авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |

«Modern NMR Techniques for Chemistry Research Andrew E. Derome The Dyson Perrins Laboratory, University of Oxford, UK Pergamon ...»

-- [ Страница 5 ] --

Параметр тс объединяет целый комплекс различных факторов, оказы вающих влияние на молекулярное движение. Поэтому он должен зави сеть от молекулярной массы, вязкости раствора, температуры и, воз можно, других специфических факторов, таких, как водородные связи и рН раствора. Сравнивать величины хс различных молекул следует, полагаясь на опыт и химическую интуицию. Например, молекулы с большой массой в растворах обычно движутся медленнее легких и поэтому имеют большее хс. Теперь нам нужно разобраться, каким образом изменения хс будут влиять на времена релаксации и относи Ядерный эффект Оверхаузера тельные вклады различных путей. Вскоре мы получим формулу, связы вающую Wo, Wt и W2 с тс (для двухспиновой системы), но сначала попробуем сделать предположение об их связи на основе физики. Для этого нам нужно будет понять, каким образом распределение частот осциллирующих полей, возникающих при движении молекул, зависит от тс, и затем сравнить их с частотами, необходимыми для инициирования процессов Wo, W1 и W2.

Учитывая, что энергия диполь-дипольного взаимодействия не зави сит от тс (она зависит только от межъядерного расстояния, которое в нашей модели считается фиксированным), а скорость его изменения, наоборот, зависит от хс, мы можем предсказать, что общее число осциллирующих полей будет постоянным, а верхний предел их частот будет определяться тс. Если мы построим график зависимости напряжен ности флуктуирующих полей (спектральная плотность, обусловленная диполь-дипольным взаимодействием, обычно обозначается J) от часто ты со для нескольких значений тс, то они будут иметь одинаковую площадь под кривой, но различные верхние пределы (рис. 5.7). Мы можем также принять без доказательства, что при со « 1/тс спектральная плотность будет приблизительно постоянной, как это показано на рисунке (такое предположение доказывается теоретически и подтвержда ется экспериментально). Это позволяет нам дать некоторые количест венные оценки величин Tt и даже W исходя из хс (т.е. с учетом температуры, вязкости и т.д.).

Скорость релаксации будет определяться интенсивностью поля, флуктуирующего с подходящей для соответствующих переходов часто той. Например, для процесса Wt это частота ш 0. Рассмотрим сначала случай, когда 1/тс намного больше соо, т.е. мы находимся на горизон тальной части кривой спектральной плотности. С уменьшением хс (на пример, при повышении температуры) высота кривой в точке соо будет также уменьшаться (поскольку площадь под кривой остается постоян ной, а верхний предел отодвигается еще дальше). Следовательно, Т, будет расти (замедление релаксации). Если мы изменим В о, а значит, и соо, то изменений 7^ не должно произойти, так как мы находимся на горизонтальном участке кривой спектральной плотности (см. рис. 5.7).

Рис. 5.7. Функции спектральной плот ности для двух различных значений тс.

Ядро с ларморовой частотой а0 будет испытывать предельное сужение линии при коротких, а не длинных хс.

156 Глава Если теперь постепенно увеличивать хс, то Гх будет понижаться, но только до области 1/тс « соо. Здесь мы уходим с горизонтальной части кривой, и дальнейшее уменьшение тс будет вызывать увеличение Т^.

В этой области можно ожидать зависимости Тх от напряженности поля, поскольку кривая спектральной плотности не горизонтальна. Таким образом, на графике зависимости 7\ от тс должен наблюдаться мини мум, что и подтверждается экспериментально.

Каковы же будут относительные вклады в релаксацию процессов И^, Wx и W21 W2 будет стимулироваться самой высокой частотой (поскольку он представляет собой сумму двух обычных переходов), Wo- самой низкой, a Wl-средней между ними. Следовательно, в области 1/тс « соо процесс W2 должен исчезать первым, a Wo еще будет достаточно эффективным. Такую ситуацию мы уже наблюдали, когда с увеличением размера молекул происходило изменение знака ЯЭО (разд. 5.2.2). Таким образом, наша модель релаксации по механизму диполь-дипольного взаимодействия способна хотя бы на качественном уровне объяснить наблюдаемую связь Tt и ЯЭО с молекулярным движением.

Количественный подход позволяет получить формулы, выражающие зависимость скорости релаксации от диполь-дипольного взаимодей ствия в системе из двух спинов, находящихся на расстоянии г друг от друга:

Зт, W\oz /- (1+ю2т2) 2 т.

^ - ^ (5.6, Коэффициент пропорциональности в каждой формуле один и тот же;

со( и со 8 -ларморовы частоты двух ядер. Заметьте, что W\ зависит только от частоты о);

, a W2 и И^0-от суммы и разности частот двух ядер соответственно. Это согласуется с нашими предыдущими рассужде ниями.

Условие 1/т с »со о (т. е. режим, когда 7\ растет с уменьшением тс) можно выразить в форме со2 т 2 « 1. В этом случае все частотно-зависи мые члены в знаменателях выражений (5.6) можно считать пренебрежи мо малыми, и они принимают вид (5.7) Условие со2 т 2 « 1 известно под названием условие предельного суже ния (это условие соответствует полному исчезновению диполь-диполь ного уширения линий за счет усреднения по всем ориентациям молеку лы). Считается, что это условие выполняется для всех обычных органи Ядерный эффект Оеерхаузера ческих молекул в невязких растворах, но в последнее время в связи с более широким применением сильнопольных спектрометров отклоне ния от него встречаются все чаще. При работе с белками и другими биологическими макромолекулами предельное сужение вряд ли может быть достигнуто, поэтому для описания скоростей релаксации нужны другие, более сложные выражения. Мы приведем их вместе с формулами для ЯЭО в разд. 5.2.4 и попробуем с их помощью измерять межъядер ные расстояния.

Другие механизмы релаксации. Дипольное взаимодействие, промоду лированное движением молекул, представляет собой наиболее важный механизм релаксации протонов и других ядер со спином 1/2 (таких, как С) в растворах. Мы кратко упомянем и другие существующие механиз мы, чтобы уметь обнаруживать и подавлять их при проведении экспери ментов по ЯЭО, поскольку все они не связаны с кросс-релаксацией и, следовательно, снижают ЯЭО. Прежде всего заметим, что до сих пор мы рассматривали диполь-дипольные взаимодействия только между ядра ми одной молекулы, хотя нет никаких запретов на существование межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Межмолеку лярные взаимодействия происходят на больших расстояниях, но это не значит, что ими можно пренебречь. Первым зарегистрированным ЯЭО был именно межмолекулярный эффект на протонах в смеси хлороформа и циклогексана. Поскольку при измерении ЯЭО используются только дейтерированные растворители, единственным вероятным межмолеку лярным эффектом будет взаимодействие друг с другом молекул раство ренного вещества. На практике для его подавления следует готовить достаточно разбавленные растворы.

Другой чрезвычайно эффективный механизм диполь-дипольной релаксации - взаимодействие с неспаренными электронами. Магнитный момент электрона приблизительно в 2000 раз больше, чем у протона, поэтому в присутствии парамагнитных веществ даже межмолекулярное взаимодействие оказывается сильным. Это приводит к большому сокра щению времен релаксации, полностью останавливает кросс-релакса цию и подавляет гомоядерный ЯЭО. Умышленно добавляя в образец парамагнитные вещества, мы можем подавлять нежелательный ЯЭО и сокращать 7\ (см. гл. 7). В то же время все обычные растворы содержат заметные количества парамагнитного кислорода, который следует удалять перед измерением ЯЭО (см. разд. 5.3).

Еще один широко распространенный механизм релаксации работает только на ядрах со спином, большим 1/2 (квадрупольные ядра). Такие ядра помимо магнитного поля способны взаимодействовать и с градиен том электрического поля, что служит очень эффективным механизмом релаксации. Поэтому квадрупольные ядра (например, 1 7 О или 1 4 N ) имеют очень малые времена релаксации Гх и Т2 и широкие линии.

Однако ядра в симметричном окружении (например, 1 4 N в соединениях типа R 4 N + Х~) или в окружении с малыми градиентами электрического 158 Глава поля (классический пример - N в изоцианидах) представляют собой исключение. Дейтерий (спин 1)-возможно, наиболее важное для хими ков квадрупольное ядро-дает относительно узкие линии в небольших молекулах по причине малого квадрупольного момента. Но все же он релаксирует значительно быстрее ядер со спином 1/2. Большая скорость релаксации, не зависящая от процессов кросс-релаксации, делает ЯЭО нехарактерным для квадрупольных ядер.

Существует еще несколько механизмов релаксации, эффективных в определенных условиях, но мы не будем загружать ими свою память.

Можно с уверенностью предположить, что для молекул среднего разме ра в невязких растворах (подразумевается, что надо исключить только очень маленькие и очень большие молекулы) основным механизмом релаксации протонов будет внутримолекулярный диполь-дипольный механизм. В необезгаженных образцах возможен вклад растворенного кислорода, другие межмолекулярные механизмы маловероятны. Исчер пывающий обзор всех остальных механизмов релаксации можно найти в гл. 9 книги Шоу [3].

5.2.4. ЯЭО и межъядерные расстояния Максимальный ЯЭО. Мы можем объединить выражения для ЯЭО и скоростей различных процессов релаксации W и попробовать извлечь из них информацию о межъядерных расстояниях. Вспомним, что для двухспиновой системы, релаксирующей только через диполь-дипольное взаимодействие, ЯЭО выражается как Заменив все Жна их выражения в условиях предельного сужения (5.7), получим Такого результата мы не ожидали! В соответствии с нашим предпо ложением ЯЭО должен не зависеть от г и быть равным точно 0,5 (или 50%, как это принято записывать в химическом контексте). Мы не сделали ошибки: наше предположение совершенно верно, но оно при менимо только к идеальной системе двух диполей, полностью изолиро ванной от всех остальных источников релаксации. Если бы Вселенная состояла только из двух протонов, находящихся в условиях предельного сужения, то насыщение сигналов одного из них дало бы 50% ЯЭО на другом независимо от того, находились бы они на расстоянии в несколь ко ангстрем или в несколько световых лет. Отсюда можно сделать вывод, что, если реальный химический эксперимент достаточно близко подходит к ситуации двух изолированных протонов, ЯЭО может не Ядерный эффект Оверхаузера содержать никакой информации о межъядерных расстояниях. Для правильного использования величин ЯЭО необходимо помнить об этом.

Каким бы нереалистичным ни было наше вычисление, из него можно извлечь полезный результат. Максимальный положительный гомоядер ный ЯЭО, который можно получить в эксперименте, составляет 50%.

В гетероядерном случае максимальный ЯЭО определяется выражением 0,5 (у/у(). Оно объясняет значительное увеличение чувствительности при наблюдении гетероядер в условиях широкополосной развязки от прото нов. Например, ун//ус составляет около 4, и максимальный ЯЭО -200%, что приведет к трехкратному увеличению интенсивности сигналов по сравнению с интенсивностью без ЯЭО (/ = / 0 (1 + ц)). В то же время некоторые ядра имеют отрицательное значение гиромагнитного от 29 ношения (например, Si и N ), поэтому облучение протонов может понизить или даже инвертировать их сигналы. Например, yH/Ysi состав ляет около — 5, и максимальный ЯЭО-около — 250%. Если же реализу ется не полный ЯЭО, а около — 100%, то сигнал может исчезнуть вообще. Этот вопрос будет обсуждаться в следующей главе, где мы сравним ЯЭО с другими способами повышения интенсивности сигналов, использующими гетероядерное спин-спиновое взаимодействие с прото нами.

Когда не выполняется условие предельного сужения. По мере того как растет напряженность полей спектрометров, а вместе с этим и наше стремление к изучению сложных молекул, довольно обычными стано вятся ситуации, когда предельное сужение уже отсутствует. Химики органики, работающие с молекулами, массы которых составляют не сколько тысяч единиц, попадают в ловушку сбалансированных W2 и Wo, где ЯЭО становится пренебрежимо малым. Единственный выход из нее-замена растворителя или изменение температуры с целью вернуть ся в область предельного сужения или перейти в другой режим, где основную роль будет играть Wo. Именно в этом режиме работают биохимики (см. ниже). Совсем недавно появилась новая эксперимен тальная методика (ЯЭО «во вращающейся системе координат» [4]), позволяющая надеяться на решение этой проблемы, но к моменту написания книги она еще недостаточно хорошо разработана, чтобы делать окончательные выводы.

При очень больших временах тс, наблюдающихся в растворах белков или нуклеиновых кислот с молекулярной массой более 10000, Wo полностью преобладает над W2. Подставив в выражение (5.5) нулевые W1 и W2, мы видим, что ЯЭО снова восстанавливается, но уже с макси мальным значением — 1. Таким образом, в макромолекулах ЯЭО отрицателен и по величине в 2 раза превышает ЯЭО в условиях предельного сужения. Это очень удобно для отнесения сигналов в спект рах белков, особенно если ЯЭО определяется в двумерном варианте (см.

гл. 8).

160 Глава ЯЭО в реальных системах. Мы получили довольно пессимистический вывод о возможностях применения ЯЭО. Но, к счастью, если в образо вании ЯЭО участвует большее число взаимодействий, он все-таки сохраняет связь с межъядерным расстоянием. Эту связь можно выявить двумя основными путями. Во-первых, ЯЭО даже в двухспиновой систе ме может зависеть от межъядерного расстояния, если имеются кон курирующие пути релаксации, всегда присутствующие в реальных экспе риментах. Приняв некоторые допущения об этих путях, мы можем экспериментально прокалибровать зависимость ЯЭО от межъядерного расстояния. Во-вторых, в многоспиновых системах, где не наблюдается кросс-релаксация, иногда удается связать величины ЯЭО с отношениями межъядерных расстояний (но не с самими расстояниями). Ниже будет представлено особенно полезное уравнение такого типа.

Сравнение величин ЯЭО в двухспиновых системах. Первый подход, разработанный Беллом и Сондерсом [5], лег в основу большинства применений ЯЭО в органической химии. Посмотрев на уравнение (5.5), мы заметим, что его числитель содержит информацию о чистой кросс релаксации и обычно обозначается ois:

(5.9) o.s=W2-W Знаменатель уравнения (5.5) выражает общую релаксацию ядра / и обыч но обозначается р ;

:

(5.10) pt = 2W[ + W2+ Wo Наши предыдущие вычисления показывают, что для случая чисто гомоядерной диполь-дипольной релаксации двух ядер со спином 1/ (5.11) Pi = 2ais т.е. ЯЭО составляет 0,5. В реальной ситуации будут присутствовать и другие механизмы релаксации. В предположении, что они не связаны с кросс-релаксацией, мы можем просто включить их в знаменатель (5.5) в виде дополнительного члена р*:

(5-12) или с учетом (5.11):

Перевернем полученное выражение:

Л((я) Р.

Используя нашу модель диполь-дипольной релаксации, в условиях Ядерный эффект Оверхаузера предельного сужения мы получаем Jl (5-15) Уравнение (5.14) приобретает форму Ц-осЮг (5.16) По Беллу и Сондерсу, для подобных молекул величину р*/тс часто можно считать постоянной, и измеряемый ЯЭО должен быть непосред ственно пропорционален 1/гб. Они проверили это предположение на ряде молекул с известной геометрией и получили хорошее соответствие между 1/г6 и т|. Этот вывод позволяет сравнивать межъядерные расстоя ния в различных молекулах с помощью величин ЯЭО, однако для получения корректных результатов нужно тщательно проверять нали чие необходимых условий. Особое внимание следует обратить на такие моменты:

1. тс будет постоянной только для молекул с близкими молекуляр ными массами в одинаковых растворителях при одинаковых температу рах. Специфические взаимодействия с растворителем, способные изме нить тс, должны отсутствовать. Не должно быть и внутримолекулярных движений, в результате которых эффективное корреляционное время конкретного ядра может отличаться от тс для молекулы в целом, т.е.

эксперимент можно проводить только на жестких молекулах.

2. Необходимо работать с достаточно малыми молекулами, чтобы в поле вашего магнита достигался режим предельного сужения.

3. р*—дополнительная релаксация, обусловленная посторонними диполь-дипольными взаимодействиями. Ее скорость должна быть по стоянной. Поэтому нельзя менять растворитель и концентрацию. Очень важно постараться исключить возможные различия во внутримолеку лярных взаимодействиях сравниваемых молекул. Однако полностью этого достичь невозможно. Эти взаимодействия и представляют собой наиболее вероятный источник ошибок при интерпретации ЯЭО. В даль нейшем мы обсудим этот вопрос более подробно.

4. При переходе от соединения к соединению не должны изменяться структурные особенности, способные изменить зависящий от межмоле кулярных взаимодействий член р*. Например, все используемые для измерений ядра должны находиться на периферии молекулы, а не в какой-либо полости. Не должно быть специфических взаимодействий, таких, как водородные связи, обусловливающих неодинаковое сродство различных частей молекулы к растворителю.

5. Образец нужно готовить очень тщательно, обращая особое внима ние на удаление растворенного кислорода. Случайное попадание в обра зец кислорода может вызвать значительное снижение измеряемого ЯЭО, что приведет к получению неверных результатов. Этот момент будет обсуждаться в разд. 5.3.

11 - 162 Глава Рис. 5.8. Межъядерные расстоя ния в трехспиновой системе.

ЯЭО в системе из нескольких ядер. Из предыдущего обсуждения ясно, что сравнение друг с другом величин ЯЭО, полученных для различных молекул, может быть не совсем корректным. Но, к счастью, многие задачи решаются с помощью сравнения ЯЭО для различных ядер внутри одной молекулы, если мы имеем о ней некоторую достоверную дополни тельную информацию. В разд. 5.4 мы приведем несколько примеров использования этого метода на качественном уровне. Для ограничен ного числа случаев можно вывести и количественные выражения. На пример, для системы АМХ без посторонних источников кросс-релакса ции (рис. 5.8) имеем [2] А(Х)Г|Х(М) Если мы измерили все ЯЭО в такой системе и знаем некоторые межъядерные расстояния, это уравнение позволяет нам вычислить не известные межъядерные расстояния. Например, положение геминальных протонов у 5/»3-гибридизованного углерода почти не меняется при переходе от молекулы к молекуле. Если эти протоны составляют АМ-часть системы АМХ, то по измеренным ЯЭО мы можем определить положение ядра X. Применение формулы возможно только при условии жесткой связи между тремя ядрами (одинаковые тс для двух межъядер ных векторов) и в отсутствие посторонних источников кросс-релаксации (т.е. в отсутствие поблизости других ядер со спином 1/2). Последнее требование надежно выполняется только в случае очень небольших молекул, однако убедиться в отсутствии других источников кросс-релак сации можно и с помощью изотопного замещения водорода на дейте рий. Кроме того, даже присутствующие в молекуле посторонние источ ники кросс-релаксации могут не оказывать существенного влияния на эксперимент, если они достаточно удалены от интересующих нас ядер.

Проверить это условие можно с помощью ЯЭО: облучение посторонних ядер не должно давать заметного ЯЭО на исследуемых ядрах.

Два основных принципа для многоспиновых систем. Разбор нескольких конкретных примеров (рис. 5.9) поможет нам сделать довольно аб страктные рассуждения этого раздела более понятными. Сначала рас смотрим два протона в молекуле, не содержащей других ядер со спином 1/2. При правильном выборе условий проведения эксперимента дополни тельных источников релаксации будет не так много (т. е. р* « 0), и мы получим почти максимальный (50%) ЯЭО на одном протоне при Ядерный эффект Оверхаузера н н Нд Нв Нс б а Рис. 5.9. Двухспиновая система и два возможных расположения ядер трехспиновой системы.

облучении другого независимо от расстояния между ними. Этот пример подтверждает первый принцип:

Наблюдение ЯЭО между двумя протонами само по себе еще не говорит об их близости.

Для правильной интерпретации таких измерений нужна дополни тельная информация: другой эксперимент для сравнения, например, по методу Белла и Сондерса или уверенность в том, что использующийся для измерения ЯЭО протон не изолирован от других источников кросс-релаксации. Второе условие выполняется при наличии в молекуле как минимум еще одного спина (рис. 5.9,5). Пусть три протона находят ся на одной линии и один из крайних (Н А ) находится ближе к централь ному (Н в ), чем другой (Н с ). Облучение Н А будет давать значительное повышение интенсивности сигнала Н в, поскольку он ближе, чем Н с, и преобладает его кросс-релаксация. По этой же причине облучение Н с будет давать небольшое увеличение сигнала Н в. Сравнение данных двух экспериментов позволяет нам с очевидностью сделать вывод об относи тельных межъядерных расстояниях. Однако облучение Н в даст похожие увеличения сигналов Н А и Н с, поскольку с их точки зрения Н в -един ственный ближайший протон;

поэтому такое измерение делать бесполез но. Это подтверждает тот факт, что в общем случае ЯЭО между двумя ядрами неодинаков в различных направлениях, так как каждое ядро может иметь различные связи с другими источниками релаксации.

Очень интересно также посмотреть, что произойдет с Н с при облуче нии Н А. В молекуле с описанной ранее геометрией Н А не будет оказывать заметного прямого влияния на Н с ;

Н с «почувствует» только увеличение разности заселенностей уровней своего соседа Н в, которое произошло по причине ЯЭО от ядра Н А. Поскольку понижение разности заселенностей при насыщении создает на соседнем ядре положительный ЯЭО, на ядре Н с мы должны получить отрицательный ЯЭО. Это известный «трехспиновый эффект», который нужно обязательно учиты вать при интерпретации данных ЯЭО. Наличие отрицательного ЯЭО в условиях предельного сужения очень характерно для линейного (или почти линейного) расположения ядер. Можно представить себе и даль нейшее распространение ЯЭО по длинным цепям ядер, сопровождаю щееся чередованием его знака, но на практике непрямой ЯЭО более чем через два ядра почти всегда пренебрежимо мал.

164 Глава 0, ©sa 0, а 2Г 0,, ДГ-1, //-7—х-\,а а0" V U^ /// *'** /// *«0, 0, \у(/—"'^ и —^ -0, i i 0 30 60 90 120 150 8, гробу;

Рис. 5.10. Зависимость r| t (2) от 6 иллюстрирует «трехспиновый эффект».

Другой аспект трехспинового эффекта можно рассмотреть на модели с геометрией, показанной на рис. 5.9,в. Расстояние Н А - Н С сделано здесь достаточно малым для того, чтобы прямой положительный ЯЭО между ними не был пренебрежимо малым. Суммарный ЯЭО, наблюдающийся на Н с при облучении Н А, теперь будет определяться соотношением прямого положительного и непрямого (через Н в ) отрицательного эффектов и при некотором отношении межъядерных расстояний может исчезнуть вообще. Поэтому иногда ЯЭО может отсутствовать даже у близко расположенных ядер при наличии значительной взаимной кросс-релаксации. На рис. 5.10 представлен диапазон ЯЭО при «трех спиновом эффекте». Отсюда вытекает наш второй принцип:

, Отсутствие ЯЭО между двумя ядрами само по себе еще не говорит об их удаленности друг от друга.

Использовать этот принцип нужно еще внимательнее, чем первый, поскольку отсутствие или малая величина ЯЭО может наблюдаться по целому ряду причин. Отсюда можно сделать общий вывод, что интер претация ЯЭО требует учета всех испытываемых ядрами взаимодей ствий. Измерения ЯЭО в условиях равновесия можно также дополнить измерениями неравновесного ЯЭО (разд. 5.2.5).

Важность такого подхода можно проиллюстрировать на примере теоретической четырехспиновой системы, релаксирующей только за счет диполь-дипольного взаимодействия [6] (рис. 5.11). ЯЭО обозначен на рисунке стрелками, направленными от облучаемого протона к протону, сигнал которого регистрируется. Не отмеченные на рисунке возможные взаимодействия пренебрежимо малы. Сравните большую величину ЯЭО на протоне Н А и малую на протоне Н с при облучении Н в. Некритичный подход к интерпретации таких данных позволил бы утверждать, что Н в Ядерный эффект Оверхаузера I0.7 I Мё.8 I геп О 4 6 относительное расстояние РИС. 5.11. ЯЭО в линейной четырехспиновой системе. Величины, использованные в тексте, приведены в толстых рамках.

находится ближе к Н А, чем к Н с, хотя правильно как раз обратное.

Большой ЯЭО на Н А объясняется тем, что он не имеет других источни ков релаксации, кроме Н в. Проанализировав все возможные в системе ЯЭО, мы, вероятно, уже не сделаем этой ошибки. На практике при более реальном соотношении межъядерных расстояний и ненулевом р* такой внезапный эффект, обусловленный величинами ЯЭО, не возникнет, но вывод ясен: к интерпретации данных нужно подходить очень аккуратно.

5.2.5. Неравновесный ЯЭО Важная дополнительная информация о геометрии молекулы может быть получена при измерении не самой величины т|, а скорости ее установления [7]. Величина ЯЭО зависит от соотношения эффектив ности различных конкурирующих путей релаксации, которое, как мы уже видели, может выражаться весьма непросто. Но начальная скорость роста зависит только от скорости кросс-релаксации между двумя рас сматриваемыми ядрами. При постоянном тс она будет зависеть только от межъядерного расстояния, и в случае рассматривавшейся ранее четырехспиновой системы (разд. 5.2.4) начальная скорость роста г\А (В) должна быть значительно меньше скорости роста т)в (С), несмотря на то что их конечные величины близки. Измерение скоростей роста Я Э О менее надежный источник информации, чем определение равновесных значений, но простота интерпретации этих данных с избытком компен сирует усложнение методики эксперимента. Кроме того, на описываемой далее технике измерения неравновесного ЯЭО основан двумерный экспе римент NOESY (гл. 8).

В принципе скорость роста Г| может быть измерена таким же путем, как и его равновесное значение,-с помощью разностного метода (см.

разд. 5.3) при изменяющейся длительности периода насыщения. Однако для интерпретации таких данных потребуется довольно сложная модель, учитывающая рост как ЯЭО, так и насыщения, поскольку насыщение тоже не может быть достигнуто моментально. Для того чтобы обойти Глава эту трудность, сначала с помощью селективного л-импульса осуще ствляют инверсию заселенностей облучаемого ядра и перед выборкой данных дают задержку переменной длительности тш (рис. 5.12). Для определения интенсивностеи можно по-прежнему использовать разност ный метод. Сигнал, дающий в равновесных условиях положительный ЯЭО, в эксперименте на скорость роста при небольших хт также даст положительный резонанс, увеличивающийся от нуля до некоторого максимума с ростом хт. При дальнейшем увеличении хт он начнет постепенно уменьшаться за счет процессов обычной продольной релак сации, возвращающих систему в состояние теплового равновесия (рис. 5.13). Наклон кривой роста интенсивности в начальный момент времени представляет собой интересующую нас величину.

Практическая трудность определения скорости роста ЯЭО заклю (я I Выборка Рис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.

.JL )мапьнып I Л спектр — J —" — 8с 5с ЗС 2С 1С О,5 С Рис. 5.13. Нестационарный ЯЭО (наверху - обычный спектр, ниже-разностные ЯЭО-спектры с переменной задержкой т т ). После селективной инверсии синглета в центре спектра на трех других сигналах наблюдается рост отклика. При достаточно больших хт интенсивности инвертированного пика и возникших ЯЭО приближаются к нулю.

Ядерный эффект Оверхаузера чается в том, что нам нужно проводить несколько измерений при различных тш. Такой эксперимент займет, вероятно, больше времени, чем измерение этого же ЯЭО в равновесных условиях, хотя, конечно, это зависит от соотношения используемой в равновесном эксперименте длительности периода насыщения с задержками тш и числом спектров при измерении скорости роста. Кроме того, в первых точках кривой ЯЭО далек от максимума, поэтому требуется большее отношение сигнал/шум. Селективность инвертирующих импульсов создает те же проблемы, что и насыщение;

однако с помощью импульсов специальной формы удается получить очень хорошие результаты (гл. 7, разд. 7.7.3).

5.3. Измерение ЯЭО 5.3.1. Введение Чтобы немного отдохнуть от теоретических выкладок, мы перейдем к практическим вопросам и рассмотрим, как ЯЭО измеряется на практике. Для регистрации столь небольших изменений в интенсивности сигнала (несколько процентов) нужна более высокая точность, чем в большинстве других экспериментов ЯМР. Это требует самой высоко качественной работы как от спектрометра, так и от экспериментатора.

Помимо описания разностного метода измерения ЯЭО, а также спосо бов получения максимальных его значений и способов уменьшения помех в эксперименте, мы уделим здесь внимание и таким важным для разностной спектроскопии характеристикам спектрометра, как надеж ность канала дейтериевой стабилизации и стабильность частоты. Все сказанное полезно знать не только при измерениях ЯЭО, но и при выполнении других экспериментов, требующих длительной стабиль ности спектрометра, как, например, двумерная спектроскопия.

5.3.2. Приготовление образца Основное требование к образцам для измерения ЯЭО-это отсут ствие парамагнитных примесей (в основном кислорода), методы удале ния которых обсуждались в гл. 3. Эффективным способом обезгажива ния образца служит метод замораживания-откачивания-разморажива ния, который лучше всего проводить непосредственно в ЯМР-ампуле (ампулы с удобными краниками, облегчающими эту процедуру, произво дит фирма Wilmad). Метод состоит из такой последовательности дей ствий:

1. Охладите образец в осушенной атмосфере с помощью жидкого азота или смеси сухого льда с ацетоном.

2. Подсоедините его к хорошей вакуумной линии и откачайте.

3. Отсоедините образец от линии и нагрейте до комнатной темпе ратуры.

168 Глава 4. Напустите в образец азот и повторите всю процедуру с самого начала.

Эту последовательность нужно повторять много раз (как минимум пять). Удалить кислород полностью очень трудно;

это легко продемон стрировать на растворе любого вещества с небольшими молекулами, как, например, бензол. Проделывайте над ним циклы замораживания откачивания-размораживания и после каждого цикла проверяйте 7\ (быстрый метод определения Tt описан в гл. 7). Обратите внимание, насколько долго нужно обезгаживать образец до получения постоянного 7\. Такой эксперимент, кроме того, позволит хорошо проверить ваше оборудование. Старайтесь проводить обезгаживание образца непосред ственно перед измерением ЯЭО, поскольку кислород довольно быстро диффундирует внутрь образца даже в ампуле с краником. Очень полезно иметь вакуумную линию непосредственно в ЯМР-лаборатории.

Значительно труднее обезгазить водные растворы, при заморажива нии которых ампула может лопнуть. В этом случае обезгаживание следует проводить в колбе и переносить раствор в ампулу в инертной атмосфере. Используйте для переноса только специальные шприцы без металлических деталей, поскольку обычные шприцы и иглы обязательно внесут в раствор ионы металла. Нельзя обезгаживать образец пропуска нием через раствор газообразного азота. Этот способ не эффективен, и при его использовании в образец может легко попасть еще большее количество парамагнитных примесей.

Обезгаживать водные растворы можно и с помощью простой откач ки образца без замораживания (естественно, подразумевается, что раст вор нелетуч). Это можно делать и непосредственно в ЯМР-ампуле (очень осторожно!), заполняя ее после каждого легкого вакуумирования инерт ным газом. Многократные повторения этого цикла позволяют сравни тельно эффективно обезгазить образец.

5.3.3. Метод разностных спектров Введение. При измерении ЯЭО мы должны насыщать один резонанс ный сигнал и сравнивать интенсивности остальных сигналов с их равновесными величинами. В принципе для этого можно просто про интегрировать сигналы, полученные в условиях насыщения и без него, но такой способ недостаточно точен для измерения малых ЯЭО. Вместо него применяется методика, известная под названием разностной спект роскопии ЯЭО (рис. 5.14). Кроме собственно разностного метода этот эксперимент включает также использование прерываемой развязки.

Этот тип развязки позволяет производить сравнение спектра, получа емого при насыщении какого-либо сигнала, со спектром без насыщения.

Облучение нужного сигнала с помощью декаплера создает новые раз ности заселенностей в соответствии со всеми ЯЭО. При этом совсем необязательно продолжать облучение сигнала и во время выборки ССИ, поскольку заселенность уровней вернется к равновесной только по Ядерный эффект Оверхаузера | выборка облучение IT 11 \ / \ / \ / - ^ повторяется с большой "2- " \V^ Лрз /а расстройкой выборка =4- разностный спектр РИС. 5.14. Схема эксперимента разностной спектроскопии ЯЭО.

истечении промежутка времени порядка T t. Более того, желательно выключить декаплер при выборке (что обычно и делается непосредствен но перед ее началом), чтобы избежать появления возможных сдвигов от развязки или сдвигов Блоха-Зигерта. На первый взгляд может показать ся непонятным, почему в обычном эксперименте с развязкой облучение необходимо производить на протяжении всего эксперимента, а ЯЭО, будучи создан, продолжает существовать и без облучения. Но на самом деле здесь нет ничего сложного.

После накопления нескольких прохождений спектра с облучением сигнала нужно записать столько же прохождений без облучения. Чтобы различие условий двух экспериментов было минимальным, обычно вместо выключения декаплера просто смещают его частоту так, чтобы она была существенно удалена от всех сигналов спектра. Это позволяет предельно снизить все чисто аппаратурные эффекты, и разность получен ных спектров будет отражать только ЯЭО (однако существует эффект селективного переноса заселенности, который мы обсудим позже). Вы читание невозбужденного ССИ из возбужденного и последующее пре образование Фурье даст нам спектр, в котором будут присутствовать только сигналы, не совпадающие в двух исходных ССИ (рис. 5.15).

Обязательно будет присутствовать и пик самого облучавшегося сигнала.

В разностном спектре он инвертирован.

Таким способом мы должны определять ЯЭО совершенно однознач но. Методы численного измерения его величины мы обсудим позднее.

Однако на практике корректное вычитание спектров возможно только при очень стабильной работе спектрометра. На стабильность прибора влияет множество факторов, и многое здесь зависит от мастерства оператора. Вообще разностная спектроскопия-это хороший тест на качество спектрометра (гл. 7). Ниже мы рассмотрим трудности, возника ющие в разностной спектроскопии, и те приемы, с помощью которых можно получить наилучшие результаты.

Вычитание лоренцевых линий. Зарегистрировав два раза сигнал ССИ в одинаковых условиях, мы должны получить идентичные данные. Но на Глава 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 1,5 1, 2ft м.З.

• I • • • • I' '' • I • •' • I •I • • • 1 •''' I 4,5 4,0 3,5 3,0 1,5 1, 2,5 2, 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2, Рис. 5.15. Разностный эксперимент по ЯЭО. Слева внизу представлен спектр с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху - получен ный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсив ностью (1);

пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок вычитания (2);

насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре (3);

интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селектив ности насыщения (4).

практике из-за несовершенства спектрометров данные этих двух экспери ментов могут различаться по амплитуде, фазе и частоте. Поэтому после вычитания ССИ, при котором должны исчезнуть все совпадающие пики, в разностном спектре все же сохраняется ряд остаточных сигналов, интенсивность которых зависит от типа и величины искажений ССИ.

Предельно допустимая интенсивность остаточных пиков зависит от типа проводимого эксперимента. При измерении ЯЭО желательно иметь возможность надежно регистрировать изменение амплитуды сигнала на 1%. Для этого интенсивность остаточных пиков не должна превышать 0,1%. В следующих параграфах мы увидим, насколько трудно выпол нить это требование, поскольку оно затрагивает такие характеристики спектрометра, как стабильность фазы и частоты. Но сначала выясним, как нам провести измерение ЯЭО с минимальными трудностями.

Основа разностного эксперимента состоит в суммировании несколь ких прохождений в условиях насыщения некоторого сигнала и такого же числа прохождений без насыщения. Это число можно выбрать в соответ ствии с требующимся отношением сигнал/шум. Однако существует и другой лимитирующий фактор, не позволяющий использовать малое число прохождений даже для протонных спектров. Усреднение сигналов позволяет повысить степень подавления паразитных пиков, если не стабильность прибора, приводящая к их появлению, носит случайный характер. В этом случае мы достигнем улучшения подавления паразит ных пиков по сравнению с одним прохождением в число раз, равное квадратному корню из числа прохождений, как и при улучшении Ядерный эффект Оверхаузера отношения сигнал/шум. Но нестабильность прибора помимо случайных факторов может содержать также и систематические дрейфы пара метров, возникающие, например, за счет постепенного изменения темпе ратуры. Поэтому лучше всего через некоторые промежутки времени чередовать накопление насыщаемого и ненасыщаемого спектров. На пример, мы можем сделать 16 прохождений с облучением сигнала, затем 16 без облучения и повторить всю эту процедуру 10 раз, чтобы получить в сумме 160 прохождений в каждом ССИ.

Таким образом мы можем добиться дополнительного уменьшения интенсивности остаточных пиков в 10-12 раз. Это значит, что если нам в конечном счете нужна ошибка 0,1%, то точность при вычитании ССИ для простой пары прохождений не должна превышать 1-2%. Добиться хорошего воспроизведения амплитуды сигналов на практике достаточно легко. Значительно труднее устранить нестабильность фазы и частоты.

Это два аспекта одного и того же явления, так как шум фазы непосред ственно связан с модуляцией частоты. Но мы будем рассматривать их раздельно, поскольку они дают различные результаты. Наш подход основан на анализе реального разностного спектра после преобразова ния, т. е. спектра в частотной области.

Сначала рассмотрим последствия небольшого изменения фазы ф при переходе от одного прохождения к другому. Будем считать, что реаль ная часть ССИ после первого прохождения содержит чисто абсорбцион ный сигнал. Тогда при втором прохождении (см. гл. 4), результат которого мы собираемся вычитать из первого, сигнал за счет сдвига фазы будет представлять собой $ = Acoscp — Dsincp (5.18) Поскольку ф-малый угол (если, конечно, спектрометр не сломан), мы можем значительно упростить это выражение. Градиент cos ф при ф = минимален, а градиент sinp максимален. Небольшие отклонения ф от нуля вызовут незначительное изменение абсорбционной составляющей, в то время как дисперсионная часть существенно вырастет. Таким образом, мы можем считать, что в разностном спектре с небольшим сдвигом фазы ф абсорбционная составляющая исчезнет полностью, а остаточные сигналы будут состоять только из дисперсионной части с амплитудой, пропорциональной Бшф. Остаточные сигналы такого типа можно легко найти почти во всех спектрах этой главы. Возьмем конкретный пример: если ф = Г, то cosp = 0,99985, а вшф = 0,017, т.е.

даже такая небольшая ошибка фазы приводит к появлению предельно допустимых остаточных сигналов. Спектрометр с частотой 500 МГц, на котором получено большинство спектров для иллюстраций этой книги (самый совершенный прибор с цифровой генерацией частот и фаз), имеет среднюю нестабильность фазы порядка + 2°. Такая ошибка легко объясняет появление в разностных спектрах значительных остаточных сигналов. В этом отношении коммерческие приборы нуждаются в даль нейшем усовершенствовании.

172 Глава Рис. 5.16. При вычитании двух лорен цевых линий, даже совсем немного от личающихся по частоте, остается зна чительный сигнал (в левой части рисун ка различие частот едва заметно).

Остаточные пики могут появляться и при вычитании сигналов с одинаковой амплитудой и фазой, но различными частотами (рис. 5.16).

Похожая ситуация встречается и в фазочувствительной двумерной спектроскопии (гл. 8) при перекрывании двух линий с противоположны ми фазами. В гл. 3 мы уже записывали уравнение лоренцевой линии с амплитудой А и шириной на полувысоте И^(рис. 3.3):

AW (5Л9) Рассмотрим две линии с v 0 = ( + \/2)р Wn (— l/2)p W(T.e. разделен ные нар ширин линий;

нас интересуют случаи, когда р меньше 1). Пусть х = 2 v/W, тогда их разность можно записать как Это выражение не соответствует точно дисперсионной лоренцевой фор ме, но задаваемая им линия также проходит_в центре через нуль: в точке х = О или посредине между двумя лоренцевыми линиями (рис. 5.16).

Нам нужно узнать амплитуду этой линии, и мы найдем х-координаты ее максимума и минимума. Продифференцировав (5.20), приравняв полу ченное уравнение нулю и решив его относительно х, получим (р2 (5.21) л-= + Это очень интересное уравнение. Из него следует, что даже для сравни тельно больших величин р измеряемая разность частот двух противо фазных пиков значительно отличается от их действительной разности.

Например, для р = 4 ошибка составляет 17%. Об этом важно помнить при измерении в двумерном фазочувствительном спектре константы спин-спинового взаимодействия протонов порядка нескольких герц по двум линиям с противоположными фазами примерно той же ширины.

Ядерный эффект Оверхаузера 2ОО| i § s I I во • - * Рис. 5.17. Зависимость амплитуды ос таточных сигналов разностного спект qo qi q? qa Q qs qe q7 qs q9 10 у у ц з у ^ р а от расстояния между лоренцевыми 4, Разделение линий р (чаешь ширины линии) ЛИНИЯМИ.

Техника таких измерений рассматривается в гл. 8, где приведено графи ческое решение уравнения (5.21).

Амплитуда остаточных пиков задается довольно сложным выраже нием (эта зависимость изображена графически на рис. 5.17), но нас с точки зрения разностной спектроскопии интересуют только малые величины р. Выражение (5.21) имеет предел х = ± 1/,/з при р - 0, т. е.

расстояние между максимумами близко к W/y/З при любых достаточно малых р. При этом условии амплитуда линии, т.е. разность интенсив ностей самой положительной и самой отрицательной точек, отнесенная к амплитуде исходных линий, будет иметь вид (5.22) Таким образом, для того чтобы интенсивность остаточных сигналов не превышала 2%, частота линий не должна изменяться от прохождения к прохождению более чем на 1% их ширины! Это значит, что для типичных протонных линий шириной 1 Гц флуктуации поля не должны превышать 10 мГц, т.е. 5 - К Г 1 0 на 500 МГц. Это близко к пределу стабильности частоты термостатированных кварцевых генераторов.

Такая стабильность может быть достигнута, но это требует использова ния оптимальных конструкций приборов и тщательного контроля усло вий эксперимента. Использование при обработке данных экспоненциаль ного умножения ССИ уменьшает амплитуду остаточных сигналов этого типа, поэтому желательно использовать экспоненциальную функцию с большим уширением линии, чем в оптимальном фильтре.

Оптимальные условия разностной спектроскопии ЯЭО. Н а м стало ясно, что измерение небольших ЯЭО требует от спектрометра предель ной реализации всех его возможностей. Поэтому нужно выяснить, что 174 Глава можно сделать для увеличения ЯЭО и улучшения подавления остаточ ных сигналов. Сначала рассмотрим последний вопрос. Стабильность спектрометра может зависеть от таких аспектов эксперимента, как дейтериевый лок и параметры окружающей среды образца. В гл. 3 мы уже рассматривали систему лока, в разд. 5.3.4 дан более подробный ее разбор. Здесь мы постараемся выяснить, какие факторы, связанные с условиями, в которых находится образец, могут дестабилизировать эксперимент.

Наиболее вероятный фактор - нестабильная температура. Химичес кие сдвиги во многих случаях обладают значительной зависимостью от температуры, которая может проявляться на интересующих нас сигна лах как непосредственно, так и через изменение химического сдвига опорного сигнала лока. Особенно сильно это проявляется в водных растворах. Таким образом, при измерении ЯЭО очень хорошо исполь зовать температурную стабилизацию, которая легко достигается нагре ванием образца чуть выше комнатной температуры. Нагревание полезно еще и потому, что оно приближает образец к области предельного сужения. При работе с большими молекулами может оказаться необхо димым использовать максимально допустимую для раствора темпе ратуру. Следует иметь в виду, что обычный температурный блок спектрометра Я М Р - довольно грубое устройство с точки зрения под держания температуры, близкой к комнатной. По возможности, лучше купить или сделать самому более качественный блок [8]. В любом случае следует экспериментально проверить, дает использование темпе ратурного контроля улучшение или нет.

Другой фактор, влияющий на качество разностных экспериментов, это, по рассказам ЯМР-спектроскопистов, перемещение людей и боль ших предметов возле лаборатории. Поэтому эксперименты по ЯЭО рекомендуется делать ранним утром или в воскресенье, хотя, по опыту автора, увеличение времени выборки позволяет полностью исключить влияние этих факторов. Но все-таки во время проведения разностных экспериментов лучше стараться избегать всяких движений в комнате, где стоит спектрометр, особенно если это прибор с высокой напряжен ностью поля.

Другое направление, в котором мы можем частично контролировать эксперимент по ЯЭО,-это сама величина ЯЭО. Минимизируя р* и обес печивая условия предельного сужения, мы тем самым увеличиваем шанс измерения чистой кросс-релаксации. Это означает, что мы должны работать с разбавленными, тщательно обезгаженными образцами в дей терированных растворителях высокой изотопной чистоты. Желательно выбирать наименее вязкий из подходящих растворителей. Надо про верить, достаточен ли период насыщения для установления новой равновесной заселенности, т. е. длительность облучения должна быть как минимум в 3 раза больше максимального Ти а лучше-еще больше.

Особенно медленно возникает непрямой трехспиновый ЯЭО, поскольку установление промежуточного прямого ЯЭО, который должен появить Ядерный эффект Оверхаузера ся первым, само требует времени порядка Tt. Очень полезно предвари тельно оценить Ti по быстрой методике (гл. 7, разд. 7.5.3), особенно это важно в случае протонов, где в одной и той же молекуле Тх может меняться от долей секунды до 5 с и более. Величины Тх могут помочь и в интерпретации данных ЯЭО, поскольку необычно большие Ti свидетельствуют об относительной изоляции протона от источников диполь-дипольной релаксации. Выводы из величин ЯЭО на таком протоне следует делать очень осторожно (вспомните протон Н А четырехспиновой системы, обсуждавшейся в конце разд. 5.2.4).

Селективность и проблема селективного переноса заселенности. До сих пор мы предполагали, что можем произвольно насыщать все линии любого мультиплета. Однако на практике насыщение одного сигнала в сложном спектре без возмущения остальных может представлять собой столь сложную проблему, что именно она часто определяет возможность применения разностного метода измерения ЯЭО. Решить ее можно только методом проб и ошибок, используя различные напря женности радиочастотного поля и оценивая насыщение желательных и нежелательных сигналов (общее обсуждение проблемы селективного облучения полями малой напряженности см. в гл. 7, разд. 7.7.2). Обычно, чтобы избежать насыщения находящихся поблизости сигналов, мы вынуждены использовать неполное насыщение интересующего нас муль типлета, что приводит к понижению величин ЯЭО. В связанных спино вых системах эта проблема может усложняться еще и эффектом, извест ным под названием селективного переноса заселенности (SPT, от англ.

Selective Population Transfer).

SPT может возникать в связанных спиновых системах, когда различ ные переходы одного и того же ядра испытывают неравное возмущение.

В идеальном случае, когда все переходы насыщаются полностью, SPT не возникает вообще. Однако, пытаясь повысить селективность облучения, мы стремимся снизить напряженность радиочастотного поля и тем самым создаем возможность для появления SPT. Мы не будем здесь рассматривать механизм переноса заселенности, поскольку он подробно обсуждается в гл. 6;

укажем только природу этого явления и способы его подавления. В отличие от ЯЭО, повышающего общую интенсивность мультиплета, SPT создает только разностную поляризацию, т. е. приво дит к появлению линий с противоположными фазами, суммарный интеграл которых равен нулю (рис. 5.18). При интегрировании сигналов для определения ЯЭО линии SPT не изменяют величину интеграла, но интенсивные линии с противоположными фазами искажают спектр, поэтому имеет смысл попробовать их подавить.

К счастью, это легко достигается при использовании тг/2-импульсов для регистрации спектра [9]. При этом задержки между прохождениями обязательно должны быть в несколько раз больше Ту. Это необходимо также из соображений повышения чувствительности. Для действительно полного подавления SPT-сигналов рекомендуется использовать состав 176 Глава ill JUL I I I 3,8 3,7 3, 1, 4,4 4,3 3, 4,1 4, м. 3.

Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное на сыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование состав ных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и вы явить ЯЭО.


ные я/2-импульсы (гл. 7, разд. 7.3). Все спектры в этой главе, кроме приведенного на рис. 5.18, были получены именно таким путем.

Количественные измерения. После того как получен удовлетворитель ный разностный спектр, нам остается провести интегрирование его сигналов и получить численные величины различных ЯЭО. Существуют два подхода к решению этой задачи. Прямой подход следует из определения ц. Он состоит в получении величин / 0 интегрированием мультиплетов в невозбужденном спектре (т.е. отдельно преобразован ной части Б на рис. 5.14), которым приписывается интенсивность 100%.

Интегрирование соответствующих мультиплетов в разностном спектре даст непосредственно величины ц. Спектр должен иметь тот же масшта бирующий фактор. Для этого, возможно, потребуется установить не который флажок в программном обеспечении спектрометра.

Ядерный эффект Оверхаузера Хотя такая процедура и позволяет получить величину реального увеличения интенсивности каждого мультиплета, пользоваться ей мож но не всегда. При снижении напряженности насыщающего поля для повышения селективности мы, вероятно, получим неполное насыщение.

В этом случае имеет смысл как-то масштабировать полученные значения ЯЭО с учетом степени насыщения, чтобы определить те значения, которые были бы получены при полном насыщении. Это можно сделать при использовании в качестве эталона интенсивности насыщавшегося сигнала в разностном спектре. Ему нужно приписать интенсивность -100%, если это мультиплет одного протона. Интегралы остальных пиков вычисляются в этой шкале. Численные величины ЯЭО, приводи мые в разд. 5.4, получены именно таким способом.

Какой бы способ измерения ни был выбран, не стоит рассчитывать на высокую точность результатов. Отношение сигнал/шум для разностного пика интенсивностью в несколько процентов обычно достаточно мало, и нет смысла приводить его величину с несколькими десятичными знаками. Но, к счастью, в большинстве случаев нас интересует отличие, скажем, 5% ЯЭО от 20%, которое можно заметить вполне отчетливо.

Большая точность не нужна даже при выполнении вычислений по уравнению (5.17), поскольку обратная зависимость расстояний от шестой степени ЯЭО делает их нечувствительными к ошибкам отдель ных величин т|.

5.3.4. Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации Использование системы долговременной стабилизации поля с помо щью системы дейтериевой стабилизации-необходимое условие осуще ствления разностной спектроскопии. Однако в масштабе времени от дельного прохождения такая система не в состоянии обеспечить доста точную стабилизацию. Причины этого станут нам вскоре ясны, но это не приведет к улучшению стабильности поля. Нам необходимо обеспечить оптимальные условия стабилизации. Мы уже обсуждали их в гл. 3, но теперь, когда объем наших знаний вырос, пора снова вернуться к этому вопросу. Сказанное здесь полностью относится и к двумерной спектро скопии, где эффекты кратковременной нестабильности отношения поле/частота проявляются как «/х-шум» (см. гл. 8).

Задача системы стабилизации-поддержание постоянного отношения напряженности поля к рабочей частоте. Для этого постоянно наблю дают сигнал некоторой линии ЯМР, обычно дейтериевого резонанса от молекулы растворителя, и подстраивают постоянное поле так, чтобы эта линия оставалась на одном и том же месте. Для этой цели очень удобна дисперсионная форма линии, имеющая нулевую амплитуду в точке резонанса, которая становится положительной и отрицательной по разные от него стороны (рис. 5.19). Выделяемый таким образом сигнал можно непосредственно использовать для коррекции поля в петле обратной связи. Нам сразу, становится понятна необходимость правиль 12- Глава коррекция ПОЛЯ РИС. 5.19. Петля обратной связи системы стабилизации, обеспечивающая по стоянное положение опорной линии, использованной в форме сигнала дисперсии.

ной настройки фазы канала стабилизации (гл. 3). Полностью неправиль ная установка фазы, например, соответствующая линии поглощения, нарушает стабилизирующую способность петли обратной связи, по скольку амплитуда сигнала в точке резонанса не будет нулевой. Даже небольшие ошибки фазы в канале стабилизации приводят к уменьшению градиента линии в ее центре, снижая тем самым эффективность его работы.

При отсутствии шума в опорном сигнале система будет способна устранять изменения отношения поле/частота с достаточно большой скоростью, ограничиваемой быстротой коррекции поля и необходи мостью подавления возможных осцилляции или устранения сбоя резо нансных условий. Однако сигналы ЯМР неизбежно содержат шум, и мы вынуждены увеличивать время регистрации опорной линии, чтобы этот шум не вызвал флуктуации постоянного поля (это была бы просто аварийная ситуация!). Регистрируемый опорный сигнал стабилизации усредняется электронным интегратором в течение довольно длитель ного промежутка времени от десятков до сотен секунд. Обычно постоян ная времени усреднения-это внутренняя характеристика спектрометра, которую не может менять оператор. Нет оснований ожидать выполне ния коррекции поля в промежутки времени, меньшие указанного. Это очень плохо, поскольку именно такие времена и интересны с точки зрения разностной спектроскопии.

Таким образом, стабилизация вряд ли будет эффективно работать во временных интервалах порядка одного прохождения. Но тем не менее долговременная стабилизация остается важной, и мы можем обсудить способы оптимизации ее работы. Сигнал коррекции, получаемый из дисперсионной формы опорной линии, будет наиболее чувствителен Ядерный эффект Оверхаузера к изменениям отношения поле/частота при условии, что сигнал узкий, при правильно настроенной фазе и большом отношении сигнал/шум.

Мы можем воздействовать на эти факторы как с помощью выбора режима работы спектрометра (тщательная настройка разрешения, пра вильная настройка мощности и фазы опорного сигнала стабилизации), так и подбором растворителя, поскольку ширины резонансных линий дейтерия в спектрах различных растворителей изменяются в широких пределах. Один из лучших ЯМР-растворителей- ацетон, дающий в спектре дейтерия очень узкую линию, так как его вязкость мала. Более вязкие растворители (например, диметилсульфоксид, пиридин), вероят но, создают худшие условия для стабилизации. Один из самых плохих в этом плане растворителей-неизбежная во многих экспериментах вода.

Ее протоны (или ионы дейтерия) участвуют в обменных процессах. При определенных рН, температуре и типе растворенного вещества они могут давать чрезвычайно широкую линию. Эти факторы необходимо учитывать при планировании эксперимента, поскольку небольшие из менения характеристик водных растворов могут вызвать значительное уширение линии опорного сигнала в канале стабилизации.

5.4. Использование ЯЭО 5.4.1. Очень простой случай Рассмотрим самую обычную проблему, надо различить цитрако новую (1) и мезаконовую (2) кислоты. В этом случае мы можем использовать подход Белла и Сондерса, поскольку обе молекулы НО 2 С СО 2 Н очень близки по структуре и нет опасности наложения посторонних диполь-дипольных взаимодействий. При выполнении эксперимента в растворе D 2 O в молекуле останутся только интересующие нас протоны:

олефиновые и метальные. При исследовании изомерных олефинов по лезно помнить об одном правиле: отношение межъядерных расстояний в цис- и транс-изомерах составляет около 1,3:1. В этом очень простом случае использование стандартных длин связей позволяет рассчитать (в предположении усреднения положений метильных протонов) отношение расстояний между олефиновым и метальными протонами в цис- и транс-изомерах, которое оказывается равным 1,32:1.

Удобнее всего измерить ЯЭО на олефиновом протоне при насыще нии метильных. Возможен и обратный эксперимент, но он менее Глава разностный спектр ЯЭО мезаконоВпя кислота нормальный цитраконобая кислота спектр 5, 6,6 6,4 6,2 6,0 2, 2,6 2,2 1,6 1, м.Э. м.б.

Рис. 5.20. Разностные спектры, обсуждающиеся в тексте.

интересен, поскольку метальные протоны релаксируют в основном за счет диполь-дипольного взаимодействия друг с другом и измеряемый на них ЯЭО будет намного меньше. На рис. 5.20 показаны протонные спектры обеих кислот и соответствующие разностные ЯЭО-спектры с облучением метальных протонов. Много усилий было затрачено на получение действительно равновесного ЯЭО. Это оказалось не самым простым делом для таких малых молекул: Тх олефинового протона в транс-изомере составляет около 18 с. Как и ожидалось, ЯЭО, получен ный для цитраконовой кислоты, значительно превышает ЯЭО для мезаконовой кислоты. Для двух соединений интегрирование сигналов дает значения т), равные 0,29 и 0,06 соответственно. Предполагая зависимость ц от расстояния типа 1/г, мы получаем отношение межъ ядерных расстояний 1,30:1, и если точность определения ц составляет ± 0,01 (оптимистичная оценка!), то ошибка в величине отношения расстояний составляет + 0,04. Таким образом, найденная величи на совпадает с известными расстояниями в пределах ошибки экспери мента.

Итак, мы получили вполне удовлетворительный результат. Но все таки рассмотрим, с какими проблемами мы столкнулись бы в случае доступности только одного из изомеров. Мы бы получили некоторый результат, допустим, 6%. Но какой вывод мы должны отсюда сделать?

Не имея данных по второму веществу, мы не можем сказать, «большой»

это или «малый» ЯЭО. Действительно, при плохом приготовлении образца и неоптимальном выборе параметров регистрации спектра мы легко можем получить такую величину и на z/uc-изомере. Например, если вы предварительно не проверили Ti и выбрали длительность периода насыщения только несколько секунд, то ЯЭО не успеет полностью установиться. Сущность использования ЯЭО для определения структу ры состоит в сравнительном характере этого метода. В самом деле, надежные результаты можно получить только при сравнении двух Ядерный эффект Оверхаузера стереоизомеров. Чем дальше вы отходите от такой ситуации, тем осторожнее надо интерпретировать полученные данные.


Еще один интересный аспект эксперимента состоит в ширине диа пазона возможных величин ЯЭО. Максимально возможный ЯЭО со ставляет, разумеется, 50%. Величины, меньшие 1%, трудно измерить достоверно. Таким образом, максимально возможное соотношение со ставляет 50:1, что соответствует отношению межъядерных расстояний чуть менее 2 : 1. Это задает «динамический диапазон» эксперимен та;

расстояния, имеющие большее отношение, оказываются несравни мыми.

5.4.2. Проверка трехспинового уравнения Если в нашем образце можно выделить изолированную трехспино вую систему, то очень полезно попробовать использовать уравнение (5.17). В качестве примера рассмотрим акриловую кислоту. Протон карбоксильной группы снова можно заменить на дейтерий и оставить чисто трехспиновую систему, дающую на частоте 500 МГц спектр первого порядка. Измерение ЯЭО в этой системе представляет собой интересную техническую проблему, поскольку резонансы разделены всего на 120 Гц, что затрудняет селективное облучение. При облучении мультиплетов первого порядка хорошо работает процедура последова тельного насыщения линий [10]. Частота декаплера настраивается на одну из линий, и на короткое время включается слабое поле (несколько герц). Затем частота облучения переводится на следующую линию и т.д.;

этот цикл выполняется в течение всего периода насыщения.

Максимальное Tj акриловой кислоты в обезгаженном метаноле составляет около 10 с (протон Н х в формуле 3). При проведении эксперимента каждая линия мультиплета подвергается краткому облуче нию в течение 0,5 с, полный цикл для четырех линий составляет 2 с.

Цикл повторяется 45 раз, и общая длительность периода насыщения получается равной 9 7^. Как видно из разностного спектра на рис. 5. (приведен только один из трех экспериментов), применение очень слабо го радиочастотного поля позволяет добиться чрезвычайно высокой селективности. Полученные величины г| приведены в табл. 5.1 (обозначе ние протонов соответствует формуле 3).

Таблица 5.1. Величины ЯЭО для акриловой кислоты (индексы протонов даны в соответ ствии с формулой 3) Облучается А М X ПА - 0,340 0, Лм 0,360 - -0, г| х 0,140 -0, Глава Л II AMJ I I Г I I I I I I \ 6,4 6,3 6,2 6,1 6,0 5,9 5,8 5, 75, м. 8.

Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.

При использовании уравнения (5.17) для данных такого типа не обходимо выбрать наиболее удобное для расчетов отношение межъ ядерных расстояний. В нашем примере каждый изомер характеризуется только одним геометрическим соотношением, но выразить его можно разными способами. Например, мы можем выбрать отношение межъ ядерных расстояний в цис- и транс-изомерах, а можем выбрать и от ношение одного из них к геминальному расстоянию (г АМ в формуле 3).

Такие варианты соответствуют перестановке индексов А, М, X в уравне нии (5.17). Анализируя уравнение и типичные данные для таких систем, легко догадаться, что наиболее точный результат может быть получен при такой расстановке индексов, когда взаимодействия AM и АХ велики по сравнению с MX. Другая расстановка индексов (формула 4) поставит отношение межъядерных расстояний в зависимость от очень малой разности неточных величин, что внесет большую ошибку.

но2с НО2С Итак, самым удобным для вычислений будет отношение расстояний между цис- и гем-протонами;

исходя из длин связей, оно должно быть Ядерный эффект Оверхаузера 1,30:1. Подставив нужные значения из табл. 5.1 в уравнение (5.17), мы получим 1,32:1. Это вполне удовлетворительный результат. Чтобы проиллюстрировать важность правильного выбора расстояний, попро буйте повторить расчеты с индексированием протонов по формуле 4. Вы будете сравнивать цис- и транс-расстояния;

оценка их отношения с уче том длин связей составляет 0,79:1. Вычисленный по (5.17) результат должен значительно отличаться от этой величины. Объясняется это тем, что в системе преобладает взаимодействие MX, в то время как требую щаяся информация содержится именно в разности взаимодействий AM и АХ.

5.4.3. Реальная задача При попытке использовать измерения ЯЭО для более интересных молекул, чем приведенные в предыдущем разделе, мы столкнемся с некоторыми трудностями. Вероятно, большое число взаимодействую щих протонов сделает невозможным расчет межъядерных расстояний.

Предположение о равных корреляционных временах для всех межъядер ных векторов, на котором основаны такие расчеты, скорее всего вообще не выполняется для больших молекул, и мы не должны забывать об этом. Для того чтобы добиться успеха в определении структур сложных молекул, мы должны частично забыть о «двух основных принципах» из разд. 5.2.4. Мы будем считать, что наблюдаемая величина ЯЭО отража ет относительную близость ядер, но при этом надо помнить, что в не которых случаях наши выводы могут быть неверны. Попробуем решить реальную задачу.

При длительном нагревании трипептида 5 с ферментом изопеницил лин-1Ч-синтетазой (IPNS, схема 1) [11] из реакционной смеси выделяется соединение 6. Общая структура легко устанавливается при простом анализе протонного спектра и подтверждается протонным двумерным корреляционным спектром (гл. 8). Задача состоит в выяснении стереохимии этого соединения и особенно в определении ориентации гидроксильной группы в семичленном цикле, которая частично оп ределяется механизмом действия фермента. В более изученных ци клических системах задачи такого типа легко решаются с помощью протон-протонных констант спин-спинового взаимодействия, но для подобных систем этих данных нет, и, кроме того, будет не так просто Глава ^ ^ g j ^ Vw,*-^vv*«*-^^ I / WiV^-nPVv t. I,J llJ. AiiAA H H H 2b 2o 4b Рис. 5.22. Эксперимент по измерению ЯЭО для соединения 6.

определить конформацию большого цикла. Однако на основании протонных констант мы можем утверждать, что два протона в четырехчленном цикле находятся в i/иоположении (как показано в формуле 6);

это дает начальную информацию для построения экспери мента по ЯЭО.

Прежде чем представить полученные величины ЯЭО, делающие отнесение структуры почти очевидным, мы коснемся некоторых практи ческих трудностей, встретившихся при решении этой задачи. Изучаемое соединение малоустойчиво, а в ферментативной реакции в каждом опыте можно получить его в очень небольших количествах (не более 1 мг). Как хорошо видно из некоторых разностных спектров на рис. 5.22, такое количество вещества соответствует пределу чувствительности даже спектрометра на 500 МГц. Это значит, что регистрация ЯЭО требует большого количества времени работы спектрометра-порядка 15 ч на каждый эксперимент, а достаточную информацию о структуре можно получить только за несколько дней. Трудно описать в книге эту сторону спектральной работы. Простой перечень результатов и сделан ных из них выводов придают эксперименту излишне сухой и аналитичес кий вид. На самом же деле это настоящая борьба и настоящий под виг. Еще одним следствием трудной доступности вещества ока зывается низкая точность полученных величин ЯЭО. Величины, от личающиеся друг от друга менее чем в 2 раза, приходится считать неразличимыми.

Результаты измерения ЯЭО на соединении 6 приведены на схеме 2.

Ядерный эффект Оверхаузера RNH Схема Сначала рассмотрим эксперимент на протонах Н 2 а и Н 2 Ь (на схеме слева). Нашей точкой отсчета будет протон Н 7, которому мы приписы ваем изображенную стереохимию и который, как известно, находится в i/мс-положении по отношению к другому протону (3-лактама. Заметный ЯЭО (5%) на Н 7 при облучении Н 2 а и нулевой эффект при облучении Н 2 Ь свидетельствуют о том, что Н 2 а также находится за плоскостью рисунка (см. формулу 6). (У авторов уже был большой опыт работы с Р-лактам ными системами, поэтому такое отнесение не вызывало сомнений.) Как очевидно, Н 2 Ь находится по ту же сторону плоскости рисунка, что и Н (3% ЯЭО). Это позволяет зафиксировать относительные конфигурации С 7 и С 5. К сожалению, вопрос о конфигурации С 3 не так ясен. Похоже, что Н 2 а создает на Н 3 больший ЯЭО, чем Н 2 Ь, но низкая точность измерений и сложность спиновой системы делают рискованным отнесе ние конфигурации по этим данным.

Только что описанные эксперименты были выполнены в первой серии измерений, и задача, таким образом, осталась нерешенной. Спустя некоторое время была проделана вторая серия измерений с облучением протонов Н 4 а и Н 4 Ь (на схеме 2 справа), которые полностью прояснили структуру. Прежде всего большие величины ЯЭО на Н 5 и Н 3 при облучении Н 4 Ъ свидетельствуют об их сходном положении, а поскольку Н 5 уже связан с Н 2 Ь, можно утверждать, что гидроксильная группа находится за плоскостью рисунка. Конфигурация С 4 была подтверждена взаимодействием Н 4 а и Н 7, также свидетельствующим о предложенной конфигурации цикла. Таким образом, установленная стереохимия со ответствует формуле 7. Позже она была подтверждена обратной карти ной взаимодействия протонов при С 2 с протоном Н 3 в изомерном веществе 8.

СО 2 Н СО 2 Н Из этого примера можно сделать важный вывод: почти всегда имеет смысл измерять все возможные ЯЭО. Даже если вам кажется, что еще 186 Глава один эксперимент будет пустой тратой времени, все-таки проделайте его - ведь он не потребует больших дополнительных усилий. Не думайте, что вы сможете заранее предсказать его результаты. Например, взаимо действие Н 4 а и Н 7 в веществе 6 оказалось неожиданным и принесло полезную информацию. Чем- больше можно получить информации, подтверждающей гипотетическую структуру, тем лучше, поскольку ошибки в интерпретации данных по ЯЭО встречаются гораздо чаще, чем в других областях ЯМР.

5.4.4. Гетероядерный ЯЭО До сих пор мы занимались только гомоядерным ЯЭО и упомянули гетероядерный эффект только как источник повышения чувствительности на ядрах со спином 1/2 и малым у. ЯЭО между протоном и гетероядром может быть информативен и в селективных экспериментах, позволяя преодолеть некоторые технические трудности. Возьмем, к примеру, С.

Релаксация протонированного углерода происходит в основном за счет непосредственно связанных с ним протонов, и в этом случае ЯЭО не будет интересен - информацию легче получить с помощью развязки или двумерной гетероядерной корреляции химических сдвигов. Очень инте ресный момент состоит в том, что часто можно избежать создания прямого ЯЭО, поскольку он получается при насыщении не основного протонного сигнала, а его 13С-сателлитов. На практике обычно удается облучать центральную 12 С-линию, не задевая сателлитов, поскольку прямые константы протон-углеродного взаимодействия довольно вели ки. В этом случае мы должны увидеть ЯЭО только на четвертичных углеродах, связанных с тем атомом углерода, протоны которого облуча лись. Этот эксперимент может дать совершенно необычную стерео химическую информацию.

Важнейшая проблема таких экспериментов-чувствительность. Она осложняется еще и тем, что спектры необходимо регистрировать с широкополосной развязкой от протонов, поэтому между прохождения ми приходится делать значительные задержки, чтобы все ненужные ЯЭО успели исчезнуть, а нужные-появиться. Задержки должны быть в не сколько раз больше Tt четвертичных углеродов, которые часто превы шают 10 с. Тем не менее, используя концентрированные образцы и не жалея времени спектрометра, можно получить очень полезные результа ты. На рис. 5.23 этот принцип проиллюстрирован на примере трет бутильной группы. Внизу приведен спектр, полученный без ЯЭО с боль шой задержкой между прохождениями. Более сильнопольный металь ный сигнал, как и ожидалось, в 3 раза интенсивнее сигнала четвертич ного углерода. В разностном спектре (вверху), полученном при облуче нии протонов метальных групп (только 12С-линии), мы видим 80% ЯЭО на четвертичном углероде и отсутствие ЯЭО на метильном сигнале.

Такая большая величина вполне нормальна, поскольку максимальный ЯЭО на углероде при насыщении протонов составляет 200%.

Ядерный эффект Оверхаузера 3* 38 34 32 30 2* 2t Рис. 5.23. Селективный гетероядерный ЯЭО для соединения с го/е/я-бутильной группой. Мультиплет в слабом поле принадлежит растворителю.

По причине недостаточной чувствительности такие эксперименты пока не нашли широкого применения. Тем не менее в литературе появляются отдельные примеры (см. [12-15]). В будущем они станут, видимо, более обычными, поскольку получаемая с их помощью инфор мация труднодоступна другими путями.

Литература 1. Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ.-М.: ИЛ, 1963.

2. Noggle J.H., Schirmer R.E., The Nuclear Overhauser Effect - Chemical Applications, Academic Press, 1972.

3. Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd edn., Elsevier, 1984.

4. Bothner-By A. A., Stephens R. L., Lee J., Warren С D., Jeanloz R. W., J. Amer. Chem.

Soc, 106, 811-813 (1984);

Bax A., Davis D.G., J. Mag. Res., 63, 207-213 (1985).

5. Bell R. A., Sounders J.K.M., Can. J. Chem., 48, 1114-1122 (1970).

6. MershJ.D., Sounders J.K.M., Prog. NMR Spec, 15, 353-400 (1982).

7. Примеры использования нестационарного ЯЭО для решения структурных задач: Heatley F., Akhter L., Brown R. Т., J. Chem. Soc. Perkin II, 919-924 (1980).

8. VoldR.L., VoldR.R., J. Mag. Res., 55, 78-87 (1983).

9. Shaka A.J., Bauer C.J., Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984).

10. Kinns M., Sounders J.K.M., J. Mag. Res., 56, 518-520 (1984).

11. Baldwin J. E., Adlington R. M., Derome A. E., Ting H.-H., Turner N. J., J. Chem. Soc.

Chem. Commun., 1211-1214 (1984).

12. Kover K.E., Batta G., i. Chem. Soc. Chem. Commun., 647-648 (1986).

13. Kover K. E., Batta G., J. Amer. Chem. Soc, 107, 5829-5830 (1985) и ссылки в этой работе.

14. Aldersley M.F., Dean F.M., Mann B.E., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 107- (1983).

15. Leeper F.J., Staunton J., J. Chem. Soc Chem. Commun., 911-912 (1982).

Глава Перенос поляризации и редактирование спектров 6.1. Введение По общему мнению, спектроскопия ЯМР-идеальный аналитический метод для решения химических задач: ЯМР имеет высокое разрешение, и его параметры (химические сдвиги и константы спин-спинового взаи модействия) связаны с химическими представителями об электронной структуре и топологии молекул вполне прямым и понятным путем. Но основной ее недостаток-это невысокая чувствительность. Слишком часто от ЯМР-спектроскопистов можно услышать слова: «Вот если бы у вас было еще 50 мг вещества...» Низкая чувствительность объясняется тем, что в существующих магнитных полях энергия ядерных переходов настолько мала, что они оказываются не так далеки от насыщения даже при комнатной температуре. При проведении ЯМР-эксперимента при бор должен регистрировать очень тонкое различие заселенностеи энерге тических уровней. Вообще эти переходы заметны только благодаря наличию резонансных условий. Недостаток чувствительности существен но снижает достоинства ЯМР, поскольку уже сейчас можно без больших преувеличений утверждать, что при наличии неограниченного количества любого вещества с молекулярной массой не более, скажем, 3000 единиц, можно подобрать такую последовательность ЯМР-экспериментов, кото рая с очевидностью установит его структуру. Но, к сожалению, интере сующие нас вещества редко доступны в неограниченных количествах.

Любой метод повышения чувствительности чрезвычайно важен для ЯМР. Именно поэтому химики сегодня с радостью покупают магниты, которые в 10 раз дороже, чем двадцать лет назад. Повышение напряжен ности поля постоянных магнитов - прямой способ увеличения интенсив ности сигналов ЯМР. Однако прогресс в этом направлении неизбежно имеет определенный предел. Современная технология производства стационарных постоянных сверхпроводящих магнитов (в отличие от магнитов, создающих мощные поля на короткие промежутки времени) позволяет получать напряженности полей, соответствующие протонным переходам на частотах 500-600 МГц. Прогресс в этом направлении пока еще не остановился, технология продолжает совершенствоваться, но трудно предположить возможность увеличения напряженности поля на несколько порядков. Даже если бы это и было достижимо, дальнейшее увеличение напряженности поля оказалось бы бессмысленным по ряду Перенос поляризации и редактирование спектров других причин. Например, с ростом поля мы быстро приближаемся к такой ситуации, когда обычное молекулярное движение становится медленным в шкале времени ЯМР. Повышения чувствительности можно добиваться и с помощью других технических новшеств, как, например, использование криогенных датчиков [1], однако здесь также обязатель но существует предел.

Практическим критерием эффективности спектроскопии ЯМР с точки зрения чувствительности служит ее способность анализировать такие количества вещества, с которыми обычно имеют дело химики. В настоя щее время это количество составляет примерно 1 мг при использовании обычной хроматографической техники или несколько микрограммов при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Это количество вещества химики уже «чувствуют». Вещество становится невидимым при уменьшении его количества, и с ним трудно обращаться.

Биологи же, напротив, часто могут определить присутствие вещества по его биологической активности, поэтому микрограммовые количества считаются достаточными для работы. Мы будем использовать компро миссную величину 100 мкг в качестве наименьшего доступного количест ва вещества. Какие ЯМР-эксперименты можно провести с таким образ цом на современных спектрометрах с не самой высокой напряженностью поля?

К сожалению, их не так много. Мы можем зарегистрировать протон ный спектр (а также спектр на фторе и экзотическом тритии). Сможем, вероятно, провести некоторые эксперименты по ЯЭО и зарегистриро вать протонный спектр COSY (гл. 8), хотя это и потребует много времени. С другими ядрами дело обстоит сложнее. На очень сильнополь ных спектрометрах, возможно, удастся зарегистрировать спектр ядра 3 1 Р и, поставив накопление в микроячейке на субботу и воскресенье, спектр С с широкополосной развязкой от протонов. Если же мы-химики неорганики и хотим получить спектры низкочастотных металлов, то без увеличения количества вещества в сотни раз у нас не будет никакой надежды на успех. Вообще, протон-это единственное ядро, позволяю щее проводить ЯМР-эксперименты с такими количествами вещества, которые обычно имеются в распоряжении химика. Для наблюдения других ядер необходимо получать его в больших количествах.

Возможность переноса этого замечательного свойства протонов на другие ядра была бы очень важна. В этой главе мы сначала рассмотрим очень старый эксперимент SPI и на его примере установим необходимые для такого переноса законы. В двух других разделах мы обсудим два наиболее общих эксперимента по переносу поляризации: INEPT и DEPT. Первый из них интересен по двум причинам. Во-первых, он был разработан первым и способствовал быстрому прогрессу в этой экспери ментальной области, и, во-вторых, он более удобен для изложения с помощью нашего иллюстративного метода. DEPT же в большей степени подходит для практических применений и излагается в основном с этой точки зрения: понять его механизм в деталях невозможно без Глава привлечения концепции многоквантовой когерентности, которую мы рассмотрим в гл. 8.

6.2. Селективный перенос заселенности Как это ни странно, метод, позволяющий перенести интересующие нас свойства протонов на другие ядра, известен уже много лет под названием селективного переноса заселенности SPT (Selective Population Transfer) или, что более точно соответствует нашему эксперименту, селективной инверсии заселенности SPI (Selective Population Inversion).



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.