авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
-- [ Страница 1 ] --

Российская Академия Наук

Дальневосточное отделение

Институт биологических проблем Севера

На

правах рукописи

Скоробрехова Екатерина Михайловна

Морфология взаимоотношений скребня Corynosoma strumosum

(Acanthocephales: Polymorphidae) и паратенических хозяев в

природе и эксперименте

Специальность 03.02.11 – паразитология Научный руководитель д.б.н. В.П. Никишин Магадан – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

Введение………………………………………………………………………………...5 Глава 1. Обзор литературы………………………………………………...………... 1.1. Вводная часть……………………………………………………………………… 1.2. Жизненные циклы скребней………………………………………..…………….. 1.3. Морфология покровов скребней……………………………………………......... 1.4. Взаимоотношения скребней с окончательными хозяевами…………………... 1.5. Взаимоотношения скребней с промежуточными хозяевами…………………. 1.6. Взаимоотношения скребней с паратеническими хозяевами………………….. Глава 2. Материалы и методика………………………………………………….. 2.1. Материал из естественных паратенических хозяев…………………………… 2.2. Методика свето-микроскопических исследований……………………………. 2.3. Методика электронно-микроскопических исследований……………………... 2.4. Методика экспериментов по заражению скребнем Corynosoma strumosum Hadropareia middendorffii) естественного (толстощек Миддендорфа и неестественных (хромис-красавец Hemichromis bimaculatus и прыткая ящерица Lacerta agilis) паратенических хозяев……………………………….……………… 2.4.1. Эксперимент по заражению толстощека Миддендорфа…………….. 2.4.2. Эксперимент по заражению хромиса-красавца………….……………. 2.4.3. Эксперимент по заражению прыткой ящерицы……………...……..… Глава 3. Сведения о жизненном цикле скребня Corynosoma strumosum……... Глава 4. Результаты исследований……………………………………………….. 4.1. Морфология покровов скребня Corynosoma strumosum………………………. 4.1.1. Световая микроскопия………………………………………………….... 4.1.2. Электронная микроскопия………………………………………………. 4.2. Морфология капсулы, окружающей скребня Corynosoma strumosum в паратенических хозяевах разных видов…………………………………………….. 4.2.1. Тихоокеанская зубастая корюшка…………………………………….… 4.2.2. Обыкновенная малоротая корюшка…………………………………….. 4.2.3. Тихоокеанская навага…………………………………………………….. 4.2.4. Пятнистый терпуг………………………………………………………. 4.2.5. Керчак Стеллера…………………………………………………………. 4.2.6. Желтоперая камбала…………………………………………………….. 4.2.7. Толстощек Миддендорфа………………………………………………... 4.3. Экспериментальное исследование процесса капсулообразования вокруг скребня Corynosoma strumosum в естественном паратеническом хозяине – толстощеке Миддендорфа…………………………………………………………… 4.

4. Экспериментальное исследование процесса капсулообразования вокруг скребня Corynosoma strumosum в неестественных паратенических хозяевах……. 4.4.1. Хромис-красавец………………………………………………………….. 4.4.2. Прыткая ящерица…………………………………………………….... Глава 5. Обсуждение полученных данных……………………………………... 5.1. Анализ морфологии покровных тканей скребня Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах…………………………………………… 5.2. Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг скребней Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах………………………..……. 5.2.1. Общая характеристика капсул………………………………………... 5.2.2. Характеристика клеточного состава капсул………………….……... 5.2.3. Строение «фибробластической» капсулы.....................………....……. 5.2.4. Строение «лейкоцитарной» капсулы………………………………...... 5.2.5. Строение «промежуточной» капсулы………………………………… 5.3. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в естественном паратеническом хозяине – толстощеке Миддендорфа…………………………… 5.4. Сравнительный анализ морфологии капсулы вокруг Corynosoma strumosum из неестественных паратенических хозяев…………………………………………… 5.4.1. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в хромисе красавце…………………………………………….………………………………... 5.4.2. Особенности инкапсуляции скребня Corynosoma strumosum в прыткой ящерице………………………………………………………………..…….……..... Выводы…………………………………..…………………………………………... Список литературы………………………………………………………………….. Приложение………………………………………………………………………….. Условные обозначения……………………………………………………………… ВВЕДЕНИЕ Паратенический (резервуарный) паразитизм относится к числу распространенных явлений и свойственен многим группам паразитических животных (Шарпило, 2005). Сущность данного явления заключается в том, что инвазионные стадии многих паразитов, оказавшись в несвойственных им хозяевах, могут сохранять жизнеспособность и инвазионность достаточно долгий период времени, до попадания в окончательного хозяина (Шарпило, 2005).

Открытие этого явления, его понимание связано с работами выдающихся ученых гельминтологов ХХ столетия – Л. Сера, Ш. Жуайе, Ж. Бэра, Г. Витенберга, К.И.

Скрябина, Р.С. Шульца, К.М. Рыжикова, В.А. Савинова и многих других. Многие исследователи отмечают, что паратенические хозяева, хотя и не являются обязательными для завершения онтогенетического развития того или иного гельминта, тем не менее, играют серьезную роль в его сохранении, накоплении и распространении.

Представители типа Acanthocephales (Rudolphi, 1808) Skrjabin et Schulz, 1931 относятся к числу таких животных, для которых паратенический паразитизм характерен едва ли не в наибольшей степени (Петроченко, 1958;

Schmidt, 1985). В разных группах скребней он представлен с разной степенью встречаемости, в целом же, по некоторым данным, он отмечен в большинстве отрядов, более чем в половине семейств и почти у трети родов (Шарпило, 1996).

Несмотря на столь широкое распространение, изучению паратенического паразитизма исследователи уделяли неоправданно мало внимания. Возможно, это объясняется тем, что по утвердившемуся ранее мнению паразиты в паратенических хозяевах не претерпевают никакого развития, и паратенические хозяева, таким образом, служат лишь экологическим звеном, оптимизирующим заражение окончательного хозяина. Однако ряд паразитологов, например, К.М.

Рыжиков, Б. Чаплинский, А.А. Мозговой с соавторами, К. Оденинг и другие не исключали возможность определенного развития паразитов в организме паратенического хозяина (Шарпило, 2005). В то же время, изученность, как в целом явления паратенического паразитизма, так и частных его аспектов, например, взаимоотношений паразитов и паратенических хозяев на организменном уровне, остается крайне низкой (Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000). Один из ведущих мировых специалистов в области морфологии скребней H. Taraschewski (Taraschewski, 2000) подчеркивает этот аспект, приводя в пример именно представителей рода Corynosoma.

Таким образом, актуальность наших исследований обусловлена, с одной стороны, особой ролью паратенического паразитизма в жизненных циклах некоторых скребней, с другой стороны, слабой изученностью взаимоотношений скребней с паратеническими хозяевами на организменном уровне.

Цель работы заключалась в изучении Цели и задачи работы.

морфологических особенностей взаимоотношений скребня Corynosoma strumosum (Rudolphi, 1802) Lhe, 1904 с паратеническими хозяевами разных видов на организменном уровне в естественных и экспериментальных условиях.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

Изучить микро- и ультраструктуру покровных тканей скребня C.

strumosum, паразитирующего в организме естественных паратенических хозяев – морских рыб семи видов.

Изучить микро- и ультраструктуру капсулы, окружающей скребня C.

strumosum в естественных паратенических хозяевах – морских рыбах семи видов.

Экспериментально изучить особенности процесса инкапсуляции скребня C. strumosum в естественном паратеническом хозяине – толстощеке Миддендорфа.

Экспериментально изучить особенности процесса инкапсуляции скребня C. strumosum в неестественных паратенических хозяевах – хромисе красавце и прыткой ящерице.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Вводная часть Взаимоотношения паразита и хозяина на уровне организмов – одна из интереснейших, сложнейших и многоплановых проблем в паразитологии. Это обусловлено тем, что многие паразиты обладают сложными жизненными циклами, которые включают хозяев разных категорий, как правило, относящихся к разным таксономическим группам и существенно различающихся между собой по физиологии, биохимии и т.п. Паразит, в свою очередь, успешно адаптируется к разнообразию условий и вырабатывает действенные механизмы защиты от негативного ответа организма хозяина на инвазию (Краснощеков, 1995, 1996).

В предлагаемом обзоре рассмотрены морфологические и, в определенной степени, патоморфологические аспекты паразито-хозяинных взаимоотношений акантоцефалов для которых характерны сложные жизненные циклы с участием хозяев разных категорий. Кроме того, необходимо отметить, что, несмотря на довольно обширную литературу по различным аспектам патологии и иммунологии при гельминтозах, сведений о морфологии взаимоотношений гельминтов и их хозяев разных категорий немного (Всеволодов, 1976), а по некоторым группам, к которым относятся и скребни, и просто мало.

Как известно, гельминты могут быть разделены на полостных, населяющих различные полостные органы организма хозяина, и тканевых, обитающих в его тканях и полости тела (Шульц, 1972;

Оксов, 1991). Соответственно характер взаимоотношений будет, очевидно, существенно различаться. В то же время такое разделение нельзя принимать безоговорочно, поскольку в ряде случаев полостные или просветные формы, вступая в тесный контакт с тканями хозяина, неизбежно подвергаются ответным реакциям, в определенной степени, вероятно, напоминающим ответ, характерный для тканевого паразитизма.

1.2. Жизненные циклы скребней Жизненные циклы всех современных скребней являются диксенными, т.е.

характеризуются обязательным участием промежуточного и окончательного хозяев (Шульц, 1972). В качестве последнего выступают исключительно позвоночные животные, промежуточными же являются только членистоногие, преимущественно ракообразные, и значительно реже насекомые (Schmidt, цит. по Шарпило, 1998). Строго диксенный характер, а также ограниченный круг облигатных промежуточных хозяев свидетельствуют об эволюционном консерватизме жизненных циклов скребней (Шарпило, 1998). Несмотря на это, однако, весьма широкая гостальная радиация некоторых скребней была обеспечена, по мнению этих авторов, включением в жизненный цикл паратенических хозяев. В числе таковых известны некоторые группы беспозвоночных, но подавляющее их большинство представлено позвоночными (Шарпило, 1998). Паратенические хозяева могут заражаться как от промежуточных, так и от других паратенических хозяев, причем такой пассаж может повторяться неоднократно (Рыжиков, 1952;

Савинов, 1964;

Шарпило, 1965).

1.3. Морфология покровов скребней Тегумент. В целом, морфология пограничной ткани (тегумента) скребней изучена относительно неплохо, хотя и на ограниченном количестве видов (Богоявленский, 1978;

Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000). В частности, были обнаружены различия в организации тегумента метасомы и пресомы. В составе тегумента метасомы на основании морфологических признаков к настоящему времени выделяются гликокаликс, покровный комплекс, а также поперечно полосатый (исчерченный или полосатый), везикулярный, войлочно-волокнистый (войлочный), радиально-волокнистый (радиальный) и трубочковый слои (Никишин, 1998, 2000, 2004). У представителей разных классов различные элементы пограничной ткани выражены в разной степени (Богоявленский, 1978), однако более детальные сведения по этому вопросу, в том числе полученные на основании электронно-микроскопических исследований, в литературе отсутствуют.

Тегумент пресомы морфологически существенно отличается от тегумента метасомы (Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000), причем различия имеют как количественный, так и качественный характер. По толщине тегумент пресомы значительно, иногда в несколько раз, тоньше тегумента метасомы (Барабашова, 1971;

Богоявленский, 1978;

Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000). Помимо узкого слоя гликокаликса на его поверхности у представителей классов Eoacanthocephala и Palaeacanthocephala имеется слой электронно-плотного материала (Никишин, 2004;

Crompton, 1965;

Hammond, 1967;

Taraschewski, 1988a, 1989а, b, 1991а;

Wanstall, 1990;

Zhao, 1990), толщина которого варьирует у разных видов (Taraschewski, 2000). Этот слой обнаружен только на поверхности пресомы и заканчивается строго над перегородкой, разделяющей тегументы метасомы и пресомы (Taraschewski, 2000). Морфологически материал этого слоя напоминает липид, что и было подтверждено гистохимически (Bullock, 1949;

Hammond, 1967;

Taraschewski 1989b), а также специальным ультрагистохимическим методом по Angermller и Fahimi (Angermller, 1982), показавшим наличие в нём нерастворимых жирных кислот (Taraschewski, 2000). Кроме того, в его составе обнаружены мукополисахариды и (или) протеогликаны (Taraschewski, 1989b), а также некоторые литические ферменты, возможно не только приводящие к лизису тканей хозяина, но и стимулирующие образование фиброзной капсулы вокруг внедрившейся части пресомы (Polzer, 1994).

Некоторые авторы рассматривают липидный слой на поверхности пресомы как часть гликокаликса (Herlyn, 2000;

Taraschewski, 2000). Однако, гликокаликс, как известно, является неотъемлемой частью цитоплазматической мембраны многих, в частности, эпителиальных клеток и состоит из кислых и нейтральных мукополисахаридов (Ito, 1969). Морфология гликокаликса у скребней может меняться на протяжении жизненного цикла паразита (Никишин, 2004), однако во всех случаях он морфологически, в том числе и химически отличается от липидного слоя, покрывающего пресому. Формируется этот слой в результате секреции его материала через «каналы» поперечнополосатого отдела тегумента (Никишин, 2004;

Hammond, 1967;

Wanstall, 1990;

Taraschewski, 1991а).

Предполагается, что первоначально этот материал накапливается в лемнисках, куда он может поступать либо из псевдоцелома либо из внешней среды через покров пресомы;

затем, возможно после некоторой трансформации, он выделяется на поверхность пресомы (Никишин, 2004). Возможность участия тегумента в абсорбции пищевых субстанций, ранее полностью отвергавшаяся многими авторами, доказана в отношении липидов и некоторых аминокислот (Taraschewski, 1988b, 1991а, b). Предполагается, что липидный слой играет определенную роль в защите от ответной реакции организма хозяина или же представляет собой своеобразную «смазку», способствуя движениям хоботка и крючьев в толще тканей хозяина (Никишин, 2004;

Hammond, 1967;

Wanstall, 1990).

Другими особенностями тегумента пресомы в отличие от такового метасомы являются меньшие количество и размеры «каналов» исчерченного слоя, бльшее количество и более плотное расположение фибрилл войлочного слоя, отсутствие в тегументе хоботка радиального и трубочкового слоев (Taraschewski, 2000). Однако по другим данным войлочно-волокнистый слой в тегументе пресомы (по крайней мере, у ряда видов), а также везикулярный слой отсутствуют, но имеется модифицированный радиально-волокнистый слой (Никишин, 2004). В целом необходимо еще раз подчеркнуть, что толщина тегумента пресомы, а также его отдельных отделов значительно уступает размерам тегумента метасомы (Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000).

Тегумент на поверхности крючьев обнаружен только у представителей Eoacanthocephala и Palaeacanthocephala (Никишин, 2004;

Taraschewski, 2000). Во всех случаях он имеет относительно небольшую толщину (1,0-1,5 мкм), а в его составе различаются лишь поперечнополосатый, везикулярный и своеобразный, не имеющий аналога в тегументе метасомы, фиброзный слои;

базальная же мембрана имеет такую же складчатую внешность, как и в тегументе пресомы (Никишин, 2004;

Crompton, 1965;

Taraschewski, 1989а, b, 2000;

Wanstall, 1990). У представителей Archiacanthocephala тегумент на поверхности крючьев обнаруживается только до завершения формирования цистаканта, а затем дегенерирует (Hutton, 1980). У скребней, извлеченных из окончательного хозяина, крючья полностью лишены тегумента или его остатков (Taraschewski, 1989c;

Zhao, 1990). По мнению последних авторов, такие таксономические различия связаны с характером фиксации скребня в кишечнике окончательного хозяина.

Гистогенез тегумента изучен очень фрагментарно и только на примере двух видов. На примере Polymorphus minutus показано, что на ультраструктурном уровне первые признаки дифференцировки (перегородка между тегументом пресомы и метасомы, отдельные элементы войлочного слоя, первые лакуны) появляются в середине или в конце стадии средней акантеллы, а на стадии цистаканта тегумент представляется полностью сформированным (Butterworth, 1969). Изменения в морфологии поверхностного отдела тегумента прослежены у формирующихся акантелл Filicollis anatis (Nikishin, 1992). Обнаружилось, что еще у мигрирующего акантора на поверхности тегумента появляются первые короткие микроворсинки, количество и длина которых увеличиваются вплоть до стадии поздней акантеллы;

их отшнуровывающиеся апикальные участки, а затем и сами микроворсинки, участвуют в образовании цисты, окружающей скребня. После отделения микроворсинок от тегумента на стадии поздней акантеллы на их месте формируется мощный слой гликокаликса, характерный для всех исследованных цистакантов и сходный с образующимся на поверхности цисты (эндоцисты) цистицеркоидов (Никишин, 2004, 2011а). Кроме того показано увеличение количества и длины «каналов» исчерченного слоя и толщины всего тегумента, происходящее в период от стадии мигрирующего акантора до стадии цистаканта.

Сведения об особенностях гистогенеза тегумента пресомы в литературе отсутствуют.

Кожная мускулатура. Кожная мускулатура скребней, как и покров, отличается целым набором специфических особенностей. Одна из них – наличие в телах и отростках миоцитов системы лакун, напоминающих лакуны тегумента (Miller, 1977). Такая организация, как полагают авторы, обеспечивает эффективное питание и удаление продуктов метаболизма. По их данным, кожные мышцы скребней представлены тремя синцитиями, два из которых (кольцевые и продольные мышцы) располагаются в метасоме и один – в пресоме (Miller, 1977), однако на электронно-микроскопическом уровне синцитиальное строение мускулатуры доказано только для акантелл (Никишин, 2004). Особенностью кожных мышц также является расположение миофиламентов, организованных по гладкому типу, преимущественно в отростках клеток. При этом пласт миофиламентов организован в виде своеобразных «блоков», разделенных плотными септами (Hammond, 1967) и располагающимися по периферии клеточных элементов. В мышечных клетках некоторых взрослых скребней, цистакантов и поздних акантелл описано явление «ядерной секреции» – периодическое синхронное выделение из ядра в цитоплазму через ядерные поры порций плотного материала (Никишин, 2000). После выделения этот материал в виде прерывистого кольца окружает ядро, при этом могут наблюдаться несколько таких колец. Из-за некоторого сходства этого материала с септами, разделяющими сократительный пласт на «блоки», предполагается, что он участвует в их образовании.

Еще одной особенностью миоцитов скребней, как и плоских червей, является синтез ими межклеточного материала, включая базальную пластинку, осуществляемый в расширенных цистернах гранулярной эндоплазматической сети. Кроме того, мышечные клетки хоботка вносят основной вклад в формирование хоботковых крючьев (Никишин, 2004). Таким образом, миоциты скребней помимо сократительной выполняют и функцию опорно-соединительной ткани. Однако от типичных миофибробластов они отличаются тем, что последние формируются из фибробластов, которые у скребней отсутствуют (Gabbiani, 1973).

Мышечная ткань образует также группу мышц в пресоме, в стенке хоботкового влагалища и в стенках органов половой системы. Сведения о морфологии этой ткани единичны. Относительно лучше изучена структура мышц хоботкового влагалища, поскольку количество мышечных слоев в его стенке (один или два) имеет таксономическое значение (Wanson, 1975). В имеющихся описаниях мышц пресомы, обеспечивающих подвижность хоботка (Dunagan, 1974), и мышечных стенок некоторых внутренних органов (Whitfield, 1968;

Asaolu, 1980, 1981) не показаны особенности, отличающие эту ткань от кожной мускулатуры. Не подтверждены сведения о ее синцитиальном характере, не ясно также, имеют ли эти ткани систему лакун. Во многих случаях, однако, указано, что все мышцы окружены слоем «соединительной» ткани, на самом деле представляющей, слой фиброзного материала, образованного этими миоцитами.

На основании сказанного можно сделать вывод, что мышечная ткань скребней существенно отличается от типичных гладких мышц высших животных.

В сущности, кожная мускулатура скребней, как и плоских червей, является неким аналогом скелетной мускулатуры позвоночных животных. Учитывая своеобразие её организации, предполагается рассматривать мышечную ткань скребней как особую разновидность гладкой мышечной ткани (Никишин, 2011б).

Нервные окончания. Нервные рецепторы не являются покровными тканями, однако, поскольку они располагаются на поверхности тегумента или в его толще, их необходимо рассматривать при анализе взаимоотношений скребней с хозяевами разных категорий. Хотя в целом нервная структура скребней изучена относительно полно (Петроченко, 1956;

Богоявленский, 1978;

Голубев, 1982), внимание исследователей было сконцентрировано на организации и топографии нервных ганглиев и проводящих путей, а сведения об их рецепторном аппарате оставались немногочисленными и противоречивыми. В свое время подробный обзор этих сведений был сделан Миллером и Данегеном (Miller, 1985), и за прошедшее время новых данных практически не добавилось. Считается, что у скребней имеются три разные модификации сенсорных окончаний: апикальный орган, расположенный на вершине хоботка, парные латеральные органы, расположенные в области шейки, и половые рецепторы самцов (Meyer, 1933). В то же время все или некоторые из этих сенсорных окончаний обнаружены не у всех видов, и структура их существенно различается. Например, апикальный сенсорный орган у Macracanthorhynchus hirudinaceus имеет вид небольшой ямки на апикальной поверхности тегумента хоботка, к которой подходят сенсорные нервы (Dunagan, 1983). Сходный по строению орган был описан у Corynosoma hamanni (Nickol, 1968) и у Oligacanthorhynchus thumbi, однако у Giganthorhynchus echinodiscus апикальный орган имеет две папиллы, и каждая открывается наружу одной ямкой (Von Haffner, 1943). Среди представителей Eoacanthocephala апикальный орган, разделенный на два участка, из которых передний содержал три ядра и был производным гиподермы, был описан у Neoechinorhynchus emydis (Van Cleave, 1950). В этих и других описаниях авторы обращали внимание на организацию подводящих нервных путей, но не рассматривали гистологическое строение собственно чувствительного окончания.

То же самое можно сказать о латеральных нервных окончаниях. Эти окончания имеют вид мелких депрессий, окруженных слегка возвышающимся кольцом тегумента, в центре которых располагаются окончания нейритов клеток церебрального ганглия (Miller, 1985). В то же время авторы подчеркивают, что детальная организация этих структур не определена, и не известно даже, у каких видов они имеются. Так, одно из немногих исследование, проведенное с использованием сканирующего электронного микроскопа, показало, что у скребня Gracilisentis gracilisentis отсутствуют как апикальный сенсорный орган, так и парные латеральные органы (Jilek, 1979).

Таким образом, вопрос о структуре нервных окончаний у скребней по сегодняшний день остается открытым.

1.4. Взаимоотношения скребней с окончательными хозяевами Попадая в организм окончательного хозяина из промежуточного или паратенического, скребни поселяются в его пищеварительном тракте. Если хозяин является истинным, т.е. облигатным или факультативным (Шульц, 1972), то скребни успешно приживаются в нем, прикрепляясь к стенке кишки, достигают половой зрелости и размножаются. В других случаях скребни могут либо претерпевать некоторое развитие, но не достигают стадии размножения, либо вовсе не способны к какому-либо развитию и удаляются естественным путем.

В настоящем разделе рассмотрены взаимоотношения скребней с истинными дефинитивными хозяевами, а также случаи, когда скребни по тем или иным причинам изменяют обычную локализацию в кишечнике и перемещаются в полость тела или иные внутренние органы.

Сведения о взаимоотношениях скребней с окончательными хозяевами, в разных аспектах, наиболее полно обобщены в монографической работе H.

Taraschewski (Taraschewski, 2000). В зависимости от длины шейки и, соответственно, от глубины проникновения хоботка в стенку кишечника автор разделил всех скребней на две группы. Гельминты из первой группы, не перфорирующие по терминологии автора, имеют короткую шейку и внедряются только в толщу слизистой оболочки кишечника, поэтому они могут менять свою локализацию, но никогда не встречаются в полости тела окончательного хозяина.

Перфорирующие скребни, имеющие длинную шейку, внедряются глубоко в мышечные слои стенки кишечника и иногда даже пронзают ее насквозь. Они характеризуются постоянной локализацией и иногда могут проникать сквозь стенку кишки окончательного хозяина и обнаруживаться в полости тела. Автор отмечает, что характер ответной реакции хозяина зависит как от принадлежности инвазирующих скребней к той или иной группе и продолжительности инвазии, так и от его систематического положения.

Вследствие наличия хоботка, вооруженного крючьями, скребни при паразитировании в окончательном хозяине неизбежно повреждают стенку его кишечника. Степень этих повреждений, приводящих к воспалению поврежденных тканей, может быть разной и, в первую очередь, зависит от периода паразитирования, размера пресомы паразита и количества и размера хоботковых крючьев. Нужно подчеркнуть, что, хотя, как известно, кишечные паразиты активизируют иммунную и эндокринную систему позвоночных (Castro, 1991;

Fairweather, 1997), в целом клеточный ответ является наиболее примитивным из всего комплекса защитных механизмов (Reichlin, 1999) и, вследствие этого, по видимому, наиболее распространенным. Очевидно, что от степени механических повреждений, в свою очередь, зависит интенсивность ответной реакции хозяина, а ее особенности обусловлены его таксономической принадлежностью (Taraschewski, 2000).

В наиболее общем виде особенности взаимоотношений скребней и дефинитивных хозяев связаны с принадлежностью скребней к группе перфорирующих или не перфорирующих (иначе говоря, имеющих длинную или короткую пресому), а также с классом, к которому относится хозяин (Taraschewski, 2000). По мнению этого автора, в воспалительной ткани рыб преобладают гранулоциты и макрофаги (эпителиоидные клетки);

встречаются также специфичные для рыб мелано-макрофаги и немногочисленные или даже редкие плазмоциты. У птиц доминируют гетерофильные гранулоциты и гигантские многоядерные клетки;

имеются также плазмоциты, а у млекопитающих наиболее многочисленны плазматические клетки (Taraschewski, 2000).

У птиц, инвазированных одним из наиболее патогенных среди паразитов птиц Filicollis anatis, прилежащий к паразиту слой воспалительной ткани, более узкий вблизи средней и задней частей шейки и более широкий вокруг хоботка, был подвержен некрозу (Taraschewski, 1991c). В этой ткани обнаружены гетерофильные гранулоциты (при малом количестве эозинофилов), макрофаги, в том числе и гигантские многоядерные клетки, а также редкие лимфоциты и плазматические клетки. Внешняя часть некротической зоны ограничена капсулой из фибробластов и коллагеновых волокон с включением в нее клеток воспалительного ряда, а также кровеносных капилляров. Авторы подчеркивают, что если для воспалительного ответа млекопитающих характерны плазматические клетки, то в воспалительной ткани птиц преобладают гетерофильные гранулоциты и многоядерные клетки (Taraschewski, 1989c).

Эти результаты в целом совпадают с полученными ранее данными Н.П.

Цветаевой (Цветаева, 1959) из экспериментальных и естественных инвазий, которая, однако, подчеркнула обилие в некротической ткани эозинофилов.

Патологические изменения тканей хозяина, наблюдаемые в период инвазии утиным скребнем Filicollis anatis, автор разделила на три стадии. На первой стадии, длящейся в течение 8-10 дней, на которой происходит внедрение хоботка скребней в стенку кишечника, наблюдается острая воспалительная реакция, сопровождающаяся миграцией лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов, включая многочисленные эозинофилы. Вторая стадия продолжается от момента окончательного прикрепления скребней до их самопроизвольного отхождения. На этой стадии развиваются некротические процессы и одновременно формируется соединительнотканная капсула;

клеточная реакция представлена гигантскими многоядерными клетками, гистиоцитами и фибробластами, также увеличивается количество эозинофилов. На завершающей стадии происходит дегенерация оставшихся в стенке кишечника пресом скребней после их отхождения, и в месте воспаления формируется плотная соединительная ткань.

У млекопитающих на примере скребня Macracanthorhynchus hirudinaceus показано, что в первые дни после инвазии домашних свиней воспалительная ткань состоит в основном из эозинофилов и нейтрофилов, в меньшей степени – из лимфоцитов и эритроцитов, но по истечении трех месяцев в ткани, располагающейся вблизи скребня, доминируют плазматические клетки и макрофаги, а на некотором расстоянии от нее – фибробласты и эритроциты (Taraschewski, 1989c;

Zhao, 1990). Нужно отметить, что эритроциты в том или ином количестве встречаются в некротической ткани практически во всех случаях. Подчеркивается, что в целом перфорирующие скребни у птиц и млекопитающих вызывают более выраженную патологию, чем у рыб, что, вероятно, объясняется вторичной инвазией очага воспаления бактериями (Taraschewski, 2000).

Наиболее хорошо изучено негативное воздействие скребней на кишечник, а также другие органы, на примерах с паразитами рыб. У рыб, инвазированных скребнями, в воспалительной ткани доминируют гранулоциты (при высоком количестве эозинофилов) и макрофаги (эпителиоидные клетки), а плазматические клетки немногочисленны. В ряде случаев, например при инвазии скребнем Neoechinorhynchus rutili, в некротической зоне формируется фиброзная капсула, обеспечивающая постоянство фиксации этого не перфорирующего паразита (Taraschewski, 1989а). В воспалительной ткани, окружающей пресому Acanthocephalus anguillae перфорирующего скребня в экспериментально зараженных молодых карасях Carassius auratus, карпах Cyprinus carpio и взрослых колюшках Gasterosteus aculeatus можно выделить три зоны. Внутренняя зона (некроза) представлена дегенерирующими клетками, преимущественно лейкоцитами и эритроцитами, средняя (клеточная) – многочисленными гранулоцитами, а также кровеносными сосудами, эритроцитами, лимфоцитами, макрофагами (моноцитами), фибробластами и коллагеновыми волокнами, наружная (фиброзная) – главным образом фибробластами и коллагеновыми волокнами. При этом при продолжительности инвазии менее 10 дней преобладает зона некроза, свыше этого срока – фиброзная зона (Taraschewski, 1989b).

Довольно много работ посвящено изучению гистопатологии скребня Pomphorhynchus laevis в хозяевах разных видов. В естественно инвазированных окуне Etheostoma caeruleum, форели Salmo gairdneri и обыкновенном гольце Noemacheilus barbatulus пресома этого перфорирующего скребня окружается фиброзной капсулой, состоящей из эозинофилов, нейтрофилов, плазматических клеток и фибробластов (McDonough, 1981;

Wanstall, 1986). Позднее было показано, что в кишечнике голавля Leuciscus cephalus этот скребень вызывает четыре основных типа тканевых реакций, вызываемых: а) метасомой в просвете кишечника, б) шейкой, погруженной в стенку кишечника, в) хоботком и бульбусом, проникшим во внешнюю оболочку кишечника, г) хоботком и бульбусом, проникшим в печень и поджелудочную железу (Histopathology, immunohistochemistry…, 2002). При этом интенсивность некротических и воспалительных проявлений увеличивается по направлению от слизистой кишечника к его серозной оболочке. В очаге воспаления авторы выделили нейтрофилы, палочковые клетки, макрофаги и эозинофилы.

Иммуногистохимические исследования показали, что, помимо механического воздействия и инициирования клеточного ответа, этот скребень изменяет физиологические функции пищеварительного канала кумжи Salmo trutta (Effect of…, 2002). У естественно инвазированных усачей Barbus barbus пресома скребня настолько глубоко внедряется в стенку кишечника, что фиброзная капсула, формируемая вокруг внедрившейся пресомы, выходит на внешнюю поверхность кишечника (Intestinal immune …, 2011). Капсула пронизана капиллярами и, помимо фибробластов и коллагеновых волокон, включает многочисленные палочковые клетки, а также тучные клетки, некоторые из которых имели положительную реакцию на серотонин. Помимо инкапсуляции, внедренная пресома скребня инициирует гиперплазию соединительной ткани (Intestinal immune …, 2011).

Воспалительный ответ стенки кишечника сига Coregonus lavaretus рассмотрен в случаях инвазии его скребнем Dentitruncus truttae (Intestinal inflammatory…, 2009). Показано, что скребень инициирует гиперплазию слизистых клеток кишечника, что приводит к оседанию слизи на поверхности тела паразитов. Вблизи места прикрепления скребня наблюдается значительное увеличение количества слизистых (бокаловидных) и тучных клеток и интенсивная дегрануляция последних.

Таким образом, реакция дефинитивного хозяина в ответ на инвазию тем или иным скребнем зависит от ряда факторов, в том числе, от видовой принадлежности обоих участников, то есть, носит специфический характер.

В некоторых случаях перфорирующие скребни проникают в полость тела окончательного хозяина, полностью превращаясь, таким образом, в тканевых паразитов. Такие хозяева получили название амфиксенических (Судариков, 1971) или амфипаратенических (Shoop, 1987). Нередко явление амфиксении наблюдается среди представителей рода Pomphorhynchus, а также других скребней, паразитирующих у рыб небольшого размера (Nickol, 1985;

Schmidt, 1985). Один из немногих исследованных случаев представляет скребень Acanthocephalus anguillae, паразитирующий у рыб многих видов. В естественных и экспериментальных инвазиях было показано, что эти гельминты способны проникать сквозь стенку кишечника в полость тела и достигать различных внутренних органов (Taraschewski, 1988a, 1989b). Дальнейшая их судьба зависела от вида хозяина. У молодых карасей на 50-й день эксперимента скребни (точнее их свободная поверхность) окружались тонкой «преципитат-подобной»

оболочкой, а со стороны соседствующих органов – слоем воспалительных клеток;

при этом большинство скребней были мертвыми, а клеточная реакция хозяина была более выраженной. У молодых карпов проникновение скребней в полость тела происходило энергичнее, они вызывали сильную эозинофилию, были полностью окружены клеточными капсулами, но и гибель их наступала быстрее.

Состав капсул в обоих случаях был сходным, но если в золотых рыбах в них преобладали макрофаги, то у карпа – гранулоциты (преимущественно, эозинофилы) и лимфоциты. Автор отмечает, что характер прикрепления этих перфорирующих скребней в кишечнике разных видов хозяев был неодинаков, и, например, у взрослой форели, пресомы скребней, внедрившиеся глубоко в стенку кишки, окружались фибробластической капсулой, препятствующей выходу паразитов в полость тела. В итоге был сделан вывод о том, что у молодых рыб стенка кишечника не представляет непреодолимую преграду для скребней, но проникновение сквозь нее происходит случайно (Taraschewski, 1988a, 1989b).

Последнее замечание особенно важно, поскольку подчеркивает необходимость четко отличать случаи такого случайного тканевого паразитизма от истинного паратенического паразитизма, обусловленного как экологически, так и эволюционно, при котором у паразита, очевидно, развиваются механизмы, нивелирующие клеточный ответ хозяина.

Для скребня Pomphorhynchus laevis случаи внекишечного паразитирования у окончательных хозяев весьма характерны. У одного из окончательных хозяев этого скребня, сома Silurus glanis, помфоринхи обнаруживаются как в просвете пищеварительного тракта, так и (у рыб, менее 40 см длиной) в инкапсулированном состоянии на брыжейке кишечника (Intestinal immune…, 2011). Капсула состояла из двух слоев, наружный из которых был образован коллагеновыми фибриллами с включением тучных клеток. Во внутреннем слое авторы отметили наличие только многочисленных тучных клеток, причем в ряде случаев создавалось впечатление, что на поверхности тегумента паразита располагаются свободные гранулы, выделенные из этих клеток. Авторы в данной работе рассматривают сома, как паратенического хозяина, однако такой вывод сомнителен, поскольку в тех же рыбах обнаруживались и скребни, локализованные в просвете кишечника. Кроме того, в более крупных рыбах инкапсулированные вне кишечника скребни не были обнаружены, что предполагает их гибель в случаях внекишечной локализации.

Таким образом, случаи внекишечной локализации скребней в окончательном хозяине следует отличать от случаев типичного паратенического паразитизма. На трудности разграничения этих случаев указывает и C.R. Kennedy (Kennedy, 2006: p. 20): “Unfortunately, it is often very difficult to determine whether a host with such parasites in the body cavity is actually a paratenic host, or an accidental, unsuitable potential definitive host, in whose body cavity acanthocephalans may also occur”. Впрочем, проникновение скребней, особенно молодых, в полость тела окончательного хозяина (облигатного или потенциального), вероятно, является необходимым элементом превращения дефинитивного хозяина в паратенического.

1.5. Взаимоотношения скребней с промежуточными хозяевами Известно, что жизненный цикл скребней включает одного обязательного промежуточного хозяина (ракообразного или насекомого), попадая в которого акантор претерпевает метаморфоз и, последовательно проходя через несколько стадий акантеллы и формируя вокруг себя цисту, развивается в цистаканта – стадию, инвазионную для окончательного (и паратенического при его наличии) хозяина.

Период миграции акантора сквозь стенку кишки промежуточного хозяина варьирует в широких пределах. Например, Echinorhynchus truttae достигает Gammarus pulex полости тела в течение 24 часов (Awachie, 1966), Neoechinorhynchus saginatus в остракоде Cypridopsis maculate – в течение трех суток (Uglem, 1969), а Macracanthorhynchus ingens мигрирует в организме личинок жуков Phyllophaga crinita, Phyllophaga hirtiventris и Ligyrus sp. в течение 30-35 дней (Moore, 1946a). Очевидно, что скорость миграции зависит от множества факторов, в числе которых могут быть как абиотические (температура среды), так и биотические (видовая принадлежность хозяина и паразита, физиологическое состояние обоих и т.д.).

Проникновение мигрирующего акантора в полость тела хозяина осуществляется с использованием как механических факторов (вооружение акантора, сокращения его мускулатуры), так и химических (секрет железы проникновения) (Никишин, 1990;

Albrecht, 1997). Сразу же после проникновения в полость тела хозяина акантор подвергается «клеточной атаке» – обычной защитной реакции организма на внедрение инородного тела, то есть окружается капсулоподобным слоем гемоцитов хозяина (Mercer, 1967;

Robinson, 1969;

Lackie, 1972a;

Rotheram, 1972;

Wanson, 1973;

Nikishin, 1992). Показано, что гемоциты хозяина, участвующие в «клеточной атаке», обладают выраженными фенолоксидазной и пероксидазной активностями, которые рассматриваются как важнейшая часть защитной системы организма членистоногих (Volkmann, 1991, цит. по: Taraschewski, 2000). Однако эта защитная реакция не приводит (в случаях инвазии специфичного промежуточного хозяина) к инкапсуляции паразита, а, напротив, быстро сходит на нет, и по истечении нескольких дней вокруг паразита наблюдаются лишь отдельные гемоциты (Hynes, 1957;

Robinson, 1969;

Lackie, 1972a;

Wanson, 1973), обычно находящиеся на разных этапах деструкции (Nikishin, 1992).

Механизмы, посредством которых паразит защищается от «гемоцитной атаки» остаются не ясными. Тем не менее, предполагается, что их морфологическим выражением может быть быстрое формирование микроворсинок на поверхности молодой акантеллы, а также начало образования наружного отдела цисты, окружающей паразита (Nikishin, 1992;

Taraschewski, 2000). Экспериментально показано, что немногие активные гемоциты, сохранившиеся вблизи развивающейся акантеллы, оттесняются формирующейся цистой, а клетки с фенолоксидазной активностью наблюдаются в этот период преимущественно только в эпителии средней кишки (Volkmann, 1991, цит. по:

Taraschewski, 2000);

на основании этих фактов сделан вывод о том, что развивающаяся акантелла уже не провоцирует защитные реакции стенки кишки (Taraschewski, 2000). Причины, по которым прекращается «гемоцитная атака»

развивающихся акантелл, остаются неясными, но, учитывая последнее замечание H. Taraschewski, можно предполагать, что в данном случае имеет место паразитарная мимикрия наружного участка формирующейся цисты.

В целом сведения о взаимоотношениях развивающихся акантелл с промежуточными хозяевами немногочисленны и нередко противоречивы.

Показательным примером сказанного является долгое время бытовавшее мнение о том, что акантеллы локализуются под тонким слоем соединительной ткани, покрывающей снаружи кишечник промежуточного хозяина, и лишь в семидесятых годах прошлого века была доказана его ошибочность (Crompton, 1975). В действительности, в подавляющем большинстве случаев акантеллы и цистаканты обнаруживались в полости тела хозяев. Тем интереснее единственное, имеющееся в нашем распоряжении упоминание о миграции скребня Pomphorhynchus bulbocolli Gammarus в сосуды и синусы гаммаруса pseudolimnaeus в экспериментальных условиях (Gleason, 1989). По мнению автора, это явление было обусловлено высокой степенью инвазии промежуточных хозяев, что довольно часто наблюдается при экспериментальном моделировании жизненного цикла.

Для жизненных циклов скребней характерна строгая специфичность к промежуточному хозяину. Имеются данные о том, что, попадая в неспецифического (необычного, unsuitable) хозяина, скребни подвергаются гемоцитной инкапсуляции, меланизируются и погибают (Miller, 1943;

Hynes, 1958). Тем интереснее результаты экспериментов, которые, казалось бы, противоречат этим данным. При заражении яйцами скребня Macracanthorhynchus hirudinaceus диплопод Floridobolus penneri и Narceus gordanus, являющихся необычными хозяевами для этого паразита, аканторы в течение 4-х дней благополучно освобождались от эмбриональных оболочек и внедрялись в слизистую кишки (Bowen, 1967). Через 4 недели аканторы достигали внешней оболочки кишки и инкапсулировались гемоцитами хозяина. К 6-й неделе инвазии вокруг скребня был заметен «тонкий фиброзный слой», происхождение которого автор связывал с активностью гемоцитов. Несмотря на инкапсуляцию, акантеллы успешно развивались и через 2,5 месяца превращались в цистакантов, которые не имели признаков меланизации и оставались жизнеспособными в течение всего времени наблюдений (общая продолжительность эксперимента составила месяцев) (Bowen, 1967). Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что инвазия необычного промежуточного хозяина сопровождается инкапсуляцией гемоцитами, но не всегда приводит к гибели паразита. «Тонкий фиброзный слой», окружающий развивающуюся акантеллу, очевидно, представляет собой цисту, формирование которой происходит примерно в середине периода развития цистаканта.

Необходимо подчеркнуть, что циста вокруг акантелл обнаруживалась не во всех случаях, в частности не отмечена у неоехиноринхид. Например, она отсутствует у Paulisentis fractus из остракоды Tropocyclops prasinus, в связи с чем авторы (Cable, 1967) предлагают именовать инвазионную стадию, развившуюся в промежуточном хозяине, термином «ювенильный», а название «цистакант»

сохранить для скребней, паразитирующих в паратеническом хозяине. Не отмечена циста у Neoechinorhynchus emydis из остракоды Cypria maculate (Hopp, 1954), Neoechinorhynchus rutili из Cypria turneri (Merritt, 1964), а также у других исследованных видов.

Тем не менее, циста («оболочка» или «капсула» в работах авторов до конца ХХ века) отмечалась подавляющим большинством исследователей, изучавших развитие и морфологию акантелл и (или) цистакантов, относящихся к другим классам. При этом, по мнению одних авторов, ее происхождение было связано с организмом хозяина (DeGiusti, 1949b), по мнению других – с самим паразитом (Meyer, 1938;

Moore, 1946 a, b). Впрочем, некоторые исследователи подчеркивали невозможность поддержать тот или иной взгляд (Hynes, 1957). Длительность периода развития акантеллы до ее инцистирования зависит как от таксономической принадлежности скребня, так и от внешних условий. Так, Macracanthorhynchus ingens инцистируется между 60-м и 70-м днями после инвазии, то есть примерно ко времени завершения развития цистаканта (Moore, 1946a), тогда как у Mediorhynchus grandis циста отмечается на 27-30 день и также уже у сформированного цистаканта (Moore, 1962).

Противоречивы сведения о тонкой структуре цисты, окружающей скребней в промежуточном хозяине, а также о характере бордюра из микроворсинок на поверхности их тегумента. Причиной противоречий стало то, что световая микроскопия не позволяла получить однозначно интерпретируемые результаты, а различия в результатах электронно-микроскопических исследований, вероятно, объясняются особенностями конкретных методов и условий экспериментов, а также не всегда корректным определением той или иной стадии развития скребня в промежуточном хозяине. Одной из первых моделей, на которых изучались структура и формирование цисты, были развивающиеся акантеллы и цистаканты скребня Moniliformis moniliformis. Согласно первым данным, полученным с применением электронной микроскопии, циста у развивающейся акантеллы этого вида состоит из плотно расположенных везикул, секретируемых, по мнению авторов, окружающими гемоцитами хозяина (Mercer, 1967). У цистакантов в добавление к везикулярному слою появляется «плотный аморфный слой»

неясного происхождения, который подстилается слоем мелких везикул. Сходное строение из двух везикулярных слоев, разделенных слоем плотного материала, Macracanthorhynchus hirudinaceus имеет циста у цистакантов из экспериментально зараженных жуков Zophobas morio (Zhao, 1992). Нужно, однако, отметить, что в последнем случае циста не могла полностью предотвратить клеточный ответ хозяина: акантеллы, начиная с 7-го дня эксперимента, были окружены увеличивающимся скоплением гемоцитов хозяина, которые со временем проникали сквозь цисту и вступали в контакт с тегументом скребня (Zhao, 1992).

По мнению Кромптона, наружная часть цисты у Polymorphus minutus, состоящая из белково-углеводного комплекса, напоминающего соединительную ткань хозяина, формируется гемоцитами хозяина, а внутренняя часть – паразитом (Crompton, 1964, 1967);

при этом автор подчеркивал, что гемоцитная инкапсуляция паразитов аналогична инкапсуляции чужеродных тел, поврежденных тканей и неспецифических трансплантатов (Crompton, 1967). В другой работе, посвященной изучению взаимоотношений 1-2-дневных аканторов монилиформов с организмом хозяина, было впервые показано, что везикулярный слой цисты является производным от микроворсинок, покрывающих поверхность паразита и простирающимися не менее чем на 2 мкм от нее (Rotheram, 1972).

Удивительно, что в единственном на сегодняшний день электронно микроскопическом исследовании развития цистаканта (Polymorphus minutus), не упоминается ни о строении цисты (капсулы), ни о наличии микроворсинок на поверхности тегумента (Butterworth, 1969). Последующими исследованиями было подтверждено наличие микроворсинок на поверхности тегумента монилиформов и предположено, что плотный слой, составляющий внутреннюю часть цисты и появляющийся в конце стадии акантеллы-II, формируется самим паразитом (Lackie, 1972a). Эксперименты по трансплантации развившихся в саранче акантелл Moniliformis moniliformis в обычного промежуточного хозяина (таракана Periplaneta americana) привели авторов к выводу о том, что циста формируется самим паразитом без участия хозяина (Lackie, 1979).

Детальное электронно-микроскопическое исследование строения цисты было выполнено на примере поздней акантеллы Arhythmorhynchus petrochenkoi из водяного ослика Asellus tschaunensis и цистакантов Polymorphus strumosoides и Polymorphus magnus из бокоплава Gammarus pulex (Никишин, 1985, 1986, 1994).

Было показано, что у цистакантов она имеет двухслойное строение и состоит из внешнего толстого везикулярного слоя и внутреннего тонкого, образованного электронно-плотным аморфным материалом. У поздней же акантеллы поверх везикулярного слоя был обнаружен тонкий пластинчатый слой, состоящий из нескольких нежных пластинок, напоминающих толстые мембраны (Никишин, 1985). Циста у цистакантов Polymorphus minutus из гаммаруса Echinogammarus stammeri имеет такое же строение, за исключением того, что авторы не отмечают наличие внешнего тонкого пластинчатого слоя, хотя он хорошо виден в статье на фотографии (Dezfuli, 1999, fig. 8). Вплотную к наружной поверхности цисты располагались скопления гемоцитов хозяина, многие из которых были частично или полностью разрушены.

Дальнейшее исследование процесса формирования цисты на примере развивающейся в водяном ослике Asellus tschaunensis акантеллы Filicollis anatis показало, что этот наружный пластинчатый слой имеется уже на двадцатый день инвазии, но его происхождение осталось невыясненным (Nikishin, 1992). При этом гемоциты хозяина наблюдались как снаружи этого слоя, так и внутри него;

в последнем случае псевдоподии гемоцитов часто находились в тесном контакте с тегументом скребня. Средний, везикулярный, слой цисты формируется из везикул, отшнуровывающихся от апикальных участков коротких микроворсинок, которые к этому времени развиваются на поверхности тегумента акантеллы. На стадии поздней акантеллы или немного ранее (в эксперименте на 60-й день инвазии) происходит одновременное выделение из «каналов» поперечно полосатого слоя плотного материала, который в виде слоя отлагается на микроворсинках и затем вместе с ними полностью отделяется от тегумента (Nikishin, 1992). В дальнейшем на месте микроворсинок развивался толстый слой гликокаликса (Никишин, 2011а). Таким образом, по крайней мере, у некоторых представителей Palaeacanthocephala циста развивающихся акантелл состоит из трех слоев, два из которых формируются самим паразитом. Что касается ее наружного слоя, то необходимы дальнейшие исследования с целью определения его динамики у поздних стадий развития цистакантов;


возможно на завершающих стадиях их развития он утрачивается.

Несколько иные результаты получены при изучении тонкой морфологии цисты у Pomphorhynchus laevis из амфиподы Echinogammarus stammeri (Dezfuli, 1992;

Crustacean-acanthocephalan…, 2008). По мнению авторов, «циста» у акантелл и цистакантов этого скребня образована исключительно длинными «ундулирующими» микроворсинками, слой которых может достигать в толщину 8 мкм. Авторы подчеркивают отсутствие в составе такой «цисты» везикулярного слоя, а немногие везикулы, обнаруживаемые в толще слоя микроворсинок, рассматриваются ими как остатки разрушенных гемоцитов. Однако фотография в первой работе (Dezfuli, 1992, fig. 8A) скорее свидетельствует об обратном, что эти везикулы могут быть отражением секреторных процессов, осуществляемых тегументом или микроворсинками. У цистакантов Acanthocephalus clavula, однако, уже имеется полноценная неклеточная циста, к которой вплотную прилегали гемоциты хозяина (Crustacean-acanthocephalan…, 2008). К сожалению, структура цисты на представленных фотографиях не просматривалась, а описание, данное авторами, было предельно лаконичным. В то же время на поверхности тегумента этих скребней отсутствовали микроворсинки.

Подытоживая сказанное легко заметить, что циста как самостоятельное образование обнаруживается только у скребней, на поверхности тегумента которых отсутствуют микроворсинки. По всей вероятности эти скребни находятся на стадии цистаканта или поздней акантеллы. Если механизм образования цисты, описанный для акантеллы Filicollis anatis (Nikishin, 1992) справедлив и для других видов скребней (иное маловероятно, поскольку морфология сформированной цисты весьма сходна у представителей разных таксономических групп), то тогда остается единственное объяснение результатам B.S. Dezfuli с соавторами (Crustacean-acanthocephalan…, 2008), а именно: исследованные скребни Pomphorhynchus laevis находились на более ранних стадиях развития.

Как уже говорилось, циста не всегда является надежной защитой от «гемоцитной атаки» со стороны организма специфичного промежуточного хозяина. В упомянутом эксперименте по заражению жуков Zophobas morio скребнем Macracanthorhynchus hirudinaceus гемоциты на 40-й день эксперимента проникали сквозь цисту, разрушая ее, и посредством псевдоподий контактировали с тегументом скребня (Zhao, 1992). При этом акантеллы часто находились в сокращенном состоянии, и наблюдались явные деструктивные изменения поверхностных участков тегумента: разбухшие каналы поперечнополосатого слоя, заполнение цитоплазмы слоя осмиофильным материалом. Через 50 дней после заражения часть паразитов (15 %) была разрушена, однако признаки меланизации не наблюдались (Zhao, 1992).

С другой стороны, имеется достаточное количество примеров, свидетельствующих об успешном отражении скребнями «гемоцитной атаки». Так, циста (оболочка по терминологии автора) скребня Acanthocephalus anguillae являлась надежной защитой от гемоцитов хозяина – водяного ослика Asellus aquaticus, которые никогда не проникали внутрь ее, а те из них, что находились с ней в контакте, были частично разрушены (Dezfuli, 2000). Среди гемоцитов были идентифицированы гранулярные, полугранулярные и гиалиновые. Автор подчеркивает, что ни один из пятидесяти шести обнаруженных в пятидесяти двух осликах скребней не был меланизирован. Однако не столь однозначен уже упомянутый пример с гаммарусами E. stammeri. В 50000 вскрытых рачков были обнаружены скребни Pomphorhynchus laevis, Acanthocephalus clavula, Polymorphus minutus и Echinorhynchus truttae, и из 18710 извлеченных Pomphorhynchus laevis только 32 были частично или полностью меланизированными, причем среди представителей остальных трех видов таковых не оказалось (Pomphorhynchus laevis…, 1999;

Crustacean-acanthocephalan…, 2008). Авторами отмечен факт различий в ответе организма хозяина на помфоринхов: гемоциты могут либо полностью отсутствовать вокруг скребня, либо присутствовать поодиночке или в виде небольших скоплений, либо полностью инкапсулировать гельминта (Crustacean-acanthocephalan…, 2008). При этом в одном хозяине, инвазированном несколькими особями скребней, могут наблюдаться разные случаи. Однако непосредственные контакты гемоцитов с тегументом скребня наблюдаются очень редко. Для объяснения причин различий в интенсивности гемоцитного ответа хозяина, равно как и малого количества гибнущих или погибших скребней авторы привлекают ранее высказанное предположение (Robinson, 1969;

Lackie, 1972b) о возможном повреждении некоторых скребней, полученных ими в процессе миграции сквозь стенку кишки промежуточного хозяина. В случаях же множественной инвазии хозяина возможной причиной гибели части паразитов могут быть конкурентные взаимоотношения между ними (Nikishin, 1992).

Таким образом, в специфичном промежуточном хозяине скребни хорошо адаптированы к выживанию и успешно противостоят «гемоцитной атаке» не только на ранних стадиях развития акантеллы, но и на последующих.

Морфологическим выражением этой адаптации служат микроворсинки, развивающиеся на поверхности тегумента, циста, формирующаяся вокруг скребня в процессе развития акантеллы, а также возможная секреция тегументом субстанций, инактивирующих или разрушающих гемоциты.

1.6. Взаимоотношения скребней с паратеническими хозяевами Термин «паратенический хозяин» («paratenic host») был предложен Бэром (Baer, 1952) для хозяев, которые не являются обязательными для осуществления жизненного цикла паразита, и в которых паразит не претерпевает развития.

Однако ныне это мнение все чаще подвергается сомнению (Шарпило, 2005).

Более того, наше понимание такого явления, как паратенический паразитизм, вероятно далеко от исчерпывающего;

взгляд же на него, как на своеобразный экологический мостик, всего лишь обеспечивающий передачу инвазии от промежуточного к окончательному хозяину, может не полностью отражать всю сущность этого явления. В частности, интересно обоснованное предложение рассматривать паратенический паразитизм как одну из стратегий жизни паразита, не менее значимую, чем паразитизм в промежуточном хозяине (Parker, 2009).

По сведениям некоторых авторов скребни, инкапсулированные в паратенических хозяевах, представлялись в разной степени дезинтегрированными, например, Pomphorhynchus bulbocolli из полости тела мелкой рыбы неопределенного вида, извлеченной из желудка щуки (Ward, 1940a).

А. Мейер полагал, что скребни погибают в паратенических хозяевах по достижении определенного возраста, либо вследствие неподходящего питания (Meyer, 1933).

Хотя в литературе накоплено значительное количество данных о случаях паратенического паразитизма скребней (Schmidt, 1985), сведения об их взаимоотношениях с паратеническими хозяевами на организменном уровне немногочисленны. Экспериментально показано, что при температуре 22-26 °С миграция скребня Sphaerirostris picae в организме обычного для этих скребней паратенического хозяина – прыткой ящерицы Lacerta agilis – завершается в течение двух суток (Лисицына, 1991). Миграция осуществляется путем эвагинации и инвагинации пресомы и сокращений метасомы;

при этом в тегументе не отмечено признаков секреции, равно как и какого-либо литического воздействия на ткани хозяина (Krasnoshchekov, 2009). Воспалительная реакция стенки кишки, вызванная миграцией скребня, отличается преобладанием в участке поражения эозинофилов при относительно небольшом количестве нейтрофилов. При этом наибольшие поражения отмечены в случае расположении скребня параллельно поверхности кишки, наименьшие – в случае его перпендикулярной ориентации (Krasnoshchekov, 2009).

Одно из первых гистологических и гистохимических исследований капсулы вокруг гельминтов выполнено на примере скребня Neoechinorhynchus cylindraceus из солнечника Lepomis sp. (Bogitsh, 1957, 1961). По мнению этого автора, капсула указанного вида состоит из двух слоев. Внутренний слой, толщиной около мкм, образован коллагеновыми волокнами, наружный, менее толстый (около мкм) представлен типичными фибробластами. Автор подчеркивает, что инкапсулирующие клетки имеют мезенхимное происхождение и что сам по себе процесс инкапсуляции является типичным ответом позвоночного на воспаление (Bogitsh, 1961). Тем самым опровергается имеющееся предположение H.L. Ward (Ward, 1940b), обнаружившей этих скребней на печени Lepomis pallidus, о составе капсулы у этого вида из гепатоцитов.

Интересные факты паратенического паразитизма описаны и для других скребней рода Neoechinorhynchus. Скребень N. emydis естественным образом инвазировал моллюсков Campeloma rufum, поселяясь в различных его органах, но наиболее часто в ноге;

при этом интенсивность инвазии колебалась от 1 до экземпляров при экстенсивности 87 % (Hopp, 1954). Все скребни были заключены в тонкостенную непрочную цисту (по терминологии автора). Сведения о структуре стенки цисты не приведены. По другим данным скребень этого вида в качестве паратенического хозяина использует, помимо названного моллюска, еще и моллюска Ceriphasia semicarinata, при этом интенсивность инвазии составила 1 4 экземпляра, а экстенсивность варьировала от 33 % в декабре и апреле до 75 % в августе (Lincicome, 1948). Гельминты были инцистированы по краю ноги или в мантии вблизи анального отверстия. Циста, окружающая скребней, была непрозрачной белой, если скребни были живыми, и желтоватой или зеленовато коричневой, если скребни были мертвы. В каждой цисте было по одному или, реже, по два скребня (Lincicome, 1948). В обеих работах, вероятно, под цистой следует понимать капсулу, образованную тканями хозяина. Подчеркнем, что в моллюсках обнаруживались как живые скребни, так и мертвые;


к сожалению, автор не указывает процентное соотношение тех и других.

Другой представитель рода Neoechinorhynchus, определенный авторами как N. rutili, в качестве паратенических хозяев использует пиявок Erpobdella и водных личинок вислокрылок Sialis (Robin, 1871;

Villot, 1885;

цит. по: Walkey, 1967), в частности, личинок ольховой мухи Sialis lutaria (Lassiere, 1988). Отмечено, что в личинках вислокрылок капсула вокруг неоэхиноринхов не образуется. Скребень этого вида также был обнаружен в раках Pacifastacus troubridgi, зараженных естественным образом (Merritt, 1964). Из 154 раков взятых для исследования, зараженными оказались только три;

в дальнейшем автор сделал вывод о том, что эти беспозвоночные не играют существенной роли в жизненном цикле скребня.

У четырех видов рыб рода Orestias были обнаружены скребни Polymorphus spindlatus, локализовавшиеся на печени (Description and host…, 1995). Паразиты располагались внутри или вне печеночной капсулы и не проникали вглубь долей печени. По данным этих авторов инкапсуляция включала образование гиалиноподобной оболочки и сопровождалась некрозом соседних гепатоцитов и разрушением печеночной капсулы. Также на поверхности печени и, кроме того, на внешней поверхности кишечника локализовались скребни Polyacanthorhynchus rhopalorhynchus в малабарской траире Hoplias malabaricus (Immature…, 1996). По данным авторов скребни были заключены в плотную коллагеновую капсулу, с включением в нее многочисленных лимфоцитов, гранулоцитов и жировых клеток;

прилежащие клетки органов подвергались некрозу.

Паратенический паразитизм широко распространен также среди гельминтов других систематических групп, в частности, среди представителей класса нематод. Например, известно, что нематоды Physocephalus sexalatus паразитируют у широкого круга паратенических хозяев, относящихся к разным классам позвоночных животных (Рыжиков, 1952). В эксперименте, описанном автором, показано, что наименее интенсивно заражаются этим гельминтом рыбы, тогда как белые мыши оказываются наиболее инвазированными. При этом характер инкапсуляции нематод в рыбах и мышах также различен. В рыбах капсула вокруг личинок тонкая или полностью отсутствует, а в млекопитающих, напротив, личинки окружены хорошо выраженной толстостенной капсулой. В то же время, Ю.А. Березанцевым была подробно изучена структура и этапы формирования капсулы вокруг этих нематод в тканях обыкновенной лягушки, живородящей ящерицы, большой синицы и белой мыши и показано, что во всех случаях формируется однотипная соединительнотканная капсула, образованная фибробластами и коллагеновыми волокнами (Березанцев, 1968а).

Для нематод Rhabdias bufonis, по мнению В.А. Савинова, в качестве паратенических хозяев выступают не только позвоночные животные, но и различные виды беспозвоночных (Савинов, 1963). В частности, в экспериментальных условиях было показано, что, помимо тритонов Frifurus vulgaris, нематоды R. bufonis могут инвазировать дождевых червей Lumbricus terrestis и моллюсков Agriolimax laevis. Полученные в результате проведенного эксперимента нематоды морфологически не отличались от таковых, вводимых подопытным животным при заражении. Также этим автором было показано, что Uncinaria stenocephala нематоды способны паразитировать в таких паратенических хозяевах как дождевой червь, плавунец окаймленный и навозник обыкновенный. При этом личинки в организме этих беспозвоночных либо заключены в капсулу, либо располагаются свободно.

Для паразитов, в циклы развития которых включаются паратенические хозяева, возможен неоднократный пассаж. Способность к одно- и многократному пассажу из одного паратенического хозяина в другого описана для гельминтов из разных классов (Рыжиков, 1952;

Савинов, 1964;

Шарпило, 1965). Скребни Centrorhynchus sp. могут успешно пассажировать из организма одного паратенического хозяина в другого не менее шести раз (Шарпило, 1965). При этом отмечено, что скребни полученные в результате однократного пассажа из прыткой ящерицы в организм другой прыткой ящерицы, а также разноцветной ящурки, медянки и болотной ящерицы, сохраняют инвазионность для своих окончательных хозяев – птиц семейства врановых. К сожалению, в данной работе нет сведений о наличии капсулы вокруг пассированных скребней в каждом последующем паратеническом хозяине, однако отмечено, что к пассажу способны не только скребни с полностью инвагинированным хоботком, но и скребни, хоботок которых или полностью эвагинирован, или эвагинирован частично.

Опытным путем была показана возможность трехкратного пассажа личинок нематод Toxocara canis от организма одних белых мышей в организм других (Савинов, 1964). Мышей, которым были скормлены яйца токсокар, автор не рассматривает в качестве паратенических хозяев. Однако мышей зараженных в результате поедания инвазивных тканей от других мышей, он рассматривает в качестве паратенических хозяев токсокар. Автор извлекал из капсул личинок нематод после одно-, двух- и трехкратного пассажа и проводил сравнительное описание, показав, что в результате нескольких пассажей нематоды по своим морфо-размерным характеристикам не различаются. При этом в тканях очередной зараженной белой мыши личинки токсокар были инкапсулированы.

Возможность однократного пассажа через паратенических хозяев была отмечена и у нематод Physocephalus sexalatus (Рыжиков, 1952). Автором производилась передача личинок от мыши к мыши, от мыши к крысе и от лягушки к крысе. Во всех случаях в новом хозяине приживаемость скормленных личинок составила 20-30 %, при этом каждая личинка была окружена капсулой.

Экспериментально возможность пассажа показана и для гельминтов, в циклы развития которых включается второй промежуточный хозяин.

Экспериментальные исследования с плероцеркоидами цестод Diphyllobothrium latum показали, что эти гельминты способны к повторному заражению ершей (Павловский, 1963). Для того чтобы отличить естественную инвазию от личинок, полученных в эксперименте, исследователи перед введением их в желудок рыб окрашивали нейтральротом, и личинки приобретали ярко-розовый цвет. Следует отметить, что личинки этого вида цестод и в предыдущем и новом хозяевах (ершах) располагаются свободно, то есть не имеют окружающей капсулы.

В своей работе Е.Н. Павловский и В.Г. Гнездилов (Павловский, 1963) провели несколько экспериментов по извлечению плероцеркоидов лентецов D.

latum из вторых промежуточных хозяев (ершей) и заражению ими неестественных хозяев. В группу неестественных хозяев вошли разные виды позвоночных животных из класса рыб, амфибий и пресмыкающихся. Результаты экспериментов показали что, плероцеркоиды этих цестод, попав в кишечник неестественного хозяина, могут благополучно мигрировать сквозь стенку кишечника и выживать в его брюшной полости. Опираясь на эти результаты, авторы пришли к выводу, что “…круг потенциальных хозяев плероцеркоидов D.

latum гораздо шире, чем видовое разнообразие действительных хозяев в природе, среди которых значится только несколько видов рыб” (Павловский, 1963). Из выполненных авторами экспериментов особо интересен эксперимент с обыкновенной лягушкой (неестественный хозяин), в которой спустя 204 дня после заражения лентецы были обнаружены жизнеспособными. Не менее интересным является то, что была доказана способность этих лентецов сохранять инвазионность для окончательных хозяев (человека) после длительного пребывания в лягушке. С этой целью личинки, извлеченные их полости тела лягушек, были проглочены В.Г. Гнездиловым. В итоге спустя 18 дней после самозаражения, при копрологическом исследовании были обнаружены яйца дифилоботриумов. В обсуждении авторы, говорят о том, что для того, чтобы особь данного вида хозяина сделалась хозяином плероцеркоидов, необходимо предрасполагающих, определяющих наличие нескольких факторов: и осуществляющих. Физиология и структурные особенности животных (хозяев) предрасполагающие рассматриваются как факторы, к заражению плероцеркоидами D. latum. Особенности трофических связей животных являются факторами определяющими возможность данного животного стать хозяином плероцеркоидов этого вида цестод. Наконец, особенности внешней среды являются факторами, осуществляющими возможность животного стать хозяином этих плероцеркоидов.

Таким образом, в паратенических хозяевах гельминты в большинстве своем подвергаются инкапсуляции клетками хозяина. В позвоночных хозяевах в инкапсуляцию вовлекаются фибробласты, продуцирующие более или менее выраженные слои коллагеновых волокон. Также в составе капсул встречаются клетки воспалительного ряда (эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты). Во многих случаях между стенкой капсулы и тканью прилежащего органа отмечаются скопления остатков разрушенных клеток.

Данные в представленной литературе свидетельствуют, что личинки гельминтов могут переходить не только от одного паратенического хозяина к другому, но и от одного промежуточного хозяина в другого. При этом в большинстве случаев отмечено, что по своему строению личинки гельминтов из промежуточных хозяев не отличаются от личинок инвазирующих паратенических хозяев. В паратенических хозяевах гельминты могут быть, как заключены в капсулу, так и могут располагаться свободно, при этом в организме беспозвоночных животных гельминты находятся чаще в свободном состоянии, чем в инкапсулированном.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА послужили скребни Corynosoma strumosum, Объектом исследования обнаруженные на поверхности внутренних органов и брыжейки семи видов морских рыб, а также полученные в результате экспериментального заражения.

2.1. Материал из естественных паратенических хозяев Исследованные рыбы – естественные паратенические хозяева скребня – относятся к пяти отрядам: лососеобразные – тихоокеанская зубастая корюшка Osmerus mordax dentex Steindachner et Kner, 1870 (8 экз.) и обыкновенная малоротая корюшка Hypomesus olidus (Pallas, [1814]) (4 экз.), трескообразные – тихоокеанская навага Eleginus gracilis (Tilesius, 1810) (6 экз.), скорпенообразные – керчак Стеллера Myoxocephalus stelleri Tilesius, 1811 (8 экз.) и пятнистый терпуг Hexagrammos stelleri Tilesius, 1810 (6 экз.), окунеобразные – толстощек Миддендорфа Hadropareia middendorffii Schmidt, 1904 (12 экз.), камбалообразные – желтоперая камбала Limanda aspera (Pallas, [1814]) (5 экз.). Рыбу добывали в период с 2005 по 2011 годы в акватории Тауйской губы Охотского моря (Карта 1).

Тихоокеанскую зубастую корюшку и тихоокенскую навагу отлавливали в период с февраля по март в бухте Гертнера Охотского моря;

керчака Стеллера, пятнистого терпуга и толстощека Миддендорфа – с июня по сентябрь под камнями и в литоральных ваннах в районе мыса Нюкля, желтоперую камбалу – в июне в бухте Нагаево Охотского моря, обыкновенную малоротую корюшку – в мае в районе устья р. Тауй (окрестности пос. Балаганное).

Неполное гельминтологическое вскрытие осуществляли в соответствии с общепринятыми методиками (Скрябин, 1928;

Быховская-Павловская, 1985). Как правило, скребни располагались на поверхности внутренних органов рыбы и легко обнаруживались невооруженным глазом (Рисунок 1, 2);

подавляющее большинство из них были инкапсулированы.

Карта 1. Общий план района исследований.

Видовую принадлежность скребней определяли при помощи «Определителя паразитов пресноводных рыб» (Определитель…, 1987) с учетом консультаций к.б.н. Г.И. Атрашкевича (ИБПС ДВО РАН). Всего было исследовано экземпляра скребней. Обнаруженных скребней, в зависимости от метода исследований, фиксировали в том или ином фиксаторе, причем период между вскрытием животного и фиксацией был минимальным, что в большинстве случаев позволяло сохранить живыми клетки, формирующие капсулу.

Для исследования использовали стандартные методы световой и электронной микроскопии (Гайер, 1974;

Уикли, 1975).

2.2. Методика свето-микроскопических исследований Для гистологического исследования инкапсулированных гельминтов отдельно или с кусочками окружающих тканей фиксировали в 70 % этиловом спирте или жидкости Буэна. Фиксированные кусочки обезвоживали в этиловом спирте восходящей концентрации (70, 80, 90 и 96 %) по 3 часа. Для абсолютного обезвоживания образцы помещали в две смены абсолютного спирта на 12 и 3 часа соответственно. Затем образцы переносили в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 3 часа, а затем в две порции ксилола на 3 часа в каждую.

После ксилола образцы пропитывали в смеси парафина и ксилола (1:1) в течение 12 часов при температуре 37 °C и в двух порциях парафина по 45 минут в каждой при температуре 56-57 °С и заключали в парафин фирмы AppliChem (Германия).

Из полученных блоков на санном микротоме с подвижным стальным ножом готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы монтировали на предметные стекла, покрытые яичным белком, расправляли на нагревательном столике, окрашивали в соответствии с задачами исследования и заключали в канадский бальзам.

Для выявления коллагеновых волокон парафиновые срезы окрашивали по стандартному методу Маллори;

для окраски некоторых образцов использовали модификацию метода по Гейденгайну (Волкова, 1982). Для выявления зернистости эозинофильных гранулоцитов срезы окрашивали гематоксилин эозином и азур II-эозином (Основы гистологии…, 1967;

Коржевский, 2010).

Подготовленные препараты просматривали в световых микроскопах Биомед-2 и Olympus СХ41 и фотографировали с использованием цифровых фотокамер Olympus Е-420 и Canon Powershot А95. Полученные фотографии обрабатывали с помощью пакетов программ CorelDRAW® 12 и CorelDRAW Graphics Suite X5.

Часть свето-микроскопических исследований была проведена на полутонких срезах, выполненных с препаратов, подготовленных к электронной микроскопии. Описание методики приводится в следующем разделе.

Всего свето-микроскопическими методами было исследовано инкапсулированных скребня: 47 из тихоокеанской зубастой корюшки, 11 из обыкновенной малоротой корюшки, 20 из тихоокеанской наваги, 27 из желтоперой камбалы, 35 из толстощека Миддендорфа, 24 из керчака Стеллера, из пятнистого терпуга, 58 из экспериментально зараженного толстощека Миддендорфа, 11 из хромиса-красавца и 16 из прыткой ящерицы. В процессе исследований из этих скребней было изготовлено более 400 препаратов и получено более 300 микрофотографий.

2.3. Методика электронно-микроскопических исследований Для электронно-микроскопических исследований скребни отбирались случайным образом. Отобранных скребней фиксировали в течение 2 дней при температуре 4 °С в 2 % глутаровом альдегиде фирмы Panreac (Испания), приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере. Для лучшей пропитки эпоксидными смолами гельминтов в процессе фиксации разрезали пополам. Постфиксацию проводили в 1 % растворе тетраоксида осмия компании Electron Microscopy Sciences (США) на 0,2 М фосфатном буфере в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем образцы дважды промывали в 0,2 М фосфатном буфере и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации: в 70, 80, 90 и 96 % по минут и в абсолютном спирте дважды по 30 минут при комнатной температуре.

Обезвоженные образцы выдерживали в двух сменах ацетона по 30 минут в каждой и пропитывали при комнатной температуре в заливочной смеси абсолютного ацетона и эпоксидных смол (эпон и аралдит) в следующих соотношениях: ацетон:смола – 2:1 (1-2 часа);

ацетон:смола – 1:1 (1-2 часа);

ацетон:смола 1:2 (24 часа). Для пропитки и последующей заливки использовали смесь эпона и аралдита фирмы Fluka (Швейцария) следующего состава: эпон – 5 мл, DDSA – 11 мл, аралдит М – 3 мл, дибутилфталат – 0,2 мл, DMP-30 – капель. В процессе обезвоживания образцы контрастировали насыщенным раствором уранилацетата в 70 % спирте в течение ночи.

Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB IV (Швеция). Полутонкие срезы, толщиной от 1 до 2 мкм, монтировали на предметные стекла, окрашивали метиленовым синим производства Индии по Моргенштерну (Morgenstern, 1969) или смесью кристаллического фиолетового компании Electron Microscopy Sciences (США) и метиленового синего согласно методике, разработанной в лаборатории, и просматривали в световых микроскопах Биомед-2 и Olympus СХ41. Фотографирование осуществляли, используя цифровые фотокамеры Olympus Е-420 и Canon Powershot А95. В ряде случаев срезы заключали в канадский бальзам. Тонкие срезы монтировали на медные сеточки (300-1000 меш) без подложки или на бленды с подложкой из PioloformRB компании Ted Pella Inc. (США) и контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронных микроскопов JEM-7, JEM-1011 и ZEISS LIBRA-120.

Полученные фотографии обрабатывали с помощью пакетов программ CorelDRAW® 12 и CorelDRAW Graphics Suite X5. Необходимые измерения проводили на необработанных фотографиях с использованием программного пакета ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

Электронно-микроскопически всего изучено 27 инкапсулированных скребня: четыре из зубастой корюшки, по три из тихоокеанской наваги и толстощека Миддендорфа, по два из керчака Стеллера и терпуга пятнистого, шесть из желтоперой камбалы, два из экспериментально зараженного толстощека Миддендорфа, один из хромиса-красавца и четыре из прыткой ящерицы. Всего было получено более 500 электронных микрофотографий.

2.4. Методика экспериментов по заражению скребнем C. strumosum естественного и неестественных паратенических хозяев Для сравнительного анализа полученных результатов, а также изучения процесса инкапсуляции скребней в разных хозяевах были проведены эксперименты по заражению скребнем Corynosoma strumosum естественных (толстощек Миддендорфа Hadropareia middendorffii) и неестественных (хромис Hemichromis bimaculatus Lacerta agilis) красавец и прыткая ящерица паратенических хозяев.

2.4.1. Эксперимент по заражению толстощека Миддендорфа С целью исследования структуры и процесса формирования капсулы вокруг скребня Corynosoma strumosum в естественных паратенических хозяевах, было проведено экспериментальное заражение толстощеков Миддендорфа. Мы использовали именно этого хозяина по двум причинам. Во-первых, во время отливов толстощеки часто остаются под камнями и в литоральных ваннах, что позволило нам в аквариуме искусственно создать условия, приближенные к естественным. Во-вторых, в бухте Нагаево нами был обнаружен участок литорали, на котором обитающие там толстощеки имели низкую зараженность (Карта 2). Такое заключение было сделано на основании серий вскрытий рыб: на протяжении трех лет (2011-2013 годы) в разные периоды с июня по сентябрь нами было вскрыто 146 экземпляров толстощеков, отловленных в этом участке литорали, и экстенсивность их инвазии составила около 5 %, при интенсивности инвазии от одной до трех кориносом.

Карта 2. Район исследований, с указанием точек сбора материала для эксперимента с толстощеком Миддендорфа.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.