ін., 1991].

Фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella в лабораторных культурах наблюдался при освещенности 500 лк (положительный) и 40000 лк (отрицательный). Переход от положительного фототопотаксиса к отрицательному зафиксирован при 1500 лк. Эти показатели находятся в границах, известных для других водорослей. Однако пороги чувствительности к слабой и сильной освещенности, перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису у разных видов водорослей отличаются в значительной степени и позволяют судить об их теневыносливости, солнцелюбивости и устойчивости к высокой освещенности.

D. viridis более, чем D. salina, чувствительна к слабому свету (30 лк) [Посудін та ін., 1991], что соответствует особенностям поведения этих двух видов в природе. Оба вида в лабораторной культуре более чувствительны к высокой освещенности (Посудін та ін., 1991], чем Ch. reinhardtii, переход которого к отрицательному фототопотаксису отмечается при 100000 лк [Rffer, Nultsch, 1990].

Переход видов Dunaliella от положительного фототопотаксиса к отрицательному осуществляется иным способом, чем у хламидомонад [Rffer, Nultsch, 1990]. В отличие от последних [Rffer, Nultsch, 1990] у видов Dunaliella не наблюдается изменение характера биения жгутиков от цилиарного (гребного) к ундуляторному (волнообразному), а нарушается лишь частота биения одного из жгутиков, в результате чего происходит поворот клетки и движение ее в противоположную от источника света сторону [Dunaliella, 1992;

наши наблюдения].

В условиях крымских гипергалинных водоемов с высокой степенью освещенности (свыше лк) природные популяции Dunaliella salina, представленные так называемой “красной формой”, демонстрируют отсутствие отрицательного фототопотаксиса [Масюк, 1973]. Таким образом гипергалобные виды D. salina и D. viridis отличаются по степени их чувствительности, как к высокой, так и к низкой интенсивности света, что обусловлено особенностями занимаемых ими в природе экологических ниш.

Максимальные значения положительного и отрицательного фототопотаксиса отмечены при температуре 20-30 0С [Посудін та ін., 1991;

Posudin et al., 1992] и рН 7,35 [Посудин, 1992а;

Масюк, Посудин, 2007].

Приложение электрических полей подавляло фототопотаксис Dunaliella, как и других водорослей (Chlamydomonas reinhardtii [Nultsch, Hder, 1979], Haematococcus pluvialis [Litvin et al., 1978]), что свидетельствует об участии биоэлектрических потенциалов в этом процессе. Повышение температуры от 18° до 30 °С снимает ингибирующее влияние напряженности электрического поля и стимулирует фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella [Зельниченко и др., 1988;

Посудин, 1992а].

Ионизирующее и ультрафиолетовое излучения ингибируют фототопотаксис D. salina и D. viridis [Посудин и др., 1992;

Посудин и др., 2004]. Ингибирующий эффект зависит от дозы облучения, а в случае использования УФ излучения – и от длины волны. Впервые у видов Dunaliella под влиянием УФ облучения обнаружено преобразование положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим ингибированием его до нулевых значений [Посудин и др., 2004].

Фоторецепторная система. Фоторецепторная система видов Dunaliella, как и других зеленых водорослей, состоит из фоторецептора, предположительно расположенного в плазмалемме и в мембранах хлоропластной оболочки (в области, прилегающей к стигме), и стигмы, состоящей у разных видов из одного-двух слоев липидных глобул, расположенных в периферической зоне пластиды (см. обзор: Масюк, Посудин, 1991б). Впервые показано, что в отличие от некоторых других водорослей (Euglena gracilis [Hder, 1987]) виды Dunaliella не имеют дихроичной структуры фоторецептора [Посудин и др, 1991].

Механизмы фоторецепции. Фоторецепция Dunaliella, как, по-видимому, и некоторых других подвижных микроорганизмов, обладающих жгутиками, базируется на взаимодействии нескольких - 161 механизмов: модуляционного, дифракционного и интерференционного. Модуляционный механизм осуществляется в результате вращательного движения клетки вокруг ее продольной оси, во время которого стигма модулирует световой сигнал, попадающий на фоторецептор [Colombetti et al., 1982b;

Kreimer, 1994;

Lebert, Hder, 2000]. При наличии в стигме более, чем одного, слоя пигментированных глобул возможен (как у хламидомонад) интерференционный механизм фоторецепции [Foster, Smyth, 1980;

Меlkonian, Robenek, 1984;

Feinleib, 1985;

Hegemann, Harz, 1998;

Hegemann, Fischer, 2001]. Впервые предложенный нами дифракционный механизм фоторецепции [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin, Massjuk, 1997], по нашему мнению, универсален для всех жгутиконосцев, обладающих глобулярной структурой стигмы [Посудин, Масюк, 1996]. Таким образом, в фоторецепции некоторых жгутиковых, в т.ч. Dunaliella, наблюдается кооперативный эффект одновременного функционирования нескольких механизмов повышения уровня светового сигнала [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin, Massjuk, 1997].

Полученные нами данные свидетельствуют, что в составе фоторецепторных пигментов Dunaliella преобладают не флавины (как у Euglena gracilis [Lenci, 1975;

Colombetti, Lenci, 1980;

Photomovement, 2001]) и не родопсин (как у E. gracilis [Gualtieri et al., 1992), Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis [Sineshchekov et al., 1991a, b, 1994;


Krger, Hegemann, 1994]), а, вероятно, другие каротиноиды и каротинобелки [Посудин и др., 1990], хотя некоторые авторы [Wayne et al., 1991] допускают возможное участие и родопсина в фоторецепции Dunaliella salina.

Что касается механизмов фоторецепции, авторы принимают гипотезу В. Нулча [Nultsch, 1983], согласно которой поглощение фоторецепторной молекулой кванта света сопровождается ее возбуждением и конформационными изменениями фоторецепторных белков. В развитие этой гипотезы предложена модель фоторегуляции движения жгутиковых водорослей на основе конформационных изменений белковых молекул, входящих в состав, как фоторецепторной системы, так и жгутикового аппарата. Согласно этой модели при поглощении света фоторецепторными молекулами происходит возбуждение экситонных или солитонных состояний в a- спиральных участках мембранных белков, сопровождающееся перестройкой их конфигурации с образованием ионных каналов, через которые ионы кальция свободно диффундируют внутрь клетки, стимулируя двигательную активность водоросли [Давыдов, Супрун, 1974;

Посудин, Супрун, 1992]. Выявление сократительного белки центрина в волокнистых структурах жгутикового аппарата Dunaliella свидетельствует о его возможном участии в фотоориентации базальных тел этих водорослей, как это имеет место у других жгутиконосцев [Salisbury, 1988;

МcFadden et al., 1988;

Huang et al., 1988;

Melkonian, 1989;

Dunaliella, 1992;

Bhattacharya et al., 1993;

Ko J.-H., Lee S.-H., 1996;

Koblenz et al, 2003].

Наши опыты с наложением электрических полей [Посудин и др., 1991] свидетельствуют, что в процессах фоторецепции у видов Dunaliella, как и других зеленых водорослей [Marbach, Mayer, 1971;

Litvin et al., 1978;

Nultsch, Hder, 1979;

Синещеков, Литвин, 1982;

Ekelund et al., 1988], определенную роль играют светоиндуцированные изменения мембранных потенциалов.

Сенсорное преобразование светового сигнала. Сенсорное преобразование поглощенного кванта света в двигательную реакцию, как свидетельствуют опыты с ионами кальция, кобальта и веществами, блокирующими или стимулирующими ионные каналы, по всей вероятности, у видов Dunaliella, как и у других зеленых водорослей, имеет ионную природу, подтверждая первостепенную роль Са2+ в этих процессах. Вместе с тем, участие Na+-K+-АТФазы в фоторегуляции движения клеток Dunaliella следует исключить. Отсутствие влияния оуабаина на параметры фотодвижения Dunaliella [Посудин и др., 1993] позволило предположить, что поступление ионов кальция внутрь клеток этих водорослей управляется не с помощью Na+-K+-насоса, как в случае Euglena gracilis [Colombetti et al., 1982b], а, вероятно, непосредственно, через индуцированные светом мембранные каналы, как это имеет место у Chlamydomonas [Nultsch, 1983].

В отличие от Chlamydomonas reinhardtii, во многих случаях реагирующего на введение в среду обитания веществ, стимулирующих или блокирующих ионные каналы неспецифически (аутотомия жгутиков) [Pfau et al., 1983], клетки Dunaliella в этих условиях жгутики не сбрасывают, поэтому их - 162 двигательные реакции можно считать специфическим ответом на блокирование/стимулирование ионных процессов.

Впервые нами показано, что разные параметры фотодвижения Dunaliella (фототопотаксис и относительное число подвижных клеток, с одной стороны, фотокинез с другой) управляются различными механизмами [Посудин, Масюк, 1993]. Об этом свидетельствует наличие (отсутствие) или разная степень зависимости этих параметров от таких факторов окружающей среды, как рН среды, длина волны падающего света, доза предварительного ионизирующего и ультрафиолетового облучения, концентрация ионов кальция, кобальта, соединений, стимулирующих или блокирующих кальциевые каналы, и др.) [Посудин и др., 1988;

1991;

1992;

1993;

1995;

2004;

Massjuk et al., 2005;

Масюк и др., 2006;

Масюк, Посудин, 2007].

Значение данных о фотодвижении водорослей для смежных областей науки. Результаты изучения процессов фотодвижения микроорганизмов представляют интерес не только для фотобиологии, но и для смежных областей науки: эволюционной биологии, филогенетики, систематики, экологии, прикладных аспектов биологии.

Сравнительное изучение фотодвижения двух близких видов одного рода – D. salina и D. viridis показало, что эти виды большей частью не отличаются друг от друга по основным параметрам этого процесса. Это свидетельствует в пользу идентичности структуры их фоторецепторных систем и механизмов фоторегуляции движения их клеток, возникшей в результате длительного процесса их совместной эволюции. Вместе с тем эти виды различаются по их чувствительности к белому свету слабой и высокой интенсивности, а также порогу перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису. По разному реагируют также эти два вида на взаимодействие некоторых факторов, включающих свет (температура, напряженность электрического поля, интенсивность света). В отличие от D. viridis в условиях природных гипергалинных водоемов D. salina не демонстрирует отрицательного фототопотаксиса при освещенности свыше 100000 лк, благодаря защитной функции накапливающегося в ее клетках -каротина.

Разная чувствительность двух видов Dunaliella к свету – результат их адаптации к биотопам, различающимся по фактору света. Такая адаптация обусловливает возможность их сосуществования в одних и тех же водоемах, но в разных нишах: на ярко освещенной поверхности рапы (D. salina) и в ее более затененных придонных слоях (D. viridis).

Неодинакова чувствительность D. salina и D. viridis и к ионизирующему излучению, что по всей видимости, связано с различными размерами их фоторецепторных систем, являющихся мишенями, ответственными за поражение двигательных реакций. Таким образом, различия на внутриродовом уровне не затрагивают структурных особенностей фоторецепторных систем, а также механизмов фоторецепции и сенсорного преобразования светового сигнала в двигательные реакции, а являются результатом либо экологических адаптаций, либо связаны с размерными характеристиками клеток и их органелл.

Немаловажную роль играет также способность одного из видов к избыточному накоплению b-каротина, выполняющего защитные функции.

Более существенны отличия в фотоповедении представителей различных родов, принадлежащих к разным порядкам зеленых водорослей из класса Chlorophyceae – видами Dunaliella (Dunaliellales), с одной стороны, и Chlamydomonas reinhardtii, Haematococcus pluvialis (Chlamydomonadales), с другой.

Так, отличия в спектрах действия и максимумах фототопотаксиса позволяют предположить наличие разных наборов фоторецепторных пигментов: каротиноидов и каротинобелков у Dunaliella [Посудин и др., 1990] и родопсина как основного фоторецепторного пигмента у Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis [Sineshchekov et al., 1991a, b, 1994;

Krger, Hegemann, 1994].

Учитывая различия в структуре стигмы у изученных нами видов Dunaliella и Chlamydomonas reinhardtii, можно полагать, что в фоторецепции Dunaliella, кроме модуляционного механизма, существенную роль играет дифракция света [Посудин, Масюк, 1996;

Posudin, Massjuk, 1997], а у Chlamydomonas reinhardtii – интерференция светового потока [Foster, Smyth, 1980;

Feinleib, 1985;

Hegemann, Harz, 1998;

Hegemann, Fischer, 2001].

- 163 Внесение в среду обитания химических соединений, стимулирующих или блокирующих мембранные ионные каналы, у видов Dunaliella вызывает специфическую, а у Chlamydomonas reinhardtii – неспецифическую (сбрасывание жгутиков) двигательные реакции [Pfau et al., 1983].

У видов Dunaliella не наблюдаются характерные для хламидомонад фотофобические реакции, с другой стороны, подвергается сомнению наличие у Chlamydomonas фотокинетических реакций [Feinleib, Carry, 1967;

Nultsch, Throm, 1975], хорошо выраженных у Dunaliella.

Chlamydomonas и Dunaliella в процессе фотодвижения отличаются по характеру биения жгутиков.

Поступательное движение клетки хламидомонады осуществляется с помощью цилиарного биения жгутиков, назад клетки двигаются благодаря ундуляторному (волнообразному) биению жгутиков [Квитко и др., 1978;

Mitchell, 2000]. Поскольку клетки Dunaliella не способны к фотофобическим реакциям, у них не наблюдается ундуляторное биение жгутиков. Повороты клеток хламидомонад происходят благодаря неравной частоте биения цис- и трансжгутиков [Nultsch, 1991];

клетки Dunaliella при поворотах приостанавливают биение одного из жгутиков [Dunaliella, 1992].

Кроме того, у представителей разных порядков зеленых водорослей отмечены различия в скорости поступательного и вращательного движения клеток [Racey et al., 1981;

Dunaliella, 1992;

Rffer, Nultsch, 1990], по всей вероятности, обусловленные разной вязкостью среды обитания гипергалобных видов Dunaliella и пресноводного Chlamydomonas reinhardtii.

Таким образом, виды Dunaliella отличаются от Chlamydomonas reinhardtii комплексом фундаментальных особенностей, касающихся состава фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции, некоторых деталей сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию, наличия/отсутствия фотофобических и фотокинетических реакций, работы жгутикового аппарата и др.

Полученные результаты согласуются с данными молекулярной кладистики [Buchheim et al., 1990, 1997;

Friedl, 1997;

Proschld et al., 2001], свидетельствующими, что представитель гетерогенного рода Chlamydomonas – Ch. reinhardtii принадлежит к той группе хламидомонад (близкой колониальным Volvocales), которая отстоит от другой группы хламидомонад, близкой Dunaliella (например, Chlamydomonas applanata Pringsh.], на расстояние сравнимое с таковым между соей и цикадами [Buchheim et al., 1990].

Возможно, дальнейшее накопление, обобщение и таксономическая интерпретация комплекса морфологических (включая ультраструктурные), физиолого-биохимических, фотобиологических и молекулярно-биологических данных приведет к созданию классификации зеленых водорослей, в которой Dunaliella spp. и Chlamydomonas reinhardtii окажутся в разных классах, представляющих разные эволюционные направления в пределах Chlorophyta.

Интересны данные, касающиеся фотодвижения Tetraselmis viridis (Roukhiyajnen) Norris et al.

[Halldal, 1961], представляющего отдельный класс зеленых водорослей - Chlorodendrophyceae [Масюк, 2006]. Фотодвижение в ультрафиолетовой области спектра и наличие в этой области максимумов фототопотаксиса свидетельствуют о возможном присутствии в составе фоторецепторных пигментов этого вида флавинов и/или птеринов [Посудин и др., 1990]. Таким образом, в различных ветвях филогенетического древа зеленых растений эволюция фоторецепторных систем, в частности, состава фоторецепторных пигментов могла происходить разными путями.

Еще более глубокие отличия, касающиеся структуры фоторецептора, обнаружены между Dunaliella spp. и Euglena gracilis Klebs – представителя отдела Euglenophyta6.

Dunaliella отличается от Euglena не только меньшей скоростью движения клеток, большей чувствительностью к низкой и высокой интенсивности света, более низким порогом перехода положительного фототопотаксиса в отрицательный, что, видимо, связано с экологическими особенностями на уровне видов. До сих пор только у видов Dunaliella под воздействием предварительного По мнению некоторых авторов, Euglena и Dunaliella относятся к разным царствам: Euglenozoa Cavalier-Smith, 1981, Euglenobionta Kussakin et Drozdov и Plantae Leedale, 1974, Viridiplantae Cavalier-Smith, 1981 соответственно, либо даже к разным надцарствам живой природы: Discicristata (Mirabdullaev) Leontiev et Akulov (Леонтьев, Акулов, 2002) ex Zmitrovich 2003 и Lamellicristata (Taylor) Starobogatov (Старобогатов, 1986) emend. Zmitrovich (Змитрович, 2003).

- 164 ультрафиолетового облучения наблюдали переход положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим полным подавлением фототопотаксиса [Посудин и др., 2004]. Различия в спектрах действия фототопотаксиса [Foster, Smyth, 1980] позволяют предположить неидентичность наборов фоторецепторных пигментов. Вместе с тем, обнаружены различия и в структуре фоторецептора: кристаллического, дихроичного у Euglena [Hder, 1987] и некристаллического, недихроичного у Dunaliella [Посудин и др, 1991].

Учитывая особенности фоторецепторной системы эвгленофитовых водорослей, в частности, строения стигмы, можно полагать, что им свойственен лишь наиболее древний, первичный модуляционный механизм фоторецепции, унаследованный от прокариот или общих с ними предков, в то время как у зеленых водорослей могут одновременно функционировать три механизма (модуляционный, дифракционный и интерференционный), повышающие интенсивность поглощаемого фоторецептором светового сигнала [Посудин, Масюк, 1996]. Хотя процессы сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию, по всей вероятности, у всех жгутиковых водорослей имеют ионную природу [Nultsch, 1983], в отличие от зеленых водорослей, у Euglena gracilis в управлении этими процессами участвует Na+-K+-насос [Colombetti et al., 1982]. Euglena отличается от видов Dunaliella и Chlamydomonas reinhardtii также своеобразным характером работы жгутикового аппарата: во время биения жгутик Euglena gracilis приобретает вид “прерваной спирали” [Jahn, Bovee, 1968]: спиральные участки жгутика прерываются прямыми отрезками жгутика;

типичные для зеленых водорослей цилиарный и ундуляторный типы движения жгутика у эвглен не наблюдаются.

Таким образом, с возрастанием филогенетической дистанции между таксонами увеличиваются и углубляются различия в их фотоповедении, структуре и механизмах функционирования фоторецепторных систем, сенсорного преобразования светового сигнала в двигательные реакции разного типа, в работе жгутикового аппарата. Поэтому сведения об особенностях фотодвижения водорослей могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциальных критериев в эволюционной биологии, филогенетике, систематике и таксономии водорослей.

Наряду с указанными различиями в процессах фотодвижения и его фоторегуляции у представителей разных таксонов жгутиконосцев имеются общие черты: структура фоторецепторной системы, за немногими исключениями состоящая из фоторецептора и стигмы, первичный модуляционный механизм фоторецепции, с которым у представителей разных таксонов, в зависимости от структуры стигмы могут быть скооперированы дополнительные механизмы (дифракционный, интерференционный), ионная природа фоторецепции и сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию при главенствующей роли в этих процессах ионов кальция, возможное участие в этих процессах индуцированных светом изменений мембранных электрических потенциалов, конформационные изменения белковых молекул, как основа фоторецепции и сенсорного преобразования, участие центрина в фотоориентации базальных тел и др.

Вместе с тем следует признать, что экспериментальные данные относительно особенностей фотодвижения водорослей – представителей разных таксонов – еще слишком неполны, охватывают небольшое число модельных объектов. К сожалению, эти исследования не всегда проводятся по единому плану на должном методическом уровне. Поэтому результаты, полученные на разных объектах, представителями разных школ фотобиологов в разных странах, не всегда сравнимы, и сделанные нами выводы имеют лишь предварительный характер. Это всего лишь необходимый этап подведения промежуточных итогов в процессе продолжающихся исследований, которые могут эти выводы уточнить, изменить или опровергнуть.

Изучение особенностей фотодвижения водорослей представляет несомненный интерес для экологии и географии водорослей, в частности для аутэкологии, так как позволяет уточнить характеристики отдельных видов, касающиеся их отношения к параметрам света, определить оптимумы, максимумы и минимумы факторов окружающей среды для параметров фотодвижения разных видов, способствует - 165 разделению их на группы тенелюбивых и светолюбивых, теневыносливых и светоустойчивых организмов, а также более глубокому пониманию закономерностей их распределения на планете Земля.

Прикладное значение результатов изучения параметров фотодвижения у видов Dunaliella определяется, прежде всего, принадлежностью этого рода к обширному царству зеленых растений (Viridiplantae), доминирующему на нашей планете и играющему решающую роль в обеспечении практических нужд человечества. Гипергалобные виды Dunaliella – классические модельные объекты для изучения механизмов солеустойчивости, осморегуляции, проницаемости мембран. процессов биосинтеза каротина у растений и фотодвижения. Благодаря способности к гиперсинтезу b-каротина, осмотически действующих соединений стратегического назначения, высокому содержанию других физиологически активных веществ виды Dunaliella являются ценными объектами биотехнологии [Масюк, 1973;

Dunaliella …, 1992]. Высокая чувствительность к факторам окружающей среды обусловливает возможность их использования в качестве тест-объектов в процессах ее биомониторинга. Большим преимуществом этих объектов является их микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, фотокинетическим и фотовекторным реакциям. Изучена чувствительность различных параметров фотодвижения Dunaliella salina и D. viridis к наличию в среде обитания поверхностно-активных веществ (ПАВ), солей тяжелых металлов и пестицидов (Посудин и др., 1996;

Posulin et al., 1996).

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования скорости поступательного и вращательного движения клеток, частоты биения их жгутиков, величины фототопотаксиса видов Dunaliella в качестве тест-функций в биологическом мониторенге водных сред. Впервые предложено использование нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей, что позволяет увеличить чувствительность метода биотестирования. Для оценки действия градиента концентраций разных токсикантов на несколько одновременно регистрируемых параметров движения предложен векторный метод биотестирования, облегчающий обработку большого числа измерений, позволяющий приблизиться к количественной оценке концентрации токсинов, а также к их качественной идентификации (Посудин и др., 1996;

Posudin et al., 1996).

Виды Dunaliella – продуценты b-каротина, аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина и других ценных органических соединений – перспективные объекты биотехнологии, которые культивируют во многих странах [Масюк, 1965, 1966, 1967, 1973;

Масюк, Абдула, 1969;

Ben-Amotz, Avron, 1982, 1989, 1990;

Borowitzka et al., 1984, 1986;

Borowitzka, Borowitzka, 1988, 1990;

Mohn, Contreras, 1990;

Dunaliella …, 1992]. Массовые культуры Dunaliella используются в качестве источника корма в рыбоводческих хозяйствах для выращивания ценных пород осетровых. Dunaliella salina – самый богатый природный источник b-каротина. Массовое культивирование штаммов этого вида производится в ряде стран с целью промышленного получения препаратов b-каротина, используемых в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине для предупреждения и лечения онкологических, сердечно-сосудистых, офтальмологических заболеваний, авитаминозов, артрозов и других болезней. Изучение закономерностей фотодвижения видов Dunaliella может помочь в решении ряда технологических проблем производства каротина из этих водорослей.

Дальнейшее развитие исследований в области фотобиологии движения микроскопических жгутиковых водорослей мы видим в следующих направлениях:

1. Расширение состава модельных объектов среди водорослей – представителей таксонов разного таксономического ранга, занимающих различное положение в системе органического мира [Масюк, Костіков, 2002;



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.